JP2018090826A - Ｐｅｇ化脂質および薬剤送達のためのそれらの使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】本発明の解決しようとする課題は、高効率で核酸をカプセル化し、高い薬剤：脂質比を有し、カプセル化された核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し、全身性の送達に好適であり、カプセル化された核酸の細胞内に送達できる、脂質−治療用核酸組成物を提供することである。
【解決手段】本発明の課題は、特定の構造を有する、ポリ（エチレングリコール）−脂質複合体によって解決できることを見出した。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１１年、１月１１日に出願された、米国特許仮出願第６１／４３１，６８４号に基づく利益を主張するものであり、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ＰＥＧ化脂質、ならびにｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡなどの活性物質を送達するための製剤におけるそれらの使用に関する。
治療用核酸としては、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性核酸、アンチセンス、アンタゴｍｉｒ（antagomir）、抗ｍｉｒ（antimir）、マイクロＲＮＡ模倣体、スーパーｍｉｒ（supermir）、Ｕ１アダプター、およアプタマーが挙げられる。これらの核酸は、様々な機序を介して作用する。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの場合、これらの核酸は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを介して、特定のタンパク質の細胞内レベルを下方制御することが出来る。細胞質中へのｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの導入後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物は、ＲＩＳＣと呼ばれるたんぱく質と結合することが出来る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖は、ＲＩＳＣ複合体から離れ、結合したｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの配列と相補的な配列を有するｍＲＮＡを認識して、それに結合することが出来る鋳型を、ＲＩＳＣ内で提供する。相補的なｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ複合体はｍＲＮＡを切断し、切断した鎖を放出する。ＲＮＡｉは、タンパク質合成をコードする、対応するｍＲＮＡの特異的破壊を標的とすることにより、特定のタンパク質を下方制御することが出来る。
ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ構築物は、標的タンパク質に対するいかなるヌクレオチド配列を用いても合成することが出来るため、ＲＮＡｉの治療用途は、極めて広範である。現在までに、ｓｉＲＮＡ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルの両方において、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を持つことがわかっている。さらに、ｓｉＲＮＡ構築物は、現在、臨床研究において評価されている。
しかしながら、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ構築物が直面している２つの問題は、第１に、血漿中のヌクレアーゼ消化に対するそれらの感受性、第２に、遊離ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡとして全身的に投与された際、それらがＲＩＳＣと結合することが出来る細胞内コンパートメントに接近する、それらの限定された能力である。これらの二本鎖構築物は、分子内の化学修飾されたヌクレオチドリンカー、例えば、ホスホチオエート基の組み込みによって、安定化させることが出来る。しかしながら、これらの化学修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限定的な保護を提供するだけであり、構築物の活性を減少させ得る。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの細胞内の送達は、例えばポリマー、カチオン性リポソームなどの担体系の使用により、または構築物の化学修飾、例えばコレステロール分子の共有結合によって促進され得る。しかしながら、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子の効力を増加させ、化学修飾の必要性を減少させるかまたは排除するために、改善された送達システムが必要とされている。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムもまた、タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害し得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列と相補的な配列を有し、ワトソン−クリック塩基対形成により、ｍＲＮＡと結合し得る。この結合は標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げ、および／またはｍＲＮＡ転写物のリボヌクレアーゼＨ分解の誘因となる。結果として、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方制御）においておびただしい潜在力を有する。現在までに、これらの化合物は、炎症性疾患、がん、およびＨＩＶのモデルを含む、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいて将来性を示している（Agrawal、Trends in Biotech. 14:376-387 (1996）に概説）。アンチセンスはまた、染色体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズすることにより、細胞活性にも影響を与え得る。いくつかのアンチセンス薬剤の、ヒトにおける高度な臨床評価が現在進行中である。これらの薬剤の標的には、ｂｃｌ２およびアポリポタンパク質Ｂ遺伝子ならびにｍＲＮＡ産物が含まれる。
免疫刺激性核酸には、デオキシリボ核酸およびリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、ある特定の配列またはモチーフが、哺乳類において免疫刺激を誘発することが示されている。これらの配列またはモチーフには、ＣｐＧモチーフ、ピリミジンリッチ配列およびパリンドローム配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のＣｐＧモチーフは、エンドソームの受容体であるｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）により特異的に認識され、それが次いで、先天的および後天的な免疫刺激経路の両方の誘因となると考えられている。ある特定の免疫刺激性リボ核酸もまた報告されている。これらのＲＮＡ配列が、ｔｏｌｌ様受容体６および７（ＴＬＲ−６およびＴＬＲ−７）と結合することにより、免疫活性化の誘因となる考えられている。さらに、二本鎖ＲＮＡもまた、免疫刺激性であると報告されており、ＴＬＲ−３との結合を介して活性化すると考えられている。
治療用核酸の使用に伴うよく知られている１つの問題は、ホスホジエステル核酸間結合の安定性およびこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関するものである。血清中のエクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの存在が、ホスホジエステルリンカーを有する核酸の急速な消化を招き、それにより、治療用核酸は、血清の存在下または細胞内において、非常に短い半減期を有し得る（Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993);およびThierry, A.R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)）。現在開発中の治療用核酸は、これらおよび他の公知の問題のため、天然の核酸にみられる基本的なホスホジエステル化学を使用していない。
この問題は、血清または細胞内の分解を減少させる化学修飾により、部分的に克服されている。ヌクレオチド間ホスホジエステル架橋（例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネートまたはホスホルアミデート結合を用いる）、ヌクレオチド塩基（例えば、５−プロピニル−ピリミジン）、または糖（例えば、２’−修飾糖）において、修飾が試験されている（Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)）。他の研究者らは、２’−５’糖結合を用いて安定性の改善を試みている（例えば、米国特許第５，５３２，１３０号を参照のこと）。他の変更も試みられている。しかしながら、これらの解決策のいずれもが、完全に十分であるとは証明されておらず、ｉｎ ｖｉｖｏ における遊離治療用核酸は、未だ限定的な有効性しか有していない。
さらに、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに関して上述のように、治療用核酸が細胞膜を通過する能力が限定されているという問題（Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)を参照のこと）、ならびに全身性の毒性、例えば補体媒介性アナフィラキシー、変化した凝固特性、および血球減少に関連する問題が残っている（Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994)）。
有効性の改善を試みるために、研究者らはまた、化学修飾された、または未修飾の治療用核酸を送達するために、脂質ベースの担体系をも使用している。Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996）において、著者らはアニオン性（従来の）リポソーム、ｐＨ感受性リポソーム、免疫リポゾーム、融合性リポソーム、およびカチオン性脂質／アンチセンス凝集体の使用に言及している。Heyes, et. al., J. Contr. Rel. 112:280-290 (2006)において、著者らは、より安定したポリ（エチレングリコール）−脂質複合体の使用に言及している。同様に、カチオン性リポソームにおいて、ｓｉＲＮＡを全身投与しており、これらの核酸−脂質粒子が、非ヒト霊長類を含む哺乳類において、標的タンパク質の下方制御を改善することが報告されている（Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)）。
米国特許第５，５３２，１３０号
この進歩にもかかわらず、当技術分野において、一般の治療的使用に好適な、改善された脂質−治療用核酸組成物が依然として必要とされている。これらの組成物は、高効率で核酸をカプセル化し、高い薬剤：脂質比を有し、カプセル化された核酸を血清中での分解およびクリアランスから保護し、全身性の送達に好適であり、ならびにカプセル化された核酸の細胞内送達を提供することが好ましい。さらに、これらの脂質−核酸粒子は、有効量の核酸での患者の治療が、患者に対する著しい毒性および／またはリスクを伴わないように、良好な耐容性を示し、かつ適切な治療指数を提供するべきである。本発明は、疾患の治療用を含む、組成物、組成物の調製方法、および、組成物を使用して核酸を細胞に導入する方法を提供する。
１つの態様において、本発明は、式（Ｉ）：
Figure 2018090826
 で表される化合物、またはその薬剤的に許容される塩に関し、
式中、
Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基であり、ここで脂肪族基は、Ｒａからそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の基により所望により置換され；およびここで脂肪族基は、シクロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−により所望により中断され；
Ｘは、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
Ｙは、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）ｃ−Ｌ３−であり；
Ｌ１は、結合、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐ−または−（ＣＲａＲｂ）ｊ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊであり；
Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここで各ｑは独立して、０、１、２、３、または４であり；および各ｒは、独立して、０、１、２、３、または４であり；
各Ｌ４は独立して、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここで各ｓは独立して、０、１、２、３、または４であり；
Ｒ３は−Ｈ、−Ｒｃ、または−ＯＲｃであり；
Ｒ４およびＲ４’のそれぞれは、独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルコキシであり；
各Ｒ５および各Ｒ５’は、独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルであるか；
またはＲ４および１つのＲ５が一緒になって、５〜８員のシクロアルキルまたは複素環を形成してもよく；
各Ｒａは独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｂは独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒｃは、−Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
ａは０または１であり；
ｂは１〜１，０００の整数であり；
ｃは０または１であり；
ｉの各出現は、独立して、１、２、３、４、５、または６であり；
ｊの各出現は、独立して、０、１、２、または３であり；
ｋの各出現は、独立して、０、１、２、または３であり；および
Ｐは１〜１０であるが；但し、
（ｉ）ＸおよびＹが同時に−ＣＨ２−であることは無く；ならびに
（ｉｉ）ａが１であり、Ｌ１が−ＣＨ２−である場合は、
（ａ）ＸおよびＹが同時に−Ｏ−であることは無く；ならびに
（ｂ）ＸおよびＹが同時に−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であることも無い。
１つの実施形態において、Ｘは−（ＣＨ２）ｉ−である。例えば、１つの実施形態において、Ｘは−ＣＨ２−であり、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
別の実施形態において、Ｘは−ＣＨ２−ではなく；Ｙは、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
１つの実施形態において、Ｚ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−である。
１つの実施形態において、Ｘは、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
１つの実施形態において、Ｙは、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
１つの実施形態において、各ＡはＬ４である。例えば、１つの実施形態において、各ＡはＬ４であり、および各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−である。
１つの実施形態において、Ｒ３はアルコキシ（例えば、メトキシ）である。
１つの好ましい実施形態において、変数ｑおよびｓはそれぞれ独立して、少なくとも１（すなわち、１、２、３、または４）である。
さらなる実施形態において、ｂは、約１〜約５００の範囲、例えば、約５〜約５００、約１０〜約５００、約１０〜約２５０、約２５〜約１００、約３０〜約６０または約４０〜約５０の範囲である。
１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の分子量は、約５００ｇ／ｍｏｌ〜約５，０００ｇ／ｍｏｌの間である。
１つの実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニル基である。
いくつかの実施形態において、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニル基であり；Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、または−ＳＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；ａは１であり；Ｌ１は結合または−（ＣＨ２）ｉ−であり、ｃは０であり；Ｌ３は−（ＣＨ２）ｉ−であり；各Ａは独立して、−Ｌ４−であり；各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；およびＲ３は−ＯＲｃであり、ここでＲｃは−Ｈまたはアルキルである。
１つの実施形態において、ｓは１、２、３または４である。別の実施形態において、ｑは１、２、３または４である。さらなる実施形態において、ｓおよびｑはそれぞれ独立して、１、２、３または４である。
別の態様において、本発明は、式（ＩＡ）：
Figure 2018090826
 で表される化合物、またはその薬剤的に許容される塩に関し、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｘ、Ｙ、Ｌ、ａおよびｂは、式（Ｉ）で定義される通りであり；
各Ａは独立して、−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここで各ｑは独立して、１、２、３、または４であってもよく；および各ｒは、独立して、０、１、２、３、または４であり；ならびに
各Ｌ４は独立して、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここで各ｓは独立して、１、２、３、または４である。
１つの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は以下：
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
 およびその薬剤的に許容される塩から選択され；
式中、
ｎは、１〜１，０００の整数であり；および
ｍは、１、２、３、４、５、または６である。
さらなる実施形態において、ｎは、約１〜約５００の範囲、例えば約５〜約５００、約１０〜約５００、約１０〜約２５０、約２５〜約１００、約３０〜約６０または約４０〜約５０の範囲である。
別の態様において、脂質粒子は、式（Ｉ）または（ＩＡ）の化合物を含む。脂質粒子は、カチオン性脂質をさらに含むことができる。脂質粒子は、中性脂質およびステロールをさらに含むことができる。中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭから選択することができる。カチオン性脂質は約２０％および約６０％のモル比で存在することができ；中性脂質は約５％〜約２５％のモル比で存在することができ；ステロールは約２５％〜約５５％のモル比で存在することができ；および式（Ｉ）または（ＩＡ）の化合物は、約０．５％〜約１５％のモル比で存在することができる。
脂質粒子は、活性物質をさらに含むことができる。活性物質は、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（antagomir）、アプタマー、およびリボザイムから成る群から選択される核酸であることができる。
別の態様において、医薬組成物は、脂質粒子および薬剤的に許容される担体を含むことができる。
別の態様において、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法は、細胞に脂質粒子を提供することを含む。活性物質は、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（antagomir）、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択される核酸であることができる。
別の態様において、対象における、ポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、前記対象に、活性物質がｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る群から選択される核酸である、医薬組成物を提供することを含み、およびここで前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖と特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、対象における、ポリペプチドの低発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、前記対象に、活性物質がポリペプチドまたは機能的変異体またはその断片をコードするプラスミドである、前記医薬組成物を提供することを含む。
別の態様において、対象における免疫応答を誘発する方法は、前記対象に、活性物質が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、医薬組成物を提供することを含み、。
標的遺伝子は、以下から成る群から選択することができる：第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、アポリポタンパク質Ｂ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、βカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢＩ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子類、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子。前記標的遺伝子は、１つまたは複数の突然変異を含むことができる。
他の特徴および態様は、本明細書および特許請求の範囲から明白となるであろう。
一般的に、式（Ｉ）または（ＩＡ）の化合物は、脂質、より具体的には凝集抑制脂質と見なされる。これらの脂質を、例えば核酸−脂質粒子組成物に使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物は、核酸の活性を高め、および／または組成物のインビボでの認容性を改善する。これらのことにより、これまでに記載されてきた脂質−核酸粒子組成物よりも、治療係数が大いに高まる可能性がある。
ある実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を送達するための組成物について説明する。これらの組成物は、標的タンパク質のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルの抑制に有効である。カチオン性脂質の有無やカチオン性脂質のモル比がこれら組成物の活性に影響を及ぼす可能性がある。
脂質粒子および組成物を様々な目的で、例えば関連する治療薬またはカプセル化した治療薬を、インビトロおよびインビボ双方において細胞へ送達するために使用することができる。従って、それを必要とする対象の疾患または障害の治療方法には、対象を、好適な治療薬を伴う脂質粒子とを接触させることを含み得る。
本明細書に記載したように、脂質粒子は核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ分子やプラスミドの送達に特に有用である。そのため、細胞と、標的遺伝子の発現を低下させる核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）または所望のタンパク質の発現を高めるのに使用することができる核酸（例えば所望のタンパク質をコードしているプラスミド）を伴う脂質と接触させることにより、インビトロおよびインビボの両方において、標的遺伝子およびタンパク質の発現の調節に脂質粒子および組成物を使用することができる。
脂質、脂質粒子およびそれらを含む組成物、ならびに治療薬の送達、および遺伝子およびタンパク質発現の調節におけるそれらの使用の様々な例となる実施形態を以下で詳細に説明する。
ある条件では、脂質粒子は、電荷誘導性凝集を起こす可能性があり、そのような状態は望ましくない場合がある。そのため、凝集を低下させる化合物を、例えば形成時に粒子を立体的に安定化することによって凝集を低下させる化合物を脂質粒子に含めることが望まれる場合がある。立体的安定性は、化合物が、立体的にかさ高いが荷電していない遮蔽物部分を有する場合、または脂質粒子に含まれる荷電した部分が他の脂質粒子に接近するのを遮断する場合に生じ得る。そのような構成要素は単に凝集を防ぐだけでなく、血中での残存期間を延長し、脂質−核酸組成物の標的組織への送達を改善する可能性もある。
粒子を立体的に安定化させる方法の一つには、粒子の外側に立体的にかさ高い基をもつ脂質を含む脂質を含めることが挙げられる。好適な立体的にかさ高い基としては、親水性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）などのポリ（オキシアルキレン）が挙げられる。そのようなかさ高い基を有する脂質は、凝集抑制脂質とも言うことができる。かさ高い基がポリ（エチレングリコール）の場合には、この脂質をポリ（エチレングリコール）−脂質複合体、ペグ化脂質、または単にペグ脂質と言うこともできる。
一実施形態において凝集抑制脂質は、式（Ｉ）の化合物、
Figure 2018090826
 またはその薬剤的に許容される塩であり、
式中、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立してＣ１０〜Ｃ３０の脂肪族基であり、ここで前記脂肪族基はＲａからそれぞれ独立して選択される１つ以上の基によって置換されていてもよく；前記脂肪族基は、シクロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−によって中断されていてもよく；
Ｘは−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
Ｙは−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
Ｌは−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）ｃ−Ｌ３−であり；
Ｌ１は結合、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、または（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
Ｚ１は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、またはＯ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
Ｌ２は−（ＣＲａＲｂ）ｐ−または（ＣＲａＲｂ）ｊ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊであり；
Ｚ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
Ｌ３は−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
Ａはそれぞれ独立して、−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−またはＣ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここでｑはそれぞれ０、１、２、３、または４であり；かつ、ｒはそれぞれ独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｌ４はそれぞれ独立して−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここでｓはそれぞれ独立して０、１、２、３、または４であり；
Ｒ３は−Ｈ、−Ｒｃ、またはＯＲｃであり；
それぞれのＲ４およびＲ４’は独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルコキシであり；
Ｒ５およびＲ５’はそれぞれ独立して−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルであるか；
またはＲ４および１つのＲ５は一緒になって５〜８員のシクロアルキルまたは複素環を形成することができ；
Ｒａはそれぞれ−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｒｂはそれぞれ独立して−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
Ｒｃはそれぞれ、−Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
ａは０または１であり；
ｂは１〜１，０００までの整数であり；
ｃは０または１であり；
ｉの発生はそれぞれ独立して１、２、３、４、５、または６であり；
ｊの発生はそれぞれ独立して０、１、２、または３であり；
ｋの発生はそれぞれ独立して０、１、２、または３であり；ならびに
ｐは１〜１０であり；ただし、
ＸおよびＹは同時に−ＣＨ２−ではなく；および
（ｉｉ）ａが１、かつ、Ｌ１が−ＣＨ２−の場合には、
（ａ）ＸおよびＹは同時に−Ｏ−ではなく；および
（ｂ）ＸおよびＹは同時に−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ではない。
一実施形態では、Ｘは−（ＣＨ２）ｉ−である。例えば一実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−であり、かつ、Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
別の実施形態では、Ｘは−ＣＨ２−はなく；かつ、Ｙは−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
一実施形態では、Ｚ１は−Ｃ（Ｏ）Ｏ−またはＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−である。
一実施形態では、Ｘは−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
一実施形態では、Ｙは−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である。
一実施形態では、ＡはそれぞれＬ４であり、例えば、一実施形態ではＡはそれぞれＬ４であり、かつ、Ｌ４はそれぞれ独立して−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、またはＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−である。
一実施形態では、Ｒ３はアルコキシ（例えば、メトキシ）である。
さらなる実施形態では、ｂは約１〜約５００までの範囲であり、例えば約５〜約５００、約１０〜約５００、約１０〜約２５０、約２５〜約１００、約３０〜約６０または約４０〜約５０である。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物の分子量は約５００ｇ／モル〜約５，０００ｇ／モルである。
一実施形態では、それぞれのＲ１およびＲ２は独立してＣ１２〜Ｃ２０のアルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０のアルケニル基である。
いくつかの実施形態では、それぞれのＲ１およびＲ２は独立してＣ１２〜Ｃ２０のアルキル基またはＣ１２〜Ｃ２０のアルケニル基であり；Ｘは−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、またはＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、またはＳＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；ａは１であり；Ｌ１は結合または（ＣＨ２）ｉ−、ｃは０であり；Ｌ３は−（ＣＨ２）ｉ−であり；Ａはそれぞれ独立して−Ｌ４−であり；Ｌ４はそれぞれ独立して−ＯＣＨ２ＣＨ２−またはＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；およびＲ３は−ＯＲｃであり、ここでＲｃは−Ｈまたはアルキルである。
一実施形態では、ｓは１、２、３または４である。別の実施形態では、ｒは１、２、３または４である。さらなる実施形態では、ｓおよびｒはそれぞれ独立して１、２、３または４である。
別の態様では、本発明は式（ＩＡ）の化合物、
Figure 2018090826
 またはその薬剤的に許容される塩に関し、
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｘ、Ｙ、Ｌ、ａおよびｂは上記式（Ｉ）で定義したものと同様であり；
Ａはそれぞれ独立して−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−またはＣ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここでｑはそれぞれ独立して１、２、３、または４であり；かつ、ｒはそれぞれ独立して０、１、２、３、または４であり；および
Ｌ４はそれぞれ独立して−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−またはＯ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここでｓはそれぞれ独立して１、２、３、または４の場合がある。
一実施形態において、Ｒ４およびＲ５の１つが一緒になって５〜８員の複素環を形成している場合、この化合物は式（ＩＩ）によって表され、
Figure 2018090826
 式中、Ｃｙは５〜８員の複素環であり、かつ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４’、Ｒ５’、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｚ１、Ｚ２、Ｌ２、Ｌ３、ｂおよびｃは上記式（Ｉ）で定義したものと同様である。
式（Ｉ）および（ＩＡ）の化合物は複数の不斉炭素を含むことができ、それによって立体異性体が生じる可能性がある。化合物は、ラセミ混合物、１種の鏡像異性体の割合が過剰な混合物、および実質的に１種類の鏡像異性体（例えば、過剰鏡像率が９５％以上、９８％以上、または９９％以上）などのいくつかの異なる立体異性体のいずれとなってもよい。複数の不斉炭素原子が存在する場合、ジアステレオ異性の形態をとることも可能であり、メソ化合物も同様に可能である。これらはいずれも様々な純度で含まれ得る。従って、式（Ｉ）の化合物は複数のジアステレオ異性体の混合物の形態であっても、或いは実質的に純粋な単一のジアステレオ異性体の形態であることができる。
基Ｒ１およびＲ２はそれぞれ疎水性の場合がある。Ｒ１およびＲ２はそれぞれ脂肪族基であってよく；例えば、主に飽和しているまたは不飽和の炭素と水素を含むが、芳香族環を含まない場合がある。Ｒ１およびＲ２は脂肪酸テールであってもよく；そのような基のいくつかにはオクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラカドニル、オレイルなどが含まれる。他の疎水性テールもまた適している。
脂肪族基であるＲ１およびＲ２は、シクロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−によって分断されていてもよい。シクロアルキレンによって分断されている脂肪族基の一例には、
Figure 2018090826
 がある。
基−（Ａ）ｂ−はポリマー基、すなわち、反復単位−Ａ−からなる基であることができる。上述のように、いくつかの例では、Ａはそれぞれ独立して−Ｌ４−であってよい。Ｌ４はそれぞれ独立して−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−またはＯ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であってよく；この場合、ｓはそれぞれ独立して０、１、２、３、または４であってよい。従っていくつかの実施形態では、基−（Ａ）ｂ−はポリオキシアルキレン、例えばポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）である。いくつかの例では、それぞれ独立して−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、またはＣ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−である。この場合、基−（Ａ）ｂ−はポリアミドであり、このポリアミドは、例えば全体は参照することにより組み込まれる、米国特許第６，３２０，０１７に記載されているポリアミドに関連する。例えば、基−（Ａ）ｂ−は、−［ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４ＣＨ２Ｃ（Ｏ）］ｂ−で表される構造をとることができる。
基−（Ａ）ｂ−は共重合体、すなわち、２種類以上の異なる種類のポリマーの重合体であることができる。共重合体の構造は、ランダム、ブロック、グラフト、または他の構造であることができる。例えば、基−（Ａ）ｂ−は、例えば−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−単位と−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）−単位のランダム共重合体であることができる。別の例では、基−（Ａ）ｂ−は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−単位と−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−のブロック共重合体であることができる。
いくつかの例では、基Ｒ３は、化合物がアルコキシ基、例えばメトキシで終わるように選択される。いくつかの例では、−（Ａ）ｂ−Ｒ３がメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）部分となるように選択される。ｂの値はｍＰＥＧ部分の分子量に基づいて選択され得る。例えば、分子量が２，０００の場合には、ｂはおよそ４５に対応する。ポリマーがポリマー鎖長の差の分布として見られることが多いことから、所与の調製法においてｎの値は、ｂの値の分布となる場合がある。
スキーム１は、ａが１、Ｘが−ＣＨ２−、Ｙが−Ｏ−、Ｌ１が−ＣＨ２−であり、かつ、Ｚ１が例えば、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ（Ｒａ）−、またはＯ−Ｎ（Ｒｃ）−であり得る、式（Ｉ）および（ＩＡ）の化合物の合成経路を示す。
Figure 2018090826
簡単に説明すると、α−オレフィンをジヒドロキシル化に供し、次いで末端ヒドロキシル基をトリチル基で保護する。次いで、二級ヒドロキシル基を、アルキル化してＲ２基を負荷してもよい。脱保護した後、末端のヒドロキシル基は、−（Ａ）ｂ−Ｒ３部分を付加する、さらなる修飾に用いることができる。最終化合物のＺ１の価は、−（Ａ）ｂ−Ｒ３部分を付加するのに選択した特定の変換法に依存する。一例ではあるが、Ｚ１が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−である最終化合物が得られる変換を、スキーム２で提供する。
Figure 2018090826
スキーム３に、式（Ｉ）および（ＩＡ）の化合物の合成経路を示す。この場合、ａは１、Ｘは−ＣＨ２−、Ｙは−Ｏ−、Ｌ１は−ＣＨ２−であり、かつ、Ｚ１は例えば、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−となることができる。
Figure 2018090826
スキーム３では、α−オレフィンをエポキシ化に供した後、例えばＮＨ４ＯＨを使用して開環する。末端のアミン基を、例えばＴｆ２Ｎ３で処理することでアジ化物に変換する。次いで二級アルコールをアルキル化する。アジ化物を還元（例えばＬＡＨを用いて）すると、合成中間体が形成される。この中間体は、Ｚ１が例えば、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、またはＮ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−となり得る化合物を作成するのに有用である。最終化合物のＺ１の価は、−（Ａ）ｂ−Ｒ３部分を付加するのに選択した特定の変換法に依存する。そのような例の１つをスキーム４に示す。
Figure 2018090826
同じ化合物を生成するための別の経路をスキーム５に示す。ここでは、スキーム１の最終ステップで生成された中間体を使用する。
Figure 2018090826
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−またはＮＨＣ（Ｏ）−であり；Ｙが−Ｏ−またはＣ（Ｏ）Ｏ−であり；ならびに、Ｌ１が結合であり、およびＺ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であるか、またはＬ１が−ＣＨ２−であり、Ｚ１が−ＯＣ（Ｏ）−である化合物は、
Figure 2018090826
 の、例えばＲ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｙが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｌ１が結合、およびＺ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−またはＣ（Ｏ）Ｏ−である化合物は、
Figure 2018090826
 の、例えば、Ｒ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｃ（Ｏ）Ｏ−またはＮＨＣ（Ｏ）−；Ｙが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−；Ｌ１が結合、かつ、Ｚ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であるか、或いはＬ１が−ＣＨ２−で、活、Ｚ１が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−またはＯＣ（Ｏ）−の化合物は、セリン
Figure 2018090826
 の、例えば、Ｒ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−またはＮＨＣ（Ｏ）−、Ｙが−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、Ｌ１が結合、かつ、Ｚ１が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−であるか、或いはＬ１が−ＣＨ２−で、かつ、Ｚ１が−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−またはＮＨＣ（Ｏ）−の化合物は、イソセリン
Figure 2018090826
 の、例えば、Ｒ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｙが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、およびＬ１が−ＣＨ２−、かつ、Ｚ１が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−またはＯＣ（Ｏ）−の化合物は、
Figure 2018090826
 の、例えばＲ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｏ−またはＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｙが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、およびＬ１が−ＣＨ２−、かつ、Ｚ１が−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−の化合物を、
Figure 2018090826
 の、例えば、Ｒ−、Ｓ−またはラセミ体から調製することができる。
ある特定の化合物、すなわち、Ｘが−Ｏ−、Ｙが−Ｏ−、Ｚ１が−Ｏ−、およびＲ４またはＲ５がメチルである化合物を、
Figure 2018090826
 の、例えば、Ｒ−、Ｓ−、またはラセミ体から調製することができる。
Ｘ、Ｙ、Ｒ４、Ｒ５、Ｌ１およびＺ１の他の組み合わせを調製するための出発材料として使用することができる他の化合物としては、
Figure 2018090826
 が挙げられる。これらはそれぞれ、Ｒ−、Ｓ−、またはラセミ体であることができる。式（Ｉ）の化合物を調製するための出発材料としては、さらに別の化合物を使用することもできる。
典型的な本発明の化合物のいくつかとしては、表１に挙げるものが含まれる。
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
Figure 2018090826
 式中、
ｎは１〜１，０００までの整数であり；および
ｍは１、２、３、４、５、または６である。
さらなる実施形態では、ｎは約１〜約５００の範囲、例えば約５〜約５００、約１０〜約５００、約１０〜約２５０、約２５〜約１００、約３０〜約６０または約４０〜約５０の範囲である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質が、少なくとも１つのカチオン性脂質と併せて脂質粒子に使われる。
カチオン性脂質
カチオン性脂質は、頭部基、１つ以上の疎水性テール、および頭部基と１つ以上のテールの間にあるリンカーなどの設計上の特定の特徴を有し得る。頭部基にはアミンが含まれ得る。ある特定の条件下では、アミン窒素が正に荷電される部位となり得る。例えばアミンが第一級、第二級または第三級アミンの場合、アミンのｐＫａは特徴的ものとなる。言い換えると、そのアミンは水性媒体中において可逆的にプロトン化される。正電荷の度合が水性媒体のｐＫａおよびｐＨの関数である。アミンは第四級アミンであってもよく、この場合アミンは、純粋な形態でなかったとしても、水性媒体中または水性媒体のｐＨでは、正電荷を有する。
脂質の構造、特に頭部基の性質はｐＫａに影響を及ぼす場合がある。そのような頭部基の性質には例えば、頭部基の有無、および官能基、例えばアニオン官能基、水素結合供与官能基、水素結合受容基、疎水性基（例えば脂肪族基）、親水性基（例えばヒドロキシルまたはメトキシ）またはアリール基の位置が挙げられる。頭部基アミンはカチオンアミンならびに第一級、第二級、第三級、または第四級アミンであってよく；頭部基は、アミン基を１つ（モノアミン）、アミン基を２つ（ジアミン）、アミン基を３つ（トリアミン）を含んでいても、または、オリゴアミン若しくはポリアミンとして、より多くのアミン基を含むことができる。頭部基には、アミンよりも弱い塩基性の官能基、例えば、イミダゾール、ピリジン、またはグアニジウム基が含まれ得る。頭部基は双性イオンであることができる。他の頭部基もまた、適している。
複数の疎水性テールは２本の疎水性鎖を含む場合があり、これら２本の鎖は同じであってもまたは異なっていてもよい。テールは脂肪族であってもよく、例えばテールは、炭素と水素から成り得、飽和であっても不飽和であることができるが、芳香族環を含まない。テールは脂肪酸テールであってもよく、そのような基のいくつかには、オクタニル、ノナニル、デシル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、α−リノレイル、ステアリドニル、リノレイル、γ−リノレニル、アラカドニル、オレイルなどが含まれる。他の疎水性テールもまた適している。
リンカーは例えば、グリセリドリンカー、非環式グリセリド類似体リンカーまたは環状のリンカー（スピロリンカー、二環式リンカー、および多環式リンカーなど）を含み得る。リンカーは、エーテル、エステル、リン酸、ホスホン酸、ホスホロチオエート、スルホネート、ジスルフィド、アセタール、ケタール、イミン、ヒドラゾン、またはオキシムなどの官能基を含む場合がある。他のリンカーおよび官能基もまた適している。
カチオン性脂質は、１つ以上の生分解性結合を含むことができる。生分解性結合は、生物学的な環境で、例えば、生物内で、器官内で、組織内で、細胞内で、またはオルガネラ中で、結合切断反応を受け得る。生分解性結合を含む官能基のいくつかとしては、エステル、ジチオール、およびオキシムがある。生分解性は、対象に化合物を投与した場合、その化合物の体からの排出に影響を及ぼす要因となり得る。生分解性は細胞を用いたアッセイによって測定することができ、このアッセイでは、カチオン性脂質を含む製剤を細胞に曝露し、試料を様々な時点で回収する。脂質画分を細胞から抽出し、分離し、その後ＬＣ−ＭＳで解析する。ＬＣ−ＭＳのデータから、生分解速度を（例えば、ｔ１／２の値として）測定することもできる。
多数のカチオン性脂質およびそれらの作成方法は、例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０５号、および同第２０１０／０５４３８４号、同第２００９／０８６５５８号；および同第２００８／０４２９７３号、ならびにこれらで参照されている出願、例えば米国仮特許出願第６１／１０４，２１９（２００８年１０月９日出願）；同第６１／１１３，１７９号（２００８年１１月１０日出願）；同第６１／１５４，３５０号（２００９年２月２０日出願）；同第６１／１７１，４３９号（２００９年４月２１日出願）；同第６１／１７５，７７０号（２００９年５月５日出願）；同第６１／１８５，４３８号（２００９年６月９日出願）；同第６１／２２５，８９８号（２００９年７月１５日出願）；および同第６１／２３４，０９８号（２００９年８月１４日出願）に記載されており、これらの文献はそれぞれ、参照することによりその全体が組み入れられる。例えば、国際公開第２０１０／０５４４０１号（２００９年１１月１０日出願）の表１（１６〜２１ページ）を参照のこと。
特定の実施形態では、脂質はカチオン性脂質である。本明細書で使用する場合、用語「カチオン性脂質」は、１つ若しくは２つの脂肪酸または脂肪族鎖と、生理学的なｐＨでプロトン化されてカチオン性脂質を形成することができるアミノ頭部基（アルキルアミノまたはジアルキルアミノ基を含む）を有する脂質を含むことを意図する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、「アミノ脂質」と呼ばれる。
他のカチオン性脂質には、アルキル置換基が異なるもの（例えば、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ−、Ｎ−プロピル−Ｎ−エチルアミノ−など）を含む、別の脂肪酸基や他のジアルキルアミノ基を有するものが含まれる得る。Ｒ１およびＲ２が両方とも長鎖アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアシル基である実施形態の場合、それらは、同じであってもまたは異なっていてもよい。一般的には、より飽和度が低いアシル鎖を有する脂質（例えば、カチオン性脂質）は、特にろ過滅菌する目的で複合体を約０．３ミクロンより小さい大きさで分類する場合、より簡単に大きさ別に分類することができる。典型的なカチオン性脂質は、炭素鎖の長さがＣ１０〜Ｃ２０の範囲の不飽和脂肪酸である。他の骨格を使用して、アミノ基（例えば、カチオン性脂質のアミノ基）と、カチオン性脂質の脂肪酸または脂肪アルキル部分とを分離することもできる。適切な骨格は当業者に公知である。
ある特定の実施形態では、カチオン性脂質は、少なくとも１つのプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有しており、そのため脂質は、生理学的なｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下では正に荷電され、第２のｐＨでは、好ましくは生理学的なｐＨまたはそれを超えるｐＨでは中性である。そのような脂質もカチオン性脂質と呼ばれる。無論、ｐＨの関数としてのプロトンの付加または脱離は平衡過程であり、荷電脂質または中性脂質への言及は、支配的な種の性質を指し、脂質の全てが荷電形態または中性形態にあることを必要としないことが理解されるだろう。この脂質は複数のプロトン化可能な基または脱プロトン化可能な基を有する場合があるか、或いは双性イオンである。
ある特定の実施形態では、プロトン化可能な脂質（すなわちカチオン性脂質）のプロトン化可能な基のｐＫａは、約４〜約１１の範囲である。典型的には、脂質粒子に組み込まれた際の脂質のｐＫａは、約４〜約７、例えば約５〜７、約５．５〜６．８などになる。そのような脂質は、ｐＨがより低い製剤段階ではカチオン性であるが、ｐＨ７．４付近の生理学的なｐＨでは、粒子の表面の大部分が（完全でないが）中性化される。ｐＫａが約４〜７の範囲であることの利点の１つは、粒子の外表面に結合している少なくともある程度の核酸が、生理学的なｐＨではその静電的相互作用を喪失し、簡単な透析により除去されること、従って、クリアランスに対する粒子の感受性が大幅に低減されることである。脂質粒子に含まれている脂質のｐＫａの測定は、例えば、Ｃｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８６） Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ ４０， １２７−１４４に記載されている方法に従って、蛍光プローブである２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）を使用することにより実施することができる。
特定の実施形態では、脂質は荷電脂質である。本明細書で使用する場合、「荷電脂質」という用語は、１つ若しくは２つの脂肪アシル鎖または脂肪アルキル鎖と第四級アミノ頭部基を有する脂質を含むことを意図する。第四級アミンは、持続的に正電荷を有する。頭部基は、生理学的なｐＨでプロトン化することができる第一級、第二級または第三級アミンなどのイオン化可能な基を含むことができる。第四級アミンが存在すると、イオン化可能な基のｐＫａは、第四級アミンを欠損している類似した構造の化合物（例えば、第四級アミンが第三級アミンに置き換えられている化合物）のｐＫａとは異なる場合がある。いくつかの実施形態では、荷電脂質は、「アミノ脂質」と呼ばれる。例えば、その全体が参照することにより組み入れられる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５９２０６号（２０１０年１２月７日出願）を参照のこと。
カチオン性脂質による実際の組織内蓄積および長期にわたる毒性（もしあれば）は、所定の製剤に単一のカチオン性脂質を含める代わりに、カチオン性脂質の混合物を選択することによって、好ましいように調整することができる。そのような混合物によって、カプセル化および／または薬剤放出の向上がもたらされ得る。カチオン性脂質を組み合わせることは、製剤中に単一のものを加える場合と比較して、全身安定性に影響を及ぼし得る。例えば、その全体が参照することにより組み入れられる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／６１０５８号（２０１０年１２月１７出願）を参照のこと。
例えば、脂質粒子に、例えば、国際公開第２００９／０８６５５８号および米国仮特許出願第第６１／１０４，２１９号（２００８年１０月９日出願）、（これらの全体はそれぞれ、参照することにより組み入れられる）に記載されているカチオン性脂質およびそのエステル類似体の混合物を含めることができる。別の例では、脂質粒子に、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１０／２２６１４号（２０１０年１月２９日出願）に記載されている脂質Ａと、例えば米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号（２００９年５月５日出願）に記載されている式Ｖまたは式ＶＩの脂質の脂質混合物を含めることができる。
具体的に上述のものに加えて、生理学的ｐＨ付近で正味正電荷を担持する他のカチオン性脂質も、本発明の脂質粒子に含めることができる。そのようなカチオン性脂質には、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（「ＤＯＴＡＰ．Ｃｌ」）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−コレステロール」）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）、１，２−ジレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、Ｎ、Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（「ＤＯＤＭＡ」）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が含まれるがこれらには限定されない。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡやＤＯＰＥなど。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から入手可能）、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社から入手可能）などの、多くの市販のカチオン性脂質調製物を使用することができる。特定の実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。
脂質粒子
脂質粒子には、以下で詳細に説明する１種類以上のカチオン性脂質を含み得る。脂質粒子はさらに、第２のアミノ脂質またはカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、および脂質粒子の凝集を低下させるために選択される脂質、すなわち凝集抑制脂質、のうちの１つ以上が含まれ得る。脂質粒子はリポソームを含むがこれには限定されない。本明細書で使用する場合、リポソームとは、水性の内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、１つ以上の脂質膜を有していてもよい。リポソームは単層のリポソーム（単層膜と呼ばれる）であっても多層のリポソーム（多重層膜と呼ばれる）であることができる。また、脂質粒子は、核酸と複合体化した際に、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎに記載されているような、ＤＮＡ層の間に挟まれたカチオン性脂質二分子膜で構成されるリポプレックスであることができる。
脂質粒子は、１つ以上のさらなる脂質および／またはコレステロールなどの他の成分をさらに含むことができる。脂質酸化を防止するためまたはリポソーム表面にリガンドを結合させるためなどの様々な目的で、リポソーム組成物に他の脂質を含めてもよい。両親媒性、中性、カチオン性、およびアニオン性脂質を含む多数の脂質のいずれをも、本発明のリポソームに加えてもよい。そのような脂質は、単独で使用しても或いは組み合わせて使用してもよい。存在していてもよいさらなる脂質成分の具体例を以下に記載する。
脂質粒子に存在していてもよいさらなる成分には、ポリアミドオリゴマーなどの二分子膜安定化成分（例えば米国特許第６，３２０，０１７号を参照のこと）、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧやセラミドに結合されたＰＥＧなど（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）が含まれる。
脂質粒子には、２種類以上のカチオン性脂質が含まれる場合がある。脂質は、異なる利点に寄与するように選択され得る。例えば、アミンのｐＫａ、化学安定性、血中半減期、組織内での半減期、実際の組織内蓄積または毒性などに関する特性が異なるカチオン性脂質が脂質粒子に使用され得る。具体的には、混合脂質粒子の特性が単一の脂質からできた単一脂質粒子の特性よりも望ましくなるように、カチオン性脂質を選択することができる。
凝集抑制脂質
形成中の粒子の凝集抑制脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、モノシアロガングリオシドＧｍ１、および例えば米国特許第６，３２０，０１７号に記載されているもののようなポリアミドオリゴマー（「ＰＡＯ」）がある。ＰＥＧ、Ｇｍ１またはＡＴＴＡのような、製剤化している間の凝集を防ぐ、電荷のない、親水性の、立体障害部分を有する他の化合物も脂質に結合させることができる。ＡＴＴＡ−脂質は例えば、米国特許第６，３２０，０１７号に記載されており、ＰＥＧ−脂質複合体は例えば、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号および同第５，８８５，６１３号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照することにより組み入れられる。通常、凝集を低下させるために選択される脂質成分の濃度は、（脂質のモル百分率で）約１〜１５％である。凝集を低下させ、および／またはＰＥＧ部分を含む他の脂質については、例えば米国特許第７，８０３，３９７号および国際公開第２００９／０８２６０７号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照することにより組み入れられる。
ＰＥＧ部分を脂質小胞の表面に固定するための様々な「アンカリング」脂質部分を有すし得るＰＥＧ修飾脂質（または脂質−ポリオキシエチレン複合体）の具体例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許第５，８２０，８７３号に記載されているＰＥＧ−セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールが挙げられる。
立体的にかさ高い部分（例えば、ＰＥＧまたはＡＴＴＡ）が脂質アンカーに結合されている実施形態では、脂質アンカーの選択は、複合体が脂質粒子とどのような種類の結合を有することになるかによって決まる。ｍＰＥＧ（分子量：２０００）−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）は、粒子が血中から除去されるまで、おそらくは数日間、リポソームと結合し続けることがよく知られている。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０などの他の複合体も同様の滞留能をもつ。しかしながら、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４は、血清に暴露されると、製剤から速やかに排出され、いくつかのアッセイでは、Ｔ１／２は６０分未満となる。
米国特許第５，８２０，８７３号に示されているように、少なくとも３つの特徴、すなわち、アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和、および立体障害頭部基の大きさが交換速度に影響を与え得る。適したこれらの特色の変化を有する化合物が本発明に有用であり得る。治療用途のいくつかでは、ＰＥＧ修飾脂質がインビボで核酸−脂質粒子から速やかに失われることが好ましい場合があり、従って、ＰＥＧ修飾脂質が比較的短い脂質アンカーを保有することになる。他の治療用途では、核酸−脂質粒子の血漿中での持続期間がより長いことが好ましい場合があり、従って、ＰＥＧ修飾脂質は比較的長い脂質アンカーを保有することになる。
凝集を防ぐ化合物が適切に機能するためには、必ずしも脂質との結合を必要とするわけではないことに留意すべきである。凝集を防ぐには、溶液中に遊離しているＰＥＧまたは遊離しているＡＴＴＡで十分な場合がある。製剤化した後に粒子が安定である場合、対象に投与する前に透析して、ＰＥＧまたはＡＴＴＡを除去してもよい。
中性脂質およびステロール
中性脂質は、脂質粒子中に存在する場合、生理的ｐＨで電荷のない形態、或いは中性の双性イオン形態として存在するいくつかの脂質種のいずれであることができる。このような脂質としては、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリン、およびセレブロシドが挙げられる。本明細書に記載の粒子中で使用される中性脂質の選択は、通常、例えば、リポソームの大きさや血流中のリポソームの安定性を考慮して判断される。好ましくは、中性脂質成分は、２つのアシル基を有する脂質（すなわち、ジアシルホスファチジルコリンやジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。様々な鎖長および飽和度の種々のアシル鎖基を有する脂質が利用可能であるか、または周知の技術により単離若しくは合成することができる。一群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の範囲の飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、炭素鎖長がＣ１０〜Ｃ２０の範囲の単不飽和脂肪酸または二不飽和脂肪酸を有する脂質を用いる。さらに、飽和脂肪酸鎖と不飽和脂肪酸鎖の混合物を含む脂質を用いることができる。好ましくは、使用される中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣまたは任意の関連したホスファチジルコリンである。有用な中性脂質はまた、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、または他の頭部基を有するリン脂質、例えば、セリンやイノシトールで構成されていてもよい。
脂質混合物のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞または脂質粒子調製の分野で従来使用されているステロールのうちのいずれであることもできる。好ましいステロールはコレステロールである。
アニオン性脂質および両親媒性脂質
脂質粒子に使用するのに好適なアニオン性脂質には、これらには限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノロアミン（Ｎ−ｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基が含まれる。
多くの実施形態では、両親媒性脂質が脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」とは、脂質材料の疎水性部分が疎水性相に向けて配置され、親水性部分が水相に向けて配置されている任意の好適な物質を指す。そのような化合物には、これらには限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、およびスフィンゴ脂質が含まれる。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトジルコリン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、リゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、およびβ−アシルオキシ酸などの他のリン欠失化合物を使用することもできる。加えて、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールなどの他の脂質と、容易に混合することができる。
融合促進脂質
プログラム可能な融合脂質もまた、脂質粒子に含めるのに適している。そのような脂質粒子は細胞膜と融合する傾向をほとんど示さず、また、所定のシグナル事象が生じるまで、それらのペイロードを送達する。そのため、脂質粒子は生物または疾患部位に注入されるとより均一に分布し、その後、細胞との融合を開始することができる。シグナル事象は、例えば、ｐＨの変化、温度、イオン環境、または時間である可能性がある。融合促進脂質は例えば、上述の式（Ｉ）の化合物であってよい。いくつかの例では、シグナル事象は例えば、細胞外環境と細胞内環境との間のｐＨの差、または細胞内環境とエンドソーム環境との間のｐＨの差のような、ｐＨの差である場合がある。
時間がシグナル事象である場合、ＡＴＴＡ−脂質複合体またはＰＥＧ−脂質複合体などの融合遅延成分または「外套（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」成分は、時間経過と共に単純に入れ替わって脂質粒子膜から外に出ていくことができる。脂質粒子は体内で適切に分布するまでに十分な被覆剤を失って、膜融合性になる。他のものをシグナル事象とする場合、炎症部位での温度上昇などの、疾患部位または標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましい。
ある特定の実施形態では、細胞型または組織に特異的な標的指向性部分を使用して、脂質粒子を標的指向性にすることが望ましい。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン（例えば、リボフラビン）、およびモノクローナル抗体などの様々な標的指向性部分を使用した脂質粒子の標的指向化に関しては、既に記載がある（例えば、その全体が参照することにより組み入れられる、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。標的指向性部分は、タンパク質全体またはその断片を含み得る。標的指向性の機序では、一般的に、標的指向性部分が標的、例えば細胞表面受容体と相互作用できるように、標的指向性物質が脂質粒子の表面に配置されていることが必要とされる。様々な標的指向性物質および標的指向化方法が当該分野において公知かつ利用可能であり、例えば、Ｓａｐｒａ， Ｐ． ａｎｄ Ａｌｌｅｎ， ＴＭ， Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ４２（５）：４３９−６２ （２００３）；およびＡｂｒａ， ＲＭ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓ． １２：１−３， （２００２）に記載されているものが挙げられる。
標的指向化に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などの親水性ポリマー鎖で表面がコーティングされている脂質粒子、すなわちリポソームの使用が提唱されている（Ａｌｌｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３７： ９９−１０８ （１９９５）；ＤｅＦｒｅｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ １１８： ６１０１−６１０４ （１９９６）；Ｂｌｕｍｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１４９： １８０−１８４ （１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２： ３２１−３３４ （１９９２）；米国特許第５，０１３５５６号；Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４： ２９６−２９９ （１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５３： ７１−７４ （１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ， ｉｎ Ｓｔｅａｌｔｈ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｃｈａｐｔｅｒ ９ （Ｌａｓｉｃ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ， Ｅｄｓ） ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ （１９９５））。１つの手法では、脂質粒子を標的指向化するためのリガンド、例えば抗体を、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合させる。別の手法では、親水性ポリマーコーティングを形成しているＰＥＧ鎖の遠位端部に、標的指向性リガンドを結合させる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２： ３２１−３３４ （１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８８： １１５−１１８ （１９９６））。
標的指向性物質を結合させるには標準的な方法を使用することができる。例えば、標的指向性物質の結合を活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、または脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化親油性化合物を使用することができる。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインＡが組み込まれているリポソームを使用して構築することができる（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．， ２６５：１６３３７−１６３４２ （１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ８７：２４４８−２４５１ （１９９０）を参照のこと）。抗体結合の他の例は、米国特許第６，０２７，７２６号に開示されており、それらの教示は、参照することにより本明細書に組み入れられる。標的指向性部分の例には、新生物または腫瘍に関連する抗原を含む細胞成分に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的指向性部分として使用されるタンパク質は、共有結合によりリポソームに結合させることができる（Ｈｅａｔｈ， Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ， １４９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１１−１１９ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７）を参照のこと）。他の標的指向化法としては、ビオチン−アビジン系が挙げられる。
脂質粒子製剤
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質と融合促進脂質の混合物を含む。脂質粒子はさらに、中性脂質、ステロール、凝集抑制脂質、またはこれらの組み合わせをさらに含む場合もある。例えば脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、および中性脂質を含むが、ステロール或いは凝集抑制脂質を含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、および中性脂質を含むが、ステロール或いは凝集抑制脂質を含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、および凝集抑制脂質を含むが、ステロール或いは中性脂質を含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、および中性脂質を含むが、凝集抑制脂質を含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、および凝集抑制脂質を含むが、中性脂質を含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、および凝集抑制脂質を含むが、ステロールを含まない場合がある。脂質粒子がカチオン性脂質、融合促進脂質、ステロール、中性脂質、および凝集抑制脂質を含む場合がある。
一つの例示となる実施形態において脂質粒子は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）および凝集抑制脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物を含む。ある特定の実施形態において脂質混合物は、カチオン性脂質、融合促進脂質、中性脂質、コレステロール、および凝集抑制脂質からなるか、または本質的にそれらからなる。さらに好ましい実施形態では、脂質粒子は、モル比で、約２０〜７０％のカチオン性脂質：０．１〜５０％の融合促進脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集抑制脂質の上述の脂質混合物を含む。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比で含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％のモル比で含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、１０〜５０％、２０〜５０％、または３０〜５０％のモル比で含まれ得る。いくつかの実施形態では、融合促進脂質は、０．１〜５０％、０．５〜４５％、１〜４０％、１％〜３５％、１％〜３０％、または１％〜２０％のモル比で含まれ得る。
さらに好ましい実施形態では、脂質粒子は、モル比で、約２０〜７０％カチオン性脂質：０．１〜５０％融合促進する脂質：５〜４５％中性脂質：２０〜５５％コレステロール：０．５〜１５％凝集抑制脂質の上述の脂質混合物からなるか、または本質的にそれらからなる。
特定の実施形態では、脂質粒子は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、および凝集抑制脂質の１種類以上の混合物を含むか、それらからなるか、或いは本質的にそれらからなる。例えば脂質粒子は、モル比が約２０〜６０％カチオン性脂質：０．１〜５０％融合促進脂質：５〜２５％ＤＳＰＣ：２５〜５５％コレステロール：０．５〜１５％凝集抑制脂質の混合物を含むか、それらからなるか、或いは本質的にそれらからなる。特定の実施形態において、脂質のモル比（つまり、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集抑制脂質のモル％）は、およそ４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０または５２／１３／３０／５であり、この混合物をさらに、モル比が０．１〜５０％、０．１〜５０％、０．５〜５０％、１〜５０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、または１５％〜３５％の融合促進脂質と組み合わせる。言い換えれば、脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集抑制脂質の４０／１０／４０／１０混合物とモル比が５０％の融合促進ペプチドを組み合わせると、得られる脂質粒子の総モル比（カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／凝集抑制脂質／融合促進ペプチドのモル％）は、２０／５／２０／５／５０となり得る。別の群の実施形態では、これらの組成物に含まれる中性脂質、ＤＳＰＣをＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥまたはＳＭで置き換える。
アポリポタンパク質
製剤は、アポリポタンパク質をさらに含むことができる。本明細書で使用する場合「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質ならびにその変異体および断片、ならびに以下に記載するアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体または断片を指す。
好適なアポリポタンパク質には、これらには限定されないが、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、ＡｐｏＡ−Ｖ、およびＡｐｏＥ、ならびに活性多形型形態、アイソフォーム、変異体、および突然変異体、ならびにそれらの断片または切断型形態が含まれる。ある特定の実施形態では、アポリポタンパク質は、チオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも１つのシステイン残基を含有するアポリポタンパク質、変異体、断片、またはイソ型を指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、１つのシステイン残基を含有するＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）およびＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）である（Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． ２９７： ２０６−１３；Ｂｉｅｌｉｃｋｉ ａｎｄ Ｏｄａ， ２００２， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１： ２０８９−９６）。ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＥ２、およびＡｐｏＥ３もチオール含有アポリポタンパク質である。単離されたＡｐｏＥおよび／またはその活性断片およびポリペプチド類似体（その組換え的に産生された形態を含む）は、米国特許第５，６７２，６８５号；同第５，５２５，４７２号；同第５，４７３，０３９号；同第５，１８２，３６４号；同第５，１７７，１８９号；同第５，１６８，０４５号；同第５，１１６，７３９号に記載されており、これらの開示は、参照することにより本明細書に組み入れられる。ＡｐｏＥ３は、Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ， ｅｔ ａｌ．，「Ｈｕｍａｎ Ｅ ａｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ： ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｏ−Ｅ ｉｓｏｆｏｒｍｓ，」Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９８１） ２５６： ９０７７−９０８３；およびＲａｌｌ， ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ ｆｒｏｍ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｈｙｐｅｒｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｅｍｉｃ ｓｕｂｊｅｃｔｓ」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９８２） ７９： ４６９６−４７００に開示されている。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｋ００３９６も参照されたい。
ある特定の実施形態では、アポリポタンパク質はその成熟形態であっても、そのプレプロアポリポタンパク質形態であることも、またはそのプロアポリポタンパク質形態であることができる。プロＡｐｏＡ−Ｉおよび成熟ＡｐｏＡ−Ｉ（可能な場合）のホモダイマーおよびヘテロダイマー（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １６（１２）：１４２４−２９）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（Ｋｌｏｎ ｅｔ ａｌ． ， ２０００， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７９：（３）１６７９−８７；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： １６３２−３５）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（Ｄａｕｍ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ７７：６１４−２２）、ＡｐｏＡ−ＩＩ（Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（１４）：８６３７−４６； Ｓｈｅｌｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９（１５）：９９２９−３５）、ＡｐｏＡ−ＩＶ（Ｄｕｖｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｅｕｒｏ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０１（２）：３７３−８３）、およびＡｐｏＥ（ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８（１４）：８９９３−９０００）も使用することができる。
ある特定の実施形態においてアポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体、またはイソ型であることができる。「断片」という用語は、天然のアポリポタンパク質のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有し、かつ、脂質結合特性を含む天然のアポリポタンパク質の活性を保持している、いずれものアポリポタンパク質を指す。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列に含まれる置換または変更を意味し、そのような置換または変更、例えばアミノ酸残基の付加および欠失は、脂質結合特性を含む天然のアポリポタンパク質の活性を消失させない。従って変異体は、１つ以上のアミノ酸残基が化学的に類似しているアミノ酸と保存的に置換された、本明細書で提供される天然アポリポタンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質またはペプチドを含み得る。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの少なくとも１つの疎水性残基をそのうちの別の残基に置換することが含まれる。同様に、例えば、アルギニンとリジン間、グルタミンとアスパラギン間、およびグリシンとセリン間などの、少なくとも１つの親水性残基間の置換も保存的置換である（米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、および同第６，０４６，１６６号を参照のこと）。「イソ型」という用語は、同じ機能、より大きな機能、または部分的な機能、および類似した配列、同一の配列、または部分的な配列を有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物であってもなくてもよく、かつ、通常は組織特異的である（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９（１）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｅ． Ｂｉｏｌ． １８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３６（１）：８０−８； Ｓａｃｒｅ ｅｔ ａｌ．， ２００３， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ５４０（１−３）：１８１−７；Ｗｅｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． １００（１−３）：４８１−９２；Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（３３）：２９９１９−２６；Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９（２３）：１４８８８−９３、および米国特許第６，３７２，８８６号）。
ある特定の実施形態において方法および組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築物の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築物は、虚血再灌流保護特性を有するアポリポタンパク質ドメインに結合している、高い脂質結合能を有するアポリポタンパク質ドメインで構成されていてもよい。アポリポタンパク質のキメラ構築物は、１つのアポリポタンパク質に含まれる別個の領域を含む構築物（つまり、相同性構築物）であってもよく、或いは、異なるアポリポタンパク質に含まれる別個の領域を含む構築物（つまり、異種性構築物）であることができる。キメラ構築物を含む組成物は、特定の特徴（例えば、脂質結合、受容体結合、酵素性、酵素活性化、抗酸化特性、または酸化還元特性）を有するように設計されたアポリポタンパク質変異体またはセグメントであるセグメントを含む場合もある（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ １９９０， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３１（８）：１５０３−１１；Ｈｉｘｓｏｎ ａｎｄ Ｐｏｗｅｒｓ １９９１， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３２（９）：１５２９−３５；Ｌａｃｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（２）：７０３−６；Ｈｏｅｇ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１（９）：３９１１−４；Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９（１）：４６８−７４；Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｃｅｌｌ ５０（６）：８３１−４０；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １８（１０）：１６１７−２４；Ａｖｉｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０１（８）：１５８１−９０；Ｂｉｌｌｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓｐｏｓ． ２８（１１）：１３３５−４２；Ｄｒａｇａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（４３）：３３４３５−４２；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ａｎｄ Ｕｔｅｒｍａｎｎ １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０（４）：２２５８−６４；Ｗｉｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５（２１）：１０４６４−７１；Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３６（１）：８０−８；Ｓｏｒｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １９（９）：２２１４−２５；Ｐａｌｇｕｎａｃｈａｒｉ １９９６， Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． １６（２）：３２８−３８：Ｔｈｕｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１（１１）：６０６２−７０；Ｄｙｅｒ １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６（２３）：１５０００９−１５；Ｈｉｌｌ １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（４７）：３０９７９−８４を参照のこと）。
使用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成、または精製されたアポリポタンパク質も含まれる。アポリポタンパク質またはその均等物を得るための方法は、当該分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば密度勾配遠心分離または免疫親和性クロマトグラフィーで血漿または天然産物から分離することができ、または合成的に、半合成的に、若しくは当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる（例えば、Ｍｕｌｕｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ７９８（１−２）： ８３−９０；Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２１（３）：２８４−９１；Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ２８（８）：９１３−２９；Ｐｅｒｓｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ７１１：９７−１０９；米国特許第５，０５９，５２８号、同第５，８３４，５９６号、同第５，８７６，９６８号、および同第５，７２１，１１４号；ならびに国際公開第８６／０４９２０号および国際公開第８７／０２０６２号を参照のこと）。
アポリポタンパク質には、ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏ（ＡｐｏＡ−ＩＭ）、ＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓ（ＡｐｏＡ−ＩＰ）、ＡｐｏＡ−ＩＩ、ＡｐｏＡ−ＩＶ、およびＡｐｏＥの活性を模倣するペプチドおよびペプチド類似体などのアポリポタンパク質アゴニストがさらに含まれる。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、同第６，０４６，１６６号、および同第５，８４０，６８８号に記載されているもののいずれであってもよく、それらの内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。
アポリポタンパク質アゴニストペプチドまたはペプチド類似体は、当該分野で知られているペプチド合成技術のいずれかを使用して、合成または製造することができる。そのような技術としては例えば、米国特許第６，００４，９２５号、同第６，０３７，３２３号、および同第６，０４６，１６６号に記載されているものが挙げられる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４）によって最初に記載された固相合成技術を使用して、ペプチドを調製することができる。他のペプチド合成技術は、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，第２版 （１９７６）、および当業者が容易に入手可能な他の文献に見ることができる。ポリペプチド合成技術の概要は、Ｓｔｕａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， （１９８４）に見ることができる。ペプチドは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． ＩＩ。第三版、 Ｎｅｕｒａｔｈ ｅｔ． ａｌ．， Ｅｄｓ．， ｐ． １０５−２３７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７６）に記載されているような溶液法で合成することもできる。様々なペプチド合成法で使用するのに適した保護基は、前述の文献ならびにＭｃＯｍｉｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ． （１９７３）に記載されている。ペプチドは、より大きな部分から、例えばアポリポタンパク質Ａ−Ｉのより大きな部分から、化学的にまたは酵素的に切断することで調製することもできる。
ある特定の実施形態では、アポリポタンパク質はアポリポタンパク質の混合物であることができる。一実施形態では、アポリポタンパク質は同種の混合物、すなわち単一の型のアポリポタンパク質であることができる。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、異種のアポリポタンパク質の混合物、すなわち２種類以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であることができる。異種のアポリポタンパク質の混合物の実施形態には、例えば、動物供給源に由来するアポリポタンパク質と半合成的供給源に由来するアポリポタンパク質の混合物が含まれ得る。ある特定の実施形態では、異種混合物は例えば、ＡｐｏＡ−ＩとＡｐｏＡ−Ｉ Ｍｉｌａｎｏの混合物を含み得る。ある特定の実施形態では、異種性混合物は例えば、ＡｐｏＡ−Ｉ ＭｉｌａｎｏとＡｐｏＡ−Ｉ Ｐａｒｉｓの混合物を含み得る。本明細書に記載の方法および組成物に使用するのに適した混合物は、当業者には明かである。
アポリポタンパク質を天然の供給源から得る場合、アポリポタンパク質は、植物または動物の供給源から得ることができる。アポリポタンパク質を動物供給源から得る場合、アポリポタンパク質は、いずれの種に由来するものであることもできる。ある特定の実施形態では、アポリポタンパク質を動物供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、アポリポタンパク質をヒト供給源から得ることができる。好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質を投与する個体と同じ種に由来するものである。
治療薬−脂質粒子組成物および製剤
脂質粒子と活性物質を含み、活性物質が脂質粒子と結合している組成物を提供する。特定の実施形態では、活性物質は治療薬である。特定の実施形態では、活性物質は脂質粒子の水性内部に封入されている。他の実施形態では、活性物質は脂質粒子の脂質層の１つ以上に存在する。他の実施形態では、活性物質は、脂質粒子の脂質表面の外側または内側に結合している。
本明細書で使用する場合「完全封入」とは、粒子中の核酸が、血清または遊離核酸を著しく分解するであろうヌクレアーゼアッセイに曝露された後でも、著しくは分解されないことを示す。完全封入した系では、通常は遊離核酸を１００％分解する処理によって、好ましくは粒子核酸の２５％未満が、より好ましくは粒子核酸の１０％未満が、最も好ましくは粒子核酸の５％未満しか分解されない。あるいは、完全封入化は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイにより決定することができる。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡを定量するための超高感度蛍光核酸染色法である（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州から入手可能）。完全封入化は、粒子が血清安定性であること、すなわちインビボ投与時にそれらの構成成分へと急速には分解しないことも示唆する。
本明細書で使用する場合、活性物質には、細胞、組織、器官、または対象に所望の効果を及ぼすことができる分子または化合物のいずれもが含まれる。そのような効果は、例えば、生物学的であっても、生理学的であっても、または美容的であることができる。活性物質は、いずれの型の分子または化合物であってもよく、それらには例えば、核酸、ペプチド、およびポリペプチドが含まれ、例えば、それらには、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片などの抗体；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、およびＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体およびそのリガンド；ホルモン；および有機小分子または化合物を含む小分子が含まれる。
一実施形態において活性物質は、治療薬またはその塩若しくは誘導体である。治療薬誘導体は、それら自体が治療効果をもつものであってもよく、またはさらに修飾された際に活性となるプロドラッグであることができる。従って治療薬誘導体は、一実施形態では修飾されていない薬剤と比較して、多少の或いは全ての治療活性を保持するが、別の実施形態では、治療薬誘導体は治療活性を欠如する。
様々な実施形態において治療薬には、抗炎症性化合物、抗うつ薬、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔ）、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば抗不整脈薬、血管収縮薬、ホルモン、およびステロイドなどの、治療上有効な任意の薬剤または薬物が含まれる。
ある特定の実施形態において治療薬は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、または抗悪性腫瘍薬などとも呼ばれる腫瘍学的な薬物である。使用することができる腫瘍学的薬物の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化二砒素、アザチオプリン、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、ブレオマイシン、静脈用ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、カルボプラチン、カルマスティン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、サイクロスポリンＡ、シタラビン、サイトシンアラビノサイド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシドホスフェート、エトポシドおよびＶＰ−１６、エキセメスタン、ＦＫ５０６、フルダラビン、フルオロウラシル、５−ＦＵ、ゲムシタビン（ジェムザール）、ジェムツツマブ−オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン（カンプトスター（Ｃａｍｐｔｏｓｔａｒ）、ＣＰＴ−１１１）、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミソール、リトレチノイン、メガストロール（ｍｅｇａｓｔｒｏｌ）、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ−５７１、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロルアミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン（ハイカムチン）、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＶＰ１６、およびビノレルビンが挙げられるが、これらには限定されない。使用することができる腫瘍学的薬物の他の例には、エリプチシンおよびエリプチシン類似体または誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、ならびにカンプトテシンが含まれる。
核酸−脂質粒子
ある特定の実施形態では、脂質粒子は核酸と結合し、核酸−脂質粒子を生じる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入されている。本明細書で使用する場合「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。５０個までのヌクレオチドを含有する断片は一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態においてオリゴヌクレオチドは、１５〜５０個の長さのヌクレオチドである。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖、および糖間（骨格）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同じように機能する天然に存在しないモノマーまたはその部分を含むポリマーまたはオリゴマーも指す。そのような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みが高いおよびヌクレアーゼの存在下での安定性が高いなどの特性があるため、天然の形態より好ましいことが多い。
脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、既知のいかなる形態の核酸も含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、またはＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＤＮＡの例には、構造遺伝子、制御領域および終止領域を含む遺伝子、およびウイルスＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例には、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。脂質−核酸粒子中に存在する核酸は、以下に記載するオリゴヌクレオチド修飾の１つ以上を含み得る。
核酸の長さは様々であってよいが、一般的には、核酸の特定の形態に依存する。例えば、特定の実施形態では、プラスミドまたは遺伝子は、約１，０００〜１００，０００個の長さのヌクレオチド残基であり得る。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約１０〜１００個の範囲の長さのヌクレオチドであり得る。種々の関連実施形態する実施形態では、一本鎖、二本鎖、三本鎖のオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０個のヌクレオチド、約２０〜約５０個のヌクレオチド、約１５〜約３０個のヌクレオチド、約２０〜約３０個の範囲の長さのヌクレオチドであり得る。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド（またはその鎖）は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするか、または標的ポリヌクレオチドに相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定で特異的な結合が生じるような、十分な度合いの相補性を示すために使用される。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列に１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的との結合が標的分子の機能を妨害し、標的分子に由来する効果または発現の消失が生じる場合であって、かつ、特異的な結合が望まれる条件（すなわちインビボアッセイまたは治療の場合には生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイが実施される条件）ではオリゴヌクレオチドと非標的配列との非特異的な結合が回避されるように十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。従って他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的とするかまたはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子またはｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１つ、２つまたは３つの塩基置換、例えばミスマッチを含む。
ＲＮＡ干渉核酸
特定の実施形態では、核酸−脂質粒子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子と結合している。ＲＮＡｉ分子を用いたＲＮＡ干渉法は、目的の遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を妨害するために使用することができる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本質的に、開発中の次世代標的オリゴヌクレオチド薬として、アンチセンスＯＤＮおよびリボザイムに取って代わっている。
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られている細胞質多タンパク質複合体と結合することができる、通常１６〜３０個の長さのヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。ｓｉＲＮＡを含むＲＩＳＣは、相同なｍＲＮＡ転写産物の分解を仲介する。そのため、タンパク質発現を高い特異性でノックダウンするように、ｓｉＲＮＡを設計することができる。他のアンチセンスの技術とは異なり、ｓｉＲＮＡは、非コードＲＮＡによって遺伝子発現を制御するように進化した天然の機構を介して機能する。このことが、ｓｉＲＮＡの活性が、インビトロおよびインビボで、アンチセンスＯＤＮまたはリボザイムのいずれよりも強力である理由であると一般的に考えられている。臨床に関連する標的を標的とするｓｉＲＮＡを含む様々なＲＮＡｉ試薬が現在、製剤開発の段階にあり、例えば、その全体が参照することにより組み入れられる、ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：４４３−４５３ （２００７）に記載されている。
最初に記載されたＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡセンス鎖およびＲＮＡアンチセンス鎖の両方を含むＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであったが、ＤＮＡセンス：ＲＮＡアンチセンスのハイブリッド、ＲＮＡセンス：ＤＮＡアンチセンスのハイブリッド、およびＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドがＲＮＡｉを仲介できることが、今では実証されている（Ｌａｍｂｅｒｔｏｎ， Ｊ．Ｓ． ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ， Ａ．Ｔ．， （２００３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４：１１１−１１９）。従って、これらの異なる型の二本鎖分子のいずれかを含むＲＮＡｉ分子の使用が考えられる。加えて、ＲＮＡｉ分子を様々な形態で使用することおよび細胞に導入することができることが理解される。従って本明細書で使用する場合ＲＮＡｉ分子は、細胞でのＲＮＡｉ応答を誘導可能なあらゆる分子を包含し、このようなＲＮＡｉ分子には、２つの別々の鎖、つまりセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；非ヌクレオチジルリンカーにより共に結合された２つの別々の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド；二本鎖領域を形成する相補的配列のヘアピンループを含むオリゴヌクレオチド、例えばｓｈＲＮＡｉ分子；および単独でまたは別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成可能な１つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクターが含まれるがこれらには限定されない。
本明細書で使用する場合「一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、単一の分子で構成されているｓｉＲＮＡ化合物である。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、鎖内対合により形成された二本鎖領域を含んでいてもよく、例えば、ヘアピンまたはパンハンドル構造であり得る。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、標的分子のアンチセンスであり得る。
一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、ＲＩＳＣに入り込み、ＲＩＳＣが介在する標的ｍＲＮＡの切断に関与することができるのに十分な長さであり得る。一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、少なくとも１４個の長さのヌクレオチドであり、他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０または５０個の長さのヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の長さは、２００、１００、または６０個ヌクレオチド未満である。
ヘアピンｓｉＲＮＡ化合物は、少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、若しくは２５個のヌクレオチド対か、または１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、若しくは２５個のヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。二本鎖領域の長さは、２００、１００、または５０以下であり得る。ある特定の実施形態では、二本鎖領域の長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１個のヌクレオチド対の範囲である。ヘアピンは、一本鎖の突出した領域または対合していない末端領域を有してもよい。ある特定の実施形態では、突出しているヌクレオチドの長さは２〜３個である。いくつかの実施形態では、突出はヘアピンのセンス側にあり、いくつかの実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側にある。
本明細書で使用する場合「二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物」は、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成することができる、複数の、いくつかの例では２本の、鎖を含むｓｉＲＮＡ化合物である。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖は、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであってもよく、または１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであり得る。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のアンチセンス鎖は、２００、１００、または５０個以下の長さのヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１個の範囲であり得る。本明細書で使用する場合「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的ＲＮＡに十分相補的なｓｉＲＮＡ化合物の鎖を意味する。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖は、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであってもよく、または１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであり得る。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物のセンス鎖は、２００、１００、または５０個以下の長さのヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの長さは、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１個の範囲であり得る。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分は、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであってよく、または１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、若しくは６０個の長さのヌクレオチドであり得る。二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の二本鎖部分は、２００、１００、または５０個以下の長さのヌクレオチドであり得る。ヌクレオチドの長さは、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１個の範囲であり得る。
多くの実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は十分に大きく、内生の分子、例えばダイサーによって切断されて、より小さなｓｉＲＮＡ化合物、例えばｓｉＲＮＡ薬剤を生成することができる。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物が分子の片方または両方の末端に一本鎖または未対合領域を含むように、センス鎖およびアンチセンス鎖を選択してもよい。従って二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物は、対合して、例えば、１〜３個のヌクレオチドの５’突出または３’突出の一方または両方、或いは３’突出を含有する、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得る。突出は、一方の鎖が他方より長いことによる場合もあるし、或いは同じ長さの２本の鎖がずれている結果である場合もある。いくつかの実施形態は、少なくとも１つの３’突出を有する。一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子の両端が３’突出を有する。いくつかの実施形態では、突出しているヌクレオチドは２個である。
ある特定の実施形態では、二本鎖領域の長さは、１５〜３０、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３個のヌクレオチドの範囲にあり、例えば上で論じたｓｓｉＲＮＡ化合物の範囲内にある。ｓｓｉＲＮＡ化合物は、天然のダイサーによって長いｄｓｉＲＮＡからプロセシングされた産物と、長さおよび構造が類似している場合がある。ｓｓｉＲＮＡ化合物の２本の鎖が結合している、例えば共有結合で結合している実施形態も含まれる。必要な二本鎖領域および３’突出を提供するヘアピンまたは他の一本鎖構造も企図される。
二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物および一本鎖ｓｉＲＮＡ化合物を含む、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写産物のサイレンシングを仲介することができる。便宜上、そのようなｍＲＮＡは、本明細書ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。そのような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。一般的に、サイレンシングされるＲＮＡは、内生の遺伝子または病原体の遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えばｔＲＮＡおよびウイルスＲＮＡも標的とすることができる。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡｉを仲介する」という表現は、配列特異的に標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論により束縛されることは望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉ機構またはプロセシング、およびガイドＲＮＡ、例えば２１〜２３個のヌクレオチドのｓｓｉＲＮＡ化合物が使用されると考えられている。
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」であり、そのためｓｉＲＮＡ化合物は、標的ｍＲＮＡによりコードされているタンパク質の生産をサイレンシングする。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、標的ＲＮＡ、例えば標的ＲＮＡと「完全に相補的」であり、ｓｉＲＮＡ化合物はアニーリングする。例えば、完全に相補的な領域で、主にワトソンクリック塩基対で作られるハイブリッドを形成する。「十分に相補的」な標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡと完全に相補的な内部領域（例えば、少なくとも１０個のヌクレオチド）を含む場合がある。さらにある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、ｓｉＲＮＡ化合物は、その領域（例えば、７個以内のヌクレオチド）に完全な相補性が見られる場合にのみ、ＲＮＡｉを仲介する。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、動物および植物のゲノムＤＮＡから転写されるがタンパク質には翻訳されない、高度に保存されたクラスの小さいＲＮＡ分子である。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる約１７〜２５個のヌクレオチド（ｎｔ）の一本鎖のＲＮＡ分子であり、発生、細胞増殖、アポトーシス、および分化の重要な調節因子として特定されている。それらは、特定のｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の制御に関与していると考えられている。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写産物の切断、またはその両方を介して遺伝子の発現を下方制御する。ＲＩＳＣは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
現在までに多数のｍｉＲＮＡ配列が特定されており、特定された配列の数は増え続けいている。それらの事例は、例えば、「ｍｉＲＢａｓｅ： ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ， ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ， Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ， ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ， Ｂａｔｅｍａｎ Ａ， Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ． ＮＡＲ， ２００６， ３４， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ， Ｄ１４０−Ｄ１４４；「Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ」 Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ． ＮＡＲ， ２００４， ３２， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ， Ｄ１０９−Ｄ１１１に見ることができ、また、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／にも見ることができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または単に「アンチセンス」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列、例えば標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的ｍＲＮＡと結合することにより遺伝子発現を阻害すると考えられている。相補的ｍＲＮＡに結合してその翻訳を阻害するか、または標的ｍＲＮＡの分解を誘導するかのいずれかによって、標的ｍＲＮＡとの結合は遺伝子の発現を阻害することができる。アンチセンスＤＮＡは、特定の相補的な（コードしているまたはコードしていない）ＲＮＡを標的とするために使用することができる。結合が生じると、酵素であるＲＮａｓｅＨがこのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１０〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１５〜約３０個のヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子に完全に相補的でない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。従って、アンチセンスとの標的特異的でない活性が見られる場合、または特定の使用に関して、アンチセンス配列が標的配列との１つ以上のミスマッチ含むことが最も好ましい場合も企図される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効な標的阻害剤であることが実証されている。従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的遺伝子によるタンパク質合成の特異的阻害に使用することができる。タンパク質合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）および２型ムスカリンアセチルコリン受容体の合成は、それらそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号、これらは参照することにより組み入れられる）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質であるサイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、およびヒトＥＧＦで実証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８８ Ｊｕｎ １０；２４０（４８５８）：１５４４−６；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒ ａｎｄ Ａｈｍｅｄ， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ． １９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １９９８ Ｊｕｎ １５；５７（２）：３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；米国特許第５，７８９，５７３号；米国特許第５，７１８，７０９号、および米国特許第５，６１０，２８８号）。さらに、様々な異常な細胞増殖（例えば癌）の阻害および治療にアンチセンス構築物を使用することができることも記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号、米国特許第５，５９１，３１７号、および米国特許第５，７８３，６８３号、これらはそれぞれ、参照することにより組み入れられる）。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの製造方法は、当該分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために容易に適合することができる。所定の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択は、選択された標的配列や二次構造の決定、Ｔｍ、結合エネルギー、および相対的な安定性の分析に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞中での標的ｍＲＮＡとの特異的な結合を低減または阻害することになる二量体、ヘアピン、または他の二次構造を形成しないそれらの相対的能力に基づいて選択することができる。特に好ましいｍＲＮＡの標的部位は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域に対して実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析および標的部位の選択に関する判断は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ社製）のｖ．４、および／またはＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施することができる。
アンタゴｍｉｒ
アンタゴｍｉｒは、ＲＮＡｓｅ保護、ならびに組織および細胞取り込みの増強などの薬理学的特性に関する種々の修飾を内包するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。アンタゴｍｉｒは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオアート骨格、および例えば３’末端のコレステロール部分により、通常のＲＮＡと区別される。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒと内生ｍｉＲＮＡを含む二本鎖を形成することで内生ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングし、それによってｍｉＲＮＡ誘導性遺伝子サイレンシングを防止するために使用することができる。アンタゴｍｉｒ介在性ｍｉＲＮＡサイレンシングの一例としてはｍｉＲ−１２２のサイレンシングがあり、参照することによりその全体が具体的に本明細書に組み入れられる、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ， Ｎａｔｕｒｅ， ２００５， ４３８： ６８５−６８９に記載されている。アンタゴｍｉｒ ＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成の手順で合成することができる。米国特許出願第２００７／０１２３４８２号、および米国特許出願第２００７／０２１３２９２号を参照のこと（これらそれぞれの開示は、参照することにより本明細書に組み入れられる）。
アンタゴｍｉｒは、オリゴヌクレオチド合成用のリガンド結合モノマーサブユニットおよびモノマーを含むことができる。モノマーの例は、米国特許出願第２００５／０１０７３２５号に記載されており、その全体は参照することにより組み入れられる。アンタゴｍｉｒは、国際公開第２００４／０８０４０６号（その全体は参照することにより組み入れられる）に記載されているものなどの、ＺＸＹ構造を有することができる。アンタゴｍｉｒは、両親媒性部分と複合体を形成することができる。オリゴヌクレオチド薬と共に使用する両親媒性部分の例は、国際公開第２００４／０８０４０６号に記載されており、その全体は参照することにより組み入れられる。
アプタマー
アプタマーは、特定の目的の分子と高い親和性と高い特異性で結合する核酸またはペプチド分子である（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：５０５ （１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ， Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８ （１９９０）、これらそれぞれの全体は参照することにより組み入れられる）。大きいタンパク質から小さい有機分子までの多数の異なる物質に結合するＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーの生成が成功している。これらそれぞれの全体は参照することにより組み入れられる、Ｅａｔｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． １：１０−１６ （１９９７）、Ｆａｍｕｌｏｋ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ９：３２４−９（１９９９）、およびＨｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８２０−５ （２０００）を参照のこと。アプタマーは、ＲＮＡに基づく物であってもＤＮＡに基づくものであってもよく、リボスイッチを含み得る。リボスイッチは、小さい標的分子に直接結合することができ、標的との結合が遺伝子の活性に影響を及ぼすｍＲＮＡ分子の一部分である。従って、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、標的分子が存在するかまたは存在しないかに応じて、それ自体の活性の制御に直接関与する。低分子、タンパク質、核酸などの様々な分子標的、ならびに細胞、組織、および生物にさえ結合するように、アプタマーは一般的に、インビトロで選抜を繰り返すこと、または同様にＳＥＬＥＸ（sｙｓｔｅｍａｔｉｃ eｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ lｉｇａｎｄｓ ｂｙ eＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）により操作される。アプタマーは、合成、組換え、および精製法を含む既知の方法のいずれによって調製してもよく、単独でまたは同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用してもよい。
本明細書により詳しく記載するように、「アプタマー」という用語はさらに、所定の標的に対する複数の既知のアプタマーを比較することで分かるコンセンサス配列を含む「第２のアプタマー」を特に含む。
リボザイム
別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子はリボザイムに結合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的な触媒ドメインを有するＲＮＡ分子複合体である（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ， Ｃｅｌｌ． １９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。例えば、多くのリボザイムは、高い特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質に含まれるいくつかのリン酸エステルのうちの１つだけを切断することが多い（Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． １９８１ Ｄｅｃ；２７（３ Ｐｔ ２）：４８７−９６；Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄ Ｗｅｓｔｈｏｆ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． １９９０ Ｄｅｃ ５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ ａｎｄ Ｓｈｕｂ， Ｎａｔｕｒｅ． １９９２ Ｍａｙ １４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、基質が、化学反応の前に、特異的な塩基対合相互作用によりリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する必要があることに起因している。
天然生じる酵素活性をもつＲＮＡとしては、現在のところ、少なくとも６種類の基本的な型があることが分かっている。これらはそれぞれ、生理学的条件下で、トランス位にあるＲＮＡリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒することができる（従って、他のＲＮＡ分子を切断することができる）。一般的に、酵素活性をもつ核酸は、まず標的ＲＮＡと結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素活性をもつ部分の近くに保持される酵素活性をもつ核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素活性をもつ核酸は、相補的な塩基対合によって、まず標的ＲＮＡを認識し、次いで標的ＲＮＡと結合し、正しい部位に結合すると酵素活性を発揮して標的ＲＮＡを切断する。このような戦略的な標的ＲＮＡの切断によって、コードされたタンパク質の合成を指示する標的ＲＮＡの能力が破壊される。酵素活性をもつ核酸は、そのＲＮＡ標的と結合してＲＮＡ標的を切断した後、そのＲＮＡから放出されて別の標的を探索し、新しい標的との結合および標的の切断を繰り返すことができる。
酵素活性をもつ核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、グループＩイントロン、またはＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と結合する）、またはニューロスポラ ＶＳ ＲＮＡモチーフの形に形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの具体例は、Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９２ Ｓｅｐ １１； ２０ （１７）：４５５９−６５に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開第０３６０２５７号）、Ｈａｍｐｅｌ ａｎｄ Ｔｒｉｔｚ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８９ Ｊｕｎ １３；２８（１２）：４９２９−３３；Ｈａｍｐｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９０ Ｊａｎ ２５；１８（２）：２９９−３０４；および米国特許第５，６３１，３５９号）に記載されている。肝炎δウイルスモチーフの例は、Ｐｅｒｒｏｔｔａ ａｎｄ Ｂｅｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９２ Ｄｅｃ １；３１（４７）：１１８４３−５２に記載されており；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． １９８３ Ｄｅｃ；３５（３ Ｐｔ ２）：８４９−５７に記載されており；ニューロスポラ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｃｅｌｌ． １９９０ Ｍａｙ １８；６１（４）：６８５−９６；Ｓａｖｉｌｌｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １９９１ Ｏｃｔ １；８８（１９）：８８２６−３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ ａｎｄ Ｏｌｉｖｅ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９３ Ｍａｒ ２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載されており；およびグループＩイントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されている。使用される酵素活性をもつ核酸分子の重要な特徴は、酵素性核酸分子が、標的遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡ領域の１つ以上に相補的な特定の基質結合部位を有することと、その基質結合部位内にまたはその周囲に分子にＲＮＡ切断活性を与えるヌクレオチド配列を有するということである。従ってリボザイム構築物を、本明細書で言及した特定のモチーフに限定する必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列に対して標的化したリボザイムの製造方法は、当該分野で公知である。リボザイムは、各々が参照により本明細書に具体的に組み込まれる国際公開第９３／２３５６９号および国際公開第９４／０２５９５号（それぞれ参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されているように設計することができ、インビトロおよびインビボで試験するためにそれらに記載されているように合成することができる。
リボザイム結合アームの長さを変更することによって、または血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を阻止する修飾を有するリボザイムを化学的に合成することによって（国際公開第９２／０７０６５号；国際公開第９３／１５１８７号；国際公開第９１／０３１６２号；欧州特許出願公開第９２１１０２９８．４号；米国特許第５，３３４，７１１号；および国際公開第９４／１３６８８号、これらには、酵素活性をもつＲＮＡ分子の糖部分に行うことができる様々な化学修飾が記載されている）、細胞内でのそれらの効力を高める修飾によって、およびステムＩＩ塩基を取り除いてＲＮＡ合成時間を短縮し化学的な要求を減らすことによって、リボザイムの活性を最適化することができる。
免疫賦活性オリゴヌクレオチド
脂質粒子に結合された核酸は、免疫賦活性であってもよく、それらには、対象に投与された際に免疫応答を誘導可能な免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖または二本鎖）が含まれる。対象は哺乳動物であってもまたは他の患者であり得る。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン型の二次構造を生じるパリンドローム（その全体が参照することにより組み入れられる、Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｓ．， ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ４０７２−４０７６を参照のこと）、またはＣｐＧモチーフ、ならびに既知のＩＳＳの他の特徴（多重Ｇドメインなど。その全体が参照することにより組み入れられる、国際公開第９６／１１２６６号を参照のこと）が含まれる。
免疫応答は、先天性の免疫応答であっても、或いは適応性の免疫応答であり得る。免疫系は、より先天性の免疫系と脊椎動物の後天性の適応免疫系に分類され、後者はさらに、体液性の細胞成分に分類される。特定の実施形態では、免疫応答は粘膜性であり得る。
特定の実施形態では、免疫賦活性核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与された場合にのみ免疫賦活性であり、その「遊離形態」で投与された場合は免疫賦活性ではない。そのようなオリゴヌクレオチドは、免疫賦活性であるとみなされる。
免疫賦活性核酸は、免疫応答を惹起するために標的ポリヌクレオチドと特異的に結合して標的ポリヌクレオチドの発現を低減させることが必要とされない場合、配列特異的ではないとみなされる。従って、ある特定の免疫賦活性核酸は、天然に生じる遺伝子またはｍＲＮＡの領域に相当する配列を含む場合があるが、それらは、依然として配列特異的ではない免疫賦活性核酸であるとみなされる。
一実施形態では、免疫賦活性核酸または免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドを少なくとも１つ含む。オリゴヌクレオチドまたはＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていなくても、またはメチル化されていてもよい。別の実施形態において免疫賦活性核酸は、メチル化されたシトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態において核酸は、ＣｐＧジヌクレオチドを１つ含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドに含まれているシトシンはメチル化されている。特定の実施形態では、核酸は、５’ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３’の配列を含む。代替的な実施形態では、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドに含まれているシトシンの少なくとも１つはメチル化されている。さらなる実施形態では、配列中に含まれているＣｐＧジヌクレオチドのシトシンはそれぞれメチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つは、メチル化されたシトシンを含む。
特定の一実施形態では、核酸は、５’ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’の配列を含む。別の特定の実施形態では、核酸配列は、５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴ３’の配列を含み、太字で示す２つのシトシンがメチル化されている。特定の実施形態では、ＯＤＮは、以下に示すＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８、およびＯＤＮ＃９からなるＯＤＮの群から選択される。
表２．免疫賦活性オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）の例
Figure 2018090826
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 「Ｚ」はメチル化されたシトシン残基を表す。ＯＤＮ１４は１５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドであり、ＯＤＮ１はその５’末端にチミジンが１つ付加された同じオリゴヌクレオチドである。その結果、ＯＤＮ１は１６−ｍｅｒとなっている。ＯＤＮ１４とＯＤＮ１の間の生物学的活性には違いは見られず、両方とも同様の免疫賦活化活性を示す（Ｍｕｉ ｅｔ ａｌ．、２００１）。
好適なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）のさらなる特定の核酸配列は、その全体が参照することにより組み入れられる、Ｒａｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ２９８：１１８５−１１９２ （２００１）に記載されている。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるＯＤＮは、リン酸ジエステル（「ＰＯ」）骨格またはホスホロチオアート（「ＰＳ」）骨格、および／またはＣｐＧモチーフ中にある少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周辺のゲノムＤＮＡが存在しない場合でさえ、比較的短い結合配列を認識するため、特定の転写因子の保存された結合配列を保持する短鎖オリゴヌクレオチドを、生細胞での遺伝子発現を操作するためのツールとして使用することができる。この戦略には、そのような「デコイオリゴヌクレオチド」を細胞内に送達することが関与し、その後デコイオリゴヌクレオチドは、標的因子によって認識され、結合される。デコイが転写因子のＤＮＡ結合部位を占有することによって、その後、転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域に結合できなくなる。転写因子により活性化される遺伝子の発現を阻害するため、または転写因子の結合により抑制される遺伝子を上方制御するためのいずれの治療薬としても、デコイを使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの使用例は、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ２０００， １０６： １０７１−１０７５に見ることができ、これは、参照することによりその全体が明示的に本明細書に組み入れられる。
スーパーｍｉｒ
スーパーｍｉｒは、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはその両方またはその修飾体の、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであり、ｍｉＲＮＡと実質的に同一で、その標的のアンチセンスであるヌクレオチド配列を有するものである。この用語には、天然に生じる核酸塩基、糖、および共有結合のヌクレオシド（骨格）間結合で構成されており、同様に機能する少なくとも１つの天然に生じない部分を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの向上、核酸標的に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性をもつため、天然形態より好ましい。好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、センス鎖を含んでおらず、別の好ましい実施形態では、スーパーｍｉｒは、それほど自己ハイブリダイズしない。スーパーｍｉｒは二次構造を有していてもよいが、生理学的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーｍｉｒとは、それ自体と二本鎖を形成するスーパーｍｉｒが約５０％未満（例えば、約４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満）の一本鎖である。スーパーｍｉｒは、自己ハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができるヘアピンセグメント、例えば配列、を好ましくは３’末端に含む場合があり、二本鎖領域は例えば、少なくとも１、２、３、または４個のヌクレオチド、好ましくは８、７、６、またはｎ個未満のヌクレオチド、例えば５個のヌクレオチドである。二本鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば３、４、５、または６個のｄＴ、例えば修飾ｄＴによって結合されていてもよい。別の実施形態では、スーパーｍｉｒは、より短いオリゴ、例えば５、６、７、８、９、または１０個の長さのヌクレオチドと、例えば、３’および５’末端の一方または両方で、或いはスーパーｍｉｒの一端と非末端または中間部で、二本鎖を形成する。
ｍｉＲＮＡ模倣体
ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力を模倣するために使用することができるクラスの分子を表す。従って「マイクロＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を制御することが可能な、人工の非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内生ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによって得ることはできない）。ｍｉＲＮＡ模倣体は、成熟分子（例えば、一本鎖）または模倣体前駆体（例えば、ｐｒｉ−またはＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、限定するものではないが、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックド核酸、または２’−Ｏ、４’−Ｃエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、または上記のいかなる組合せ（ＤＮＡ‐ＲＮＡハイブリッドを含む）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸（修飾または修飾核酸）で構成されていてもよい。加えて、ｍｉＲＮＡ模倣体は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、機能性、鎖の使用、および／または効力に影響を及ぼし得る結合を含むことができる。一つの設計では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、二本鎖分子（例えば、長さが約１６〜約３１個のヌクレオチドの二本鎖領域を有する）であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との相同性を有する１つ以上の配列を含有する。修飾には、分子の一方または両方の鎖における２’修飾（２’−Ｏメチル修飾および２’Ｆ修飾を含む）、ならびに核酸安定性および／または特異性を増強するヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオアート修飾）が含まれていてもよい。加えて、ｍｉＲＮＡ模倣体は突出を含むことができる。突出は、どちらかの鎖の３’または５’末端いずれかにあって、１〜６個のヌクレオチドで構成されていてもよく、安定性または機能性を増強するために修飾されていてもよい。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、１６〜３１個のヌクレオチドの二本鎖領域と以下の化学修飾パターンの１つ以上を含む：センス鎖はは、１番目と２番目（センスオリゴヌクレオチドの５’末端から数えて）のヌクレオチド、および全てのＣとＵに２’−Ｏ−メチル修飾を含み；アンチセンス鎖修飾には、全てのＣおよびＵの２’Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、および２つのヌクレオチドからなる３’突出に結合した安定なヌクレオチド間結合が含まれ得る。
抗ｍｉｒまたはｍｉＲＮＡ阻害剤
「抗ｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害剤」、「ｍｉＲ阻害剤」、または「阻害剤」という用語は同義語であり、特定のｍｉＲＮＡの能力を干渉するオリゴヌクレオチドまたは修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。一般的に阻害剤は、ＲＮＡ、修飾されたＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾されたＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または上記の任意の組合せを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸または修飾された核酸である性質のものである。修飾には、２’修飾（２’−０アルキル修飾および２’Ｆ修飾を含む）、および送達、安定性、特異性、細胞内区画化、または効力に影響を及ぼし得るヌクレオチド間修飾（例えば、ホスホロチオアート修飾）が含まれる。加えて、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、送達、細胞内区画化、安定性、および／または効力に影響を及ぼし得る結合を含むことができる。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）、およびヘアピン構造などの様々な配置をとることができ、一般的には、マイクロＲＮＡ阻害剤は、標的となるｍｉＲＮＡの成熟鎖（１つまたは複数の鎖）と相補的な或いは部分的に相補的な１つ以上の配列または部分配列を含み、加えて、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補鎖である配列の５’および３’に位置しているさらなる配列も含んでいてよい。さらなる配列は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（成熟ｍｉＲＮＡはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡに由来する）中の成熟ｍｉＲＮＡに隣接している配列の逆相補体であってもよく、またはさらなる配列は、任意の配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵの混合物を有する）であることができる。幾つかの実施形態では、さらなる配列の一方または両方は、ヘアピンを形成することができる任意の配列である。従っていくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列は、ヘアピン構造の５’側および３’側に隣接している。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖の場合、互いの鎖がヌクレオチドのミスマッチを含むことができる。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、細胞内への阻害剤取り込みを促進するために、結合部分に結合されていてもよい。例えば、マイクロＲＮＡ阻害剤は、コレステリル５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ヒドロキシペンチルカルバメートに結合されていてもよく、このことによって、細胞内へのマイクロＲＮＡ阻害剤の受動取り込みが可能になる。ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含むマイクロＲＮＡ阻害剤は、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， 「Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」 ＲＮＡ １３： ７２３−７３０ （２００７）、および国際公開第２００７／０９５３８７号、および国際公開第２００８／０３６８２５号に詳細に記載されており、これらはそれぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み入れられる。当業者であれば、データベースから所望のｍｉＲＮＡの配列を選択し、本明細書で開示の方法に有用な阻害剤を設計することができる。
Ｕ１アダプター
Ｕ１アダプターは、ポリＡ部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソンに含まれる部位に相補的な標的ドメイン、およびＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１核内低分子ＲＮＡ成分に結合する「Ｕ１ドメイン」を有する二機能性オリゴヌクレオチドである（Ｇｏｒａｃｚｎｉａｋ， ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２７（３）， ２５７−２６３、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる）。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡエキソン−イントロン境界に結合することにより、主としてスプライセオソーム形成の初期ステップを指示するように機能するリボ核タンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ， １９９８， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ４９：７７−９５）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡ塩基対の５’末端から２番目〜１１番目のヌクレオチドは、ｐｒｅ ｍＲＮＡの５’ｓｓと結合する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＵ１アダプターである。一実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つの他のｉＲＮＡ薬剤と組み合わせて投与することができる。
オリゴヌクレオチド修飾
未修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかの用途では、最適ではない場合があり、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼにより分解され易い場合がある。ヌクレアーゼは、核酸のリン酸ジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドを化学的修飾することで特性の向上を付与することができ、例えば、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定的にすることができる。
オリゴヌクレオチドはサブユニットまたはモノマーのポリマーであるため、以下に記載する修飾、例えば塩基、糖、ホスフェート部分、またはホスフェート部分の非架橋酸素の修飾の多くは、オリゴヌクレオチド内で繰り返される位置で生じる。所定のオリゴヌクレオチドの全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前述した修飾のうちの１つ以上を単一のオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、または、あるオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むことさえできる。
いくつかの例では、修飾は、オリゴヌクレオチド内の対象となる全ての位置で生じるが、多くの例では、実際はほとんどの例では、修飾は対象となる位置の全てで生じるとは限らない。例えば、修飾は、３’または５’末端位置のみで生じてもよく、内部領域でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドの位置でのみまたはオリゴヌクレオチドの最後の２、３、４、５、または１０個のヌクレオチドでのみ生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方で生じてもよい。修飾は、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域でのみ、または二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖領域でのみ生じてもよい。例えば、非架橋酸素位置でのホスホロチオアート修飾は、末端の一方または両方でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドの位置でのみまたは鎖の最後の２、３、４、５、若しくは１０個のヌクレオチドでのみ生じてもよく、または二本鎖および一本鎖領域、特に末端で生じてもよい。５’末端はリン酸化することができる。
本明細書に記載の修飾は、唯一の修飾であっても、または複数のヌクレオチドに含まれている唯一の型の修飾であってもよく、或いは修飾は、本明細書に記載の他の修飾の１つ以上と組み合わせることができる。本明細書に記載の修飾は、オリゴヌクレオチドに関しても組み合わせることができ、例えば、あるオリゴヌクレオチドに含まれる別個のヌクレオチドは、本明細書に記載されている異なる修飾を有する。
いくつかの実施形態では、例えば、安定性を高めること、突出に特定の核酸塩基を含めること、または一本鎖の突出、例えば５’突出若しくは３’突出若しくはその両方に修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド代用物を含めることが、特に好ましい。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、３’または５’突出の塩基の全てまたはいくつかは、本明細書に記載の修飾によって修飾される。修飾には、例えばリボース糖の２’ＯＨ基における修飾の使用、例えばリボヌクレオチドの代りのデオキシチミジンの使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホチオアート修飾の使用が含まれる。突出は、標的配列と相同性である必要はない。
具体的な修飾を以下でより詳細に論じる。
リン酸基
リン酸基は負に荷電した種である。電荷は、２つの非架橋酸素原子に等しく分配されている。しかしながら、リン酸基は、酸素の１つを別の置換基で置き換えることで修飾することができる。ＲＮＡリン酸骨格に対してこのような修飾を行う結果、一例として、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの抵抗性を高めることができる。従って、理論により束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、荷電のないリンカーまたは電荷が非対称に分布した荷電リンカーのいずれかを生じる変更を導入することが望ましい場合がある。
修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ある特定の実施形態では、ホスフェート骨格部分の非架橋ホスフェート酸素原子のうちの１つは、Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは、水素、アルキル、アリール）、またはＯＲ（Ｒは、アルキルまたはアリールである）のうちのいずれかで置換することができる。未修飾リン酸基の亜リン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素の１つを上記の原子または原子団の１つで置換すると亜リン酸原子はキラルとなる。言いかえれば、このように修飾されたリン酸基の亜リン酸原子は不斉中心である。不斉亜リン酸原子は、「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかをとることができる。
ホスホロジチオアートでは、非架橋酸素は両方とも硫黄で置換されている。ホスホロジチオアートのリン中心はアキラルであり、そのため、オリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーは形成されない。従って、理論により束縛されることは望まないが、キラル中心を排除する両非架橋酸素の修飾、例えばホスホロジチオアートの形成は、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないという点で望ましい場合がある。従って、非架橋酸素は、独立して、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒは、アルキルまたはアリール）のいずれか１つであることができる。
リン酸リンカーは、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合させる酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオアート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することで修飾することもできる。置換は、結合している酸素の一方で、または両方で生じることができる。架橋酸素が、ヌクレオシドの３’−酸素である場合、炭素での置換が好ましい。架橋酸素が、ヌクレオシドの５’−酸素である場合、窒素での置換が好ましい。
リン酸基の置換
リン酸基は、リンを含まない連結部分で置換することができる。理論により束縛されることは望まないが、荷電ホスホジエステル基は核酸分解の反応中心であるため、荷電ホスホジエステル基を中性の構造模倣体と置換することで、ヌクレアーゼに対する安定性が高まるはずだと考えられる。重ねて、理論により束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、荷電をもつリン酸基を中性部分と置換する変更を導入することが望ましい場合がある。
リン酸基と置き換わることのできる部分の例としては、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。好ましい置換には、メチレンカルボニルアミノおよびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
リン酸に結合した酸素の少なくとも１つが置換されている、またはリン酸基が非亜リン酸基により置換されている修飾されたリン酸結合は、「非ホスホジエステル骨格結合」とも呼ばれる。
リボリン酸骨格の置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代用物で置換されているオリゴヌクレオチド模倣骨格を構築することもできる。理論により束縛されることは望まないが、電荷の繰り返しを含む骨格が存在しないことで、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）との結合が低下すると考えられる。重ねて、理論により束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、塩基を中性代用物骨格にテザーする変更を導入することが望ましい場合がある。例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられる。好ましい代用物は、ＰＮＡ代用物である。
糖修飾
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかに修飾を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されてもよく、または様々な「オキシ」または「デオキシ」置換基で置換されていてもよい。理論により束縛されないが、ヒドロキシルは、脱プロトン化して２’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、安定性が高まることが予測される。２’−アルコキシドは、リンカーに含まれるリン原子を分子内求核攻撃することによって分解を触媒し得る。重ねて、理論により束縛されることは望まないが、いくつかの実施形態では、２’位でアルコキシドを形成することができない変更を導入することが望ましい場合がある。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、へテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、（Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ）；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）、およびアミノアルコキシ、（Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン、（例えば、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含むオリゴヌクレオチドが、頑強なホスホロチオアート修飾で修飾されているオリゴヌクレオチドに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち、部分的にｄｓ ＲＮＡの突出部分に特に関連するデオキシリボース糖）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、へテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキルチオアルキル；チオアルコキシ；ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは、例えばアミノ官能基で随意に置換されていてもよい）を含む。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
糖基は、リボースに含まれている対応する炭素の立体化学配置とは反対の立体化学配置をもつ炭素を１つ以上含有する場合がある。従ってオリゴヌクレオチドは、例えばアラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含むことができる。モノマーは、糖の１’位にアルファ結合を有していてもよく、例えばアルファ−ヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドは、Ｃ−１’の核酸塩基を欠損した「脱塩基」糖を含むこともできる。これらの脱塩基糖は、構成糖原子の１つ以上に、さらに修飾を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、Ｌ型の糖、例えばＬ−ヌクレオシドを１つ以上含むことができる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’および５’末端を修飾することができる。そのような修飾を、分子の３’末端、５’末端、または両端に行うことができる。それらには、末端ホスフェート全体を、またはリン酸基の原子のうちの１つ以上を修飾することまたは置換することが含まれ得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’および５’両方の末端に、標識部分、例えば蛍光体（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３、またはＣｙ５染料）、または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、またはエステルに基づく）などの他の官能性分子実体を結合させることができる。官能性分子実体を、リン酸基および／またはリンカーを介して糖に結合させることができる。リンカーの末端原子を、リン酸基の結合原子、または糖のＣ−３’若しくはＣ−５’、Ｏ、Ｎ、Ｓ、若しくはＣ基の結合原子に接続するかまたは置換してもよい。あるいは、リンカーを、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続させるかまたは置換することができる。
リンカー／リン酸官能性分子実体−リンカー／リン酸配列が、ｄｓＲＮＡの２本の鎖の間に挿入されている場合、この配列は、ヘアピン型ＲＮＡ薬剤のヘアピンＲＮＡループの代用となることができる。
調節活性に有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’がリン酸化されているか、または５’末端にリン酸類似体を含む。５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ介在性遺伝子サイレンシングと適合するものが含まれる。適した修飾としては、５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオアート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオアート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄で置換されたモノホスフェート、ジホスフェート、およびトリホスフェート（例えば、５’−アルファ−チオトリホスフェート、５’−ガンマ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホルアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）のさらなる任意の組合せ、が挙げられる。
また、末端修飾は、分布を監視するのに有用な場合があり、そのような場合、付加するのに好ましい基には、蛍光色素分子、例えば、フルオルセイン、Ａｌｅｘａ色素、例えばＡｌｅｘａ４８８が含まれる。また、末端修飾は、取り込みの増強に有用な場合もあり、このための有用な修飾には、コレステロールが含まれる。また、末端修飾は、ＲＮＡ薬剤を別の部分に架橋するのに有用な場合もあり、このために有用な修飾には、マイトマイシンＣが含まれる。
核酸塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡの中に見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基を修飾または置換して、特性が向上したＲＮＡを提供することができる。これらの塩基、または合成および天然核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、またはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））、ならびに上記の修飾のいずれか１つを用いて、例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドを調製することができる。あるいは、上述の塩基のいずれかを置換した類似体または修飾した類似体、例えば、本明細書に記載されている「一般的ではない塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」、および「ユニバーサル塩基」を使用することができる。例としては、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノアリルウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられるが、これらには限定されない。さらなるプリンおよびピリミジンには、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されているもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ｐａｇｅｓ ８５８−８５９， Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ， Ｊ． Ｉ．， ｅｄ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９０で開示されているもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９１， ３０， ６１３で開示されているものが含まれる。
カチオン基
オリゴヌクレオチドの修飾には、１つ以上のカチオン基を、糖、塩基、および／またはリン酸または修飾したリン酸骨格部分のリン原子に結合させることが含まれ得る。カチオン基は、天然塩基、一般的ではない塩基、またはユニバーサル塩基の置換可能な任意の原子に結合させることができる。好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない、すなわち塩基対合に必要とされる水素結合相互作用を妨害しない位置である。カチオン基は、例えば、糖のＣ２’位、または環式または非環式糖代用物の類似した位置を介して結合させることができる。カチオン基には例えば、Ｏ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）に由来する、例えばプロトン化アミノ基；アミノアルコキシ、例えばＯ（ＣＨ２）ｎアミン）（例えば、アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）が含まれ得る。
オリゴヌクレオチド内での配置
いくつかの修飾は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの特定の位置に、例えば鎖の内部にまたはオリゴヌクレオチドの５’または３’末端に含まれていてもよい。好ましい位置のオリゴヌクレオチドの修飾は、薬剤に好ましい特性を付与し得る。例えば、好ましい位置の特定の修飾は、最適な遺伝子サイレンシング特性、またはエンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性の向上を付与することができる。
オリゴヌクレオチドに含まれる１つ以上のヌクレオチドは、２’−５’結合を有していてもよい。オリゴヌクレオチドに含まれる１つ以上のヌクレオチドは、逆の結合、例えば３’−３’、５’−５’、２’−２’、または２’−３’結合を有していてもよい。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド（この場合、ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）を、または末端５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−ウリジンは２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−シチジンが２’−修飾ヌクレオチドである）、または末端５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチド（この場合、５’−ウリジンが２’−修飾ヌクレオチドである）を少なくとも１つ含む。これらの修飾を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ活性に対して特に安定化される。
総合的な参考文献
オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成で合成することができる。例えば、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」、 Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｆ． Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１（特に、１章、Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２章、Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３章、２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ− ｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４章、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、５章、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、６章、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、および７章、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ）を参照のこと。他の特に有用な合成手順、試薬、保護基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ．， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４；Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ｉｙｅｒ， Ｒ． Ｐ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９２， ４８， ２２２３−２３１１、およびＢｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ｉｙｅｒ， Ｒ． Ｐ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９３， ４９， ６１２３−６１９４、またはこれらで引用されている文献に記載されている。国際公開第００／４４８９５号、国際公開第０１／７５１６４号、または国際公開第０２／４４３２１号に記載されている修飾を、本明細書で使用することができる。本明細書で列挙した全ての出版物、特許、および公開特許出願の開示は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
リン酸塩基に関する参考文献
ホスフィネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されている。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されている。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号に記載されている。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミダートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されている。３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、Ａｎ， Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２００１， ６６， ２７８９−２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８， ７，６５１およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９８９， ３０， ４６９３に記載されている。
糖基に関する参考文献
２’修飾に対する改変は、Ｖｅｒｍａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９８， ６７， ９９−１３４およびその中の文献全てに見出すことができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の文献に見出すことができる：２’−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， １９９３， ３６， ８３１−８４１）、２’−ＭＯＥ （Ｍａｒｔｉｎ， Ｐ． Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ １９９６， ７９， １９３０−１９３８）、「ＬＮＡ」（Ｗｅｎｇｅｌ， Ｊ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． １９９９， ３２， ３０１−３１０）。
リン酸基の置換に関する参考文献
本明細書ではＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンカルボニルアミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド−４結合のオリゴリボヌクレオシドとしても識別されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴリボヌクレオシド、ならびに例えばＭＭＩとＰＯまたはＰＳに交互に結合した混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ国際公開第９２／２０８２２号および国際公開第９２／２０８２３号として公開されている）に記載されているように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８８， １６， ４５８３に記載されている。カーボネート置換は、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ， Ｊ．Ｒ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃ １９７１， １９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、Ｅｄｇｅ， Ｍ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ １９７２， １９９１に記載されている。カルバメート置換は、Ｓｔｉｒｃｈａｋ， Ｅ．Ｐ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９８９， １７， ６１２９に記載されている。
リン酸−リボース骨格の置換に関する参考文献
シクロブチル糖代用化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号に記載されているように調製することができる。 ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，２３５，０３３号、ならびに他の関連特許開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、それ自身公知であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ （ＰＮＡ）： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ４， ５−２３に引用されている種々の手順のいずれかに従って調製することができる。それらは、米国特許第５，５３９，０８３号に従って調製することもできる。
末端修飾に関する参考文献
末端修飾は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２， １０３−１２８ （２００２）およびその文参考文献に記載されている。
核酸塩基に関する参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイト（Ｎ−２ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｄ ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｍｉｄｉｔｅ）は、米国特許第５，４５９，２５５号に記載されているように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号に記載されているように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号に記載されているように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号に記載されているように調製することができる。
リガンド
多種多様な実体を、オリゴヌクレオチドや脂質に結合させることができる。好ましい部分はリガンドであり、リガンドは、好ましくは共有結合で、直接的にまたは介在的テザーを介して間接的に結合されている。
好ましい実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる分子の分布、標的指向性、または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞若しくは細胞型、区画、例えば細胞若しくは器官区画、組織、器官、または身体の領域に対する親和性を高める。選択した標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的指向性リガンドとも呼ばれる。脂質に結合させるための好ましいリガンドは、標的指向性リガンドである。
リガンドのいくつかは、エンドソームの特徴を有している場合がある。エンドソーム性リガンドは、エンドソームの溶解、および／または組成物若しくはその成分をエンドソームから細胞の細胞質に輸送することを促進する。エンドソーム性リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および膜融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であることができる。ある特定の実施形態では、エンドソーム性リガンドは、エンドソームのｐＨで、活性をもつ立体構造をとると推定される。「活性をもつ」立体構造とは、エンドソーム性リガンドが、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物若しくはその成分をエンドソームから細胞の細胞質に輸送することを促進する立体構造である。エンドソーム性リガンドの説明のための例としては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８７， ２６： ２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９６， １１８： １５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２００２， １５５９： ５６−６８）が挙げられる。ある特定の実施形態では、エンドソーム性の成分は、ｐＨの変化に応じて電荷の変化またはプロトン化の変化を受ける化学基（例えば、アミノ酸）を含むことができる。エンドソーム性成分は、直鎖であっても、または分岐していてもよい。ペプチドを利用したエンドソーム性リガンドの例となる一次配列を表３に示す。
表３．エンドソーム性活性を有するペプチドの一覧
Figure 2018090826
 ｎ；ノルロイシン
参考文献
Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８７， ２６： ２９６４ ２９７２．
Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９９６， １１８： １５８１-１５８６
Ｔｕｒｋ， Ｍ． Ｊ．， Ｒｅｄｄｙ， Ｊ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ-ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｏｌａｔｅ-ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １５５９， ５６-６８．
Ｐｌａｎｋ， Ｃ． Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ， Ｂ． Ｍｅｃｈｔｌｅｒ， Ｋ． Ｋｏｃｈ， Ｃ． Ｗａｇｎｅｒ， Ｅ． （１９９４）． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍｅ-ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖｉｒｕｓ-ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９ １２９１８-１２９２４．
Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ， Ｅ．， Ｋｏｎｉｎｇ， Ｇ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００２）． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｄｏｓｏｍｅ-ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ-ｅｎｔｒａｐｐｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ２７１３５-４３．
Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ， Ｂ．， Ｐｌａｎｋ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｘｉｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ ｐＨ-ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｉｒａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｄｅｌｉｖ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒ． ２４７-６６．
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上することができ、その結果生じる天然の若しくは修飾されたオリゴリボヌクレオチド、或いは本明細書に記載されているモノマーおよび／または天然の若しくは修飾されたリボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上することもできる。
リガンドは、一般的に、例えば取り込みを高めるための治療用修飾因子；例えば分布を監視するための診断用化合物またはリポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性付与部分を含むことができる。全般的な例としては、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドには天然に生じる物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、または脂質などが含まれ得る。また、リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）などの組換えまたは合成分子であることができる。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリエド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドコポリマー、またはポリホスファジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはアルファヘリックスペプチドが含まれる。
リガンドはまた、標的指向性の基、例えば細胞または組織を標的とする薬剤、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質、またはタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、を含み得る。標的指向性の基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価性ラクトース、多価性ガラクトース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）多価性マンノース、多価性フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価性ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸エステル、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであることができる。標的指向性リガンドおよびそれらの関連する受容体のいくつかの例を表４に示す。
表４．標的指向性リガンドとそれに関連する受容体
Figure 2018090826
リガンドの他の例には、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子（例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル置換アルキル、放射性同位体標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状分子のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが含まれる。
リガンドは、タンパク質（例えば糖タンパク質）、またはペプチド（例えば共リガンドに対する特異的な親和性を有する分子）、または抗体（例えば癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体）であることができる。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。また、それらには非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価性ラクトース、多価性ガラクトース、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価性マンノース、多価性フコース、またはアプタマーなどが含むことができる。リガンドは例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であることができる。
リガンドは、例えば、ｉＲＮＡ薬剤の細胞への取り込みを、細胞の細胞骨格、例えば、細胞の微小管、微小繊維、および／または中間径フィラメントを破壊することによって増加させることができる物質、例えば薬物であることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であることができる。
例えば、リガンドは、炎症反応を活性化することにより、ｉＲＮＡ薬剤の細胞への取り込みを増加させることができる。そのような効果を有するだろう例となるリガンドには、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａｌｐｈａ）、インターロイキン−１ベータ、またはガンマインターフェロンが含まれる。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質に基づく分子である。そのような脂質または脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、複合体が、標的組織、例えば体内の非腎臓標的組織に分布することを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であることができる。ＨＳＡに結合することができる他の分子をリガンドとして使用することもできる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質に基づくリガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を高めることができ、（ｂ）標的細胞または細胞膜に対する標的指向性および輸送を向上させることができ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
脂質に基づくリガンドは、複合体の標的組織への結合を調節、例えば制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質に基づくリガンドが腎臓を標的とする可能性は高くないため、体内から除去される可能性も高くないだろう。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質に基づくリガンドは、複合体の腎臓標的化に使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質に基づくリガンドは、複合体が好ましくは腎臓ではない組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合を逆戻りさせることができないほどは強くないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、ＨＳＡに対して弱く結合するかまたは全く結合せず、そのため複合体は、好ましくは腎臓に分布するだろう。腎臓細胞を標的とする他の部分も、脂質に基づくリガンドの代わりにまたはそれに加えて使用することができる。
別の実施形態では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性のまたは非悪性型の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えば癌細胞を治療するのに特に有用である。代表的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが含まれる。他のビタミンの例としては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞により取り込まれる他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は両親媒性である。代表的な薬剤には、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドがある。薬剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物質、逆転異性体、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用などの修飾を施すことができる。好ましくは、ヘリックス型作用剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス作用剤である。
リガンドは、ペプチドであってもまたはペプチド模倣物であることができる。ペプチド模倣物（本明細書ではオリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然のペプチドと同様の、決まった三次元構造に折り畳むことが可能な分子である。ペプチドまたはペプチド模倣部分のアミノ酸の長さは約５〜５０個、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個の長さのアミノ酸であることができる（例えば表５を参照のこと）。
表５．細胞透過性ペプチドの例
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ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主としてＴｙｒ、Ｔｒｐ、またはＰｈｅで構成される）であることができる。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束性ペプチド、または架橋ペプチドであることができる。別の選択肢では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことができる。疎水性ＭＴＳ含有ペプチドの具体例には、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号５７）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号５８））も、標的指向性部分となり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大型極性分子を、細胞膜を越えて運搬することができる「送達」ペプチドであることができる。例えば、ＨＩＶのＴａｔタンパク質に由来する配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５９））およびショウジョウバエアンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）タンパク質に由来する配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６０））は、送達ペプチドとして機能可能であることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣物は、ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ−１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によりコードされていてもよい（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３５４：８２−８４， １９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位によりｉＲＮＡ作用剤にテザーされたペプチドまたはペプチド模倣物は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などの細胞標的指向性ペプチドである。ペプチド部分は、約５個のアミノ酸〜約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性または直接的な立体構造特性を増加させるなどの、構造修飾を有していてもよい。以下に記載する構造修飾のいずれを使用してもよい。
ＲＧＤペプチド部分は、腫瘍細胞、例えば内皮系腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６２：５１３９−４３， ２００２）。ＲＧＤペプチドによって、ｉＲＮＡ薬剤の、肺、腎臓、脾臓、または肝臓などの様々な他の組織の腫瘍への標的化を容易にすることができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７， ２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドによって、腎臓に対するｉＲＮＡ薬剤の標的化が容易になる。ＲＧＤペプチドは、直鎖であってもまたは環状であってもよく、修飾されていてもよく、例えば、特定の組織に対する標的化を容易にするためにグリコシル化またはメチル化されていてもよい。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドを使用することで、αＶβ３を発現している腫瘍細胞にｉＲＮＡ薬剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．， ４２：３２６−３３６， ２００１）。
増殖細胞に富化されているマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤを含むペプチドやペプチド模倣物は、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを発現している細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含有するＲＧＤペプチド、ならびに合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、αｖβ３インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般的に、そのようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。この型のリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば本明細書に記載の癌遺伝子を標的とする。
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば細菌細胞や真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を貫通することが可能である。微生物細胞を透過するペプチドの例としては、α−ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７またはセクロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシン、またはバクテネシン）、または１種若しくは２種のアミノ酸のみを主に含むペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であることができる。細胞透過性ペプチドは、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む場合もある。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来するＭＰＧなどの、二分両親媒性ペプチドであることができる（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４， ２００３）。
一実施形態では、ｉＲＮＡ薬剤および／または担体オリゴマーにテザーされた標的指向性ペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであることができる。両親媒性α−ヘリックスペプチドの典型的な例としては、セクロピン、リコトキシン、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブホリン、ＣＰＦ、ボンビニン−様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン、Ｓ．クラバ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎｅ）、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、およびカエリンが挙げられるが、これらには限定されない。好ましくは、多くの要因が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされるだろう。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えば、ｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）が使用され、ヘリックス不安定化残基（例えば、プロリン、または環状モノマー単位）は最小数しか使用されない。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは典型的なＮ−キャッピング残基であり、および／またはＣ末端をアミド化してＨ−結合を追加し、ヘリックスを安定させることができる）。ｉ±３またはｉ±４の位置で隔てられている反対の電荷を有する残基間に塩橋を形成することにより、安定化することができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、またはヒスチジンなどのカチオン残基は、アニオン残基であるグルタメートまたはアスパルテートと塩橋を形成することができる。
ペプチドおよびペプチド模倣リガンドには、天然に存在するペプチドまたは修飾されているペプチド、例えば、ＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上のアミドを有するペプチド、すなわちペプチド結合が１つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換されているペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが含まれる。
標的指向性リガンドは、特定の受容体を標的とすることができる、いかなるリガンドでもあることができる。例としては、葉酸エステル、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖クラスター（例えばＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター）、またはアプタマーである。クラスターは、複数の糖単位の組合せである。標的指向性リガンドには、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬおよびＨＤＬリガンドも含まれる。また、リガンドは、核酸、例えばアプタマーに基づくものであることができる。アプタマーは、修飾されていなくてもよく、または本明細書に開示されている修飾を任意の組合せで有していてもよい。
エンドソーム放出剤には、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカルボン酸、ポリカチオン、遮蔽したオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、遮蔽したまたは遮蔽していないカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、遮蔽したまたは遮蔽していないカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが含まれる。
ＰＫ調節因子は、薬物動態調節因子を表す。ＰＫ調節因子には、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが含まれる。例となるＰＫモジュレーターには、限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが含まれる。多数のホスホロチオアート結合を含むオリゴヌクレオチドが血清タンパク質に結合することも分かっているため、骨格に複数のホスホロチオアート結合を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドもリガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）適用可能である。
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして適用可能である。
適用可能な他のリガンドは、米国特許出願第２００５／０１０７３２５号、同第２００５／０１６４２３５号、および同第２００８−０２５５３４５号、ならびに米国特許第７，０２１，３９４号および同第７，６２６，０１４号に記載されており、これらはそれぞれ、その全体が参照することにより組み入れられる。
複数のリガンドが含まれている場合、リガンドは、全てが同じ特性を有していてもよく、全てが異なる特性を有していてもよく、またはいくつかが同じ特性を有し、その一方で他のリガンドは異なる特性を有していてもよい。例えば、リガンドは、標的指向特性を有していてもよく、エンドソーム的活性を有していてもよく、またはＰＫ調節特性を有していてもよい。好ましい実施形態では、リガンドは全て、異なる特性を有する。
リガンドを、オリゴヌクレオチドの様々な位置に、例えば３’−末端、５’−末端、および／または内部に、結合させることができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介入性テザーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。伸長しつつある鎖にモノマーが組み込まれる場合、リガンドまたはテザーを介して結合しているリガンドが前記モノマーに存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体」モノマーが伸長しつつある鎖に組み込まれた後にリガンドを前記「前駆体」モノマーに結合することによって、リガンドを組み込むことができる。例えば、末端がアミノである（すなわち、リガンドが結合されていない）テザー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２、を有するモノマーを、伸長しつつあるセンスまたはアンチセンス鎖に組み込むことができる。その後の作業で、すなわち前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、求電子基（例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）をもつリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基を結合させることによって、前駆体モノマーに結合させることができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方または両方の鎖に結合させることができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ薬剤は、センス鎖に結合されたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ薬剤は、アンチセンス鎖に結合されたリガンドを含有する。
いくつかの実施形態では、リガンドを、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合に結合させることができる。核酸塩基であるプリンまたはその誘導体の環内および環外原子を含む任意の位置で、リガンドを結合させることができる。いくつかの実施形態では、プリン核酸塩基の２、６、７、または８位に結合部分を結合させる。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体の任意の位置に、リガンドを結合させることができる。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２、５、および６位を、結合部分で置換することができる。ヌクレオシドの糖部分の任意の炭素原子に結合させることができる。結合部分に結合させることができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’の炭素原子がある。脱塩基残基などの１’位も、結合部分に結合させることができる。ヌクレオシド間結合も、結合部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオタート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、およびホスホロアミデートなど）の場合、結合部分は、リン原子に直接結合させることができるか、或いはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合させることができる。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、結合部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合させることができる。
オリゴマー化合物の複合体を調製するための多数の方法が存在する。一般的に、オリゴマー化合物の反応基（例えば、ＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、およびアルデヒドなど）を結合部分の反応基と接触させることによって、オリゴマー化合物を結合部分に結合させる。いくつかの実施形態では、反応基の一方は求電子性であり、他方は求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能基であることができ、求核基は、アミンまたはチオールであることができる。核酸と、結合基を用い、および結合基を用いない関連オリゴマー化合物とを結合させるための方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ， ｅｄｓ．， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．， １９９３，１７章などの文献に詳細に記載されており、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
オリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許としては、それぞれ、その全体が参照することにより組み入れられる、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７，５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，１４９，７８２号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号；同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号；同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，６８８，９４１号；同第５，７１４，１６６号；同第６，１５３，７３７号；同第６，１７２，２０８号；同第６，３００，３１９号；同第６，３３５，４３４号；同第６，３３５，４３７号；同第６，３９５，４３７号；同第６，４４４，８０６号；同第６，４８６，３０８号；同第６，５２５，０３１号；同第６，５２８，６３１号；および同第６，５５９，２７９号が挙げられるが、これらには限定されない。
核酸−脂質粒子の特徴
核酸が脂質層の内部に封入されている脂質に封入された核酸粒子を生成するための方法および組成物を提供する。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み込んでいるそのような核酸−脂質粒子は、（１）薬物対脂質比、（２）封入化効率、および（３）粒径などの様々な生物物理学的パラメーターを使用して特徴付けられる。高い薬物対脂質比、高い封入効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに制御可能な粒径、一般的に直径は２００ｎｍ未満、が望ましい。加えて、核酸ポリマーの性質は重要である。なぜならば、ヌクレアーゼ耐性を付与するための核酸修飾は、多くの場合、限定的な耐性を提供するに過ぎないものの、治療の費用を増大させるためである。別段の記載がない限り、これらの基準は、本明細書では以下のように計算される。
核酸対脂質比は、決められた量の調製物に含まれている核酸の量を、同じ量に含まれる脂質の量で除算したものである。これは、１モル当たりのモル数、または１重量当たりの重量、または１モルあたりの重量に基づいていてもよい。最終的なそのまま投与できる剤形の場合、核酸対脂質比は、透析、クロマトグラフィー、および／または酵素（例えばヌクレアーゼ）消化を使用して、外部核酸をできるだけ多く除去した後で計算される。
封入効率とは、開始混合物の薬物対脂質比を、最終的な投与適格製剤の薬物対脂質比で除算したものを指す。これは相対的効率の尺度である。絶対的効率の尺度のために、最終的には投与適格製剤となる開始混合物に添加される核酸の総量を計算することもできる。製剤過程で失われた脂質量を計算することもできる。効率は、製剤の損失および費用の尺度である。
サイズは、形成された粒子のサイズ（直径）を示す。粒度分布は、Ｎｉｃｏｍｐ社製３７０型サブマイクロメートル粒径測定器で準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を使用して決定することができる。新生物および炎症部位などの血管新生化組織（漏出性の）組織に分布させるためには、２００ｎｍ未満の粒子が好ましい。
医薬組成物
脂質粒子は、特に治療薬と結合している場合には医薬組成物として、例えば、投与経路および標準的薬務に従って選択される、生理食塩水またはリン酸緩衝液などの薬剤的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体をさらに含む医薬組成物として製剤化することができる。
特定の実施形態では、本発明の脂質−核酸粒子を含む医薬組成物は、標準的な方法によって調製され、薬剤的に許容される担体をさらに含む。一般的には、通常の生理食塩水が、薬剤的に許容される担体として使用される。他の好適な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの、安定性の増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝化水、０．９％生理食塩水、および０．３％グリシンなどが含まれる。生理食塩水または他の塩含有担体を含む組成物では、担体は、好ましくは脂質粒子を形成した後に添加される。従って、脂質−核酸組成物を形成した後に、通常の生理食塩水などの薬剤的に許容される担体で組成物を希釈することができる。
その結果生じる医薬品は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができる。その後、水溶液を使用用に包装するかまたは無菌条件下でろ過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌水溶液と混合される。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤ならびに浸透圧調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの、生理学的条件を近似するために必要とされる薬剤的に許容される補助物質を含有していてもよい。加えて、脂質懸濁液は、保管時にフリーラジカルおよび脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含むことができる。α−トコフェロール、およびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤などの親油性フリーラジカル失活剤が適している。
医薬製剤中の脂質粒子または脂質−核酸粒子の濃度は大きく異なり得、例えば、約０．０１％未満、通常は約０．０５〜５％または少なくとも約０．０５〜５％から１０〜３０重量％までであり、選択される特定の投与方法に従って、主として液量、粘性などに応じて選択される。例えば、濃度を増加させて、治療に伴う液体負荷を低下させることができる。これは、アテローム性動脈硬化に関連するうっ血性心不全または重篤な高血圧を有する患者に特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性脂質で構成された複合体を低濃度に希釈して、投与部位の炎症を軽減することができる。一群の実施形態では、核酸には標識が結合されており、診断（相補的核酸の存在を示すことによる）に使用されるだろう。この場合、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断する疾患状態、および臨床医の判断に依存することになるが、一般的に、体重１キログラム当たり約０．０１〜約５０ｍｇ、好ましくは体重１キログラム当たり約０．１〜約５ｍｇとなる。
脂質−治療薬組成物は、キットの形態でも提供される。キットは、典型的には、キットの種々の構成要素を収納するために区画化された容器で構成されるだろう。キットは、本発明の粒子または医薬組成物を、好ましくは脱水されたまたは濃縮形態で、それらの再水和または希釈および投与に関する説明書と共に含有するだろう。ある特定の実施形態では、粒子は活性物質を含むが、他の実施形態では、粒子は活性物質を含まない。
製造方法
記載の方法および組成物は、ある特定のカチオン性脂質が使用され、その合成、調製、および特徴付けは、例えば、以下の特許文献に記載されている：それぞれ２００９年１１月１０日出願の国際公開第２０１０／０５４４０１号、国際公開第２０１０／０５４４０１号、国際公開第２０１０／０５４４０５号、および国際公開第２０１０／０５４３８４号、ならびにこれらで言及されている出願、すなわち、第６１／１０４，２１９号、２００８年１０月９日出願；第６１／１１３，１７９号、２００８年１１月１０日出願；第６１／１５４，３５０号、２００９年２月２０出願；第６１／１７１，４３９号、２００９年４月２１日出願；第６１／１７５，７７０号、２００９年５月５日出願；第６１／１８５，４３８号、２００９年６月９日出願；第６１／２２５，８９８号、２００９年７月１５日出願；および第６１／２３４，０９８号、２００９年８月１４日出願；国際公開第２００９／０８６５５８号；および国際公開第２００８／０４２９７３号を含む。これらの書類はそれぞれ、参照することによりその全体が組み入れられる。例えば、２００９年１１月１０日出願の国際公開第２０１０／０５４４０１号の１６〜２１ページに記載されている表、第６１／２８７，９９５号の２８〜５３ページおよび１３５〜１４１ページに記載されている表１〜４および９を参照のこと。加えて、治療薬、例えば核酸に結合された脂質粒子を含む脂質粒子を調製する方法を記載する。本明細書に記載の方法では、脂質の混合物を、核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子に封入された核酸を含有する中間混合物を生成する。この場合、封入された核酸は、約３重量％〜約２５重量％、好ましくは５〜１５重量％の核酸／脂質比で存在する。随意で、中間混合物を大きさ別に分類し、脂質部分が、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの直径を有する単層膜リポソームである脂質−封入核酸粒子を取ることができる。その後、ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部を中和し、従って少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物が提供される。
上述のように、これらのカチオン性脂質のいくつかは、アミノ基のｐＫａ未満のｐＨで荷電され、アミノ基のｐＫａを超えたｐＨでは実質的に中性であるアミノ脂質である。これらのカチオン性脂質は、滴定可能なカチオン性脂質と名付けられており、二段階プロセスを使用した製剤化に使用することができる。まず、より低いｐＨで、滴定可能なカチオン性脂質や他の小胞成分を用い、核酸存在下で脂質小胞を形成することができる。このようにして、小胞は、核酸を封入し、捕捉するようになる。次に、培地のｐＨを滴定可能なカチオン性脂質が示すｐＫａを超えるレベルに、すなわち生理学的なｐＨ以上に上昇させることによって、新しく形成された小胞の表面電荷を中和することができる。このプロセスの特に有利な側面は、あらゆる表面吸着核酸が容易に除去されることと、その結果生じる中性表面を有する核酸送達媒体の両方が含まれる。リポソームまたは脂質粒子の表面を中性にすることによって、血流からの急速な排出を回避し、カチオンリポソーム製剤に伴う特定の毒性が回避されると期待される。このような、核酸−脂質粒子の処方における、そのような滴定可能なカチオン性脂質の使用に関するさらなる詳細は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号に提供されている。
さらに注目すべきは、このようにして形成された小胞は、核酸の含有量が高い、小胞の大きさが均一な製剤を供給することである。加えて、小胞のサイズは、約３０〜約１５０ｎｍ、より好ましくは約３０〜約９０ｎｍの範囲である。
任意の特定の理論により束縛されることを意図していないが、非常に効の率の良い核酸封入は、低いｐＨでの静電的相互作用の結果であると考えられる。酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）では、小胞表面は帯電し、静電的相互作用によって核酸の一部と結合する。外部の酸性緩衝液を、より中性の緩衝液（例えば、ｐＨ７．５）と交換すると、脂質粒子またはリポソームの表面が中和され、あらゆる外部核酸の除去が可能になる。製剤過程に関するより詳細な情報は、種々の出版物に提供されている（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号）。
上記を考慮して、脂質／核酸製剤の調製方法を説明する。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を、核酸の緩衝水溶液と混合して、核酸が封入された脂質粒子を含む中間混合物を生成する。この場合、封入された核酸は例えば、約１０重量％〜約２０重量％の核酸／脂質比で存在する。随意に、中間混合物を大きさ別に分類し、脂質部分の直径が、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは約４０〜９０ｎｍの単層膜小胞である脂質−封入核酸粒子を得ることができる。その後ｐＨを上昇させて、脂質−核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部を中和する。このようにして、少なくとも部分的に表面が中和された脂質−封入核酸組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも２つの脂質成分を含む。第１の脂質成分は、その脂質のｐＫａ未満のｐＨではカチオン性であり、そのｐＫａを超えるｐＨでは中性であるようなｐＫａを有する脂質の中から選択され、第２の脂質成分は、脂質−核酸粒子形成中の粒子凝集を防ぐ脂質の中から選択される。特定の実施形態では、アミノ脂質はカチオン性脂質である。
核酸−脂質粒子を調製する際、脂質混合物は、典型的には有機溶媒に溶かした脂質溶液である。次いで、この脂質混合物を乾燥して薄い膜状にするか、或いは凍結乾燥して粉末にし、その後、水性緩衝液で水和してリポソームを形成させる。あるいは、好ましい方法では、脂質混合物は、エタノールなどの水混和性アルコール中に可溶化することができ、このエタノール溶液を水性緩衝液に添加すると、自発的にリポソームが形成される。多くの実施形態では、アルコールは、市販されている形態で使用される。例えば、エタノールは、無水エタノール（１００％）または９５％エタノールとして使用することができ、残りは水である。この方法は、米国特許第５，９７６，５６７号により詳細に記載されている。
１つの例となる実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒に溶かした、カチオン性脂質、中性脂質（カチオン性脂質以外）、ステロール（例えば、コレステロール）、および凝集抑制脂質（例えば、式（Ｉ）の化合物、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ＤＭＡ）の混合物である。好ましい実施形態では、脂質混合物は、アルコール、より好ましくはエタノールに溶解した、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、および凝集抑制脂質から本質的になる。さらなる好ましい実施形態では、第１の溶液は、モル比が、約２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％の凝集抑制脂質の上述の脂質混合物からなる。またさらなる好ましい実施形態では、第１の溶液は、カチオン性脂質か、或いはカチオン性脂質、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、および凝集抑制脂質の混合物から本質的になり、より好ましくは、モル比は、カチオン性脂質、約２０〜６０％：ＤＳＰＣ、５〜２５％：Ｃｈｏｌ、２５〜５５％：凝集抑制脂質、０．５〜１５％である。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ４０／１０／４０／１０（モル％で、 カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、３５／１５／４０／１０（モル％で、 カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、または５２／１３／３０／５（モル％ で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／または凝集抑制脂質）である。このましい実施形態の別の群では、これらの組成物に含まれる中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換えられる。
脂質混合物を、核酸を含有し得る緩衝水溶液と混合する。緩衝水溶液は、典型的には、緩衝材が、脂質混合物中に含まれるプロトン化可能な脂質のｐＫａ未満のｐＨを有する溶液である。好適な緩衝剤の例には、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、およびＭＥＳが含まれる。特に好ましい緩衝液は、クエン酸緩衝液である。好ましい緩衝液では、封入される核酸の化学的性質に応じて、アニオンの範囲が１〜１０００ｍＭになり、緩衝液濃度の最適化は、充填レベルを高めるのに重要であり得る（例えば、米国特許第６，２８７，５９１号および米国特許第６，８５８，２２５号を参照のこと。これらはそれぞれ、その全体が参照することにより組み入れられる）。あるいは、塩化物または硫酸塩などでｐＨ５〜６に酸性にした純水が有用である場合がある。この場合、粒子を透析してエタノールを除去するか、ｐＨを増加させるか、または通常の生理食塩水などの薬剤的に許容される担体と混合した際に、粒子膜内外の浸透ポテンシャルの均衡を保つことになる５％グルコースまたは別の非イオン性溶質を添加することが好適である場合がある。緩衝液中の核酸の量は変化しうるが、通常、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬとなる。
脂質混合物および治療用核酸の緩衝水溶液を混合して、中間混合物を提供する。中間混合物は、典型的には、封入された核酸を有する脂質粒子の混合物である。加えて、中間混合物はさらに、負に帯電している核酸と、脂質粒子表面にあって、正に帯電している脂質とのイオン間力によって、脂質粒子（リポソームまたは脂質小胞）の表面に結合している、一部の核酸を含んでいる（アミノ脂質またはプロトン化可能な第１の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質のプロトン化可能な基のｐＫａより低いｐＨの緩衝液中では正に帯電する）。一群の好ましい実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、混合する際にそれぞれの溶液の量を調節し、得られるアルコールの含有量が、約２０容積％〜約４５容積％になるようする。混合物を混合する方法は、多様なプロセスのいずれかを含むことができ、生成される製剤の規模に依存することが多い。例えば、全量が約１０〜２０ｍＬ以下の場合、溶液を試験管内で混合し、ボルテックスミキサーを使用して一緒に撹拌することができる。大規模プロセスは、好適な生産規模のガラス器具中で実施することができる。
随意で、脂質混合物と治療薬（核酸）の緩衝水溶液を混合することによって生成した脂質を封入した治療薬（例えば、核酸）複合体を大きさ別に分類し、大きさの範囲を望ましいものにし、脂質の粒径分布を比較的狭くすることができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物は、直径の平均が約７０〜約２００ｎｍに、より好ましくは約９０〜約１３０ｎｍの大きさとなるようにされる。リポソームを所望のサイズするためのいくつかの技術が使用可能である。大きさを決定する１つの方法は、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている。水槽を使ったまたはプローブを使った超音波処理のいずれかを用いてリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、約０．０５マイクロメートル未満のサイズの小さな単層膜小胞（ＳＵＶ）にまで漸進的に大きさを小さくする。別の方法としては均質化があり、これは、大きなリポソームをより小さなものへと断片化するための剪断エネルギーに依存する。典型的な均質化手順では、予め設定した大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートル、のリポソームが観察されるまで、多重層膜小胞を標準的なエマルジョンホモジナイザーを再循環させる。どちらの方法でも、粒経分布は、従来のレーザー光線粒径決定法により監視することができる。本明細書の特定の方法の場合、小胞の大きさを均一にするために押出法が使用される。
細孔の小さいポリカーボネート膜または非対称性セラミック膜を通してリポソーム組成物を押出することにより、粒径分布は、比較的一定したものになる。通常、リポソーム複合体の粒径分布が望ましいものになるまで、複数回、懸濁液を膜に通すことを繰り返す。連続して、リポソームをより小さな細孔膜を通して押出して、リポソームサイズを段階的に小さくすることができる。いくつかの場合、形成される脂質−核酸組成物は、ある大きさにすることを全く行うことなく使用することができる。
特定の実施形態において方法は、脂質−核酸組成物の脂質部分の表面電荷の少なくともいくらかを中和するステップをさらに含む。表面電荷を少なくとも部分的に中和することによって封入されなかった核酸が脂質粒子表面から遊離し、従来技術を使用して、遊離した核酸を組成物から除去することができる。封入されず、表面に吸着している核酸は、好ましくは、緩衝液を交換することによって、得られた組成物から除去する。例えば、クエン酸緩衝液（約ｐＨ４．０、組成物の形成に使用される）をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ｐＨが約７．５のＨＢＳ）溶液に置換することにより、リポソーム表面の中和と核酸の表面からの放出がもたらされる。その後、放出された核酸は、標準的方法を使ったクロマトグラフィーで除去することができ、次いで、使用される脂質のｐＫａを超えるｐＨを有する緩衝液へと切替えることができる。
随意で、脂質小胞（すなわち、脂質粒子）を、水性緩衝液中での水和により形成し、上述の方法のいずれかを使用してある大きさとし、その後、核酸を添加することができる。上述のように、水性緩衝液のｐＨは、アミノ脂質のｐＫａより低いものであるべきである。その後、核酸溶液を、大きさが決定された、予め形成しておいたこれらの小胞に、添加することができる。そのような「予め形成しておいた」小胞への核酸の封入を可能にするために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含有しているべきである。エタノールの場合、約２０％（重量／重量）〜約４５％（重量／重量）の濃度で含まれるべきである。加えて、予め形成しておいた小胞および核酸の混合物を、水性緩衝液−エタノール混合物中で、脂質小胞の組成および核酸の性質に応じて約２５℃〜約５０℃の温度まで加温することが必要な場合がある。当業者であれば、脂質小胞中に所望するレベルの核酸を封入するための封入プロセスの最適化には、エタノール濃度や温度などの変数を操作することが必要であることは明白であろう。核酸封入化に好適な条件の例を、実施例において提供する。予め形成しておいた小胞内に核酸が封入されれば、外部のｐＨを上昇させて、表面電荷を少なくとも部分的に中和することができる。その後、封入されず、表面に吸着している核酸を、上述のように除去することができる。
使用方法
脂質粒子は、インビトロまたはインビボで、治療薬を細胞に送達するために使用することができる。特定の実施形態では、治療薬は核酸であり、それは核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達される。脂質粒子および関連する医薬組成物を使用する様々な方法に関する以下の記載は、核酸−脂質粒子に関する記載により例示されているが、これらの方法および組成物は、そのような治療から利益を得る可能性のある任意の疾患または障害を治療するための任意の治療薬の送達に容易に適合させることができると理解される。
ある特定の実施形態では、核酸を細胞に導入するための方法を説明する。細胞に導入するための好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が生じるのに十分な期間、粒子または組成物を細胞と接触させることにより実施することができる。
組成物は、ほとんど全ての型の細胞に吸着することができる。一旦吸着すると、核酸−脂質粒子は、細胞のある部分によってエンドシトーシスされるか、脂質を細胞膜と交換するか、または細胞と融合するかのいずれかとなり得る。複合体の核酸部分の移行または取り込みは、これらの経路のいずれか１つを介して生じる場合がある。限定することを意図してはいないが、粒子がエンドサイトーシスを介して細胞に取り込まれる場合、その後、粒子はエンドソーム膜と相互作用し、恐らくは非二重層膜相を形成することでエンドソーム膜を不安定にして、封入された核酸を細胞質内へ導入すると考えられる。同様に、粒子が細胞原形質膜と直接融合する場合、融合が生じると、リポソーム膜が細胞膜に統合され、リポソームの内容物は細胞内液と混ざる。細胞と脂質−核酸組成物との接触は、インビトロで実施される場合、生物学的に適合する培地中で生じるだろう。組成物の濃度は、特定の用途に応じて大きく異なり得るが、一般的に約１マイクロモル〜約１０ミリモルである。ある特定の実施形態では、脂質−核酸組成物による細胞の処理は、一般的に、生理学的な温度（約３７℃）で、約１〜２４時間の間、好ましくは約２〜８時間実施されるだろう。インビトロ用途の場合、培養されている任意の細胞に対して核酸を送達することができ、細胞は、植物由来または動物由来であり得、脊椎動物または無脊髄動物由来り得、あらゆる組織または型であることができる。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
一群の実施形態では、脂質−核酸粒子懸濁液を、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは約２×１０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する、６０〜８０％コンフルエントのプレーティングされた細胞に添加する。細胞に添加する懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜２０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬである。
別の実施形態では、本発明の脂質粒子は、細胞または細胞系（例えば、腫瘍細胞系）に核酸を送達するために使用することができる。そのような細胞系の非限定的な例としては、ＨＥＬＡ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−２）、ＫＢ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−１７）、ＨＥＰ３Ｂ（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＢ−８０６４）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−７７）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−２４７）、ＨＴ−２９（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−３８）、ＰＣ−３（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＲＬ−１４３５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ−１８５）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣカタログ番号：ＨＴＢ−２６）が挙げられる。
典型的な用途には、ｓｉＲＮＡを細胞内送達するための周知の手順を使用して、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングさせることが含まれる。あるいは、用途には、治療上有用なポリペプチドをコードしているＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達が含まれる。このようにして、欠損または消失している遺伝子産物を供給することで、遺伝病の治療を提供する（すなわち、デュシェンヌ型ジストロフィーについては、Ｋｕｎｋｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ４５（３）：６３０−６４３ （１９８９）を参照、および嚢胞性線維症については、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：１０２−１０３ （１９８９）を参照）。組成物の他の使用には、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入が含まれる（Ｂｅｎｎｅｔｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍ． ４１：１０２３−１０３３ （１９９２）を参照のこと）。
あるいは、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を使用して、インビボで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達に関しては、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を使用した、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達が、参照することにより本明細書に組み入れられるＺｈｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１ （１９９３）に記載されている。参照することにより本明細書に組み入れられるＨｙｄｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６ （１９９３）は、リポソームを使用した、マウスの肺気道上皮および肺胞への嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達を記載している。参照することにより本明細書に組み入れられるＢｒｉｇｈａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８−２８１ （１９８９）には、細胞内酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウス肺のインビボでの形質導入が記載されている。従って組成物は、感染症の治療に使用することができる。
インビボ投与の場合、医薬組成物は、好ましくは非経口的に、すなわち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内にまたは腹腔内に投与される。一例として、Ｓｔａｄｌｅｒらの米国特許第５，２８６，６３４号（参照することにより本明細書に組み入れられる）を参照のこと。細胞内核酸送達に関しては、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． １０１：５１２−５２７ （１９８３）；Ｍａｎｎｉｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０ （１９８８）；Ｎｉｃｏｌａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． ６：２３９−２７１ （１９８９）、およびＢｅｈｒ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２６：２７４−２７８ （１９９３）でも論じられている。脂質を利用した治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、Ｒａｈｍａｎら、米国特許第３，９９３，７５４号；Ｓｅａｒｓ、米国特許第４，１４５，４１０号；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，２３５，８７１号；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、米国特許第４，２２４，１７９号；Ｌｅｎｋら、米国特許第４，５２２，８０３号；およびＦｏｕｎｔａｉｎら、米国特許第４，５８８，５７８号に記載されている。
他の方法では、製剤を組織に直接使用することで、医薬品を標的組織と接触させてもよい。適用は、局所的、「開放」、または「閉鎖」術式でなされてもよい。「局所的」とは、皮膚、口腔咽頭、および外耳道などの環境に曝されている組織に、医薬品を直接的に適用することを意味する。「開放」術式は、患者の皮膚を切開し、医薬品を適用する下層組織を直接視覚化することを含む術式である。これには、一般的に、肺に接近する開胸術、腹部臓器に接近する腹式開腹術、または標的組織への他の直接的な外科的接近などの外科手術により達成される。「閉鎖」術式は、内部標的組織は直接視覚化されないが、皮膚の小さな創傷を通して器具を挿入することにより接近する侵襲的な術式である。例えば、針洗浄で、製剤を腹膜に投与することができる。同様に、脊髄麻酔またはメトラザミド（ｍｅｔｒａｚａｍｉｄｅ）を使った画像診断のために一般的に行われているように、腰椎穿刺し、その後適切な体位をとっている間に、医薬品を、髄膜または脊髄に投与することもできる。あるいは、内視鏡検査装置を介して製剤を投与してもよい。
脂質−核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルで（Ｂｒｉｇｈａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｓｃｉ． ２９８（４）：２７８−２８１ （１９８９）を参照）、または疾患部位への直接注射により（Ｃｕｌｖｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ， Ｉｎｃ．， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． ｐｐ．７０−７１ （１９９４））投与することもできる。
方法は、様々な宿主で実施することができる。好ましい宿主には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、およびヒツジなどの哺乳動物種が含まれる。
脂質−治療薬粒子の用量は、脂質に対する治療薬の比率、および患者の年齢、体重、状態に基づく投薬医師の見解に依存するだろう。
一実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を説明する。これらの方法は、一般的に、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節可能な核酸に結合している本発明の脂質粒子と細胞とを接触させることを含む。本明細書で使用する場合、「調節する」という用語は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変化させることを指す。異なる実施形態においては、調節とは、増加または増強を意味していてもよく、または減少若しくは低減を意味していてもよい。標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、当該分野において公知および使用可能であり、それらには、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および免疫組織化学的技術を使用する方法が含まれる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルは、適切な対照値と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または５０％を超えて上昇または低下する。
例えば、ポリペプチド発現の上昇させることが望ましい場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよい。他方で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現を低下させることが望まれる場合、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、それによって標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡであってもよい。あるいは、核酸は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡを発現するプラスミドであってもよい。
特定の一実施形態では、細胞によってポリペプチドの発現を調節する方法は、カチオン粒子、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、および凝集抑制脂質からなるまたは本質的にからなる、例えば、モル比が、カチオン性脂質、約２０〜６０％：融合促進脂質、０．１〜５０％、：ＤＳＰＣ、５〜２５％：Ｃｈｏｌ、２５〜５５％：凝集抑制脂質、０．５〜１５％：からなるまたは本質的にからなる脂質粒子を細胞に提供することを含む。ここで脂質粒子は、該ポリペプチドの発現を調節することが可能な核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、０．１〜５０％の融合促進脂質であり、残りの成分は、およそ４０／１０／４０／１０（モル％ カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、３５／１５／４０／１０（モル％ で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、または５２／１３／３０／５（モル％ で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）の相対的脂質モル比で存在する。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置換される。
特定の実施形態では、治療薬は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合し、そのためポリペプチドの発現が低減されるポリヌクレオチドまたはその相補体を含む。
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチドまたはその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドであり、ポリペプチドまたはその機能的変異体若しくは断片の発現が上昇する。
関連実施形態では、本発明は、対象でのポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、対象に医薬組成物を提供することを含み、ここで治療薬は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖と特異的に結合するポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、および凝集抑制脂質を１つ以上含む混合物からなるかまたは本質的にそれらからなる脂質粒子、例えば、モル比で、カチオン性脂質約２０〜６０％：ＤＳＰＣ５〜２５％：Ｃｈｏｌ２５〜５５％：凝集抑制脂質０．５〜１５％の脂質粒子を含み、ここで脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ４０／１０／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、３５／１５／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、または５２／１３／３０／５（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）である。別の群の実施形態では、これら組成物中の中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換えられている。
別の関連実施形態では、対象でのポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法は、対象に医薬組成物を提供することを含み、ここで治療薬は、ポリペプチドまたはその機能的変異体若しくは断片をコードしているプラスミドである。
一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、および凝集抑制脂質を１つ以上含む混合物からなるかまたは本質的にそれらからなる脂質粒子、例えば、モル比が、カチオン性脂質約２０〜６０％：融合促進脂質０．１〜５０％：ＤＳＰＣ５〜２５％：Ｃｈｏｌ２５〜５５％：凝集抑制脂質０．５〜１５％である脂質粒子を含み、ここで脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、０．１〜５０％の融合促進脂質であり、残りの成分は、およそ４０／１０／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、３５／１５／４０／１０（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）、または５２／１３／３０／５（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）の相対的脂質モル比で存在する。別の群の実施形態では、これらの組成物に含まれる中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換えられている。
対象の免疫応答を誘導する方法は、対象に医薬組成物を提供することを含む場合があり、ここで治療薬は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、免疫応答は、体液性または粘膜性免疫応答である。一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、および凝集抑制脂質を１つ以上含む混合物からなるかまたは本質的にそれらからなる脂質粒子、例えば、モル比が、約２０〜６０％のカチオン性脂質：０．１〜５０％の融合促進脂質：５〜２５％のＤＳＰＣ：２５〜５５％のＣｈｏｌ：０．５〜１５％の凝集抑制脂質の脂質粒子を含み、ここで脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、融合促進脂質の脂質モル比が０．１〜５０％であり、その他の成分は、およそ４０／１０／４０／１０、３５／１５／４０／１０、または５２／１３／３０／５の相対的な脂質モル比で（モル％で、カチオン性脂質／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／凝集抑制脂質）含まれる。別の群の実施形態では、これらの組成物に含まれる中性脂質は、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭで置き換えられる。
さらなる実施形態では、医薬組成物は、ワクチンまたは抗原と組み合わせて対象に提供される。従ってワクチンは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含む脂質粒子を含むことができ、かつ、その抗原に免疫応答が望まれる抗原と結合している。特定の実施形態では、抗原は腫瘍抗原であるか、または感染体、例えばウイルス、細菌、または寄生虫などに関連するものである。
様々な腫瘍抗原、感染体抗原、および他の疾患に関連する抗原は、当該分野で良く知られており、これらの例は、本明細書で引用した文献に記載されている。好適な抗原の例には、限定されないが、ポリペプチド抗原およびＤＮＡ抗原が含まれる。抗原の具体例としては、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽菌、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、および風疹抗原が挙げられる。好ましい実施形態では、抗原はＢ型肝炎の組換え抗原である。他の態様では、抗原はＡ型肝炎の組換え抗原である。別の態様では、抗原は腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例としては、ＭＵＣ−１、ＥＢＶ抗原、およびバーキットリンパ腫関連抗原がある。さらなる実施形態では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原の組換え抗原である。当業者であれば、使用するのに適した他の抗原が分かるだろう。
使用するのに好適な腫瘍関連抗原には突然変異分子および非突然変異分子の両方が含まれ、これらの分子は、単一の腫瘍型を示す場合、複数の型の腫瘍に共有されている場合、および／または正常な細胞と比較して主に腫瘍細胞で発現または過剰表現している場合がある。タンパク質および糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、およびムチンの腫瘍特異的な発現パターンも確認されている。本主題癌ワクチンに使用するための例となる腫瘍関連抗原には、腫瘍細胞に特有な突然変異または再編成を有する癌遺伝子、癌抑制遺伝子、および他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的（しかし、腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、および多数の他の自己タンパク質が含まれる。
腫瘍関連抗原の具体的な実施形態としては、例えば、Ｒａｓ ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３、およびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、およびベータカテニンのタンパク質産物などの突然変異抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２、およびＫＳＡなどの過剰発現抗原、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）などの腫瘍胎児性抗原；Ｍａｒｔ １／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、およびＴＲＰ２などの癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびメラノサイト分化抗原などの自己抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１、およびＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、およびＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、およびＳＣＰ１などの他の癌精巣抗原などの再活性化胚遺伝子産物；Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２などのムチン；ＧＭ２、ＧＤ２、およびＧＤ３などのガングリオシド、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびｇｌｏｂｏ−Ｈなどの中性糖脂質および糖タンパク質；ならびにＴｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）、およびｓＴｎなどの糖タンパク質が挙げられる。また、全細胞溶解物および腫瘍細胞溶解物、ならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対して使用するための、Ｂリンパ球の単クローン増殖で提示される免疫グロブリンのイディオタイプも、本明細書に腫瘍関連抗原として含まれる。
病原体には、限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染因子、例えばウイルスが含まれる。感染性ウイルスの例には、限定されないが、以下のものが含まれる：レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、またはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；およびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株）；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロノウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、ＲＳウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；および分類不能なウイルス（例えば、海綿状脳症の原因菌、デルタ肝炎（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損付随体であると考えられる）の原因菌、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の原因菌（クラス1＝内部的に伝染；クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎））；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）。
また、グラム陰性菌およびグラム陽性菌は、脊椎動物の抗原として役立つ。そのようなグラム陽性菌には、限定されないが、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が含まれる。グラム陰性細菌には、限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が含まれる。感染性細菌の具体的な例には、限定されないが、以下のものが含まれる：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジュネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば、結核菌（Ｍ． ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．アビウム（Ｍ． ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ． ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ． ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ． ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群ストレプトコッカス属）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス属）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ビリダンス（ｖｉｒｉｄａｎｓ）群）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ）、ストレプトコッカス属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種）、エンテロコッカス種（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｕｅｎｚａｅ）、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｒａｃｉｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クロストリジウム・パーフリンガース（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス−モリニフオルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ・パリジウム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｌｉ）。
病原体のさらなる例には、限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染性真菌が含まれる。感染性真菌の例には、限定されないが、以下のものが含まれる：クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマーティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）。感染性寄生虫の例には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、および三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）などのマラリア原虫が含まれる。他の感染性生物（すなわち、原生生物）には、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
一実施形態では、本発明の製剤は、限定されないが、以下のものを含む標的遺伝子をサイレンシングまたは調節するために使用することができる：ＦＶＩＩ、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦベータ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、ベータ−カテニン遺伝子、ｃ−Ｍｅｔ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢ Ｉ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、ｐ５３ファミリーメンバーＤＮ−ｐ６３、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子、ｍＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子、ＥＷ／ＦＬＩ１融合遺伝子、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子、アルファｖ−インテグリン遺伝子、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要な遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス遺伝子、Ａ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｃ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｄ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｅ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｆ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｇ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス遺伝子、Ｈ型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、ＲＳウイルス遺伝子、ＲＳウイルス複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ＪＣウイルス遺伝子、ＪＣウイルス複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルス複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要な遺伝子、ダニ仲介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ仲介性脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス４０遺伝子、シミアンウイルス４０複製に必要な遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス遺伝子、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス複製に必要な遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス遺伝子、モロニー−マウス白血病ウイルス複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹（Ｖｅｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム遺伝子、プラスモジウム遺伝子複製に必要な遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス複製に必要な遺伝子、結核菌遺伝子、結核菌遺伝子に必要な遺伝子、癩菌遺伝子、癩菌複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌遺伝子、黄色ブドウ球菌複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、肺炎連鎖球菌複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ遺伝子、クラミジア・ニューモニエ複製に必要な遺伝子、肺炎ミコプラズマ遺伝子、肺炎ミコプラズマ複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、ＧＣＳＦ遺伝子、Ｇｒｏ１遺伝子、Ｇｒｏ２遺伝子、Ｇｒｏ３遺伝子、ＰＦ４遺伝子、ＭＩＧ遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、ＭＩＰ−１Ｉ遺伝子、ＭＩＰ−１Ｊ遺伝子、ＲＡＮＴＥＳ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子、ＭＣＰ−２遺伝子、ＭＣＰ−３遺伝子、ＣＭＢＫＲ１遺伝子、ＣＭＢＫＲ２遺伝子、ＣＭＢＫＲ３遺伝子、ＣＭＢＫＲ５ｖ、ＡＩＦ−１遺伝子、Ｉ−３０９遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、ＨＤ遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＳＣＡ１遺伝子、ＳＣＡ２遺伝子、ＭＪＤ１遺伝子、ＣＡＣＮＬ１Ａ４遺伝子、ＳＣＡ７遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＬＯＨ細胞に見出される対立遺伝子、または多形遺伝子のうちの１つの対立遺伝子。
定義
「アルキル」は、１〜２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐の非環状のまたは環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、およびｎ−ヘキシルなどが含まれ；飽和分岐アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびイソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環状アルキル基（「シクロアルキル」とも呼ばれる）には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどが含まれ；不飽和環状アルキル基には、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが含まれる。
「アルケニル」は、隣接した炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を含有する、上で定義されているようなアルキルを意味する。アルケニル基には、シスおよびトランス異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖および分岐アルケニル基には、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、および２，３−ジメチル−２−ブテニルなどが含まれる。
「アルキニル」は、隣接した炭素間に少なくとも１つの三重結合をさらに含有する、上で定義されているような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニル基には、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、および３−メチル−１ブチニルなどが含まれる。
「アシル」という用語は、水素、アルキル、部分的に飽和したまたは完全に飽和したシクロアルキル、部分的に飽和したまたは完全に飽和したヘテロ環、アリール、およびへテロアリールで置換されたカルボニル基を指す。例えば、アシル基には、（Ｃ１〜Ｃ２０）アルカノイル（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、ｔ−ブチルアセチルなど）、（Ｃ３〜Ｃ２０）シクロアルキルカルボニル（例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、ヘテロ環式カルボニル（例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド−２−オン−５−カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、テトラヒドロフラニルカルボニルなど）、アロイル（例えば、ベンゾイル）、およびヘテロアロイル（例えば、チオフェニル−２−カルボニル、チオフェニル−３−カルボニル、フラニル−２−カルボニル、フラニル−３−カルボニル、1Ｈ−ピロイル−２−カルボニル、1Ｈ−ピロイル−３−カルボニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル−２−カルボニルなど）などの基が含まれる。
「アリール」という用語は、芳香族単環式、二環式、または三環式炭化水素環系を指し、そこでは任意の環原子が置換されていてもよい。アリール部分の例には、限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルが含まれる。
「ヘテロ環」は、５〜８員の単環式、または７〜１２員の二環式、１１〜１４員のヘテロ環式環を意味し、これらは飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、かつ、単環式の場合には１〜３個のヘテロ原子を、二環式の場合には１〜６個のヘテロ原子を、三環式の場合には１〜９個のヘテロ原子を含む。これらのヘテロ原子は、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択され、窒素および硫黄ヘテロ原子は随意で酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は随意で四級化されていてもよい。ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合されていてもよい。ヘテロ環基は、以下で定義するヘテロアリール基を含む。「アルキルヘテロ環」という用語は、少なくとも１個の環原子が、アルキル、アルケニル、またはアルキニルで置換されているヘテロ環を指す。ヘテロ環には、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクトンバレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、およびテトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
「へテロアリール」という用語は、単環式の場合は１〜３個のヘテロ原子、二環式の場合は１〜６個のヘテロ原子、三環式の場合は１〜９個のヘテロ原子を有する芳香族５〜８員単環式、７〜１２員二環式、または１１〜１４員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば、炭素原子、および単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ１〜３、１〜６、または１〜９個のＮ，Ｏ、またはＳのヘテロ原子）、ここで任意の環原子が置換されていてもよい。本明細書に記載されているへテロアリール基は、共通の炭素間結合を共有する融合環を含有することもできる。「アルキルヘテロアリール」という用語は、環原子の少なくとも１つが、アルキル、アルケニル、またはアルキニルで置換されているへテロアリールを指す。
「置換された」という用語は、所与の構造の１つ以上の水素ラジカルが、指定された置換基のラジカルで置換されることを指す。指定された置換基のラジカルとしては、限定されないが、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ（ａｒａｌｋｏｘｙ）、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル（ａｒａｌｋｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、へテロアリール、ヘテロ環式、および脂肪族が挙げられる。置換基をさらに置換してもよいことに留意されたい。代表的な置換基には、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、および環状アミノ化合物が含まれる。
「ハロゲン」または「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
いくつかの実施形態では、方法が保護基の使用を必要とする場合がある。保護基の方法論は当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｇｒｅｅｎ， Ｔ． Ｗ． ｅｔ． ａｌ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ， １９９９を参照のこと）。簡単に説明すると、本発明の状況内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、官能基に付加されて、ある特定の反応中にその反応性を遮蔽し、その後取り除かれて元の官能基に戻すことができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、当該分野で周知の技術を使用して、付加および除去することができる。
化合物は、既知の有機合成技術によって調製することができる。
実施例１：ＰＥＧ脂質１およびＰＥＧ脂質１Ａの調製
Figure 2018090826
ＰＥＧ脂質１の調製
ステップ１：イコサン−１，２−ジオール（１０２）
Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（３．８ｇ、３３．２ｍｍｏｌ）、６５ｍＬのアセトン、１３ｍＬのＨ２Ｏおよび四酸化オスミウム（１．３ｍＬ、４ｗｔ％）の混合物に、イコサ−１−エン（１０１）（７．２ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を窒素下で添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮した。得られた残渣をジクロロメタン中に溶解し、飽和ＮａＨＳＯ３、ブラインで洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥した。溶媒の除去後、白色固体の、所望の化合物１０２を得た（７．４ｇ、９２％）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．２２−４．１２（ｍ、２Ｈ）、３．２３（ｍ、１Ｈ）、１．３７（ｍ、２Ｈ）、１．２４（ｍ、３２Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、３Ｈ）。
ステップ２：１−（（Ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）イコサン−２−オール（１０３）
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のイコサン−１，２−ジオール（１０２）（６．４ｇ、２０．３８ｍｍｏｌ）懸濁液に、イミダゾール（２．７ｇ、４０．７６ｍｍｏｌ）、その後ＴＢＳＣｌ（３．１ｇ、２０．３８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。混合物を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を分離し、水、ブラインで洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を蒸発させて粗成生物を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物１０３（４．７ｇ、５４％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．６１（ｄｄ、Ｊ＝１０．４、３．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．３７（ｄｄ、Ｊ＝１０．４、８．３Ｈｚ、１Ｈ）、２．４１（ｄ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、１．４０−１．２４（ｍ、３４Ｈ）、０．９−０．８４（ｍ、１２Ｈ）、０．０７（ｓ、６Ｈ）。
ステップ３：２−（オクタデシルオキシ）イコサン−１−オール（１０６）および１−（オクタデシルオキシ）イコサン−２−オール（１０６Ａ）
無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（８７０ｍｇ、２０．８６ｍｍｏｌ、油中６０％）撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中の化合物１０３（４．６８ｇ、１０．９３ｍｍｏｌ）溶液を、０〜５℃で、１時間に渡り添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を再び０℃まで冷却し、３０ｍｌのＤＭＦ中の臭化ステアリル（６．９２ｇ、２０．８６ｍｍｏｌ）を、１時間に渡り、滴下漏斗でゆっくりと添加した。添加完了後、反応混合物を、室温で２時間、および５５℃で１５時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を、飽和塩化アンモニウムで希釈した。水層を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒減圧下での溶媒の除去により、粗残渣を得、それを、ヘキサン中０〜５％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物およびＴＢＳ移動副産物（TBS migrated byproduct）（３．９ｇ）を含む混合物を単離した。
上述（３．９ｇ）の混合物をＴＨＦ（１００ｍＬ）中に溶解し、ＴＢＡＦ（２０ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。混合物を酢酸エチルで希釈し、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去後、白色固体を得た。その白色固体を酢酸エチル／ヘキサン（体積／体積＝１／２）と混合し、濾過して、白色固体の化合物１０６Ａ（６２９ｍｇ）を得た。濾液を２日間室温に保ち、析出した白色固体は、化合物１０６（４２０ｍｇ）であると特定された。
化合物１０６：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．６８−３．６１（ｍ、１Ｈ）、３．５３−３．３９（ｍ、３Ｈ）、３．３４−３．３０（ｍ、１Ｈ）、１．９３（ｄｄ、Ｊ＝７．４、４．９Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．３２−１．２０（ｍ、６４Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
化合物１０６Ａ：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．７７（ｍ、１Ｈ）、３．４７−３．３７（ｍ、３Ｈ）、３．２２（ｔ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、１Ｈ）、２．３０（ｄ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、１．５６（ｍ、２Ｈ）、１．４０（ｍ、２Ｈ）、１．３２−１．２３（ｍ、６２Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ４：（４−ニトロフェニル（２−（オクタデシルオキシ）イコシル）カルボネート（１０６Ｂ）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物１０６（０．４２ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、トリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９７ｍｍｏｌ）、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．１８ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加し、その後４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．４４ｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を何度かに分けて添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。混合物を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、所望の生成物１０６Ｂ（０．４ｇ、７４％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ８．２７（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３７（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、４．３２（ｄｄ、Ｊ＝１１．３、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２（ｄｄ、Ｊ＝１１．３、６．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．５９−３．４３（ｍ、３Ｈ）、１．５９−１．５２（ｍ、２Ｈ）、１．３８−１．２１（ｍ、６２Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ５：ＰＥＧ脂質１の調製
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の１０６Ｂ（０．４ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（０．９１ｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質を、ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配を溶出剤として使用する、シリカゲルクロマトグラフィーにより２回精製し、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質１（０．４３ｇ、２９％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０２（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、３．８９（ｍ、２Ｈ）、３．７３（ｍ、１Ｈ）、３．５−３．４（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．４−３．３（ｍ、４Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、２．９（ｍ、２Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、１．３６（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｍ、６２Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
ＰＥＧ脂質１Ａの調製
ステップ４：４−ニトロフェニル（１−（オクタデシルオキシ）イコサン−２−イル）カルボネート（１０６Ｃ）
ピリジン（３０ｍＬ）中の化合物１０６Ａ（０．４３ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．７６ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、所望の生成物１０６Ｃ（０．４３ｇ、７７％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ８．２７（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．９７（ｍ、１Ｈ）、３．５６（ｄ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．４９−３．３９（ｍ、２Ｈ）、１．６９（ｍ、２Ｈ）、１．３２−１．１９（ｍ、６２Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ５：ＰＥＧ脂質１Ａの調製
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１０６Ｃ（０．６ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ＰＥＧ−アミン（１．４５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．７ｍＬ、３．６３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去し、粗化合物を単離した。この物質を、ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配を溶出剤として使用する、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質１Ａ（１．２ｇ、６４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０４（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、４．６３（ｍ、１Ｈ）、３．７３（ｍ、１Ｈ）、３．５−３．４（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．４−３．３（ｍ、５Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、１．６（ｍ、２Ｈ）、１．４（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｍ、６２Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例２：ＰＥＧ脂質２の調製
Figure 2018090826
ステップ１：（Ｒ）−２、３−ビス（オクタデシルオキシ）プロパン酸（１０８）
ジクロロメタン（１０ｍＬ）およびＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）混合物中の１０７（３．０ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）溶液に、ピリジニウムジクロメート（６．６１ｇ、１７．５７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を周囲温度で４８時間撹拌した。混合物を水（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗物質を得、それを、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中１〜５％のメタノールを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、純粋な酸１０８（１．５３ｇ、５０％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．０４−４．０１（ｍ、１Ｈ）、３．８２−３．７７（ｍ、１Ｈ）、３．７２−３．６０（ｍ、３Ｈ）、３．５０−３．４２（ｍ、２Ｈ）、１．６５−１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．１６（ｍ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ＡＰＣＩ−＝６０９。
ステップ２および３：ＰＥＧ脂質２の調製
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の酸１０８（１．５ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、無水ＤＭＦを２滴、その後塩化オキサリル（０．６２ｇ、４．９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、４８時間撹拌した。混合物を蒸発させて余分な塩化オキサリルを除去し、得られた残渣をジクロロメタン（２ｘ５０ｍＬ）と共蒸発させ、真空下で乾燥して、粗酸塩化物１０９を単離した。ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の酸塩化物１０９氷冷溶液に、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（３．４ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）溶液、その後トリエチルアミン（０．９９ｇ、４．８０ｍｍｏｌ）を添加し、次いで混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ＤＣＭ中２〜１０％のメタノール勾配で溶出し、淡黄色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質２（２．４６ｇ、５５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．１０−３．７０（ｍ、６Ｈ）、３．７０−３．５０（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．５０−３．３７（ｍ、４Ｈ）、３．３５（ｓ、３Ｈ）、１．８５−１．７０（ｍ、２Ｈ）、１．６３−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．３７−１．１０（ｍ、６２Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例３：ＰＥＧ脂質３Ａおよび３Ｂの調製
Figure 2018090826
ＰＥＧ脂質３Ａの調製
ステップ１：（Ｒ）−２、３−ビス（オクタデシルオキシ）プロパナール（１１０）
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の塩化オキサリル（１．２７ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）溶液に、−７０℃、窒素下で、ジメチルスルホキシド（１．５７ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を−７０℃で３０分間撹拌した。ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の化合物１０７（３．０ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）溶液を滴加し、得られた混合物を−４０℃で４０分間撹拌した。次いでトリエチルアミン（３．３０ｇ、３２．６１ｍｍｏｌ）を反応溶液に添加し、それを１０℃まで昇温させ、１時間撹拌した。混合物を飽和塩化アンモニウム（５０ｍＬ）で希釈した。有機相を分離し、水相をジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗物質を得、それを、１〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、純粋アルデヒド１１０（２．０７ｇ、６９％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ９．７２（ｄ、Ｊ＝１．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２−３．７７（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．５４（ｍ、４Ｈ）、３．４７−３．３８（ｍ、２Ｈ）、１．６５−１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．１６（ｍ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ＡＰＣＩ＋＝５９５。
ステップ２：（２Ｓ，３Ｒ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−２−オール（１１１Ａ）および（２Ｒ，３Ｒ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−２−オール（１１１Ｂ）（ジアステレオマー）
無水テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の１１０（２．０ｇ、３．３６ｍｍｏｌ）溶液に、−１０℃、窒素下で、臭化メチルマグネシウム（１．２ｇ、１０．０６ｍｍｏｌ、ＴＨＦ／トルエン中１．４Ｍ）を滴加し、混合物を−１０℃で４時間撹拌した。反応混合物を室温まで昇温させ、１時間撹拌した。混合物を０℃まで冷却し、飽和塩化アンモニウム（２０ｍＬ）でクエンチした。水相を酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗物質を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体のジアステレオマー１１１Ａ（４５０ｍｇ、２２％）および１１１Ｂ（４６０ｍｇ、２２％）を単離した。
１１１Ａに対する１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．９２−３．８６（ｍ、１Ｈ）、３．６２−３．４０（ｍ、６Ｈ）、３．３０−３．２０（ｍ、１Ｈ）、２．７０（ｄ、Ｊ＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、１．５７−１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．２０（ｍ、６０Ｈ）、１．１８（ｄ、Ｊ＝６．１Ｈｚ、３Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ＡＰＣＩ＋＝６１１。
１１１Ｂに対する１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．８２−３．７６（ｍ、１Ｈ）、３．７３−３．６６（ｍ、１Ｈ）、３．５８−３．３５（ｍ、５Ｈ）、３．２０−３．１５（ｍ、１Ｈ）、２．６５（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、１．５９−１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．２０（ｍ、６０Ｈ）、１．２０（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ＡＰＣＩ＋＝６１１。
１１１Ａおよび１１１Ｂの割り当ては任意であり、１１１Ａおよび１１１Ｂ（および、それに続く順番の化合物）それぞれはＲ，Ｒ−またはＲ，Ｓ−立体化学のどちらかであり得る。
ステップ３：（２Ｓ，３Ｒ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−２−イル（２，５−ジオキソピロリジン１−イル）カルボネート（１１２Ａ）
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の１１１Ａ（０．４３ｇ、０．７ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ、２７０ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、その後トリエチルアミン（０．２１ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、２日間撹拌した。過剰量のＤＳＣ（０．１６ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を反応溶液に添加し、もう１日撹拌を継続した。反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、乾燥させて、粗物質を得［０．７２ｇ、１Ｈ ＮＭＲ分析によると、約０．２２ｇ（４１％）の１１２Ａを含有した］、それを次のステップで直接使用した。
ステップ４：ＰＥＧ脂質３Ａの調製
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の１１２Ａ（０．２２ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（０．５ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、その後無水ピリジン（０．３ｍＬ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ＤＣＭ中１〜１０％のメタノール勾配で溶出し、オフホワイト固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質３Ａ（０．５１ｇ、６５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０５（ｂｔ、１Ｈ）、４．７０（ｍ、１Ｈ）、３．８０−３．７０（ｍ、１Ｈ）、３．６０−３．２５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．０−２．９８（ｍ、２Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、１．６２−１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、１．１０（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
ＰＥＧ脂質３Ｂの調製
ステップ３：（２Ｒ、３Ｒ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−２−イル（２，５−ジオキソピロリジン１−イル）カルボネート（１１２Ｂ）
無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中の１１１Ｂ（０．４４ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ、０．２７ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）、その後トリエチルアミン（０．２１ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、２日間撹拌した。過剰量のＤＳＣ（０．１６ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を反応溶液に添加し、もう一日撹拌を継続した。反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、粗物質を得［０．５６ｇ、１Ｈ ＮＭＲ分析によると、約０．２７ｇ（５０％）の１１２Ｂを含有した］、それを次のステップで直接使用した。
ステップ４：ＰＥＧ脂質３Ｂの調製
ジクロロメタン（１０ｍＬ）中１１２Ｂ（０．２７ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（０．６ｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）、その後無水ピリジン（０．３ｍＬ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ＤＣＭ中１〜１０％のメタノール勾配で溶出し、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質３Ｂ（０．５５ｇ、７０％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０６（ｂｔ、１Ｈ）、４．７５（ｍ、１Ｈ）、３．７４−３．７１（ｍ、１Ｈ）、３．６０−３．２５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．０２−２．９８（ｍ、２Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、１．６４−１．５５（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、１．０７（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例４：ＰＥＧ脂質４の調製
Figure 2018090826
ステップ１：（Ｓ）−（（３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブトキシ）メチル）ベンゼン（１１４）
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１．０３ｇ、２５．９１ｍｍｏｌ、油中６０％）撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（２５ｍＬ）中化合物１１３（１．２７ｇ、６．７４ｍｍｏｌ）溶液を、０〜５℃で、１時間に渡り添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を再び０℃まで冷却し、３０ｍｌのＤＭＦ中の臭化ステアリル（８．６ｇ、２５．９１ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗（１時間）によりゆっくりと添加し、その後ヨウ化ナトリウム（５．５ｇ、３７０ｍｍｏｌ）を添加した。添加完了後、反応混合物を室温で２時間、および５５℃で１５時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈した。水層を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、粗１１４を得、それを、ヘキサン中０〜５％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体（３．２４ｇ、７２％）として単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．６２−３．３５（ｍ、９Ｈ）、１．９０−１．７０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．４５（ｍ、４Ｈ）、１．１０（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝７０１。
ステップ２：（Ｓ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−１−オール（１１５）
酢酸エチル（４０ｍＬ）中の化合物１１４（３．２ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐｄ−Ｃ（１０％湿潤、３００ｍｇ）を添加し、水素化を２４時間実施した。フラスコの内容物を温めて沈殿した固体を溶解し、セライトのパッドで熱いまま濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、白色固体の、所望のアルコール１１５（１．９７ｇ、７０％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：３．８３−３．７９（ｍ、２Ｈ）、３．７０−３．５２（ｍ、２Ｈ）、３．５２−３．４０（ｍ、５Ｈ）、２．８３（ｔ、Ｊ＝５．９０、１Ｈ）、１．８３−１．７８（ｍ、２Ｈ）、１．５８−１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．０（ｍ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６１１。
ステップ３：（（Ｓ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）ブチル２−（４−ニトロフェニル）アセテート（１１５Ａ）
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の化合物１１５（１．１１ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．４５ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、その後４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．５５ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、２４時間撹拌した。混合物を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、１〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、所望の生成物１１５Ａ（１．１９ｇ、８５％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：８．２８（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．４１（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０−３．３５（ｍ、７Ｈ）、２．１０−１．８０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．５０（ｍ、４Ｈ）、１．３６−１．０（ｍ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の１１５Ａ（１．５３ｇ、１．１９ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（２．５４ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．８０ｇ、６．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配で溶出して、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質４（１．５８ｇ、５６％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０３（ｂｔ、１Ｈ）、３．９６（ｔ、Ｊ＝６．５７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７４−３．７１（ｍ、３Ｈ）、３．７５−３．３２（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、３．０３−２．９６（ｍ、２Ｈ）、１．６６−１．５３（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．３８（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例５：ＰＥＧ脂質５の調製
Figure 2018090826
ステップ１：（Ｒ）−２、３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピルメタンスルホネート（１１６）
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の化合物１０７（３．０ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、トリエチルアミン（２．０３ｇ、２０．０６ｍｍｏｌ）および４−ジメチルアミノピリジン（６１ｍｇ、０．５０２ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液に、ジクロロメタン（６ｍＬ）中の塩化メタンスルホニル（１．１５ｇ、１０．０４ｍｍｏｌ）溶液を添加し、０℃で１０分間撹拌を継続した。混合物を室温まで昇温させ、１時間撹拌した。フラスコの内容物を冷水（２０ｍＬ）で希釈した。有機相を分離し、１ＮのＨＣｌ（１０ｍＬ）、水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、粗メシレート１１６（３．４ｇ、１００％）を得た。この材料は、次のステップで使用するために十分純粋であった。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．３５（ｄｄ、Ｊ＝１２．５、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、４．２４（ｄｄ、Ｊ＝１２．５、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．７０−３．６０（ｍ、２Ｈ）、３．５７−３．４０（ｍ、５Ｈ）、３．０３（ｓ、３Ｈ）、１．６０−１．４５（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．１６（ｍ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６７５。
ステップ２：（Ｓ）−３、４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタンニトリル（１１７）
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２４ｍＬ）中の１１６（３．７ｇ、５．５ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、シアン化ナトリウム（０．７４ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６５℃で２４時間撹拌した。混合物を室温まで放冷し、エーテル（１００ｍＬ）、その後水（２００ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、水層をジエチルエーテルで抽出した（３ｘ１００ｍＬ）。合わせた有機相を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗物質を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体のニトリル１１７（２．８ｇ、９３％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．７２−３．６４（ｍ、１Ｈ）、３．５６−３．５２（ｍ、３Ｈ）、３．４５−３．４０（ｍ、３Ｈ）、２．７０−２．５０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．４５（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．１６（ｍ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６０６。
ステップ３：（Ｓ）−３、４−ビス（オクタデシルオキシ）ブタン−１−アミン（１１８）
無水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の１１７（１．４ｇ、２．３１ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、ボラン−ＴＨＦ複合物（０．７９ｇ、９．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温まで昇温させ、２４時間撹拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、メタノール（１０ｍＬ）を滴加し、反応混合物を０℃で２０分間、次いで還流にて２時間撹拌した。フラスコの内容物を室温まで冷却し、塩酸（２Ｍ、４ｍＬ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタン（６０ｍＬ）中に溶解し、それに飽和重炭酸ナトリウムを添加した。得られた懸濁液を、セライトのパッドで濾過した。有機相を濾液から分離し、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、白色固体の、所望のアミン１１８（１．０ｇ、７１％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ３．６２−３．５４（ｍ、１Ｈ）、３．５０−３．３２（ｍ、６Ｈ）、２．９０−２．７６（ｍ、２Ｈ）、１．７０−１．６０（ｍ、２Ｈ）、１．６０−１．４８（ｍ、４Ｈ）、１．３５−１．１６（ｍ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６１０。
ステップ４：ｍＰＥＧ−ＯＮｐ
ジクロロメタン（６０ｍＬ）中のｍＰＥＧ−ＯＨ（３．０ｇ、１．５ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下でＮ−ジメチルアミノピリジン（０．３７ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）を添加し、その後４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．４６ｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を、何度かに分けて添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。混合物を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、粗ｍＰＥＧ−ＯＮｐを得、それを、２〜１０％メタノール／ジクロロメタンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、淡黄色固体の純粋な化合物、ｍＰＥＧ−ＯＮｐ（２．９ｇ、９０％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ８．２８（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、２Ｈ）、４．４２（ｔ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．９０−３．４０（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）３．３６（ｓ、３Ｈ）。
ステップ５：ＰＥＧ脂質５の調製
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１１８（０．７１ｇ、０．１．１６ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、ｍＰＥＧ−ＯＮｐ（１．５ｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．４４ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配で溶出して、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質５（０．５１ｇ、２８％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０６（ｂｔ、１Ｈ）、４．０４（ｔ、Ｊ＝３．８４、２Ｈ）、３．７４−３．７１（ｍ、２Ｈ）、３．６０−３．２５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．４３−３．３４（ｍ、４Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、３．１０−２．９６（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．３８（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例６：ＰＥＧ脂質６の調製
Figure 2018090826
ステップ１：（Ｓ）−４−（３−（ベンジルオキシ）プロピル）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン（１１９）
無水Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中のアルコールＡ（２．０ｇ、１２．４８ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、水素化ナトリウム（６０％、０．６ｇ、１４．９８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。この溶液に、臭化ベンジル（２．６ｇ、１５．１６ｍｍｏｌ）を滴加し、０℃で１０分間、撹拌を継続した。混合物を室温まで昇温させ、２４時間撹拌した。フラスコの内容物を、冷水（２００ｍＬ）で希釈した。水相を酢酸エチル（３ｘ５０ｍＬ）で抽出し、水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、粗化合物１１９を得た。この物質を、１〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを溶出剤として使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、無色油状の、純粋な生成物として単離した（２．１６ｇ、６９％）。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、４．１２−４．００（ｍ、２Ｈ）、３．５２−３．４８（ｍ、３Ｈ）、１．８０−１．６０（ｍ、４Ｈ）、１．４２（ｓ、３Ｈ）、１．３４９ｓ、３Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝２５１。
ステップ２：（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）ペンタン−１，２−ジオール（１２０）
メタノール（３０ｍＬ）中の１１９（２．１５ｇ、８．５９ｍｍｏｌ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２００ｍｇ）を添加した。混合物を室温で２４時間撹拌した。反応は不完全だったため、１０滴の２Ｎ ＨＣｌを混合物に添加し、還流まで、さらに２４時間加熱した。メタノールを減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル中に溶解し、飽和重炭酸ナトリウム、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、黄色油状の、所望のジオール１２０（１．５５ｇ、８６％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．７５−３．４０（ｍ、５Ｈ）、３．０４（ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、１Ｈ）、１．９２（ｔ、Ｊ＝５．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．８０−１．４０（ｍ、４Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝２１１。
ステップ３：（（Ｓ）−（（（４，５−ビス（オクタデシルオキシ）ペンチル）オキシ）メチル）ベンゼン（１２１）
無水ＤＭＦ（２３ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１．１７ｇ、２９．２８ｍｍｏｌ、油中６０％）撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）ペンタン−１，２−ジオール（１２０）（１．５４ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）溶液を、０〜５℃で１時間に渡り添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を０℃まで再度冷却し、５０ｍｌのＤＭＦ中の臭化ステアリル（９．７３ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗（１時間に渡り）によりゆっくりと添加した。添加完了後、反応混合物を室温で２時間、５５℃で１５時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈した。水層を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、粗１２１を得、それを、ヘキサン中０〜５％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の（０．９１ｇ、１７％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．６２−３．３５（ｍ、９Ｈ）、１．８０−１．４０（ｍ、６Ｈ）、１．４０−１．１０（ｂｓ、６２Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝７１５。
ステップ４：（Ｓ）−４，５−ビス（オクタデシルオキシ）ペンタン−１−オール（１２２）
酢酸エチル（２０ｍＬ）中の化合物１２１溶液に、Ｐｄ−Ｃ（１０％湿潤、１００ｍｇ）を添加し、水素化を２日間実施した。フラスコの内容物を、セライトのパッドで濾過し、ＥｔＯＡｃで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、白色固体の、所望のアルコール１２２（０．８ｇ、１００％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：３．７０−３．３５（ｍ、８Ｈ）、１．７０−１．５０（ｍ、８Ｈ）、１．３５−１．２０（ｍ、６２Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６２６。
ステップ５：（Ｓ）−４、５−ビス（オクタデシルオキシ）ペンチル（４−ニトロフェニル）カルボネート（１２２Ａ）
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の化合物１２２（０．８ｇ、１．２８ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下でＮ−ジメチルアミノピリジン（０．３１ｇ、２．５６ｍｍｏｌ）を添加し、その後４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．３９ｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を、何度かに分けて添加した。混合物を室温まで昇温させ、１時間撹拌した。混合物を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、所望の生成物１２２Ａ（０．６７ｇ、６６％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ８．２８（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．３０（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６５−３．５５（ｍ、２Ｈ）、３．５０−３．３６（ｍ、６Ｈ）、２．０−１．４０（ｍ、７Ｈ）、１．３６−１．０（ｍ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ６：ＰＥＧ脂質６の調製
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１２２Ａ（０．６７ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（１．４９ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．４４ｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配で溶出して、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質６（１．１ｇ、５６％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．０６（ｂｔ、１Ｈ）、３．９２（ｔ、Ｊ＝６．５７Ｈｚ、２Ｈ）、３．７４−３．７１（ｍ、２Ｈ）、３．７０−３．２５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、３．１０−２．９６（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．３８（ｍ、８Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例７：脂質７の調製
Figure 2018090826
ステップ１：１−デオキシ−２，３−イイソプロピリデン−Ｄ−リボース（Ｂ）
アセトン（１０ｍＬ）中の１−デオキシ−Ｄ−リボースＡ（１．５ｇ、１１．１９ｍｍｏｌ）溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（５．５ｍＬ、４４．７６ｍｍｏｌ）およびｐ−トルエンスルホン酸（５．３ｇ、２７．９７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチした。溶媒の除去後、残渣を酢酸エチル中に溶解し、水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて、黄色油状の粗成生物を得（８５０ｍｇ、未精製、４４％）、それを次のステップで直接使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．７８−４．８１（ｍ、１Ｈ）、４．５９（ｄｄ、Ｊ＝６．３、１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９−４．１４（ｍ、１Ｈ）、３．８９−４．００（ｍ、２Ｈ）、３．５４−３．６９（ｍ、２Ｈ）、１．５１（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）。
ステップ２：１−デオキシ−２，３−イイソプロピリデン−６−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボース（Ｃ）
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の化合物Ｂ（０．８５ｇ、４．８８ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下でＮａＨ（３９０ｍｇ、９．７７ｍｍｏｌ、油中６０％）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。臭化ベンジル（１．２ｍＬ、９．７７ｍｍｏｌ）の添加後、混合物を２時間撹拌し、室温まで昇温させた。反応物を水でクエンチし、酢酸エチルで希釈した。有機相を分離し、水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、２０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、黄色油状の、所望の生成物Ｃ（１．２ｇ、９３％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３０−７．４１（ｍ、５Ｈ）、４．７８−４．８２（ｍ、１Ｈ）、４．７２（ｄｄ、Ｊ＝６．５、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．５４（ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．４８（ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．１９（ｔｄ、Ｊ＝３．８、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０３（ｄｄ、Ｊ＝１０．２、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５（ｄｄ、Ｊ＝９．９、１．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．５７（ｄｄ、Ｊ＝７．９、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．５３（ｄｄ、Ｊ＝７．９、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、１．５０（ｓ、３Ｈ）、１．３３（ｓ、３Ｈ）。
ステップ３：１−デオキシ−６−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リボース（Ｄ）
化合物Ｃ（１．２ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）および酢酸（７０％）の混合物を２時間還流させ、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。得られた残渣を酢酸エチル中に溶解し、水、飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。溶媒の除去後、粗成生物を、３０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、無色油状の、所望の生成物Ｄ（５２０ｍｇ、５１％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．２８−７．３４（ｍ、５Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝１１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．５５（ｄ、Ｊ＝１１．９Ｈｚ、１Ｈ）、４．２３−４．２９（ｍ、１Ｈ）、４．０４−４．１４（ｍ、２Ｈ）、３．８７−３．９２（ｍ、１Ｈ）、３．７６−３．８１（ｍ、１Ｈ）、３．５９−３．６５（ｍ、２Ｈ）、２．４２−２．５７（ｍ、２Ｈ、２ＯＨ）。
ステップ４：（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（オクタデシルオキシ）テトラヒドロフラン−３−オールおよび（３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−５−（（ベンジルオキシ）メチル）−４−（オクタデシルオキシ）テトラヒドロフラン−３−オール（Ｅ）
トルエン（１００ｍＬ）中の化合物Ｄ（０．５２ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）溶液に、０℃、窒素下で、ＮａＨ（２７８ｍｇ、６．９５ｍｍｏｌ、油中６０％）を添加し、混合物を３０分間撹拌した。トルエン（２０ｍＬ）中メシル酸ステアリル（２．４ｇ、６．９６ｍｍｏｌ）溶液を、滴下漏斗によりゆっくりと添加した（１時間）。添加完了後、反応混合物を室温で２時間、および５５℃で２４時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、Ｅの粗混合物を得、それを、ヘキサン中１０〜２０％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、各位置異性体（０．３４ｇ、５０％）を単離した。
位置異性体１：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．２６−７．３３（ｍ、５Ｈ）、４．５７（ｓ、２Ｈ）、４．００−４．１２（ｍ、２Ｈ）、３．８７−３．９４（ｍ、２Ｈ）、３．７９（ｄｄ、Ｊ＝９．６、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．６８（ｄｄ、Ｊ＝１０．４、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、３．４４−３．５８（ｍ、３Ｈ）、２．７５（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、１．５９（ｍ、２Ｈ）、１．１６−１．３９（ｍ、３０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）。
位置異性体２：１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．２６−７．３４（ｍ、５Ｈ）、４．６１（ｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、１Ｈ）、４．５３（ｄ、Ｊ＝１２．３Ｈｚ、１Ｈ）、４．２２−４．２８（ｍ、１Ｈ）、４．０５（ｄｄ、Ｊ＝１０．１、４．９Ｈｚ、Ｈ）、３．９３−３．９６（ｍ、１Ｈ）、３．８１（ｄｄ、Ｊ＝１２．３、５．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７７（ｄｄ、Ｊ＝９．６、３．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．６３（ｄｄ、Ｊ＝１０．７、３．６Ｈｚ、１Ｈ）、３．５５（ｄｄ、Ｊ＝１０．４、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、３．４９（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ）、２．７１（ｄ、Ｊ＝４．６Ｈｚ、１Ｈ、ＯＨ）、１．５４−１．５９（ｍ、２Ｈ）、１．１９−１．３２（ｍ、３０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、３Ｈ）。
ステップ５：（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−（（ベンジルオキシ）メチル）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）テトラヒドロフラン（１２４）
無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（４７ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、油中６０％）撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の混合物Ｅ（０．２８ｇ、０．５８７ｍｍｏｌ）溶液を、０〜５℃で、１時間に渡り添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を再度０℃まで冷却し、５ｍｌのＤＭＦ中の臭化ステアリル（０．３９ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗によりゆっくりと添加し（１時間）、その後ヨウ化ナトリウム（０．２ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を添加した。添加完了後、反応混合物を室温で２時間、および５５℃で２４時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈した。水層を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、粗１２４を得、それを、ヘキサン中１〜８％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体（０．２１ｇ、５０％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．５７（ｑ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．０５−３．９７（ｍ、２Ｈ）、３．９５−３．８２（ｍ、２Ｈ）、３．８０−３．７５（ｍ、１Ｈ）、３．６８−３．６２（ｍ、１Ｈ）、３．５９−３．４０（ｍ、５Ｈ）、１．６０−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．４０−１．１０（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝７２９。
ステップ６：（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メタノール（１２５）
酢酸エチル（１０ｍＬ）中の化合物１２４（０．２１ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐｄ−Ｃ（１０％湿潤、６０ｍｇ）を添加し、反応混合物を１．５時間水素化した。フラスコの内容物をセライトのパッドで濾過した。灰色のケークをテトラヒドロフラン中に懸濁し、還流まで加熱し、セライトのパッドで熱いまま濾過し、ＴＨＦで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、白色固体の、所望のアミン１２５（０．１７ｇ、９４％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：４．０−３．７９（ｍ、５Ｈ）、３．６３−３．４２（ｍ、６Ｈ）、１．７４（ｑ、Ｊ＝４．４１Ｈｚ、１Ｈ、−ＯＨ）、１．６４−１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．１０（ｍ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６３９。
ステップ７：（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−３，４−ビス（オクタデシルオキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（４−ニトロフェニル）カルボネート（１２５Ａ）
ジクロロメタン（６ｍＬ）中の化合物１２５（０．１７ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）懸濁液に、０℃、窒素下で、テトラヒドロフラン（４ｍＬ）を添加した。溶液に、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（８１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、その後４−ニトロフェニルクロロホルメート（８１ｍｇ、０．５３２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、２４時間撹拌した。混合物を水、ブラインで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗成生物を得、それを、２〜１０％酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の、所望の生成物１２５Ａ（０．１７ｇ、８１％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ８．２８（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．４０（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、２Ｈ）、４．５８−４．５０（ｍ、１Ｈ）、４．３４−４．２５（ｍ、１Ｈ）、４．２０−４．１０（ｍ、１Ｈ）、４．０５−３．９０（ｍ、３Ｈ）、３．７８−３．７０（ｍ、１Ｈ）、３．６３−３．４０（ｍ、４Ｈ）、１．６４−１．５６（ｍ、４Ｈ）、１．３３−１．１６（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ８：ＰＥＧ脂質７の調製
ジクロロメタン（６ｍＬ）中の１２５Ａ（０．１７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（０．４ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．１１ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配で溶出し、白色固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質７（０．４８ｇ、８７％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．１５（ｂｔ、１Ｈ）、４．１０−４．０（ｍ、２Ｈ）、３．９６−３．８６（ｍ、２Ｈ）、３．７８−３．７０（ｍ、２Ｈ）、３．７０−３．６０（ｍ、６Ｈ）、３．５４−３．３４（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．３０−３．２５（ｍ、２Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、１．６４−１．５９（ｍ、２Ｈ）、１．４８−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例８：ＰＥＧ脂質８の調製
Figure 2018090826
ステップ１：ベンジルシス−３，４−ジヒドロキシピロリジン−１−カルボキシレート（１２７）
アセトンおよび水（３２ｍＬａｎｄ６ｍＬ）混合物中の化合物１２６（３．０ｇ、１４．７６ｍｍｏｌ）溶液に、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（２．２５ｇ、１９．２１ｍｍｏｌ）、その後四酸化オスミウム溶液（４％ 水性、０．７ｍＬ）を添加した。黄色の混合物を、周囲温度で一晩撹拌した。この溶液に、固体のメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５、５．０ｇ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。アセトンを、反応混合物から蒸発により除去し、得られた固体を酢酸エチル中に懸濁し、濾過した。固体を水中に溶解し、酢酸エチルで抽出し、濾液と混合した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発させて粗化合物１２７を得た。この物質を、１〜８％メタノール／ジクロロメタンを溶出剤として使用するフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体の純粋な生成物（３．０２ｇ、８６％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、５．１１（ｓ、２Ｈ）、４．２８−４．２０（ｍ、２Ｈ）、３．６５（ｄｄ、Ｊ＝１１．０、５．５Ｈｚ、２Ｈ）、３．４１（ｄｔ、Ｊ＝１１．０、４．１Ｈｚ、２Ｈ）、２．６１−２．５８（ｍ、２Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝２３８。
ステップ２：ベンジルシス−３、４−ビス（オクタデシルオキシ）ピロリジン−１−カルボキシレート（１２８）
無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１．５ｇ、３７．１２ｍｍｏｌ、油中６０％）撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で、ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物１２７（２．２ｇ、９．２８ｍｍｏｌ）溶液を、０〜５℃で１時間に渡り添加した。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を０℃まで再度冷却し、７０ｍｌのＤＭＦ中の臭化ステアリル（１２．３ｇ、３７．１２ｍｍｏｌ）を、滴下漏斗によりゆっくりと添加し（１時間に渡り）、その後ヨウ化ナトリウム（５．５ｇ、３７０ｍｍｏｌ）を添加した。添加完了後、反応混合物を室温で２時間、および５５℃で１５時間撹拌した。反応混合物を次いで０℃まで冷却し、数滴の冷水でクエンチした。混合物を飽和塩化アンモニウムで希釈した。水層を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下での溶媒の除去により、粗１２８を得、それを、ヘキサン中０〜５％の酢酸エチルを用いるフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、白色固体（２．８３ｇ、４１％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．３９−７．２６（ｍ、５Ｈ）、４．４９（ｓ、２Ｈ）、３．６２−３．３５（ｍ、９Ｈ）、１．８０−１．４０（ｍ、６Ｈ）、１．４０−１．１０（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝７１５。
ステップ３：シス−３、４−ビス（オクタデシルオキシ）ピロリジン（１２９）
酢酸エチル（２０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（８０ｍＬ）の混合物中の化合物１２８（２．８ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐｄ−Ｃ（１０％ｗｅｔ、１００ｍｇ）を添加し、反応物を２４時間水素化した。フラスコの内容物をセライトのパッドで濾過した。灰色の濾過ケーキをテトラヒドロフラン中に懸濁し、還流まで加熱し、セライトのパッドで熱いまま濾過し、ＴＨＦで洗浄し、濾液を減圧下で濃縮して、オフ白色固体の、所望のアミン１２９（２．３ｇ、１００％）を単離した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：３．８３−３．７９（ｍ、２Ｈ）、４．５０−３．４２（ｍ、４Ｈ）、２．９８−２．９４（ｍ、４Ｈ）、１．８３（ｂｓ、１Ｈ）、１．６４−１．５３（ｍ、４Ｈ）、１．３８−１．０（ｍ、６０Ｈ）、０．８７（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、６Ｈ）。ＡＰＣＩ＋＝６０８。
ステップ４：ＰＥＧ脂質８の調製
ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の１２９（０．５５ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ−ＯＮｐ（１．５ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）、その後ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温まで昇温させ、一晩撹拌した。揮発物を減圧下で除去して、粗化合物を単離した。この物質をジクロロメタン（２０ｍＬ）中に溶解し、酢酸エチル中に詰めたシリカゲルのパック済みカラムに添加した。カラムを最初に酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中１〜８％のメタノール勾配で溶出し、オフホワイトの固体の所望の生成物、ＰＥＧ脂質８（８２０ｍｇ、４５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ４．２９−４．１８（ｍ、２Ｈ）、３．９２−３．８５（ｍ、２Ｈ）、３．８０−３．４０（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．３７（ｓ、３Ｈ）、１．６２−５．５２（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｂｓ、６０Ｈ）、０．８４（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例９：ＰＥＧ脂質９および１０の調製
Figure 2018090826
ＰＥＧ脂質９の調製
ステップ１：（Ｓ）−２，３−ジステアルアミドプロパン酸
Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）中の（Ｓ）−２，３−ジアミノプロパン酸塩酸塩（１．６ｇ、１１．５３ｍｍｏｌ）溶液に、ＮａＨＣＯ３（１９．４ｇ、２３０．６６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１０分間撹拌した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のステアリン酸ＮＨＳエステル（１１ｇ、２８．８３ｍｍｏｌ）溶液を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。反応物を３ＮのＨＣｌでクエンチし、沈殿した白色固体を濾過した。粗白色固体の化合物を、ＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁し、３０分間激しく撹拌した。固体を濾過し、真空下で一晩乾燥して、純粋な生成物１３０（３．３ｇ、４６％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．９２（ｂｄ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、６．５８（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、４．３４（ｍ、１Ｈ）、３．８６（ｍ、１Ｈ）、３．４８（ｍ、１Ｈ）、２．２６（ｍ、４Ｈ）、１．６２（ｍ、４Ｈ）、１．３４−１．２４（ｍ、５６Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
ステップ２：ＰＥＧ脂質９の調製
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１３０（４１５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下、ｍＰＥＧ２０００−ＮＨ２（１ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３７ｍＬ、２ｍｍｏｌ）、その後ＰｙＢｏｐ（３３８．３ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で一晩撹拌した。反応物をＨ２Ｏでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、粗化合物を得た。この物質を、ＣＨ２Ｃｌ２中１〜１０％メタノールを溶出剤として使用するシリカゲルクロマトグラフィーで、２回精製し、所望の生成物、ＰＥＧ脂質９（０．４３ｇ、２４％）を、白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋１％Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．４４（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、７．１９（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、６．６３（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、４．３８（ｍ、１Ｈ）、３．８６（ｍ、１Ｈ）、３．６０−３．５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．５−３．３（ｍ、３Ｈ）、３．３５（ｓ、３Ｈ）、２．２３−２．１３（ｍ、２Ｈ）、１．７１−１．７９（ｍ、２Ｈ）、１．５０−１．４０（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｍ、５６Ｈ）、０．８６（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、６Ｈ）。
ＰＥＧ脂質１０の調製
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１３０（４１５ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）溶液に、窒素下で、ｍＰＥＧ２０００−ＯＨ（１ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３７ｍＬ、２ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（７９．６ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）、その後ＥＤＣＩ（１２４．９ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３日間撹拌した。反応物をＨ２Ｏでクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。合わせた有機層をＨ２Ｏ、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去して、粗化合物を得た。この物質を、ＣＨ２Ｃｌ２中１〜１０％メタノールを溶出剤として使用する、シリカゲルクロマトグラフィーで３回精製し、所望の生成物、ＰＥＧ脂質１０（０．２６ｇ、１５％）を、白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋１％Ｄ２Ｏ、３００ＭＨｚ）：δｐｐｍ ７．４７（ｄ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、７．０２（ｂｔ、１Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ）、４．５８（ｍ、１Ｈ）、４．３８（ｍ、１Ｈ）、４．２１（ｍ、１Ｈ）、３．７−３．６（ｍ、４Ｈ）、３．６−３．５（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．３６（ｓ、３Ｈ）、２．１６（ｄｔ、Ｊ＝２２．５、７．９Ｈｚ、１Ｈ）、１．６（ｍ、４Ｈ）、１．２２（ｍ、５６Ｈ）、０．８５（ｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）。
実施例１０：カチオン性脂質由来のリポソームを使用した、第ＶＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏ評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバーラブズ社（Charles River Labs）、マサチューセッツ州）に、生理食塩水または所望の製剤中のｓｉＲＮＡのどちらかを、０．０１ｍＬ／ｇの体積で、尾静脈注射により投与する。投与後の種々の時間点で、動物をイソフルラン吸入により麻酔し、後眼窩出血により、血液を血清分離管中に収集する。製造者のプロトコルに従って、発色アッセイ（Ｃｏａｓｅｔ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ、ダイファーマグループ（DiaPharma Group）、オハイオ州、またはＢｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ、アニアラ社（Aniara Corporation）、オハイオ州）を使用して、試料中の第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを測定する。生理食塩水で治療した動物から収集した血清を使用して、標準曲線を作成する。肝臓ｍＲＮＡレベルを評価する実験において、投与後の種々の時間点で、動物を屠殺して肝臓を収集し、液体窒素中で瞬間冷凍する。凍結した肝臓組織を粉砕して粉末にする。組織可溶化液を調製し、第ＶＩＩ因子およびアポリポタンパク質Ｂの肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡ法（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ、パノミクス社（Panomics）カリフォルニア州）、カリフォルニア州）を使用して測定する。
実施例１２：ｉｎ ｖｉｖｏげっ歯類第ＶＩＩ因子サイレンシングモデルを使用した、種々のカチオン性脂質を含む脂質粒子製剤の有効性の測定。
凝固カスケードにおける顕著なタンパク質である第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、肝臓（肝細胞）において合成され、血漿中に分泌される。血漿中のＦＶＩＩレベルは、簡易な、プレートベースの比色分析アッセイにより測定することが出来る。したがって、ＦＶＩＩは、肝細胞由来タンパク質の、ｓｉＲＮＡ媒介性の下方制御を測定するため、ならびに核酸脂質粒子およびｓｉＲＮＡの血漿濃度および組織分布をモニタするための、便利なモデルである。
Figure 2018090826
 小文字は、２’ＯＭｅ修飾であり、Ｎｆは２’Ｆ修飾核酸塩基、ｄＴはデオキシチミジン、ｓはホスホチオエートである。
上に示されるカチオン性脂質は、例えば、その全体が参照により組み入れられる米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号に記載される、インライン混合法（in-line mixing method）を使用して、ＡＤ−１６６１二本鎖を含むリポソームを製剤化するために使用される。脂質粒子は、以下のモル比を使用して製剤する：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％凝集抑制脂質。
インライン混合のための一般的プロトコル
１つは脂質を含み、他方はｓｉＲＮＡを含む、それぞれの別々のストック溶液を調製する。所望の脂質または脂質混合物、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび凝集抑制脂質を含む脂質原液を、９０％エタノール中に溶解することにより調製する。残りの１０％は低ｐＨクエン酸塩緩衝剤である。脂質原液の濃度は４ｍｇ／ｍＬである。このクエン酸塩緩衝剤のｐＨは、使用する脂質の種類に応じて、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲であることができる。ｓｉＲＮＡを、４ｍｇ／ｍＬの濃度で、クエン酸塩緩衝剤中にも溶解させる。各ストック溶液、５ｍＬを調製した。
ストック溶液は完全に透明であり、脂質が確実に完全溶解したことを確認した後、ｓｉＲＮＡと混合する。脂質を完全に溶解させるために、ストック溶液を加熱してもよい。このプロセスで使用するｓｉＲＮＡｓは、未修飾のまたは修飾されたオリゴヌクレオチドであってもよく、親油性部分、例えばコレステロールと複合体化させてもよい。
各溶液をＴ字管にポンプで汲み入れることにより、個々の原液を混合する。２つの流れの開始および停止を同時に制御するために、双頭のワトソン・マーローポンプを使用する。線流速を増加させる為に、１．６ｍｍポリプロピレンチューブを、さらに０．８ｍｍチューブまで小型化する。ポリプロピレン線（ＩＤ＝０．８ｍｍ）をＴ字管のどちらかの側に取り付ける。ポリプロピレンＴは、得られる体積４．１ｍｍ３に対して１．６ｍｍの線端部を有する。ポリプロピレン線の各大端部（１．６ｍｍ）を、溶解された脂質ストックまたは溶解されたｓｉＲＮＡのどちらかを含む試験管中に配置する。Ｔ字管の後に、１つにまとまった流れが出てくるところに、単一管を配置する。次いで管を、ＰＢＳの体積の二倍の容器中まで伸長し、それを素早く撹拌する。ポンプの流速は、３００ｒｐｍまたは１１０ｍＬ／分の設定にする。エタノールを除去し、透析によりＰＢＳと交換する。次いで脂質製剤を、遠心分離または血液透析濾過を使用して、適切な作業濃度まで濃縮する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（チャールズリバーラブズ社（Charles River Labs）、マサチューセッツ州）に、生理食塩水または製剤化したｓｉＲＮＡのどちらかを、尾静脈注射により投与する。投与後の種々の時間点で、後眼窩出血により血清試料を収集する。試料中の第ＶＩＩ因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ、アニアラ社（Aniara Corporation）、オハイオ州）を使用して測定する。第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを測定するために、動物を屠殺して肝臓を収集し、液体窒素中で瞬間冷凍する。凍結組織から組織可溶化液を調製し、第ＶＩＩ因子の肝臓ｍＲＮＡレベルを、分岐ＤＮＡ法（（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ａｓｓａｙ、パノミクス社（Panomics）カリフォルニア州））を使用して定量化する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの静脈内（ボーラス）注射の４８時間後に、ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡで治療した動物において、ＦＶＩＩ活性を評価する。血清または組織中のタンパク質レベルを測定するための市販キットを使用し、製造者の指示に従って、マイクロプレート規模で、ＦＶＩＩを測定する。ＦＶＩＩの低減を未治療の対照マウスと比較して判断し、結果を残留ＦＶＩＩ％として表す。２つの用量レベル（０．０５および０．００５ｍｇ／ｋｇのＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ）を、各新規リポソーム組成物のスクリーニングにおいて使用する。
実施例１３：予備形成された小胞を使用したｓｉＲＮＡ製剤化
予備形成小胞法（preformed vesicle method）を使用して、粒子を含むカチオン性脂質を作製する。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび凝集抑制脂質を、それぞれ、４０／１０／４０／１０のモル比で、エタノール中に溶解した。脂質混合物を、水性緩衝剤（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４）に、それぞれ３０％（体積／体積）および６．１ｍｇ／ｍＬの最終エタノールおよび脂質濃度に、混合しながら添加し、押出前に室温で２分間平衡化させる。水和した脂質を、Ｎｉｃｏｍｐ分析による測定で７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまで、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（ノーザンリピッズ社（Northern Lipids）、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）を使用し、２２℃で、２つの積層型８０ｎｍ孔径フィルタ（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通して押し出す。これには一般的に１〜３回の通過が必要とされる。小胞を形成しなかったいくつかのカチオン性脂質混合物においては、より低いｐＨ緩衝剤（５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ３）で脂質混合物を水和させ、ＤＳＰＣ頭部基上のホスフェート基をプロトン化することが、安定した７０〜９０ｎｍの小胞形成を助ける。
ＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含む５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ４水溶液中に溶解）を、３５℃に予め平衡化した小胞に、約５ｍＬ／分の速度で、混合しながら添加する。０．０６（重量／重量）の最終標的ｓｉＲＮＡ／脂質比を達成した後、小胞の再形成およびＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡのカプセル化を可能にするために、混合物をさらに３０分間、３５℃でインキュベートする。次いでエタノールを除去し、透析または接線流透析濾過のどちらかにより、外部緩衝剤をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）と入れ替える。最終のカプセル化ｓｉＲＮＡ対脂質比は、サイズ排除スピンカラムまたはイオン交換スピンカラムを使用して、未カプセル化ｓｉＲＮＡの除去後に測定する。
実施例１４：脂質製剤の有効性のＩｎ ｖｉｖｏ測定
試験製剤をまず、治療群あたり３匹のマウスを用い、０．１、０．３、１．０および５．０ｍｇ／ｋｇで、雌性の７〜９週齢、１５〜２５ｇの、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＦＶＩＩノックダウンについて評価する。全ての実験には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、対照群）またはベンチマーク製剤のどちらかを投与した動物が含まれた。製剤を、試験の直前に、ＰＢＳ中で適切な濃度まで希釈する。マウスを計量し、適切な投与体積を算出する（１０μＬ／ｇ体重）。試験製剤およびベンチマーク製剤、ならびにＰＢＳ（対照動物に対して）を、側尾静脈に、静脈内投与する。動物を２４時間後に、ケタミン／キシラジンの腹腔内注射で麻酔し、心臓穿刺により５００〜７００μＬの血液を、血清分離管（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）中に収集する。血液を、２，０００ｘｇで１０分間、１５℃で遠心分離し、血清を収集し、分析するまで−７０℃で保管する。血清試料を３７℃で３０分間解凍し、ＰＢＳ中に希釈し、９６−ウェルのアッセイプレート中に等分した。発色アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ ＦＶＩＩ ｋｉｔ、ハイフェン・バイオメッド社（Hyphen BioMed））を使用し、製造者の指示に従って、第ＶＩＩ因子レベルを評価し、４０５ｎｍ波長フィルタを備えたマイクロプレートリーダーで、吸光度を測定する。血漿ＦＶＩＩレベルを定量化し、対照動物由来の血清のプールした試料から生成した標準曲線を使用して、ＥＤ５０値（対照動物と比較して、血漿ＦＶＩＩレベルの５０％低減をもたらす用量）を算出する。高レベルのＦＶＩＩノックダウン（ＥＤ５０＜＜０．１ｍｇ／ｋｇ）を示す、目的の製剤を、より低い用量範囲で、独立した実験において再試験して、効力を確認し、ＥＤ５０を確立する。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (29)

  1. 以下の式（Ｉ）で表される化合物、またはその薬剤的に許容される塩：
    Figure 2018090826
     式中、
    Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪族基であり、ここで脂肪族基は、Ｒａからそれぞれ独立して選択される１つまたは複数の基により随意に置換され；およびここで脂肪族基は、シクロアルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−により随意に中断され；
    Ｘは、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
    Ｙは、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−であり；
    Ｌは、−Ｌ１−Ｚ１−（Ｌ２−Ｚ２）ｃ−Ｌ３−であり；
    Ｌ１は、結合、−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−、または−（ＣＲ５Ｒ５’）ｉ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊ−であり；
    Ｚ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
    Ｌ２は、−（ＣＲａＲｂ）ｐ−または−（ＣＲａＲｂ）ｊ−（Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ））ｋ−（Ｃ≡Ｃ）ｋ−（ＣＲａＲｂ）ｊであり；
    Ｚ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）−、または−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−であり；
    Ｌ３は、−（ＣＲａＲｂ）ｉ−であり；
    各Ａは独立して、−Ｌ４−、−ＮＨ−（Ｌ４）ｑ−（ＣＲａＲｂ）ｒ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲａＲｂ）ｒ−（Ｌ４）ｑ−ＮＨ−であり；ここで各ｑは独立して、０、１、２、３、または４であり；および各ｒは、独立して、０、１、２、３、または４であり；
    各Ｌ４は独立して、−（ＣＲａＲｂ）ｓＯ−または−Ｏ（ＣＲａＲｂ）ｓ−であり；ここで各ｓは独立して、０、１、２、３、または４であり；
    Ｒ３は−Ｈ、−Ｒｃ、または−ＯＲｃであり；
    Ｒ４およびＲ４’のそれぞれは、独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルコキシであり；
    各Ｒ５および各Ｒ５’は、独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはシクロアルキルであるか；
    またはＲ４および１つのＲ５が一緒になって、５〜８員のシクロアルキルまたは複素環を形成し；
    各Ｒａは独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    各Ｒｂは独立して、−Ｈ、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    各Ｒｃは、−Ｈ、アルキル、アシル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；
    ａは０または１であり；
    ｂは１〜１，０００の整数であり；
    ｃは０または１であり；
    ｉの各出現は、独立して、１、２、３、４、５、または６であり；ｊの各出現は、独立して、０、１、２、または３であり；
    ｋの各出現は、独立して、０、１、２、または３であり；および
    Ｐは１〜１０であるが；但し、
    （ｉ）ＸおよびＹが同時に−ＣＨ２−であることは無く；ならびに
    （ｉｉ）ａが１であり、Ｌ１が−ＣＨ２−である場合は、
    （ａ）ＸおよびＹが同時に−Ｏ−であることは無く；ならびに
    （ｂ）ＸおよびＹが同時に−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であることも無い。
  2. Ｘが−（ＣＨ２）ｉ−である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｘが−ＣＨ２−であり、およびＹが−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｘが−ＣＨ２−では無く；およびＹが−（ＣＲａＲｂ）ｉ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｚ１が−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−である、請求項４に記載の化合物。
  6. Ｘが、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である、請求項１に記載の化合物。
  7. Ｙが、−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、−ＳＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）−、または−Ｎ（Ｒｃ）Ｃ（Ｏ）Ｓ−である、請求項１に記載の化合物。
  8. 各ＡがＬ４であり、および各Ｌ４が独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
  9. Ｒ３がアルコキシである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
  10. 前記化合物の分子量が、５００ｇ／ｍｏｌ〜５，０００ｇ／ｍｏｌの間である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
  11. Ｒ１およびＲ２のそれぞれが独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニル基である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
  12. 変数ｑおよびｓがそれぞれ独立して、１、２、３、または４である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
  13. Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立して、Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルまたはＣ１２〜Ｃ２０アルケニル基であり；
    Ｘは、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；
    Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−、または−ＳＣ（Ｏ）ＮＨ−であり；
    ａは１であり；
    Ｌ１は結合または−（ＣＨ２）ｉ−であり，
    ｃは０であり；
    Ｌ３は−（ＣＨ２）ｉ−であり；
    各Ａは独立して、−Ｌ４−であり；
    各Ｌ４は独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−であり；および
    Ｒ３は−ＯＲｃであり、ここでＲｃは−Ｈまたはアルキルである、請求項１に記載の化合物。
  14. 以下から選択される化合物、およびその薬剤的に許容される塩：
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
    Figure 2018090826
     式中、
    ｎは、１〜１，０００の整数であり；および
    ｍは、１、２、３、４、５、または６である。
  15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物を含む、脂質粒子。
  16. カチオン性脂質をさらに含む、請求項１５に記載の脂質粒子。
  17. 中性脂質およびステロールをさらに含む、請求項１６に記載の脂質粒子。
  18. 前記中性脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、またはＳＭから選択される、請求項１７に記載の脂質粒子。
  19. 前記カチオン性脂質が約２０％および約６０％のモル比で存在し；前記中性脂質が約５％〜約２５％のモル比で存在し；前記ステロールが約２５％〜約５５％のモル比で存在し；および請求項１に記載の化合物が約０．５％〜約１５％のモル比で存在する、請求項１８に記載の脂質粒子。
  20. 活性物質をさらに含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の脂質粒子。
  21. 前記活性物質が、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（antagomir）、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択される核酸である、請求項２０に記載の脂質粒子。
  22. 請求項２０または２１に記載の脂質粒子および薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
  23. 細胞において標的遺伝子の発現を調節する方法であって、請求項２０または２１に記載の脂質粒子を細胞に提供することを含む、方法。
  24. 前記活性物質が、プラスミド、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ（antagomir）、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択される核酸である、請求項２３に記載の方法。
  25. 対象においてポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に請求項２２に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記活性物質が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドから成る群から選択される核酸であり、および前記ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖と特異的に結合するポリヌクレオチドを含む、方法。
  26. 対象においてポリペプチドの低発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に請求項２２に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記活性物質が、前記ポリペプチドまたは機能的変異体またはその断片をコードするプラスミドである、方法。
  27. 対象において免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、前記対象に請求項２２に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記活性物質が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、方法。
  28. 前記標的遺伝子が、以下から成る群から選択される、請求項２３に記載の方法：第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、アポリポタンパク質Ｂ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、βカテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、ＳＯＲＴ１遺伝子、ＸＢＰ１遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢＩ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制因子遺伝子類、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子。
  29. 前記標的遺伝子が、１つまたは複数の突然変異を含む、請求項２８に記載の方法。
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