CN110946892B - 红菽草萃取物用于提升玻尿酸合成酶的基因表现量的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于植物提取物领域，尤其是一种红菽草萃取物用于提升玻尿酸合成酶之的基因表现量的用途。本发明的红菽草萃取物是红菽草以水、醇、或醇水混合物的溶剂所萃取而得，其可用于提升尿酸合成酶的基因表现量，能增加皮肤含水量及减少皮肤皱纹，以使皮肤形成更多保湿因子，并维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。
Description
技术领域
本发明是关于植物提取物领域，尤其是红菽草萃取物用于提升玻尿酸合成酶的基因表现量的用途。
背景技术
表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。
表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。
综合上面所述，为了改善因角质细胞受损及保水能力下降，导致皮肤变得脆弱、易敏的问题，开发一种能有效使角质细胞分泌更多保湿因子，并维持角质细胞排列、维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能的组成物，着实有其必要性。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种红菽草萃取物用于制备提升玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase，HAS)基因表现量的组合物的用途，其中该红菽草萃取物是以一溶剂萃取一红菽草所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。
在本发明的一实施例中，该溶剂与该红菽草的重量比为5～20∶1～5，且该萃取步骤是在50℃～100℃进行。
在本发明的又一实施例中，该玻尿酸合成酶基因为玻尿酸合成酶2 (Hyaluronansynthase 2，HAS2)基因。
在本发明的又一实施例中，该红菽草萃取物的浓度为至少0.0039mg/mL。
在本发明的另一实施例中，该红菽草萃取物是提升皮肤保湿能力，以及减少皮肤皱纹。
本发明以水、醇类、或醇水混合物为溶剂所萃取得的红菽草萃取物，能有效提升角质细胞中合成玻尿酸的HAS2基因的表现量，并能有效增加皮肤含水量及减少皱纹，以使皮肤形成更多保湿因子，并维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。因此，本发明的红菽草萃取物可用于制备提升皮肤保湿能力的组合物的用途，该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
附图说明
图1为本发明的红菽草萃取物提升HAS2基因表现量的效果的直方图；** p＜0.01；
图2为本发明的红菽草萃取物提升皮肤含水量的效果的直方图； *p＜0.05；##p＜0.01；
图3为本发明的红菽草萃取物减少皮肤皱纹的效果的直方图。
具体实施方式
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
本发明提供一种红菽草萃取物用于制备提升玻尿酸合成酶(Hyaluronansynthase，HAS)基因表现量的组合物的用途，本发明的红菽草萃取物是以一溶剂萃取一红菽草所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，其可用于增加皮肤含水量及减少皮肤皱纹。
同时，本发明用于制备提升角质细胞中HAS基因表现量的组合物，亦可包含一有效量的红菽草萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是以粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型存在，且其剂型是以食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂的形式提供。
以下将详细说明本发明红菽草萃取物的详细萃取方法，与该红菽草萃取物于调控角质细胞中TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、AQP3 基因、FLG基因、SMAD1基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的测试、以及增加皮肤保水度与减少皱纹的测试，以证实该红菽草萃取物对于提升HAS基因表现量、以及增加皮肤含水量及减少皮肤皱纹的效果。
实施例1本发明的红菽草萃取物的制备方法
红菽草(Trifoliumpratense)是豆科(Fabaceae)菽草属(Trifolium)的多年生草本植物，原产于欧洲及亚洲北部，中国台湾早期引进作为牧草、水土保持植物，偶尔也供栽植观赏。红菽草茎为直立或斜上升茎，长约15-65公分，具有分枝及散生绒毛；叶则为三出复叶，呈卵形、倒卵形或长椭圆形，长约1.5-3公分，宽则为0.5-2公分；花为粉红色且密集生长，其排列为一头状花序。红菽草具有清热止咳、消肿的功效。
在本发明一实施例中，将红菽草整株清洗，取洗净后的红菽草整株与水的萃取溶剂以5-20∶1-5的重量比混合，在溶剂中进行萃取0.5-3小时后。萃取后冷却至室温，将该粗萃取物经由0.45-0.2微米的滤网过滤以获得滤液。最后，将该滤液于45-70℃进行减压浓缩并加入防腐剂，得到本发明的红菽草萃取物。
实施例2本发明的红菽草萃取物调控角质细胞中基因表现量的功效
本发明以人类初代皮肤角质细胞(human primary epidermal keratinocytes，HPEK)进行本发明的红菽草萃取物调控TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、 KRT14基因、APQ3基因、FLG基因、SMAD1基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因表现量的分析。该人类初级皮肤角质细胞购自CELLnTEC公司(瑞士)编号HPEK-50，将该细胞培养于无血清的角质细胞培养液 (keratinocyte-SFM)(Gibco公司，编号为#17005042，美国)，并于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
将人类初代角质细胞分成两组：(1)加入0.0039mg/mL本发明的红菽草萃取物的实验组以及(2)仅含有细胞培养液的控制组作用24小、时，接着将角质细胞以细胞裂解液(RBbuffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No. RBD300)分别收集两组细胞内的RNA，接着利用
III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板并以引物产生mRNA反转录的相应eDNA产物，接着利用ABI StepOnePlusTMReal-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将两组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时反转录聚合酶连锁反应(quantitative real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction)试验，条件为95℃反应1秒， 60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG基因、SMAD1基因、GBA基因、HAS2基因、及HAS3基因的mRNA表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2-Δct，其中ΔCt＝Ct目标基因-CtACTB(β-肌动蛋白，beta-actin)，再利用Excel软件进行非成对单尾student t-test以决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值＜0.05；**p值＜0.01；***p值＜0.001)。
表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物
本发明的红菽草萃取物提升HAS2基因表现量的结果如图1所示。其中玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase，HAS)会促进角质细胞分泌玻尿酸的能力，并使皮肤角质层结构完整且提升皮肤屏障功能，能使皮肤保水力提升。人类初代角质细胞经本发明的红菽草萃取物处理后，HAS2基因表现量为控制组的1.3 倍，TGM1基因、KRT1基因、KRT10基因、KRT14基因、AQP3基因、FLG 基因、SMAD1基因、GBA基因、及HAS3则与控制组差异不大，此结果显示本发明的红菽草萃取物是藉由提高HAS2基因的表现量，而有效提高玻尿酸的合成，并使皮肤保湿能力上升。
实施例3本发明的红菽草萃取物于增加人体皮肤含水量及减少皱纹的功效
为证实本发明的红菽草萃取物于增加皮肤含水量及减少皱纹产生的功效，首先，制备添加2％红菽草萃取物的2％红菽草精华液；以及不合红菽草萃取物的精华液作为对照组精华液，其中该精华液成分皆为水、馨鲜酮、己二醇、 1，3-丁二醇、三仙胶、增稠剂以及三乙醇胺。接着，募集8位受试者，每位受试者于每日早晚清洗完脸部后，将控制组精华液、含本发明的红菽草萃取物精华液分别使用于左右半脸的肌肤，并以指腹稍加按摩促进吸收，于使用前与使用后4周以VISIA肌肤检测仪(CIS-VISIA.7 VISIA Complexion AnalysisSystem，Canfield scientific，美国，序号V71214)进行皮肤含水量及纹路的肤质检测，其中以VISIA肤质检测仪进行皮肤纹路检测，是利用高解析单眼相机搭配三种光源(全光域波长、紫外光及偏光波域的光源)，拍摄脸部肌肤，取得清晰图文件后，利用专业软件进行纹路分析；含水量检测则是以CK 
dual MPA 580多探头肤质分析仪(CKelectronic，德国)进行测定，利用电容测量来测量皮肤水合作用的状态，其中是利用探头按压皮肤进行测量。
本发明的红菽草萃取物于增加皮肤含水量的结果如图2所示；于减少皱纹产生的实验结果如图3所示。使用含本发明的红菽草萃取物的精华液后，比使用前提高了皮肤含水量25.8％，未含本发明的红菽草萃取物的控制组仅提高 10％；而使用含本发明的红菽草萃取物的精华液后，比使用前减少了皮肤纹路深度12.8％，未含本发明的红菽草萃取物的控制组反而上升20.7％。此二结果显示本发明的红菽草萃取物能有效提高皮肤含水量及减少皮肤皱纹深度，具有提升皮肤保湿能力的效果。
综上所述，本发明的红菽草萃取物，能有效提升角质细胞中合成玻尿酸的 HAS2基因的表现量，并能有效增加皮肤含水量及减少皱纹，以使皮肤形成更多保湿因子，并维持角质层结构完整，以提升皮肤屏障功能。因此，本发明的红菽草萃取物可用于制备提升皮肤保湿能力的组合物的用途，该组合物可为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状，且可制成食品、饮品、药品、试剂或营养补充剂，藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。
Claims (6)
1.一种红菽草萃取物用于制备提升玻尿酸合成酶2(Hyaluronan synthase2,HAS2)基因表现量以使角质细胞玻尿酸合成量增加的组合物的用途，其中该红菽草萃取物是以一溶剂萃取一红菽草所获得，该溶剂为水，且所述溶剂与所述红菽草的重量比为5～20：1～5，于一萃取温度为50℃-100℃之萃取条件进行萃取，所述红菽草为整株红菽草。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述红菽草萃取物的浓度为至少0.0039mg/mL。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述红菽草萃取物是提升皮肤保湿能力。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述红菽草萃取物是减少皮肤皱纹。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包含一医药上可接受的载体。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物的形式为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型。
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