CN106456684A - 包含红三叶草和石榴的复合提取物作为有效成分的组合物的女性更年期改善用途 - Google Patents

包含红三叶草和石榴的复合提取物作为有效成分的组合物的女性更年期改善用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及含有石榴和红三叶草复合提取物的天然组合物及其多种用途，尤其是其在药学、食品学、化妆品学上的应用，该组合物在更年期症状改善效果、雌激素(estrogen)类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果以及骨质疏松症抑制效果等方面发挥协同作用，且不具有副作用。

Description

包含红三叶草和石榴的复合提取物作为有效成分的组合物的 女性更年期改善用途
技术领域
本发明涉及在多种用途中显示优异效果的天然组合物，更具体地，涉及在更年期症状改善方面显示优异效果的天然植物复合提取物。
本申请要求基于2014年4月17日申请的韩国专利申请第10-2014-0046185号和2015年4月17日申请的韩国专利申请第10-2015-0054547号的优先权，在这些韩国专利申请的说明书和附图中公开的所有内容通过引用并入本文。
背景技术
雌激素(estrogen)对子宫、阴道、骨骼肌和心血管系统等女性多种脏器显示必须的调节效果，主要担当异化作用和活化作用(Couse and Korach，1999；Korach等，1995)。因此女性绝经所伴随的雌激素不足会导致所谓的更年期障碍的多种临床症状(Turner等，1994；Versi等，2001)。
更年期障碍是统称女性绝经伴随的雌激素(estrogen)急剧减少引起的多种症状的术语(Dennerstein等，2002；Wolff等，2006)。为了改善更年期障碍，以往使用补充不足的雌激素的激素疗法(Greendale等，1998；Nichols等，1984)，但是长期使用时引发子宫癌、乳房癌、脑卒中和肺血栓栓塞症等多种副作用(Han等，2002；Beral等，2005；Kaari等，2006)，因此植物雌激素(phytoestrogen)作为其替代方案而受到关注(Knight和Eden，1996；Setchell，1998；del Giorno等，2010；Ateba等，2013)。已知植物雌激素结构上与雌激素类似，与雌激素受体ER-α及ER-β结合(Akiyama等，1987；Kuiper等，1997、Cornwell等，2004)，显示弱雌激素类似效果(Kuiper等，1997)，除了对女性绝经伴随的多种代谢症候群具有抑制效果(Taku等，2007)之外，还显示比较优异的骨量保存效果(Ma等，2008)。已知雌激素不足导致子宫和阴道等女性生殖器的明显萎缩(Versi等，2001；Ateba等，2013)，且在卵巢切除(OVX)引起的雌激素不足时也导致明显的子宫萎缩(Kawakita等，2009；Ateba等，2013)。
骨质疏松症是相比骨形成具有更显著的骨吸收特征的骨再造(remodeling)障碍，导致身体矿物质代谢障碍，显著增加骨折的代谢性疾病(Sakai等，1998)，尤其，骨关节周边的骨折会导致威胁生命的严重问题(Yamaguchi等，1999)。OVX大鼠在经手术后4～6周显示与女性绝经期之后引起的骨质疏松症极其类似的症状，因此有效利用于骨质疏松症治疗剂或骨保护物质的开发中(Kalu，1991；Wronski等，1991；Frost和Jee，1992)。尤其，美国食品药品管理局将OVX大鼠列为骨质疏松症治疗剂开发中必须的药效检索动物模型(US Foodand Drug Administration，1994)。骨重量减少直接与骨质疏松症进行过程引起的骨矿物质损失相关联(Yamamoto等，1998)，尤其碳化骨重量减少抑制用作对骨质疏松症具有治疗效果的直接证据(Puel等，2005；Xie等，2005)。已知骨钙蛋白(Osteocalcin)用作代表性的骨转换标志物(bone turnover marker)骨特异性碱性磷酸酶(bALP)含量为代表性的血中骨形成指标(Ke等，2004；Rissanen等，2008；Yang等，2011；Kuo等，2012)。通常随着骨质疏松症的发展，由于骨转换(bone turnover)的增加而导致血中骨钙蛋白(Osteocalcin)含量增加，由于骨形成抑制而血中bALP含量显著减少(Ismail等，1988；Ederveen和Kloosterboer，1999；Rissanen等，2008；Yang等，2011；Kuo等，2012)。已知骨矿物质密度(BMD)及骨强度是显示骨质的重要指标，骨质疏松症时与诱发原因无关地引发显著的骨密度及骨强度的减少(Bilston等，2002；Diez，2002；Syed和Khan，2002)。组织学检查提供最精确的骨形态学信息(Yamaguchi等，1999；Heikkinen等，2004)，随着骨质疏松症的发展，与骨量和骨形成相关的骨组织计量学因子(histomorphometrical index)显著减少，与骨吸收相关的因子增加(Heikkinen等，2004；Jakubas-Przewlocka等，2005)。在OVX大鼠中能够通过组织学方法确认显著的骨量及结构的减少和骨吸收活性增加，因此骨组织病理学检查一直以来提供着直接的药效评价标准(Glatt等，2004；Jakubas-Przewlocka等，2005)。
发明内容
技术问题
从而，本发明的目的在于提供一种含有石榴和红三叶草复合提取物的天然组合物及其多种用途，尤其是其在药学、食品学、化妆品学上的用途，该组合物在更年期症状改善方面发挥协同效果，且不具有副作用。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供一种含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的组合物。
作为一实施方式，本发明提供一种含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的更年期障碍改善用组合物。
此外，本发明提供一种改善更年期障碍的方法，包括：将含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的组合物给药至需要改善更年期障碍的对象。
此外，本发明提供石榴和红三叶草的复合提取物在更年期障碍改善用组合物制备中的用途。
在本发明中，以下为了避免对与“含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的更年期障碍改善用组合物”相关的内容进行重复记载，其内容在“包括将含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的组合物给药至需要改善更年期障碍的对象的步骤的改善更年期障碍的方法”及“石榴和红三叶草的复合提取物在更年期障碍改善用组合物制备中的用途”中同样适用。
红三叶草(Red clover，Trifolium pretense L)是豆科的多年生草本，也称为红车轴草、红兔子草、红三叶或金花菜。原产地为地中海沿岸和西南亚，为在全世界广泛分布和栽培的直立牧草。红三叶草还用作饲料，春天其嫩叶经焯水后还可以食用。已知红三叶草具有祛痰效果，对咳嗽和哮喘治疗有效。
红三叶草可以分为地上部分(aerial part)和地下部分，本发明优选利用红三叶草的地上部分提取物，但不限于此。
作为另一实施方式，红三叶草提取物可以优选使用水、碳原子数为1～4的低级醇或它们的混合物作为溶剂提取。
根据本发明的红三叶草提取物可以通过如下方法制备。例如，首先洗涤红三叶草，然后分离红三叶草的地上部分，优选添加水、碳原子数为1-4的低级醇或它们的混合物作为溶剂，在60℃～90℃和0.01MPa～0.5MPa下提取1～4小时，进行1～5次，但不限于此。
作为另一实施方式，本发明的组合物优选可以提供相对于总的红三叶草提取物含有50mg/g～150mg/g异黄酮的组合物，但不限于此。
石榴(Pomegranate，Punica granatum L)是亚洲西南部、印度西北部和美国加利福尼亚的野生植物，现已广泛分布在亚热带和热带各地。自古以来石榴尤其是红石榴被认为是强壮剂，特别是已知对高血压和动脉硬化的预防具有良好效果。此外，富含水溶性糖达38％～47％，且含有多种维生素和矿物质。
本发明中利用的石榴的种类不受特别限制，但是优选为红石榴，具体例可以为伊朗、加利福尼亚、台湾、乌兹别克斯坦、土耳其和韩国产的红石榴。根据本发明的石榴提取物根据所利用的石榴的产地和采摘时间等而可能有差异。
本发明提供不包含石榴果皮和种子的仅使用石榴果肉的提取物。石榴的果皮和种子可能会导致副作用，例如，石榴果皮中包含的特定生物碱(alkaloid)具有降低身体机能的作用，对呼吸系统和肌肉产生影响，可能会引发中毒时发作、痉挛、昏迷状态等。此外，服用石榴种子的提取物时部分人会发生作为过敏的舌头肿胀(tongue swellin)等副作用。
根据本发明的石榴提取物可以通过如下方法制备。例如，将石榴洗涤后，完全去除果皮和种子，添加果胶酶(pectinase)、蛋白酶(proteinase)、淀粉酶、纤维素酶等酶，分解石榴中含有的淀粉等多糖类。然后，选择性地添加明胶、二氧化硅、膨润土、硅溶胶(silicasol)、鞣质、纤维素、酪蛋白酸钾(casseinate)等添加剂，调节石榴提取物的浊度、颜色、粘度等，加热浓缩，从而制得石榴提取物，但不限于此。
作为另一实施方式，本发明的石榴提取物优选相对于总石榴提取物含有0.5mg/g～1mg/g的鞣花酸，但不限于此。
本发明的含有石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的更年期障碍改善用组合物相比石榴提取物或红三叶草提取物单独的更年期障碍改善效果显示显著高的效果，以小的给药量也显示出显著的效果。优选石榴提取物与红三叶草提取物的重量比可以为1:1～1:4；更优选石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1:1.5～1:2.5；进一步优选石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：2，但不限于此。
作为另一实施方式，本发明的组合物每100ml优选含有50mg～150mg的石榴和红三叶草的复合提取物。
作为另一实施方式，本发明的石榴和红三叶草的复合提取物优选含有30mg/g～100mg/g的异黄酮和0.15mg/g～0.4mg/g的鞣花酸；更优选石榴和红三叶草的复合提取物含有50mg/g～70mg/g的异黄酮和0.2mg/g～0.3mg/g的鞣花酸。
作为另一实施方式，优选地，本发明提供以如下为特征的组合物：所述更年期障碍示出选自由面部泛红、发汗、不眠症、神经过敏、抑郁症、眩晕症、缺乏集中力、关节痛、头痛、心悸、阴道干燥感、疲劳、兴奋、失眠、记忆丧失、忧愁和动脉粥样硬化组成的组中的一种以上更年期症状。
本发明中所述更年期障碍是指面部泛红、发汗、不眠症、神经过敏、抑郁症、眩晕症、缺乏集中力、关节痛、头痛、心悸、阴道干燥感、疲劳、兴奋、失眠、记忆丧失、忧愁或动脉粥样硬化等，但不限于此。
作为另一实施方式，优选所述更年期障碍改善用组合物可以对由更年期症状改善、抗肥胖、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨质疏松症抑制、肝保护和子宫保护组成的组中的一种以上具有效果。
作为另一实施方式，本发明提供含有上述组合物中的任意一种组合物的药物组合物。
根据本发明的药物组合物可以单独含有药学上有效量的石榴和红三叶草的复合提取物，或还可以包含一种以上的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。所述“药学上可接受的”是指生理学上允许的、向人体给药时不阻碍活性成分的作用，通常不会引起胃肠障碍、眩晕症等过敏反应或与其类似的反应的非毒性组合物。
所述载体、赋形剂或稀释剂的具体例可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等。此外，所述药物组合物还可以包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂或防腐剂等。
所述“药学上有效量”是指相比阴性对照组显示其以上的反应的量，优选指显示更年期障碍预防和/或治疗效果充分的量。
此外，本发明的药物组合物可以通过本领域公知的方法剂型化，从而给药于哺乳动物后提供活性成分的迅速、持续或延迟释放。剂型可以是粉末、颗粒、片剂、乳剂、糖浆、喷雾剂、软质或硬质明胶胶囊、灭菌注射用液、灭菌粉末的形态。
本发明的药物组合物的给药途径可以为口服或非口服给药，但不限于此。非口服给药途径可以包括例如经皮、鼻腔、腹腔、肌肉、皮下或静脉等多种途径。
此外，本发明的药物组合物可以与具有更年期障碍预防和/或治疗效果的公知化合物并用给药。
作为另一实施方式，本发明提供一种含有上述组合物中的任意一种组合物的食品组合物。
本发明的食品组合物包括食品、功能性食品(functional food)、营养辅助剂(nutritional supplement)、健康食品(health feed)和食品添加剂(food additives)等所有天然材料的加工形态。所述类型的食品组合物可以通过本领域公知的通常的方法制造为多种形态。
例如，健康食品可以是将石榴及红三叶草的复合提取物本身制造为茶、果汁和饮料的形态而饮用，或者进行颗粒化、胶囊化或粉末化而摄取。此外，在不阻碍本发明的目的的范围内，除了本发明的石榴和红三叶草复合提取物之外，还可以单独或混合地含有白芍药、山茱萸、刺五加皮、灵芝、陈皮、草杜仲、当归、栀子、黄芪、麦芽、枳实、维生素C、低聚果糖、甜菊苷、纯化水、麦芽糊精等，但本发明的食品组合物额外可含有的其他药效成分和/或添加剂不限于上述例子。
例如，根据本发明的食品组合物可以含有如硫胺素(维生素B1)、核黄素、抗坏血酸、烟酸和维生素B6的水溶性维生素；可以含有肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚麻酸等脂肪酸；可以含有乙醇酸和醋酸等弱酸成分；可以含有例如苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及赖氨酸的人体必需8种氨基酸之外，还可以含有天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等氨基酸。
作为另一实施方式，本发明提供含有上述组合物中的任意一种组合物的化妆品组合物。
本发明的化妆品组合物含有的成分，除了作为有效成分的石榴和红三叶草的复合提取物之外，含有化妆品组合物中通常利用的成分，例如包括：抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等通常的辅助剂；及载体。
根据本发明的化妆品可以制造为本领域通常制造的任何剂型。例如，可以剂型化为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜、乳液、粉、香皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉状粉底、乳状粉底、蜡状粉底和喷雾等，但不限于此。
更具体地，可以制造为柔润化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华、眼霜、洁面霜、洁面泡沫、洁面水、面膜、喷雾或粉的剂型。
本发明的剂型为溶液或乳剂时，载体成分利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如可以是水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨醇酐脂肪酸酯。
本发明的剂型为悬浮液时，载体成分可以利用例如水、乙醇或丙二醇的液状稀释剂；例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯山梨坦酯的悬浮剂；微晶纤维素；偏氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄蓍胶等。
本发明的剂型为含表面活性剂的清洁剂时，载体成分可以利用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉盐衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
本发明的剂型为粉或喷雾时，载体成分可以利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉，尤其在喷雾时，还可以包括含氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。
本发明的剂型为糊剂、霜或凝胶时，载体成分可以利用动物性油、植物性油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
作为另一实施方式，优选红三叶草提取物可以为红三叶草提取粉末。
作为另一实施方式，优选石榴提取物可以为石榴提取粉末。
所述“粉末”是指例如冷冻干燥粉末或干燥粉末，但不限于此。
作为另一实施方式，本发明提供一种提高更年期障碍改善效果的方法，该方法包括将红三叶草提取物和石榴提取物混合，使得石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：1～1：4；优选使得石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：1.5～1：2.5；更优选使得石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：2。
作为另一实施方式，本发明提供更年期症状改善用石榴和红三叶草的复合提取物的制备方法，该方法包括：步骤S1在石榴果肉中添加淀粉分解酶并且加热浓缩，以制备石榴果肉提取物；步骤S2在红三叶草的地上部分中添加水、碳原子数为1～4的低级醇或它们的混合物作为溶剂，以制备红三叶草地上部分提取物；以及步骤S3将石榴果肉提取物和红三叶草地上部分提取物混合并搅拌。
本发明中，上述步骤S1中，淀粉分解酶可以包括例如果胶酶(pectinase)、蛋白酶(proteinase)、淀粉酶及纤维素酶等酶，但不限于此。
作为另一实施方式，优选地，在所提供的用于更年期症状改善的石榴及红三叶草复合提取物的制备方法中，在对所述红三叶草地上部分提取物进一步加热浓缩后，添加多糖类并进行干燥，从而以红三叶草地上部分提取粉末在步骤S3中混合。
作为另一实施方式，优选地，在所提供的用于更年期症状改善的石榴及红三叶草复合提取物的制备方法中，向所述石榴果肉提取物进一步添加多糖类并进行干燥，从而以石榴果肉提取粉末在步骤S3中混合。
发明效果
根据本发明，可以提供含有石榴和红三叶草复合提取物的天然组合物，该组合物具有示出选自由更年期症状改善、抗肥胖、高脂血症抑制、脂肪肝抑制以及骨质疏松症抑制、肝保护及子宫保护所构成的组中的一种以上的效果的协同的更年期症状改善效果，且不具有副作用。
附图说明
图1示出为了利用OVX大鼠试验包括红三叶草提取物和石榴提取物的复合物的协同效果的实验计划表。
图2示出大鼠的观察到组织病理学变化的部位。
图3的左侧示出骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)测定装置，右侧示出利用双能X射线骨密度仪(dual-energy x-ray absorptionmetry)(诺兰德(Norland)公司的pDEXA；阿特金森堡、威斯康星州、美国)检出的右侧大腿骨(femur)的整体(total(T))、骺(epiphyseal(E))及骨干((diaphyseal，(中段；M)区域、胫骨(tibia)和L5全区域的图。
图4示出骨强度测定装置，骨强度通过FL(破坏载荷，failure load)测定。
图5示出在假手术对照组或OVX大鼠中摘取的左侧腹壁蓄积的脂肪。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。
图6示出在假手术对照组或OVX大鼠中摘取的子宫。
从左上侧开始为从A至G，A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。
图7示出OVX大鼠的血清中的雌二醇(estradiol)的数值。a p<0.01:按照MW检验与假手术对照组比较；b p<0.01:按照MW检验与OVX对照组比较；c p<0.01和d p<0.05:按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；e p<0.01:按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图8示出OVX大鼠的血清中的骨钙蛋白的数值。a p<0.01和b p<0.05:按照LSD检验与假手术对照组比较；c p<0.01和d p<0.05:按照LSD检验与OVX对照组比较；e p<0.01和fp<0.05:按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；g p<0.01:按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图9示出OVX大鼠的血清中的bALP的数值。a p<0.01和b p<0.05:按照MW检验与假手术对照组比较；c p<0.01和d p<0.05:按照MW检验与OVX对照组比较；e p<0.01和f p<0.05:按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；g p<0.01:按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图10示出OVX大鼠的大腿骨(Femur)强度。a p<0.01和b p<0.05:按照LSD检验与假手术对照组比较；c p<0.01:按照LSD检验与OVX对照组比较；d p<0.01和e p<0.05:按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；f p<0.01和g p<0.05:按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图11示出胫骨强度。a p<0.01和b p<0.05:按照MW检验与假手术对照组比较；c p<0.01和d p<0.05:按照MW检验与OVX对照组比较；e p<0.01:按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；f p<0.01:按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图12示出在假手术对照组或OVX大鼠背腹肌的腹部脂肪中摘取的脂肪细胞的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。
图13示出从假手术对照组或OVX大鼠摘取的左侧子宫角(horn)的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。L是内腔(Lumen)；MU是粘膜(Mucosa)；ML是肌层(Muscular layer)；Ep是上皮(Epithelium)；UG是子宫腺(Uterinegland)。
图14示出从假手术对照组或OVX大鼠摘取的左侧肝叶(lobe)的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。CV是中央静脉(Central vein)；PT是肝门三联(Portal Triad)。
图15示出从假手术对照组或OVX大鼠摘取的大腿骨的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。Cb是皮质骨(cortical bone)；Tb是小梁骨(trabecular bonem)；Bm是骨髓(bone marrow)；Gp是生长板(growth Plate)。
图16示出从假手术对照组或OVX大鼠摘取的胫骨的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。Cb是皮质骨(cortical bone)；Tb是小梁骨(trabecular bonem)；Bm是骨髓(bone marrow)；Gp是生长板(growth Plate)。
图17示出从假手术对照组或OVX大鼠摘取的L4的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是红三叶草提取物40mg/kg给药组；D是石榴提取物20mg/kg给药组；E是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)60mg/kg给药组。Cb是皮质骨(cortical bone)；Tb是小梁骨(trabecular bonem)；Bm是骨髓(bone marrow)；Gp是生长板(growth Plate)。
图18示出为了利用OVX小鼠试验取决于包括红三叶草提取物和石榴提取物的复合物的比率的协同效果的实验计划表。
图19示出小鼠的观察到组织病理学变化的部位。
图20示出骨矿物质密度(bone mineral density，BMD)测定装置(左侧及中央，韩国城南Medikors公司的nAlyzer)及利用其拍摄的照片(右侧)。
图21示出骨强度测定装置(SV-H1000，日本计测系统有限公司(JapanInstrumentation System Co.,Ltd))，骨强度时通过FL(破坏载荷，failure load)测定。
图22是示出假手术对照组(Sham-operated)或OVX ddY小鼠模型中的体重变化的表。
图23示出假手术对照组或OVX ddY小鼠模型的腹腔内蓄积的腹部脂肪垫的代表总(gross)照片。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。(比例尺＝11mm)。
图24示出假手术对照组或OVX ddY小鼠模型的子宫的代表总(gross)照片。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。(比例尺＝11mm)。
图25示出假手术对照组或OVX ddY小鼠血清中的雌二醇(estradiol)的数值。a p<0.01:按照MW检验与假手术对照组比较；b p<0.01:按照MW检验与OVX对照组比较；c p<0.01：按照MW检验与红三叶草提取物单一组合物处理组比较；及d p<0.01:按照MW检验与石榴提取物单一组合物处理组比较。(E2为17β-雌二醇)
图26示出假手术对照组或OVX ddY小鼠血清中的骨钙蛋白的数值。a p<0.01和b p<0.05:按照MW检验与假手术对照组比较；c p<0.01:按照MW检验与OVX对照组比较；d p<0.01：按照MW检验与红三叶草提取物单一组合物处理组比较；及e p<0.01:按照MW检验与石榴提取物单一组合物处理组比较。
图27示出假手术对照组或OVX ddY小鼠血清中的bALP的数值。a p<0.01:按照LSD检验与假手术对照组比较；b p<0.01和c p<0.05:按照LSD检验与OVX对照组比较；d p<0.01和e p<0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；f p<0.01和g p<0.05:按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较。
图28和图29示出假手术对照组或OVX ddY小鼠的双能X射线骨密度仪(DEXA)照片。示出模型的腹腔内蓄积的腹部脂肪垫的代表总(gross)照片。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。
图30示出假手术对照组或OVX ddY小鼠的大腿骨(Femur)强度(破坏载荷，骨强度)。a p<0.01和b p<0.05:按照MW检验与假手术对照组比较；c p<0.01和d p<0.05:按照MW检验与OVX对照组比较；e p<0.01和f p<0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较；及g p<0.01和h p<0.05:按照MW检验与石榴提取物单40mg/kg给药组比较。
图31和图32示出假手术对照组或OVX ddY小鼠腹部脂肪的脂肪细胞的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。(比例尺＝120μm)
图33和图34示出从假手术对照组或OVX ddY小鼠摘取的左侧子宫角(horn)的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。L是内腔(Lumen)；MU是粘膜(Mucosa)；ML是肌层(Muscularlayer)；Ep是上皮(Epithelium)；UG是子宫腺(Uterine gland)。(比例尺＝120μm)
图35和图36示出从假手术对照组或OVX ddY小鼠摘取的左侧肝叶(lobe)的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。CV是中央静脉(Central vein)；PT是肝门三联(PortalTriad)。(比例尺＝120μm)
图37和图38示出从假手术对照组或OVX ddY小鼠摘取的左侧大腿骨的组织学图像。A是假手术对照组；B是OVX对照组；C是给药17β-雌二醇0.03μg/只的OVX小鼠；D是红三叶草提取物120mg/kg给药组；E是石榴提取物120mg/kg给药组；F是红三叶草提取物：石榴提取物为1:1的复合物(g/g)120mg/kg(60:60mg/kg)给药组；G是红三叶草提取物：石榴提取物为1:2的复合物(g/g)120mg/kg(40:80mg/kg)给药组；H是红三叶草提取物：石榴提取物为1:4的复合物(g/g)120mg/kg(24:96mg/kg)给药组；I是红三叶草提取物：石榴提取物为1:6的复合物(g/g)120mg/kg(17:103mg/kg)给药组；J是红三叶草提取物：石榴提取物为1:8的复合物(g/g)120mg/kg(13:107mg/kg)给药组；K是红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合物(g/g)120mg/kg(80:40mg/kg)给药组；L是红三叶草提取物：石榴提取物为4:1的复合物(g/g)120mg/kg(96:24mg/kg)给药组；M是红三叶草提取物：石榴提取物为6:1的复合物(g/g)120mg/kg(103:17mg/kg)给药组；N是红三叶草提取物：石榴提取物为8:1的复合物(g/g)120mg/kg(107:13mg/kg)给药组。Cb是皮质骨(cortical bone)；Tb是小梁骨(trabecularbonem)；Bm是骨髓(bone marrow)；Gp是生长板(growth Plate)。(比例尺＝240μm)
具体实施方式
下面，为了帮助理解本发明，通过制备例和实施例进行详细说明。但是根据本发明的制备例和实施例可以变更为其他多种形态，不应当解释为本发明的范围由下列制备例和实施例限定。本发明的制备例和实施例是为了向本领域的普通技术人员更完整地说明本发明而提供的。
[0.含有红三叶草提取物及石榴提取物的复合物的制备方法]
(1)红三叶草提取物的制备
首先洗涤红三叶草。仅分离红三叶草的地上部分(aerial part)，准备了总重量为80kg～120kg的红三叶草地上部分。以相对于红三叶草重量的约3倍的重量添加70％的乙醇，在75℃～80℃和0.05MPa下，经2.5小时提取2～3次，从而获得红三叶草提取物300kg。通过固液分离(Solid/liquid seperation)工艺进行分离，然后用100目(mesh)过滤。将过滤的红三叶草提取物在70℃和0.06MPa下，加热浓缩6小时，从而获得红三叶草浓缩提取物25kg。在浓缩物中添加麦芽糖糊精0kg-1kg，喷雾干燥，用8目粉碎，从而获得含有10％异黄酮的红三叶草提取物粉末10kg。
(2)石榴提取物制备
首先将1000kg石榴的杂质去除，分离破碎的石榴并洗涤。切割分类的果子并去除果皮，压榨分离种子，从而获得了450kg的石榴果肉。过滤后，在100℃～105℃下杀菌60秒，再冷却至48℃～55℃。向每1000L的石榴汁加入70ml～100ml的果胶酶，在48℃～55℃下经30分钟分解淀粉。然后为了维持浊度和颜色、生成有利于服用的粘度等，向每10000L的石榴汁中加入900g的膨润土，在48℃～55℃下搅拌10分钟。此后以1.5mm和1mm真空过滤，加热浓缩(依次为，在80℃、475mbar下，加热浓缩至12百利度(brix)；在87℃、626mbar下，加热浓缩至17brix；在95℃、847mbar下，加热浓缩至31brix；在70℃、312mbar下，加热浓缩至43brix；以及在49℃、118mbar下，加热浓缩至65brix)，再次以0.15mm过滤，从而获得含有1.8mg/g～3.0mg/g鞣花酸的石榴浓缩液。然后，将上述石榴浓缩液与糊精混合后通过喷雾干燥(spraydry)工艺，制备了含有0.5mg/g～1.0mg/g鞣花酸的石榴浓缩粉末。
(3)红三叶草和石榴复合提取物的制备
将上述制备的红三叶草提取粉末40kg(含有10％异黄酮)和石榴提取粉末20kg(含有0.8mg/g鞣花酸)混合并搅拌，最终获得60kg的红三叶草和石榴复合提取物(含有66.7mg/g的异黄酮、0.26mg/g鞣花酸)。
[1.取决于红三叶草提取物和石榴提取物的组合的效果]
红三叶草提取物和石榴提取物以特定比例组合时，预期根据异黄酮(isoflavonoid)的不同变化而带来显著的协同效果，由此计划了实验。
本发明中根据石榴提取物添加的红三叶草提取物对更年期障碍的生理活性提升效果，利用卵巢切除(Ovariectomy，OVX)大鼠模型来进行评价。即，OVX28天后开始，将红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg溶解或稀释于灭菌蒸馏水中，以5ml/kg的用量每日口服给药1次，给药84天(12周，3个月)，区分为雌激素类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果和骨质疏松症的抑制效果5个药理效果，进行了评价。
为了评价雌激素类似效果和抗肥胖效果，分别评价了体重及体重增加量；水和饲料摄取量；尿量及粪便排泄量；血清中雌二醇(estradiol)含量；腹部蓄积脂肪和子宫的重量变化；腹部蓄积脂肪的厚度和平均脂肪细胞直径；子宫整体、上皮和粘膜的厚度以及粘膜内子宫腺所占的比例变化。此外，测定肝重量、血清中天冬氨酸转氨酶(Aspartateaminotransferase，AST)和丙氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)的含量、显示平均肝细胞直径和脂肪变化的肝变性部位的变化，从而评价对于脂肪肝的肝保护效果；高脂血症改善效果通过血中总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)及甘油三酯(TG)的含量变化来评价；为了评价骨质疏松症改善效果，即骨保护效果，分别测定大腿骨、胫骨和腰椎骨的湿、干燥和碳化重量，骨密度(BMD)(图3)，骨强度(图4)，血中骨钙蛋白(osteocalcin)及骨特异性碱性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase，bALP)的含量，针对骨量和结构以及骨吸收的组织病理学变化。将本实验中红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的结果与分别给药红三叶草提取物40mg/kg和石榴提取物20mg/kg的大鼠的结果进行比较而评价。
实施例1-1：实验动物和实验方法
(1)实验动物
使用雌性未交配的斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley，SD)大鼠(6周龄，韩国城南OrientBio公司)，本实验的所有实验动物均按照大邱韩医大学实验动物伦理委员会的动物伦理标准来处理，在事先获得批准的前提下实施了实验(批准号：DHU2013-042)。
(2)实验方法
分组(总7个组，每组8只)后进行实验(表1和图1)。
即，分为假手术对照组(Sham control)、OVX对照组、OVX术后红三叶草干燥提取物单独组合物40mg/kg给药组、OVX术后石榴提取物单独组合物20mg/kg给药组、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组、以及OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物60mg/kg给药组，进行实验。
将适量红三叶草提取物、石榴提取物或红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物悬浮或溶解于灭菌蒸馏水中，以5ml/kg的用量，从OVX 28日后开始，每日1次口服给药，持续84天。即，红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg及60mg/kg分别口服给药84天，在假手术对照组(Shamcontrol)、OVX对照组中，仅以相同的用量口服给药作为介质的灭菌蒸馏水代替实验物质，持续相同的时间(表1)。
[表1]
OVX＝两侧卵巢切除手术(Bilateral ovariectomy)
PCP＝石榴提取物(Pomegranate Concentrate Powder)
RC＝红三叶草干燥提取物(Red clover dry extract)
为了通过OVX诱发更年期障碍，如下进行实验。
即，除了假手术对照组的所有实验动物随机选择，完全去除两侧卵巢，诱发骨质疏松症。另外，假手术组中以相同方法确认两侧卵巢后，不进行去除，重新缝合腹腔。包括假手术组的所有实验动物在手术28天后，以体重(OVX大鼠：323.81±4.77g、304-354g；假手术大鼠：253.25±9.08g、240-265g)为基准，每组选定8只，用于实验。
对更年期障碍的效果分为雌激素(estrogen)类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果和对骨质疏松症的抑制效果5种药理效果，进行评价。
更具体地，抗肥胖和雌激素类似效果，如下进行实验。分别在OVX手术日、给药前1天(OVX 27日后)、给药开始日、从给药开始第一天到最后处死日为止最少每周1次记录体重，测定OVX后恢复期(更年期障碍诱发期)和给药开始后12周期间的体重变化量，即体重增加量。观察水和饲料摄取量、尿量和粪便排泄量(给药开始后第28日、49日及83日)、血清中雌二醇(estradiol)含量、腹部蓄积脂肪和子宫的重量、子宫及腹部蓄积脂肪的组织病理学变化(腹部蓄积脂肪的厚度和平均脂肪细胞的直径、子宫整体、上皮和粘膜的厚度以及粘膜内子宫腺所占的比例变化)。
此外，为了确认对于脂肪肝的保护效果，如下进行实验。观察肝重量、血清中AST和ALT含量、肝的组织病理学变化(显示平均肝细胞直径和脂肪变化的肝变性部位的变化)。
高脂血症的抑制效果通过血中TC、LDL、HDL和TG含量变化确认。
骨质疏松症改善效果通过对大腿骨、胫骨和腰椎骨的湿、干燥及碳化重量；BMD(图3)；骨强度；血中骨钙蛋白(osteocalcin)及bALP含量；骨量及结构(小梁骨量、小梁骨数、厚度、长度、皮质骨厚度)和骨吸收(破骨细胞数和破骨细胞面积(OS/BS)的组织病理学变化，进行确认。
实施例1-2：体重及体重增加量的变化
OVX手术28天后，仅选定相比假手术对照组显示显著的体重增加的实验动物使用(OVX大鼠：323.81±14.77g，304-354g；假手术大鼠：253.25±9.08g，240-265g)，在所有OVX手术组中确认相比假手术对照组具有显著性(p＜0.01)的体重以及OVX后诱发期4周期间的体重增加量的增加；但在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组中，从给药开始49日开始，才确认相比OVX对照组具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重的减少；在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物60mg/kg给药组中，分别从给药开始56、63和70日后开始，才确认相比OVX对照组具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重的减少。此外，所有实验物质给药组中，相比OVX对照组具有显著性(p＜0.01)的给药期间84日期间，显示体重增加量的减少。尤其是，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组中，相比各红三叶草提取物40mg/kg和石榴提取物20mg/kg给药组，从给药开始77日起确认有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重减少；在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg及60mg/kg给药组中，相比各红三叶草提取物40mg/kg和石榴提取物20mg/kg给药组，在给药期间84日期间确认有显著性(p＜0.01)的体重增加量的减少。
[表2]
*所有动物在夜间禁食。
ap＜0.01：按照最小显著差异(LSD)检验与假手术对照组比较
bp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
cp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
dp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
ep＜0.01：按照MW检验与假手术对照组比较
fp＜0.01：按照MW检验与OVX对照组比较
gp＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
hp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药期间体重增加量显示96.55％的变化，在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg的给药组中，相比OVX对照组，分别显示-23.64％、-23.00％、-38.90％和-31.87％的变化。
实施例1-3：饲料摄取量的变化
在OVX对照组中，在给药开始第28日、49日和83日分别确认到相比假手术对照组具有显著性(p＜0.01)的饲料摄取量的增加；相比OVX对照组，与红三叶草提取物、石榴提取物、和红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物给药相关的饲料摄取量的变化在测定日第28日、49日和83日没有被确认到；与红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组相比，在所有用量的所有红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物给药组中，没有确认到有显著性的饲料摄取量变化(表3)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药开始第28日、49日和83日的饲料摄取量分别显示30.53％、32.50％和37.35％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg、60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，在给药开始第28日分别显示了-5.60％、-6.48％、-8.86％、-3.17％的饲料摄取量的变化，在给药开始第49日分别显示了0.68％、-7.11％、-8.95％和5.94％的变化，在给药开始第83日分别显示了-1.40％、-0.98％、-1.77％及4.57％的变化。
[表3]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
dp＜0.01和ep＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
实施例1-4：水摄取量的变化
在OVX对照组中，在给药开始第28日、49日和83日分别确认到相比假手术对照组具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的水摄取量的增加；相比OVX对照组，与红三叶草提取物、石榴提取物、和红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物给药相关的水摄取量的变化在测定日第28日、49日和83日没有被确认到；仅在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组中，局限于给药开始83日后，确认到相比石榴提取物20mg/kg给药组具有显著性(p＜0.05)的水摄取量的减小之外，在所有用量的所有红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物给药组中，与红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组相比，没有确认到有显著性的水摄取量变化(表3)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药开始第28日、49日和83日的水摄取量分别显示24.77％、32.09％和40.31％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，在给药开始第28日分别显示了4.12％、8.24％、5.99％、14.98％的水摄取量的变化，在给药开始第49日分别显示了-5.63％、-3.32％、-5.88％和4.60％的变化，在给药开始第83日分别显示了-1.10％、14.92％、-8.56％及11.60％的变化。
实施例1-5：尿量的变化
在OVX对照组中，在作为测定日的给药开始第28日、49日和83日没有确认到相比假手术对照组有意义的尿量变化水摄取量的增加，然而，相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的(g/g)复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，在作为测定日的给药开始第28日、49日和83日分别显示了具有显著性(p＜0.01)的尿量增加；尤其是相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在所有测定日确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的尿量增加(表4)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药开始第28日、49日和83日的尿量分别显示1.61％、4.35％和11.99％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，在给药开始第28日分别显示了5.82％、-1.59％、80.95％、65.08％的尿量的变化，在给药开始第49日分别显示了53.33％、33.33％、115.83％、82.08％的变化，在给药开始第83日分别显示了36.70％、34.25％、163.00％及115.29％的变化。
[表4]
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01和cp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01和ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
fp＜0.01和gp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
mp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
hp＜0.01和ip＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
jp＜0.01和kp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
lp＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
实施例1-6：粪便排泄量的变化
在OVX对照组中，在作为测定日的给药开始第28日、49日和83日分别示出相比假手术对照组没有显著性的轻微的粪便排泄量增加；相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组中，分别在给药开始第49日和83日显示了显著(p＜0.01或p＜0.05)的粪便排泄量的增加；相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物60mg/kg给药组中，分别在作为测定日的给药开始第28日、49日和83日显示了显著(p＜0.01或p＜0.05)的粪便排泄量的增加；尤其是相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，在给药开始第49日和83日确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的粪便排泄量的增加。在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药开始第28日、49日和83日的粪便排泄量分别显示13.29％、26.96％和25.76％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，在给药开始第28日分别显示了28.46％、7.87％、25.15％、33.63％的粪便排泄量的变化，在给药开始第49日分别显示了42.80％、39.56％、90.16％、77.55％的变化，在给药开始第83日分别显示了35.89％、32.54％、60.58％及57.03％的变化(表4)。
实施例1-7：腹部蓄积脂肪重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组分别确认到有显著性(p＜0.01)的左侧腹壁蓄积脂肪的绝对重量增加和相对于体重的相对重量的增加，然而，相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的腹部脂肪重量的减少。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认到具有显著性(p＜0.01)的腹部脂肪重量的减少(表5，图5)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，左侧腹壁蓄积脂肪的绝对重量和相对于体重的相对重量的分别显示307.47％和183.68％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-40.94％、-36.38％、-64.82％、-55.77％的绝对重量的变化，且分别显示-35.49％、-30.82％、-59.59％、-50.86％的腹部脂肪相对重量的变化。
[表5]
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
ep＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
fp＜0.01和gp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
hp＜0.01和ip＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
jp＜0.01和kp＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
lp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
实施例1-8：子宫重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组分别确认到有显著性(p＜0.01)的子宫绝对重量减小和相对于体重的相对重量的减小；相比OVX对照组，在包括红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的所有实验物质给药组中，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的子宫重量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的子宫重量的增加(表5，图6)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，子宫绝对重量和相对于体重的相对重量分别显示-87.37％和-91.35％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了26.76％、23.39％、66.36％、52.75％的绝对重量的变化，且分别显示38.78％、33.80％、91.02％、70.17％的子宫相对重量的变化。
实施例1-9：肝重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的肝相对重量的减少；相比OVX对照组，在包括红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的所有候选物质给药组中，分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的肝相对重量的增加。尤其是，相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的肝绝对重量的增加；相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的肝绝对重量和相对重量的增加(表5)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，肝绝对重量和相对于体重的相对重量分别显示-0.03％和-30.91％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了4.18％、3.96％、14.99％、15.49％的肝绝对重量的变化，且分别显示13.95％、12.75％、32.21％、28.83％的肝相对重量的变化。
实施例1-10：骨重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的相对于体重的大腿骨、胫骨和腰椎骨(L5)的湿/干燥相对重量减少以及大腿骨、胫骨和L5碳化绝对重量和相对重量的减少；但是在包括石榴提取物20mg/kg的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，确认到显著的骨湿/干燥相对重量的增加，分别确认了碳化骨相对重量和绝对重量的具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也显示了显著的骨湿重量的增加，并分别确认到有显著性的(p＜0.01或p＜0.05)骨干燥/碳化骨绝对重量和相对重量的增加(表6-表8)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨的湿、干和碳化骨的相对于体重的相对重量分别显示了-29.34％、-31.02％和-42.92％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了7.81％、12.49％、17.16％、14.78％的湿相对重量的变化，且分别显示12.82％、11.11％、29.59％、24.58％的干燥骨相对重量的变化；分别显示了25.36％、29.70％、53.23％、42.77％的碳化大腿骨相对重量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，胫骨的湿、干和碳化骨的相对于体重的相对重量分别显示了-27.38％、-32.82％和-44.13％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了7.22％、9.78％、22.73％、18.15％的湿相对重量的变化，且分别显示13.83％、19.44％、36.30％、29.55％的干燥骨相对重量的变化；分别显示了30.03％、32.77％、62.18％、50.77％的碳化胫骨相对重量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，L5的湿、干和碳化骨的相对于体重的相对重量分别显示了-29.62％、-34.86％和-44.49％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了6.91％、10.84％、34.79％、27.46％的湿相对重量的变化，且分别显示15.82％、15.44％、42.68％、31.84％的干燥骨相对重量的变化；分别显示了26.19％、18.74％、48.36％、39.84％的碳化L5相对重量的变化。
[表6]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
[表7]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
[表8]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
kp＜0.01和lp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
mp＜0.01和np＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
op＜0.01和pp＜0.05：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
实施例1-11：血液生物化学变化(1)：AST、ALT、TC、LDL、HDL和TG
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸转氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)及甘油三酯(TG)含量增加以及有显著性(p＜0.05)的高密度脂蛋白(HDL)HDL(Hight density lipoprotein)含量减少；但在所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中AST、ALT、TC、LDL和TG含量的减少，并确认到血中HDL含量的增加。尤其是，相比OVX对照组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认了具有显著性(p＜0.01)的血中HDL含量的增加；相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中AST、ALT、TC、LDL和TG含量的减少以及血中HDL含量的增加(表9)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中AST和ALT含量分别显示77.03％和72.53％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-14.50％、-12.10％、-31.63％、-25.80％的AST含量的变化，且分别显示-20.70％、-16.77％、-34.93％、-29.30％的血中ALT含量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中TC和LDL含量分别显示105.00％和163.08％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-24.00％、-20.98％、-40.39％、-36.78％的TC含量的变化，且分别显示-22.37％、-24.56％、-44.30％、-39.62％的血中LDL含量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中HDL和TG含量分别显示-18.62％和121.81％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了5.88％、13.73％、52.92％、41.83％的HDL含量的变化，且分别显示-27.51％、-24.69％、-42.68％、-36.92％的血中TG含量的变化。
[表9]
实施例1-12：血液生物化学变化(2)：雌二醇(Estradiol)
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中雌二醇(estradiol)含量的减少；但在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.0或p＜0.05)的血中雌二醇(estradiol)含量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中雌二醇(estradiol)含量的增加(图7)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中雌二醇(estradiol)含量显示-86.58％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了165.55％、141.18％、307.56％和247.90％的血中雌二醇(estradiol)的含量变化。
实施例1-13：血液生物化学变化(3)：骨钙蛋白和bALP
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中血中骨钙蛋白含量的增加以及具有显著性(p＜0.01)的bALP含量的减少，然而，与OVX对照组相比，在所有候选物质给药组中，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中骨钙蛋白含量的减少以及血中bALP含量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中骨钙蛋白含量的减少以及血中bALP含量的增加(图8和图9)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中骨钙蛋白含量和bALP含量分别显示69.33％和-49.94％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-17.75％、-13.83％、-31.27％、-27.36％的血中骨钙蛋白的含量变化，并分别显示了26.37％、21.16％、64.38％、47.53％的血中bALP含量的变化。
实施例1-14：骨密度的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到大腿骨和胫骨整体、颈部和中段(mid-shaft)部位的骨密度与L4(第四腰椎，fourth lumbar vertebrae)整体骨密度一同显著(p＜0.01)减少；相反，在所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，在上述所有测定部位中确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的骨密度增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，在上述所有测定部位中也分别确认到显著的骨密度增加(表10)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，大腿骨整体、颈部和中段(mid-shaft)部位的骨密度分别显示-18.42％、-20.06％和-16.44％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了5.67％、5.46％、14.64％、11.13％的整体骨密度的变化；显示9.33％、6.65％、22.12％、16.77％的颈部骨密度的变化；分别显示了7.94％、5.81％、16.47％、13.51％的中段(mid-shaft)的骨密度变化。
在OVX对照组中，相比正常对照组，胫骨整体、颈部和中段(mid-shaft)部位的骨密度分别显示-22.65％、-20.24％和-28.62％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了8.92％、6.75％、19.28％、16.75％的整体骨密度的变化；显示了8.39％、6.45％、18.71％、14.95％的颈部骨密度的变化；分别显示了13.22％、11.01％、30.21％、19.38％的中段(mid-shaft)骨密度的变化。
在OVX对照组中，相比正常对照组，L4整体部位的骨密度显示-21.38％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了9.60％、7.43％、18.74％、15.20％的变化。
[表10]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
kp＜0.01和lp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
mp＜0.01和np＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
op＜0.01和pp＜0.05：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
实施例1-15：骨强度的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到大腿骨和胫骨的中段(mid-shaft)部位的骨强度显著性(p＜0.01)减少；相反，在包括3种用量的红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨和胫骨骨强度的增加。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，在大腿骨和胫骨的中段(mid-shaft)部位分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的骨强度的增加(图10和图11)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨和胫骨的中段(mid-shaft)部位的骨强度显示-51.06％和-53.22％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了51.66％、48.93％、87.20％、78.09％的大腿骨中段部位的骨强度的变化，且分别显示了26.38％、24.75％、80.90％、50.49％的胫骨中段部位的骨强度的变化。
实施例1-16：组织病理学变化(1)：腹壁蓄积脂肪、子宫及肝
(1)腹壁蓄积脂肪
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认了由于腹部脂肪的腹壁蓄积显著增加引起的腹壁蓄积脂肪厚度的具有显著性(p＜0.01)的增加以及脂肪细胞平均直径的具有显著性(p＜0.01)的增加；然而，在所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认了具有显著性(p＜0.01)的腹壁蓄积脂肪及脂肪细胞直径的减少。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的脂肪的腹壁蓄积以及脂肪细胞肥大现象的抑制(表11和图12)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，腹壁蓄积脂肪厚度和脂肪细胞平均直径分别显示122.59％和92.49％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-21.82％、-18.61％、-43.66％、-35.33％的腹壁蓄积脂肪厚度的变化；分别显示了-25.72％、-19.19％、-37.39％、-35.67％的脂肪细胞平均直径的变化。
(2)子宫
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到以显著的子宫粘膜的减少为表现的不溶性萎缩，从而确认了子宫的整体、上皮及粘膜厚度以及粘膜内子宫腺所占比例的具有显著性(p＜0.01)的减少；但在所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认了具有显著性(p＜0.01)的子宫的整体、上皮及粘膜厚度以及粘膜内子宫腺所占比例的增加；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的对子宫的不溶性萎缩现象的组织病理学上的抑制(表11和图13)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，子宫的整体和上皮的平均厚度分别显示-83.08％和-74.62％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了62.99％、34.94％、167.13％、102.53％的子宫整体平均厚度的变化；并分别显示73.09％、96.22％、148.66％、133.62％的子宫上皮平均厚度的变化。
在OVX对照组中，相比正常对照组，子宫粘膜的平均厚度和粘膜内子宫腺所占比例分别显示-81.70％和-83.16％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了56.88％、47.96％、174.02％、137.75％的子宫粘膜平均厚度的变化；并分别显示91.41％、127.57％、314.70％、264.53％的子宫内子宫腺所占比例的变化。
(3)肝
在OVX对照组中，相比假手术对照组，导致了以显著的肝细胞内脂肪蓄积引起的肥大为特征的肝脂肪病症，从而确认了肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径的具有显著性(p＜0.01)的增加；但在包括红三叶草提取物40mg/kg的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认了具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的肝脂肪病症的减少；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认了具有显著性(p＜0.01)的肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径的减少(表11和图14)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径分别显示1001.19％和152.94％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-38.93％、-29.44％、-65.97％、-59.16％的肝脂肪变性部位的变化；并分别显示了-20.83％、-19.11％、-45.46％、-35.65％的平均肝细胞直径的变化。
[表11]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01和ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
fp＜0.01和gp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
hp＜0.01：按照MW检验与假手术对照组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
kp＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
lp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
上表11中的缩略语如下：
Th＝thickness，厚度
DM＝diameter，直径
Epi＝epithelium，上皮
UG＝uterine gland，子宫腺
FC＝fatty change，脂肪变化
实施例1-17：组织病理学变化(2)：大腿骨、胫骨和腰椎骨(L4)
在假手术组的大腿骨、胫骨和L4中观察到比较好的发达的小梁骨(Trabecularbone)和皮质骨(Cortical bone)，相反在OVX对照组中，确认到破骨细胞(Osteoclastcell)的显著的数量及活性增加导致的小梁骨和皮质骨的显著的组织学减少；但在包括石榴提取物20mg/kg的所有实验物质给药组中，确认到大腿骨、胫骨和L4的破骨细胞活性抑制引起的小梁骨和皮质骨的骨量及厚度的显著增加，尤其是相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也确认到显著的破骨细胞活性抑制和骨量保存效果(表12-14和图15-17)。
(1)骨量(bone mass)和结构
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认凹到大腿骨、胫骨和L4小梁骨的量、小梁骨平均长度、厚度和数、中段部分的皮质骨厚度显著(p＜0.01)减少；但在包括红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨、胫骨和L4的小梁骨的量、小梁骨平均长度、厚度和数、皮质骨厚度的增加；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认到对骨量和结构的组织病理学指标的显著的减小抑制效果。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨的小梁骨量和中段(mid-shaft)皮质骨厚度分别显示了-66.40％和-25.69％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了43.75％、20.91％、111.04％、82.21％的小梁骨量的变化；并分别显示了17.00％、14.54％、27.73％、24.76％的皮质骨厚度的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，胫骨的小梁骨量和中段(mid-shaft)皮质骨厚度分别显示了-63.65％和-46.83％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了35.78％、23.25％、101.87％、72.78％％的小梁骨量的变化；并分别显示了16.05％、11.62％、58.61％、29.80％％的皮质骨厚度的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，L4的小梁骨量和中段(mid-shaft)皮质骨厚度分别显示了-44.84％和-38.59％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了30.88％、24.90％、56.05％、44.72％％的小梁骨量的变化；并分别显示了23.16％、17.86％、40.78％、39.53％％的皮质骨厚度的变化。
(2)骨吸收
在OVX对照组中，相比假手术对照组，大腿骨、胫骨和L4的破骨细胞数和比例(OS/BS)分别显著(p＜0.01)增加；但在所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到显著的大腿骨、胫骨和L4的破骨细胞数和OS/BS的减少；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组和石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg给药组和60mg/kg给药组中，也分别确认到显著的骨吸收增加抑制效果(表12-14)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨的破骨细胞数和OS/BS分别显示了280.30％和229.41％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-37.05％、-30.28％、-60.16％、-52.59％的破骨细胞数的变化；并分别显示了-21.94％、-10.44％、-44.78％、-35.85％的OS/BS的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，胫骨的破骨细胞数和OS/BS分别显示了145.69％和351.02％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-29.82％、-23.86％、-44.21％、-37.89％的破骨细胞数的变化；并分别显示了-24.34％、-17.04％、-68.83％、-51.81％的OS/BS的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，L4的破骨细胞数和OS/BS分别显示了188.89％和254.62％的变化；在红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-18.68％、-13.19％、-52.75％、-45.60％的破骨细胞数的变化；并分别显示了-21.41％、-16.01％、-62.69％、-54.16％的OS/BS的变化。
[表12]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01和ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
fp＜0.01和gp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比
mp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
hp＜0.01和ip＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
jp＜0.01和kp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
lp＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
[表13]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
fp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
kp＜0.01和lp＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
mp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
[表14]
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
kp＜0.01和lp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
mp＜0.01和np＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物40mg/kg给药组比较
op＜0.01和pp＜0.05：按照MW检验与石榴提取物20mg/kg给药组比较
作为参考，上述表12-14中的缩略语如下：
Cbt＝Cortical bone thickness(横向厚度(Cross Thickness)；μm)，皮质骨厚度
Tbl＝Trabecular bone length(纵向厚度(Longitudinal thickness)；mm)，小梁骨长度
Tbn＝Trabecular bone number(N/骺(epiphyseal))，小梁骨数
Tbt＝Trabecular bone thickness(横向厚度；μm)，小梁骨厚度
TV/BV＝Trabecular bone volume(％)、小梁骨体积
OS/BS＝Osteoclast cell surface/bone surface(％)，破骨细胞面积/骨面积
Ocn＝Osteoclast cell number(N/骺)，破骨细胞数
[实施例1整理]
在本研究中的石榴和红三叶草复合提取物对更年期障碍的生理活性增大效果，利用已知为与人体闭经期导致的更年期障碍类似的OVX大鼠模型(Tominaga等，2001，2002；Iwamoto等，2005；Cheng和Tian，2012)来进行评价。
即，从OVX 28天后开始，将红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg溶解或稀释于灭菌蒸馏水中，以5ml/kg的用量，每天口服给药1次，持续84日(12周，3个月)，分为雌激素类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果和对骨质疏松症的抑制效果5种药理效果，进行评价。
为了评价雌激素类似效果和抗肥胖效果，分别对体重和体重增加量；水和饲料摄取量；尿量和粪便排泄量；血清中雌二醇(estradiol)含量；腹部蓄积脂肪和子宫的重量变化；腹部蓄积脂肪的厚度和平均脂肪细胞的直径；子宫整体、上皮和粘膜的厚度以及粘膜内子宫腺所占的比例变化进行评价。此外，测定肝重量、血清中AST和ALT含量、显示平均肝细胞直径和脂肪变化的肝变性部位的变化，评价对脂肪肝的保护效果；高脂血症的改善效果通过血中总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和甘油三酯(TG)的含量变化来评价；为了评价骨质疏松症改善效果，即骨保护效果，分别测定大腿骨、胫骨和腰椎骨的湿、干燥及碳化重量，骨密度(BMD)，骨强度，血中骨钙蛋白及骨特异性碱性磷酸酶(bALP)的含量，针对骨量及结构和骨吸收的组织病理学变化。本实验中，将红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物的结果与单独给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg的大鼠中的结果进行比较并评价。
本实验的结果是，在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到显著的体重和体重增加量；饲料和水摄取量；腹部蓄积脂肪重量；血清中AST、ALT、TC、LDL、TG和骨钙蛋白(osteocalcin)含量的增加，同时确认到子宫、肝、大腿骨、胫骨和L5重量和血中bALP和雌二醇(estradiol)含量的减少，又从组织病理学和组织形态计量学方面，分别确认到腹壁蓄积脂肪厚度的增加和脂肪细胞的肥大、肝的脂肪病症、子宫的不溶性萎缩、大腿骨、胫骨和L4的骨量和结构的显著的减少现象，以及骨吸收指标(Ocn和OS/BS)的显著的增加。即，通过OVX诱发了肥胖、高脂血症、肝脂肪病症和骨质疏松症等多种障碍。此外，这种由OVX诱发的障碍现象，通过连续口服给药红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg 84天，得到了显著的抑制。尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，对肥胖、高脂血症、肝脂肪病症和骨质疏松症等OVX诱发的障碍，显示了显著的改善效果。因此，适当比例的石榴提取物的添加(红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物)通过所含的异黄酮的多样性增加，预期使得红三叶草提取物对OVX诱发的更年期障碍的改善效果协同提高，但本发明不限于上述这些内容。
在本研究中，在没有由OVX引起的尿和粪便排泄量的显著变化的情况下，确认到显著的饲料和水摄取量的增加；结果导致了显著的体重增加和腹壁脂肪的蓄积和脂肪细胞的肥大。此外，由这种OVX诱发的肥胖现象，通过连续给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg 84天，得到了显著的抑制，尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，也确认到对体脂肪蓄积和体重增加显著的抑制现象。此外，相比给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg的大鼠，在给药红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg的大鼠中，在测定日(给药开始第28日、49日和83日)分别确认到尿量和粪便排泄量的显著增加。这种结果判断为是适当比例的石榴提取物的添加(红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物)协同增加了红三叶草提取物对肥胖的改善效果的证据，认为红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg，通过通常对已知与异黄酮的饱满感相关的消化荷尔蒙CCK(Asarian和Geary，2007；Thammacharoen等，2008)和胰高血糖素(glucagon)(Geary和Asarian，2001)进行调节，与雌激素效果一同，通过消化管的联动运动增加和利尿效果，而对肥胖显示非常有效的效果，但本发明不限于上述内容。通常增加消化管的联动运动，导致粪便排泄量的增加，结果导致如体重减少的抗肥胖效果(Hyland等，2010；Bertrand等，2011；Snedeker和Hay，2012)，已知利尿效果也是显示类似的体重减少效果(Dagnault等1996；Verlander等，1998)。
在本实验的结果中，通过OVX，导致了子宫重量的显著减少，还导致了组织病理学上子宫整体、粘膜和上皮厚度的显著减少与粘膜内子宫腺的减少。此外，这种子宫萎缩现象，分别通过口服给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg，得到显著的抑制；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，确认到具有显著性的子宫萎缩抑制效果。
本研究的结果是，分别通过口服给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg，确认到显著的血中TC、LDL和TG含量的减少以及HDL含量的增加；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，分别确认到显著的抗高脂血症效果；根据本发明的比例的石榴提取物的添加，红三叶草提取物的抗高脂血症的效果至少在本实验的条件下，判断为协同增加，预期这种抗高脂血症效果与参与胆固醇合成的酶HMG-CoA(Di Croce等，1996)相关。
在本研究中，在OVX对照组中，从血液生物化学和组织病理学上，分别确认到显著的肝脂肪病症。此外，这种由OVX引起的脂肪肝现象，分别通过口服给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg，得到显著抑制；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，也确认到显著的肝保护效果。这种结果也是判断为是适当比例的石榴提取物和红三叶草提取物的复合物的肝保护效果的协同增加的又一证据。本实验的结果是，在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到血中骨钙蛋白(osteocalcin)的含量显著增加，以及大腿骨、胫骨和L5重量以及血中bALP含量的减少；从组织病理学和组织形态计量学方面，分别确认到大腿骨、胫骨和L4骨量和结构的减少现象以及骨吸收指标(Ocn和OS/BS)的显著增加，从而观察到由OVX诱发骨质疏松症。此外，这种骨质疏松症现象，分别通过连续口服给药红三叶草提取物40mg/kg、石榴提取物20mg/kg、红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg，得到显著抑制；尤其是，相比红三叶草提取物40mg/kg给药组、石榴提取物20mg/kg给药组，在红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物120mg/kg和60mg/kg给药组中，确认了具有显著性的骨质疏松症的改善效果。从而，根据本发明的比例的石榴提取物和红三叶草提取物的复合物观察为协同增加对骨质疏松症的改善效果。
[2.与石榴提取物和红三叶草提取物的复合比例设定相关的研究]
实施例2-1：实验动物及实验方法
(1)实验动物
购买雌性未交配的斯普拉格-杜勒(Sprague-Dawley，SD)大鼠(6周龄)，随机选择除了假手术对照组的所有实验动物，完全切除两侧卵巢，以诱发更年期。此外，在假手术组中，通过相同方法确认两侧卵巢后，不进行切除，重新缝合腹腔。所有实验动物在手术28天后，以体重(OVX大鼠：312.21±12.3g，假手术大鼠：255.12±12.11g)为基准，每组选择4只用于实验。
(2)实验方法
分为抗肥胖效果、高脂血症抑制效果和骨质疏松症抑制效果3种药理效果，评价对更年期障碍的效果。
将实验物质悬浮或溶解于灭菌蒸馏水中，以5ml/kg的用量从OVX28日后开始，每日口服给药1次，持续56天。在假手术(sham)和OVX对照组中，仅口服给药相同用量的作为介质的灭菌蒸馏水代替实验物质，持续相同的时间。
在OVX手术日、给药前12天(OVX27日后)、给药开始日和最终处死日测定并记录体重变化。高脂血症抑制效果，通过在最终处死日采集血液测定血中TC而确认，骨质疏松症改善效果通过测定大腿骨的BMD而确认。
实施例2-2：取决于石榴提取物和红三叶草提取物复合比例设定的雌激素活性结 果
为了确认红三叶草提取物和石榴提取物复合物对更年期诱导模型的更年期症状改善效果的协同效果，在红三叶草提取物40mg/kg的摄取量中混合如表1所示的石榴提取物后，通过在更年期诱导动物模型中的抗肥胖效果、高脂血症抑制效果及骨质疏松症抑制效果，测定添加石榴提取物引起的更年期症状改善的协同效果。
其结果是，在通过OVX形成的更年期诱导模型中，确认到由红三叶草提取物(RC)40mg/kg和石榴提取物(PCP)的复合物的经8周口服给药引起的更年期症状的改善程度。
在通过OVX形成的更年期诱导模型中，确认到体重变化为增加了约146g，相比红三叶草单独处理组，在复合石榴提取物10mg/kg以上时，确认到改善；在石榴提取物20mg/kg以上时，虽然确认了显著性的改善，但在混合石榴提取物40mg/kg以上时，并没有确认到取决于用量的改善。
在BMD变化中也与体重变化类似地，在石榴提取物为20mg/kg以上时确认到显著的改善，但没有确认到取决于用量的改善。
在血中TC的测定结果中，在石榴提取物为10mg/kg时，确认有改善，但在80mg/kg和160mg/kg之间时，并没有确认到取决于用量的变化。
从这些结果确认到相比单独给药红三叶草提取物(RC)，通过复合给药石榴提取物(PCP)而获得更年期诱导模型中的显著性改善，在最佳给药浓度10～80mg/kg之间获得了取决于用量的结果。
因此，针对红三叶草提取物(RC)和石榴提取物(PCP)的复合物制备，在红三叶草提取物40～80mg/kg中添加石榴提取物10～80mg/kg而制备复合物时，能够获得协同效果。
[3.取决于石榴提取物和红三叶草提取物的复合比例设定的协同效果的确认]
实施例3-1：实验动物及实验方法
(1)实验动物
使用雌性未交配的ddY小鼠(6周龄，日本和歌山市Kiwa实验室动物公司)，本实验的所有实验动物均按照大邱韩医大学实验动物伦理委员会的动物伦理标准来处理，在事先获得批准的前提下实施了实验(批准号：DHU2014-020)。
(2)实验方法
分组(总14个组，每组8只)后进行实验(表15和图18)。
即，分为假手术后给药10ml/kg灭菌蒸馏水的介质对照组(Sham control，以下称为假手术对照组)；OVX手术后给药10ml/kg的灭菌蒸馏水的介质对照组(OVX comtrol，以下称为OVX对照组)；OVX后石榴提取物单独组合物120mg/kg给药组(PCP)；以及OVX手术后9种红三叶草提取物：石榴提取物复合组合物(g/g)给药组(OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为1:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(1-1)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为1:2(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(1-2)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为1:4(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(1-4)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为1:6(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(1-6)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为1:8(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(1-8)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(2-1)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为4:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(4-1)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为6:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(6-1)、OVX术后红三叶草提取物：石榴提取物为8:1(g/g)的复合组合物120mg/kg给药组(8-1))，进行了实验。
将适量红三叶草提取物或石榴提取物悬浮或溶解于灭菌蒸馏水中，以10ml/kg的用量，从OVX28日后开始，每日口服给药1次，持续84天。即，将红三叶草提取物单独组合物；石榴提取物单独组合物；以及红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合物120mg/kg，分别口服给药84天，在假手术对照组和OVX对照组中，口服给药相同用量的作为介质的灭菌蒸馏水代替实验物质，持续相同的时间，按照以往研究者的方法(Chiba等，2003；Murakami等，2007；Tousen等，2011)，将0.03μg的17β-雌二醇(美国密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司)溶解于0.2ml的灭菌生理盐水中，以0.2ml/只的用量(0.03μg/只/日)，从OVX手术28日开始，每天1次经84天，在背部皮肤皮下给药(表15，图18)。考虑小鼠的体表面积，将复合组合物的给药用量选择为人临床用量600mg的12倍，即600mg/60kg)×12＝120mg/kg，为了直接的药效比较评价，也分别选择120mg/kg的红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物。
[表15]
OVX＝两侧卵巢切除术(Bilateral ovariectomy)
PCP＝石榴提取物(Pomegranate Concentrate Powder)
RC＝红三叶草干燥提取物(Red clover dry extracts)
RC：PCP＝由RC和PCP构成的混合剂型(g/g)
为了通过OVX诱发更年期障碍，进行如下实验。
即，随机选择除了假手术对照组之外的所有实验动物，完全去除两侧卵巢，诱发雌激素不足(estrogen dificient)更年期障碍。另外，在假手术组中以相同方法确认两侧卵巢后，不进行去除，重新缝合腹腔。包括假手术组的所有实验动物在手术27天后，以体重为基准(OVX小鼠：30.71±1.65g、28.0-35.1g；假手术小鼠：26.99±1.46g、24.4-28.7g)，每组选定8只，用于实验。
分为雌激素(estrogen)类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果和对骨质疏松症的抑制效果5种药理效果，评价对更年期障碍的效果。分别与红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物比较，同时显示统计学上显著(p<0.01或p<0.05)的药效提升效果的复合组合物，通过显示协同效果的红三叶草：石榴提取物复合组合物，确认了最佳复合组成比例。
更具体地，抗肥胖和雌激素类似效果如下进行实验。分别在OVX手术日、给药前1天(OVX27日后)、给药开始日、从给药开始第一天到最后处死日为止最少每周1次记录体重，测定OVX后恢复期(更年期障碍诱发期)和给药开始后12周期间的体重变化量，即体重增加量。观察饲料摄取量(给药开始后第1日、3日、7日、28日、56日及83日)、血清中雌二醇(estradiol)含量、体脂肪和腹部脂肪量、腹部蓄积脂肪和子宫的重量、子宫及腹部蓄积脂肪的组织病理学变化(腹部蓄积脂肪的厚度和平均脂肪细胞的直径、子宫整体、上皮和粘膜的厚度以及粘膜内子宫腺所占的比例变化)(图19)。
此外，为了确认对于脂肪肝的保护效果，如下进行实验。观察肝重量、血清中AST和ALT含量、肝的组织病理学变化(显示平均肝细胞直径和脂肪变化的肝变性部位的变化)。
高脂血症的抑制效果通过血中TC、LDL、HDL和TG含量变化确认。
骨质疏松症改善效果通过大腿骨的湿、干燥及碳化重量；BMD(图20)；骨强度(图21)；血中骨钙蛋白(osteocalcin)及bALP含量；骨量及结构(小梁骨量、小梁骨数、厚度、长度、皮质骨厚度)和骨吸收(破骨细胞数和破骨细胞面积(OS/BS)的组织病理学变化，进行确认。
实施例3-2：体重及体重增加量的变化
在OVX手术28天后，仅选定相比假手术对照组显示显著的体重增加的实验动物使用(OVX小鼠：30.71±1.65g，28.0-35.1g；假手术小鼠：26.99±1.46g，24.4-28.7g)，在所有OVX手术组中确认相比假手术对照组的显著(p＜0.01)的体重以及OVX后诱发期4周期间的体重增加量的增加；但在雌二醇(estradiol)、石榴提取物和红三叶草提取物单独组合物给药组中，从给药开始14日、21日和28日后起，确认到相比OVX对照组的具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重的减少；在所有9种红三叶草提取物：石榴提取物复合物给药组中，从给药开始14日、21日和28日后起，也分别确认到相比OVX对照组具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重的减少；在所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，在给药期间84日期间确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体重增加量的减少。尤其是，在红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、2:1和4:1的复合物给药组中，相比红三叶草提取物和石榴提取物单独组合物给药组，从给药开始28日、42日和49日后起开始确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)体重的减少；相比红三叶草提取物和石榴提取物单独组合物给药组，确认到按红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1的顺序的、具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的给药期间的体重增加量的减少(表16和图22)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，给药期间的体重增加量显示351.54％的变化；在雌二醇、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示-52.56％、-44.46％、-41.91％、-67.72％、-54.51％、-51.28％、-53.33％、-52.30％、-74.19％、-64.40％、-48.89％及-44.55％的变化。
[表16]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
*所有动物在夜间禁食。
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物给药组比较
ep＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物给药组比较
fp＜0.01：按照MW检验与假手术对照组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
ip＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物给药组比较
jp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物给药组比较
RC：PCP＝红三叶草提取物和石榴提取物的复合物(g/g)。
实施例3-3：饲料摄取量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，从给药开始第1天到第83天的所有测定日，均确认具有显著性(p＜0.01)的饲料摄取量的增加；与OVX对照组相比，仅限于雌二醇(estradiol)给药组，从给药开始第7日起，确认具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的饲料摄取量的减少；除此之外，在红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)复合组合物给药组中，与OVX对照组比较，并没有确认到有意义的饲料摄取量的变化；在9种红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)复合组合物给药组中，相比在红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，也并没有确认到有显著性的饲料摄取量的变化(表17)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，在给药开始的第1日、3日、7日、28日、56日和83日的饲料摄取量，分别显示58.37％、75.12％、79.42％、72.71％、75.06％和95.69％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，给药开始第一天分别显示0.87％、-1.21％、4.52％、0.59％、-2.78％、-1.34％、-0.93％、1.96％、2.36％、0.22％、0.70％和-0.46％的饲料摄取量的变化；给药开始第3天分别显示-5.24％、-0.92％、2.22％、-1.19％、-1.41％、2.02％、1.42％、0.48％、1.23％、1.25％、-1.52％和0.15％的变化；给药开始第7天分别显示-13.04％、-2.04％、2.05％、-1.44％、0.37％、2.51％、0.66％、0.70％、-2.27％、0.91％、-0.22％和0.68％的变化；给药开始第28天分别显示-16.34％、-2.35％、-1.00％、-0.79％、-1.73％、4.05％、0.25％、0.48％、-0.56％、-0.34％、2.52％和0.74％的变化；从给药开始第56天分别显示-20.01％、-1.12％、-0.59％、-2.86％、1.89％、-2.76％、-1.35％、1.19％、-0.75％、-0.30％、-2.73％和0.46％的变化；从给药开始第83天分别显示-27.82％、-1.01％、-0.57％、-1.57％、0.24％、-2.64％、-4.01％、-0.71％、-1.08％、0.54％、-0.85％和0.95％的变化。
[表17]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01和cp＜0.05：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01：按照MW检验与假手术对照组比较
ep＜0.01：按照MW检验与OVX对照组比较
实施例3-4：腹部蓄积脂肪重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认具有显著性(p＜0.01)腹部蓄积脂肪的绝对重量和相对于体重的相对重量的增加；然而，在包括雌二醇(estradiol)的所有给药组中，相比OVX对照组，分别确认具有著性(p＜0.01)腹部脂肪重量的减少；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的腹部脂肪重量的减少(表18和图23)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，腹部蓄积脂肪的绝对重量显示2375.48％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示-82.20％、-50.38％、-45.23％、-73.29％、-49.86％、-54.48％、-45.27％、-48.56％、-80.93％、-70.89％、-52.72％和-49.28％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，腹部蓄积脂肪的相对于体重的相对重量显示1491.59％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示-78.86％、-41.76％、-36.56％、-65.51％、-39.48％、-45.64％、-34.56％、-38.46％、-74.73％、-62.83％、-42.68％和-38.75％的变化。
实施例3-5：子宫重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)子宫的绝对重量和相对于体重的相对重量的减少；在包括红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认具有著性(p＜0.01)的子宫重量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01)的子宫重量的增加(表18和图24)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，子宫的绝对重量显示-88.57％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示288.64％、47.73％、45.00％、90.45％、50.00％、42.73％、45.45％、44.55％、125.00％、90.00％、71.82％和52.73％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，子宫的相对于体重的相对重量显示-92.53％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示372.56％、74.57％、67.51％、145.55％、84.03％、72.76％、76.97％、73.48％、200.64％、142.46％、109.43％和80.95％的变化。
实施例3-6：肝重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认具有显著性(p＜0.01)的肝的相对于体重的相对重量的减少；在包括9种红三叶草：石榴提取物复合组合物给药组的所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有著性(p＜0.01或p＜0.05)的肝相对重量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的肝相对重量的增加。此外，与假手术对照组比较，在所有OVX对照组中，没有确认到有意义的肝绝对重量变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草提取物：石榴提取物的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，也没有确认到有意义的肝绝对重量的变化(表18)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，肝绝对重量显示4.28％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示5.37％、3.34％、4.95％、10.29％、-1.80％、-0.24％、-1.10％、1.49％、12.28％、11.71％、1.66％和0.54％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，肝的相对于体重的相对重量显示-31.75％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示27.16％、21.96％、21.28％、42.26％、19.79％、21.18％、19.73％、22.57％、49.99％、42.54％、23.11％和18.01％的变化。
[表18]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01和bp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
cp＜0.01和dp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
ep＜0.01和fp＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物单独给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照MW检验与石榴提取物单独给药组比较
实施例3-7：大腿骨重量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)相对于体重的大腿骨相对湿重量的减少以及干燥和碳化骨绝对重量和相对重量的减少；但在包括雌二醇(estradiol)的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到显著的大腿骨重量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨相对湿重量的增加以及干燥和碳化骨绝对重量和相对重量的增加(表19)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨绝对湿重量和相对于体重的相对湿重量分别显示-4.19％和-37.68％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示5.79％、1.27％、2.68％、3.67％、0.85％、0.56％、2.82％、-0.71％、4.94％、3.39％、0.56％和0.58％的绝对湿重量的变化；并分别显示了27.75％、19.30％、18.35％、33.90％、23.11％、21.48％、23.97％、19.47％、39.91％、31.87％、21.50％和18.54％的相对湿重量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨绝对干燥重量和相对于体重的相对干燥重量分别显示-21.64％和-49.05％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示14.93％、8.96％、8.46％、17.16％、10.70％、10.45％、12.69％、9.70％、20.65％、16.92％、10.70％和9.95％的绝对干燥重量的变化；并显示38.22％、28.18％、24.70％、50.75％、35.13％、33.14％、35.43％、31.69％、60.65％、48.83％、33.29％和29.00％的相对干燥重量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨绝对碳化重量和相对于体重的相对碳化重量分别显示-34.74％和-57.77％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示30.35％、21.39％、19.40％、38.81％、23.88％、25.87％、23.88％、22.39％、51.24％、36.32％、24.38％和21.39％的绝对碳化重量的变化；并分别显示了57.03％、43.35％、37.53％、79.44％、51.03％、52.74％、49.80％、47.40％、102.33％、74.11％、50.56％和43.57％的相对碳化重量的变化。
[表19]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01和bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01和ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
fp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
gp＜0.01和hp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
ip＜0.01和jp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
kp＜0.01和lp＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物单独给药组比较
mp＜0.01和np＜0.05：按照MW检验与石榴提取物单独给药组比较
实施例3-8：血液生物化学变化(1)：AST、ALT、TC、LDL、HDL和TG
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中天冬氨酸转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸转氨酶(Alanineaminotransferase，ALT)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)及甘油三酯(TG)含量增加以及有显著性(p＜0.01)的高密度脂蛋白(Hight density lipoprotein，HDL)含量减少；但在包括红三叶草提取物单独组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的血中AST、ALT、TC、LDL和TG含量的减少，并确认到具有显著性(p＜0.01)的血中HDL含量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中AST、ALT、TC、LDL和TG含量的减少和血中HDL含量的增加(表20)。
在OVX对照组的情况时，相比假手术对照组，血中AST和ALT含量分别显示92.30％和100.66％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-33.98％、-13.94％、-12.56％、-26.73％、-14.10％、-13.71％、-12.25％、-12.17％、-32.67％、-25.96％、-16.26％和-13.10％的血中AST含量的变化；且分别显示了-31.58％、-17.11％、-16.28％、-31.74％、-16.78％、-19.08％、-18.82％、-17.60％、-37.17％、-30.43％、-19.74％和-18.26％的血中AST含量的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中TC和LDL含量分别显示100.00％和189.26％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-25.94％、-20.01％、-17.85％、-28.87％、-20.64％、-19.94％、-18.27％、-17.50％、-36.33％、-26.85％、-21.27％和-19.46％的血中TC含量变化；且分别显示了-26.87％、-14.98％、-11.96％、-26.87％、-14.57％、-13.40％、-12.92％、-12.03％、-36.49％、-23.71％、-15.40％和-15.05％的血中LDL的含量变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中HDL和TG含量分别显示-50.45％和305.74％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了52.09％、37.17％、33.25％、60.99％、36.91％、32.98％、34.55％、34.03％、87.70％、59.42％、39.27％和34.29％的血中HDL含量的变化；且分别显示了-34.80％、-17.99％、-17.07％、-31.56％、-19.48％、-18.98％、-18.48％、-17.74％、-43.55％、-28.56％-18.65％和-18.23％的血中TG含量的变化。
[表20]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01且bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01且ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
fp＜0.01且gp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
实施例3-9：血液生物化学变化(2)：雌二醇(Estradiol)
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中雌二醇(estradiol)含量减少；但在包括石榴提取物单独组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的血中雌二醇(estradiol)含量增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性(p＜0.01)的血中雌二醇(estradiol)含量增加(图25)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中雌二醇(estradiol)含量显示-72.46％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示185.69％、37.14％、30.62％、84.78％、37.86％、36.23％、35.87％、31.34％、116.30％、83.70％、49.64％和44.02％的变化。
实施例3-10：血液生物化学变化(3)：骨钙蛋白和bALP
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到有显著性(p＜0.01)的血中骨钙蛋白(osteocalcin)含量的增加以及具有显著性(p＜0.01)的bALP含量的减少，与OVX对照组相比，在包括红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物的所有候选物质给药组中，确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的血中骨钙蛋白含量的减少以及血中bALP含量的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的血中骨钙蛋白含量的减少以及血中bALP含量的增加(图26和图27)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，血中骨钙蛋白含量和bALP含量分别显示77.11％和-42.35％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-31.95％、-18.80％、-17.20％、-31.43％、-19.54％、-19.35％、-17.27％、-16.83％、-34.29％、-30.05％、-20.62％和-18.39％的血中骨钙蛋白的含量变化，并分别显示了39.72％、22.04％、17.04％、36.32％、22.87％、19.17％、18.92％、17.31％、49.67％、34.38％、24.84％和22.84％的血中bALP含量的变化。
实施例3-11：骨密度的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到平均全身(total body)骨密度和大腿骨整体骨密度分别显著(p＜0.01)减少；相反在包括9种的所有红三叶草：石榴提取物复合组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到全身骨密度和大腿骨整体骨密度的具有显著性(p＜0.01)的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的平均全身骨密度和大腿骨整体骨密度的增加(表21、图28和图29)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，平均全身骨密度显示-12.75％的变化，在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了9.86％、4.41％、3.48％、8.00％、5.10％、4.29％、4.00％、3.77％、10.84％、7.42％、5.57％及5.16％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨整体骨密度显示-12.56％的变化，在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了10.78％、5.23％、5.18％、9.20％、6.73％、5.93％、5.61％、5.39％、11.53％、8.97％、7.42％和5.02％的变化。
实施例3-12：体脂肪和腹部蓄积脂肪量的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到具有显著性(p＜0.01)的体脂肪和腹部蓄积脂肪量的增加；相反在包括雌二醇(estradiol)的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到体脂肪和腹部蓄积脂肪量的具有显著性(p＜0.01)的减少。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的体脂肪和腹部蓄积脂肪量的减少(表21)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，体脂肪量显示213.34％的变化，在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-33.02％、-15.21％、-13.20％、-31.06％、-20.16％、-15.67％、-14.24％、-13.90％、-46.56％、-27.58％、-18.22％和-15.32％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，腹部蓄积脂肪量显示279.17％的变化，在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-35.00％、-17.21％、-15.43％、-35.30％、-18.61％、-17.54％、-16.07％、-15.42％、-43.69％、-32.08％、-19.54％和-17.66％的变化。
[表21]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01且bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01且ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
fp＜0.01且gp＜0.05：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
实施例3-13：骨强度的变化
在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到具有显著性(p＜0.01)的大腿骨中段(mid-shaft)部位的骨强度的减少；相反在包括红三叶草提取物单独组合物的所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨骨强度的增加。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨骨强度的增加(图30)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，大腿骨中段部位的骨强度显示-51.62％的变化，在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了61.41％、35.17％、32.31％、59.11％、39.58％、44.06％、40.40％、40.85％、78.65％、56.44％、33.33％和32.61％的变化。
实施例3-14：组织病理学变化(1)：腹部蓄积脂肪、子宫及肝
(1)腹部蓄积脂肪
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认到由于显著的腹部脂肪蓄积引起的腹部脂肪垫厚度和脂肪细胞平均直径的具有显著性(p＜0.01)的增加；在包括石榴提取物单独组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的腹部脂肪垫厚度和脂肪细胞平均直径的减少。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的腹部脂肪垫厚度和脂肪细胞平均直径的减少(图31和图32)。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，腹部脂肪垫的厚度显示了329.04％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-52.23％、-25.90％、-22.25％、-40.72％、-23.97％、-24.59％、-24.45％、-22.71％、-55.21％、-38.83％、-26.54％和-25.98％的变化。
在OVX对照组的情况下，相比假手术对照组，脂肪细胞的平均直径显示了270.68％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-48.06％、-28.54％、-25.14％、-57.23％、-31.57％、-31.50％、-27.72％、-26.29％、-63.70％、-51.62％、-28.55％和-27.24％的变化。
(2)子宫
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认到以显著的子宫粘膜的减少为表现的不溶性萎缩，从而确认到子宫整体、上皮及粘膜厚度以及粘膜内子宫腺所占比例的具有显著性(p＜0.01)的减少；但在包括9种的红三叶草：石榴提取物复合组合物的所有候补物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的子宫整体、上皮及粘膜厚度以及粘膜内子宫腺所占比例的增加；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的子宫整体、上皮及粘膜厚度以及粘膜内子宫腺所占比例的增加(表22、图33和图34)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，子宫整体和上皮的平均厚度分别显示-73.99％和-77.79％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了181.27％、37.05％、30.46％、77.23％、39.43％、37.12％、33.70％、31.79％、98.58％、61.95％、40.74％和40.64％的子宫整体平均厚度的变化；且分别显示了170.17％、51.29％、44.04％、133.75％、71.36％、62.15％、61.74％、46.04％、205.44％、119.58％、83.78％和57.71％的子宫上皮平均厚度的变化。
在OVX对照组中，相比正常对照组，子宫粘膜的平均厚度和粘膜内子宫腺所占比例分别显示-78.74％和-76.90％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了196.04％、46.06％、39.48％、102.37％、55.72％、47.16％、44.15％、41.20％、125.29％、84.08％、53.63％和53.00％的子宫粘膜平均厚度的变化；且分别显示了180.37％、92.88％、80.37％、164.14％、109.49％、91.62％、84.40％、80.88％、186.05％、159.76％、112.69和98.34％的子宫粘膜内子宫腺所占比例的变化。
[表22]
ap＜0.01且bp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
cp＜0.01且dp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
ep＜0.01且fp＜0.05：按照MW检验与红三叶草提取物单独给药组比较
gp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物单独给药组比较
(3)肝
在OVX对照组中，相比假手术对照组，导致以由显著的肝细胞内脂肪蓄积引起的肥大为特征的肝脂肪病症，从而确认到肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径的具有显著性(p＜0.01)的增加；但在包括雌二醇(estradiol)的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的肝脂肪病症的减少；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径的减少(表23、图35和图36)。
在OVX对照组中，相比正常对照组，肝脂肪变性部位和平均肝细胞直径分别显示500.66％和224.65％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-44.73％、-24.38％、-21.08％、-43.20％、-25.72％、-23.91％、-23.20％、-22.21％、-51.85％、-41.47％、-27.38％和-23.67％的肝脂肪变性部位的变化；且分别显示了-42.21％、-26.50％、-25.88％、-49.87％、-30.22％、-30.02％、-29.80％、-25.35％、-55.39％、-45.10％、-27.18％和-26.68％的平均肝细胞直径的变化。
[表23]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01且bp＜0.05：按照LSD检验与假手术对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
dp＜0.01且ep＜0.05：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
fp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
实施例3-15：组织病理学变化(2)：大腿骨
在假手术组的大腿骨中观察到比较好的发达的小梁骨和皮质骨，相反在OVX对照组中，确认到由破骨细胞的显著的数量及活性增加导致的小梁骨和皮质骨的数量的减少；但在包括石榴提取物单独组合物的所有实验物质给药组中，确认到由大腿骨的破骨细胞活性抑制引起的小梁骨和皮质骨的骨量及厚度的显著增加；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，分别确认到显著的破骨细胞活性抑制及骨量保存效果(表24、表25和图37、图38)。
(1)骨量(bone mass)和结构
在OVX对照组中，相比假手术对照组，分别确认到大腿骨小梁骨的量、小梁骨平均长度、厚度和数、中段部分的皮质骨厚度分别显著(p＜0.01)减少；但在包括红石榴提取物单独给药组的所有候选物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨小梁骨的量、小梁骨平均长度、厚度和数、皮质骨厚度的增加；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的大腿骨小梁骨的量、小梁骨平均长度、厚度和数、皮质骨厚度的增加。
在OVX对照组中，相比正常对照组，大腿骨的小梁骨量和小梁骨平均数分别显示了-53.66％和-59.41％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了73.01％、32.47％、25.54％、59.92％、31.08％、30.51％、26.55％、26.42％、81.75％、58.54％、33.70％和30.75％的小梁骨量的变化；且分别显示了92.68％、46.34％、36.59％、102.44％、46.34％、43.90％、36.59％、34.15％、139.02％、97.56％、53.66％和46.34％的平均小梁骨数的变化。
在OVX对照组中，相比正常对照组，大腿骨的小梁骨的平均长度和厚度分别显示了-53.47％和-55.82％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了89.04％、23.62％、20.88％、79.43％、27.47％、26.57％、25.18％、21.16％、99.20％、72.68％、27.65％和24.04％的小梁骨平均长度的变化；且分别显示了70.56％、35.69％、33.29％、104.28％、44.40％、43.67％、34.65％、34.98％、129.10％、101.26％、40.19％和37.58％的小梁骨平均厚度的变化。
在OVX对照组中，相比假手术对照组，大腿骨的皮质骨厚度显示了-27.80％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了21.85％、16.11％、13.83％、25.23％、18.97％、16.70％、15.84％、15.01％、30.43％、24.33％、20.10％和14.00％的变化。
[表24]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
dp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
ep＜0.01且fp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
gp＜0.01且hp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
ip＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物单独给药组比较
jp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物单独给药组比较
(2)骨吸收
在OVX对照组中，相比假手术对照组，大腿骨破骨细胞数和比例(OS/BS)分别显著(p＜0.01)增加；但在包括9种红三叶草：石榴提取物复合组合物的所有实验物质给药组中，相比OVX对照组，分别确认到具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的大腿骨破骨细胞数和比例OS/BS的减少；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物(g/g)为2:1、1:1和4:1的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性(p＜0.01)的大腿骨破骨细胞数和OS/BS的减少。
在OVX对照组中，相比正常对照组，大腿骨的破骨细胞数和OS/BS分别显示了209.09％％和146.31％％的变化；在雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物给药组中，相比OVX对照组，分别显示了-55.15％、-19.12％、-16.91％、-46.32％、-23.53％、-20.59％、-19.85％、-18.38％、-58.82％、-44.85％、-21.32％和-19.85％的破骨细胞数的变化；且分别显示了-37.50％、-18.29％、-15.47％、-35.88％、-20.81％、-18.67％、-15.92％、-20.12％、-45.43％、-35.05％、-17.87％和-15.10％的OS/BS变化。
[表25]
上述值以小鼠8只个体的平均值±标准偏差表示。
ap＜0.01：按照LSD检验与假手术对照组比较
bp＜0.01：按照LSD检验与OVX对照组比较
cp＜0.01：按照LSD检验与红三叶草提取物单独给药组比较
dp＜0.01：按照LSD检验与石榴提取物单独给药组比较
ep＜0.01且fp＜0.05：按照MW检验与假手术对照组比较
gp＜0.01且hp＜0.05：按照MW检验与OVX对照组比较
ip＜0.01：按照MW检验与红三叶草提取物单独给药组比较
jp＜0.01：按照MW检验与石榴提取物单独给药组比较
[实施例3整理]
在本研究中的红三叶草提取物和石榴提取物的最佳复合组合，目前利用包括骨质疏松症的多种更年期障碍实验动物模型的OVX ddY小鼠模型(Yamaguchi等,1999；Ku和Lee,2005；Han等,2007；Shin等,2007)来进行评价。即，在OVX28天后开始，将红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草：石榴提取物复合组合物(1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1，g/g)120mg/kg溶解或稀释于灭菌蒸馏水中，以10ml/kg的用量，每天口服给药1次，持续84天，分为雌激素类似效果、抗肥胖效果、高脂血症抑制效果、对脂肪肝的保护效果和对骨质疏松症的抑制效果5种药理效果，进行评价。为了评价雌激素类似效果和抗肥胖效果，分别对体重和体重增加量、水和饲料摄取量、体脂肪量和腹部脂肪量、血清中雌二醇(estradiol)含量、腹部蓄积脂肪和子宫的重量变化、腹部蓄积脂肪的厚度和平均脂肪细胞的直径、子宫整体、上皮和粘膜的厚度以及粘膜内子宫腺所占的比例变化等的组织病理学变化进行评价。并且测定肝重量、血清中AST和ALT含量、组织病理学变化(显示平均肝细胞直径和脂肪变化的肝变性部位)，评价对脂肪肝的保护效果；高脂血症的改善效果通过血中TC、LDL、HDL和TG的含量变化来评价；为了评价骨质疏松症改善效果，即骨保护效果，分别测定大腿骨的湿、干燥及碳化重量；BMD；骨强度；血中骨钙蛋白及bALP的含量；针对大腿骨骨量及结构和骨吸收的组织病理学变化。本实验中，分别与红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物比较，在统计学上具有显著性(p＜0.01或p＜0.05)的药效提高的复合组合物，确定为产生协同效果的红三叶草：石榴提取物复合组合物，并与皮下给药17β-雌二醇0.03μg/只/天的小鼠(Chiba等,2003；Murakami等,2007；Tousen等,2011)中的结果进行比较并评价。
考虑小鼠的体表面积，将在本实验中使用的复合组合物的给药用量选择为人类临床用量600mg的12倍，即，600mg/60kg×12＝120mg/kg，为了直接的药效比较评价，也分别选择120mg/kg的红三叶草提取物单独组合物和石榴提取物单独组合物，按照之前的研究者的方法(Chiba等,2003；Murakami等,2007；Tousen等,2011)，将0.03μg的17β-雌二醇溶解于0.2ml的灭菌生理盐水中，以0.2ml/小鼠的用量(0.03μg/只/天)，从OVX手术28天开始每日1次经84天在背部皮肤皮下给药。
本实验的结果，在OVX对照组中，相比假手术对照组，确认到显著的体重和体重增加量；饲料摄取量；体脂肪和腹部蓄积脂肪量；腹部蓄积脂肪重量；血清中AST、ALT、TC、LDL、TG和骨钙蛋白(osteocalcin)含量的增加，同时确认到子宫、肝、大腿骨重量和血中bALP和雌二醇(estradiol)含量、平均全身骨密度及大腿骨骨密度的减少，又从组织病理学方面分别确认到腹壁蓄积脂肪厚度的增加和脂肪细胞的肥大；肝的脂肪病症；子宫的不溶性萎缩；大腿骨骨量的减少现象；骨吸收指标(Ocn和OS/BS)的显著增加，即，通过OVX诱发了典型的雌激素(estrogen)缺乏性更年期障碍(肥胖、高血脂症、肝脂肪病症和骨质疏松症)。此外，这种由OVX诱发的雌激素缺乏性闭经期相关的更年期障碍现象，通过雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草：石榴提取物复合组合物，经84天的连续给药，得到了显著的抑制。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组、石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，分别确认到对由OVX诱发的雌激素缺乏性更年期障碍(肥胖、高脂血症、肝脂肪病症和骨质疏松症等)的具有显著性(p＜0.01)的改善效果。因此，适当比例的红三叶草提取物：石榴提取物复合组合-红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1的复合组合物，通过所含的异黄酮的多样性增加，预期使得红三叶草提取物和石榴提取物对由OVX诱发的更年期障碍的改善效果协同提高，其中，观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1的复合组合物具有最优异的更年期障碍的协同改善效果，但本发明不限于这些内容。
在本研究中，确认到通过OVX的显著的饲料摄取量的增加；结果导致了显著的体重增加和脂肪的蓄积和脂肪细胞的肥大。此外，通过这种由OVX诱发的雌激素缺乏性肥胖现象，分别通过红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草：石榴提取物复合组合物，经84天连续给药，得到显著的抑制。尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，分别确认到具有显著性的体脂肪蓄积、脂肪肥大和体重增加抑制现象。这种结果判断为是适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物-红三叶草：石榴提取物2:1、1:1和4:1，协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物对与更年期障碍相关的肥胖的改善效果的证据，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的抗肥胖效果，但本发明不限于上述内容。
在本研究中，通过OVX导致具有显著性的子宫重量的减少以及血中雌二醇的减少，还导致组织病理学上显著的子宫整体、粘膜和上皮厚度的减少与粘膜内子宫腺的减少。此外，这种雌激素缺乏性子宫萎缩现象，通过雌二醇、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物的给药，得到了显著的抑制；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组和石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，分别确人到具有显著性的血中雌二醇含量增加和子宫萎缩抑制现象；这成为适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物-红三叶草：石榴提取物2:1、1:1和4:1，通过所含有的异黄酮的多样性增加，协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物的雌激素效果的证据，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的雌激素效果，但本发明不限于上述内容。
在本研究中，分别通过雌二醇(estradiol)皮下给药和所有红三叶草提取物、石榴提取物单独或复合组合物的口服给药，确认到显著的血中TC、LDL和TG含量的减少以及HDL含量的增加；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组、石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性的抗高脂血症效果的增加，这成为适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物-红三叶草：石榴提取物2:1、1:1和4:1，至少在本实验的条件下经参与胆固醇合成的酶HMG-GoA(Di Croce等,1996)，协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物的抗高脂血症效果的证据，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的抗高脂血症效果，但本发明不限于上述内容。
在本研究中，在OVX对照组中，从血液生物化学和组织病理学上，分别确认了显著的肝脂肪病症诱发。此外，这种由OVX引起的脂肪肝现象，分别通过雌二醇(estradiol)、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种红三叶草：石榴提取物复合组合物的给药，得到了显著的抑制；尤其是相比红三叶草提取物单独组合物给药组、石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性的肝保护效果的增加；这成为适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物，协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物的肝保护效果的证据，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的肝保护效果，但本发明不限于上述内容。
本实验的结果是，在OVX对照组中，相比假手术介质对照组，确认到显著的血中骨钙蛋白含量的增加以及大腿骨重量和血中bALP含量减少，在组织病理学上确认到大腿骨骨量减少现象和骨吸收指标(Ocn和OS/BS)的显著增加，观察到通过OVX诱发了典型的雌激素缺乏性骨质疏松症。此外，这种雌激素缺乏性骨质疏松现象，通过雌二醇、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、红三叶草提取物：石榴提取物为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、2:1、4:1、6:1和8:1(g/g)的复合组合物的给药，得到了显著的抑制；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组、石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性的雌激素缺乏性骨质疏松症改善效果的增加；这成为适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物-红三叶草：石榴提取物2:1、1:1和4:1，通过所含有的异黄酮的多样性增加，协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物的雌激素缺乏性骨质疏松症改善效果的证据，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的雌激素缺乏性骨质疏松症改善效果。
本实验的结果是，在ddY小鼠中，通过OVX诱发的雌激素缺乏性闭经期相关更年期障碍现象(肥胖、高脂血症、肝脂肪病症和骨质疏松症)，通过雌二醇、红三叶草提取物单独组合物、石榴提取物单独组合物、9种所有的红三叶草：石榴提取物复合组合物的连续84天给药，得到了显著的抑制；尤其是，相比红三叶草提取物单独组合物给药组、石榴提取物单独组合物给药组，以红三叶草提取物：石榴提取物为2:1、1:1和4:1(g/g)的复合物给药组的顺序，确认到具有显著性的更年期障碍改善效果；观察到适当比例的红三叶草：石榴提取物复合组合物-红三叶草：石榴提取物2:1、1:1和4:1，通过所含有的异黄酮的多样性增加，进一步协同增加了红三叶草提取物和石榴提取物的对OVX诱发的更年期障碍的改善效果，其中观察到红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合组合物显示最优异的更年期障碍改善效果。因此，红三叶草提取物：石榴提取物为2:1(g/g)的复合物被期待开发为更有效的新型更年期障碍改善剂的可能性高，尤其是判断为对雌激素缺乏性肥胖、高脂血症、脂肪肝病症和骨质疏松症的改善有效。

Claims (21)

1.一种更年期障碍改善用组合物，包括石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的更年期障碍改善用组合物，其特征在于，所述更年期障碍是选自由面部泛红、发汗、不眠症、神经过敏、抑郁症、眩晕症、缺乏集中力、关节痛、头痛、心悸、阴道干燥感、疲劳、兴奋、失眠、记忆丧失、忧愁和动脉粥样硬化组成的组中的一种以上更年期症状。
3.根据权利要求1所述的更年期障碍改善用组合物，其特征在于，所述更年期障碍改善显示选自由更年期症状改善、抗肥胖、高脂血症抑制、脂肪肝抑制、骨质疏松症抑制、肝保护和子宫保护组成的组中的一种以上效果。
4.一种药物组合物，包括根据权利要求1至3中任一项所述的更年期障碍改善用组合物。
5.一种食品组合物，包括根据权利要求1至3中任一项所述的更年期障碍改善用组合物。
6.一种化妆品组合物，包括根据权利要求1至3中任一项所述的更年期障碍改善用组合物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：1至1：4。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，石榴提取物与红三叶草提取物的重量比为1：1.5至1：2.5。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，在每100ml组合物中包括50mg至150mg的所述石榴和红三叶草的复合提取物。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，相对于总石榴提取物，所述石榴提取物含有0.5mg/g至1mg/g的鞣花酸。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，相对于总红三叶草提取物，所述三叶草提取物含有50mg/g至150mg/g的异黄酮。
12.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，所述石榴和红三叶草的复合提取物含有30mg/g至100mg/g的异黄酮和0.15mg/g至0.4mg/g的鞣花酸。
13.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，使用水、碳原子数为1至4的低级醇或它们的混合物作为溶剂提取红三叶草提取物。
14.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，红三叶草提取物是红三叶草提取物粉末。
15.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其特征在于，石榴提取物是石榴提取物粉末。
16.一种提高包括石榴和红三叶草的复合提取物的组合物的更年期障碍改善效果的方法，其特征在于，将石榴提取物和红三叶草提取物以1:1至1:4的重量比混合。
17.一种更年期症状改善用石榴及红三叶草复合提取物的制备方法，包括：
步骤S1：在石榴果肉中添加淀粉分解酶并加热浓缩，以制备石榴果肉提取物的；
步骤S2：在红三叶草地上部分中添加作为溶剂的水、碳原子数为1至4的低级醇或它们的混合物，以制备红三叶草地上部分提取物；
步骤S3：将石榴果肉提取物和红三叶草地上部分提取物混合并搅拌。
18.根据权利要求17所述的更年期症状改善用石榴及红三叶草复合提取物的制备方法，其特征在于，在进一步加热浓缩所述红三叶草地上部分提取物后，添加多糖类并干燥，从而以红三叶草地上部分提取粉末在步骤S3中混合。
19.根据权利要求17所述的更年期症状改善用石榴及红三叶草复合提取物的制备方法，其特征在于，在所述石榴果肉提取物中进一步添加多糖类并干燥，从而以石榴果肉提取粉末在步骤S3中混合。
20.一种改善更年期障碍的方法，包括如下步骤：向需要改善更年期障碍的对象给药包括石榴和红三叶草的复合提取物作为有效成分的组合物。
21.石榴及红三叶草复合提取物在更年期障碍改善用组合物制备中的用途。
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