BR112015001596B1 - Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo e uso de um derivado de oxintomodulina - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE HIPERLIPIDEMIA QUE COMPREENDE OXINTOMODULINA. A presente invenção diz respeito a uma composição para a prevenção e para o tratamento de hiperlipidemia, doença do fígado gordo ou arteriosclerose, a qual compreende um derivado de oxintomodulina enquanto ingrediente ativo. O derivado de oxintomodulina tem uma aptidão elevada para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon em comparação com a oxintomodulina nativa e possui o efeito de reduzir os níveis de colesterol total, colesterol de baixa densidade e triglicéridos no sangue, os quais tinham sido aumentados por uma dieta com elevado teor em gordura, e de aumentar os níveis de colesterol de elevada densidade e a proporção entre colesterol de elevada densidade/colesterol de baixa densidade. Assim, o derivado de oxintomodulina pode ser utilizado com eficácia para o tratamento de hiperlipidemia e doenças associadas.

Description

Campo técnico
[001] A presente invenção diz respeito a uma composição para a prevenção e para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, a qual compreende um derivado de oxintomodulina enquanto ingrediente ativo; e um método para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose utilizando a composição.
Técnica anterior
[002] Em anos recentes, na Coréia, a ingestão de gorduras provenientes de alimentos tem aumentado devido ao crescimento econômico e à ocidentalização dos hábitos alimentares e doenças metabólicas, tais como hiperlipidemia, diabetes, hipertensão, arteriosclerose e doença hepática gordurosa, as quais são provocadas por falta de exercício, tem aumentado.
[003] A hiperlipidemia diz respeito a uma patologia associada a níveis elevados de lípidos, tais como colesterol livre, ésteres de colesterol, fosfolípidos e triglicéridos, no sangue. A hiperlipidemia pode aparecer sob três formas: (1) hipercolesterolemia, (2) hipertrigliceridemia e (3) hiperlipidemia combinada (hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia). De um modo geral, a hiperlipidemia é classificada em hiperlipidemia primária e hiperlipidemia secundária. De um modo geral, a hiperlipidemia primária é provocada por defeitos genéticos, ao passo que a hiperlipidemia secundária é provocada por várias condições patológicas, fármacos e hábitos alimentares. Além disso, a hiperlipidemia também é provocada por uma combinação de causas primárias e secundárias de hiperlipidemia. Como critério para o diagnóstico de hiperlipidemia, um nível de colesterol total de 220 mg/dl ou superior e um nível de triglicéridos de 150 mg/dl ou superior, são normalmente utilizados.
[004] Existem várias formas de colesterol que ocorrem naturalmente em mamíferos. Sabe-se que o colesterol de baixa densidade (LDL) é prejudicial para a saúde e sabe-se que um aumento no colesterol LDL aumenta o risco de doença cardíaca (Assman et al., Am. J. Card, 1996). Além disso, o colesterol de elevada densidade (HDL) é considerado como colesterol bom e é essencial para a saúde, uma vez que previne a aterosclerose e semelhantes.
[005] Embora a hiperlipidemia não apresente sintomas específicos por si própria, os lípidos em excesso no sangue aderem às paredes dos vasos sanguíneos reduzindo o tamanho dos vasos sanguíneos e provocando aterosclerose através de reações inflamatórias. Por este motivo, podem ocorrer doenças cardíacas coronárias, doenças cerebrovasculares, obstrução dos vasos sanguíneos periféricos, etc., (E. Falk et al., Circulation, 1995). Além do mais, os lípidos em excesso no sangue são acumulados no tecido do fígado, podendo assim provocar a doença hepática gordurosa. O fígado gordo designa uma patologia na qual a proporção de gorduras no peso do fígado é superior a 5%. O fígado gordo pode ser causado não apenas pela ingestão excessiva de gorduras, mas também pela ingestão de álcool.
[006] Os métodos correntes que são utilizados para reduzir os níveis de lípidos no sangue incluem terapia de dieta, terapia de exercício e terapia com fármacos. No entanto, a terapia de dieta ou a terapia de exercício é difícil de controlar rigidamente e de efetuá-la, e a sua eficácia terapêutica também é limitada.
[007] Os fármacos para reduzir os níveis de lípidos, desenvolvidos até a data, incluem resina de ligação a ácido biliar, fármacos para baixar o colesterol, tais como inibidores de HMG-CoA-reductase importante na biossíntese de colesterol, fármacos para baixar os triglicéridos, tais como derivados de ácido fíbrico e ácido nicotínico, etc.. No entanto, foram descritos efeitos secundários para estes fármacos, tais como toxicidade hepática, distúrbio gastrointestinal e carcinogênese. Assim, existe uma necessidade urgente para o desenvolvimento de fármacos que possam ser utilizados para o tratamento de hiperlipidemia e de doenças associadas (v.g., aterosclerose e doença hepática gordurosa), que apresentem menos efeitos secundários.
[008] Como candidato para tais fármacos, foi recentemente prestada atenção a oxintomodulina. A oxintomodulina é produzida a partir de pré-glucagon e é um peptídeo que se liga ao peptídeo 1 de tipo glucagon (GLP-1) e ao receptor de glucagon para efetuar uma função dual. Devido a estas características, a oxintomodulina tem vindo a ser estudada para vários propósitos, incluindo o tratamento de obesidade, hiperlipidemia e doença hepática gordurosa. No entanto, a oxintomodulina tem um problema pelo facto de ser necessário administrá-la em uma dose elevada, visto que apresenta um período de semi-vida curta in vivo e a sua atividade ser insuficiente para utilização no tratamento de obesidade, hiperlipidemia e doença hepática gordurosa.
[009] Assim sendo, as requerentes da presente invenção desenvolveram um derivado de oxintomodulina que apresenta uma atividade aumentada em comparação com oxintomodulina nativa e concluíram que o derivado de oxintomodulina reduz o teor e a proporção de lípidos no sangue em modelos com hamster de hiperlipidemia induzida, o que indica que o derivado pode ser utilizado eficazmente para o tratamento e doenças de hiperlipidemia, completando assim a presente invenção.
Descrição Problema técnico
[010] Constitui um objeto da presente invenção proporcionar uma composição para a prevenção ou para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, a qual contém um derivado de oxintomodulina enquanto ingrediente ativo.
[011] Um outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar um método para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, método esse que compreende o passo que consistem em administrar um derivado de oxintomodulina a um sujeito.
[012] Ainda um outro objeto da presente invenção consiste em proporcionar a utilização de um derivado de oxintomodulina para a preparação de um medicamento para a prevenção ou para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose.
Solução técnica
[013] Para se alcançar os objetos anteriores, de acordo com um aspecto, a presente invenção proporciona uma composição para a prevenção ou para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, a qual contém um derivado de oxintomodulina enquanto ingrediente ativo.
[014] Tal como aqui utilizado, o termo “oxintomodulina” designa um peptídeo produzido a partir de pré-glucagon que é um precursor de glucagon. Na presente invenção, o termo oxintomodulina pretende incluir oxintomodulina nativa e seus precursores, análogos (derivados), fragmentos e variantes. De preferência, a oxintomodulina possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
[015] Tal como aqui utilizado, o termo “variante de oxintomodulina” designa um peptídeo que tem um ou mais resíduos aminoácidos diferentes daqueles da sequência de aminoácidos da oxintomodulina nativa e possui uma função de ativar os receptores de GLP-1 e de glucagon. A variante de oxintomodulina pode ser preparada por uma ação qualquer entre substituição, adição, deleção, modificação ou uma sua combinação, de alguns aminoácidos de oxintomodulina nativa.
[016] Tal como aqui utilizado, o termo “derivado de oxintomodulina” designa um peptídeo, derivado de peptídeo ou mímico de peptídeo, que é preparado por adição, deleção ou substituição de alguns aminoácidos da oxintomodulina nativa e que pode ativar tanto o receptor de GLP-1 como o receptor de glucagon, em um nível elevado em comparação com o nível ativado pela oxintomodulina nativa.
[017] Tal como aqui utilizado, o termo “fragmento de oxintomodulina” designa um fragmento que tem uma adição ou deleção de um ou de mais aminoácidos na extremidade do terminal amino ou carboxilo de oxintomodulina nativa, em que os aminoácidos adicionados também podem ser aminoácidos que não ocorrem naturalmente (v.g., aminoácidos do tipo D). Tais aminoácidos têm a função de regular os níveis de glicose no sangue in vivo.
[018] Os métodos para a preparação de variantes, derivados e fragmentos de oxintomodulina podem ser utilizados por si sós ou em combinação. Por exemplo, a presente invenção inclui um peptídeo que possui um ou mais aminoácidos diferentes daqueles do peptídeo nativo e a desaminação dos resíduos aminoácidos do terminal N e que tem a função de ativar tanto o receptor de GLP-1 como o receptor de glucagon.
[019] Os aminoácidos aqui mencionados são abreviados de acordo com as regras de nomenclatura da IUPAC-IUB, tal como a seguir se descreve: Alanina A; Arginina R; Asparagina N; Ácido aspártico D; Cisteína C; Ácido glutâmico E; Glutamina Q; Glicina G; Histidina H; Isoleucina I; Leucina L; Lisina K; Metionina M; Fenilalanina F; Prolina P; Serina S; Treonina T; Triptofano W; Tirosina Y; Valina V.
[020] Na presente invenção, o derivado de oxintomodulina abrange qualquer peptídeo que seja preparado por substituição, adição, deleção ou modificação pós-tradução (v.g., metilação, acilação, ubiquitinação ou ligação covalente intramolecular) de aminoácidos na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e que possa ativar tanto o receptor de glucagon como o receptor de GLP-1. Para a substituição ou adição de aminoácidos, é possível utilizar não só os 22 aminoácidos habitualmente encontrados em proteínas humanas, mas também aminoácidos atípicos ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente. As fontes comerciais de aminoácidos atípicos incluem a Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. e Genzyme Pharmaceuticals. Os peptídeos que incluem esses aminoácidos e sequências de peptídeos atípicas podem ser sintetizados e adquiridos a fornecedores comerciais, por exemplo, American Peptide Company ou Bachem (EUA) ou Anygen (Coreia).
[021] De acordo com uma variante específica da presente invenção, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo novo que compreende a sequência de aminoácidos que satisfaz a seguinte fórmula 1: Fórmula 1 R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16- X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 em que o símbolo R1 representa histidina, desamino-histidilo, dimetil-histidilo (N- dimetil-histidilo), beta-hidroxi-imidazopropionilo, 4-imidazoacetilo, beta-carboxi- imidazopropionilo ou tirosina; o símbolo X1 representa Aib (ácido aminoisobutírico), d-alanina, glicina, Sar (N-metilglicina), serina ou d-serina; o símbolo X2 representa ácido glutâmico ou glutamina; o símbolo X3 representa leucina ou tirosina; o símbolo X4 representa serina ou alanina; o símbolo X5 representa lisina ou arginina; o símbolo X6 representa glutamina ou tirosina; o símbolo X7 representa leucina ou metionina; o símbolo X8 representa ácido aspártico ou ácido glutâmico; o símbolo X9 representa ácido glutâmico, serina, ácido alfa-metil-glutâmico ou é deletado; o símbolo X10 representa glutamina, ácido glutâmico, lisina, arginina ou serina ou é deletado; o símbolo X11 representa alanina, arginina ou valina ou é deletado; o símbolo X12 representa alanina, arginina, serina ou valina ou é deletado; o símbolo X13 representa lisina, glutamina, arginina ou ácido alfa-metil- glutâmico ou é deletado; o símbolo X14 representa ácido aspártico, ácido glutâmico ou leucina ou é deletado; o símbolo X15 representa fenilalanina ou é deletado; o símbolo X16 representa isoleucina ou valina ou é deletado; o símbolo X17 representa alanina, cisteína, ácido glutâmico, lisina, glutamina ou ácido alfa-metil-glutâmico ou é deletado; o símbolo X18 representa triptofano ou é deletado; o símbolo X19 representa alanina, isoleucina, leucina, serina ou valina ou é deletado; o símbolo X20 representa alanina, lisina, metionina, glutamina ou arginina ou é deletado; o símbolo X21 representa asparagina ou é deletado; o símbolo X22 representa alanina, glicina ou treonina ou é deletado; o símbolo X23 representa cisteína ou lisina ou é deletado; o símbolo X24 representa um peptídeo que possui 2 a 10 aminoácidos constituídos por uma combinação de alanina, glicina e serina ou é deletado e o símbolo R2 representa KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) ou é deletado (excluído caso a sequência de aminoácidos de fórmula 1 seja idêntica à da SEQ ID NO: 1).
[022] Para aumentar a atividade de oxintomodulina de tipo selvagem para o receptor de glucagon e para o receptor de GLP-1, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser substituído com 4-imidazoacetilo, obtido por supressão do carbono alfa de histidina na posição 1 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, desamino-histidilo, obtido por supressão do grupo amino no terminal N, dimetil-histidilo (N-dimetil-histidilo), obtido por modificação do grupo amino no terminal N com dois grupos metilo, beta-hidroxi-imidazopropionilo, obtido por substituição do grupo amino no terminal N com um grupo hidroxilo, ou beta-carboxi-imidazopropionilo, obtido por substituição do grupo amino no terminal N com um grupo carboxilo. Além disso, a região de ligação ao receptor de GLP-1 pode ser substituída com aminoácidos que aumentam as ligações hidrofóbicas e iónicas ou uma sua combinação. Uma porção da sequência de oxintomodulina pode ser substituída com a sequência de aminoácidos do GLP-1 ou de exendina-4 para aumentar a atividade do receptor de GLP-1.
[023] Além disso, uma porção da sequência de oxintomodulina pode ser substituída com uma sequência que aumenta a hélice alfa. De preferência, os aminoácidos nas posições 10, 14, 16, 20, 24 e 28 da sequência de aminoácidos da fórmula 1 podem ser substituídos com aminoácidos ou com derivados de aminoácidos selecionados entre Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4- CN), Phe(4-NO 2),Phe(4-NH 2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-tienilo) e Ala(benzotienilo), os quais são conhecidos por estabilizar a hélice alfa, em que o tipo e o número de aminoácido ou de derivados de aminoácidos estabilizadores da hélice alfa a inserir não são limitados.
[024] De preferência, os aminoácidos nas posições 10 e 14, 12 e 16, 16 e 20, 20 e 24 e 24 e 28 da sequência de aminoácidos também podem ser substituídos com ácido glutâmico ou lisina de modo a formar anéis, em que o número de anéis a inserir não é limitado. Mais preferencialmente, o derivado de oxintomodulina pode ter uma sequência de aminoácidos selecionada entre as seguintes fórmulas 1 a 6.
[025] De acordo com uma variante específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo novo que inclui a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 2, obtida por substituição da sequência de aminoácidos de oxintomodulina com a de exendina ou de GLP-1:[Fórmula 2] R1-A-R3.
[026] De acordo com outra variante específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo novo que compreende a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 3, que é preparada por ligação de uma porção da sequência de aminoácidos de oxintomodulina e uma porção da sequência de aminoácidos de exendina ou de GLP-1, através de um ligador de aminoácidos adequado: [Fórmula 3] R1-B-C-R4.
[027] Ainda de acordo com outra variante específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo novo que compreende a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 4, em que uma porção da sequência de aminoácidos de oxintomodulina é substituída com um aminoácido capaz de aumentar a afinidade de ligação ao receptor de GLP-1, por exemplo, a Leu na posição 26, que se liga ao receptor de GLP-1 por interação hidrofóbica, é substituída pelo resíduo hidrofóbico Ile ou Val. [Formula 4] R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3.
[028] Ainda de acordo com outra variante específica, o derivado de oxintomodulina da presente invenção é um peptídeo novo que compreende a sequência de aminoácidos da seguinte fórmula 5, em que uma porção da sequência de aminoácidos de oxintomodulina nativa é deletada, adicionada ou substituída, com outros aminoácidos, para assim aumentar a aptidão de oxintomodulina nativa para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon: [Fórmula 5] R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5.
[029] Nas fórmulas 2 a 5, o símbolo R1 possui o significado descrito na fórmula 1; o símbolo A é selecionado entre o conjunto constituído por SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46) e SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47); o símbolo B é selecionado entre o conjunto constituído por SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT (SEQ ID NO: 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEQ ID NO: 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEQ ID NO: 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG (SEQ ID NO: 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA (SEQ ID NO: 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG (SEQ ID NO: 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEQ ID NO: 48) e SQGTFTSDYSRYLD (SEQ ID NO: 49); o símbolo representa um peptídeo que possui 2 a 10 aminoácidos que consistem em uma combinação de alanina, glicina e serina; o símbolo D1 representa serina, ácido glutâmico ou arginina; o símbolo D2 representa arginina, ácido glutâmico ou serina; o símbolo D3 representa arginina, alanina ou valina; o símbolo D4 representa arginina, valina ou serina; o símbolo D5 representa glutamina, arginina ou lisina; o símbolo D6 representa isoleucina, valina ou serina; o símbolo D7 representa metionina, arginina ou glutamina; o símbolo D8 representa treonina, glicina ou alanina; o símbolo E1 representa serina, Aib, Sar, d-alanina ou d-serina; o símbolo E2 representa serina ou ácido glutâmico; o símbolo E3 representa arginina ou lisina; o símbolo E4 representa glutamina ou lisina; o símbolo E5 representa ácido aspártico ou ácido glutâmico; o símbolo E6 representa glutamina, cisteína ou lisina; o símbolo E7 representa cisteína ou lisina ou é deletado; o símbolo R3 representa KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37); o símbolo R4 representa HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) e o símbolo R5 representa KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36) ou GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37) ou é deletado (excluído se a sequência de aminoácidos das fórmulas 2 a 5 forem idênticas à da SEQ ID NO: 1).
[030] De preferência, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser um novo peptídeo que satisfaz a seguinte fórmula 6: [Fórmula 6] R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16- X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 em que o símbolo R1 representa histidina, desamino-histidilo, 4- imidazoacetilo ou tirosina; o símbolo X1 representa Aib(ácido aminoisobutírico), glicina, serina ou d- serina; o símbolo X2 representa ácido glutâmico ou glutamina; o símbolo X3 representa leucina ou tirosina; o símbolo X4 representa serina ou alanina; o símbolo X5 representa lisina ou arginina; o símbolo X6 representa glutamina ou tirosina; o símbolo X7 representa leucina ou metionina; o símbolo X8 representa ácido aspártico ou ácido glutâmico; o símbolo X9 representa ácido glutâmico ou ácido alfa-metil-glutâmico ou é deletado; o símbolo X10 representa glutamina, ácido glutâmico, lisina ou arginina ou é deletado; o símbolo X11 representa alanina ou arginina ou é deletado; o símbolo X12 representa alanina ou valina ou é deletado; o símbolo X13 representa lisina, glutamina, arginina ou ácido alfa-metil- glutâmico ou é deletado; o símbolo X14 representa ácido aspártico, ácido glutâmico ou leucina ou é deletado; o símbolo X15 representa fenilalanina ou é deletado; o símbolo X16 representa isoleucina ou valina ou é deletado; o símbolo X17 representa alanina, cisteína, ácido glutâmico, glutamina ou ácido alfa-metil-glutâmico ou é deletado; o símbolo X18 representa triptofano ou é deletado; o símbolo X19 representa alanina, isoleucina, leucina ou valina ou é deletado; o símbolo X20 representa alanina, lisina, metionina ou arginina ou é deletado; o símbolo X21 representa asparagina ou é deletado; o símbolo X22 representa treonina ou é deletado; o símbolo X23 representa cisteína, lisina ou é deletado; o símbolo X24 representa um peptídeo que possui 2 a 10 aminoácidos que consistem em glicina ou é deletado e o símbolo R2 representa KRNRNNIA (SEQ ID NO: 35), GPSSGAPPPS (SEQ ID NO: 36), GPSSGAPPPSK (SEQ ID NO: 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEQ ID NO: 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEQ ID NO: 39) ou HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEQ ID NO: 40) ou é deletado (excluído se a sequência de aminoácidos de fórmula 6 for idêntica à da SEQ ID NO: 1).
[031] Mais preferencialmente, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser selecionado entre o conjunto constituído pelos peptídeos das SEQ ID NO: 2 a 34. Ainda mais preferencialmente, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser um derivado de oxintomodulina descrito na tabela 1 do exemplo 2-1.
[032] Em um exemplo da presente invenção, preparou-se os derivados de oxintomodulina que possuem as sequências de aminoácidos das SEQ ID NO: 2 a 34, respectivamente, e concluiu-se que os derivados de oxintomodulina apresentavam atividades para o receptor de GLP-1 e para o receptor de glucagon excelentes em comparação com a de oxintomodulina nativa (exemplo 2). Por outras palavras, foi possível observar a partir dos resultados anteriores que o derivado de oxintomodulina da presente invenção exibiu uma excelente ação terapêutica contra hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, por meio da activação do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon.
[033] Os derivados de oxintomodulina da presente invenção estão presentes sob a forma de conjugados que compreendem diversos polímeros para melhorar o efeito terapêutico e o período de semi-vida in vivo dos derivados.
[034] O conjugado da presente invenção apresenta um aumento na duração da ação em comparação com a da oxintomodulina nativa e os conjugados de ação prolongada incluem uma oxintomodulina preparada por modificação, substituição, adição ou supressão de aminoácidos da oxintomodulina nativa, uma oxintomodulina conjugada com um polímero biodegradável, tal como polietileno- glicol (PEG), uma oxintomodulina conjugada com um polissacárido, tal como albumina, anticorpo, elastina, fibronectina ou quitina, ou com uma proteína de ação prolongada, tal como um fragmento de imunoglobulina, uma oxintomodulina conjugada com ácido gordo que possui a aptidão de ligação a albumina in vivo, ou um conjugado de oxintomodulina encapsulado em nanopartículas biodegradáveis, em que o tipo de conjugado de ação prolongada utilizado na presente não é limitado.
[035] De preferência, o conjugado é um conjugado em que um derivado de oxintomodulina, que possui uma sequência de aminoácidos selecionada entre o conjunto constituído pelas SEQ ID NO: 2 a 34, está ligado a uma região Fc de imunoglobulina através de um polímero não peptídico.
[036] A região Fc de imunoglobulina é um polipeptídeo biodegradável que é metabolizado in vivo, sendo assim possível utilizá-lo com segurança como veículo para um fármaco. A região Fc de imunoglobulina tem um baixo peso molecular em comparação co a molécula de imunoglobulina completa, sendo tal vantajoso em termos de preparação, purificação e rendimento de conjugados. Além disso, uma vez que a sequência de aminoácidos difere entre anticorpos, uma porção Fab que apresenta uma elevada não homogeneidade, sendo assim possível que a homogeneidade do material possa ser bastante aumentada e sendo também possível reduzir a possibilidade de induzir antigenicidade no sangue.
[037] Tal como aqui utilizada, a expressão “região Fc de imunoglobulina” designa uma proteína que contém a região constante 2 da cadeia pesada (CH2) e a região constante 3 da cadeia pesada (CH3) de uma imunoglobulina, excluindo as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, a região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e a região constante 1 da cadeia leve (CL1) da imunoglobulina. Pode ainda incluir uma região de dobra na região constante da cadeia pesada. Além disso, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode ser uma região Fc expandida incluindo parte, ou a totalidade, da região constante 1 da cadeia pesada (CH1) e/ou a região constante 1 da cadeia leve (CL1), com excepção das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve, desde que apresente uma ação que seja praticamente igual ou melhor do que a proteína nativa. Além do mais, a região Fc de imunoglobulina pode ser uma região que apresenta uma supressão de uma porção de uma sequência de aminoácidos relativamente longa que corresponda a CH2 e/ou CH3. De um modo específico, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode compreender 1) um domínio da CH1, um domínio da CH2, um domínio da CH3 e um domínio da CH4, 2) um domínio da CH1 e um domínio da CH2, 3) um domínio da CH1 e um domínio da CH3, 4) um domínio da CH2 e um domínio da CH3, 5) uma combinação de um ou mais domínios e uma região de dobra de imunoglobulina (ou uma porção da região de dobra), ou 6) um dímero de cada domínio das regiões constantes da cadeia pesada e da região constante de cadeia leve.
[038] A região Fc de imunoglobulina da presente invenção inclui uma sequência de aminoácidos nativa e um seu derivado de sequência (mutante). Tal como aqui utilizada, a expressão “derivado de sequência de aminoácidos” designa uma sequência que é diferente da sequência de aminoácidos nativo devido a uma deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa ou uma sua combinação, de um ou de mais resíduos aminoácidos da sequência de aminoácidos nativa. Por exemplo, no caso de um Fc de IgG, os resíduos aminoácidos nas posições 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322 ou 327 a 331, sobre os quais se sabe que são importantes em termos de ligação, podem ser utilizados como locais adequados para modificação.
[039] Além disso, são possíveis vários outros derivados, incluindo um que possua uma supressão de uma região que é capaz de formar uma ponte dissulfureto, ou uma supressão de alguns resíduos aminoácidos na extremidade do terminal N do Fc nativo ou uma adição de um resíduo metionina na extremidade do terminal N de Fc nativo. Além disso, para se remover funções efectoras, pode ocorrer uma supressão em um local de ligação de complemento, tal como um local de ligação de C1q e um local ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo). As técnicas para a preparação de tais derivados de sequência da região Fc de imunoglobulina encontram-se descritas nas publicações de patente de invenção internacionais nos. WO 97/34631 e WO 96/32478.
[040] São conhecidas na especialidade permutas de aminoácidos em proteínas e peptídeos, que não alteram a atividade das proteínas ou peptídeos (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). As permutas que ocorrem mais normalmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly, em ambas as direcções. Além disso, a região Fc pode, se necessário, ser modificada por fosforilação, sulfação, acrilação, glicosilação, metilação, farnesilação, acetilação, amidação e semelhantes.
[041] Os derivados de Fc descritos antes apresentam uma atividade biológica idêntica à da região Fc da presente invenção ou apresentam uma estabilidade estrutura aumentada contra calor, pH ou semelhante.
[042] Além disso, esta região Fc pode ser obtida a partir de formas nativas provenientes de seres humanos e de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias, ou a partir de seus recombinantes ou derivados, obtidos a partir de células animais transformadas ou de microrganismos. Aqui, a região Fc pode ser obtida a partir de uma imunoglobulina nativa por isolamento de uma imunoglobulina completa a partir de do corpo de um ser humano ou de um animal vivo e tratamento com proteinase. Quando a imunoglobulina completa é tratada com papaína, este é digerida em regiões Fab e Fc, e quando a imunoglobulina completa é tratada com pepsina, esta é digerida em fragmentos pF'c e F(ab)2. O Fc ou pF'c pode ser isolado utilizando cromatografia de exclusão por tamanho ou semelhante. De preferência, uma região Fc proveniente de humanos é uma região Fc de imunoglobulina recombinante obtida a partir de um microrganismo.
[043] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina da presente invenção pode estar em uma forma que tenha cadeias de açúcar nativas ou cadeias de açúcar reduzidas ou aumentadas comparativamente com a forma nativa, ou pode estar em uma forma desglicosilada. O aumento, redução ou remoção de cadeias de açúcar de Fc de imunoglobulina pode ser alcançado por métodos convencionais, tal como um método químico, um método enzimático e um método de engenharia genética utilizando um microrganismo. A região Fc obtida por remoção de cadeias de açúcar a partir de Fc apresenta uma redução significativa na afinidade de ligação à parte C1q do primeiro componente de complemento C1 e uma redução ou perda na citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo ou citotoxicidade dependente do complemento, não induzindo assim respostas imunes desnecessárias in vivo. Neste sentido, uma região Fc de imunoglobulina sob uma forma desglicosilada ou aglicosilada pode ser mais adequada para o objeto da presente invenção, enquanto veículo de fármaco.
[044] Tal com aqui utilizado, o termo “desglicosilação” designa a remoção enzimática de resíduos açúcar a partir de uma região Fc e o termo “aglicosilação” designa uma região Fc não glicosilada produzida em um procariota, de preferência, E.coli.
[045] Entretanto, uma região Fc de imunoglobulina pode ser obtida a partir de seres humanos ou de outros animais, incluindo vacas, cabras, porcos, murganhos, coelhos, hamsters, ratos e cobaias e, de preferência, a partir de humanos.
[046] Além do mais, a região Fc de imunoglobulina pode ser proveniente de IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, ou uma sua combinação ou híbrido. De preferência, é proveniente de IgG ou IgM, as quais estão entre as proteínas mais abundantes no sangue humano e, mais preferencialmente proveniente de IgG, que é conhecida como capaz de aumentar os períodos de semi-vida de proteínas de ligação a ligandos.
[047] Tal como aqui utilizado, o termo “combinação” designa que os polipeptídeos que codificam uma região Fc de imunoglobulinas de cadeia individual com a mesma origem estão ligadas a um polipeptídeo de cadeia individual de uma origem diferente para formar um dímero ou multímero. Especificamente, um dímero ou multímero pode ser formado a partir de dois ou mais fragmentos selecionados entre o conjunto constituído por fragmentos de Fc de IgG, Fc de IgA, Fc de IgM, Fc de IgD e Fc de IgE.
[048] Tal como aqui utilizado, o termo “híbrido” designa que as sequências que corresponder a dois ou mais fragmentos de Fc de imunoglobulina de origens diferentes estão presentes em uma região Fc de cadeia individual de imunoglobulina. Na presente invenção, são possíveis várias formas de híbridos. Por outras palavras, é possível um híbrido constituído por 1 a 4 domínios selecionados entre o conjunto constituído por CH1, CH2, CH3 e CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE e Fc de IgD, e este pode incluir uma dobra.
[049] Entretanto, a IgG também pode ser subclassificada em IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, e, na presente invenção, também é possível uma combinação ou híbrido destas subclasses. De preferência, a IgG é a subclasse IgG2 e IgG4 e, mais preferencialmente é a região Fc de IgG4, qual se falta substancialmente as funções efectoras, tais como a citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
[050] Por outras palavras, a região Fc de imunoglobulina mais preferida utilizada como veículo de fármaco na presente invenção é uma região Fc proveniente de IgG4 humana. Uma região Fc proveniente de humano é mais preferida do que uma região Fc proveniente de outro que não humano, a qual pode actuar como um antigénio no corpo humano e causar respostas imunes indesejadas, tais como a produção de um novo anticorpo contra o antigénio.
[051] Tal como aqui utilizado, o termo “polímero não peptídico" designa um polímero biocompatível, incluindo duas ou mais unidades repetidas ligadas entre si por qualquer ligação covalente em vez de uma ligação peptídica. Na presente invenção, o termo polímero não peptídico pode ser utilizado de um modo inter- permutável com o termo ligador não peptidilo.
[052] O polímero não peptídico utilizável na presente invenção pode ser selecionado entre o conjunto constituído por polietileno-glicol, polipropileno-glicol, um copolímero de etileno-glicol/propileno-glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacáridos, dextrano, éter polivinil-etílico, polímeros biodegradáveis, tais como PLA (poli(ácido láctico)) e PLGA (ácido poliláctico- glicólico), polímeros de lípidos, quitinas, ácido hialurónico e suas combinações. De preferência, o polímero não peptídico é polietileno-glicol. Além disso, os seus derivados conhecidos na especialidade e os derivados que podem ser facilmente preparados por métodos conhecidos na especialidade estão incluídos no âmbito da presente invenção.
[053] O ligador peptídico, utilizado em uma proteína de fusão, obtida por um método de fusão em moldura convencional, apresenta desvantagens uma vez que é facilmente clivável por proteinase in vivo, pelo que não é possível obter uma ação suficiente para aumentar o período de semi-vida no soro do fármaco ativo por um veículo, conforme esperado. No entanto, na presente invenção, um polímero que tenha resistência a proteinase pode ser utilizado para manter o período de semi-vida no soro do peptídeo, de um modo semelhante ao veículo. Assim sendo, é possível utilizar qualquer polímero não peptídico sem limitação na presente invenção, desde que este seja um polímero que possua a função supramencionada, isto é, um polímero que tenha resistência a proteinase in vivo. O polímero não peptídico possui um peso molecular compreendido entre 1 e 100 kDa e, de preferência, entre 1 e 20 kDa. O polímero não peptídico da presente invenção, o qual está ligado à região Fc de imunoglobulina, pode ser de um tipo de polímero ou uma combinação de polímeros diferentes.
[054] O polímero não peptídico que é utilizado na presente invenção pode ter um grupo reativo capaz de se ligar à região Fc de imunoglobulina e ao fármaco proteico. O grupo reativo em ambas as extremidades do polímero não peptídico preferencialmente selecionado entre o conjunto constituído por um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um derivado de succinimida, reativos.
[055] O derivado de succinimida pode ser propionato de succinimidilo, hidroxi-succinimidilo, carboximetil-succinimidilo ou carbonato de succinimidilo. Em particular, quando o polímero não peptídico possui um grupo aldeído reativo em ambas as suas extremidades, é possível minimizar reações não específicas, e um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina podem ligar-se eficazmente a uma e à outra extremidade do polímero não peptídico, respectivamente. Um produto final gerado por alquilação redutiva com uma ligação aldeído é muito mais estável do que um ligado por uma ligação amida. O grupo aldeído reativo pode ligar-se selectivamente a um terminal N a um valor de pH baixo e pode formar uma ligação covalente com lisina a um valor de pH elevado, tal como pH 9,0.
[056] Os grupos reativos em ambas as extremidades do polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode possuir um grupo maleimida em uma extremidade, e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Quando um polietileno-glicol que possui um grupo hidroxi reactivo em ambas as suas extremidades é utilizado como polímero não peptídico, o grupo hidroxi pode ser ativado para vários grupos reativos por reações químicas conhecidas, ou um polietileno-glicol que possui um grupo reativo modificado comercialmente disponível pode ser utilizado para preparar o conjugado de ação prolongada da presente invenção.
[057] O conjugado da presente invenção pode ser um em que uma extremidade do polímero não peptídico e a outra estão ligadas a um grupo amina ou a um grupo tiol da região Fc de imunoglobulina e ao derivado de oxintomodulina, respectivamente.
[058] O polímero não peptídico da presente invenção tem um grupo funcional em ambas as extremidades, o qual pode ser ligado quer a uma região Fc de imunoglobulina ou a um fármaco proteico. Os grupos funcionais podem ser um grupo aldeído, um grupo propionaldeído, um grupo butiraldeído, um grupo maleimida e um grupo succinimida (isto é, propionato de succinimidilo, hidroxi- succinimidilo, carboximetil-succinimidilo ou carbonato de succinimidilo), mas não são limitados a estes.
[059] Os grupos reativos em ambas as extremidades do ligador que é o polímero não peptídico podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, o polímero não peptídico pode ter um grupo maleimida em uma extremidade e um grupo aldeído, um grupo propionaldeído ou um grupo butiraldeído na outra extremidade. Por exemplo, quando o polímero não peptídico possui um grupo aldeído reativo em uma extremidade e um grupo maleimida reativo na outra extremidade, as reação não específicas podem ser minimizadas, e um polipeptídeo fisiologicamente ativo e uma imunoglobulina podem ser ligados de um modo eficaz a ambas as extremidades do polímero não peptídico. De acordo com uma variante da presente invenção, um conjugado foi sintetizado por ligação de oxintomodulina, ou um seu derivado, à região Fc de imunoglobulina através de uma ligação covalente utilizando o polímero não peptídico PEG, incluindo um grupo propionaldeído por si só ou então um grupo maleimida e um grupo aldeído.
[060] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada para a prevenção ou para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose.
[061] Tal como aqui utilizado, o termo “prevenção” designa todas as ações que inibem ou que retardam o desenvolvimento de uma doença alvo. Tal como aqui utilizado, o termo “prevenção” designa a administração do derivado de oxintomodulina da presente invenção para inibir ou retardar o desenvolvimento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, que apresente um aumento nos níveis de colesterol total e de colesterol de baixa densidade no sangue e uma diminuição nos níveis de colesterol de elevada densidade.
[062] Tal como aqui utilizado, o termo “tratamento” designa todas as ações que aliviam ou melhoram os sintomas da doença desenvolvida. Tal como aqui utilizado, o termo “tratamento” designa a administração do derivado de oxintomodulina da presente invenção para aliviar ou melhorar hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, que apresente um aumento nos níveis de colesterol total e de colesterol de baixa densidade no sangue e uma diminuição nos níveis de colesterol de elevada densidade.
[063] Tal como aqui utilizado, o termo “hiperlipidemia” designa uma patologia associada a nível anormalmente elevados de lípidos, tais como colesterol livre, ésteres de colesterol, fosfolípidos e triglicéridos, no sangue. Embora a hiperlipidemia não apresente sintomas específicos por si só, os lípidos em excesso no sangue aderem às paredes dos vasos sanguíneos para reduzir o tamanho do vaso sanguíneo e provoca aterosclerose através de reações inflamatórias. Devido a esta razão, podem ocorrer doença cardíaca coronária, doença cerebrovascular, obstrução dos vasos sanguíneos periféricos, etc..
[064] Assim, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser utilizada para o tratamento não só de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou aterosclerose, mas também de doença cardíaca coronária, doença cerebrovascular ou obstrução dos vasos sanguíneos periféricos.
[065] Tal como aqui utilizado, o termo “doença hepática gordurosa” designa uma patologia em que a proporção de gorduras no peso do fígado é superior a 5%. Na presente invenção, a doença hepática gordurosa inclui doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), doença hepática gordurosa alcoólica, doença hepática gordurosa nutricional, doença hepática gordurosa associada à inanição, doença hepática gordurosa associada à obesidade, doença hepática gordurosa diabética ou esteato-hepatite. A doença hepática gordurosa não alcoólica pretende incluir doença hepática gordurosa não alcoólica primária e secundária, mas pode ser, de preferência, uma doença hepática gordurosa não alcoólica causada por hiperlipidemia primária, diabetes ou obesidade.
[066] Além disso, na presente invenção, a doença hepática gordurosa não alcoólica pretende incluir esteatose simples, esteato-hepatite não alcoólica e fibrose hepática e cirrose hepática que são causadas pela progressão de tais doenças.
[067] A aterosclerose designa uma doença vascular em que o ateroma é formado como resultado do depósito de colesterol no endotélio de vasos sanguíneos e proliferação de células endoteliais.
[068] De acordo com um exemplo da presente invenção, preparou-se um conjugado de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada por ligação do derivado de oxintomodulina à região Fc de imunoglobulina através de uma ligação covalente, utilizando polietileno-glicol, e administrou-se o conjugado preparado a modelos animais de hamster animal que apresentava hiperlipidemia induzida por ingestão de uma dieta com teor elevado em gorduras. Como resultado, demonstrou-se que o grupo ao qual se administrou o conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada de acordo com a presente invenção apresentou uma diminuição significativa nos níveis de triglicéridos no sangue (FIG. 1), uma diminuição significativa nos níveis de colesterol total no sangue (FIG. 2) e uma diminuição significativa nos níveis de colesterol de baixa densidade (LDL) no sangue, em comparação com os modelos animais com indução de hiperlipidemia. Além disso, observou-se que o grupo ao qual foi administrado o conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada de acordo com a presente invenção apresentou um aumento significativo nos níveis de colesterol de elevada densidade (HDL) no sangue (FIG. 4) e um aumento significativo no rácio colesterol HDL/colesterol LDL no sangue (FIG. 5), em comparação com os modelos animais com indução de hiperlipidemia.
[069] Além disso, foi possível observar que o conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada de acordo com a presente invenção apresentou uma diminuição nos níveis de colesterol total no sangue (FIG. 6) e uma diminuição nos níveis de colesterol LDL e de triglicéridos no sangue (FIG. 7), em comparação com VICTOZA <®>, que é um análogo comercial de GLP-1 de ação prolongada. Além do mais, foi possível observar que a administração do conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção apresentou um aumento no nível de colesterol HDL no sangue e no rácio de colesterol HDL/LDL, em comparação com a administração de VICTOZA <®> (FIGS. 8 e 9). Em particular, um conjugado de ação prolongada do peptídeo da SEQ ID NO: 25 com Fc apresentou um aumento nos níveis de HDL no sangue e no rácio de colesterol HDL/LDL, em comparação com VICTOZA <®>.
[070] Por outras palavras, o derivado de oxintomodulina de acordo com a presente invenção reduz os níveis de lípidos no sangue, podendo assim ser utilizado como agente para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose. Além do mais, o conjugado da presente invenção tem uma excelente aptidão para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon em comparação com oxintomodulina nativa e apresenta um período de semi-vida no sangue aumentado in vivo, podendo assim manter a sua atividade in vivo durante um período de tempo prolongado.
[071] O derivado de oxintomodulina da presente invenção pode aumentar a atividade de um factor (proteína cinase C-Z ou PKC-Z), regulando a atividade das enzimas que estão implicadas na lipólise de gorduras, e pode aumentar a expressão de um factor (Glut2) que está envolvido na lipólise de gorduras, tratando, deste modo, hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, embora o âmbito da presente invenção não esteja limitado ao mecanismo de ação anterior.
[072] A composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um agente farmacêutico que exiba uma ação preventiva ou terapêutica contra hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose. Em particular, a composição da presente invenção pode ainda compreender um agente farmacêutico que seja conhecido como agente para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, de modo a administrar o agente farmacêutico em combinação com o derivado da presente invenção.
[073] Assim, a composição da presente invenção pode ser administrada por si só ou em combinação com outros fármacos, de modo a prevenir ou tratar hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose.
[074] Tal como aqui utilizado, o termo “administração” designa a introdução de um determinado material em um paciente através de um qualquer método adequado. O derivado da presente invenção pode ser administrado por qualquer via habitual, desde que possa atingir o tecido alvo. Em particular, o derivado da presente invenção pode ser administrado por via intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, oral, local, intranasal, intrapulmonar ou intrarectal, mas não é limitada a estas. No entanto, visto que o peptídeo é digerido quando administrado por via oral, a composição oral é preferencialmente formulada de modo que o ingrediente ativo seja revestido ou protegido contra degradação no estômago. De preferência, a composição da presente invenção pode ser administrada em uma forma injectável. Além disso, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada utilizando qualquer sistema capaz de levar o ingrediente ativo às células alvo.
[075] A composição farmacêutica que compreende o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Para administração por via oral, como veículos farmaceuticamente aceitáveis refere-se um aglutinante, um lubrificante, um desintegrante, um excipiente, um solubilizador, um agente de dispersão, um estabilizador, um agente de suspensão, um corante e um edulcorante. Para preparações injectáveis, como veículos farmaceuticamente aceitáveis refere-se um tampão, u conservante, um analgésico, um solubilizador, um agente isotónico e um estabilizador. Para administração por via tópica, como veículos farmaceuticamente aceitáveis refere-se uma base, um excipiente, um lubrificante e um conservante.
[076] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em várias formas de dosagem utilizando os veículos farmaceuticamente aceitáveis supramencionados. Por exemplo, para a administração por via oral, a composição farmacêutica pode ser formulada em comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas ou semelhantes. Para as preparações injectáveis, a composição farmacêutica pode ser apresentada sob a forma de um ampola de dosagem unitária ou de um recipiente de doses múltiplas.A composição farmacêutica também pode ser formulada em soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas e preparações de libertação prolongada.
[077] Entretanto, como exemplos de veículos, excipientes e diluentes adequados para a formulação refere-se lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, borracha de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, água, metil-hidroxibenzoato, propil- hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleos minerais. Além do mais, a composição farmacêutica da presente invenção pode ainda incluir cargas, agentes anti-coagulação, lubrificantes, agentes humectantes, edulcorantes, conservantes e semelhantes.
[078] A dose da composição farmacêutica da presente invenção é determinada de acordo com o tipo de ingrediente ativo, em conjunto com vários factores, tais como a doença a tratar, a via de administração, a idade, o sexo e o peso do paciente e a gravidade da doença.
[079] A composição farmacêutica da presente invenção possui um longo período de semi-vida in vivo e uma excelente potência, pelo que o número e a frequência de administração da composição farmacêutica pode ser significativamente reduzida.
[080] De acordo com outra variante, a presente invenção proporciona um método para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, método esse que compreende um passo que consiste em administrar o derivado de oxintomodulina da presente invenção a um sujeito.
[081] A oxintomodulina, hiperlipidemia, doença hepática gordurosa e arteriosclerose são tal como descritas antes.
[082] Tal com aqui utilizado, o termo “sujeito” designa um sujeito que se suspeite ter hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose. Em particular, o termo designa mamíferos, incluindo humanos, ratos e animais domésticos, que têm ou que correm o risco de desenvolver as doenças anteriores. Além disso, o sujeito pode ser um sujeito qualquer que possa ser tratado pelo derivado de oxintomodulina da presente invenção.
[083] O método terapêutico da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende o conjugado. A dose diária total da composição pode ser determinada segundo um julgamento médico adequado por parte do médico assistente e a composição pode ser administrada uma ou mais vezes. No entanto, tendo em conta o propósito da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz específica da composição para qualquer paciente particular pode variar em função de vários factores bem conhecidos na especialidade médica, incluindo o tipo e o grau de resposta a alcançar, de composições concretas de acordo com o facto de serem utilizadas em conjunto com outros agentes ou não, da idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente, do tempo e da via de administração, da taxa de secreção da composição, da duração do tratamento, de outros fármacos utilizados em combinação ou coincidentemente com a composição da presente invenção e de outros factores conhecidos na especialidade médica.
[084] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a preparação de um conjugado do derivado de oxintomodulina.
[085] O método de preparação pode compreender os passos que consistem em: (1) ligar covalentemente um polímero não peptídico que possui um grupo aldeído, maleimida ou succinimida reativo ao grupo amina ou tiol de um peptídeo derivado de oxintomodulina; (2) separar o peptídeo derivado de oxintomodulina, que possui o polímero não peptídico covalentemente ligado a este em uma posição diferente da extremidade no terminal amino, a partir da mistura de reação do passo (1); e (3) ligar covalentemente uma região Fc de imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico ligado, produzindo assim m conjugado de peptídeo que compreende a região Fc de imunoglobulina e o peptídeo derivado de oxintomodulina, ligados a uma e à outra extremidade do polímero não peptídico, respectivamente.
[086] Mais especificamente, o método de preparação pode compreender os passos que consistem em: 1) ligar covalentemente um polímero não peptídico, que possui um grupo aldeído reativo e um grupo maleimida reativo em uma ou na outra das suas extremidades, respectivamente, ao resíduo cisteína de um derivado de oxintomodulina; (2) separar o derivado de oxintomodulina, que possível o polímero não peptídico covalentemente ligado ao resíduo cisteína, a partir da mistura de reação do passo (1); e (3) ligar covalentemente uma região Fc de imunoglobulina à outra extremidade do polímero não peptídico ligado, produzindo assim um conjugado de peptídeo que compreende a região Fc de imunoglobulina e o peptídeo do derivado de oxintomodulina, ligado a uma e à outra extremidade do polímero não peptídico, respectivamente.
[087] Ainda de acordo com outro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização do derivado de oxintomodulina para a preparação de um medicamento para a prevenção ou para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose.
Efeito vantajoso
[088] O derivado de oxintomodulina da presente invenção possui uma aptidão elevada para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon comparativamente com a de oxintomodulina nativa e exibe o efeito de redução dos níveis de colesterol total, de colesterol de baixa densidade e de triglicéridos no sangue, os quais tinham sido aumentados por uma dieta com teor elevado em gorduras, e aumentar os níveis de colesterol de elevada densidade e do rácio de colesterol de elevada densidade/colesterol de baixa densidade. Assim, o derivado de oxintomodulina da presente invenção pode ser eficazmente utilizado para o tratamento de hiperlipidemia e de doenças associadas.
Descrição das figuras
[089] A FIG. 1 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de triglicéridos no sangue provocada pela administração de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (#: indica um aumento significativo em comparação com um grupo de dieta normal com um intervalo de confiança de 99,.9% (p<0,001); *: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
[090] A FIG. 2 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol total no sangue provocada pela administração de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (#: indica um aumento significativo em comparação com um grupo de dieta normal com um intervalo de confiança de 99,.9% (p<0,001); *: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
[091] A FIG. 3 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol LDL no sangue provocada pela administração de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (#: indica um aumento significativo em comparação com um grupo de dieta normal com um intervalo de confiança de 99,.9% (p<0,001); *: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
[092] A FIG. 4 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de triglicéridos colesterol HDL no sangue provocada pela administração de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (*: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99% (p<0,01)).
[093] A FIG. 5 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol HDL/LDL no sangue provocada pela administração de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (*: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 95% (p<0,05)).
[094] A FIG. 6 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol total no sangue provocada pela administração de VICTOZA <®> ou de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (***: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
[095] A FIG. 7 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol LDL no sague provocada pela administração de VICTOZA <®> ou de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (***: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
[096] A FIG. 8 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol HDL no sangue provocada pela administração de VICTOZA <®> ou de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (*: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 95% (p<0,05)).
[097] A FIG. 9 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de colesterol HDL/LDL no sangue provocada pela administração de VICTOZA <®> ou de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (**: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99% (p<0,01)).
[098] A FIG. 10 representa um gráfico que mostra a alteração nos níveis de triglicéridos no sangue provocada pela administração de VICTOZA <®> ou de um derivado de oxintomodulina de ação prolongada a hamsters com hiperlipidemia induzida por uma dieta com teor elevado em gorduras (***: indica uma diminuição significativa em comparação com um grupo com uma dieta de teor elevado em gorduras com um intervalo de confiança de 99,9% (p<0,001)).
Modo da invenção
[099] Doravante, a presente invenção irá ser descrita mais minuciosamente por referência a exemplos. No entanto, faz-se observar que estes exemplos são apresentados apenas com um fim ilustrativo e não pretendem limitar o âmbito da presente invenção.
Exemplo 1: produção de linhagem celular para activação in vitro Exemplo 1-1: produção de linhagem celular que mostre a resposta de cAMP a GLP-1
[100] Utilizando uma porção correspondente ao ORF (quadro de leitura aberta) de cADN (OriGene Technologies, Inc. EUA) do gene do receptor de GLP- 1 humano como matriz, efetuou-se PCR utilizando iniciadores inversos e diretos, incluindo um local de clivagem HindIII e um local de clivagem EcoRI, respectivamente, obtendo assim um produto de PCR.
[101] Iniciador direto: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3' (SEQ ID NO: 50)
[102] Iniciador inverso: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3' (SEQ ID NO: 51)
[103] Clonou-se o produto de PCR no vetor de expressão celular animal conhecido, x0GC/dhfr, construindo assim o vetor recombinante x0GC/GLP-1R.
[104] Introduziu-se o vetor recombinante x0GC/GLP-1R em uma linhagem celular CHO DG44, desenvolveu-se em cultura em meio DMEM/F12 (10% de FBS), utilizando lipofectamina (Invitrogene, EUA), para se obter um transformante. Manteve-se o transformante a incubar em meio seletivo que contém 1 mg/mL de G418 e metotraxatro 10 nM, e selecionou-se as linhagens celulares monoclonais a partir deste. Depois, selecionou-se por fim uma linhagem celular que apresenta uma boa resposta de cAMP dependente de concentração a GLP-1 a partir das linhagens celulares monoclonais.
Exemplo 1-2: produção de uma linha celular que apresente uma resposta de cAMP a glucagon
[105] Utilizando uma porção correspondente ao ORF (quadro aberto de leitura) de cADN (OriGene Technologies, Inc. EUA) do gene do receptor de glucagon humano como matriz, efetuou-se PCR utilizando iniciadores inversos e diretos, incluindo um local de clivagem de EcoRI e u local de clivagem de XhoI, respectivamente, obtendo assim um produto de PCR.
[106] Iniciador direto: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3' (SEQ ID NO: 52)
[107] Iniciador inverso: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3' (SEQ ID NO: 53)
[108] Clonou-se o produto de PCR no vetor de expressão celular animal conhecido, x0GC/dhfr, construindo assim o vetor recombinante x0GC/GCRG.
[109] Introduziu-se o vetor recombinante x0GC/GCRG em uma linhagem celular CHO DG44, desenvolveu-se em cultura em meio DMEM/F12 (10% de FBS), utilizando lipofectamina (Invitrogene, EUA), para se obter um transformante. Manteve-se o transformante a incubar em meio seletivo que contém 1 mg/mL de G418 e metotraxatro 10 nM, e selecionou-se as linhagens celulares monoclonais a partir deste. Depois, selecionou-se por fim uma linhagem celular que apresenta uma boa resposta de cAMP dependente de concentração a glucagon a partir das linhas celulares monoclonais.
Exemplo 2: atividade in vitro dos derivados de oxintomodulina Exemplo 2-1: síntese dos derivados de oxintomodulina
[110] Para se medir as atividades in vitro dos derivados de oxintomodulina, utilizou-se os derivados de oxintomodulina que têm as sequências de aminoácidos apresentadas na tabela 1 seguinte.Tabela 1 Oxintomodulina e derivados de oxintomodulina
Figure img0001
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[111] Na tabela 1 acima, os aminoácidos indicados pelas letras em negrito nas sequências SEQ ID NOs.19, 20, 22, 25, 26, 27, 32, 33 e 34, em conjunto, formam um anel e os aminoácidos indicados por X representam ácido alfa-metil-glutâmico, que é um aminoácido não nativo. Além disso, CA indica 4-imidazoacetilo, DA indica desamino-histidilo, Aib indica ácido aminoisobutírico e (d)S indica d-serina. Exemplo 2-2: medição das atividades in vitro dos derivados de oxintomodulina
[112] Para se medir os efeitos das peptídeos anti-obesidade, mediu-se as atividades in vitro das células utilizando os transformantes preparados nos exemplos 1-1 e 1-2.
[113] Transformou-se cada um dos transformantes de modo a que estes expressem cada um dos genes do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon humanos em CHO (ovários de hamster chinês) e mediu-se as atividades de GLP- 1 e glucagon. Assim, a atividade de cada um dos derivados de oxintomodulina foi medida utilizando cada um dos transformantes.
[114] Especificamente, cada um dos transformantes foi submetido a subcultura duas ou três vezes por semana e introduziu-se as células em cada cavidade de uma placa com 96 cavidades a uma densidade de 1 X 105 células/cavidade e desenvolveu-se em cultura durante 24 horas.
[115] Lavou-se as células de cultura com tampão de KRB, colocou-se em suspensão em 40 mL de tampão de KRB 1 mM que contêm IBMX e p manteve-se em repouso à temperatura ambiente durante 5 minutos. Diluiu-se em série a oxintomodulina e os derivados de oxintomodulina (SEQ ID NO: 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 e 32-34), cinco vezes, desde 1000 nM até 0,02 nM, e adicionou- se 40 mL de cada uma das diluições às células, as quais foram então mantidas a incubar em uma incubadora de CO2, a 37°C durante 1 hora. Depois, adicionou-se 20 mL de tampão de lise celular para lisar as células e mediu-se a concentração de cAMP em cada um dos lisados de células, utilizando um estojo de ensaio de cAMP (Molecular Device, EUA). A partir dos resultados das medições, calculou-se os valores de CE50 e comparou-se entre si (tabela 2).Tabela 2 Comparação das atividades in vitro do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon entre os derivados de oxintomodulina
Figure img0004
Figure img0005
[116] Conforme pode ser observado na tabela 2 anterior, os derivados de oxintomodulina demonstraram excelentes atividades in vitro de GLP-1 e glucagon, em compactação com a oxintomodulina da SEQ ID NO:1.
[117] Sabe-se que a oxintomodulina pode ser utilizada para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, através da activação do receptor de GLP-1 e do receptor de glucagon. Os derivados de oxintomodulina de acordo com a invenção apresente uma excelente atividade para ativar o receptor de GLP-1 e o receptor de glucagon em comparação com a oxintomodulina nativa, podendo assim ser utilizados para o tratamento de hiperlipidemia e da doença hepática gordurosa e arteriosclerose associadas a hiperlipidemia, em vez da oxintomodulina nativa.
Exemplo 3: preparação de um conjugado que compreende um derivado de oxintomodulina ( SEQ ID NO : 23) com Fc de imunoglobulina (conjugado de imunoglobulina Fc-derivado de oxintomodulina 23)
[118] Para se pegilar um resíduo cisteína na posição 24 de um derivado de oxintomodulina de SEQ ID NO: 24 com MAL-10K-ALD PEG (NOF., Japão), deixou-se reagir o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) e MAL-10K-ALD PEG entre si em uma proporção molar de 1:3, a uma concentração de proteína de 3 mg/mL, à temperatura ambiente durante 3 horas. Efetuou-se a reação em tampão Tris 50 mM (pH 8,0) que continha guanidina 1M. Depois de se completar a reação, purificou-se a solução de reação utilizando SOURCE S sob as condições seguintes, obtendo-se assim uma oxintomodulina mono-pegilada na cisteína: coluna: SOURCE S, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + 45% de etanol, B: A + KCl 1M)).
[119] A seguir, deixou-se reagir o derivado de oxintomodulina mono-pegilado purificado (SEQ ID NO: 23) e Fc de imunoglobulina entre si a uma proporção molar de 1:5 e uma concentração em proteína de 20 mg/mL, a 4°C durante 16 horas. efetuou-se a reação em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) que contém SCB 20mM como agente redutor. Depois de se completar a reação, purificou-se a solução sob as condições seguintes, obtendo-se assim um conjugado que compreende o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 23) e imunoglobulina: coluna: SOURCE 15Q, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente: A 0 ^ 4% 1 min, B ^ 20% 80 min B (A: Tris-HCl 20mM, pH 7,5, B: A + NaCl 1M)); coluna ‘source ISSO’: SOURCE ISO, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: Tris-HCl 20mM, pH 7,5, B: A + AS 1,1 M).
Exemplo 4: preparação de um conjugado que compreende um derivado de oxintomodulina ( SEQ ID NO : 25) com Fc de imunoglobulina (conjugado de Fc de imunoglobulina-derivado de oxintomodulina 25)
[120] Para se pegilar um resíduo cisteína na posição 30 de um derivado de oxintomodulina de SEQ ID NO: 25 com MAL-10K-ALD PEG, deixou-se reagir o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) e MAL-10K-ALD PEG entre si em uma proporção molar de 1:3, a uma concentração de proteína de 3 mg/mL, à temperatura ambiente durante 3 horas. Efetuou-se a reação em tampão Tris 50 mM (pH 8,0) que continha guanidina 1M. Depois de se completar a reação, purificou-se a solução de reação utilizando SOURCE S sob as condições seguintes, obtendo-se assim uma oxintomodulina mono-pegilada na cisteína: coluna: SOURCE S, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente: A 0 ^100% 50 min B (A: Na-citrato 20 mM, pH 3,0 + 45% de etanol, B: A + KCl 1M)).
[121] A seguir, deixou-se reagir o derivado de oxintomodulina mono-pegilado purificado (SEQ ID NO: 25) e Fc de imunoglobulina entre si a uma proporção molar de 1:5 e uma concentração em proteína de 20 mg/mL, a 4°C durante 16 horas. efetuou-se a reação em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,0) que contém SCB 20mM como agente redutor. Depois de se completar a reação, purificou-se a solução sob as condições seguintes, obtendo-se assim um conjugado que compreende o derivado de oxintomodulina (SEQ ID NO: 25) e imunoglobulina: coluna SOURCE 15Q: SOURCE 15Q, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente A 0 → 4% 1 min, B → 20% 80 min B (A: Tris-HCl 20mM, pH 7,5, B: A + NaCl 1M)); coluna ‘source ISSO’: SOURCE ISO, caudal: 2,0 mL/minuto, gradiente: B 0 ^ 100% 100 min A, (A: Tris-HCl 20mM, pH 7,5, B: A + AS 1,1 M).
Exemplo 5: efeito de oxintomodulina de ação prolongada na redução de lípidos em um modelo de hiperlipidemia em hamsters Exemplo 5-1: agrupamento dos animais de teste
[122] Adquiriu-se hamsters machos com 8 semanas de idade (hamsters Golden Syrian, 120-130 g) à Vital River China. Sabe-se que os hamsters apresentam perfis de lípidos no sangue semelhantes aos dos humanos, ao contrário de outros roedores, e são sensíveis a dietas com teor elevado em gorduras.
[123] Deixou-se os animais com acesso a dieta esterilizada com teor elevado em gordura (Purina 5001, que contém 11,5% de óleo de milho, 11,5% de óleo de coco, 0,5% e colesterol e 0,25% de desoxicolato; Dyets, Bethlehem, PA) ou a dieta padrão para roedores (teor reduzido em gordura, 2018; Harlan Teklad, Madison, WI). Ao grupo de dieta normal deu-se acesso a água corrente filtrada e esterilizada-UV e ao grupo de dieta com teor elevado em gordura deu-se acesso a água que contém 10% de fructose. Manteve-se o animais em uma câmara de criação, satisfazendo os padrões de GLP, sob um ciclo de 12 horas de luz/12 h de escuridão (luz: 6 da manhã até às 6 da tarde), e todos os procedimentos experimentais foram efetuados de acordo com as linhas orientadoras padrão para experiências em animais. A administração de fármaco teve início após 3 semanas de indução de hiperlipidemia e os animais foram divididos em quatro grupos (n=6), tal como apresentado na tabela 3 seguinte.Tabela 3
Figure img0006
[124] Especificamente, o grupo 1 (grupo normal) foi alimentado com ração normal e foi administrado por via subcutânea com 5 ml/kg de soluto salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma), uma ou mais vezes por semana.
[125] O grupo 2 (grupo com hiperlipidemia induzida) foi alimentado com uma dieta com um teor elevado de gordura para induzir hiperlipidemia e depois foi administrado por via subcutânea com 5 ml/kg de soluto salino tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS, Sigma), uma ou mais vezes por semana.
[126] O grupo 3 (grupo com hiperlipidemia induzida + grupo administrado com 3,25 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc) foi alimentado com uma dieta com um teor elevado de gordura para induzir hiperlipidemia e depois foi administrado por via subcutânea com 3,25 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc (preparado no exemplo 4), uma vez por semana, em uma injecção com dose de 5 ml/kg.
[127] O grupo 4 (grupo com hiperlipidemia induzida + grupo administrado com 8,96 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc) foi alimentado com uma dieta com um teor elevado de gordura para induzir hiperlipidemia e depois foi administrado por via subcutânea com 8,96 nmol/kg de conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc (preparado no exemplo 3), uma vez por semana, em uma injecção com dose de 5 ml/kg.
[128] Administrou-se soluto salino ou o fármaco a cada grupo (n=6) durante 2 semanas e depois analisou-se os seus efeitos na redução dos níveis de lípidos.
Exemplo 5-2: análise do efeito do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada na redução dos níveis de lípidos
[129] Para se examinar o efeito do conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada na redução dos níveis de lípidos em hamsters, foram realizadas as experiências seguintes.
[130] Recolheu-se sangue a partir dos hamsters aos quais tinha sido administrado ou não o derivado de oxintomodulina de ação prolongada, conforme descrito no exemplo 5-1, e analisou-se os níveis de lípidos no sangue, utilizando o aparelho HITACHI 7020. Os resultados das análises são apresentados nas FIGS. 1 a 5.
[131] As FIGS. 1 a 5 mostram a alteração nos níveis de triglicéridos no sangue (FIG. 1), da alteração dos níveis de colesterol total no sangue (FIG. 2), da alteração dos níveis de colesterol LDL (FIG. 3), a alteração dos níveis de colesterol HDL no sangue (FIG. 4), e a alteração do rácio de colesterol HDL/LDL (FIG. 5). Os resultados obtidos foram processados estatisticamente e os valores médios e os desvios padrão dos valores médios foram calculados. Na verificação de significância entre os grupos (n=6), os dados foram processados estatisticamente utilizando o teste de Dunnett de uma via ANOVA, e um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
[132] Especificamente, nos resultados da medição dos níveis de triglicéridos no sangue, observou-se que, no caso dos hamsters alimentados com a dieta com teor elevado em gorduras, os níveis de triglicéridos aumentaram significativamente, mas quando foi administrado o derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc) aos hamsters, os níveis de triglicéridos diminuíram significativamente (FIG. 1).
[133] Nos resultados da medição dos níveis de colesterol total no sangue, observou-se que, no caso dos hamsters alimentados com a dieta com teor elevado em gorduras, os níveis de colesterol total no sangue aumentaram significativamente, mas quando foi administrado o derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc) aos hamsters, os níveis de colesterol total no sangue diminuíram significativamente (FIG. 2).
[134] Nos resultados da medição dos níveis de colesterol LDL no sangue, observou-se que, no caso dos hamsters alimentados com a dieta com teor elevado em gorduras, os níveis de colesterol LDL no sangue aumentaram significativamente, mas quando foi administrado o derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado de SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado de SEQ ID NO: 23-Fc) aos hamsters, os níveis de colesterol LDL total no sangue diminuíram significativamente (FIG. 3).
[135] Nos resultados da medição dos níveis de colesterol HDL/LDL no sangue, o grupo administrado com o conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc ou com o conjugado da ID NO: 23-Fc demonstrou um aumento significativo nos níveis de colesterol HDL no sangue, em comparação com o grupo de hamsters de dieta com teor elevado em gorduras (FIG. 4).
[136] Nos resultados da medição dos níveis de colesterol HDL no sangue, o grupo administrado com o conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc ou com o conjugado da ID NO: 23-Fc demonstrou um aumento significativo nos níveis de colesterol HDL/LDL no sangue, em comparação com o grupo de hamsters de dieta com teor elevado em gorduras (FIG. 5).
[137] A partir dos resultados anteriores, é possível concluir que o conjugado do derivado de oxintomodulina da presente invenção, que compreende a região Fc de imunoglobulina covalentemente ligada ao derivado de oxintomodulina por PEG, previne a acumulação de triglicéridos e de colesterol de baixa densidade (LDL) no sangue, podendo assim ser eficazmente utilizado para o tratamento de hiperlipidemia ou de doença hepática gordurosa ou arteriosclerose associadas.
Exemplo 6: análise dos efeitos de análogo de GLP-1 de ação prolongada conhecido e do conjugado de derivado de oxintomodulina de ação prolongada
[138] O VICTOZA <®> é um peptídeo 1 de tipo glucagon de ação prolongada, análogo de GLP-1 que é presente comercializado como agente para o tratamento de diabetes e sobre o qual se sabe que possui os efeitos para o tratamento de obesidade e de aumentar os níveis de colesterol HDL.
[139] O efeito de redução dos níveis de lípidos foi comparado entre o conjugado de derivado de oxintomodulina e VICTOZA <®> conhecido.
[140] Tal como descrito no exemplo 5, dividiu-se os hamsters em um grupo normal de hamsters e em grupos de hamsters alimentados com uma dieta de elevado teor em gordura. O grupo normal de hamsters foi administrado subcutaneamente com 5 ml/kg de DPBS, uma ou mais vezes por semana. Os grupos de hamsters alimentados com a dieta com teor elevado em foi dividido em um grupo administrado subcutaneamente com 5 ml/kg de DPBS, uma ou mais vezes por semana, um grupo administrado subcutaneamente com 35,5 nmol/kg de VICTOZA <®>, uma ou mais vezes por semana, um grupo administrado subcutaneamente com 3,25 nmol/kg do conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc e um grupo a administrado subcutaneamente com 8,96 nmol/kg do conjugado da SEQ ID NO:23-Fc, e analisou-se os níveis de lípidos no sangue dos grupos.
[141] Como resultado, foi possível observar que a administração do conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado da SEQ ID NO: 23-Fc) apresentou uma diminuição nos níveis de colesterol total no sangue (FIG. 6) e uma diminuição no nível de colesterol LDL no sangue (FIG. 7), em comparação com a administração do produto comercial VICTOZA <®>.
[142] Além disso, foi possível observar que a administração do conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado da SEQ ID NO: 23-Fc) apresentou um aumento dos níveis de colesterol HDL no sangue e no rácio de colesterol HDL/LDL, em comparação com a administração de VICTOZA <®> (FIGS. 8 e 9). Em particular, o conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc de ação prolongada apresentou um aumento significativo nos níveis de colesterol HDL e no rácio de colesterol HDL/LDL, em comparação com VICTOZA <®>.
[143] Além disso, a administração do conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada (conjugado da SEQ ID NO: 25-Fc ou conjugado da SEQ ID NO: 23-Fc) apresentou uma diminuição nos níveis de triglicéridos no sangue, em comparação com a administração de VICTOZA <®>.
[144] A partir dos resultados anteriores, é possível concluir que o conjugado do derivado de oxintomodulina de ação prolongada da presente invenção exibe um efeito de redução de lípidos que é igual ou superior ao de VICTOZA <®>, pelo que o conjugado pode ser eficazmente utilizado para o tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose.

Claims (13)

1. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, em que a sequência de aminoácidos de derivados de oxintomodulina é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 23 a 28.
2. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos dos derivados de oxintomodulina serem selecionados do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 24 a 26 e 28
3. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o derivado de oxintomodulina estar na forma de um conjugado ligado a um selecionado do grupo consistindo de um fragmento de imunoglobulina, um anticorpo, elastina, albumina e fibronectina.
4. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o conjugado ser um conjugado no qual o derivado de oxintomodulina, para o qual a sequência de aminoácidos é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID Nos: 23 a 28, é ligado a uma região Fc de imunoglobulina via um polímero não-peptídico.
5. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o polímero não peptídico ser selecionado do grupo consistindo de polietileno-glicol, polipropileno-glicol, um copolímero de etileno- glicol/propileno-glicol, poliol polioxietilado, álcool polivinílico, polissacarídeos, éter polivinil-etílico, PLA (ácido poliláctico), PLGA (ácido poliláctico-glicólico), polímeros de lipídeos, ácido hialurônico e combinações dos mesmos.
6. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os polissacarídeos serem dextrana ou quitinas.
7. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por uma extremidade do polímero não peptídico e a outra estarem ligadas a um grupo amina ou a um grupo tiol da região Fc de imunoglobulina e ao derivado de oxintomodulina, respetivamente.
8. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o medicamento ainda compreender um agente farmacêutico que apresenta efeitos preventivos ou terapêuticos contra hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose.
9. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença hepática gordurosa ser doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática gordurosa alcoólica ou esteato-hepatite.
10. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a doença hepática gordurosa não alcoólica ser resultado de hiperlipidemia, diabetes ou obesidade.
11. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a doença hepática gordurosa não alcoólica ser selecionada do grupo consistindo de esteatose simples, esteato-hepatite não alcoólica, fribrose hepática e cirrose hepática.
12. Uso de uma composição compreendendo um derivado de oxintomodulina como um ingrediente ativo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a doença hepática gordurosa ser doença hepática gordurosa nutricional, doença hepática gordurosa por inanição, doença hepática gordurosa por obesidade e doença hepática gordurosa diabética.
13. Uso de um derivado de oxintomodulina caracterizado por ser na preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de hiperlipidemia, doença hepática gordurosa ou arteriosclerose, em que a sequência de aminoácidos do derivado de oxintomodulina é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 23 a 28.
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