JP2018090595A - オキシントモジュリン誘導体を含む高脂血症の治療のための組成物 - Google Patents

オキシントモジュリン誘導体を含む高脂血症の治療のための組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】オキシントモジュリン誘導体を有効成分とする高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物を提供する
【解決手段】配列番号２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、オキシントモジュリン誘導体を有効成分として含む高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物に関する。本発明のオキシントモジュリン誘導体は、天然型のオキシントモジュリンに比べてＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体に対して高い活性を持ち、高脂肪の食餌により増加した血中総コレステロール、低密度コレステロールおよび中性脂肪を減少させ、高密度コレステロール値および高密度コレステロール/低密度コレステロールの割合を増加させる効果を持つ。
【選択図】図５

Description

本発明は、オキシントモジュリン誘導体を有効成分として含む高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物、およびこれを用いた高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療方法に関する。
近年、韓国では経済成長と食生活の西欧化により、食物から得られる脂肪分の摂取量が増加し、運動不足などによる高脂血症、糖尿病、高血圧、動脈硬化症、および脂肪肝疾患などの代謝性疾患が増加する傾向にある。
高脂血症とは、血液内の遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、中性脂肪などの脂肪が異常に増加した状態をいう。高脂血症は、（１）高コレステロール血症（２）高中性脂肪血症（３）混合型高脂血症（高コレステロール血症および高中性脂肪血症）の３種類の形で発生しうる 。高脂血症は通常、一次性または二次性高脂血症に分類される。一次性高脂血症が一般的に遺伝的欠損によるものであるのに対し、ニ次性高脂血症は様々な疾患の状態、薬物および食習慣によって誘発される。また、高脂血症は一次性および二次性の原因の組み合わせにより誘発されることもある。高脂血症の診断基準は、一般的に総コレステロールの基準値２２０ｍｇ/ｄｌ以上、中性脂肪の基準値１５０ｍｇ/ｄｌ以上が用いられている。
哺乳類において自然発生するコレステロールには、様々な形態がある。低密度（ ＬＤＬ ）コレステロールは健康に有害なコレステロールとして知られているが、低密度コレステロールの増加は心臓病のリスクを増加させることで知られている（非特許文献１）。また、高密度（ＨＤＬ）コレステロールは善玉コレステロールと見なされており、動脈硬化を予防するなど健康に不可欠である。
高脂血症は、それ自体が特定の症状を示すものではないが、血液内の過剰な脂質は血管壁に付着して血管のサイズを狭め、炎症反応によるアテローム性動脈硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を引き起こす。これにより、冠状動脈性心臓病や脳血管疾患、末梢血管の閉鎖などが発症しうる（非特許文献２）。また、過剰な血液中の脂質は肝臓の組織に蓄積され、これにより脂肪肝疾患が誘発される。前記脂肪肝疾患とは肝臓の重量において脂肪が占める割合が５％を超えた状態をいう。肝脂肪は過剰な脂肪の摂取量だけでなく、アルコール摂取によっても誘発される。
血中の脂質濃度を減少させるこれまでの方法としては、コレステロールや脂肪が多く含まれる食物の摂取量を減らす食餌療法、運動療法、および薬物療法などが用いられている。しかし、食餌療法や運動療法は厳密な管理と実施が困難であり、その治療効果にも限界がある。
現在まで開発されてきた脂質濃度を減少させる薬物としては、胆汁酸結合樹脂、コレステロール生合成における重要なＨＭＧ-ＣｏＡ還元酵素阻害剤（ＨＭＧ-ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）などのコレステロール降下剤、フィブリン酸誘導体およびニコチン酸などの中性脂肪降下剤が挙げられる。しかし、これらの薬剤は、肝毒性、胃腸障害、および発がん性などの副作用が報告されている。したがって、血中脂質濃度を効果的に下げ、高脂血症およびこれに関連する疾患（例えば、動脈硬化症および脂肪肝疾患）の治療に使用できるもので、尚且つ副作用の少ない薬剤の開発が急がれているのが実情である。
そのような薬物の候補物質の一つとして、オキシントモジュリンが近年注目されている。オキシントモジュリンはプレグルカゴン（ｐｒｅ-ｇｌｕｃａｇｏｎ）から作製され、主な特徴としてはグルカゴン様ペプチド-１（ＧＬＰ-１）とグルカゴン受容体のいずれにも結合して二重機能を果たすことのできるペプチドである。そのような特徴により、オキシントモジュリンは肥満、高脂血症および脂肪肝疾患の治療など様々な目的のために研究が成されてきた。しかし、オキシントモジュリンは生体内での半減期が短く、その活性が前記肥満、高脂血症、脂肪肝疾患の治療などに使用できる程度のものでないため、高容量を投与しなければならないという問題がある。
そこで、本発明者らは天然型オキシントモジュリンよりも活性が増大したオキシントモジュリン誘導体を開発し、前記誘導体が高脂血症の誘導されたハムスターモデルで血中内脂質含量および割合を向上させることによって、高脂血症疾患の治療に効果的に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
国際特許公開第97/34631号 国際特許公開第96/32478号
Assman et al., Am. J. Card, 1996 E. Falk et al., Circulation, 1995 H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979
本発明の目的は、オキシントモジュリン誘導体を有効成分とする高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、オキシントモジュリン誘導体を個体に投与するステップを含む、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を治療する方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、高脂血症、脂肪肝疾患、もしくは動脈硬化症の予防または治療のための医薬の製造における、前記オキシントモジュリン誘導体の用途を提供することである。
前記課題を解決するために、一態様において、本発明はオキシントモジュリン誘導体を有効成分として含む高脂血症、脂肪肝疾患、もしくは動脈硬化症の予防または治療のための組成物を提供する。
本発明における用語「オキシントモジュリン」とは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴンから作製されるペプチドを意味する。本発明において、オキシントモジュリンは天然型オキシントモジュリンとその前駆物質、アナログ（誘導体）、断片および変異体を含む。好ましくは、オキシントモジュリンは配列番号１（ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ）のアミノ酸配列を有する。
本発明における用語「オキシントモジュリン変異体」とは、天然型オキシントモジュリンとアミノ酸配列が１つ以上の異なるアミノ酸残基を有するペプチドであり、ＧＬＰ-１とグルカゴン受容体の活性化機能を有するペプチドを意味する。前記オキシントモジュリン変異体は、天然型オキシントモジュリンの一部のアミノ酸の置換、付加、欠失および修飾のうちいずれかの方法またはそれらの方法の組み合わせにより製造できる。
本発明における用語「オキシントモジュリン誘導体」とは、天然型オキシントモジュリンの一部のアミノ酸を付加、欠失または置換によって製造し、天然型オキシントモジュリンによって活性化されたレベルに比べ、ＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体をいずれも高レベルに活性化させることのできるペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣体を意味する。
本発明における用語「オキシントモジュリン断片」とは、オキシントモジュリンのアミノ末端またはカルボキシ末端に１つまたはそれ以上のアミノ酸が付加または欠失した断片を意味し、付加されたアミノ酸は天然に存在しないアミノ酸（例えば、Ｄ型アミノ酸）であってもよい。このようなアミノ酸は体内で血糖調節機能を持つ。
オキシントモジュリン変異体、誘導体、および断片を製造するための方法は、独立して用いられるか、または組み合わせて用いられる。例えば、本発明には、天然型ペプチドとアミノ酸配列が１つ以上異なり、Ｎ末端アミノ酸残基に脱アミノ化されたＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体のいずれに対しても活性化機能を持つペプチドが含まれる。
本明細書におけるアミノ酸は、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ命名法にしたがって次のように略語で記載した。
アラニン Ａ；アルギニン Ｒ；
アスパラギン Ｎ；アスパラギン酸 Ｄ；
システイン Ｃ；グルタミン酸 Ｅ；
グルタミン Ｑ；グリシン Ｇ；
ヒスチジン Ｈ；イソロイシン Ｉ；
ロイシン Ｌ；リシン Ｋ；
メチオニン Ｍ；フェニルアラニン Ｆ；
プロリン Ｐ；セリン Ｓ；
トレオニン Ｔ；トリプトファン Ｗ；
チロシン Ｙ；バリン Ｖ
本発明において、オキシントモジュリン誘導体は、配列番号１のアミノ酸配列でアミノ酸の置換、付加、欠失または翻訳後修飾（例えば、メチル化、アシル化、ユビキチン化、分子内共有結合）され、グルカゴンとＧＬＰ-１受容体をいずれも活性化させることのできる任意のペプチドを含む。前記アミノ酸の置換または付加時には、通常ヒトタンパク質において観察される２０個のアミノ酸だけでなく、非定型的または非自然発生アミノ酸を用いることができる。非定型的アミノ酸の商業的出所には、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ、ＣｈｅｍＰｅｐおよびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが含まれる。これらのアミノ酸が含まれるペプチドと非定型的なペプチド配列は商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＣｏｍｐａｎｙまたはＢａｃｈｅｍまたは韓国のＡｎｙｇｅｎにおいて合成および購入することができる。
具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、下記式（１）のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
Ｒ１-Ｘ１-Ｘ２-ＧＴＦＴＳＤ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｘ６-Ｘ７-Ｘ８-Ｘ９-Ｘ１０-
Ｘ１１-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０-
Ｘ２１-Ｘ２２-Ｘ２３- Ｘ２４-Ｒ２ (式１)
前記式で、
Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジル（ｄｅｓａｍｉｎｏ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、ジメチル-ヒスチジル（Ｎ-ｄｉｍｅｔｈｙｌ-ｈｉｓｔｉｄｙｌ）、β-ヒドロキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ-ｈｙｄｒｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）、４-イミダゾアセチル（４-ｉｍｉｄａｚｏａｃｅｔｙｌ）、β-カルボキシイミダゾプロピオニル（ｂｅｔａ-ｃａｒｂｏｘｙｉｍｉｄａｚｏｐｒｏｐｉｏｎｙｌ）またはチロシンであり、
Ｘ１はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）、ｄ-アラニン、グリシン、Ｓａｒ（Ｎ-メチルグリシン）、セリンまたはｄ-セリンであり、
Ｘ２はグルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ３はロイシンまたはチロシンであり、
Ｘ４はセリンまたはアラニンであり、
Ｘ５はリジンまたはアルギニンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはチロシンであり
Ｘ７はロイシンまたはメチオニンであり、
Ｘ８はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
Ｘ９はグルタミン酸、セリン、α-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、 Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンまたはセリン、または欠失した配列であり、
Ｘ１１はアラニン、アルギニンまたはバリンまたは欠失した配列であり、
Ｘ１２はアラニン、アルギニン、セリンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ１３はリジン、グルタミン、アルギニンまたはα-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、
Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸またはロイシン、または欠失した配列であり、 Ｘ１５はフェニルアラニンまたは欠失した配列であり、
Ｘ１６はイソロイシンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、リジン、グルタミンまたはα-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、
Ｘ１８はトリプトファンまたは欠失した配列であり、
Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシン、セリンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ２０はアラニン、リジン、メチオニン、グルタミンまたはアルギニン、または欠失した配列であり、
Ｘ２１はアスパラギンまたは欠失した配列であり、
Ｘ２２はアラニン、グリシンまたはトレオニン、または欠失した配列であり、
Ｘ２３はシステインまたはリジン、または欠失した配列であり、
Ｘ２４はアラニン、グリシンおよびセリンの組み合わせからなる２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドまたは欠失した配列であり
Ｒ２は、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、
ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）または欠失した配列である（ただし、式（１）のアミノ酸配列が配列番号１と同じである場合は除く）。
野生型のオキシントモジュリンのグルカゴン受容体およびＧＬＰ-１受容体に対する活性を高めるために、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１番目のアミノ酸であるヒスチジンのαカーボンを欠失させた４-イミダゾアセチル、Ｎ末端アミノ基を欠失させたデスアミノ-ヒスチジル、Ｎ末端アミノ基を２つのメチル基で修飾したジメチル-ヒスチジル(Ｎ-ジメチル-ヒスチジル) 、Ｎ末端アミノ基をヒドロキシル基に置換したβ-ヒドロキシイミダゾプロピオニルまたはＮ末端アミノ基をカルボキシル基に置換したβ-カルボキシイミダゾプロピオニルに置換することができる。また、ＧＬＰ-１受容体と結合する部位を疎水性結合とイオン結合を強化させるアミノ酸に置換したりまたはこれらを組み合わせることができる。また、オキシントモジュリン配列の一部配列をＧＬＰ-１のアミノ酸配列またはエキセンデイン-４のアミノ酸配列に置換してＧＬＰ-１受容体の活性を高めることができる。
さらに、オキシントモジュリン配列の一部配列をαへリックスを強化する配列に置換することができる。好ましくは、式（１）のアミノ酸配列の１０番目、１４番目、１６番目、２０番目、２４ 番目、および２８番目のアミノ酸がαへリックスを安定させることで知られているＴｙｒ（４-Ｍｅ）、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（４-Ｍｅ）、Ｐｈｅ（４-Ｃｌ）、Ｐｈｅ（４-ＣＮ）、Ｐｈｅ（４-ＮＯ2)、Ｐｈｅ（４-ＮＨ2)、Ｐｈｇ、Ｐａｌ、Ｎａｌ、Ａｌａ（２-チエニル）またはＡｌａ（ベンゾチエニル）からなるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体に置換されてもよく、挿入されうるαへリックスを安定させるアミノ酸もしくはアミノ酸誘導体の種類および数は限定されない。
好ましくは、アミノ酸配列が1０番と１４番、１２番と１６番、１６番と２０番、２０番と２４番および２４番と２８番の位置のアミノ酸は、それぞれグルタミン酸またはリジンに置換することによって環を形成することができ、挿入される環の数も限定されるものではない。最も好ましくは、前記オキシントモジュリン誘導体は、下記式（１）〜（６）から選択されるアミノ酸配列を有することができる。
具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列にエクセンディンもしくはＧＬＰ-１の配列に置換した下記式（２）のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
Ｒ１-Ａ-Ｒ３ (式２)
他の具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部とエクセンディンまたはＧＬＰ-１の配列の一部を適当なアミノ酸リンカーを介して連結した下記式（３）のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
Ｒ１-Ｂ-Ｃ-Ｒ４ (式３)
さらに、他の具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、オキシントモジュリンのアミノ酸配列の一部をＧＬＰ-１受容体との結合力を高めるアミノ酸に置換、例えば２６番目のＬｅｕをＧＬＰ-１受容体と疎水性結合をするため、疎水性を増加させるアミノ酸であるＩｌｅもしくはＶａｌに置換された下記式（４）のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
Ｒ１-ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ-Ｄ１-Ｄ２-Ｄ３-Ｄ４-Ｄ５-ＬＦＶＱＷ-
Ｄ６-Ｄ７-Ｎ-Ｄ８-Ｒ３ (式４)
さらに、他の具体的な一実施態様において、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、天然のオキシントモジュリンのＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体の活性を高めるためにアミノ酸配列の一部を欠失させたり、挿入したり、他のアミノ酸に置換した下記式（５）のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
Ｒ１-Ｅ１-ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ-Ｅ２-Ｅ３-ＲＡ-Ｅ４-Ｅ５-ＦＶ-Ｅ６-
ＷＬＭＮＴ-Ｅ７-Ｒ５ (式５)
式（２）〜（５）において、Ｒ１は、式（１）で前述したとおりである。
Ａは、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号4１）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）、および
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７）からなる群から選択され、
Ｂは、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号４１）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＴ（配列番号４２）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＡＷＬＫＮＴ（配列番号４３）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４４）、
ＧＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧ（配列番号４５）、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＡＡ（配列番号４６）、
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＭＮＧ（配列番号４７） 、
ＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＲＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷ（配列番号４８）、および
ＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤ（配列番号４９）
からなる群から選択され、
Ｃは、アラニン、グリシンおよびセリンの組み合わせからなる２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドであり、
Ｄ１はセリン、グルタミン酸またはアルギニンであり、
Ｄ２はアルギニン、グルタミン酸またはセリンであり、
Ｄ３はアルギニン、アラニンまたはバリンであり、
Ｄ４はアルギニン、バリンまたはセリンであり、
Ｄ５はグルタミン、アルギニンまたはリジンであり、
Ｄ６はイソロイシン、バリンまたはセリンであり、
Ｄ７はメチオニン、アルギニンまたはグルタミンであり、
Ｄ８はトレオニン、グリシンまたはアラニンであり、
Ｅ１はセリン、Ａｉｂ、Ｓａｒ、ｄ-アラニンまたはｄ-セリンであり、
Ｅ２は、セリンまたはグルタミン酸であり、
Ｅ３は、アルギニンまたはリジンであり、
Ｅ４は、グルタミンまたはリジンであり、
Ｅ５は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
Ｅ６はグルタミン、システインまたはリジンであり、
Ｅ７はシステインまたはリジン、または欠失した配列であり、
Ｒ３は、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）であり、
Ｒ４は、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）またはＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）であり、および
Ｒ５は、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）または欠失した配列である（ただし、式（２）〜（５）のアミノ酸配列が、配列番号１と同じである場合は除く）。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、下記式（６）の新規なペプチドであることが好ましい。
Ｒ１-Ｘ１-Ｘ２-ＧＴＦＴＳＤ-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-Ｘ６-Ｘ７-Ｘ８-Ｘ９-Ｘ１０-
Ｘ１１-Ｘ１２-Ｘ１３-Ｘ１４-Ｘ１５-Ｘ１６-Ｘ１７-Ｘ１８-Ｘ１９-Ｘ２０-
Ｘ２１-Ｘ２２-Ｘ２３- Ｘ２４-Ｒ２ (式６)
Ｒ１はヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジル、４-イミダゾアセチルまたはチロシンであり、
Ｘ１はＡｉｂ（ａｍｉｎｏｓｉｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）、グリシン、セリンまたはｄ-セリンであり、
Ｘ２はグルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ３はロイシンまたはチロシンであり、
Ｘ４はセリンまたはアラニンであり、
Ｘ５はリジンまたはアルギニンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはチロシンであり、
Ｘ７はロイシンまたはメチオニンであり、
Ｘ８はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
Ｘ９はグルタミン酸またはα-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、
Ｘ１０はグルタミン、グルタミン酸、リジンまたはアルギニン、または欠失した配列であり、
Ｘ１１はアラニンまたはアルギニン、または欠失した配列であり、
Ｘ１２はアラニンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ１３はリジン、グルタミン、アルギニンまたはα-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、
Ｘ１４はアスパラギン酸、グルタミン酸またはロイシン、または欠失した配列であり、 Ｘ１５は、フェニルアラニンまたは欠失した配列であり、
Ｘ１６はイソロイシンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ１７はアラニン、システイン、グルタミン酸、グルタミンまたはα-メチルグルタミン酸、または欠失した配列であり、
Ｘ１８は、トリプトファンまたは欠失した配列であり、
Ｘ１９はアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはバリン、または欠失した配列であり、
Ｘ２０はアラニン、リジン、メチオニンまたはアルギニン、または欠失した配列であり、
Ｘ２１は、アスパラギンまたは欠失した配列であり、
Ｘ２２は、トレオニンまたは欠失した配列であり、
Ｘ２３は、システイン、リジンまたは欠失した配列であり、
Ｘ２４は、グリシンからなる２〜１０個のアミノ酸を有するペプチドまたは欠失した配列であり、
Ｒ２は、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３５）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号３６）、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号３７）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤ（配列番号３８）、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＲＹＬＤＫ（配列番号３９）、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＫ（配列番号４０）または欠失した配列である（ただし、前記式（６）のアミノ酸配列が、配列番号１と同じである場合は除く）。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、配列番号２〜３４のペプチドからなる群から選択されたものであることがより好ましく、実施例２-１の表１に記載されたオキシントモジュリン誘導体であることがさらに好ましい。
本発明の一実施例では、それぞれ配列番号２〜３４のアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体を製造し、前記オキシントモジュリン誘導体が天然型オキシントモジュリンに比べて優れたＧＬＰ-１受容体と、グルカゴン受容体活性を示すことを確認した（実施例２）。すなわち、前記の結果から本発明のオキシントモジュリン誘導体は、ＧＬＰ-１受容体およびグルカゴン受容体を活性化させることによって、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療効果を示すことが分かる。
前記本発明のオキシントモジュリン誘導体は、治療学的効能と生体内半減期を向上させるために、様々な重合体を含む結合体の形態で存在する。
本発明の前記結合体は、天然型オキシントモジュリンに比べて効果の持続性が増加しており、前記持続型結合体は天然型オキシントモジュリンのアミノ酸が修飾、置換、付加または欠失することによって製造されたオキシントモジュリンを含み、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような生分解性重合体が結合したオキシントモジュリン、もしくはアルブミン、抗体 、エラスチン、フィブロネクチンまたはキチンなどのポリサッカライド、免疫グロブリン断片のような持続性に優れたタンパク質が結合したオキシントモジュリン、生体内アルブミンとの結合力を有する脂肪酸が結合したオキシントモジュリン、または生分解性ナノ粒子に封入された形態のオキシントモジュリンを含むことができ、本発明で用いられる持続型結合体の種類は限定されない。
好ましくは、前記結合体は、配列番号２〜３４からなる群から選択されたアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が、非ペプチド性重合体を介して連結されたものである。
免疫グロブリンＦｃ領域は、生体内で代謝される生分解性ポリペプチドであるため、薬物のキャリアとしての使用において安全である。免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製、および収率の面において有利である。また、抗体間のアミノ酸配列が異なるのでＦａｂ部分が高い非均質性を示し、それにより物質の同質性が大幅に増加し、血中抗原性の誘発可能性を低くすることができる。
本発明における用語「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、免疫グロブリンの重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除く免疫グロブリンの重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３ （ＣＨ３）を意味し、重鎖不変領域にヒンジ部分を含んでもよい。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等あるいは向上した効果を持つ限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域を除き、重鎖不変領域１（ＣＨ１）および/または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）の一部または全体を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ２および/またはＣＨ３に該当する相対的に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。特に、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、５）１つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列、およびその配列誘導体（変異体）を含む。本発明における用語「アミノ酸配列誘導体」とは、天然アミノ酸配列のうち１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、もしくはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基を修飾するための適当な部位として使用することができる。
また、ジスルフィド結合の形成可能な部位が除去されたり、または天然型ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸残基が除去されたり、あるいは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、様々な種類の誘導体が可能である。さらに、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞障害）部位が除去されることもある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、特許文献１、特許文献２などに開示されている。
活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知となっている（非特許文献３）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ/Ｓｅｒ、Ｖａｌ/Ｉｌｅ、Ａｓｐ/Ｇｌｕ、Ｔｈｒ/Ｓｅｒ、Ａｌａ/Ｇｌｙ、Ａｌａ/Ｔｈｒ、Ｓｅｒ/Ａｓｎ、Ａｌａ/Ｖａｌ、Ｓｅｒ/Ｇｌｙ、Ｔｈｙ/Ｐｈｅ、Ａｌａ/Ｐｒｏ、Ｌｙｓ/Ａｒｇ、Ａｓｐ/Ａｓｎ、Ｌｅｕ/Ｉｌｅ、Ｌｅｕ/ Ｖａｌ、Ａｌａ/ＧｌｕおよびＡｓｐ/ Ｇｌｙ間の交換である。また、場合によっては、Ｆｃ領域はリン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化 、ファルネシル化 、アセチル化およびアミド化などにより修飾されうる。
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどの構造的安定性を増大させた誘導体である。
また、このようなＦｃ領域は、ヒトおよびウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットまたはモルモットなどを含む動物から分離した天然型から得てもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得た組み換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、Ｆｅ領域は、免疫グロブリン全体をヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理することによって天然型免疫グロブリンから得ることができる。免疫グロブリン全体にパパインを処理する場合はＦａｂおよびＦｃ領域に切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ、およびＦ（ａｂ）2断片に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィーなどを用いて、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。好ましくは、ヒト由来のＦｃ領域は微生物から得た組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または脱グリコシル化した形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去は、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去されたることによって得られたＦｃ領域は、最初の補体（Ｃ１ｑ）との結合親和性が著しく低下し、抗体依存性細胞障害または補体依存性細胞障害が減少または除去されるので、生体内での不要な免疫反応を誘発しない。このような点において、薬物のキャリアとしての本発明の目的により適した形態は、脱グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域 、または非グリコシル化された形態の免疫グロブリンＦｃ領域である。
本発明における用語「脱グリコシル化 」とは、酵素で糖部を除去したＦｃ領域を意味し、用語「非グリコシル化」とは、原核生物、好ましくは大腸菌において生産されたグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットおよびモルモットなどの動物由来てあってもよいが、ヒト由来であることが好ましい。
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ、もしくはこれらの混成によるＦｃ領域であってもよい。好ましくは、ヒト血液に最も豊富に存在するタンパク質であるＩｇＧまたはＩｇＭ由来であり、最も好ましくは、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知となっているＩｇＧ由来である。
本発明における用語「組み合わせ」とは、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域をコード化するポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドと連結して、二量体または多量体を形成することを意味する。具体的には、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ ＦｃおよびＩｇＥのＦｃ断片からなる群れから選択される２つ以上の断片から二量体または多量体を形成することができる。
本発明における用語「ハイブリッド」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する。本発明では、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ ＦｃおよびＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなるハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のサブクラスに分けられるが、本発明ではこれらのサブクラスの組み合わせまたはハイブリッドも可能である。好ましくは、ＩｇＧはＩｇＧ２およびＩｇＧ４サブクラスであり、最も好ましくは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能がほとんど無いＩｇＧ４のＦｃ領域である。
すなわち、本発明で薬物キャリアとして使用される最も好ましい免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来のＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、人体で抗原として作用し、その抗原に対する新しい抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を引き起こしうる非ヒト由来のＦｃ領域より好ましい。
本発明における用語「非ペプチド性重合体」とは、２つ以上の反復単位がペプチド結合の代わりに任意の共有結合によって互いに連結した生体適合性重合体を意味する。本発明では、前記非ペプチド性重合体は非ペプチド性リンカーとほとんど同じ意味で使用される。
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択することができ、好ましくは、ポリエチレングリコールである。また、当該分野で既に公知となっている誘導体および当該技術分野で公知の方法により容易に製造できる誘導体も本発明の範囲に含まれる。
従来のインフレームフュージョン法（ｉｎｆｒａｍｅ ｆｕｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって得られる融合タンパク質において使用されるペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待した程十分に得られないことである。しかし、本発明では、タンパク質分解酵素に抵抗性を持つ重合体を用いて、キャリアと類似したペプチドの血中半減期を維持することができる。したがって、本発明で使用できる非ペプチド性重合体は前述の機能、すなわち生体内タンパク質分解酵素に抵抗性を持つ重合体であれば制限なく使用できる。非ペプチド性重合体の分子量の範囲 は1〜１００ｋＤａであり、好ましくは1〜２０ ｋＤａである。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域に連結される本発明の非ペプチド性重合体は、一種類の重合体、もしくは異なる種類の重合体の組み合わせであってもよい。
本発明に使用される非ペプチド性重合体は、免疫グロブリンＦｃ領域およびタンパク質薬物と結合できる反応基を有することができる。前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、反応アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基およびスクシンイミド誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルプロピオン酸塩、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、またはスクシンイミジル炭酸塩であってもよい。特に、前記非ペプチド性重合体が両末端にアルデヒド反応基を有する場合、非特異的反応を最小化することができ、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンが非ペプチド性重合体の両末端にそれぞれ効果的に結合することができる。アルデヒド結合による還元性アルキル化によって生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりもはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低ｐＨでＮ末端に選択的に結合し、ｐＨ９．０のような高ｐHにおいてリジン残基と共有結合を形成されうる。
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は互いに同一、または異なってもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体は、一方の末端にマレイミド基を、もう一方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基を有してもよい。両末端にヒドロキシ反応基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合には、公知の化学反応によって前記ヒドロキシ基を前記の様々な反応基で活性化したり、商業的に入手可能な改変した反応基を有するポリエチレングリコールを用いて、本発明の持続型結合体を製造することができる。
本発明の結合体は、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびオキシントモジュリン誘導体のアミン基またはチオール基に結合するものであってもよい。
本発明の前記非ペプチド性重合体は、両末端に免疫グロブリンＦｃ領域またはタンパク質薬物のいずれかに連結できる反応基を有する。前記反応基は、特にこれらに限定されないが、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド誘導体（スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシまたはスクシンイミジル炭酸塩）などであってもよい。
前記非ペプチド性重合体の両末端の反応基は、互いに同一または異なってもよい。例えば、前記非ペプチド性重合体は、一方の末端にマレイミド基を有し、もう一方の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基またはブチルアルデヒド基などを有してもよい。例えば、前記の非ペプチド性重合体が一方の末端にアルデヒド基の反応基を有し、他方の末端にマレイミド基の反応基を有する場合、非特異的反応を最小化することができ、非ペプチド性重合体の両末端に生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンが効果的に結合される。本発明の一実施態様によれば、プロピオンアルデヒドを単独で含むかまたはマレイミド基とアルデヒド基を共に含む非ペプチド性重合体のＰＥＧを用いて、オキシントモジュリンまたはその誘導体を免疫グロブリンＦｃ領域に共有結合によって連結することによって、結合体を合成した。
本発明の医薬組成物は、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療に使用することができる。
本発明の用語「予防」とは、標的疾患の発症を抑制したり、遅延させる全ての行為を意味する。本発明における「予防」とは、本発明のオキシントモジュリン誘導体を投与することによって、血中総コレステロールおよび低密度コレステロール値が増加し、高密度コレステロール値が減少する高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の発症を抑制したり、遅延することを意味する。
本発明の用語「治療」とは、発生した病気の症状を軽減、改善または緩和させる全ての行為を意味する。本発明における用語「治療」とは、本発明のオキシントモジュリン誘導体を投与することによって、血中総コレステロール値および低密度コレステロールが増加し、高密度コレステロール値が減少して高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の軽減、改善または緩和されることを意味する。
本発明の用語「高脂血症」とは、血液内の遊離コレステロール、コレステロールエステル、リン脂質、中性脂肪などの脂肪が異常に増加した状態を意味する。高脂血症は、一般的に、それ自体が特定の症状を示すものではないが、血液内の過剰な脂質が血管壁に付着して血管のサイズを狭め、炎症反応によるアテローム性動脈硬化を引き起こす。これにより、冠状動脈性心臓病、脳血管疾患、末梢血管の閉鎖などが発症することがある。
したがって、本発明の医薬組成物は、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症だけではなく、冠状動脈性心臓病、脳血管疾患または末梢血管の閉塞などの治療にも使用できる。
前記「脂肪肝疾患」とは、肝重量における脂肪の占める割合が５％以上である状態を意味する。本発明において、脂肪肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、アルコール性脂肪肝疾患、栄養性脂肪肝疾患、飢餓性脂肪肝疾患、肥満性脂肪肝疾患、糖尿病性脂肪肝疾患または脂肪肝炎をすべて含む。前記非アルコール性脂肪肝疾患は、原発性と続発性による非アルコール性脂肪肝疾患の両方を含むが、原発性高脂血症、糖尿病または肥満から引き起こされる非アルコール性脂肪肝疾患であることが好ましい。
また、本発明における非アルコール性脂肪肝疾患は、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、およびこれらの疾患の進行によって生じる肝繊維症と肝硬変を含む。
前記動脈硬化症は、主に血管の最も内側を覆っている内膜にコレステロールが沈着して内皮細胞の増殖が起こることから、アテローム（ａｔｈｅｒｏｍａ）が形成される血管疾患をいう。
本発明の一実施例では、ポリエチレングリコールを用いて本発明によるオキシントモジュリン誘導体と免疫グロブリンＦｃ領域が共有結合的に連結した持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体を製造した後、これを高脂肪の飼料の摂取よって高脂血症が誘導されたハムスター動物モデルに投与した。その結果、本発明による持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体を投与した群において、高脂血症が誘導された動物モデルに比べて血中中性脂肪値が大幅に減少し（図１）、血中総コレステロール値が大幅に減少し（図２）、血中低密度コレステロール値（ＬＤＬコレステロール）が顕著に減少することを確認した。さらに、本発明による持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体を投与した群では、高脂血症が誘導された動物モデルに比べて血中の高密度コレステロール値（ＨＤＬコレステロール）が大幅に増加し（図４）、血中ＨＤＬコレステロール/ＬＤＬコレステロールの割合が有意に増加することが確認できた（図５）。
さらに、本発明による持続型オキシントモジュリン誘導体結合体は、市販の持続型ＧＬＰ-１アナログであるＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)に比べて血中総コレステロール値がさらに減少し（図６）、血中ＬＤＬコレステロール値と中性脂肪の値が減少することが確認できた（図7）。さらに、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体の投与時の血中ＨＤＬコレステロール値およびＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合がＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)より増加することが確認できた（図８および図９）。特に、配列番号２５とＦｃとの持続型結合体は、ＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)に比べ血中ＨＤＬ値およびＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合が顕著に増加した。
すなわち、本発明によるオキシントモジュリン誘導体は血中脂質の値を減少させるので、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療薬として使用することができる 。また、本発明の結合体は、天然型オキシントモジュリンに比べてＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体を活性する優れた能力を持ち、体内で血中半減期を増加させて長時間生体内で活性を維持することができる。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、脂肪分解に関与する酵素の活性を調節する因子（プロテインキナーゼＣ-ζ、ＰＫＣ-ζ）の活性を増加させることができ、脂肪分解に関与する因子（Ｇｌｕｔ２）の発現を増加させて、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を予防または治療することができるが、本発明の範囲が前記作用機序に限定されるわけではない。
本発明の医薬組成物は、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症に対して予防または治療効果を示す薬剤をさらに含んでもよい。特に、本発明の医薬組成物は、本発明の誘導体と組み合わせて投与するために、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療薬として公知となっている薬剤をさらに含むことができる。
したがって、本発明の組成物は、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を予防または治療するために単独投与、あるいは他の薬剤と併用して投与してもよい。
本発明における用語「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味する。本発明の誘導体は、薬物が標的組織に到達できるものであれば、いなかる一般的経路を通じて投与されてもよい。具体的には、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与または直腸内投与などが挙げられるが、これに限定されるものではない。しかし、経口投与時にペプチドが消化されるため、経口用組成物は活性成分をコーティングしたり、胃の中での分解から保護されるように製剤化することが好ましい。本発明の医薬組成物は注射剤の形で投与することが好ましく、さらに、活性成分を標的細胞に移動させ得る任意の装置によって投与できる。
本発明のオキシントモジュリン誘導体を含む医薬組成物は、薬剤学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。薬剤学的に許容される担体は、経口投与には、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、着色剤、香味剤などを用いることができる。注射剤の場合は、薬剤学的に許容される担体は、緩衝剤、保存剤、鎮痛剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを用いることができる。
本発明の医薬組成物は、前述したような薬剤学的に許容される担体を用いて様々な剤形に製造することができる。例えば、経口投与には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができる。注射剤の場合、単位投与量アンプルあるいは多回投与容器の形態に製造することができる。また、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油などが挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
本発明の医薬組成物の投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別および体重、疾患の重症度などの様々な要因と共に、活性成分の種類によって決定される。
本発明の医薬組成物は、生体内持続性および力価に優れるので、その投与回数および頻度を著しく減らすことができる。
他の実施態様では、本発明はオキシントモジュリン誘導体を個体に投与するステップを含む、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を予防または治療する方法を提供する。
前記オキシントモジュリン誘導体、高脂血症、脂肪肝疾患および動脈硬化症は、前述した通りである。
本発明における用語「個体」とは、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の疑いのある個体である。具体的には、前記疾患が発症しているか、あるいは発症リスクのあるヒト、ラットおよび家畜を含む哺乳動物を意味する。また、本発明のオキシントモジュリン誘導体で治療可能ないかなる個体であってもよい。
本発明の治療方法は、結合体を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含むことができる。前記組成物の１日総投与量は医師による適切な医学的判断によって決定され、１回または数回投与できる。しかし、本発明の目的に鑑みて、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、他の製剤と共に使用されているか否かによる具体的な組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別および食餌、投与時間および経路、組成物の分泌率、治療期間、他の薬剤と組み合わせたり、または他の薬剤と同時に使用されているかなど、医薬分野によく知られている様々な要素によって異なってもよい。
さらに、他の態様において、本発明はオキシントモジュリン誘導体の結合体の製造方法を提供する。
前記製造方法は、
（１） アルデヒド、マレイミドまたはスクシンイミド反応基を有する非ペプチド性重合体をオキシントモジュリン誘導体ペプチドのアミン基またはチオール基に共有結合で連結するステップ、
（２）ステップ（１）の反応混合物からアミノ末端以外の位置に非ペプチド性重合体が共有結合されたオキシントモジュリン誘導体ペプチドを分離するステップ、および
（３） 連結された非ペプチド性重合体のもう一方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合で連結して、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびオキシントモジュリン誘導体ペプチドと結合したペプチド結合体を生成するステップを含むことができる。
より具体的には、前記製造方法は、
（１）各末端にアルデヒド反応基とマレイミド反応基を有する非ペプチド性重合体をそれぞれオキシントモジュリン誘導体のシステイン残基に共有結合で連結するステップ、
（２）ステップ（１）の反応混合物からシステイン残基に非ペプチド性重合体が共有結合されたオキシントモジュリン誘導体を含む結合体を分離するステップ、および
（３） 非ペプチド性重合体のもう一方の末端に免疫グロブリンＦｃ領域を共有結合で連結して、非ペプチド性重合体の両末端がそれぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびオキシントモジュリン誘導体ペプチドと連結されたペプチド結合体を生成するステップを含むことができる。
さらに、他の態様では、本発明は、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための薬物の製造におけるオキシントモジュリン誘導体の用途を提供する。
本発明のオキシントモジュリン誘導体は、天然型のオキシントモジュリンに比べてＧＬＰ-１受容体およびグルカゴン受容体に対して高い活性能力を有しており、高脂肪の飼料により増加された血中総コレステロール、低密度コレステロールおよび中性脂肪を減少させ、高密度コレステロール値ならびに、高密度コレステロール/低密度コレステロールの割合を増加させる効果を持つ。したがって、本発明のオキシントモジュリン誘導体は、高脂血症およびこれに関連する疾患の治療において有効に用いることができる。
高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中中性脂肪の値の変化を示すグラフである（＃；一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中総コレステロール値の変化を示すグラフである（＃;一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（Ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（＃；一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１）。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９５％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０５））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中総コレステロール値の変化を示すグラフである（***；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＬＤＬコレステロール値を示すグラフである（***;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９５％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０５））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体の投与による血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（**；高脂肪の飼料群に比べて９９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中中性脂肪の値の変化を、高脂肪の飼料ハムスターを基準として示すグラフである（***;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。
以下、下記の実施例により本発明をより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらに限定されるものではないと理解されるべきである。
実施例1： ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性のための細胞株の生産
実施例１-１：ＧＬＰ-１に対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の生産
ヒトＧＬＰ-１受容体遺伝子のｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ. ＵＳＡ）のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）に該当する部分を鋳型として、ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位とＥｃｏＲＩ切断部位をそれぞれ含む正方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行って、ＰＣＲ産物を得た。
正方向プライマー：５’-ＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＴＴＣＧＡＡＡＴＡＣ-３ ‘（配列番号５０）
逆方向プライマー：５’-ＧＡＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＴＡＧ-３ ‘（配列番号５１）
前記ＰＣＲ産物を公知の動物細胞発現ベクターであるｘ０ＧＣ/ｄｈｆｒにクローニングして、組み換えベクターｘ０ＧＣ/ＧＬＰ-１Ｒを製造した。
前記製造した組み換えベクターｘ０ＧＣ/ＧＬＰ-１ＲをＤＭＥＭ/Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞株にリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を用いて導入し、形質転換体を得た。前記形質転換体を１ｍｇ/ｍＬ Ｇ４１８および１０ｎＭメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒａｘａｔｅ）を含む選択培地で選択培養した後、そこからモノクローナル細胞株を選別した。それから、ＧＬＰ-１に対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株をモノクローナル細胞株から最終的に選別した。
実施例１-２：グルカゴンに対してｃＡＭＰ反応を示す細胞株の生産
ヒトグルカゴン受容体遺伝子のｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ. ＵＳＡ）からＯＲＦに（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）対応する部分を鋳型として、ＥｃｏＲＩ切断部位とＸｈｏＩ切断部位をそれぞれ含む正方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を得た。
正方向プライマー：５’-ＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＧＡＣＣＧＴＣＣＣＣＣＣＧＴＡＣＴＴＡＡＧＧＣＣ-３ ‘（配列番号５２）
逆方向プライマー：５’-ＣＴＡＡＣＣＧＡＣＴＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣ-３ ‘（配列番号５３）
前記ＰＣＲ産物を公知の動物細胞発現ベクターであるｘ０ＧＣ/ｄｈｆｒにクローニングして、組み換えベクターｘ０ＧＣ/ＧＣＧＲを製造した。
前記製造した組み換えベクターｘ０ＧＣ/ＧＣＧＲをＤＭＥＭ/Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）培地で培養したＣＨＯ ＤＧ４４細胞株にリポフェクタミンを用いて導入することによって形質転換体を得た。前記形質転換体を１ｍｇ/ｍＬ Ｇ４１８および１０ｎＭメトトレキサートを含む選択培地で選択培養した後、それからモノクローナル細胞株を選別した。それから、グルカゴンに対して優れた濃度依存的ｃＡＭＰ反応を示す細胞株をモノクローナル細胞株から最終的に選別した。
実施例２：オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
実施例２-１：オキシントモジュリン誘導体の合成
オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を測定するために、下記アミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体を合成した（表１）。
オキシントモジュリンおよびオキシントモジュリン誘導体

前記表１において太字で示されたアミノ酸は、環の形成を意味し、Ｘと表記されたアミノ酸は、非天然型アミノ酸であるα-メチルグルタミン酸を意味する。また、ＣＡは４-イミダゾアセチル、ＤＡはデスアミノ-ヒスチジル、Ａｉｂはアミノイソブチル酸、（ｄ）Ｓはd-Ｓｅｒｉｎｅを意味する。
実施例２-２：オキシントモジュリン誘導体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性の測定
抗肥満ペプチドの効果を測定するために、前記実施例１-１と１-２で製造した形質転換体を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞活性を測定した。
前記各形質転換体は、ＣＨＯ（ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）にヒトＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体遺伝子をそれぞれ発現するように形質転換されたものであり、ＧＬＰ-１とグルカゴンの活性を測定するのに適しているため、各オキシントモジュリン誘導体の活性をそれぞれの形質転換体を用いて測定した。
具体的には、前記各形質転換体を、１週間に２回もしくは３回継代培養し、９６ウェルプレートに、各ウェル当り1×１０5個の前記細胞を分注し、２４時間培養した。
前記培養された細胞をＫＲＢ緩衝液で洗浄し、１ｍＭ ＩＢＭＸを含むＫＲＢ緩衝液４０ｍｌに懸濁し、その後５分間室温に静置した。オキシントモジュリン（配列番号１）またはオキシントモジュリン誘導体（配列番号２-６、８、１０-１３、１７、１８、２３-２５、２７、２８、および３２〜３４）をそれぞれ１０００ｎＭから５倍ずつ０．０２ｎＭまで連続的に希釈し、これを４０ｍｌずつ前記細胞に添加した後、ＣＯ2培養器にて３７℃で１時間培養した。次に、細胞溶解緩衝液を２０ｍｌずつ加えて細胞を溶解させ、前記細胞溶解物をｃＡＭＰ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を使用してｃＡＭＰ濃度を測定した。測定の結果からＥＣ50値を算出した後、相互比較した（表２）。
前記表２に示されるように、オキシントモジュリン誘導体は配列番号１のオキシントモジュリンに比べて、ＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体活性において優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示している。
オキシントモジュリンはＧＬＰ-１受容体とグルカゴン受容体の活性化により、高脂血症、脂肪肝疾患、動脈硬化症などの治療に効果があることが知られている。本発明によるオキシントモジュリン誘導体は、天然型オキシントモジュリンに比べてＧＬＰ-１受容体およびグルカゴン受容体を活性化する優れた活性を有するので、天然のオキシントモジュリンの代わりに、高脂血症、高脂血症に関連する脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療に用いることができる。
実施例３：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃを含む結合体の製造（免疫グロブリンＦｃ領域結合オキシントモジュリン誘導体２３）
ＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧ（ＮＯＦ., Ｊａｐａｎ）をオキシントモジュリン誘導体（配列番号２４）のアミノ酸配列２４番のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）とＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ/ｍｌとし、室温で３時間反応させた。この際、反応はグアニジン１Ｍを含んだ５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）において行われた。反応終了後、前記反応液はＳＯＵＲＣＥ Ｓを使用してシステインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ、流速：２．０ｍ/分、勾配：Ａ０屋ずるし→１００％ ５０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０＋４５％エタノール、Ｂ：Ａ +１Ｍ ＫＣｌ））。
次に、前記精製されたモノペギル化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃを、モル比１：５、タンパク質濃度を２０ｍｇ/ｍｌとし、４℃で１６時間反応させた。反応液は、還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）において行われた。反応終了後、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ、流速：２．０ｍｌ/分、勾配：Ａ０→４％ １分 Ｂ→２０％ ８０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５、Ｂ：Ａ +１Ｍ ＮａＣｌ））とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ、流速：２．０ｍｌ/分、勾配：Ｂ０→１００％１００分 Ａ、（Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５、Ｂ：Ａ +１．１Ｍ ＡＳ））を使用して、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃを含む結合体を精製した。
実施例４：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃを含む結合体の製造（免疫グロブリンＦｃ領域の結合オキシントモジュリン誘導体２５）
ＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧをオキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）のアミノ酸配列３０番のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）とＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ/ｍｌとし、室温で３時間反応させた。この際、反応は１Ｍグアニジンを含む５０ｍのＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）において行われた。反応終了後、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｓを使用して、システインにモノペギル化オキシントモジュリン誘導体を精製した（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ S、流速：２．０ｍｌ/分、勾配：Ａ０→１００％ ５０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０＋４５％エタノール、Ｂ：Ａ +１Ｍ ＫＣｌ））。
次に、前記精製されたモノペギル化オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃをモル比１：５、タンパク質の濃度を２０ｍｇ/ｍｌとし、４℃で１６時間反応させた。反応液は、 還元剤として２０ｍＭ ＳＣＢが添加された１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）において行われた。反応終了後、前記反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ精製カラム（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ １５Ｑ、流速：２．０ｍｌ/分、勾配：Ａ０→４% １分 Ｂ→２０％ ８０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.５、Ｂ：Ａ +１Ｍ ＮａＣｌ））とＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ精製カラム（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ ＩＳＯ、流速：２．０ｍｌ/分、勾配：Ｂ０→１００％ １００分 Ａ、（Ａ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ ７.５、Ｂ：Ａ +１．１Ｍ ＡＳ））を使用して、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５）と免疫グロブリンＦｃを含む結合体を精製した。
実施例５：持続型オキシントモジュリンが高脂血症モデルハムスターの脂質減少に及ぼす影響
実施例５-１：実験動物の分類
８週齢の雄ハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ、１２０-１３０ｇ）は、中国のＶｉｔａｌ Ｒｉｖｅｒ Ｃｈｉｎａから購入した。ハムスターは血中脂質プロファイルが、他のげっ歯類とは異なりヒトと類似しており、高脂肪の食餌に敏感な動物として知られている。
前記動物は、滅菌された高脂肪の飼料 （トウモロコシ油１１．５％、ココナッツオイル１１．５％、コレステロール０．５％、およびデオキシコーツ酸塩０.２５％を含むＰｕｒｉｎａ ５００１; Ｄｙｅｔｓ 、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）または標準的なげっ歯類食餌（ｌｏｗ ｆａｔ、２０１８; Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の供給を受け、自由給餌させた。通常の食餌群には、ろ過した後に紫外線殺菌された水道水を自由摂取させ、高脂肪の飼料群は１０％フルクトースを給水ボトルで自由摂取させた。ＧＬＰ施設基準に適合した飼育室で、明１２時間/暗１２時間のサイクル（午前６時点灯-午後６時消灯）を維持し、動物の飼育標準ガイドラインに沿って管理した。以後、３週間の高脂血症誘導期間をおいて薬物投与を開始し、動物は下記のように４つの群（ｎ＝６）に分けられた（表３）。
具体的には、１群（正常群）、通常の飼料を摂取させた群であり、薬物投与はタルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）５ｍｌ/ｋｇを週1回以上皮下投与した。
２群（高脂血症誘導群）は高脂肪の飼料を摂取させて高脂血症を誘導した後、タルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ）５ｍｌ/ｋｇを週１回以上皮下投与した。
３群（高脂血症誘導群＋配列番号２５-Ｆｃ結合体３.２５ｎｍｏｌ/ｋｇ投与群）は高脂肪の飼料を摂取させ、高脂血症を誘導した後、実施例４で製造した配列番号２５-Ｆｃ結合体を、３.２５ｎｍｏｌ/ｋｇで、週１回５ｍｌ/ｋｇを注射により皮下投与した。
４群（高脂血症誘導群＋配列番号２３-Ｆｃ結合体８．９６ｎｍｏｌ/ｋｇ投与群）は高脂肪の飼料を摂取させ、高脂血症を誘導した後、実施例３で製造した配列番号２３-Ｆｃ結合体を８．９６ｎｍｏｌ/ｋｇで、週１回５ｍｌ/ｋｇを注射により皮下投与した。
各群（ｎ＝６）いずれも生理食塩水または薬物を２週間 投与した後、脂質減少に及ぼす影響について分析した。
実施例５-２：持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体が脂質減少に及ぼす影響についての分析
本発明による持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体がハムスターの脂質減少に及ぼす影響を調べるために、次のような実験を行った。前記実施例５-１で分類した持続型オキシントモジュリン誘導体の投与または非投与ハムスターの血液を採取して血液内の脂質含有量を分析した（ＨＩＴＡＣＨＩ７０２０を使用）。分析結果は図１〜５に示した。
図１〜５は、血中中性脂肪濃度の変化（図１）、血中総コレステロール濃度の変化（図２）、血中ＬＤＬコレステロール濃度の変化（図３）、血中ＨＤＬコレステロール濃度の変化（図４）、血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合の変化（図５）を示す。前記で得られた結果は、統計処理して平均値と平均値の標準誤差を計算した。各実験群間（ｎ＝６）の有意性検定は、一元配置分散分析（ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）のダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ‘ｓ ｔｅｓｔ）を用いて統計処理した後、p の値が０．０５よりも小さい場合（p<０．０５)、統計的に有意であると判断される。
具体的には、血中の中性脂肪濃度を測定した結果、高脂肪の飼料を摂取したハムスターの場合、中性脂肪の量が有意に増加したが、持続型オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）の投与時には、中性脂肪が有意に減少することが確認された（図１）。
血中総コレステロールの量を測定した結果、高脂肪の飼料を摂取したハムスターの場合、血中総コレステロールの量が有意に増加したが、持続型オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）の投与時には、血中総コレステロール値が有意に減少することが確認された（図２）。
血中ＬＤＬコレステロール値を測定した結果、高脂肪の飼料を摂取したハムスターでは血中ＬＤＬコレステロール値は有意に増加したが、持続型オキシントモジュリン誘導体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）の投与時には、血中ＬＤＬコレステロール値が有意に減少することが確認された（図３）。
血中ＨＤＬコレステロールの量を測定した結果、持続型配列番号２５-Ｆｃ結合体、および配列番号２３-Ｆｃ結合体の投与群で高脂肪の飼料を摂取したハムスター群に比べ、血中ＨＤＬコレステロール値が有意に増加することが確認された（図４）。
血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合を測定した結果、持続型配列番号２５-Ｆｃ結合体、および配列番号２３-Ｆｃ結合体の投与群で高脂肪の飼料を摂取したハムスター群に比べ、血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合が有意に増加することが確認された（図５）。
前記の結果から、ＰＥＧによって免疫グロブリンＦｃ領域のオキシントモジュリン誘導体が共有結合された本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体は、血中の中性脂肪、低密度（ＬＤＬ）コレステロールの蓄積を防止することによって、高脂血症またはこれに関連する脂肪肝疾患、もしくは動脈硬化症の治療に有効に使用できることを見出した。
実施例６：公知の持続型ＧＬＰ-１アナログおよび持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体の効果についての分析
ＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)は、持続型グルカゴン様ペプチド-1（ＧＬＰ-１）であり、現在糖尿病治療薬として市販されており、肥満治療効果とＨＤＬコレステロール値の増加効果が知られている。
オキシントモジュリン誘導体の結合体と公知となっている前記ＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)との脂質減少効果を比較した。
前記実施例５で分類されたとおり、ハムスターは正常なハムスター群と高脂肪の飼料を摂取させた群に分けた。正常なハムスター群には、ＤＰＢＳ５ｍｌ/ｋｇを週1回以上皮下投与した。高脂肪の飼料を摂取させたハムスター群は、ＤＰＢＳ５ｍｌ/ｋｇを週1回以上皮下投与した群、ＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)を３５．５ｎｍｏｌ/ｋｇで週１回皮下投与した群、配列番号２５-Ｆｃ結合体を３.２５ｎｍｏｌ/ｋｇで投与した群および配列番号２３-Ｆｃ結合体を８．９６ｎｍｏｌ/ｋｇで投与した群に分け、血液内の脂質含量を分析した。
その結果、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）投与時、市販のＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)よりも、血中総コレステロールが減少しており（図６）、血中ＬＤＬコレステロールの量がさらに減少したことを確認した（図７）。
また、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）投与時の血中ＨＤＬコレステロール値とＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合がＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)よりも、さらに増加することを確認した（図８および図９）。特に、持続型配列番号２５-Ｆｃ結合体はＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)よりも、血中ＨＤＬとＨＤＬ/ＬＤＬコレステロールの割合が有意に増加した。
また、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体の結合体（配列番号２５-Ｆｃ結合体または配列番号２３-Ｆｃ結合体）の投与時には、血中中性脂肪の値がＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)より、さらに減少していることが分かる。
前記結果から、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体は、脂質減少効果が公知となっているＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)と同等か、またはそれ以上の優れた脂質減少効果を示すことから、前記結合体が高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療薬として有効に使用し得ることが分かる。
高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中中性脂肪の値の変化を示すグラフである（＃；一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中総コレステロール値の変化を示すグラフである（＃;一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（Ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（＃；一般飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．００１）、*;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１）。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９９％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．０１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへの持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９５％の信頼性の範囲内で有意な増加を示す（ｐ<０．０５））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中総コレステロール値の変化を示すグラフである（***；高脂肪の飼料群に比べて９９．９％信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＬＤＬコレステロール値を示すグラフである（***;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中ＨＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（*；高脂肪の飼料群に比べて９５％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０５））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体の投与による血中ＨＤＬ/ＬＤＬコレステロール値の変化を示すグラフである（**；高脂肪の飼料群に比べて９９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．０１））。 高脂肪の飼料によって誘導された高脂血症ハムスターへのＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)または持続型オキシントモジュリン誘導体投与による血中中性脂肪の値の変化を、高脂肪の飼料ハムスターを基準として示すグラフである（***;高脂肪の飼料群に比べて９９．９％の信頼性の範囲内で有意な減少を示す（ｐ<０．００１））。
実施例３：オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）と免疫グロブリンＦｃを含む結合体の製造（免疫グロブリンＦｃ領域結合オキシントモジュリン誘導体２３）
ＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧ（ＮＯＦ., Ｊａｐａｎ）をオキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）のアミノ酸配列２４番のシステイン残基にペグ化するために、オキシントモジュリン誘導体（配列番号２３）とＭＡＬ-１０Ｋ-ＡＬＤ ＰＥＧのモル比を１：３、タンパク質の濃度を３ｍｇ/ｍｌとし、室温で３時間反応させた。この際、反応はグアニジン１Ｍを含んだ５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）において行われた。反応終了後、前記反応液はＳＯＵＲＣＥ Ｓを使用してシステインにモノペグ化されたオキシントモジュリン誘導体を精製した（ｃｏｌｕｍｎ：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ、流速：２．０ｍ/分、勾配：Ａ０→１００％ ５０分 Ｂ（Ａ：２０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０＋４５％エタノール、Ｂ：Ａ +１Ｍ ＫＣｌ））。
前記結果から、本発明の持続型オキシントモジュリン誘導体結合体は、脂質減少効果が公知となっているＶＩＣＴＯＺＡ(登録商標)と同等か、またはそれ以上の優れた脂質減少効果を示すことから、前記結合体が高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の治療薬として有効に使用し得ることが分かる。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕オキシントモジュリン誘導体を有効成分として含む高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物。
〔２〕前記オキシントモジュリン誘導体が、配列番号２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、前記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記オキシントモジュリン誘導体が、免疫グロブリン断片、抗体、エラスチン、アルブミン、フィブロネクチンからなる群から選択されたものに連結した結合体の形態である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔４〕前記結合体は、配列番号２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体が非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものである、前記〔３〕に記載の組成物。
〔５〕前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、 ポリ乳酸（ＰＬＡ）、 ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、前記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびオキシントモジュリンのアミン基またはチオール基に連結する、前記〔４〕に記載の組成物。
〔７〕前記組成物が、高脂血症、脂肪肝疾患、もしくは動脈硬化症の予防または治療効果を示す薬学的製剤をさらに含む、前記〔１〕に記載の組成物。
〔８〕前記脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪肝疾患、栄養性脂肪肝疾患、飢餓性脂肪肝疾患、肥満性脂肪肝疾患、糖尿病性脂肪肝疾患または脂肪性肝炎である、前記〔１〕に記載の組成物。
〔９〕前記非アルコール性脂肪肝疾患が、高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、前記〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕前記非アルコール性脂肪肝疾患が、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、肝繊維症および肝硬変症からなる群から選択される、前記〔８〕に記載の組成物。
〔１１〕オキシントモジュリン誘導体を個体に投与するステップを含む、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を予防または治療する方法。
〔１２〕高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための医薬の製造におけるオキシントモジュリン誘導体の用途。

Claims (12)

  1. オキシントモジュリン誘導体を有効成分として含む高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための組成物。
  2. 前記オキシントモジュリン誘導体が、配列番号２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記オキシントモジュリン誘導体が、免疫グロブリン断片、抗体、エラスチン、アルブミン、フィブロネクチンからなる群から選択されたものに連結した結合体の形態である、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記結合体は、配列番号２〜３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するオキシントモジュリン誘導体が非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものである、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、 ポリ乳酸（ＰＬＡ）、 ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記非ペプチド性重合体の両末端が、それぞれ免疫グロブリンＦｃ領域およびオキシントモジュリンのアミン基またはチオール基に連結する、請求項４に記載の組成物。
  7. 前記組成物が、高脂血症、脂肪肝疾患、もしくは動脈硬化症の予防または治療効果を示す薬学的製剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪肝疾患、アルコール性脂肪肝疾患、栄養性脂肪肝疾患、飢餓性脂肪肝疾患、肥満性脂肪肝疾患、糖尿病性脂肪肝疾患または脂肪性肝炎である、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記非アルコール性脂肪肝疾患が、高脂血症、糖尿病または肥満から発生する、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記非アルコール性脂肪肝疾患が、単純性脂肪肝、非アルコール性脂肪肝炎、肝繊維症および肝硬変症からなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
  11. オキシントモジュリン誘導体を個体に投与するステップを含む、高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症を予防または治療する方法。
  12. 高脂血症、脂肪肝疾患または動脈硬化症の予防または治療のための医薬の製造におけるオキシントモジュリン誘導体の用途。
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