JP2018135395A - レッドクローバーとザクロとの複合抽出物を有効成分として含む組成物の女性更年期改善用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、多様な用途で優れた効果を奏する天然組成物に関し、より詳しくは、更年期症状の改善に優れた効果を奏する天然植物複合抽出物に関する。
エストロゲン(estrogen)は、子宮、膣、骨格筋及び心血管系など女性の多様な臓器に対して必須な調節効果を有し、主に異化作用及び活性作用を担当する[Couse and Korach、1999;Korach et al.、1995]。したがって、閉経による女性のエストロゲン不足は、いわゆる更年期障害と呼ばれる多様な臨床症状を引き起こす[Turner et al.、1994;Versi et al.、2001]。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、更年期症状の改善に相乗効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物及びその多様な用途、特に、薬学的、食品学的、化粧学的用途を提供することを目的とする。
上記の課題を達成するため、本発明は、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を提供する。
本発明によれば、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された1つ以上の効果を奏する相乗的な更年期症状改善効果を発揮しながらも副作用がない、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む天然組成物を提供することができる。
〔図1〕OVXラットを用いてレッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを含む複合物の相乗効果を実験するための実験スケジュールを示した図である。
以下、本発明の理解を助けるために製造例と実施例を挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による製造例と実施例は多くの他の形態で変形でき、本発明の範囲が後述される製造例と実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の製造例と実施例は当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
(1)レッドクローバー抽出物の製造
まず、レッドクローバーを洗浄した。レッドクローバーの地上部のみを分離して総重量80〜120kgのレッドクローバー地上部を準備した。レッドクローバー重量対比約3倍の重量で70%エタノールを添加し、75℃〜80℃、0.05MPaで2.5時間に亘って2〜3回抽出してレッドクローバー抽出物300kgを得た。固液分離工程を通じて分離した後、100meshで濾過した。濾過されたレッドクローバー抽出物を70℃、0.06Mpaで6時間加熱濃縮し、レッドクローバー濃縮抽出物25kgを得た。濃縮物にマルトデキストリン0〜1kgを添加して噴霧乾燥し、8meshで粉砕して10%イソフラボンが含まれたレッドクローバー抽出粉末10kgを得た。
(2)ザクロ抽出物の製造
まず、ザクロ1000kgの異物を除去し、割れた果実を分離及び洗浄した。分類した果実を切断して皮を除去し、圧搾して種を分離してザクロの果肉450kgを得た。濾過後、100〜105℃で60秒間殺菌し、48〜55℃に冷却した。ペクチナーゼをザクロジュース1000L当り70〜100ml投入し、48〜55℃で30分間澱粉を分解した。その後、濁度及び色相の維持、服用に有利な粘度のため、ザクロジュース10000L当りベントナイト900gを投入し、48〜55℃で10分間撹拌した。次いで、1.5mm及び1mm真空濾過し、加熱濃縮(順次に、80℃、475mbarで12Brixまで、87℃、626mbarで17Brixまで、95℃、847mbarで31Brixまで、70℃、312mbarで43Brixまで、そして49℃、118mbarで65Brixまで加熱濃縮)した後、さらに0.15mm濾過してエラグ酸1.8〜3.0mg/gを含むザクロ濃縮液を得た。その後、前記ザクロ濃縮液をデキストリンと混合し、噴霧乾燥過程を通じてエラグ酸0.5〜1.0mg/gを含むザクロ濃縮粉末を製造した。
(3)レッドクローバー及びザクロ複合抽出物の製造
上記のようにして製造したレッドクローバー抽出粉末40kg(イソフラボン10%含有)とザクロ抽出粉末20kg(0.8mg/gエラグ酸含有)とを混合して撹拌し、最終的なレッドクローバーとザクロとの複合抽出物60kg(イソフラボン66.7mg/g、エラグ酸0.26mg/g含有)を得た。
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物とを特定の比率で組み合わせるとき、イソフラボノイド含有量の多様化による著しい相乗効果が奏されると予想し、実験を計画した。
(1)実験動物
処女雌Sprague−Dawleyラット(6週齢、OrientBio、城南、韓国)を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会の動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した[Approval No.DHU2013−042]。
(2)実験方法
群分離(総7ヶ群;群当り8匹)して実験した(表1、図1)。
PCP=ザクロ抽出物(Pomegranate Concentrate Powder)
RC=レッドクローバー乾燥抽出物(Red clover dry extracts)
OVXによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。
OVX手術28日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため(OVXラット:323.81±14.77g、304〜354g;偽手術ラット:253.25±9.08g、240〜265g)、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重及びOVX後誘発期である4週間の増体量の増加が全体OVX手術群で認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では投与開始後49日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物60mg/kg投与群ではそれぞれ投与開始後56、63及び70日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始めた。また、すべての実験物質投与群から、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)投与期間である84日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が投与開始後77日目から認められ、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群ではレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)投与期間である84日間の増体量の減少も認められた(表2)。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較、
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較、
c(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較、
d(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較、e(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較、
f(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較、
g(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
h(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与期間中の増体量が96.55%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ−23.64、−23.00、−38.90、及び−31.87%の変化を示した。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)飼料摂取量の増加が投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ認められた。OVX対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与に関連する飼料摂取量の変化は、測定日である28、49及び83日でそれぞれ認められず、すべての用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった(表3)。
d(p<0.01)及びe(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
(実施例1−4.水摂取量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)水摂取量の増加が投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ認められた。OVX対照群と比べて、レッドクローバー抽出物、ザクロ抽出物及びレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与に関連する水摂取量の変化は、測定日である28、49及び83日でそれぞれ認められず、ザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べて有意な(p<0.05)水摂取量の減少が投与開始後83日目に限ってレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群で認められた以外は、すべての用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物投与群の全体からも、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群のそれぞれと比べて、有意な水摂取量の変化が認められなかった(表3)。
OVX対照群では、測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意な尿量の変化が認められなかったが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)尿量の増加を測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)尿量の増加がすべての測定日で認められた(表4)。
b(p<0.01)及びc(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
l(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
(実施例1−6.糞便排出量の変化)
OVX対照群では、測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ偽手術対照群に比べて有意でない軽微な糞便排出量の増加を示したが、OVX対照群と比べてレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120mg/kg投与群では、投与開始後49日及び83日目に有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加をそれぞれ示し、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加を測定日である投与開始後28、49及び83日目にそれぞれ示し、特にレッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kg投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)糞便排出量の増加が、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群で、それぞれ投与開始後49日及び83日目に認められた。OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて投与開始後28、49及び83日目の糞便の排出量がそれぞれ13.29、26.96及び25.76%の変化を示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg、ザクロ抽出物20mg/kg、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ28.46、7.87、25.15、33.63%の糞便排出量の変化を投与開始後28日目に示し、42.80、39.56、90.16、77.55%の変化を投与開始後49日目に示し、35.89、32.54、60.58、57.03%の変化を投与開始後83日目にそれぞれ示した。(表4)
(実施例1−7.蓄積腹部脂肪重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)、左側腹壁に蓄積された脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)、腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められた(表5、図5)。
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
e(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
l(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−8.子宮重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた(表5、図6)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)肝の絶対重量の増加も示し、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた(表5)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)、体重に対する大腿骨、脛骨及び腰椎骨(L5)の湿/乾燥相対重量の減少とともに、大腿骨、脛骨及びL5の炭化絶対及び相対重量の減少が認められたが、ザクロ抽出物20mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい骨の湿/乾燥相対重量の増加が認められ、炭化骨の相対及び絶対重量の有意な(p<0.01又はp<0.05)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨の湿重量の増加を示し、有意な(p<0.01又はp<0.05)骨の乾燥/炭化絶対及び相対重量の増加がそれぞれ認められた(表6〜表8)。
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−11.血液の生化学的変化(1):AST、ALT、TC、LDL、HDL及びTG)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC(Total Cholesterol)、LDL(Low Density Lipoprotein)及びTG(Triglyceride)含量の増加が、有意な(p<0.05)HDL(High Density Lipoprotein)含量の減少とともに認められたが、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少が認められ、血中HDL含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中HDL含量の増加も認められ、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少及びHDL含量の増加がそれぞれ認められた(表9)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の減少が認められたが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120、60mg/kg投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた(図7)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の増加が、有意な(p<0.01)bALP含量の減少とともに認められたが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少が、血中bALP含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少及びbALP含量の増加がそれぞれ認められた(図8、9)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の全体、脛部及び中軸部位の骨密度とともに、L4(第4腰椎)全体の骨密度が有意に(p<0.01)減少した一方、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)骨密度増加が全体測定部位でそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨密度の増加が全体測定部位でそれぞれ認められた(表10)。
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
(実施例1−15.骨強度の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨及び脛骨の中軸部位の骨強度がそれぞれ有意に(p<0.01)減少した一方、2種の用量のレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨及び脛骨の骨強度の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)骨強度の増加が大腿骨及び脛骨の中軸部位でそれぞれ認められた(図10、11)。
(1)蓄積腹壁脂肪
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい腹部脂肪の腹壁蓄積増加による蓄積腹壁脂肪厚さの有意な(p<0.01)増加と脂肪細胞平均直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、すべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)蓄積腹壁脂肪及び脂肪細胞直径の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)脂肪の腹壁蓄積及び脂肪細胞肥大所見の抑制が認められた(表11、図12)。
(2)子宮
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい子宮粘膜の減少を特徴とする不溶性萎縮が認められ、子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、そして粘膜内子宮腺が占める比率の有意な(p<0.01)減少がそれぞれ認められたが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)子宮の不溶性萎縮所見の組織病理学的抑制が認められた(表11、図13)。
(3)肝
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい肝細胞内の脂肪蓄積による肥大を特徴とする肝脂肪病症が引き起こされ、肝の脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物40mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝脂肪病症の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても有意な(p<0.01)肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の減少が認められた(表11、図14)。
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
l(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
表11において、略語の意味は次のようである。
Th=thickness、厚さ
DM=diameter、直径
Epi=epithelium、上皮
MG=uterinegland、子宮
FC=fatty change、脂肪変化
(実施例1−17.組織病理学的変化(2):大腿骨、脛骨及び腰椎骨(L4))
偽手術群の大腿骨、脛骨及びL4では比較的によく発達した柱骨と皮質骨が観察された一方、OVX対照群では破骨細胞(Osteoclast cell)の著しい数的増加及び活性増加による柱骨及び皮質骨の著しい組織学的減少が認められたが、ザクロ抽出物20mg/kgを含むすべての実験物質投与群では、大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞活性抑制による柱骨及び皮質骨の骨量及び厚さの著しい増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい破骨細胞活性抑制及び骨量保存効果が認められた(表12〜14、図15〜17)。
(1)骨質量(Bone mass)及び構造
OVX対照群の場合、大腿骨、脛骨及びL4の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、中軸部分の皮質骨の厚さがそれぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)減少したが、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨、脛骨及びL4の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨質量及び構造に対する組織病理学的指標の減少抑制効果が認められた。
(2)骨吸収
OVX対照群の場合、大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞の数と比率(OS/BS)が、それぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)増加したが、すべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい大腿骨、脛骨及びL4の破骨細胞の数及びOS/BSの減少が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1(g/g)複合物120及び60mg/kg投与群では、レッドクローバー抽出物40mg/kg及びザクロ抽出物20mg/kgそれぞれの投与群に比べても著しい骨吸収増加の抑制効果が認められた(表12〜14)。
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
h(p<0.01)及びi(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
j(p<0.01)及びk(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
l(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
f(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
m(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物40mg/kg投与群と比較
o(p<0.01)及びp(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物20mg/kg投与群と比較
参考までに、表12〜表14における略語の意味は次のようである。
Cbt=Cortical bone thickness(Cross thickness;μm)、皮質骨の厚さ
Tbl=Trabecular bone length(Longitudinal thickness;mm)、柱骨の長さ
Tbn=Trabecular bone number(N/epiphyseal)、柱骨の数
Tbt=Trabecular bone thickness(Cross thickness;μm)、柱骨の厚さ
TV/BV=Trabecular bone volume(%)、柱骨の体積
OS/BS=Osteoclast cell surface/bone surface(%)、破骨細胞の面積/骨面積
Ocn=Osteoclast cell number(N/epiphyseal)、破骨細胞の数
[実施例1のまとめ]
本研究では、ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む複合物の更年期障害に対する生理活性増大効果を、ヒトの閉経期による更年期障害と類似すると知られたOVXラットモデル[Tominaga et al.、2001、2002;Iwamoto et al.、2005;Cheng and Tian、2012]を用いて評価した。
(実施例2−1.実験動物及び実験方法)
(1)実験動物
処女雌Sprague−Dawleyラット(6週齢)を入手して、偽手術対照群を除いたすべての実験動物を無作為に選定し、両側の卵巣を完全に切除して更年期を誘発した。一方、偽手術群では同じ方法で両側の卵巣を確認した後、切除せずに腹腔を閉じた。すべての実験動物は手術28日後、体重(OVXラット:312.21±12.3g、偽手術ラット:255.12±12.11g)を基準に、群当り4匹ずつ設定して実験に用いた。
(2)実験方法
更年期障害に対する効果を抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果の3種の薬理効果に区分して評価した。
レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との複合物の更年期誘導モデルにおける更年期症状改善効果の相乗効果を確認するため、レッドクローバー抽出物40mg/kgの摂取量にザクロ抽出物を配合した後、更年期誘導動物モデルにおける抗肥満効果、高脂血症抑制効果及び骨粗鬆症抑制効果を通じてザクロ抽出物の添加による更年期症状改善相乗効果を測定した。
(実施例3−1.実験動物及び実験方法)
(1)実験動物
処女雌ddYマウス(6週齢、紀和実験動物研究所、和歌山、日本)を使用した。本実験において、すべての実験動物は大邱漢医大学実験動物倫理委員会の動物倫理基準に従って取り扱い、事前承認下で実験を施した[Approval No.DHU2014−020]。
(2)実験方法
群分離(総14ヶ群;群当り8匹)して実験した(表15、図18)。
et al.、2007;Tousen et al.、2011]に従って、0.03μgの17β‐エストラジオール(Sigma−Aldrich、St.Louise、MO、USA)を0.2mlの滅菌生理食塩水に溶解させて、0.2ml/マウスの用量(0.03μg/頭/日)でOVX手術28日後から毎日1回ずつ84日間背中の肌に皮下投与した(表15、図18)。複合組成物の投与用量は、マウスの体表面積を考慮してヒト臨床用量600mgの12倍、すなわち、(600mg/60kg)×12=120mg/kgに選定し、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物の用量も直接的な薬効の比較評価のため120mg/kgにそれぞれ選定した。
PCP=ザクロ抽出物
RC=レッドクローバー乾燥抽出物
RC:PCP=RCとPCPとで構成された混合剤形(g/g)
OVXによる更年期障害誘発のため、下記のように実験した。
OVX手術28日後、偽手術対照群に比べて体重の増加が顕著な実験動物のみを選定して使用したため(OVXマウス:30.71±1.65g、28.0〜35.1g;偽手術マウス:26.99±1.46g、24.4〜28.7g)、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重及びOVX後誘発期である4週間の増体量の増加が全体OVX手術群で認められたが、エストラジオール、ザクロ抽出物及びレッドクローバー抽出物の単独組成物投与群では投与開始後14、21及び28日目からOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合物投与群でも投与開始後14、21または28日目からそれぞれOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が認められ始め、すべての実験物質投与群ではOVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)、投与期間である84日間の増体量の減少も認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、2:1及び4:1複合物投与群では、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)体重の減少が投与開始後28、42及び49日目から認められ始め、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べて有意な(p<0.01)投与期間中の増体量の減少がレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1複合物投与群の順に認められた(表16、図22)。
*すべての動物は夜間に絶食した。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
e(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物投与群と比較
f(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
i(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物投与群と比較
j(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物投与群と比較
RC:PCP=レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との配合物(g/g)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)飼料摂取量の増加が投与1日目から83日目まですべての測定日でそれぞれ認められ、OVX対照群と比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)飼料摂取量の減少がエストラジオール投与群に限って投与開始後7日目から認められ始めた以外は、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物(g/g)複合組成物投与群で、OVX対照群と比べて有意な飼料摂取量の変化は認められず、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物(g/g)複合組成物投与群でも、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれと比べて、有意な飼料摂取量の変化が認められなかった(表17)。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01)及びc(p<0.05):LSDテストによってOVX対照群と比較d(p<0.01):MWテストによって偽手術対照群と比較
e(p<0.01):MWテストによってOVX対照群と比較
(実施例3−4.蓄積腹部脂肪重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)蓄積腹部脂肪の絶対重量及び体重に対する相対重量の増加がそれぞれ認められたが、エストラジオールを含むすべての投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)腹部脂肪重量の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)腹部脂肪重量の減少が認められた(表18、図23)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮の絶対重量及び体重に対する相対重量の減少がそれぞれ認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)子宮重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)子宮重量の増加が認められた(表18、図24)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する肝の相対重量の減少が認められたが、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物投与群を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)肝の相対重量の増加が認められた。一方、偽手術対照群と比べて有意な肝の絶対重量の変化はすべてのOVX対照群で認められず、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物投与群でも、OVX対照群に比べて有意な肝の絶対重量の変化が認められなかった(表18)。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−7.大腿骨重量の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体重に対する大腿骨の相対湿重量の減少とともに、乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の減少が認められたが、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて著しい大腿骨重量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨の相対湿重量の増加、そして乾燥及び炭化骨の絶対及び相対重量の増加が認められた(表19)。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
i(p<0.01)及びj(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
k(p<0.01)及びl(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
m(p<0.01)及びn(p<0.05):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−8.血液の生化学的変化(1):AST、ALT、TC、LDL、HDL及びTG)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の増加が、有意な(p<0.01)HDL含量の減少とともに認められたが、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少が認められ、血中HDL含量の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)血中AST、ALT、TC、LDL及びTG含量の減少とともに血中HDL含量の増加が認められた(表20)。
OVX対照群の場合、偽手術対照群に比べて血中HDL及びTG含量がそれぞれ−50.45及び305.74%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ52.09、37.17、33.25、60.99、36.91、32.98、34.55、34.03、87.70、59.42、39.27及び34.29%の血中HDL含量の変化を示し、それぞれ−34.80、−17.99、−17.07、−31.56、−19.48、−18.98、−18.48、−17.74、−43.55、−28.56、−18.65及び−18.23%の血中TG含量の変化を示した。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−9.血液の生化学的変化(2):エストラジオール)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の減少が認められたが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)血中エストラジオール含量の増加が認められた(図25)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の増加とともに有意な(p<0.01)bALP含量の減少が認められたが、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)血中オステオカルシン含量の減少が、血中bALP含量の増加とともにそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)血中オステオカルシン含量の減少及び血中bALP含量の増加が認められた(図26、27)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度がそれぞれ有意に(p<0.01)減少した一方、全9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)平均全身骨密度及び大腿骨全体骨密度の増加が認められた(表21、図28及び29)。
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて有意な(p<0.01)体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の増加が認められた一方、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の有意な(p<0.01)減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)体脂肪及び腹部蓄積脂肪量の減少が認められた(表21)。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01)及びg(p<0.05):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−13.骨強度の変化)
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて大腿骨中軸部位の骨強度が有意に(p<0.01)減少した一方、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨骨強度の増加がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨骨強度の増加が認められた(図30)。
(1)蓄積腹部脂肪
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい腹部脂肪の蓄積によって、腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の減少がそれぞれ認められた。特に、レッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)腹部脂肪パッド厚さ及び脂肪細胞平均直径の減少が認められた(図31及び32)。
(2)子宮
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい子宮粘膜の減少を特徴とする不溶性萎縮が認められ、子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、そして粘膜内子宮腺が占める比率の有意な(p<0.01)減少がそれぞれ認められたが、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01又はp<0.05)子宮の全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率の増加が認められた(表22、図33及び34)。
c(p<0.01)及びd(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
g(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(3)肝
OVX対照群では、偽手術対照群に比べて著しい肝細胞内の脂肪蓄積による肥大を特徴とする肝脂肪病症が引き起こされ、肝の脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の有意な(p<0.01)増加がそれぞれ認められたが、エストラジオールを含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01)の肝脂肪病症の減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)の肝脂肪変性部位及び平均肝細胞直径の減少が認められた(表23、図35及び36)。
a(p<0.01)及びb(p<0.05):LSDテストによって偽手術対照群と比較c(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
d(p<0.01)及びe(p<0.05):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
f(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(実施例3−15.組織病理学的変化(2):大腿骨)
偽手術群の大腿骨では比較的によく発達した柱骨と皮質骨が観察された一方、OVX対照群では破骨細胞の著しい数的増加及び活性増加による柱骨及び皮質骨量の減少が認められたが、レッドクローバー抽出物単独組成物を含むすべての実験物質投与群では、大腿骨の破骨細胞活性抑制による柱骨及び皮質骨の骨量及び厚さの著しい増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても著しい破骨細胞活性抑制及び骨量保存効果が認められた(表24、25及び図37、38)。
(1)骨質量及び構造
OVX対照群の場合、大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、中軸部分の皮質骨の厚さがそれぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)減少したが、ザクロ抽出物の単独組成物を含むすべての候補物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)大腿骨の柱骨量、柱骨の平均長さ、厚さ及び数、皮質骨の厚さの増加が認められた。
大腿骨の柱骨量及び柱骨の平均数は、OVX対照群では、偽手術対照群に比べてそれぞれ−53.66及び−59.41%の変化を示し、エストラジオール、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、レッドクローバー:ザクロ抽出物の1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1(g/g)複合組成物投与群では、OVX対照群に比べてそれぞれ73.01、32.47、25.54、59.92、31.08、30.51、26.55、26.42、81.75、58.54、33.70及び30.75%の柱骨量の変化を示し、それぞれ92.68、46.34、36.59、102.44、46.34、43.90、36.59、34.15、139.02、97.56、53.66及び46.34%の平均柱骨数の変化を示した。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
d(p<0.01):LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
i(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
j(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
(2)骨吸収
OVX対照群の場合、大腿骨の破骨細胞の数と比率(OS/BS)が、それぞれ偽手術対照群に比べて有意に(p<0.01)増加したが、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物を含むすべての実験物質投与群では、OVX対照群に比べて有意な(p<0.01又はp<0.05)大腿骨の破骨細胞の数とOS/BSの減少がそれぞれ認められ、特にレッドクローバー:ザクロ抽出物の2:1、1:1及び4:1(g/g)複合物投与群の順に、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物投与群のそれぞれに比べても有意な(p<0.01)大腿骨の破骨細胞の数とOS/BSの減少が認められた。
a(p<0.01):LSDテストによって偽手術対照群と比較
b(p<0.01):LSDテストによってOVX対照群と比較
c(p<0.01):LSDテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
dはp<0.01LSDテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
e(p<0.01)及びf(p<0.05):MWテストによって偽手術対照群と比較
g(p<0.01)及びh(p<0.05):MWテストによってOVX対照群と比較
i(p<0.01):MWテストによってレッドクローバー抽出物単独投与群と比較
j(p<0.01):MWテストによってザクロ抽出物単独投与群と比較
[実施例3のまとめ]
本研究では、レッドクローバー抽出物とザクロ抽出物との最適複合組成を、現在骨粗鬆症を含む多様な更年期障害の実験動物モデルとして用いられているOVX ddYマウスモデル[Yamaguchi et al.、1999;Ku and Lee、2005;Han et al.、2007;Shin et al.、2007]を用いて評価した。すなわち、OVX28日後から、レッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物、9種のレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1及び8:1、g/g)120mg/kgを滅菌蒸留水に溶解または希釈して、10ml/kgの用量で毎日1回ずつ84日間経口投与し、エストロゲン様効果、抗肥満効果、高脂血症抑制効果、脂肪肝に対する保護効果及び骨粗鬆症抑制効果の5種の薬理効果に区分して評価した。エストロゲン様効果及び抗肥満効果を評価するため、体重及び増体量、水及び飼料の摂取量、体脂肪量及び腹部脂肪量、血清中エストラジオールの含量、蓄積腹部脂肪及び子宮の重量変化を、蓄積腹部脂肪の厚さ及び平均脂肪細胞直径、子宮全体、上皮及び粘膜の厚さ、粘膜内子宮腺が占める比率などの組織病理学的変化とともに評価し、肝重量、血清中AST及びALTの含量、組織病理学的変化(平均肝細胞直径及び脂肪変化を示す肝変性部位)を測定して脂肪肝に対する肝保護効果を評価し、高脂血症改善効果を血中TC、LDL、HDL及びTG含量の変化で評価し、骨粗鬆症改善効果、すなわち骨保護効果を評価するため、大腿骨の湿重量、乾重量及び炭化重量、BMD、骨強度、血中オステオカルシン及びbALPの含量、大腿骨の骨量及び構造と骨吸収に対する組織病理学的変化をそれぞれ測定した。本実験において、それぞれのレッドクローバー抽出物及びザクロ抽出物の単独組成物と比べて、同時に統計学的に有意な(p<0.01又はp<0.05)薬効相乗を示す複合組成物を、相乗効果を奏するレッドクローバー:ザクロ抽出物複合組成物として確認し、17β‐エストラジオール0.03μg/頭/日の皮下投与マウス[Chiba et al.、2003;Murakami et al.、2007;Tousen et al.、2011]における結果と比較評価した。
et al.、2011]に従って、0.03μgの17β‐エストラジオールを0.2mlの滅菌生理食塩水に溶解させて、0.2ml/マウスの用量(0.03μg/頭/日)でOVX手術28日後から毎日1回ずつ84日間背中の肌に皮下投与した。
Claims (21)
- ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む更年期障害改善用組成物。
- 前記更年期障害が、顔面紅潮、発汗、不眠症、神経過敏、うつ病、めまい、集中力欠乏、関節痛、頭痛、心悸亢進、膣乾燥感、疲れ、興奮、不眠、記憶喪失、心配及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択された1つ以上の更年期症状を示すことを特徴とする請求項1に記載の更年期障害改善用組成物。
- 前記更年期障害改善が、更年期症状改善、抗肥満、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨粗鬆症抑制、肝保護及び子宮保護からなる群より選択された1つ以上の効果を奏することを特徴とする請求項1に記載の更年期障害改善用組成物。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む薬学的組成物。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む食品組成物。
- 請求項1〜請求項3のいずれか1項に記載の更年期障害改善用組成物を含む化粧料組成物。
- ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1〜4であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1.5〜2.5であることを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- 前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を組成物100ml当り50〜150mgで含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- ザクロ抽出物が、全体ザクロ抽出物対比0.5〜1mg/gのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- レッドクローバー抽出物が、全体レッドクローバー抽出物対比50〜150mg/gのイソフラボンを含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物が、30〜100mg/gのイソフラボン及び0.15〜0.4mg/gのエラグ酸を含むことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- レッドクローバー抽出物が、水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として使用して抽出したことを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- レッドクローバー抽出物が、レッドクローバー抽出粉末であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- ザクロ抽出物が、ザクロ抽出粉末であることを特徴とする請求項1〜請求項6のいずれか1項に記載の組成物。
- ザクロ抽出物対比レッドクローバー抽出物の重量比が1:1〜4になるように混合することを特徴とするザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を含む組成物の更年期障害改善効果を向上させる方法。
- (S1)ザクロの果肉に澱粉分解酵素を添加し加熱濃縮してザクロ果肉抽出物を製造する段階と、
(S2)レッドクローバーの地上部に水、炭素数1〜4の低級アルコールまたはこれらの混合物を溶媒として添加してレッドクローバー地上部抽出物を製造する段階と、
(S3)ザクロ果肉抽出物とレッドクローバー地上部抽出物とを混合して撹拌する段階と、を含む更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。 - 前記レッドクローバー地上部抽出物は、さらに加熱濃縮した後、多糖類を添加し乾燥してレッドクローバー地上部抽出粉末として(S3)段階に混合されることを特徴とする請求項17に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。
- 前記ザクロ果肉抽出物は、さらに多糖類を添加し乾燥してザクロ果肉抽出粉末として(S3)段階に混合されることを特徴とする請求項17に記載の更年期症状改善用ザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の製造方法。
- 更年期障害の改善が必要な対象にザクロとレッドクローバーとの複合抽出物を有効成分として含む組成物を投与する段階を含む更年期障害を改善する方法。
- 更年期障害改善用組成物を製造するためのザクロとレッドクローバーとの複合抽出物の用途。
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