JP2016001227A - レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】検出器としてＰＰＤを採用し、フォトンの数え落しを極力低減して検出可能な光強度入射範囲を拡大する。【解決手段】標本Ｓからの戻り光を集光する対物レンズ５と、対物レンズ５により集光された戻り光を略平行光束にするコリメートレンズ１５、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換された戻り光を検出する複数のピクセルを有するＰＰＤ１７と、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径と複数のピクセルによるＰＰＤ１７の有効検出領域とを略一致させる制御部１９とを備えるレーザ顕微鏡装置１０を提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。

従来、検出器としてＰＭＴ(光電子増倍管)を採用したレーザ顕微鏡装置が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、検出器としては、ＰＭＴの他に、ＭＰＰＣ（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ)、ＳｉＰＭ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、マルチピクセル型アバランシェフォトダイオードのようなＰＰＤ（Ｐｉｘｅｌａｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、マルチピクセル型のフォトン検出器）が知られている。

ここで、光を検出するとその光の強度に関係なく一定強度の信号を出力する動作モード、すなわち、ガイガーモードでＰＰＤを使用すると、１フォトンレベルの微弱光を検出することが可能になる。また、ガイガーモードでＰＰＤを使用した場合において、単位時間当たりに検出することができるフォトン数は１ピクセル当たり１フォトン程度であるが、ＰＰＤはマルチピクセルであるから、ＰＰＤへの入射フォトン数が多くなっても、それに応じたフォトン数を検出することができる。すなわち、ＰＰＤは光強度入射範囲を広くとることができる。

原口徳子編、木村宏編、平岡泰編、「講義と実習 生細胞蛍光イメージング−阪大・北大 顕微鏡コースブック」、共立出版、ｐ．１５０−１５１

しかしながら、比較的強い光がＰＰＤに入射した場合において、フォトンがピクセルごとに均等に振り分けられないと、素子自体の応答速度制限によりフォトンの数え落しが生じてしまうという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、検出器としてＰＰＤを採用し、フォトンの数え落しを極力低減して、弱い光から強い光までを高感度に検出することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本からの光を集光する対物レンズと、該対物レンズにより集光された光を検出する複数の検出要素を有する光検出部と、該光検出部に入射する光のビーム径と前記複数の検出要素による前記光検出部の有効検出領域とを略一致させる調整機構とを備えるレーザ顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、対物レンズにより集光された標本からの光が光検出部の複数の検出要素により検出される。ここで、各検出要素により単位時間当たりに検出することができるフォトン数は１フォトン程度であるとしても、複数の検出要素によりフォトンを検出することで、標本からの光を検出可能な光強度入射範囲を広げることができる。

この場合において、調整機構により光のビーム径と光検出部の有効検出領域とを略一致させることで、標本からの光のフォトンが各検出要素に均等に入射し易くなる。したがって、フォトンの数え落しを極力低減して、標本からの光を検出可能な光強度入射範囲をより広げることができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて前記ビーム径を調整することとしてもよい。
対物レンズの射出ＮＡが変化すると、光検出部に入射する光のビーム径も変化する。このように構成することで、採用する対物レンズを変更した場合でも、調整機構により光のビーム径と光検出部の有効検出領域とを略一致させることができる。これにより、対物レンズの変更によるフォトンの数え落しを防止することができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にするコリメートレンズと、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に前記コリメートレンズを移動させる制御部とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、コリメートレンズの光軸方向の位置に応じて光検出部での光のビーム径を変えられるので、制御部により、採用する対物レンズに合わせて、光検出部の有効検出領域を満たす適当なビーム径に光を整形することができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にする複数群の光学系からなるコリメートレンズ群と、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に、少なくとも１群以上の前記光学系を移動させる制御部とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、１群の光学系からなるコリメートレンズを用いる場合と比較して、各光学系の移動範囲を狭くすることができる。また、１群の光学系からなるコリメートレンズよりも、光検出部への入射光をより高精度に平行光束にすることができ、角度依存性による光の検出ロスを低減することができる。

上記発明においては、光軸方向における前記光学系間の距離間隔が異なる複数のコリメートレンズ群を切り替え可能な切替機構を備え、前記制御部が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた前記コリメートレンズ群に切り替えることとしてもよい。

このように構成することで、各光学系の光軸方向の位置を調整しなくて済み、採用する対物レンズに合わせてコリメートレンズ群ごと切り替えるだけで、光のビーム径と光検出部の有効検出領域とを簡易に略一致させることができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にするコリメートレンズと、該コリメートレンズと前記光検出部との間に光軸方向に移動可能に配され、前記コリメートレンズにより略平行光束に変換された光を略均一な強度分布で発散させる均一照明素子と、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に前記均一照明素子を移動させる制御部と備えることとしてもよい。

このように構成することで、均一照明素子の光軸方向の位置に応じて、発散したときの光のビーム径が異なる。この場合において、均一照明素子により発散した光が均一な強度分布を有することで、制御部により、採用する対物レンズに合わせて均一照明素子を所定の位置に移動させるだけで、強度分布が均一で光検出部の有効検出領域を満たす適当なビーム径に整形するとともに、フォトンの数え落しをより低減することができる。

上記発明においては、前記所定の位置が前記対物レンズの射出ＮＡにおける波長依存性を考慮して決められていることとしてもよい。
このように構成することで、対物レンズごとの射出ＮＡの波長依存性に関わらず、光軸方向の最適な位置にコリメートレンズあるいは均一照明素子を移動させて適当なビーム径に整形することができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記コリメートレンズにより略平行光束になった光を発散させる発散素子と、該発散素子により発散した光を内面反射して前記光検出部の有効検出領域内に集光させる内面反射素子とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、光検出部に入射する光が発散素子により一旦発散した後、内面反射素子により内面反射されて光検出部の有効検出領域内に集光する。したがって、光検出部の有効検出領域の略全面に戻り光を集光させてフォトンの数え落しの低減を図ることができる。

上記発明においては、複数の前記光検出部が光軸に交差する方向にアレイ状に配列されている検出装置を備え、前記調整機構が、前記検出装置に入射する光のビーム径と前記複数の光検出部による前記検出装置の有効検出領域とが略一致するよう、前記光のビーム径に応じて駆動させる前記光検出部を切り替えることとしてもよい。

このように構成することで、光のビーム径に応じて検出装置の有効検出領域を略一致させて、複数の光検出部の各検出要素にフォトンを均等に入射させ易くすることができる。この場合において、検出要素に入射する光のビーム径から外れる光検出部は駆動させる必要がない。したがって、調整機構により、必要な光検出部のみを駆動させて、暗ノイズを低減することができる。

上記発明においては、前記調整機構が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた前記光検出部を駆動させることとしてもよい。
このように構成することで、採用する対物レンズに合わせて、光のビーム径に対して検出装置の有効検出領域を簡易に略一致させることができる。

上記発明においては、前記光検出部が、前記検出装置の有効検出領域の中心部に配される前記検出要素ほど大きさが細かくなるように形成され、前記検出装置の有効検出領域の周辺部に配される前記検出要素ほど大きさが粗くなるように形成されていることとしてもよい。

検出装置に入射する光のフォトンの密度は光軸の中心と周辺とで異なり、光軸中心に近いほどフォトンが集中する傾向がある。したがって、このように構成することで、光軸中心に集中するフォトンをもれなく検出し、フォトンの数え落しを低減することができる。

上記発明においては、前記検出要素が、検出する光の強度に関わらず一定の強度信号を出力することとしてもよい。
このように構成することで、１フォトンレベルの微弱光を高精度に検出することができる。

本発明によれば、検出器としてＰＰＤを採用し、フォトンの数え落しを防いで光を検出可能な光強度入射範囲を広げることができるという効果を奏する。

本発明の第１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 図１のＰＰＤの位置での戻り光のビーム径を示す図である。 本発明の第１実施形態の第１変形例に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 本発明の第１実施形態の第２変形例に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 本発明の第２実施形態に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 本発明の第３実施形態に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 本発明の第４実施形態に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。

〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０は、図１に示すように、励起光を発生する光源（図示略）と、光源から発せられた励起光を２次元的に走査するＸＹガルバノミラー１と、ＸＹガルバノミラー１により走査された励起光をリレーするリレー光学系３と、リレー光学系３によりリレーされた励起光を標本Ｓに照射する一方、標本Ｓから発せられる戻り光（例えば、蛍光。）を集光する対物レンズ５とを備えている。

また、レーザ顕微鏡装置１０は、対物レンズ５により集光されて励起光の光路を戻る戻り光を分岐するダイクロイックミラー７と、分岐した戻り光を反射する反射ミラー９と、反射ミラー９により反射された戻り光を集光する集光レンズ１１と、集光した戻り光の通過を制限するコンフォーカルアパーチャ１３と、コンフォーカルアパーチャ１３を通過した戻り光を略平行光束にするコリメートレンズ（調整機構）１５と、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換された光を検出するＰＰＤ（Ｐｉｘｅｌａｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、光検出部）１７と、コリメートレンズ１５の光軸方向の位置を調整等する制御部（調整機構）１９とを備えている。

対物レンズ５は、他の対物レンズ５と共にレボルバ６により支持されている。
レボルバ６は、制御部１９の制御または手動により、いずれかの対物レンズ５を励起光の光路に択一的に挿入したり、励起光の光路に挿入する対物レンズ５を切り替えたりすることができるようになっている。

ダイクロイックミラー７は、光源からの励起光をＸＹガルバノミラー１に向けて反射する一方、標本Ｓから対物レンズ５やＸＹガルバノミラー１等を介して励起光の光路を戻る戻り光を反射ミラー９に向けて透過させるようになっている。
コンフォーカルアパーチャ１３は、標本Ｓと光学的に共役な位置に配置されており、対物レンズ５の焦点位置からの光のみを通過させることができるようになっている。

ＰＰＤ１７は、例えば、ＭＰＰＣ（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ)、ＳｉＰＭ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、マルチピクセル型アバランシェフォトダイオード等である。このＰＰＤ１７は、戻り光を検出する複数のピクセル（検出要素、図示略）を有している。なお、検出要素はフォトン検出を行う単位である。

各ピクセルは、それぞれ戻り光のフォトンを検出してパルスを出力するようになっている。そして、ＰＰＤ１７は、各ピクセルの出力の和を強度信号として出力するようになっている。また、ＰＰＤ１７は、各ピクセルが入射光強度に関わらず一定強度のパルスを出力するガイガーモードで駆動するよう設定されている。ＰＰＤ１７をガイガーモードで駆動した場合において、各ピクセルが単位時間当たり検出するフォトン数は１フォトン程度である。

制御部１９には、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径と複数のピクセルによるＰＰＤ１７の有効検出領域とが略一致するように、対物レンズ５の射出ＮＡに応じて予め決められたコリメートレンズ１５の光軸方向の位置が記憶されている。ＰＰＤ１７に入射する光のビーム径は、戻り光が平行光にコリメートされてＰＰＤ１７に入射する場合は対物レンズ５の射出瞳径×投影倍率により決まるが、コリメートレンズ１５の位置を調節することにより、光を非平行ビームにしてＰＰＤ１７への入射ビーム径を調整することができる。この制御部１９は、使用する対物レンズ５に応じて、その対物レンズ５に対応付けて記憶している光軸方向の所定の位置にコリメートレンズ１５を移動させるようになっている。

例えば、射出ＮＡの小さな対物レンズ５を使用する場合は、コンフォーカルアパーチャ１３を通過後の戻り光のビーム径が小さくなる。したがって、制御部１９は、コリメートレンズ１５をＰＰＤ１７から離間する方向に移動させるようになっている。これにより、コリメートレンズ１５からの出射光束をやや発散させ、図２において実線の円で示す光束Ｅのように、ＰＰＤ１７の位置での戻り光のビーム径を拡大させてＰＰＤ１７の有効検出領域に略一致させるようになっている。なお、図２において鎖線の円で示す光束Ｆは、射出ＮＡの小さな対物レンズ５を使用した場合において、コリメートレンズ１５の位置調整を行う前の戻り光のビーム径を表している。

一方、射出ＮＡの大きな対物レンズ５を使用する場合は、コンフォーカルアパーチャ１３を通過後の戻り光のビーム径が大きくなる。したがって、制御部１９は、コリメートレンズ１５をＰＰＤ１７に近接する方向に移動させるようになっている。これにより、コリメートレンズ１５からの出射光束を平行光束またはやや収束した光束にし、図２に示す光束Ｅのように、ＰＰＤ１７の位置での戻り光のビーム径をＰＰＤ１７の有効検出領域に略一致させるようになっている。

また、制御部１９は、対物レンズ５の挿入／切り替えを電動制御する場合は、対物レンズ５の切り替え情報に基づいてコリメートレンズ１５の位置調整を行うようになっている。また、制御部１９は、対物レンズ５の挿入／切り替えが手動で行われる場合は、ユーザが入力する使用中の対物レンズ５の情報に基づいてコリメートレンズ１５の位置調整を行うようになっている。なお、使用する対物レンズ５の種別を検知してその情報を制御部１９に送る検知部を設けることとしてもよい。

このように構成されたレーザ顕微鏡装置１０の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０により標本Ｓの画像を取得する場合は、対物レンズ５を設定して、制御部１９によりコリメートレンズ１５の光軸方向の位置を調整し、光源から励起光を発生させる。

このとき、制御部１９は、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径がＰＰＤ１７の有効検出領域に略一致するよう、対物レンズ５の射出ＮＡに対応付けられて予め決められた所定の位置にコリメートレンズ１５を移動させる。例えば、使用する対物レンズ５の射出ＮＡが小さい場合は、図１に示すように、ＰＰＤ１７から離間した位置にコリメートレンズ１５が移動させられる。

光源から発せられた励起光は、ダイクロイックミラー７により反射された後、ＸＹガルバノミラー１により走査されてリレー光学系３によりリレーされ、対物レンズ５により標本Ｓに照射される。これにより、ＸＹガルバノミラー１の揺動動作に応じて、標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査される。

レーザ光が照射されることにより標本Ｓから発せられる戻り光は、対物レンズ５により集光された後、リレー光学系３およびＸＹガルバノミラー１を介してダイクロイックミラー７を透過し、反射ミラー９により反射されて集光レンズ１１により集光される。集光レンズ１１により集光された戻り光の内、標本Ｓにおける対物レンズ５の焦点位置からの光のみがコンフォーカルアパーチャ１３を通過し、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換されてＰＰＤ１７に入射する。

ＰＰＤ１７においては、入射した戻り光が各ピクセルにより検出されて一定強度のパルスが出力され、これらの和の強度信号が出力される。これにより、例えば、図示しないＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）等において、ＰＰＤ１７から出力される強度信号とＸＹガルバノミラー１による励起光の走査位置情報とに基づいて２次元的な画像を生成することができる。

ここで、ガイガーモードでＰＰＤ１７を駆動することで、各ピクセルによりそれぞれ１フォトンレベルの微弱光も検出することができる。そして、複数のピクセルによりこれらピクセルごとにフォトンを検出することで、例えばＰＭＴ(光電子増倍管)により戻り光を検出するような場合と比較して、戻り光の検出感度を向上するとともに戻り光を検出可能な光強度入射範囲を広げることができる。

この場合において、制御部１９により、コリメートレンズ１５の光軸方向の位置を調整して、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径とＰＰＤ１７の有効検出領域とを略一致させることで、標本Ｓからの戻り光のフォトンが各ピクセルに割り振られてそれぞれに均等に入射し易くなる。

また、使用する対物レンズ５の射出ＮＡが大きい場合も、制御部１９により、対物レンズ５の射出ＮＡに対応付けられて予め決められた所定の位置、この場合はＰＰＤ１７に近接する位置にコリメートレンズ１５を移動させることで、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径とＰＰＤ１７の有効検出領域とを略一致させて、戻り光のフォトンを各ピクセルに均等に入射させ易くすることができる。

したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０によれば、検出器としてＰＰＤ１７を採用し、フォトンの数え落しを極力低減して標本Ｓからの戻り光を検出可能な光強度入射範囲をより広げて検出することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、１群の光学系からなるコリメートレンズ１５を例示して説明したが、第１変形例としては、図３に示すように、複数群（本変形例においては３群）の光学系１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃからなるコリメートレンズ群１６を採用することとしてもよい。

この場合、制御部１９が、対物レンズ５の射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に、少なくとも１群以上の光学系１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ（例えば、２群の光学系１４Ｂ，１４Ｃ）を移動させることで、複数のピクセルによるＰＰＤ１７の有効検出領域に対して入射させる戻り光のビーム径を略一致させることとすればよい。

このようにすることで、１群の光学系からなるコリメートレンズ１５を移動させる場合と比較して、光学系１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃの移動範囲を狭くすることができる。また、１群の光学系からなるコリメートレンズ１５よりも、戻り光をより高精度に平行光束にすることができ、角度依存性による戻り光の検出ロスを低減することができる。
また、本変形例においては、例えば、コリメートレンズ群１６を２群の光学系により構成し、一方の群の光学系のみの光軸方向の位置を調整することとしてもよい。

また、本変形においては、光軸方向における光学系１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ間の距離間隔が異なる複数のコリメートレンズ群１６を切り替え可能な切換機構（図示略）を備え、制御部１９が、使用する対物レンズ５の射出ＮＡに応じて予め決められたコリメートレンズ群１６に切り替えることとしてもよい。この場合、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径とＰＰＤ１７の有効検出領域とが略一致するように対応付けた対物レンズ５の射出ＮＡと複数のコリメートレンズ群１６との組み合わせを制御部１９に記憶させておくこととすればよい。

このようにすることで、各光学系１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃの光軸方向の位置を調整しなくて済み、採用する対物レンズ５に合わせてコリメートレンズ群１６ごと切り替えるだけで、戻り光のビーム径とＰＰＤ１７の有効検出領域とを簡易に略一致させることができる。

また、本実施形態においては、コンフォーカルアパーチャ１３を用いて対物レンズ５の焦点位置からの光のみを検出することとしたが、第２変形例としては、図４に示すように、コンフォーカルアパーチャ１３を用いず、励起光として２光子励起を起こさせる赤外パルスレーザ光を使用して、２光子励起によって生じた蛍光を検出することとしてもよい。

この場合、標本Ｓから発せられて対物レンズ５により集光された戻り光をＸＹガルバノミラー１を介さずにダイクロイックミラー７によって光路から分岐し、集光レンズ１１およびコリメートレンズ１５を介してＰＰＤ１７により検出することとすればよい。
このようにすることで、標本Ｓの３次元空間における赤外パルスレーザ光の集光位置のみを観察することができる。
本変形例においては、第１変形例と同様に、コリメートレンズ１５に代えて、コリメートレンズ群１６を採用することとしてもよい。

また、本実施形態および本変形例においては、コリメートレンズ１５の所定の位置を対物レンズ５の射出ＮＡにおける波長依存性を考慮して決めることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズ５ごとの射出ＮＡの波長依存性に関わらず、光軸方向の最適な位置にコリメートレンズ１５を移動させて適当なビーム径に整形することができる。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２０は、図５に示すように、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換された戻り光を略均一な強度分布で発散させる均一照明素子（調整機構）２１を備えるとともに、制御部１９に代えて、均一照明素子２１の光軸方向の位置を制御する制御部（調整機構）２３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

均一照明素子２１としては、例えば、拡散板、単レンズ、フライアイレンズ、ホモジナイザ（フライアイレンズ＋結像レンズ）またはホログラフィックディフューザ等が挙げられる。この均一照明素子２１は、コリメートレンズ１５とＰＰＤ１７との間に光軸方向に移動可能に配されている。均一照明素子２１の光軸方向の位置に応じて、発散したときのＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径が異なる。

制御部２３には、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径と複数のピクセルによるＰＰＤ１７の有効検出領域とが略一致するように、対物レンズ５の射出ＮＡに応じて決められた均一照明素子２１の光軸方向の位置が記憶されている。この制御部２３は、使用する対物レンズ５に応じて、対物レンズ５に対応付けて記憶している光軸方向の所定の位置に均一照明素子２１を移動させるようになっている。

このように構成されたレーザ顕微鏡装置２０によれば、例えば、射出ＮＡの小さな対物レンズ５を使用する場合は、コリメートレンズ１５による略平行光束に変換後の戻り光のビーム径が小さくなるため、制御部２３により均一照明素子２１をＰＰＤ１７から離間した位置に移動させるようになっている。均一照明素子２１とＰＰＤ１７との距離を広げることで、ＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径を拡大して、戻り光のビーム径をＰＰＤ１７の有効検出領域に略一致させることができる。

一方、射出ＮＡの大きな対物レンズ５を使用する場合は、コリメートレンズ１５による略平行光束に変換後の戻り光のビーム径が大きくなるため、制御部２３により均一照明素子２１をＰＰＤ１７に近接した位置に移動させるようになっている。均一照明素子２１とＰＰＤ１７との距離を狭くすることで、発散によりＰＰＤ１７に入射する戻り光のビーム径が大きくなるのを抑えて、戻り光のビーム径をＰＰＤ１７の有効検出領域に略一致させることができる。

この場合において、標本Ｓからの戻り光を均一照明素子２１により略均一な強度分布で発散させることで、ビーム径に関わらずＰＰＤ１７にほぼ均一な強度分布の戻り光を入射させることができる。

以上説明したように、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置２０によれば、制御部２３により、使用する対物レンズ５に合わせて均一照明素子２１を予め決められた所定の位置に移動させるだけで、強度分布が均一でＰＰＤ１７の有効検出領域を満たす適当なビーム径に整形するとともに、フォトンの数え落しをより低減することができる。

本実施形態においては、均一照明素子２１の所定の位置を対物レンズ５の射出ＮＡにおける波長依存性を考慮して決めることとしてもよい。
このようにすることで、対物レンズ５ごとの射出ＮＡの波長依存性に関わらず、光軸方向の最適な位置に均一照明素子２１を移動させて適当なビーム径に整形することができる。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置３０は、図６に示すように、制御部１９を備えず、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換された戻り光を発散させる発散素子（調整機構）３１と、発散素子３１により発散した戻り光を内面反射してＰＰＤ１７の有効検出領域内に集光させる内面反射素子（調整機構）３３とを備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態においては、ＰＰＤ１７は、複数のピクセルにより、略四角形状の有効検出領域を有していることとする。
ビーム発散素子３１としては、例えば、拡散板、単レンズ、フライアイレンズまたはホログラフィックディフューザ等が用いられる。

内面反射素子３３は、例えば、長手方向に貫通する四角筒状に形成されており、射出端側の開口面積がＰＰＤ１７の有効検出領域と略同程度の大きさを有している。この内面反射素子３３は、ＰＰＤ１７の手前に設けられ、ＰＰＤ１７によって射出端が閉塞されるように配されている。また、内面反射素子３３は、４つの内側面がそれぞれ反射ミラーにより形成されている。

このように構成されたレーザ顕微鏡装置３０によれば、コリメートレンズ１５により略平行光束に変換された戻り光が発散素子３１により一旦発散して内面反射素子３３の一端に入射する。内面反射素子３３の一端に入射した戻り光は、反射ミラーにより内面反射されて他端から射出され、ＰＰＤ１７の有効検出領域内に集光する。このとき、内面反射素子３３により、ＰＰＤ１７に入射する光のビーム径は略四角形状になる。

したがって、本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置３０によれば、ＰＰＤ１７の有効検出領域内の略全面に戻り光を集光させて、ＰＰＤ１７のフォトンの数え落しの低減を図ることができる。また、内面反射素子３３により戻り光のビーム径を四角形状にすることで、ＰＰＤ１７の略四角形状を有する有効検出領域の略全面に戻り光を効率的に入射させて、フォトンの数え落しをより低減することができる。

〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置４０は、図７に示すように、複数のＰＰＤ１７が光軸に交差する方向にアレイ状に配列して構成された検出装置４１を備えるとともに、制御部１９に代えて、検出装置４１の各ＰＰＤ１７の駆動を制御する制御部（調整機構）４３を備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１０と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

検出装置４１は、各ＰＰＤ１７のピクセルが均等な大きさを有している。
制御部４３は、検出装置４１に入射する戻り光のビーム径に応じて、各ＰＰＤ１７に印加する駆動電圧のＯＮ／ＯＦＦを切り替えるようになっている。

例えば、射出ＮＡの小さな対物レンズ５を使用する場合は、コリメートレンズ１５による略平行光束に変換後の戻り光のビーム径が小さくなるため、制御部４３は、戻り光のビーム径に合わせて必要な数区画のＰＰＤ１７だけを駆動させるようになっている。また、射出ＮＡの大きな対物レンズ５を使用する場合は、コリメートレンズ１５による略平行光束に変換後の戻り光のビーム径が大きくなるため、制御部４３は、全てのＰＰＤ１７を駆動させるようになっている。

このように構成されたレーザ顕微鏡装置４０によれば、制御部４３により、戻り光のビーム径に応じて駆動させるＰＰＤ１７を切り替えることで、検出装置４１の有効検出領域を戻り光のビーム径に略一致させて、各ピクセルにフォトンを均等に入射させ易くすることができる。

この場合において、ピクセルに入射する光のビーム径から外れるＰＰＤ１７は駆動させる必要がない。したがって、制御部４３により、必要なＰＰＤ１７のみを駆動させることで、暗ノイズを低減することができる。

本実施形態は以下のように変形することができる。
本実施形態においては、各ＰＰＤ１７のピクセルが均等な大きさを有していることとしたが、これに代えて、例えば、各ＰＰＤ１７が、検出装置４１の有効検出領域の中心部に配されるピクセルほど大きさが細かくなるように形成され、検出装置４１の有効検出領域の周辺部に配されるピクセルほど大きさが粗くなるように形成されていることとしてもよい。

検出装置４１に入射する戻り光のフォトンの密度は光軸の中心と周辺とで異なり、光軸中心に近いほどフォトンが集中する傾向がある。したがって、本変形例によれば、検出装置４１の有効検出領域の中心部に配された大きさが細かい多数のピクセルにより光軸中心に集中するフォトンをもれなく検出し、フォトンの数え落しを低減することができる。また、検出装置４１の有効検出領域の周辺部に配された大きさが粗い少数のピクセルにより、光軸の周辺のまばらに分布するフォトンを検出することで、有効検出領域の周辺部での開口効率を向上することができる。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の各実施形態に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、第２実施形態、第３実施形態および第４実施形態においても、第１実施形態の第２変形例と同様に、コンフォーカルアパーチャ１３を用いず、励起光として２光子励起を起こさせる赤外パルスレーザ光を使用して、２光子励起によって生じた蛍光を検出することとしてもよい。

１０，２０，３０，４０ レーザ顕微鏡装置
１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ 光学系
１５ コリメートレンズ（調整機構）
１６ コリメートレンズ群
１７ ＰＰＤ（光検出部）
１９，２３，４３ 制御部（調整機構）
２１ 均一照明素子（調整機構）
３１ 発散素子（調整機構）
３３ 内面反射素子（調整機構）
４１ 検出装置
Ｓ 標本

Claims (12)

1. 標本からの光を集光する対物レンズと、
   該対物レンズにより集光された光を検出する複数の検出要素を有する光検出部と、
   該光検出部に入射する光のビーム径と前記複数の検出要素による前記光検出部の有効検出領域とを略一致させる調整機構とを備えるレーザ顕微鏡装置。
2. 前記調整機構が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて前記ビーム径を調整する請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
3. 前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にするコリメートレンズと、
   前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に前記コリメートレンズを移動させる制御部とを備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
4. 前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にする複数群の光学系からなるコリメートレンズ群と、
   前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に、少なくとも１群以上の前記光学系を移動させる制御部とを備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
5. 光軸方向における前記光学系間の距離間隔が異なる複数のコリメートレンズ群を切り替え可能な切替機構を備え、
   前記制御部が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた前記コリメートレンズ群に切り替える請求項４に記載のレーザ顕微鏡装置。
6. 前記調整機構が、前記対物レンズにより集光された光を略平行光束にするコリメートレンズと、
   該コリメートレンズと前記光検出部との間に光軸方向に移動可能に配され、前記コリメートレンズにより略平行光束に変換された光を略均一な強度分布で発散させる均一照明素子と、
   前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた光軸方向の所定の位置に前記均一照明素子を移動させる制御部と備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
7. 前記所定の位置が前記対物レンズの射出ＮＡにおける波長依存性を考慮して決められている請求項２から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
8. 前記調整機構が、前記コリメートレンズにより略平行光束になった光を発散させる発散素子と、
   該発散素子により発散した光を内面反射して前記光検出部の有効検出領域内に集光させる内面反射素子とを備える請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
9. 複数の前記光検出部が光軸に交差する方向にアレイ状に配列されている検出装置を備え、
   前記調整機構が、前記検出装置に入射する光のビーム径と前記複数の光検出部による前記検出装置の有効検出領域とが略一致するよう、前記光のビーム径に応じて駆動させる前記光検出部を切り替える請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
10. 前記調整機構が、前記対物レンズの射出ＮＡに応じて予め決められた前記光検出部を駆動させる請求項９に記載のレーザ顕微鏡装置。
11. 前記光検出部が、前記検出装置の有効検出領域の中心部に配される前記検出要素ほど大きさが細かくなるように形成され、前記検出装置の有効検出領域の周辺部に配される前記検出要素ほど大きさが粗くなるように形成されている請求項９または請求項１０に記載のレーザ顕微鏡装置。
12. 前記検出要素が、検出する光の強度に関わらず一定の強度信号を出力する請求項１から請求項１１のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
    

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