KR102514071B1 - 체내흡수율이 증가된 엘라그산과 갈산을 고함량 포함하는 부종 또는 비만 개선용 석류 발효조성물 및 efc 공법을 이용한 그의 제조방법 - Google Patents
체내흡수율이 증가된 엘라그산과 갈산을 고함량 포함하는 부종 또는 비만 개선용 석류 발효조성물 및 efc 공법을 이용한 그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 체내흡수율이 증가된 엘라그산과 갈산을 고함량 포함하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물 및 EFC 공법을 이용한 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 EFC 공법을 이용하여 석류를 특정 효소와 균 주로 발효하여 갈산과 엘라그산 등 유효성분이 현저하게 증가되어 부종이나 비만의증상에 대한 예방 또는 개선용으로 유용한 석류 발효조성물과 그 제조방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명이 조성물은 건강식품, 약학조성물 또는 동물용 사료첨가제 등으로 유용하다.
Description
본 발명은 체내흡수율이 증가된 엘라그산과 갈산을 고함량 포함하는 부종 또는 비만 개선용 석류 발효조성물 및 EFC 공법을 이용한 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 EFC 공법을 이용하여 석류를 특정 효소와 균주로 발효하여 갈산과 엘라그산 등 유효성분이 현저하게 증가된 부종 또는 비만의 예방과 개선 효과가 있는 석류 발효조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.
석류는 이도금양목, 부처꽃과, 석류나무속, 석류나무과, 석류나무종에 속하는 낙엽 활엽 소교목으로 약 500여종이 존재한다. 석류는 이란이 원산지이고 인도, 파키스탄 등 남아시아에서 주로 생산되며 우리나라에는 조선시대에 들어왔다.
열매는 얇은 칸막이가 된 여섯 개의 작은 방으로 나뉘고 그 안에 수많은 씨앗을 품고 있다. 석류는 새콤달콤하면서 독특한 맛과 뛰어나고 다양한 건강상 이로움 때문에 세계적으로 가장 인기 있는 기능성 식품의 하나로 꼽히고 있으며, 그 소비가 급속히 확대되고 있다.
석류에는 탄수화물 단백질, 지방, 비타민 B군, C, E, K, 무기물 등 풍부한 영양성분을 함유하고 있다. 특히 항산화, 항암, 항균, 항염증 등 강력한 생리활성을 가진 페놀성 화합물을 비롯한 식물 estrogen 등 다양한 종류의 phytochemicals을 함유하고 있다.
석류의 대표적인 효능은 갱년기 장애 개선과 피부보호 기능이며, 이미 대한민국 식품의약품안전처에 건강기능식품 원료로 등재되어있다. 이와 같은 효능은 석류에 함유되어 있는 엘라그산으로부터 생성되는 urolithin과 같은 에스토로겐 유사물질(estrogenic substances)과 갈산과 같은 페놀성 화합물에 의한 강력한 항산화 물질에 기인한다.
그런데 이러한 두가지 대표적인 생리활성 물질은 실제로 석류즙에 함유되어 있기는 하지만 매우 미량 함유하고 있으며, 대부분 이들이 전구물질인 ellagtannin과 gallotannin 등 분해성 탄닌(hydrolyable tannins)으로 존재한다.
따라서 석류 과즙에서 유효성분의 활성을 개선하기 위해서는 엘라그산과 갈산을 증대시켜 체내흡수를 촉진할 수 있는 기능성 원료생산 기술개발이 필요하다.
비만은 과다한 식품이나 지방질, 탄수화물 등이 다량 함유된 식품 등의 섭취가 대부분 영향을 주는 것으로 알려 있으며, 섭취한 열량 중에서 소모되고 남은 부분이 지방으로 전환되어 체내에 과잉으로 축적된 상태를 말한다.
비만의 원인은 과식을 비롯한 유전적, 심리적, 생활습관 등 요인을 들수 있지만, 식생활과 생활습관과 운동부족 등 생활환경에 의해 비만이 발맹하는 것이 대부분이다.
기존에 알려진 비만 치료제로는 크게 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물, 대사 작용에 의한 약물 등로 나누어 볼 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 각각의 기전에 따라 세로토닌 신경계를 저해하는 펜플루라민, 덱스펜플루라민 등의 약물, 노르아드레날린 신경계를 통한 에페드린 및 카페인 등의 약물 등이 알려져 있으며, 일부에서는 세로토닌 및 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하여 비만을 저해하는 시부트라민 등의 약물들이 시판되고 있다.
또한, 비만 치료를 위해 위장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로는 대표적으로 췌장에서 생성되는 리파제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여줌으로써 최근 비만 치료제로 허가된 오를리스타트 등이 있다.
그러나 기존에 사용되어온 약물은 대부분 다양한 부작용을 일으켜 최근에 사용이 금지되거나 혈압감소나 유산산혈증, 심부전, 신장질환 등에 사용이 제한되는 문제가 있다.
그러므로 부작용이 적으며 보다 우수한 비만 예방 또는 치료제에 대한 요구가 많고, 그 대안으로 천연물이 떠오르고 있다.
기존에 석류 등을 이용하여 비만 치료 용도로 적용된 예가 일부 나타나고 있으며, 그 예로 한국특허등록 제10-1144059호에서는 석류 추출물, 홍삼 추출물, 상엽 추출물 및 산죽 추출물을 포함하는 당뇨병 또는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 제안되어 있으며, 한국특허등록 제10-1099718호에서는 석류를 냉수, 에탄올 또는 열수 추출한 추출물을 이용한 비만치료용 조성물이 제안되어 있다.
또한, 한국특허등록 제10-2112599호에서는 석류와 유자를 특정 비율로 혼합하여 추출한 추출물을 이용한 비만 개선용 건강식품 조성물에 제안되어 있고, 한국특허등록 제10-2214532호에서는 석류를 비롯한 우유, 가르시이나 캄보지아 등의 혼합물에 대한 유산균 발효물을 이용하는 항염증 및 항비만용 조성물이 제안되어 있다.
그러나 이러한 종래의 기술에서는 단순하게 석류 추출물이 항비만 등에 이용되는 것을 제안하고 있는 수준으로서, 유효성분의 함량이 적어서 항비만 효과가 미미할 뿐만 아니라 체내 흡수도 한계가 있어서 그 효과를 충분하게 기대하기 어려운 문제가 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제 해결을 위하여, 석류에 함유된 엘라그산, 갈산 등 유효성분의 함량을 현격하게 증대시키고, 체내흡수율을 향상시켜 항비만 등의 작용 효과를 현저하게 향상시키는 것을 해결과제로 한다.
따라서 본 발명의 목적은 석류에 함유된 유효성분의 전구물질에 직접 작용하는 효소와 균주를 이용하여 유효성분의 함량을 고함량으로 함유하는 부종 또는 비만의 에방 또는 개선용 석류 발효조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 석류를 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)로 효소발효시켜 얻은 발효물을 유효성분으로 함유하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 발효물은 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하나 이상을 발효한 발효물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 탄네이즈는 0.01∼1 중량% 사용하고, Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)는 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml 로 발효된 발효물을 포함할 수 있다.
본 발명의 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 조성물은 건강식품으로 유용하다.
또한, 본 발명의 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 조성물은 약학조성물로 유용하다.
또한, 본 발명의 부부종이나 비만의 예방 또는 개선용 조성물은 동물사료용 첨가제로 유용하다.
또한, 본 발명은
석류 과육으로부터 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하나이상의 석류 원액을 제조하는 단계;
석류 원액을 5-10brix로 희석하여 탄네이즈 0.01∼1 중량%와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)의 유산균 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml 로 처리하고 30~40℃에서 2~48시간 동안 진탕 배양하는 단계; 및
상기 진탕 배양하여 얻은 효소반응액을 70∼80℃에서 효소를 실활하는 단계
를 포함하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 진탕 배양은 80~200rpm으로 교반 하에 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 효소를 실활하는 단계는 5~30분간 수행될 수 있다.
본 발명은 석류 추출물에 존재하는 가수분해성 탄닌을 EFC공법으로 발효시켜 엘라그산과 갈산 및 페놀성 화합물 등의 유효성분을 짧은 시간에 선택적으로 다량 생성할 수 있는 효과가 있다.
본 발명은 상기와 같은 유효성분이 고함량으로 함유되어 있으므로, 이러한 유효성분 강화로 인해 항산화 효과가 우수하고 특히 부종이나 비만 등의 억제나 개선 효능이 현저하게 증가되는 효과가 있다.
또한, 반응을 통해 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중의 tannin이 감소되어 떫은 맛이 줄어 맛을 개선하는 등 품질을 현저하게 향상시킬 수 있는 효과도 있다.
도 1은 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물의 갈산과 엘라그산의 증가를 나타낸 그림이다.
도 2는 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물에 대한 갈산과 엘라그산의 함량변화를 보여주는 HPLC profile 이다.
도 3은 석류에 대하여 발효 전(Control)과 비교예 1(Tanase) 및 실시예(Tan+L)의 발효 후 석류즙이 LPS에 의해 유도된 NO생성 억제효과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물에 대한 갈산과 엘라그산의 함량변화를 보여주는 HPLC profile 이다.
도 3은 석류에 대하여 발효 전(Control)과 비교예 1(Tanase) 및 실시예(Tan+L)의 발효 후 석류즙이 LPS에 의해 유도된 NO생성 억제효과를 비교하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 석류를 이른바 EFC(효소발효공법)을 이용하여 부종이나 비만 개선에 특히 효과가 우수한 석류 발효조성물로 제조한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 석류를 효소 발효함으로써, 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 등(이를 ‘석류즙’ 또는 ‘석류 원액’으로 통칭할 수 있음)에 존재하는 가수분해성 탄닌(hydrolyable tannins)을 탄네이즈와 새로운 유산균(Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023))로 효소 발효시켜 엘라그산과 갈산의 함량을 획기적으로 증가시킨 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 본 발명의 석류 발효조성물은 항산화 및 비만 개선 효과가 우수한 엘라그산과 갈산의 함량이 현저한 증가된 석류발효액으로 제공될 수 있다. 바람직하게는 갈산은 5배 이상, 엘라그산은 1.5배 이상 증가된 효과를 얻을 수 있으며, 항산화 활성 및 비만 억제활성을 월등하게 증가시킬 수 있다.
이렇게 본 발명의 방법으로 석류의 주요 유효성분의 함량을 현저하게 향상시킬 수 있는 것은, 석류를 발효함에 있어서 특정 조건의 발효를 수행함으로써 가능한 것이다. 이를 위해 본 발명에서는 석류를 탄네이즈와 유산균으로 발효처리하여 석류즙에서 생리활성 성분을 증가시켜서 현저하게 우수한 효과를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 석류를 효소발효공법을 이용하여 발효처리할 수 있다. 여기서 효소발효공법(EFC; Enzyme Fermentation Control System)이라 함은 효소 존재하에 발효 처리하는 공법으로서, 이러한 공법을 이용해 생리활성 물질을 구조를 전환하면 체내흡수가 현저하게 잘 이루어지고, 또 약리효능이 높은 유효성분을 대량 생산할 수 있도록 해주는 특화된 공법이라 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명에서는 석류 추출물에서 핵심 phytoestrogen인 엘라그산과 갈산을 이들의 전구물질에 직접 작용하는 효소와 특수균주를 사용하여 효소발효공법을 이용함으로 인해 단기간에 엘라그산과 갈산 등 유효성분을 획기적으로 증가시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 발효물인 석류 추출물인 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하나 이상을 발효한 발효물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 탄네이즈는 0.01∼1 중량%와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023) 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml 이 동시에 적용되어 발효된 것을 특징으로 한다, 여기서 효소만 적용하거나 유산균만 적용하는 경우는 본 발명에 따른 현저한 생리활성 효과를 얻기 어렵다.
특히, 본 발명에 따르면 상기 효소는 탄네이즈가 바람직하게 사용될 수 있고, 유산균으로서는 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)가 선택적으로 바람직하게 사용되는데, 여기서 유산균이 다른 종류로 사용되는 경우 본 발명에 따른 효과를 기대할 수 없다.
이와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명은 탄네이즈를 단독 사용하거나 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 단독으로 사용하여 발효하는 경우는 본 발명의 목적달성이 어렵다. 또한, 탄네이즈 사용 후 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 사용하거나 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023) 유산균 사용 후 탄네이즈를 사용하는 경우에도 본 발명의 목적달성이 어렵다.
따라서 본 발명은 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용하여 발효처리하여 상승효과를 얻는 것에 기술적 의의가 있다. 이러한 두 성분을 동시에 사용하는 경우 본 발명의 우수한 효과를 얻을 수 있다. 그러므로 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용하는 경우 선택적으로 활성성분인 갈산이나 엘라그산 등의 생리활성 성분이 다른 경우에 비해 상승효과로 현저하게 우수한 결과를 나타낼 수 있다. 또한, 체내 흡수율도 현저하게 개선된다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같은 효소발효공법을 적용하기 위해서, 본 발명에서는 우선 석류 과육으로부터 압착방법에 의한 석류 추출물을 준비할 수 있다. 이러한 석류 추출물은 예컨대 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 등으로 준비할 수 있다.
이렇게 준비된 석류 추출물은 특정 효소와 특정 유산균으로 발효처리하는데, 예컨대 석류 추출물을 5-10brix로 희석하여 탄네이즈 0.01∼1 중량%. 더 좋기로는 0.05~0.5 중량%와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)의 유산균 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml. 더 좋기로는 0.8x107cfu/ml 내지 1.5x107cfu/ml로 처리하여 발효하고 30~40℃에서 2~48시간 동안 진탕 배양하는 단계를 거칠 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 발효처리하여 진탕 배양하여 얻은 효소반응액을 70∼80℃에서 효소를 실활하는 단계를 거쳐서 목적하는 석류 발효조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 진탕 배양은 80~200rpm, 더 바람직하게는 100~150rpm으로 교반 하에 이루어질 수 있다. 또한, 상기 발효 배양 후 효소를 실활하는 단계는 5~30분간 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 제조된 석류 발효조성물은 엘라그산이나 갈산 등의 생리활성 성분이 현저하게 향상된 결과물로 얻어질 수 있으며, 이러한 석류 발효조성물은 항산화 효과는 물론 부종이나 비만의 개선에 매우 우수한 효과를 나타낸다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 석류 발효조성물을 유효성분으로 하는 부종 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 본 발명의 부종 또는 비만의 예방 또는 개선용 조성물은 건강식품으로 매우 유용하다. 특히 이러한 본 발명의 조성물을 상기 용도로 사용하는 경우 생체 흡수율이 우수하여 우수한 사용 효과를 발휘할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 본 발명의 조성물을 건강식품으로 이용하는 경우에는 정제, 캅셀제, 과립, 그래뉼, 환제, 겔제, 분말, 젤리, 액제, 드링크, 탄산음료, 청량음료 등 다양한 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기와 유사한 제형으로 경구투여용 약학조성물로 유용하다.
본 발명의 조성물은 다양한 형태의 통상적인 첨가제, 부형제 등을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 건강식품이나 약학조성물은 유효성분 성인 기준으로 1회 10~1,000mg의 량으로 1일 2~3회 경구투여 할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 따른 석류 발효조성물은 본 발명은 석류 추출물에 존재하는 가수분해성 탄닌을 EFC공법으로 발효시켜 엘라그산과 갈산 및 페놀성 화합물을 짧은 시간에 선택적으로 다량 생성할 수 있는 것이다. 그러므로 본 발명은 엘라그산과 갈산 등 유효성분을 단기간에 획기적으로 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
이러한 본 발명의 석류 발효조성물은 생리활성이 우수한 유효성분 강화로 인해 부종 억제나 항비만 효과 등이 우수하여 부종이나 비만의 예방 또는 개선 효능이 현저하게 증가되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하나이상의 석류 원액에 대하여 효소발효 반응을 통해 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중의 tannin이 감소되어 떫은 맛이 크게 감소하여 맛도 향상시킬 수 있어서, 석류 추출물이나 이를 이용한 건강식품, 의약품 등에 대하여 품질을 향상시킬 수 있는 효과도 있다.
또한, 본 발명은 이러한 부종이나 비만에 대한 예방과 개선 효과가 우수함으로 인해 동물용 약제나 동물사료용 첨가제 등으로 활용할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의거 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 석류 발효조성물의 제조
(1) 석류과육으로부터 압착방법에 의한 석류착즙 원액(석류즙)을 제조하는 단계를 거친다.
(2) 상기 (1)단계에서 제조한 석류착즙 원액을 8brix로 희석하여 탄네이즈0.2 중량%와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)(1x107cfu/ml)로 처리하고 34℃에서 24시간 발효하고, 120rpm으로 교반하에 진탕 배양하는 단계를 거쳐서 효소반응액을 얻는다.
(3) 상기 (2)단계에서 얻은 효소반응액을 70∼80℃에서 10분간 처리하여 효소를 실활시킨다.
(4) 상기 단계에서 실활한 효소 반응액을 석류 농축액으로 조제하여 석류 발효조성물을 제조한다.
비교예 1
상기 실시예와 동일한 비교 조건으로 실시하되, 효소로 탄네이즈(TAH; Tannin acylhydrolase)를 단독으로 사용하되 유산균을 사용하지 아니한 다음 발효하고 진탕 배양하여 석류 발효조성물을 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예와 동일한 비교 조건으로 실시하되, 효소로 탄네이즈(TAH)를 사용한 후, 이어서 유산균으로 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 사용하여 발효하고 진탕 배양하여 석류 발효조성물을 제조하였다.
비교예 3
상기 실시예와 동일한 비교 조건으로 실시하되, 유산균으로 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 사용하여 발효하고, 이어서 효소로 탄네이즈(TAH)를 사용한 후 진탕 배양하여 석류 발효조성물을 제조하였다.
비교예 4
상기 실시예와 동일한 비교 조건으로 실시하되, 유산균으로 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 사용하여 발효하고 진탕 배양하여 석류 발효조성물을 제조하였다.
실험예 1 : 유산균 선발을 위한 발효효과 비교
유산균의 발효 효과를 비교하기 위해, 상기 실시예와 동일한 원료를 사용하여 발효시키되, 효소를 사용하지 아니하고 유산균으로 Lactobacillus brevis, Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023), Lactobacillus panaxibrevis DCY65, Bacillus amyloliquefaciens, Saccharomyces cerevisiae 를 각각 단독으로 사용하여 발효하여 석류 발효조성물을 제조하였다.
상기 각 유산균 사용 발효조성물에 대하여 갈산 생성량을 대조군과 비교하여 측정하였다. 그 결과로, 하기 표 1은 발효를 위한 균주선발을 위해 갈산 생성량을 기준으로 나타낸 결과이다.
상기 표 1에서 보면, 갈산 생성량에서 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)가 다른 균주에 비하여 월등하에 우수한 효과를 보인다. 따라서 유산균으로 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 이용하는 것이 갈산 등 유효 생리활성 물질의 증가에 선택적으로 우수한 효과가 있음을 보여준다.
실험예 2 : 갈산 생성량 비교를 통한 효과 비교실험
상기 실시예와 비교예 1 ~ 4에 대하여 각 시료에 대해 발효처리 후 최종 생성된 석류 발효조성물에 대하여 각각 갈산 생성량을 측정하여 비교하였다.
그 결과는, 하기 표에 나타내었 다. 하기 표 2는 탄네이즈(TAH) 및 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)의 각각 단독 사용과 순차적 사용(화살표로 표시), 그리고 동시 혼합 사용(+로 표시)에 따른 동일 조건에서의 갈산 생성량의 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
상기 표 2에서 보면, 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우가 다른 비교군에 비하여 월등하게 우수한 갈산 생성량의 증가을 보여준다. 이 결과로부터, 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023) 를 각각 단독으로 사용하거나 순차적으로 사용하는 경우에 비해 이들을 동시에 사용하는 경우가 현저하게 우수한 상승효과가 있음을 확인할 수 있다.
실험예 3 : 갈산과 엘라그산의 함량변화 실험
상기 실시예의 시료에 대한 엘라그산(Ellaguc acid)과 갈산(Gallic acid) 분석은 HPLC시스템으로 분석하였다. HPLC system은 Agilent 1260 Infinity Quaternary 펌프(G1311B), Agilent 1260 Infinity이었으며, 표준자동 시료 주입기(G1329B), Agilent 1260 Infinity 컬럼 온도 조절 장치 구획(G1316A), 및 Agilent 1260 Infinity Variable Wavelength Detector(G1314F)가 기기로 사용되었다.
사용한 컬럼은 ZORBAX Eclipse Plus C18 컬럼(250mm × 4.6mm, 5μm 입자 크기)(Mil ford, MA, USA)이 고정상으로 선택되었다. 이동상은 농도구배로 용리액 조성은 다음과 같다. (0-16분, 15-30% B, 16-34분, 30-100% B, 34-40분, 100-100% B, 40-41분, 100-15% B; 41-42분 15-15% B)
상기 실험으로 석류즙의 발효 전(대조군)과 실시예에 따른 발효 후의 시료에 대하여 갈산 및 엘라그산 함량변화를 측정하여 본 결과는 다음 표 3 및 도 1과 같다.
| 함량단위 (UG/ML 60BRIX) | Gallic acid | Ellagic acid |
| Control | 56 | 140 |
| TAH+L. DCY75 | 314 | 210 |
상기 표에서의 결과에 대해, 함량변화를 보여주는 HPLC profile은 도 2와 같다.
이 결과로부터 실시예와 같은 방법으로 발효처리한 석류 발효조성물의 경우 발효 전에 비해 갈산과 엘라그산 모두에서 월등하게 증가한 것으로 확인되었다.
실험에 4 : 항산화 활성 변화
실시예의 발효추출물의 항산화 활성은 DPPH 이용한 자유 라디칼 소거 활성 측정법으로 실시하였다. 즉, 에탄올에 용해시킨 DPPH 용액을 495㎕씩 시험관에 분주하고, 여기에 상기 시료를 5㎕씩 첨가하여, 최종 반응용액이 500㎕가 되도록 하였다. 이를 일정시간 동안 반응시킨 후, 96-wall plate에 200㎕ 씩 2개의 wall에 분주한 뒤 517nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다. 활성도는 gallic acid, Rutin 및 Ascorbic acid 대등량으로 각각 표시하였다.
항산화 활성 척도의 하나인 reduci ng power는 Nayan 등(2013)의 방법에 따라 다음과 같이 측정하였다. 즉, 10-100ug/ml 농도의 시료와 표준용액을 1.0ml의 탈이온 증류수에 녹인 후 2.5ml의 인산염완충액(pH 6.5)과 2.5ml의 potassium ferric yanide 용액과 혼합하였다. 이 용액을 50℃에서 20분간 반응시킨 후 식힌 다음 2.5ml의 10% TCA용액을 천가하고 잘 섞은 후 3,000rpm에서 10분간 원심분리하였 다. 상등액 2.5ml 취한 다음 2.5ml의 증류수와 신선한 0.1% ferric chloride용액을 첨가하고 700nm에서 흡광도 변화를 측정하였다. Reducing power 계산은 gallic acid, rutin 및 ascorbic acid를 대조로 측정하여 나타내었다.
하기 표 4는 시료인 석류즙의 발효 전(대조군)과 비교예 1 및 실시예에 의한 발효 후 항산화 활성 변화를 나타낸 것이다.
상기 표 4에서 보면, 실시예의 시료의 경우 다른 시료에 비해 월등하게 우수한 항산화 활성을 나타내는 것으로 확인된다.
실험예 5 : 중성지방 측정에 의한 항비만 효과실험
상기 실시예의 시료에 대하여 항비만 효과를 확인하기 위하여, MDI로 분화가 유도된 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 cell lysate에서 실시예에서 제조된 석류 발효추출물 등 각 시료를 처리한 후 중성지방의 축적 정도를 정상대조군(p<0.01 vs 정상대조군) 및 유발대조군(p<0.05 vs 유발대조군)과 비교하였다.
중성지방(TG) 측정은 Trypsin-EDTA 처리로 세포를 분리한 다음 원심분리(12,000rpm, 3min, 4℃)하여 상층액을 제거하였다. 1.5 ml의 튜브에 남은 펠릿은 lysis buffer(50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 10 mM EDTA 및 0.1% Tween-20, pH 7.5 with HCl, 및 Halt Protease Inhibitor Cocktail)로 세포 내 지방 및 단백질 등을 추출하였다. 추출된 cell lysate 내 TG의 농도는 Enzychrom TM Triglyceride Assay Kit(BioAssay Systems, Hayward, CA, USA,)를 사용하여 spectrophotomerter를 이용하여 흡광도 570nm로 측정하였다
참고로, 유발균에 대해서는 생리식염수를 동일 방법으로 적용하였으며, 이와 같은 실험결과는 다음 표에 나타내었다.
| 시료 | TG (μM/L) | TG 감소율(%) |
| 실시예 | 49 | 22.2 |
| 비교예 1 | 56 | 11.1 |
| 비교예 2 | 57 | 9.5 |
| 비교예 3 | 59 | 6.4 |
| 비교예 4 | 60 | 4.8 |
| 정상군 | 42 | - |
| 유발군 | 63 | - |
이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우 22% 이상의 중성지방(TG) 감소 효과를 보이고 있어서, 다른 비교군의 4.8% ~ 11.1% 감소에 비하여 중성지방 감소율이 현저하게 우수함을 확인할 수 있다. 이로부터 실시예의 시료가 비만 억제 효과에 월등하게 우수한 효과가 있음이 확인된다.
실험예 6 : 아디포넥틴 측정에 의한 항비만 효과실험
상기 실시예의 시료에 대하여 항비만 효과를 확인하기 위하여, MDI로 분화가 유도된 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 cell lysate에서 실시예와 비교예 시료를 처리한 후 아디포넥틴(adiponectin)의 생성 정도를 정상대조군(p<0.05 vs 정상대조군) 및 유발대조군(p<0.05 vs 유발대조군)과 비교하였다.
지방전구세포 3T3-L1 cell lysate 또는 cell supernatant로 Adiponectin ELISA kit(Koma Biotech, Korea)을 이용하여 아디포넥틴(adiponectin)의 생성량을 측정하였다.
Manufacturer's instruction에 따라 ELISA microplate reader(Molecular Devices Co., Ltd., U.S.A.)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
지방세포 분화가 유도된 유발대조군의 아디포넥틴 농도는 분화를 유도하지 않은 정상대조군에 비해 약 5배 증가하는 것으로 관찰되었다.
참고로, 유발균에 대해서는 생리식염수를 동일 방법으로 적용하였으며, 그 실험결과는 다음 표와 같다.
| 시료 | adiponectin (pg/ml) | adiponectin 감소율(%) |
| 실시예 | 68 | 72.4 |
| 비교예 1 | 214 | 13.0 |
| 비교예 2 | 217 | 11.8 |
| 비교예 3 | 219 | 10.0 |
| 비교예 4 | 228 | 7.3 |
| 정상군 | 51 | - |
| 유발군 | 246 | - |
이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우 72%이상의 아디포넥틴 감소 효과를 보이고 있어서, 다른 비교군의 7.3% ~ 13% 감소에 비하여 아디포넥틴 감소율이 현저하게 우수함을 확인할 수 있다. 이로부터 실시예의 시료가 비만 억제 효과에 월등하게 우수한 효과가 있음이 확인된다.
실험예 7 : 렙틴 측정에 의한 항비만 효과실험
상기 실시예의 시료에 대하여 항비만 효과를 확인하기 위하여, MDI로 분화가 유도된 마우스 유래 지방전구세포 3T3-L1의 cell lysate에서 실시예와 비교예 시료를 처리한 후 랩틴(leptin)의 생성 정도를 정상대조군(p<0.05) 및 유발대조군(p<0.05)과 비교하였다.
실험은 3T3-L1 cell lysate 또는 cell supernatant로 Leptin ELISA kit(Koma Biotech, Seoul, South Korea)을 이용하여 랩틴의 생성량을 측정하였다. Manufacturer's instruction에 따라 ELISA microplate reader(Molecular Devices Co., Ltd., U.S.A.)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
참고로, 유발균에 대해서는 생리식염수를 동일 방법으로 적용하였으며, 그 실험결과는 다음 표와 같다.
| 시료 | leptin (pg/ml) | leptin 감소율(%) |
| 실시예 | 79 | 53.8 |
| 비교예 1 | 145 | 15.2 |
| 비교예 2 | 147 | 14.0 |
| 비교예 3 | 148 | 13.5 |
| 비교예 4 | 152 | 11.1 |
| 정상군 | 105 | - |
| 유발군 | 171 | - |
이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우 53% 이상의 렙틴 감소 효과를 보이고 있어서, 다른 비교군의 11.1% ~ 15.2% 감소에 비하여 렙틴 감소율이 현저하게 우수함을 확인할 수 있다. 이로부터 실시예의 시료가 비만 억제 효과에 월등하게 우수한 효과가 있음이 확인된다.
실험예 8 : 부종 개선 효능 실험
부종에 대한 효능을 실험하기 위하여 만성적인 부종이 있다고 답변한 30~50대의 검사대상자 35명(남자 14, 여자 21)을 선별하여, 상기 실시예와 비교예에 의해 제조된 시료를 각각 1일 2회(1,000mg/회)씩, 15일 간 매일 음용하도록한 뒤, 각 검사대상자에게 부종 부위의 둘레 길이 변화, 체중변화 및 부종 상태(육안 관찰)에 대한 설문 조사를 실시하였다.
각 검사대상자의 부종 부위는 각자가 평소 부종이 심하다고 느껴지는 특정 부위(얼굴, 손가락, 종아리, 발등 등)를 각자 지정하여 관찰하도록 하였다. 평가방식은, 부종부위 둘레 길이에 대하여, 감소, 불변, 증가 중에서 선택하고, 부종상태에 대하여, 완화, 불변, 악화 중에서 선택하도록 하였다. 또한, 체중변화에 대하여, 감소, 불변, 증가 중에서 선택하도록 하고 각 응답자가 선택한 변화에 해당하는 검사결과 변화 여부에 해당하는 검사대상자의 수를 숫자로 표시하였다.
그 결과는 다음 표와 같다.
| 측정항목 | 실시예 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | |
| 부종 둘레길이 |
감소 | 34 | 15 | 14 | 13 | 9 |
| 불변 | 1 | 17 | 18 | 19 | 22 | |
| 증가 | 0 | 3 | 3 | 3 | 4 | |
| 부종상태 | 완화 | 34 | 16 | 16 | 17 | 10 |
| 불변 | 1 | 16 | 16 | 15 | 21 | |
| 악화 | 0 | 3 | 3 | 3 | 4 | |
| 체중변화 | 감소 | 35 | 17 | 17 | 16 | 12 |
| 불변 | 0 | 16 | 17 | 18 | 20 | |
| 증가 | 0 | 2 | 1 | 1 | 3 | |
이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우 비교예 1~4에 비하여 부종 감소와 체중 감소 효과가 현저하게 우수함을 확인할 수 있다. 이로부터 실시예의 시료가 부종과 비만 억제 효과에 월등하게 우수한 효과가 있음이 확인된다.
실험예 9 : NO생성에 미치는 영향
NO 생성 및 억제활성은 Griess 방법으로 측정하였다. 즉, RAW 264.7 세포에서 NO를 측정하기 위하여 먼저 RAW264.7 cell을 well 당 1x104 세포를 seeding하고 24시간 배양하고 1ug/ml의 LPS와 함께 다양한 농도의 석류농축물(PG) 및 석류발효농축물(PG-F0 전처리하였다. 세포에서 생성되어 배양액 중에 유리된 NO를 측정하기 위하여 100ul의 배양액에 동량의 Griess resgent를 첨가하고 540nm에서 흡광도를 측정하였으며 sod. nitrite를 표준용액으로 사용하였다.
도 3은 발효 전(Control)과 비교예 1(Tanase) 및 실시예(Tan+L)의 발효 후 석류즙이 LPS에 의해 유도된 NO생성 억제효과를 비교하여 나타낸 그림이다. 이 실험결과에서, 실시예의 시료가 다른 비교군에 비해 월등하게 우수한 NO 생성 억제 활성 효과가 있음이 확인된다.
실험예 10 : 가수분해성 탄닌 함량 실험
상기 실시예와 비교예 1에 따른 시료에 대하여, 동일 조건에서 통상의 방법으로 가수분해성 탄닌의 함량을 측정하여 비교하였다.
이에 대한 대조군(발효나 효소처리 전)과의 비교는 다음 표에 나타내었다.
상기 표는 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물에 대한 가수분해성 탄닌 함량을 비교하여 나타낸 것이다. 이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우가 다른 비교군에 비하여 월등하게 우수한 탄닌 함량 감소 효과가 있음을 보여준다. 이 결과로부터, 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 혼합 사용하는 경우 탄네이즈 단독 사용에 비해 탄닌 감소에도 월등하게 우수한 상승효과가 있음을 확인할 수 있다.
실험예 10 : 관능평가
상기 실시예와 비교예 1에 따른 시료에 대하여, 동일 조건에서 맛을 비교하는 관능평가를 시행하였다.
관능평가는 5점 평가 방법으로 대학생(남 36명, 여 13명)과 주부(11명) 등 60명을 대상으로 하여 떫은 맛과 단맛을 비교하여 평가하도록 하였다.
이에 대한 대조군(발효나 효소처리 전)과의 비교는 다음 표에 나타내었다.
상기 표 10은 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물에 대한 떫은 맛과 단맛에 대한 관능을 비교하여 나타낸 것이다. 이 실험결과로부터 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 동시에 사용한 실시예의 경우가 다른 비교군에 비 하여 우수한 맛의 개선 효과가 있음을 보여준다. 이 결과로부터, 탄네이즈(TAH)와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)를 혼합 사용하는 경우 탄네이즈 단독 사용에 비해 맛에서도 우수한 상승효과가 있음을 확인할 수 있다.
상기 실험들의 결과로부터, 본 발명에 따른 실시예의 EFC 공법으로 발효한 석류 발효조성물은 그 특정 효소와 특정 유산균의 선택과 혼합 사용으로 인한 상승효과의 기술적 의의가 있는 것으로 확인되며, 체내흡수율이 증가된 엘라그산, 갈산 고함량 포함하는 비만, 부종 등의 증상에 대하여 현저하게 개선된 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 조성물을 체내흡수율이 매우 높고 떫은맛과 단맛 등 맛에서도 뚜렷한 개선 효과가 있음이 확인되었다.
Claims (9)
- 석류를 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)로 동시에 효소 발효시켜 얻은 발효물을 유효성분으로 함유하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 발효물은 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하 나이상의 석류 원액을 발효한 발효물을 포함하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 탄네이즈는 0.01∼1 중량%를 사용하고 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)는 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml를 사용하여 발효된 발효물을 포함하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물.
- 석류를 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)로 효소 발효시켜 얻은 발효물을 유효성분으로 함유하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물을 포함하는 건강식품.
- 석류를 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)로 효소 발효시켜 얻은 발효물을 유효성분으로 함유하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물을 포함하는 약학조성물.
- 석류를 탄네이즈와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)로 효소 발효시켜 얻은 발 효물을 유효성분으로 함유하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물을 포함하는 동물용 사료첨가제 조성물.
- 석류 과육으로부터 석류즙, 석류쥬스 또는 석류농축액 중 하나 이상의 석류 원액을 제조하는 단계;
석류 원액을 5-10brix로 희석하여 탄네이즈 0.01∼1 중량%와 Lactobacillus vespulae DCY75(KCTC 21023)의 유산균 0.5x107cfu/ml 내지 3x107cfu/ml 로 처리하고, 30~40℃에서 2~48시간 동안 진탕 배양하는 단계; 및
상기 진탕 배양하여 얻은 효소반응액을 70∼80℃에서 효소를 실활하는 단계
를 포함하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물의 제조방법. - 청구항 7에 있어서, 상기 진탕 배양은 80~200rpm으로 교반 하에 이루어지는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물의 제조방법.
- 청구항 7에 있어서, 상기 효소를 실활하는 단계는 5~30분간 수행하는 부종이나 비만의 예방 또는 개선용 석류 발효조성물의 제조방법
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