KR20140018462A - 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물 - Google Patents

옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물 Download PDF

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KR20140018462A
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Abstract

본 발명은 옥신토모듈린 유도체를 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 지방간 질환 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 천연형의 옥신토모듈린에 비해 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에 대해 높은 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 고지방 식이로 인해 증가된 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 고밀도 콜레스테롤 및 고밀도 콜레스테롤/저밀도 콜레스테롤의 비율을 증가시키는 효과를 가진다. 따라서, 고지혈증 및 이와 관련된 질환의 치료에 있어서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물 {A composition for treating hyperlipidemia comprising oxyntomodulin analog}
본 발명은 옥신토모듈린 유도체를 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 지방간 질환 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 우리나라에서는 경제 성장과 식생활의 서구화로 인하여 음식물에서 얻는 지방분의 섭취양이 증가하였으며, 운동부족 등으로 인한 고지혈증, 당뇨병, 고혈압, 동맥 경화증 및 지방간과 같은 대사성 질환이 증가하고 있는 추세이다.
고지혈증(Hyperlipidemia)은 혈액 내에 유리 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 인지질, 중성 지방 등의 지방질이 비정상적으로 증가된 상태를 말한다. 고지혈증은 (1)고콜레스테롤혈증 (2) 고중성지방혈증 (3) 조합 고지혈증 (고콜레스테롤혈증 및 고중성지방혈증)의 3가지 형태로 나타날 수 있다. 고지혈증은 통상적으로 일차 또는 이차 고지혈증으로 분류된다. 일차 고지혈증은 일반적으로 유전적 결손에 의한 것인 반면, 이차 고지혈증은 다양한 질환 상태, 약물 및 식이 습관에 의해 유발된다. 또한 고지혈증의 일차 및 이차원인 모두에 조합에 의해 고지혈증이 유발되기도 한다. 고지혈증의 진단 기준으로서, 일반적으로 총콜레스테롤의 기준치로서 220 mg/dl이상, 중성지방의 기준치로서 150 mg/dl이상이 사용되고 있다.
포유류에서 자연 발생하여 순환하는 혈중 콜레스테롤에는 여러 형태가 있다. 저밀도 콜레스테롤 (LDL-cholesterol)은 건강에 해로운 콜레스테롤로 알려져 있는데 저밀도 콜레스테롤의 증가는 심장 질환의 위험을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Assman et al., Am. J. Card, 1996). 또한 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)은 좋은 콜레스테롤로 간주되며 동맥 경화를 예방하는 등 건강에 필수적이다.
고지혈증은 일반적으로 그 자체가 특정 증상을 나타내는 것은 아니나, 혈액 내에 과다한 지질은 혈관 벽에 달라붙어 혈관 크기를 줄이며, 염증 반응을 통한 동맥경화(Atherosclerosis)를 일으킨다. 이로 인해 관상동맥 심장질환이나 뇌혈관 질환, 말초 혈관의 폐쇄 등이 발생할 수 있다 (E. Falk et al., Circulation, 1995). 또한 과다한 혈액 내 지질은 간 조직에 축적되게 되며 이로 인해 지방간(Fat liver)이 유발될 수 있다. 상기에서 지방간은 간의 무게에서 지방이 차지하는 비율이 5%를 초과한 상태를 말하며, 과다한 지방 섭취뿐만 아니라 알코올 섭취에 의해서도 유발될 수 있다.
현재까지 혈중 지질 농도를 감소시키는 방법으로는 콜레스테롤이나 지방이 많이 함유되어 있는 음식물의 섭취를 줄이는 식이요법, 운동 요법 및 약물 요법 등이 사용되고 있다. 하지만 식이 요법이나 운동 요법은 엄격한 관리 및 실시가 곤란하며, 그 치료 효과에 있어서도 한계가 있다. 현재까지 개발된 지질 농도를 감소시키는 약물로는 담즙산 결합수지, 콜레스테롤 생합성에 있어서 중요한 효소인 HMG-CoA 환원효소 억제제 (HMF-CoA reductase inhibitors)와 같은 콜레스테롤 양을 낮추어주는 약물, 피브린산 유도체, 니코틴 산 등의 중성지방을 낮추는 약제들이 개발되었다. 그러나 이들 약제는 간독성, 위장장애 및 발암성 등의 부작용이 보고되었다. 따라서 혈중 지질 농도를 효과적으로 낮추어서 고지혈증 및 이와 관련된 질병(예를 들어, 동맥경화증, 지방간)의 치료에 사용할 수 있으면서 부작용이 적은 약제의 개발이 시급한 실정이다.
이러한 하나의 후보물질로서 옥신토모듈린이 최근 각광을 받고 있다. 옥신토모듈린은 전구체인 프리 글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지며 주요 특징으로서 Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1)과 글루카곤 (glucagon)수용체에 모두 결합하여 이중 기능 (dual function)을 할 수 있는 펩타이드이기 때문에, 비만, 고지혈증, 지방간 f치료 등 다양한 목적으로 연구가 되고 있다.
그러나, 옥신토모듈린은 생체 내에서 반감기가 짧고, 이의 활성이 상기 비만, 고지혈증, 지방간 치료 등에 사용될 수 있을 정도로 나타나지 않아 고용량을 투여해야 하는 문제점이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 천연형 옥신토모듈린보다 활성이 증진된 옥신토모듈린 유도체를 개발하고, 상기 유도체가 고지혈증이 유도된 햄스터 모델에서 혈중 내 지질 함량 및 비율을 개선시킴으로써, 고지혈증 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 일 양태로서, 옥신토모듈린 유도체를 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "옥신토모듈린(oxyntomodulin)"이란 글루카곤의 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 옥신토모듈린은 천연형 옥신토모듈린, 이의 전구물질(precursor), 유도체 (analog), 단편 (fragments) 및 변이체 (variants) 등을 포함한다. 바람직하게는 서열번호1(HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA)의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에서 용어, "옥신토모듈린 변이체"는, 천연형 옥신토모듈린과 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩타이드로서, GLP-1과 글루카곤 수용체 활성화 기능을 보유한 펩타이드를 의미하며, 천연형 옥신토모듈린에서 일부 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion) 및 수식(modification) 중에 어느 하나의 방법 또는 이들의 방법의 조합을 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 용어, "옥신토모듈린 유도체"란 상기 천연형 옥신토모듈린의 일부 아미노산을 부가, 결실 또는 치환의 형태로 변형시켜서, GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체를 모두 활성화시킬 수 있고, 원래의 옥신토모듈린에 비하여 상기 각 수용체를 높은 수준으로 활성화시킬 수 있는 펩티드, 펩티드 유도체 또는 펩티드 모방체 등을 포함한다.
본 발명에서 용어, "옥신토모듈린 단편"은 옥신토모듈린의 아미노말단 또는 카르복시말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지않는 아미노산 (예; D형 아미노산)도 가능할 수 있다. 이러한 옥신토모듈린 단편은 체내에서 혈당조절 기능을 보유한다.
옥신토모듈린 변이체, 유도체, 및 단편에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고, N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화 (deamination)된 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 둘 다에 대한 활성화 기능을 보유한 펩타이드도 포함된다.
본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌A 아르기닌R
아스파라긴N 아스파르트 산D
시스테인C 글루타민 산E
글루타민Q 글리신G
히스티딘H 아이소루이신I
루이신L 리신K
메티오닌M 페닐알라닌F
프롤린P 세린S
트레오닌T 트립토판W
타이로신Y 발린V
본 발명에서 옥신토모듈린 유도체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 아미노산의 치환, 부가 결실 또는 번역후 변형(예를 들어, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 분자내 공유결합)되어, 글루카곤과 GLP-1 수용체를 동시에 활성화시킬 수 있는 임의의 펩티드를 포괄한다. 상기 아미노산의 치환 또는 부가시에는 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매가능하다.
구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 하기 일반식 1의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(일반식 1)
상기 식에서,
R1은 히스티딘, 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), 디메틸-히스티딜 (N-dimethyl-histidyl), 베타-히드록시 이미다조프로피오닐 (beta-hydroxyimidazopropionyl), 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl), 베타-카르복시 이미다조프로피오닐 (beta-carboxy imidazopropionyl) 또는 티로신이며;
X1은 Aib(aminoisobutyric acid), d-알라닌, 글리신, Sar(N-methylglycine), 세린 또는 d-세린이고;
X2는 글루탐산 또는 글루타민이며;
X3은 류신 또는 티로신이고;
X4는 세린 또는 알라닌이며;
X5는 리신 또는 아르기닌이며;
X6는 글루타민 또는 티로신이고;
X7은 류신 또는 메티오닌이며;
X8은 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
X9은 글루탐산, 세린, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X10는 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌, 세린 또는 결실된 서열이고;
X11은 알라닌, 아르기닌, 발린 또는 결실된 서열이며;
X12은 알라닌, 아르기닌, 세린, 발린 또는 결실된 서열이고;
X13는 리신, 글루타민, 아르기닌, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X14은 아스파르트산, 글루탐산, 류신 또는 결실된 서열이고;
X15는 페닐알라닌 또는 결실된 서열이며;
X16는 이소류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X17는 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 리신, 글루타민, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이고;
X18는 트립토판 또는 결실된 서열이며;
X19은 알라닌, 이소류신, 류신, 세린, 발린 또는 결실된 서열이며;
X20는 알라닌, 리신, 메티오닌, 글루타민, 아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X21은 아스파라긴 또는 결실된 서열이며;
X22은 알라닌, 글리신, 트레오닌 또는 결실된 서열이며;
X23는 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이고;
X24은 알라닌, 글리신 및 세린의 조합으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드 또는 결실된 서열이며; 및,
R2는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37), HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 1의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 야생형의 옥신토모듈린의 글루카곤 수용체 및 GLP-1 수용체에 대한 활성을 높이기 위해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 1번 아미노산인 히스티딘의 알파 카본을 결실시킨 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl), N-말단 아미노기를 결실시킨 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), N-말단 아미노기를 2개의 메틸그룹으로 수식한 디메틸-히스티딜 (N-dimethyl-histidyl), N-말단 아미노기를 하이드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐 (beta-hydroxyimidazopropionyl), 또는 N-말단 아미노기를 카르복실 그룹으로 치환한 베타-카르복시 이미다조프로피오닐 (beta-carboxy imidazopropionyl)로 치환할 수 있다. 또한, GLP-1 수용체와 결합하는 부위를 소수성 결합과 이온 결합을 강화시키는 아미노산으로 치환시키거나 또는 이들을 조합할 수 있다. 또한, 옥신토모듈린 서열의 일부 서열을 GLP-1의 아미노산 서열 또는 Exendin-4의 아미노산 서열로 치환하여 GLP-1 수용체의 활성을 높일 수 있다.
또한, 옥신토모듈린 서열의 일부 서열을 알파 헬릭스를 강화시키는 서열로 치환시킬 수 있다. 바람직하게는 상기 일반식 1의 아미노산 서열의 10, 14, 16, 20, 24 및 28번 아미노산이 알파 헬릭스에 도움을 주는 것으로 알려진 Tyr(4-Me), Phe, Phe(4-Me), Phe(4-Cl), Phe(4-CN), Phe(4-NO2), Phe(4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala(2-thienyl) 또는 Ala(benzothienyl)로 구성되는 아미노산 혹은 아미노산 유도체로 치환될 수 있으며, 삽입될 수 있는 알파 헬릭스에 도움을 주는 아미노산 혹은 아미노산 유도체의 종류 및 개수는 제한되지 않는다. 또한, 바람직하게는 10과 14번, 12와 16번, 16과 20번, 20과 24번 및 24와 28번은 각각 링을 형성할 수 있는 글루탐산 또는 리신으로 치환하여 링을 형성할 수 있으며, 삽입되는 링의 개수 역시 제한되지 않고, 가장 바람직하게는 하기의 일반식 1 내지 6으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 옥신토모듈린 유도체일 수 있다.
구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열에 엑센딘 혹은 GLP-1의 서열로 치환한 하기 일반식 2의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-A-R3(일반식 2)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열 일부와 엑센딘 또는 GLP-1의 서열 일부를 적당한 아미노산 링커로 연결한 하기 일반식 3의 아미노산을 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-B-C-R4(일반식 3)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 옥신토모듈린의 아미노산 서열의 일부를 GLP-1 수용체와의 결합력을 높이는 아미노산으로 치환, 예컨대 26번째 Leu을 GLP-1 수용체와 소수성 결합을 하는 바, 소수성을 증가시키는 아미노산인 Ile 혹은 Val으로 치환된 하기 일반식 4를 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3(일반식 4)
다른 구체적인 일 양태에서, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 고유 옥신토모듈린의 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체의 활성을 높이기 위해 아미노산 서열 일부를 삭제하거나 아미노산 일부를 삽입하거나 아미노산 일부를 다른 아미노산으로 치환한 하기 일반식 5를 포함하는 신규한 펩티드이다.
R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5(일반식 5)
상기 일반식 2 내지 5에 있어서,
R1은 상기 일반식 1에서 설명된 구성과 동일하고;
A는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(서열번호 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(서열번호 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(서열번호 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(서열번호 46) 및 SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(서열번호 47)로 구성되는 군으로부터 선택되고;
B는 SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(서열번호 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT(서열번호 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT(서열번호 43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG(서열번호 45), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAA(서열번호 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNG(서열번호 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW(서열번호 48), 및 SQGTFTSDYSRYLD(서열번호 49)로 구성되는 군으로부터 선택되며;
C는 알라닌, 글리신 및 세린의 조합으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드이고;
D1은 세린, 글루탐산 또는 아르기닌이며;
D2는 아르기닌, 글루탐산 또는 세린이고;
D3은 아르기닌, 알라닌 또는 발린이며;
D4는 아르기닌, 발린 또는 세린이고;
D5는 글루타민, 아르기닌 또는 리신이며;
D6은 이소류신, 발린 또는 세린이고;
D7은 메티오닌, 아르기닌 또는 글루타민이며;
D8은 트레오닌, 글리신 또는 알라닌이고;
E1은 세린, Aib, Sar, d-알라닌 또는 d-세린이며;
E2는 세린 또는 글루탐산이고;
E3은 아르기닌 또는 리신이며;
E4는 글루타민 또는 리신이고;
E5는 아스파르트산 또는 글루탐산이며;
E6는 글루타민, 시스테인 또는 리신이고;
E7은 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이며;
R3은 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36) 또는 GPSSGAPPPSK(서열번호 37)이며;
R4는 HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39) 또는 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40)이고; 및,
R5는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 2 내지 5의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
바람직하게는, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 하기 일반식 6의 신규한 펩티드일 수 있다.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2(일반식 6)
상기 일반식 6에 있어서,
R1은 히스티딘, 데스아미노-히스티딜 (desamino-histidyl), 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl) 또는 티로신이며;
X1은 Aib(aminoisobutyric acid), 글리신, 세린 또는 d-세린이고;
X2는 글루탐산 또는 글루타민이며;
X3은 류신 또는 티로신이고;
X4는 세린 또는 알라닌이며;
X5는 리신 또는 아르기닌이며;
X6는 글루타민 또는 티로신이고;
X7은 류신 또는 메티오닌이며;
X8은 아스파르트산 또는 글루탐산이고;
X9은 글루탐산, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X10는 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X11은 알라닌, 아르기닌 또는 결실된 서열이며;
X12은 알라닌, 발린 또는 결실된 서열이고;
X13는 리신, 글루타민, 아르기닌, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이며;
X14은 아스파르트산, 글루탐산, 류신 또는 결실된 서열이고;
X15는 페닐알라닌 또는 결실된 서열이며;
X16는 이소류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X17는 알라닌, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 알파-메틸-글루탐산 또는 결실된 서열이고;
X18는 트립토판 또는 결실된 서열이며;
X19은 알라닌, 이소류신, 류신, 발린 또는 결실된 서열이며;
X20는 알라닌, 리신, 메티오닌,아르기닌 또는 결실된 서열이고;
X21은 아스파라긴 또는 결실된 서열이며;
X22은 트레오닌 또는 결실된 서열이며;
X23는 시스테인, 리신 또는 결실된 서열이고;
X24은 글리신으로 구성된 2 내지 10개의 아미노산을 가지는 펩타이드 또는 결실된 서열이며; 및,
R2는 KRNRNNIA(서열번호 35), GPSSGAPPPS(서열번호 36), GPSSGAPPPSK(서열번호 37), HSQGTFTSDYSKYLD(서열번호 38), HSQGTFTSDYSRYLDK(서열번호 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK(서열번호 40) 또는 결실된 서열이다(단, 상기 일반식 6의 아미노산 서열이 서열번호 1과 동일한 경우는 제외한다).
보다 바람직하게는 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 서열번호 2 내지 34의 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 것일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 실시예 2-1의 표 1에 기재된 옥신토모듈린 유도체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 각각 서열번호 2 내지 34의 아미노산 서열을 갖는 옥신토모듈린 유도체를 제조하고, 상기 옥신토모듈린 유도체가 천연형 옥신토모듈린에 비해 우월한 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 활성을 나타냄을 확인하였는다(실시예 2). 즉, 상기 결과로부터 본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체를 활성화시켜서 종래의 옥신토모듈린보다 우수한 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증 치료 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
본 발명의 상기 옥신토모듈린 유도체는 치료학적 효능과 생체내 반감기를 증가시키기 위해 다양한 중합체의 결합체를 포함한다.
본 발명에서 결합체는 효력의 지속성이 천연형 옥신토모듈린에 비해 증가한 것을 의미하며, 상기 지속형 결합체는 천연형 옥신토모듈린의 아미노산이 수식, 치환, 추가 또는 제거된 형태, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 같은 생분해성 중합체가 옥신토모듈린에 결합된 결합체 혹은 알부민 (albumin), 항체(antibody), 엘라스틴 (Elastin), 피브리텍틴 (Fibronectin), 키틴(chitin)과 같은 당중합체(polysaccharide), 면역글로불린 단편과 같은 지속성이 뛰어난 단백질이 옥신토모듈린에 결합된 결합체, 혹은 비정형화된 폴리펩타이드의 결합체, 생체 내 알부민과 결합력을 갖는 지방산이 결합된 결합체 또는 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태의 옥신토모듈린을 포함할 수 있으며, 지속형 결합체의 종류는 본 발명에 제한을 두지 않는다.
바람직하게는, 상기 결합체는 서열번호 2 내지 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 옥신토모듈린 유도체 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 것이다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1)CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2)CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3)CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4)CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5)1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6)중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 본 발명에서 상기 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 링커와 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다.그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질약물과 결합될 수 있는 반응기를 가질 수 있다. 상기 비 펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알테히드 그룹, 부틸 알테히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체인 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 지속형 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 결합체는 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체의 아민그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합하는 것등이 될 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 비펩티드성 중합체는 양쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 포함하고, 상기 반응기는 특별히 이에 제한되지 않으나, 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹, 석시니미드(succinimide) 유도체(석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트) 등이 될 수 있다.
상기 비펩티드성 중합체의 양 말단 반응기는 서로 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 예를 들어, 상기 비펩티드성 중합체의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 그룹을 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹 또는 부틸 알데히드 그룹 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 비펩티드성 중합체의 한쪽 말단이 알데히드 그룹의 반응기를 포함하고, 다른 한쪽 말단이 말레이미드 그룹의 반응기를 포함하는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩티드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩티드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면, 프로피온 알데히드를 단독으로 포함하거나 또는 말레이미드 그룹과 알데히드 그룹을 동시에 포함하는 비펩티드성 중합체인 PEG를 사용하여, 옥신토모듈린 또는 그의 유도체와 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여, 결합체를 합성하였다.
본 발명의 약제학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 있다.
본 발명의 용어, "예방"이란 목적하는 질환의 발명을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 "예방"이란 본 발명의 옥신토모듈린 유도체를 투여함에 의하여 혈중 총 콜레스테롤 및 저밀도 콜레스테롤이 증가되며, 고밀도 콜레스테롤이 감소되는 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 발생을 억제하거나 지연되는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"란 발생된 질병의 증상을 경감, 개선 또는 완화시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 "치료"란 본 발명의 옥신토모듈린 유도체를 투여함에 의하여 혈중 총 콜레스테롤 및 저밀도 콜레스테롤이 증가되며, 고밀도 콜레스테롤이 감소되는 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 경감, 개선 또는 완화되는 것을 의미한다.
상기 "고지혈증"은 혈액 내에 유리 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 인지질, 중성 지방 등의 지방질이 비정상적으로 증가된 상태를 의미한다. 고지혈증은 일반적으로 그 자체가 특정 증상을 나타내는 것은 아니나, 혈액 내에 과다한 지질은 혈관 벽에 달라붙어 혈관 크기를 줄이며, 염증 반응을 통해 동맥경화(Atherosclerosis)를 일으킨다. 이로 인해 관상동맥 심장질환이나 뇌혈관 질환, 말초 혈관의 폐쇄 등이 발생할 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증 뿐만 아니라, 이로 인해 발생하는 관상동맥 심장질환, 뇌혈관 질환, 또는 말초 혈관의 폐쇄 등의 치료에 사용될 수 있다.
상기 "지방간"은 간의 무게에서 지방이 차지하는 비율이 5%를 초과한 상태를 의미한다. 본 발명의 지방간은 비알콜성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD), 알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환, 또는 지방간염을 모두 포함한다. 상기 비알콜성 지방간 질환은 원발성과 속발성에 따른 비알콜성 지방간 질환을 모두 포함하나, 바람직하게는 원발성 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 비알콜성 지방간 질환일 수 있다.
또한 본 발명에서 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간 (Simple steatosis), 비알콜성 지방간염 (Non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 및 이러한 질환의 전진에 의해 발생되는 간섬유화 (Liver fibrosis)와 간경화 (Liver cirrhosis)를 포함한다.
상기 동맥경화증(Atherosclerosis)은 주로 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 내막(endothelium)에 콜레스테롤이 침착하고 내피세포의 증식이 일어난 결과, 죽종(atheroma)이 형성되는 혈관질환을 말한다.
본 발명의 일 실시예에서는 폴리에틸렌글리콜을 통해 본 발명에 따른 옥신토모듈린 유도체와 면역글로블린 Fc 영역이 공유결합으로 연결된, 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체를 제조한 후 이를 고지방 식이 섭취로 인해 고지혈증이 유도된 햄스터 동물모델에 투여하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체를 투여한 군에서 고지혈증이 유도된 동물 모델 대비 혈중 중성지방의 농도가 현저히 감소하고(도 1), 혈중 총 콜레스테롤의 농도가 현저히 감소하며(도 2), 혈중 저밀도 콜레스테롤(LDL-콜레스테롤)의 농도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체를 투여한 군에서 고지혈증이 유도된 동물 모델 대비 혈중 고밀도 콜레스테롤(HDL-콜레스테롤)의 농도가 현저히 증가하며(도 4), 혈중 HDL-콜레스테롤/LDL-콜레스테롤의 비율이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 본 발명의 따른 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체는 상용화된 지속형 GLP-1 유사체인 VICTOZA®에 비해 혈중 총 콜레스테롤이 더 감소되고(도 6), 혈중 LDL-콜레스테롤의 양 및 중성지방의 양이 감소됨을 확인할 수 있었다(도 7). 뿐만 아니라, 본 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체 투여 시 혈중 HDL-콜레스테롤의 양 및 HDL/LDL-콜레스테롤 비율(ratio)이 VICTOZA®보다 더 증가됨을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9). 특히, 지속형 서열번호 25-Fc 결합체는 VICTOZA 보다 유의적으로 혈중 HDL 및 HDL/LDL-콜레스테롤 비율이 증가되었다.
즉, 본 발명에 따른 옥신토모듈린 유도체는 혈중 내 지질의 함량을 개선시킴으로써, 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증의 치료제로 유용히 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 결합체는 천연형 옥신토모듈린에 비하여 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에 우수한 활성을 가지며, Fc 영역을 결합시킴에 따라 체내에서 혈중 반감기를 증가시켜서, 오랜 시간 생체 내에서 활성을 유지시킬 수 있다.
본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 지방의 산화(Lipolysis)에 관여하는 효소의 활성을 조절하는 인자 (Protein kinase C-ζ, PKC-ζ)의 활성을 증가시킬 수 있으며, 지방의 산화(Lipolysis)에 관여하는 인자 (Glut2)의 발현을 증가시켜 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증을 예방 또는 치료할 수 있으나, 상기 작용기전에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물에는 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약학적 제제가 추가로 포함될 수 있다. 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증의 치료제로 공지된 약학적 제제를 병용투여하기 위해 본 발명의 조성물에 추가로 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료에 사용하기 위하여 단독으로 사용하거나, 또는 다른 약제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 유도체의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 옥신토모듈린 유도체를 포함한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 옥신토모듈린 유도체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 옥신토모듈린 유도체, 고지혈증, 지방간 질환, 및 동맥경화증은 상기 설명한 바와 동일하다.
상기 개체는 고지혈증, 지방간 질환, 또는 동맥경화증이 의심되는 개체로서, 상기 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 옥신토모듈린 유도체로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 치료 방법은 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 옥신토모듈린 유도체 결합체의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 옥신토모듈린 유도체 펩타이드의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 아미노말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유 결합된 옥신토모듈린 유도체 펩타이드를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체 펩타이드와 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 제조방법은 1) 각 말단에 알데히드 반응기과 말레이미드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 옥신토모듈린 유도체의 시스테인 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계; (2) (1)의 반응 혼합물로부터 시스테인 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및 (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린 유도체와 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 옥신토모듈린 유도체는 천연형의 옥신토모듈린에 비해 GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체에 대해 높은 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 고지방 식이로 인해 증가된 혈중 총 콜레스테롤, 저밀도 콜레스테롤 및 중성지방을 감소시키며, 고밀도 콜레스테롤 및 고밀도 콜레스테롤/저밀도 콜레스테롤의 비율을 증가시키는 효과를 가진다. 따라서, 고지혈증 및 이와 관련된 질환의 치료에 있어서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터(High fat diet-induced hyperlipidemia hamsters)에 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 중성 지방(Triglyceride) 농도의 변화를 나타낸 그래프이다 (#; 일반 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 증가를 나타낸다(p<0.001), *; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001)).
도 2는 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 총 콜레스테롤(Cholesterol) 농도의 변화를 나타낸 그래프이다(#; 일반 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 증가를 나타낸다(p<0.001), *; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001)).
도 3은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 LDL-콜레스테롤 농도의 변화를 나타낸 그래프이다(#; 일반 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 증가를 나타낸다(p<0.001), *; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001).
도 4는 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 HDL-콜레스테롤 농도의 변화를 나타낸 그래프이다(*; 고지방 사료군에 비해 99% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.01)).
도 5는 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 HDL/LDL-콜레스테롤 농도의 변화를 나타낸 그래프이다(*; 고지방 사료군에 비해 95% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.05)).
도 6은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 VICTOZA®, 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 총 콜레스테롤 농도를 고지방 식이 햄스터를 기준으로 나타낸 그래프이다(***; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001)).
도 7은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 VICTOZA?, 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 LDL-콜레스테롤 농도를 고지방 식이 햄스터를 기준으로 나타낸 그래프이다(***; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001)).
도 8은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 VICTOZA?, 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 HDL-콜레스테롤 농도를 고지방 식이 햄스터를 기준으로 나타낸 그래프이다(*; 고지방 사료군에 비해 95% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.05)).
도 9는 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 VICTOZA?, 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 HDL/LDL-콜레스테롤 농도의 변화를 나타낸 그래프이다(**; 고지방 사료군에 비해 99% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.01)).
도 10은 고지방 식이로 유도된 고지혈증 햄스터에 VICTOZA?, 지속형 옥신토모듈린 유도체 투여에 의한 혈중 중성 지방(Triglyceride) 농도를 고지방 식이 햄스터를 기준으로 나타낸 그래프이다 (***; 고지방 사료 군에 비해 99.9% 신뢰도 범위 내에서 유의적인 감소를 나타낸다(p<0.001)).
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. in vitro 활성용 세포주 생산
실시예 1-1: GLP -1에 대해 cAMP 반응을 보이는 세포주의 생산
인간 GLP-1 수용체 유전자의 cDNA(OriGene Technologies, Inc. USA)에서 ORF (open reading frame)에 해당하는 부분을 주형으로 하고, HindIII 절단부위와 EcoRI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
정방향 프라이머: 5'-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3'(서열번호 50)
역방향 프라이머: 5'-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3'(서열번호 51)
상기 PCR 산물을 공지된 동물세포 발현벡터인 x0GC/dhfr에 클로닝하여 제조합 벡터 x0GC/GLP-1R를 제조하였다.
상기 제조한 재조합 벡터 x0GC/GLP-1R를 DMEM/F12 (10% FBS) 배지에서 배양한 CHO DG44 세포주에 리포펙타민(Lipofectamine, invitrogene, USA)을 이용한 방법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 1mg/mL G418 및 10 nM 메토트락세이트(methotraxate)를 포함하는 선별배지에서 선별 배양한 다음, 이로부터 단일 클론 세포주를 선별하여, GLP-1에 대해 우수한 농도의존적 cAMP 반응을 보이는 세포주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 1-2: 글루카곤에 대해 cAMP 반응을 보이는 세포주의 생산
인간 글루카곤 수용체 유전자의 cDNA(OriGene Technologies, Inc. USA)에서 ORF에 해당하는 부분을 주형으로 하고, EcoRI 절단부위와 XhoI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
HindIII 절단부위와 EcoRI 절단부위를 각각 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, PCR 산물을 수득하였다.
정방향 프라이머: 5'-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3'(서열번호 52)
역방향 프라이머: 5'-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3'(서열번호 53)
상기 PCR 산물을 공지된 동물세포 발현벡터인 x0GC/dhfr에 클로닝하여 제조합 벡터 x0GC/GCGR을 제조하였다.
상기 제조한 재조합 벡터 x0GC/GCGR를 DMEM/F12 (10% FBS) 배지에서 배양한 CHO DG44 세포주에 리포펙타민을 이용한 방법으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 1mg/mL G418 및 10 nM 메토트락세이트를 포함하는 선별배지에서 선별 배양한 다음, 이로부터 단일 클론 세포주를 선별하여, 글루카곤에 대해 우수한 농도의존적 cAMP 반응을 보이는 세포주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 2. 옥신토모듈린 유도체 in vitro 활성
실시예 2-1: 옥신토모듈린 유도체들의 합성
옥신토모듈린 유도체들의 in vitro 활성을 측정하기 위하여 하기의 아미노산 서열을 가지는 옥신토모듈린 유도체들을 합성하였다(표 1).
옥신토모듈린 및 옥신토모듈린 유도체
서열번호 서열
서열번호1 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호2 CA-SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNTKRNRNNIA
서열번호3 CA-SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNTGPSSGAPPPS
서열번호4 CA-GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
서열번호5 CA-GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS
서열번호6 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSKYLD
서열번호7 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWLMNTK
서열번호8 CA-SQGTFTSDLSRQLEEEAVRLFIEWLMNK
서열번호9 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIEWLMNTKRNRNNIA
서열번호10 CA-SQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLMNGGPSSGAPPPSK
서열번호11 CA-GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEWAAHSQGTFTSDYSRYLDK
서열번호12 CA-SQGTFTSDYSRYLDGGGHGEGTFTSDLSKQMEEEAVK
서열번호13 CA-SQGTFTSDYSRYLDXEAVXLFIEWLMNTK
서열번호14 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVXLFIXWLMNTKRNRNNIA
서열번호15 CA-GQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIXWLMNTKRNRNNIA
서열번호16 CA-SQGTFTSDLSRQLEGGGHSQGTFTSDLSRQLEK
서열번호17 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNTKRNRNNIA
서열번호18 CA-SQGTFTSDYSRYLDEEAVRLFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
서열번호19 CA-SQGTFTSDYSRYLD E EAV K LFIEWIRNTKRNRNNIA
서열번호20 CA-SQGTFTSDYSRYLD E EAV K LFIEWIRNGGPSSGAPPPSK
서열번호21 CA-SQGTFTSDYSRQLEEEAVRLFIEWVRNTKRNRNNIA
서열번호22 DA-SQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTK
서열번호23 HAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVCWLMNT
서열번호24 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNTC
서열번호25 HAibQGTFTSDYSKYLD E KRA K EFVQWLMNTC
서열번호26 HAibQGTFTSDYS K YLD E KRAKEFVQWLMNTC
서열번호27 HAibQGTFTSDYSKYLD E QAA K EFICWLMNT
서열번호28 HAibQGTFTSDY SKYLDEKRAK EFVQWLMNT
서열번호29 H(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호30 CA-SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호31 CA-(d)SQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA
서열번호32 CA-AibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
서열번호33 HAibQGTFTSDYAKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
서열번호34 YAibQGTFTSDYSKYLDEKRAKEFVQWLMNTC
상기 표 1에서 볼드체로 표시된 아미노산들은 링형성을 의미하며 X로 표기된 아미노산은 비천연형 아미노산인 알파-메틸-글루탐산을 의미한다. 또한, CA는 4-이미다조아세틸(4-imidazoacetyl)을, DA는 데스아미노-히스티딜(desamino-histidyl)을, (d)S는 d-serine을 의미한다.
실시예 2-2: 옥신토모듈린 유도체의 in vitro 활성 측정
항 비만 펩타이드의 효력을 측정하기 위해 상기 실시예 1-1 및 1-2에서 제조한 형질전환체를 이용한 in vitro에서 세포 활성을 측정하는 방법을 이용하였다.
상기 각 형질전환체는 CHO (chinese hamster ovary)에 인간 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 유전자를 각각 발현하도록 형질전환된 것으로서, GLP-1과 글루카곤의 활성을 측정하기에 적합하므로, 각 옥신토모듈린 유도체의 활성을 각각의 형질전환체를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 각 형질전환체를 1주일에 2 또는 3회 계대배양하고, 96웰 플레이트에 각 웰당 1 X 105개의 계대배양된 형질전환체를 분주하여 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양된 세포를 KRB 완충액으로 세척하고, 1mM IBMX를 포함하는 KRB 완충액 40㎖에 현탁시킨 다음, 5분간 상온에 정치하였다. 옥신토모듈린(서열번호 1) 또는 옥신토모듈린 유도체들(서열번호 2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 및 32-34)을 1000 nM부터 5배씩 0.02 nM까지 연속적으로 희석하고, 이를 40㎖씩 상기 세포에 첨가한 다음, 1시간 동안 37℃의 온도조건으로 CO2 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 세포용해완충액(cell lysis buffer) 20㎖씩 가하여 세포를 용해시키고, 상기 세포용해물을 cAMP assay kit(Molecular Device, USA)에 적용하여 cAMP 농도를 측정하고, 이로부터 EC50값을 산출한 후, 상호 비교하였다(표 2).
옥신토모듈린 유도체의 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 in vitro 활성비교
서열번호 EC50 (nM)
CHO/GLP-1R CHO/GCGR
서열번호1 50 - 210 10 - 43
서열번호2 51.8 12.8
서열번호3 >1,000 637.7
서열번호4 5.5 >1000
서열번호5 5.9 >1000
서열번호6 500.1 >1000
서열번호8 419.6 >1000
서열번호10 >1,000 >1000
서열번호11 >1,000 >1000
서열번호12 >1,000 >1,000
서열번호13 >1,000 >1000
서열번호17 97.9 >1000
서열번호18 96.3 >1000
서열번호23 2.46 5.8
서열번호24 1.43 6.95
서열번호25 1.9 1.3
서열번호27 2.8-5.5 3.1-5.6
서열번호28 3.1 0.3
서열번호32 41.3 17.7
서열번호33 2.2 80.2
서열번호34 12.5 1.04
상기 표 2에서 보듯이, 서열번호 1인 고유 옥신토모듈린의 in vitro 활성에 비해 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체 활성이 우수한 옥신토모듈린 유도체들이 확인되었다.
옥신토모듈린은 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체의 활성화를 통해 비만, 고지혈증, 지방간 치료, 동맥경화증 등에 효과가 있음이 알려져 있다. 본 발명에 따른 옥신토모듈린 유도체는 천연형 옥신토모듈린에 비해 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체에 대해 높은 in vitro 활성을 가지고 있는 바, 기존 옥신토모듈린에 비해 높은 효력의 고지혈증 치료제, 고지혈증과 관련된 지방간 치료제, 또는 동맥경화증 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 23)
우선, MAL-10K-ALD PEG(NOF.,일본)를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)의 아미노산 서열 24번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl)).
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 23)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다.
실시예 4. 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc 를 포함하는 결합체의 제조(면역글로불린 Fc 영역 결합 옥신토모듈린 유도체 25)
우선, MAL-10K-ALD PEG를 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)의 아미노산 서열 30번 시스테인 잔기에 페길화시키기 위하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 MAL-10K-ALD PEG의 몰비를 1:3, 단백질의 농도를 3㎎/㎖로 하여 상온에서 3 시간동안 반응시켰다. 이때, 반응은 50mM Tris 완충액(pH 8.0)에 1M 구아니딘이 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE S에 적용하여 시스테인에 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체를 정제하였다(Column : SOURCE S, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 →100% 50분 B(A: 20mM Na-citrate, pH 3.0 + 45% 에탄올, B: A + 1M KCl)).
다음으로, 상기 정제된 모노-페길화된 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc을 몰비가 1:5, 단백질의 농도를 20㎎/㎖로 하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응액은 100mM 인산칼륨 완충액(pH6.0)에 환원제인 20mM SCB가 첨가된 환경하에서 수행되었다. 반응이 종료된 후, 상기 반응액을 SOURCE 15Q 정제컬럼(Column : SOURCE 15Q, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : A 0 → 4% 1분 B → 20% 80분 B(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1M NaCl))과 Source ISO 정제컬럼(Column : SOURCE ISO, 유속 : 2.0㎖/분, 구배 : B 0 → 100% 100분 A,(A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A + 1.1M AS))에 적용하여, 옥신토모듈린 유도체(서열번호 25)와 면역글로블린 Fc를 포함하는 결합체를 정제하였다.
실시예 5. 지속형 옥신토모듈린 유도체가 고지혈증 모델인 햄스터의 지질 개선에 미치는 영향
실시예 5-1: 실험동물의 분류
수컷 8주령 햄스터 (Golden Syrian hamster, 120-130g)는 중국 Vital River China에서 구입하였다. 햄스터는 혈중 지질 프로파일 (lipid profile)이 다른 설치류와 달리 사람과 유사하고, 고지질 식이에 민감한 동물로 알려져 있다.
사료는 방사선 조사로 멸균된 실험동물용 사료 고지방 식이(high-fat diet) (11.5% 옥수수 오일, 11.5% 코코넛 오일, 0.5% 콜레스테롤, 및 0.25% 디옥시콜레이트(deoxycholate)을 포함하는 Purina 5001; Dyets, Bethlehem, PA), 또는 표준 설치류 식이(standard rodent diet) (low fat, 2018; Harlan Teklad, Madison, WI)를 공급받아 자유 급이시켰다. 정상 사료군의 물은 여과 후 자외선 살균된 상수도수를, 그리고 고지방 사료군은 10% 과당(fructose)을 급수 병을 이용하여 자유 섭취시켰다. GLP 시설기준에 부합되는 사육실에서 조명시간 12시간 (오전 6시 점등-오후 6시 소등)을 유지하였으며, 동물사육 표준 가이드라인에 따라 관리하였다. 이후, 3주일간의 고지혈증 유도 기간을 두고 약물 투여를 시작하였으며, 군 분류와 투여는 하기와 같이 4개 군 (n=6)으로 나누어 진행하였다(표 3).
그룹 투여 약물 투여 방법
정상군 Vehicle (DPBS) 주 1회 피하 투여
고지혈증 유도군 Vehicle (DPBS)
서열번호 25-Fc 결합체
3.25 nmol/kg
서열번호 23-Fc 결합체
8.96 nmo/kg
구체적으로, 1군 (정상군)은 정상 사료를 섭취시킨 군으로서, 약물 투여는 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(DULBECCO'S PHOSPHATE BUFFERED SALINE, DPBS, Sigma)를 주 1회 이상 피하 투여하였으며, 투여액량은 5 ml/kg로 주사하였다.
2군 (고지혈증 유도군)은 고지방 사료를 섭취시켜 고지혈증을 유도한 후, 둘베코스 포스페이트 완충 식염수(DPBS, Sigma)를 주 1회 이상 피하 투여하였으며, 투여액량은 5 ml/kg로 주사하였다.
3군 (고지혈증 유도군 + 서열번호 25-Fc 결합체 3.25 nmol/kg투여 군)은 고지방 사료를 섭취시켜 고지혈증을 유도한 후, 실시예 4에서 제조한 서열번호 25-Fc 결합체를 3.25 nmol/kg로 주 1회 피하 투여하였으며, 투여액량은 5 ml/kg로 주사하였다.
4군 (고지혈증 유도군 + 서열번호 23-Fc 결합체 8.96 nmol/kg투여 군)은 고지방 사료를 섭취시켜 고지혈증을 유도한 후, 실시예 3에서 제조한 서열번호 23-Fc 결합체를 8.96 nmol/kg로 주 1회 피하 투여하였으며, 투여액량은 5 ml/kg로 주사하였다.
각각의 군 (n=6) 모두 2주간 식염수 또는 약물을 투여한 후, 지질 개선에 미치는 영향에 대해 분석하였다.
실시예 5-2: 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체가 지질 개선에 미치는 영향 분석
본 발명에 따른 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체가 햄스터의 지질 개선에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상기 실시예 5-1에서 분류한 지속형 옥신토모듈린 유도체를 투여하거나 투여하지 않은 햄스터의 혈액을 채취하여 혈액 내의 지질 함량을 분석하였다 (HITACHI 7020 사용). 각각의 지질의 농도 변화 결과는 도면 1 내지 5에 나타내었다.
혈중 중성지방 농도의 변화(도 1), 혈중 총 콜레스테롤 농도의 변화 (도 2), 혈중 LDL-콜레스테롤 농도의 변화 (도 3), 혈중 HDL-콜레스테롤 농도의 변화 (도 4), 혈중 HDL/LDL-콜레스테롤 비율 (ratio)의 변화 (도 5)를 나타내었다. 상기에서 얻어진 결과는 통계처리 하여 평균값과 평균의 표준오차를 계산하였다. 각 실험군간(n=6)의 유의성 검정은 one-way ANOVA의 Dunnett's test를 이용하여 통계처리한 후, 신뢰구간 (p value)이 0.05보다 작은 경우 통계학적인 의의가 있는 것으로 판정하였다.
구체적으로, 혈중 중성지방 농도를 측정한 결과, 고지방 식이를 한 햄스터의 경우 유의적인 혈중 중성지방의 양이 증가되었으나, 지속형 옥신토모듈린 유도체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시 유의적으로 혈중 중성지방이 감소함을 확인하였다(도 1).
또한, 혈중 총 콜레스테롤의 양을 측정한 결과, 고지방 식이를 한 햄스터의 경우 유의적인 혈중 총 콜레스테롤의 양이 증가되었으나, 지속형 옥신토모듈린 유도체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시 유의적으로 혈중 총 콜레스테롤의 양이 감소함을 확인하였다(도 2).
혈중 LDL-콜레스테롤의 양을 측정한 결과, 고지방 식이를 한 햄스터의 경우 유의적인 혈중 LDL-콜레스테롤의 양이 증가되었으나, 지속형 옥신토모듈린 유도체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시 유의적으로 혈중 LDL-콜레스테롤의 양이 감소함을 확인하였다(도 3).
혈중 HDL-콜레스테롤 양을 측정한 결과, 지속형 서열번호 25-Fc 결합체 및 서열번호 23-Fc 결합체 투여 군에서 고지방 식이의 햄스터 그룹 대비 유의적인 혈중 HDL-콜레스테롤 양이 증가함을 확인하였다(도 4).
혈중 HDL/LDL-콜레스테롤 비율(ratio)을 측정한 결과, 지속형 서열번호 25-Fc 결합체 및 서열번호 23-Fc 결합체 투여 군에서 고지방 식이의 햄스터 그룹 대비 유의적인 혈중 HDL/LDL-콜레스테롤 비율(ratio)이 증가함을 확인하였다(도 5).
상기 결과로부터, PEG에 의해 면역글로블린 Fc 영역과 옥신토모듈린 유도체가 공유 결합된, 본 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체는 혈중 중성지방, 저밀도 콜레스테롤(LDL-콜레스테롤)의 축적을 방지함으로써, 고질혈증 또는 이와 관련된 지방간, 또는 동맥경화증 치료에 유용히 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6: 공지된 지속형 GLP -1 유사체와 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체가 지질 개선에 미치는 영향 분석
VICTOZA®는 지속형(long-acting) 글루카곤-유사 펩타이드-1(GLP-1) 유사체로서, 현재 당뇨병 치료제로 상용화되어 시판되고 있으며, 이의 비만 치료 효과 및 HDL 콜레스테롤 수치 증가 효과가 알려져 있다.
본 발명에 따른 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체와 상기 공지된 VICTOZA®와의 지질 개선 효과를 비교하였다.
상기 실시예 5에서 분류한 정상 햄스터 군, 고지방 식이를 섭취시킨 햄스터 군으로 나누었다. 그런 후, 정상 햄스터 군에는 DPBS 5 ml/kg를 주 1회 이상 피하투여하였다. 고지방 식이를 섭취시킨 햄스터 군은 DPBS 5 ml/kg를 주 1회 이상 피하 투여한 군, VICTOZA®를 35.5nmol/kg로 주 1회 피하 투여한 군, 서열번호 25-Fc 결합체를 3.25 nmol/kg로 투여한 군, 서열번호 23-Fc 결합체를 8.96 nmol/kg로 투여한 군으로 나누어서 혈액 내 지질 함량을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시, 상용화된 VICTOZA® 보다 혈중 총 콜레스테롤이 더 감소되고(도 6), 혈중 LDL-콜레스테롤의 양이 더 감소됨을 확인할 수 있었다(도 7).
또한, 본 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시 혈중 HDL-콜레스테롤의 양 및 HDL/LDL-콜레스테롤 비율(ratio)이 VICTOZA? 보다 더 증가됨을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9). 특히, 지속형 서열번호 25-Fc 결합체는 VICTOZA? 보다 유의적으로 혈중 HDL 및 HDL/LDL-콜레스테롤 비율이 증가되었다.
또한, 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체 (서열번호 25-Fc 결합체, 서열번호 23-Fc 결합체) 투여 시, 혈중 중성지방의 양이 VICTOZA? 보다 더 감소됨을 확인할 수 있다.
상기 결과로부터 본 발명의 지속형 옥신토모듈린 유도체 결합체는 지질 개선 효과가 공지된 VICTOZA® 와 동등한 수준 이상으로 우수한 지질 개선 효과가 나타나는 바, 지질 개선 효과와 관련된 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 치료제로 유용히 사용될 수 있음을 알 수 있다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> A composition for treating hyperlipidemia comprising oxyntomodulin analog <130> PA120731KR <160> 53 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin <400> 1 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <400> 2 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Ala Trp Leu Lys Asn Thr Gly Pro Ser 20 25 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Ser Gln Gly Thr 20 25 30 Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 35 40 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <400> 7 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <400> 8 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Lys 20 25 <210> 9 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 9 His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile 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Asp Gly 1 5 10 15 Gly Gly His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met 20 25 30 Glu Glu Glu Ala Val Lys 35 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <220> <221> VARIANT <222> (16) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 13 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Xaa 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 14 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <220> <221> VARIANT <222> (24) <223> Xaa = alpha-methyl-glutamic acid <400> 14 His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Xaa Leu Phe Ile Xaa Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg 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Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Ile Arg Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 35 40 <210> 21 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <400> 21 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Leu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Val Arg Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 22 <211> 30 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, desamino-histidyl. <400> 22 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys 20 25 30 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 23 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Cys 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Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 31 <211> 37 <212> PRT <213> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> This "S" refers a variant of serine, d-serine. <400> 31 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn 20 25 30 Arg Asn Asn Ile Ala 35 <210> 32 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (1) <223> This "H" refers a derivative of histidine, 4-imidazoacetyl. <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 32 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 33 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 33 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 34 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 34 Tyr Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 35 Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 36 Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 37 Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Lys 1 5 10 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group R2 <400> 38 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp 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44 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 44 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 20 25 <210> 45 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 45 Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly 20 25 <210> 46 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 46 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Ala 20 25 <210> 47 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group A or B <400> 47 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Gly 20 25 <210> 48 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group B <400> 48 Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Arg Gln Met Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp 20 <210> 49 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> group B <400> 49 Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Leu Asp 1 5 10 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cccggccccc gcggccgcta ttcgaaatac 30 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gaacggtccg gaggacgtcg actcttaaga tag 33 <210> 52 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cagcgacacc gaccgtcccc ccgtacttaa ggcc 34 <210> 53 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 ctaaccgact ctcggggaag actgagctcg cc 32

Claims (10)

  1. 옥신토모듈린 유도체를 유효성분으로 포함하는 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 옥신토모듈린 유도체는 서열번호 2 내지 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 옥신토모듈린 유도체는 면역글로불린 단편, 항체, 엘라스틴, 알부민, 피브로넥틴으로 구성된 군으로부터 선택된 것이 연결된 결합체 형태인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 결합체는 서열번호 2 내지 34로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 옥신토모듈린 유도체 및 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(polylactic acid), PLGA(polylactic-glycolic acid), 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, polysaccharide 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 옥신토모듈린의 아민그룹 또는 티올 그룹(Thiol group)에 결합하는 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 고지혈증, 지방간, 또는 동맥경화증의 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약학적 제제가 추가로 포함되는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 지방간은 비알콜성 지방간 질환, 알콜성 지방간 질환, 영양성 지방간 질환, 기아성 지방간 질환, 비만성 지방간 질환, 당뇨병성 지방간 질환 또는 지방간염인 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 비알콜성 지방간 질환은 고지혈증, 당뇨 또는 비만으로부터 발생되는 것인 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 비알콜성 지방간염, 간섬유와 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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