JP2015524789A

JP2015524789A - 新規なスフィンゴシン１‐リン酸受容体アンタゴニスト

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Publication number: JP2015524789A
Application number: JP2015503399A
Authority: JP
Inventors: スウェンソン，ロルフ，イー
Original assignee: スウェンソン，ロルフ，イー
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2015-08-27
Anticipated expiration: 2033-03-21
Also published as: CN104334556B; EP2831072A1; AU2013240139A1; US9663511B2; EP2831072A4; EP2831072B1; CN104334556A; ES2625727T3; WO2013148460A1; AU2013240139B2; CA2868277A1; US20150045332A1; JP6023308B2

Abstract

本発明は、式（Ｉ）のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）アンタゴニストを含み、式中、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、または−ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔであり、Ｒ３は、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジン、４‐置換２‐クロロ‐６‐ヒドロキシエチルピリジン、４‐置換‐２‐クロロ‐６‐ヒドロキシプロピルピリジン、４‐置換‐２‐（アミノエチル）‐６‐クロロピリジン、４‐置換‐２‐（アミノエチルメチル）‐６‐クロロピリジン、または５‐置換‐２，３‐ジクロロチオフェンである。スフィンゴシン‐１‐リン酸Ｓ１Ｐ２受容体２アンタゴニスト受容体を含む医薬組成物も、腫瘍性眼障害および失明、ならびに線維性肺、腎臓、肝臓、および皮膚疾患の治療に有用であるとして開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１２年３月２６日出願の米国特許仮出願第６１／６１５４５４号の優先権の利益を主張するものである。

本発明は、スフィンゴシン‐１‐リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体、ならびにそのような受容体に関連する病状の治療および予防に用いられる化合物に関する。より詳細には、本発明は、公知のスフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）アンタゴニストであるＪＴＥ０１３の新しい誘導体の合成および生物学的試験に関する。Ｓ１Ｐ２アンタゴニストは、癌、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、およびその他の炎症性疾患に用いられる可能性を有する。Ｓ１Ｐ２アンタゴニストで治療される可能性のあるこれらの炎症性疾患の中で、慢性肺疾患、慢性腎臓および肝臓疾患、慢性心疾患、ならびに硬化症／強皮症などの皮膚疾患を含む線維症を特徴とする疾患が挙げられる。Ｓ１Ｐ２アンタゴニストはまた、多形神経膠芽腫（脳癌）、小児神経芽細胞腫、およびその他の癌の治療にも用いられ得る。

受容体アンタゴニストは、受容体と結合した際に、生物学的応答は誘発せずに、アゴニスト媒介応答を遮断または抑制する細胞受容体リガンドとして作用する化学化合物である。薬理学では、アンタゴニストは、その同族受容体に対して親和性は有するが、有効性は持たず、それとの結合により、受容体部位でのアゴニストまたはインバースアゴニストの相互作用を妨害し、機能を阻害する。アンタゴニストは、受容体上の活性部位もしくはアロステリック部位へ結合することによってその効果を媒介するか、またはそれは、細胞受容体活性の生物学的制御には通常関与しない独特の結合部位で相互作用を起こし得る。アンタゴニスト活性は、アンタゴニスト‐受容体複合体の寿命に応じて、可逆的または非可逆的であり得、それはさらに、アンタゴニスト受容体結合の性質に依存する。薬物アンタゴニストの大部分は、受容体上の構造が定められた結合部位における内在性リガンドまたは基質と競合することによって、その効力を達成する。血管新生は、腫瘍成長、炎症、および糖尿病性網膜症などの数多くの病態に直接関与している。眼における異常な血管新生の治療に対する現行の手法としては、ある程度の視覚を保護するために網膜組織の一部を破壊するレーザー療法、ならびに抗ＶＥＧＦ抗体および／または抗ＶＥＧＦＲＮＡアプトマー（aptomer）の投与が挙げられる。眼の組織における異常な血管新生および有害な病理学的血管新生が関与する病状の予防および治療のための改善された方法ならびに剤が依然として明らかに求められている。

スフィンゴシン１‐リン酸（Ｓ１Ｐ）は、細胞増殖、遊走、生存、および分化などの様々な生物学的プロセスを制御する脂質メディエーターである。スフィンゴシンキナーゼ１（Ｓｐｈｋ１）およびスフィンゴシンキナーゼ２（Ｓｐｈｋ２）によるスフィンゴシンのリン酸化によって産生されるＳ１Ｐは、Ｓ１Ｐ特異的ホスファターゼおよびリアーゼによって分解される。これは、別個の分子内シグナル伝達経路を制御する細胞表面の５つのＧタンパク質共役型Ｓ１Ｐ受容体、Ｓ１Ｐ１Ｒ、Ｓ１Ｐ２Ｒ、Ｓ１Ｐ２Ｒ、Ｓ１Ｐ４Ｒ、およびＳ１Ｐ５Ｒ、に対して高い親和性を有するリガンドである。Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、およびＳ１Ｐ３受容体は、広く発現される一方、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５の発現は、それぞれ、免疫系および神経系の細胞中で突出している。Ｓ１Ｐ１受容体は、Ｇｉシグナル伝達経路のみと結合し、一方Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ３受容体は、Ｇｉ、ならびにＧｑおよびＧ１２／１３経路と結合する。しかし、Ｓ１Ｐ２は、Ｇ１２／１３を強力に活性化する一方、Ｓ１Ｐ３は、Ｇｑを優先的に活性化する。

ＦＴＹ７２０は、Ｔリンパ球中の５つのＳ１Ｐ受容体のうちの４つに対するアゴニストであるＦＴＹ７２０‐Ｐへのリン酸化を含む作用機構を有する、強力な免疫調節剤である。ＦＴＹ７２０は、リンパ球輸送の強力な調節剤であることが過去に示されているが、血管要素へのＦＴＹ７２０の効果は、これまで未知であった。

血管内皮細胞が、ＦＴＹ７２０およびその類似体を「活性化」する酵素系を含有することが実証されている。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの培養された内皮細胞が、血管新生を研究するための生体外モデル系として受け入れられている。ＨＵＶＥＣ条件培地または細胞抽出物とのインキュベーションにより、ＦＴＹ７２０は、リン酸化され、百日咳毒素感受性の様式での内皮細胞の遊走を活性化することができ、このことは、それがＧｉ共役Ｓ１Ｐ受容体を活性化していることを示唆している。ここでは、内皮細胞由来スフィンゴシンキナーゼ‐２（ＳＫ２）が、ＦＴＹ７２０のＦＴＹ７２０‐Ｐへの活性化に関与していることが示されている。

Ｓ１Ｐ受容体はまた、血管形態形成および成熟、心機能、血管透過性、および腫瘍血管新生などの血管系の重要な生理学的機能も制御する。実際、Ｓ１Ｐ１受容体が、内皮細胞と血管平滑筋細胞との間のＮ‐カドヘリンに基づく強力な接合の形成を促進することにより、胎芽の血管系の適切な安定化にとって必須なものであることから、Ｓ１Ｐ１ヌル胎芽は、胎齢Ｅ１２．５〜１４．５日に、大量出血によって死亡する。しかし、Ｓ１Ｐ２またはＳ１Ｐ３受容体のいずれかを欠失したマウスは、生存し、繁殖力を有する。

興味深いことに、Ｓ１Ｐ１／Ｓ１Ｐ２二重ヌル胎芽（double null embryo）は、Ｓ１Ｐ１単一ヌル胎芽（single null embryo）よりも重篤な表現型を示し、このことは、Ｓ１Ｐ２受容体も、胎芽の血管発達の過程において重要であることを示唆している。加えて、Ｓ１Ｐ２ヌルマウスは、内耳の血管条における血管異常、およびコルチ器官の感覚有毛細胞の変性により、まったく耳が聞こえない。さらに、ゼブラフィッシュ遺伝子ｍｉｌｅｓ‐ａｐａｒｔ（Ｍｉｌ）における変異、Ｓ１Ｐ２類似体は、その結果として心臓前駆細胞の遊走異常による心臓発達異常（二股心臓）をもたらし、このことは、魚類の心臓発達におけるこの受容体の重要性を強調するものである。しかし、血管発達および病理学におけるＳ１Ｐ２受容体の役割は、活発に研究が行われている分野である。

新しい血管が形成されるプロセスは、血管新生と称される。血管新生の過程において、血管内皮細胞は、増殖、遊走、および形態形成を順序正しく起こし、新しい毛細血管ネットワークを形成する。正常または非病理学的条件下では、血管新生は、創傷治癒、虚血に対する組織および細胞の応答、ならびに胎芽および胎児の発達過程などの詳細に明らかにされた条件下で発生する。しかし、持続的または制御されない血管新生は、様々な疾患状態または病状に繋がる恐れがあり、固形腫瘍の場合、それは、疾患状態の維持に必要な条件であり得る。

Hla et al.の特許文献１には、血管透過性障害の治療に有用であると主張されている血管内皮スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体のアゴニスト化合物がいつくか開示され、請求されており、２‐アミノ‐２‐［２‐（４‐オクタフェニル）エチル］プロパン‐１，３ジオールまたは２‐アミノ‐２‐メチル‐４‐［４‐ヘプトキシ‐フェニル］ブタン‐１‐オールを含む群より選択される化合物の治療有効量を投与することを含む。血管透過性障害は、内皮損傷、血小板減少症、虚血性末梢血管疾患に関連するいずれであってもよく、糖尿病、デング出血熱、急性呼吸促迫症候群、血管漏出症候群に関連するいくつかの末梢血管障害のいずれであってもよく、またはこれらの組み合わせであってもよい。上述の化合物は、スフィンゴシンキナーゼ‐２によってリン酸化形態へとリン酸化され得るものであり、これが、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体のアゴニストとして作用する。

Brinkman et al.の特許文献２には、慢性またはうっ血性心不全を治療するための化合物が開示されており、その遊離形態、または薬理学的に許容される塩、またはリン酸塩である２‐アミノ‐２‐［２‐（４‐オクチルフェニル）エチル］プロパン‐１，３‐ジオールの治療有効量を前記対象へ投与することを含む。

Kikuchi et al.の特許文献３には、臓器もしくは組織移植に起因する自己免疫疾患または急性および慢性拒絶反応、骨髄移植に起因する移植片対宿主（ＧｖＨ）病の治療または予防、ならびにアレルギー性疾患の治療または予防に有用である化合物が開示され、請求されている。特に適切な化合物としては、２‐アミノ‐２‐｛２‐［２’‐フルオロ‐４’‐（４‐メチルフェニルチオ）ビフェニル‐４‐イル］エチル｝プロパン‐１，３‐ジオールおよび２‐アミノ‐４‐［２’‐フルオロ‐４’‐（４‐メチルフェニルチオ）ビフェニル‐４‐イル］‐２‐（ホスホリロキシメチル）ブタノールの薬理学的に許容される酸付加塩、水和物、または溶媒和物が挙げられる。

やはりHla et al.による特許文献４には、血管内皮スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体の新規なアゴニスト化合物がいつくか開示され、請求されている。ＦＴＹ７２０などの公知の化合物アゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ‐２によってリン酸化形態へとリン酸化され得るものであり、これが、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体のアゴニストとして作用する。これらの血管内皮受容体アゴニストは、血管透過性障害および望ましくない血管内皮細胞アポトーシスを治療するための医薬組成物へと製剤され得る。

Kawasaki et al.の特許文献５は、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体アンタゴニスト活性を有する新しいピラゾロピリジン化合物、およびＳｐｈ‐１‐Ｐ受容体アンタゴニスト活性または薬理学的に許容される塩を活性成分として含有する線維症治療薬としての医薬組成物におけるその使用に関する。具体的には、この発明は、以下の式の新しい化合物に関し：

式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々、Ｃ１−８アルキルなどであり；Ｒ４は、水素などであり；Ｒ５およびＲ６は、各々独立して、水素、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲンであり；Ｘは、ＮＨ−、−Ｏ−、−ＣＨ２−であり、Ｙは、ＮＨ−であり；Ｚは、ＣＯ−であり；Ｗは、ＮＨ−であり；ならびにＡは、アリールまたはヘテロアリールである。これらの化合物は、肝臓、腎臓、および肺の線維症、または血管平滑筋の増厚化に起因する動脈硬化症に対して治療有効性を有すると主張されている。

S. Nakade et al.の特許文献６には、スフィンゴシン１‐リン酸受容体制御剤を含む呼吸器疾患のための治療薬としてのいくつかのＳ１Ｐアンタゴニストが開示され、請求されている。これらの化合物は、気道狭窄、気管支喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺気腫、気管狭窄、びまん性汎細気管支炎または感染症を伴う気管支炎、結合組織疾患または移植、リンパ脈管筋腫症、成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺炎、肺癌、過敏性間質性肺炎または特発性間質性肺炎の治療、または予防に用いられ得る。

W.K. Fang et al.の特許文献７には、スフィンゴシン１‐リン酸‐２（Ｓ１Ｐ２）受容体のサブタイプ選択性調節剤としての縮合環ピリジン化合物が開示され、請求されている。これらの化合物は、眼疾患、心臓の疾患もしくは病状、線維症、疼痛、および創傷から成る疾患および病状の治療または予防に用いられ得る。

Hla et al.の特許文献８には、血管内皮スフィンゴシン１‐リン酸受容体のいくつかの新規なアゴニストが開示され、請求されている。ＦＴＹ７２０などの公知の化合物アゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ‐２によってリン酸化形態へとリン酸化され得るものであり、これが、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体アゴニストとして作用する。これらの血管内皮受容体アゴニストは、血管透過性障害および望ましくない血管内皮細胞を治療するための医薬組成物へと製剤され得る。ＦＴＹ７２０などの公知のアゴニストは、スフィンゴシンキナーゼ‐２によってリン酸化形態へとリン酸化され得るものであり、これが、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体アゴニストとして作用する。これらの血管内皮受容体アゴニストは、血管透過性障害および望ましくない血管内皮細胞腫瘍を治療するための医薬組成物へと製剤され得る。

やはりHla et al.の特許文献９には、眼、特に網膜における血管新生異常を阻害するいくつかの化合物が開示されている。これらの化合物は、Ｓ１Ｐ２受容体の受容体活性の有効な阻害剤であると主張されている。組成物は、Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストおよび眼科的に許容される賦形剤を含む。

哺乳類の血管発達におけるＳ１Ｐ２受容体の役割を特定する目的で、Ｓ１Ｐ２受容体を欠失したマウスの網膜血管の発達についての調査が、生理学的（正常な網膜発達）および病態生理学的（虚血誘発網膜症）条件下にて行われた。マウス網膜の出生後血管発達は、血管新生および血管安定化の機構を調べるための魅力的なモデル系を提供する。出生後、視神経乳頭から内皮細胞が出現し、マウス網膜の一次脈管構造を形成する。半径方向へ向かって成長する血管が、網膜神経細胞および星状細胞の神経叢（retina neuronal and astrocytic plexus）に沿って形成される。他方、病理学的網膜血管新生では、「血管叢（vascular tufts）」として硝子体液中へと成長し、最終的には失明を引き起こすものである、異常に成長して無秩序に配向される機能不全血管が作り出される。この表現型は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）および成人糖尿病性網膜症によく見られる。

Ｓ１Ｐ−／−２マウスでは、正常な網膜発達の過程において、血管新生プロセスが正常に進行することが示されている。しかし、マウスを虚血ストレスに暴露した場合、Ｓ１Ｐ２−／−網膜は、「生理学的」網膜内血管新生を増加させ、「病理学的」硝子体内血管新生を減少させたと思われる。さらに、Ｓ１Ｐ２受容体は、炎症細胞浸潤、炎症誘発性および血管新生促進性酵素シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）‐２の誘導、ならびに血管拡張因子一酸化炭素（ＮＯ）を産生する内皮型一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の抑制に必要とされることが実証された。この研究により、失明の恐れのある網膜症の予防および／または治療のための新規な標的として、Ｓ１Ｐ２受容体によるＳ１Ｐシグナル伝達が識別された。

Schwalm Pfeilschifter and Huwilerによる文献（非特許文献１）では、細胞外および細胞内Ｓ１Ｐの、組織損傷、炎症、ならびにＥＣＭ産生および沈着を刺激する線維化促進サイトカインの作用を含む病理学的線維化の多段階カスケードに対する一般的影響について研究されている。Ｓ１Ｐの関与についての現在の知見から、肺、腎臓、肝臓、心臓、および皮膚の臓器線維症の発症におけるシグナル伝達の制御に関与していることが示唆される。さらに、スフィンゴシンキナーゼ‐１／Ｓ１Ｐシグナル伝達経路を標的とすることによって、種々の線維化プロセスの治療における治療の可能性が提供されることも示されている。

米国特許第７，８３８，５６２号明細書米国特許第７，９１０，６２６号明細書米国特許第８，１１４，９０２号明細書米国特許出願公開第２０１１／００１５１５９号明細書国際公開第０１／９８３０１号パンフレット欧州特許出願公開第１４２４０７８号Ａ１明細書国際公開第２０１１／０４８２８７号Ａ１パンフレット米国特許出願公開第２００９／００００４２０７号明細書米国特許出願公開第２０１１／０４１２８７号明細書

Biochimica et Biophysica Acta 1831 (2013) 239-250

本発明の１つの実施形態において、眼の血管新生異常を治療する方法は、それを必要とする個人に、有効量のＳ１Ｐ２受容体アンタゴニストを投与することを含む。本明細書で用いられる場合、「治療する」の用語は、眼の血管新生異常に罹患している個人への投与、ならびに眼の血管新生異常のリスクを有する個人への、防止または予防の両方の意味での投与を含む。眼の血管新生異常のリスクを有する個人へのＳ１Ｐ２受容体アンタゴニストの投与により、眼の血管新生異常を防止することができる。１つの実施形態では、個人は、眼の血管新生異常のリスクを有するか、または眼の血管新生異常を有すると診断されている。

本発明の別の実施形態では、治療の方法は、血管新生眼疾患に関連する眼の病理学的血管新生が関係する。この種の疾患は、網膜または角膜などの眼の構造中への新しい血管の侵襲を特徴とする。これは、失明の最も一般的な原因であり、およそ２０の眼疾患と関係している。加齢黄斑変性において、関連する視覚の問題は、網膜色素上皮の下にある血管結合組織が増殖したブルッフ膜中の欠陥を通しての脈絡膜毛細血管の内部成長によって引き起こされる。血管新生による損傷は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、および後水晶体線維増殖症とも関連する。角膜血管新生と関連するその他の疾患としては、これらに限定されないが、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過装着、アトピー性角膜炎、上輪部角膜炎、翼状片乾性角膜炎、シェーグレン病（sjogrens disease）、酒さ性ざ瘡、フィレクテヌローシス（phylectenulosis）、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス感染症、帯状ヘルペス感染症、原虫感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、周辺角質溶解（marginal keratolysis）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発動脈炎、外傷、ウェゲナーサルコイドーシス、強膜炎、スティーブンス・ジョンソン病、類天疱瘡、および放射状角膜切開が挙げられる。

網膜／脈絡膜血管新生と関連するその他の疾患としては、これらに限定されないが、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球貧血、サルコイドーシス、梅毒、弾力線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頚動脈閉塞性疾患、慢性ぶどう膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性エリテマトーデス、乳児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、細菌もしくはウィルス感染症に起因する網膜炎または脈絡膜炎、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、乳頭小窩、シュタルガルト病、毛様体扁平部炎（pars planatitis）、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラズマ症、外傷、およびレーザー照射後合併症（post-laser complications）が挙げられる。その他の眼に関連する疾患としては、これらに限定されないが、ルベオーシス（眼の血管新生）に関連する疾患、および増殖性硝子体網膜症のすべての形態を含む血管結合組織または線維組織の異常増殖に起因する疾患が挙げられる。

別の実施形態では、眼の病理学的血管新生は、腫瘍性眼疾患と関連している。腫瘍性眼疾患としては、ぶどう膜黒色腫、黒色細胞腫、網膜細胞腫、網膜血腫および分離腫、網膜血管腫、網膜神経膠腫およびアストサイトーマ（astocytomas）、脈絡膜血管腫、脈絡膜神経線維腫、脈絡膜血腫および分離腫、眼リンパ腫、および眼母斑症（ocular phakomatoses）などの原発性眼腫瘍；ならびに脈絡膜および網膜の血管新生に関連する転移性眼腫瘍が挙げられる。非腫瘍性疾患と同様に、上記の腫瘍でも、網膜血管新生が重要な成分として共通している。

病理学的血管新生およびいくつかの種類の炎症性疾患は、Ｓ１Ｐ２受容体レベルの上昇との相互関係が示されている。ＪＴＥ０１３は、現在利用可能である唯一のＳ１Ｐ２受容体選択性アンタゴニスト化合物である。しかし、事例報告により、ＪＴＥ０１３は、その迅速な代謝クリアランスに少なくとも部分的に基づいて、生体内特性が非常に悪いことが確認されている。これらの特性により、スフィンゴシン‐１‐リン酸媒介疾患および障害の治療ならびに予防におけるＪＴＥ０１３の有効性および有用性が制限される。Ferrer and Hlaは、神経芽細胞腫細胞株がＳ１Ｐ２受容体を過剰発現すると報告しており、Ｓ１Ｐ２アンタゴニストがこの小児癌に用いられ得ることを示唆している。Van Brooklyn and Young、およびその他の研究者らは、神経膠腫細胞（多形性神経膠芽細胞腫の原因である）における細胞侵襲性およびその増殖の形態におけるＳ１Ｐ２受容体の重要性を示した。

ＪＴＥ０１３は、癌、アテローム性動脈硬化症、およびその他の炎症性疾患における抗血管新生剤として有用である可能性を有する公知のスフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）クラスのアンタゴニストである。本発明は、スフィンゴシン１‐リン酸２受容体（Ｓ１Ｐ２）のシグナル伝達を遮断または阻害することによって癌、アテローム性動脈硬化症、およびその他の炎症性障害における抗血管新生剤として有用なＳ１Ｐ２アンタゴニストとして機能する、スフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）受容体誘導体の群の開発を含む。

本発明は、スフィンゴシン１‐リン酸２受容体（Ｓ１Ｐ２）を遮断または阻害することによって癌、アテローム性動脈硬化症、およびその他の炎症性障害の治療のための抗血管新生剤として有用なＳ１Ｐ２アンタゴニストとして機能する化合物の特定の群の開発を含む。このＳ１Ｐ２アンタゴニストは、多形性神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、およびその他の癌の治療に有用である可能性がある。これらの組成物は、薬物動態パラメータの改善、経時での血中濃度レベルの上昇、および受容体親和性の増加など、その遅延されたクリアランスに少なくとも部分的に起因する生体内特性の改善に基づいて、眼、特に網膜における血管新生異常の阻害に有効である。また、本明細書では、Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストおよび眼科的に許容される賦形剤を含む組成物の投与による、特定の種類の失明を治療または予防するための方法も提供される。

病理学的血管新生およびいくつかの種類の炎症性疾患は、Ｓ１Ｐ２受容体レベルの上昇との相互関係が示されている。先行技術において、ＪＴＥ０１３は、公知の選択性Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニスト化合物である。この化合物は、その迅速な代謝クリアランスに少なくとも部分的に基づいて、生体内特性が非常に悪い。これらの特性により、スフィンゴシン‐１‐リン酸媒介疾患の治療および予防におけるこの化合物の有効性および有用性が制限され得る。

そこで、本発明は、眼、特に網膜における血管新生異常の阻害のための組成物ならびに方法を含む。また、本明細書では、特定の種類の失明を治療または予防するための方法も提供される。さらには、Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストおよび眼科的に許容される賦形剤を含む、生体内特性が改善された組成物も提供される。本発明は、眼、特に網膜における血管新生異常の阻害のための組成物ならびに方法を含む。また、本明細書では、特定の種類の失明を治療または予防するための方法も提供される。さらには、Ｓ１Ｐ２受容体アンタゴニストおよび眼科的に許容される賦形剤を含む、代謝安定性および／または作用継続期間の延長に基づいて生体内特性が改善された組成物も提供される。

スフィンゴシン‐１‐リン酸（Ｓ１Ｐ）は、Ｇタンパク質共役型受容体のＳ１Ｐファミリー（Ｓ１ＰＲ）を介してシグナル伝達する多機能脂質メディエーターである。Ｓ１Ｐは、血管成熟、透過性、および血管新生を制御することが知られている。例えば、Ｓ１Ｐは、血管新生、すなわち、新しい血管の成長の刺激因子であることが知られている。本明細書で用いられる場合、Ｓ１Ｐ２Ｒ、Ｓ１Ｐ２Ｒ、Ｓ１Ｐ２受容体、およびＳ１Ｐ２受容体の用語は、スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２型（Ｓ１Ｐ）を意味するために交換可能に用いられる。

いくつかの新規なスフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）アンタゴニストが作製された。アンタゴニスト化合物を作製するための詳細は、実施例に提供される。これらの化合物は、生体内代謝および代謝安定性のための十分に確立された生体外モデルを用いて、肝ミクロソームに対する予想外に高められた安定性を示した。加えて、これらの化合物のほとんどは、予想外なことに、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ５受容体の両方と結合した。これらの化合物は、Ｓ１Ｐ受容体によって媒介される病状または疾患の治療および予防のための治療薬として有用である。そのような病状および疾患としては、これらに限定されないが、広く様々な炎症性疾患および病状、ならびに血管新生プロセスによって媒介される疾患および病状が挙げられる。

本発明の１つの実施形態において、新規なスフィンゴシン‐１‐リン酸アンタゴニスト化合物は、アテローム性動脈硬化症、ならびに例えば心筋梗塞、脳卒中、アンギナ、および末梢血管疾患などの心血管および脳血管疾患を含むそれと関連する病状の治療または予防に用いることができる。これらの化合物はまた、敗血症および敗血症性ショック、ならびに、糖尿病、肝硬変、透過性の増加を伴う血管疾患、およびアレルギー反応を含む広く様々なその他の疾患の治療または予防にも用いることができる。これらの化合物の合成の一般的方法は、以下の通りである：

本発明の好ましい化合物は、以下の一般構造の化合物を含み、

ここで、各々は、以下から成り：

以下の実施例は、本発明のプロセスをより具体的に示し、明らかとするために提供される。本明細書で開示される具体的なパラメータおよび範囲に変更が成されてよいこと、および開示される変数を変更するためのいくつかの異なる方法が本技術分野にて公知であることは認識される。明細書および図面に示されるように、これらの要素の好ましい実施形態のみが本明細書にて開示されることは理解されるが、本発明は、それに限定されるべきではなく、本明細書に続く請求項の趣旨および範囲の観点から解釈されるべきである。

実施例１
ａ．５‐アミノ‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾールの合成

β‐アミノ‐クロトノニトリル（４．２ｇ、５０ｍｍｏｌ）およびアリルヒドラジン（３．６ｇ、５０ｍｍｏｌ）を、イソプロパノール（２０ｍＬ）に溶解し、この溶液を少しずつ加熱して、窒素雰囲気下にて５時間還流させた。この反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ中の２．５％メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、５‐アミノ‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾール（４．２ｇ）をシロップとして得た。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ６．００−５．８８（１Ｈ，ｍ），５．３５（１Ｈ，ｓ），５．２３−５．０４（２Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．４７（２Ｈ，ｂｓ）２．１５（３Ｈ，ｓ）

ｂ．１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐イソプロピル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジンの合成

イソブチリル酢酸エチル（１０．５ｇ、６６．５ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸中の５‐アミノ‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾール（９．００ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、加熱して２０時間還流した。冷却後、酢酸エチル（８０ｍＬ）を添加し、加熱して１時間還流した。溶媒を蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中の５％メタノールを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐イソプロピル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジンを無色結晶として得た（１．１ｇ、７％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ６．１６（１Ｈ，ｓ），６．０６−５．９７（１Ｈ，ｍ），５．３０−５．２２（２Ｈ，ｍ），４．９５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．３１−３．２７（１Ｈ，ｍ），２．５２（３Ｈ，ｓ），１．３１（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）

実施例２
２，６‐ジクロロピリジル‐４‐イソシアネートの合成

ａ）２，６‐ジクロロピリジン‐４‐カルボニルアジドの合成
ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）（５ｍＬ、２３．２ｍｍｏｌ）を、酢酸エチル（４０ｍＬ）中の２，６‐ジクロロイソニコチン酸（４．０５ｇ、２１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．８ｍＬ、２７．５ｍｍｏｌ）の溶液へ、０〜５℃で添加し、室温で２０時間撹拌した。酢酸エチルを添加して希釈し、有機層を水で洗浄した。有機層を、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、真空濃縮して、２，６‐ジクロロピリジン‐４‐カルボニルアジドの粗生成物を得た（７．０８ｇ）。これを酢酸エチルに溶解し、活性炭で処理した。ろ過および蒸発後、２，６‐ジクロロピリジン‐４‐カルボニルアジドを（４．５７ｇ）無色結晶として得た。上記手順から得た２，６‐ジクロロピリジン‐４‐カルボニルアジド（４．２１ｇ）を、乾燥トルエン（４０ｍＬ）に溶解し、この溶液を１００℃で４時間加熱して、２，６‐ジクロロピリジル‐４‐イソシアネートを得た。これを、溶液として０℃で保存した。

化合物１の合成

トリエチルアミン（２．１７ｍＬ、３．０当量、１５．５７ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐イソプロピル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン（１．２０ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、−１０℃に冷却した。無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．３０ｍＬ、７．７８ｍｍｏｌ、１．５当量）をこの冷溶液へ滴下した。この溶液を、４５分間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで撹拌した。水で反応停止し、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で抽出した。この混合物を濃縮し、乾燥し、カラムクロマトグラフィー（１０：１ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、１．３２ｇの所望される生成物を黄色オイルとして、７０％の収率で得た。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ６．７５（１Ｈ，ｓ），６．０６−５．９５（１Ｈ，ｍ），５．２９−５．２２（２Ｈ，ｍ），４．９５（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．６５−３．６０（１Ｈ，ｍ），２．６９（３Ｈ，ｓ）および１．３８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）

上記の化合物（２００ｍｇ、０．５５１ｍｍｏｌ）、ｔ‐ブチルカルバゼート（８７ｍｇ、０．６６１ｍｍｏｌ、１．２当量）、オーブン乾燥した炭酸セシウム（４３１ｍｇ、１．３２２ｍｍｏｌ、２．４当量）、キサントホス（１５モル％、４８ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ）、およびＰｄ２（ｄｂａ）３（５モル％、２６ｍｇ、０．０２７６ｍｍｏｌ）をすべて、オーブン乾燥したフラスコへ窒素下にて投入した。この反応混合物を、脱気した乾燥ジオキサンに溶解し、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで、６５℃で加熱した。物質を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／酢酸エチル）に掛けて、１３３ｍｇの所望されるヒドラジン誘導体を、７０％の収率で得た。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．３４（１Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｍ），５．２２（１Ｈ，ｍ），５．１６（１Ｈ，ｍ），４．９７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），４．３４（２Ｈ，ｂｓ），３．５９（１Ｈ，ｍ）２．６５（３Ｈ，ｓ），１．５５（９Ｈ，ｓ），１．３４（３Ｈ，ｓ）１．３６（３Ｈ，ｓ）

トルエン中の２，６‐ジクロロ‐ピリジル‐４‐イソシアネート（２．０当量、１．３ｍＬ、０．７７１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の上記ヒドラジン誘導体（１３３ｍｇ、０．３８５ｍｍｏｌ）へ添加し、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで撹拌した。この粗反応物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（２：１から１：１ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、所望される生成物を、黄色固体として得た（１９３ｍｇ、収率９４％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ９．５６（１Ｈ，ｂｓ），７．４４（２Ｈ，ｓ），７．２５（１Ｈ，ｓ），７．１０（１Ｈ，ｂｓ）６．１０−５．９７（１Ｈ，ｍ），５．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．５Ｈｚ），５．０１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１．５Ｈｚ），４．９８−４．９５（２Ｈ，ｍ），３．６９−３．６０（１Ｈ，ｍ），２．７０（３Ｈ，ｓ），１．５５（９Ｈ，ｓ），１．４０（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ）

化合物１の合成

塩酸（エーテル中の２Ｍ、５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）中の上記Ｂｏｃ‐化合物（５００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加し、この反応物を、室温にて１２時間撹拌した。この反応混合物を濃縮し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た（４２４ｍｇ）。純生成物（化合物‐１）を、分取用ＴＬＣ（ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃ）を用いて精製した後、白色固体として単離した（１４０ｍｇ、収率３４％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４１（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｓ（１Ｈ，ｍ），５．０７−４．９７（２Ｈ，ｍ），４．７７（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），３．４１−３．２９（１Ｈ，ｍ），２．５１（３Ｈ，ｓ），１．２４（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｚＭＨ＋）４３４．２

Ｎ‐（１Ｈ‐４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）アミノ‐Ｎ’‐（２，６‐ジクロロピリジン‐４‐イル）ウレア（ＪＴＥ０１３）

上記表題の化合物を、文献の報告に従って作製した（国際公開第０１／９８３０１号パンフレット）

化合物‐２の合成

ブロモ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル（５００ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＥ（１ｍＬ）中のＮ‐（１Ｈ‐４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）アミノ‐Ｎ’‐（２，６‐ジクロロピリジン‐４‐イル）ウレア（１２５ｍｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、この反応混合物を、１００℃で一晩加熱した。次に、それをＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液（１×１０ｍＬ）で、続いて水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧濃縮した。残渣を、カラムクロマトグラフィー（５％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、所望される純生成物を、白色固体として得た（２５ｍｇ）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ７．５８（２Ｈ，ｓ），６．７８（１Ｈ，ｓ），４．８７（２Ｈ，ｂｓ），３．９９（３Ｈ，ｓ），３．６５（１Ｈ，ｍ），２．８１（３Ｈ，ｓ），１．５０（９Ｈ，ｓ），１．３７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｅ）５２３（ＭＨ＋）

ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した上記ｔ‐ブチルエステル（１５ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）中のトリフルオロメタンスルホン酸（１５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加した。この反応混合物を、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣで示される反応完了の後、ＮａＨＣＯ３（９ｍｇ）およびＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）を、この反応混合物へ添加し、１５分間撹拌した。この反応混合物を、真空濃縮し、ＤＣＭと共蒸発させ、ヘキサンで研和して、所望される生成物（化合物‐２）を褐色固体として得た（２５ｍｇ、３４％化合物および６６％ナトリウムトリフレートを含有）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ７．５８（２Ｈ，ｓ），６．７８（１Ｈ，ｓ），５．４９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），４．００（３Ｈ，ｓ），３．４４−３．５７（１Ｈ，ｍ），２．８２（３Ｈ，ｓ），１．３７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｚＭＨ＋）４６６．２

化合物‐３の合成：

炭酸セシウム（１４０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物１（１８０ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ）およびブロモ酢酸ｔｅｒｔ‐ブチル（８０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この反応混合物を、室温にて３時間撹拌した。次にこれを、ＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、水（３×１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧濃縮した。所望される生成物を、分取用ＴＬＣ（２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）を用いて精製し、続いてイソプロピルエーテルで研和した後、無色結晶として単離した（４５ｍｇ）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ８．４９（１Ｈ，ｂｓ），７．４９（２Ｈ，ｓ），７．０１（１Ｈ，ｂｓ），６．４０（１Ｈ，ｓ），６．０２−５．９６（１Ｈ，ｍ），５．２１−５．１５（２Ｈ，ｍ），４．９７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ），４．９６−４．８８（２Ｈ，ｍ），３．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ），３．５５−３．４２（１Ｈ，ｍ），２．６２（３Ｈ，ｓ），１．４７（９Ｈ，ｓ），１．３２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｚＭＨ＋）４４７

ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した上記Ｂｏｃ‐保護化合物（２２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＣＭ（４ｍＬ）中のトリフルオロメタンスルホン酸（２２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）へ０℃で添加した。この反応混合物を、室温で１時間撹拌した。ＴＬＣで示される反応完了の後、ＮａＨＣＯ３（１１ｍｇ）およびＭｅＯＨ（０．５ｍＬ）を、この反応混合物へ添加し、１５分間撹拌した。反応混合物を、真空濃縮し、ＤＣＭと共蒸発させ、ヘキサンで研和して、所望される生成物（化合物‐３）を薄褐色固体として得た（３６ｍｇ、３４％化合物および６６％ナトリウムトリフレートを含有）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ９．６９（１Ｈ，ｂｓ），７．６７（２Ｈ，ｓ），６．６４（１Ｈ，ｓ），５．９７−５．９１（１Ｈ，ｍ），５．０９−４．８５（６Ｈ，ｍ），３．５７−３．３４（１Ｈ，ｍ），２．６０（３Ｈ，ｓ），１．３６（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｅＭＨ＋）４９０

化合物４の合成：

化合物４は、上記のスキームに従って作製した。ＭＳ（ｍ／ｅＭＨ＋）４４７

化合物‐５の合成
１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐トリフルオロメチル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジンの合成

プロピオン酸（１０ｍＬ）中の４，４，４‐トリフルオロアセト酢酸エチル（５．６ｇ、３０ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸中の５‐アミノ‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾール（４．２ｇ、３０ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、加熱して（１５０℃）２３時間還流した。冷却後、酢酸エチル（４０ｍＬ）を添加し、加熱して１時間還流した。ゆっくり冷却すると、所望される化合物の結晶が析出し、これをろ過し、酢酸エチルで洗浄し、減圧乾燥した。こうして、１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐トリフルオロメチル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジンを白色結晶として得た（５．１ｇｍ、６６％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ６．６３（１Ｈ，ｓ），６．０７−５．９４（１Ｈ，ｍ），５．２９−５．２３（２Ｈ，ｍ），４．９６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），２．５１（３Ｈ，ｓ）および１．８５（１Ｈ，ｂｓ）

トリエチルアミン（１．７７ｇ、２．４２ｍＬ、３．０当量、１７．５２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐トリフルオロメチル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン（１．５０ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、−１０℃に冷却した。無水トリフルオロメタンスルホン酸（１．４８ｍＬ、２．４７ｇ、８．７５ｍｍｏｌ、３．０当量）をこの冷溶液へ添加した。この溶液を、４５分間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで、この温度で撹拌した。水で反応停止し、ジクロロメタン（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を濃縮し、乾燥し、カラムクロマトグラフィー（１０：１ヘキサン／酢酸エチル）で精製して、２．１５ｇの所望される生成物を黄色オイルとして得た。収率９６％１Ｈ６００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ ６．６０（１Ｈ，ｓ），６．０３（１Ｈ，ｍ），５．３０（２Ｈ，ｍ），４．９８（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），２．４９（３Ｈ，ｓ）

上記の化合物（２１５ｍｇ、．５５３ｍｍｏｌ）、ｔ‐ブチルカルバゼート（８８ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ、１．２当量）、オーブン乾燥した炭酸セシウム（４３２ｍｇ、１．３２７ｍｍｏｌ、２．４当量）、キサントホス（１５モル％、４８ｍｇ、．０８３ｍｍｏｌ）、およびＰｄ２（ｄｂａ）３（５モル％、２５ｍｇ、０．０２７６ｍｍｏｌ）をすべて、窒素雰囲気下の乾燥状態でフラスコへ投入した。この反応混合物を、脱気した乾燥ジオキサンに溶解し、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで、６５℃で加熱した。この反応混合物を濃縮し、物質をカラムクロマトグラフィー（３：１ヘキサン／酢酸エチル）に直接掛けて、８５ｍｇの所望される生成物を、４２％の収率で得た。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．９３（１Ｈ，ｓ），６．０４（１Ｈ，ｍ），５．２４（２Ｈ，ｍ），５．０２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），４．９１（２Ｈ，ｂｓ）２．５８（３Ｈ，ｓ），１．５８（９Ｈ，ｓ）

トルエン中の２，６‐ジクロロ‐ピリジル‐４‐イソシアネート（約２．０当量、１．０ｍＬ、０．４５８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の上記ヒドラジン誘導体（８５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ）の溶液へ０〜５℃で添加した。この溶液を、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで撹拌した。この反応物を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（２：１から１：１ヘキサン／酢酸エチル）で直接精製して、１２２ｍｇの所望されるＢｏｃ生成物を、９５％の収率で得た。１Ｈ６００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．７５（１Ｈ，ｂｓ），８．０６（１Ｈ，ｂｓ），７．７２（１Ｈ，ｓ），７．３２（２Ｈ，ｓ），６．０１（１Ｈ，ｍ），５．２４（２Ｈ，ｄＪ＝５．６Ｈｚ，２．５Ｈｚ），５．００（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），２．６４（３Ｈ，ｓ），１．５７（９Ｈ，ｓ）

塩酸（エーテル中の２Ｍ溶液、１．０ｍＬ、２ｍｍｏｌ）を、乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）中の上記Ｂｏｃ誘導体（４４ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）の溶液へ、０℃で添加した。この反応混合物を、室温で１２時間撹拌した。この反応混合物をろ過し、こうして得られた結晶化合物を、イソプロピルエーテルで洗浄し、真空オーブン中で乾燥した。化合物‐５を、無色固体として単離した（２６ｍｇ、収率７２％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）δ ７．６０（２Ｈ，ｓ），６．９３（１Ｈ，ｓ），５．９７−５．８８（１Ｈ，ｍ），５．０８−４．９２（２Ｈ，ｍ），４．９１−４．８８（２Ｈ，ｍ），２．４９（３Ｈ，ｓ），ＭＳ（ｍ／ｅＭＨ＋）４６０

化合物‐６の合成

アニソール（１ｍＬ）中の１Ｈ‐６‐ヒドロキシ‐４‐イソプロピル‐１‐アリル‐３‐メチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン（２００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＰＯＢｒ３（３６５ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を、１３０℃で３時間加熱した。ＴＬＣで示される反応完了の後、反応混合物をトルエン（１０ｍＬ）で希釈した。これを、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍｇ）で、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過した。ろ液を減圧蒸発させ、得られた残渣を、１０％酢酸エチル／ヘキサンを溶出液として用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。所望される生成物（化合物６）を黄色オイルとして得た（１０８ｍｇ、収率：４２％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ７．０３（１Ｈ，ｓ），６．１５（１Ｈ，ｍ），５．２２−５．１６（２Ｈ，ｍ），５．０２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．６２−３．４５（１Ｈ，ｍ），２．６２（３Ｈ，ｓ），１．３８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ）

カリウムｔｅｒｔ‐ブトキシド（１Ｍ溶液、１ｍＬ）を、乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中のエチルＮ‐ヒドロキシアセトイミデート（１０５ｍｇ、１０２ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加し、２．５時間撹拌した。０℃でＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した上記ブロモ化合物（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を注意深く添加し、室温での撹拌を１２時間継続した。この反応混合物を、水（５ｍＬ）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（２０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して、アセトヒドロキサメート誘導体を無色オイルとして得た（８０ｍｇ、収率：７４％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ６．９１（１Ｈ，ｓ），５．９９（１Ｈ，ｍ），５．２３−５．１７（２Ｈ，ｍ），４．９７（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），４．２８（２Ｈ，ｑ），３．５６（１Ｈ，ｍ），２．６３（３Ｈ，ｓ），２．１９（３Ｈ，ｓ），１．３９−１．３３（９Ｈ，ｍ）

メタノール（４ｍＬ）中の上記アセトヒドロキサメート化合物（８０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液へ、硫酸（０．０１ｍＬ）を添加した。この反応混合物を、室温で２．５時間加熱した。ＴＬＣで示される反応完了の後、これをＮａ２ＣＯ３（１０８ｍｇ）で中和し、水（１０ｍＬ）を添加し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を１つにまとめ、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧蒸発させた。この粗アミン（６０ｍｇ、収率：９６％）を、さらなる精製を行わずに次の反応で用いた。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ６．５５（２Ｈ，ｂｓ），６．４９（１Ｈ，ｓ），６．０８−５．９７（１Ｈ，ｍ），５．２３−５．１６（２Ｈ，ｍ），４．９６（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．５２−３．４７（１Ｈ，ｍ），２．６２（３Ｈ，ｓ），１．３３（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）

化合物６の合成

トルエン中の２，６‐ジクロロ‐ピリジル‐４‐イソシアネート（約２．０当量、１．１ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＴＨＦ（４ｍＬ）中の上記粗アミン（６０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）へ０℃で添加した。この溶液を、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで撹拌した。溶媒を減圧除去し、所望される化合物６を、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、白色固体として単離した（７０ｍｇ、収率：６６％）。１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．６７（１Ｈ，ｓ），７．７２（１Ｈ，ｓ），７．４８（２Ｈ，ｓ），６．６３（１Ｈ，ｓ），５．９９−５．９４（１Ｈ，ｍ），５．２１−５．１３（２Ｈ，ｍ），４．９４（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１．５Ｈｚ），３．６０−３．５６（１Ｈ，ｍ），２．６５（３Ｈ，ｓ），１．３８（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝７Ｈｚ），ＭＳ（ｍ／ｅＭＨ＋）４３５

上記方法を用いて、以下の化合物も作製することができる。化合物９の合成方法を以下に示す。

Ｎ‐（２，６‐ジクロロピリジン‐４‐イル）‐２‐（２‐ヒドロキシエチル）‐２‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジン‐１‐カルボキシアミド（化合物９）：
２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）エタン‐１‐オール：

２‐ヒドラジノエタノール（５．１ｍＬ、１４９．２５ｍｍｏｌ）を、エタノール（１０ｍＬ）中の１Ｈ‐６‐ブロモ‐４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン（２．０ｇ、７．４６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、還流下で一晩加熱した。冷却後、これを氷浴中で４時間撹拌した。粗物質をろ過し、得られた固体を、５０％エタノール水溶液（５ｍＬ）で研和し、ろ過し、６０℃で減圧乾燥して、２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）エタン‐１‐オールを１．３ｇの白色固体として得た（４．９４ｍｍｏｌ、収率６６％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ６．７６（ｓ，１Ｈ），４．９２（ｂｒｓ，２Ｈ），４．２０−３．９６（ｍ，２Ｈ），３．９４−３．８６（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．５２−３．４５（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ），１．２５（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）

２，６‐ジクロロピリジン‐４‐カルボニルアジド（１．０ｇ、４．６１ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液を、１００℃で４時間撹拌した。０〜５℃に冷却後、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）エタン‐１‐オール（７５０ｍｇ、２．８５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、室温で１８時間撹拌した。濃縮後、この粗物質を、勾配溶出（０〜２０％メタノール／ＤＣＭ）を用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｎ‐（２，６‐ジクロロピリジン‐４‐イル）‐２‐（２‐ヒドロキシエチル）‐２‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジン‐１‐カルボキシアミドを、６２４ｍｇの白色固体として得た（１．３８ｍｍｏｌ、収率３０％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ ９．２８（ｂｒｓ，１Ｈ），７．４７（ｓ，２Ｈ），６．７０（ｂｒｓ，１Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），４．７０−４．５０（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２０（ｍ，１Ｈ），４．０８−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．９１（ｓ，３Ｈ），３．５３−３．４６（ｍ，２Ｈ），２．９２−２．７０（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），１．３２（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１９Ｈ２３Ｃｌ２Ｎ７Ｏ２の質量［Ｍ＋Ｈ］＋理論値４５２．１２９０、測定値４５２．１４８０

化合物２７〜３３は、参照により本明細書に組み込まれる公開特許出願、国際公開第２０１１／０４１２８７号Ａ１パンフレットに示され、開示されるように作製することができる。化合物２７および３３の合成を以下に記載する。これらは、以下の構造を有し、

以下から成る：

化合物２７および３３の合成

化合物Ａ‐２の作製
ＬＤＡ（２４７ｍＬ、１Ｍ）を、ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の化合物Ａ‐１（２０ｇ、２０６ｍｍｏｌ）の溶液へ、−７８℃でゆっくり添加した。この溶液を−７８℃で１時間撹拌し、次にアセトン（１００ｍＬ）を添加した。この反応物を１時間撹拌し、次にＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、粗化合物Ａ‐２を得た。

化合物Ａ‐３の作製
Ｒｅｄ‐Ｐ（２０ｇ）を、４０％ＨＩ（水溶液、２５０ｍＬ）中の化合物Ａ‐２（２０ｇ、１２９ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を、１４０℃で加熱して２日間還流し、この溶液を、５ＮＮａＯＨ（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィ（石油エーテル：酢酸エチル２０：１）で精製して、化合物Ａ‐３を得た（５ｇ、収率＝２７％）。

化合物Ａ‐４の作製
ｎ‐ＢｕＬｉ（１７ｍＬ、２．５Ｍ）を、ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中の化合物Ａ‐３（５ｇ、３６ｍｍｏｌ）の溶液へ、−７８℃でゆっくり添加した。この反応物を−７８℃で１時間撹拌し、次に化合物Ｂ（７．５ｇ、４３．２ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、この反応物を−７８℃で２時間撹拌し、次にＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、粗化合物Ａ‐４（１０ｇ）を得た。

化合物Ａ‐５の作製
ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ、１８ｇ、６３ｍｍｏｌ）を、４０ｍＬのＤＭＳＯ中の化合物Ａ‐４（１０ｇ、３１．５ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を６０℃で３時間撹拌し、次に０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。この化合物を、フラッシュクロマトグラフィ（石油エーテル：酢酸エチル＝２０：１〜１０：１）で精製して、化合物Ａ‐５を得た（６ｇ、収率６０％）。

化合物Ａ‐６の作製
ＭｅＮＨＮＨ２（１０ｍＬ）を、グリコール（３ｍＬ）中の化合物Ａ‐５（６ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を、１４０℃で加熱して一晩還流した。水（５０ｍＬ）を添加し、この溶液をジクロロメタンで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィで精製して、化合物Ａ‐６を得た（３ｇ、収率５０％）。

化合物Ｂｎ‐Ａ‐６の作製
６ＭＨＣｌ（１０ｍＬ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の化合物Ａ‐６（３ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この反応物を室温で１時間撹拌し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、化合物Ａ‐６‐１を得た。ＮａＨ（７６０ｍｇ、１９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の化合物Ａ‐６‐１に添加し、この溶液を６０℃で２時間撹拌した。この溶液を０℃に冷却し、ＢｎＢｒ（３．２３ｇ、１９ｍｍｏｌ）。この溶液を、室温まで加温し、一晩撹拌した。水（２０ｍＬ）を添加し、この溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、化合物Ｂｎ‐Ａ‐６を得た（２．７ｇ、収率９０％）。

化合物Ａ‐７の作製
ｍ‐クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ、３．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）を、ＣＨＣｌ３（３０ｍＬ）中の化合物Ｂｎ‐Ａ‐６（２．７ｇ、８．４ｍｍｏｌ）の溶液へ０℃で添加した。この溶液を９０℃で加熱して３時間還流した。この溶液をＮａＨＣＯ３（水溶液）で反応停止し、ＤＣＭで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、粗化合物Ａ‐７（３ｇ）を得た。

化合物Ａ‐８の作製
ＰＯＣｌ３（５ｍＬ）を、トルエン（３０ｍＬ）中の化合物Ａ‐７（３ｇ、８．８ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を９０℃で３時間撹拌し、次に濃縮し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）で反応停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、化合物Ａ‐８を得た（８００ｍｇ、収率２５％）。

化合物Ａ‐９の作製
ＥｔＯＨ（１ｍＬ）中の化合物Ａ‐８（２５０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＮＨ２ＮＨ２（水溶液）の溶液へ、ＣＥＭＭｉｃｒｏｗａｖｅ中、１２０℃で１２時間撹拌した。この溶液を冷却し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、粗化合物Ａ‐９を得た（２００ｍｇ）。

化合物Ａ‐１０の作製
２，６‐ジクロロ‐４‐イソシアネートピリジン（化合物Ｃ、１６０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物Ａ‐９（２００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を、室温で３０分間撹拌した。メタノールを添加し、得られた固体をろ過した。ろ液を濃縮し、化合物Ａ‐１０を、分取用ＴＬＣで精製した（１００ｍｇ、収率３３％）。

化合物３３の作製
ヨウ化トリメチルシリル（０．５ｍＬ）を、ジクロロメタン中のＡ‐１０（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液へゆっくり添加した。この溶液を室温で３０分間撹拌し、ＮａＨＣＯ３（水溶液）で反応停止し、ＤＣＭで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、化合物３３を得た（４０ｍｇ、収率４８％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．６８（１Ｈ，ｂｒ），７．５５（１Ｈ，ｂｒ），７．４０（２Ｈ，ｓ），７．００（１Ｈ，ｓ），６．７１（１Ｈ，ｓ），４．１８（３Ｈ，ｓ），３．６２−３．５５（１Ｈ，ｍ），３．５６（２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，ｔ），３．０４（２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ｔ），２．００−１．９８（２Ｈ，ｍ），１．３６（６Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ｄ）；ＭＳ（ＥＳＩ）：４５２［Ｍ＋Ｈ］＋

化合物２７の作製
バージェス試薬（８０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４ｍＬ）中の３３（５０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液へ添加した。この溶液を室温で一晩撹拌した。この反応物を１時間、６０℃で加温し、次にこの溶液を濃縮し、分取用ＨＰＬＣで精製して、化合物２７を得た（２ｍｇ）。

上記の方法を用いて、以下の化合物も作製することができる（方法は表の次に記載）。

化合物３４〜４５の合成のための一般方的方法
酸からイソシアネートへの一般的手順
方法Ａ
適切な酸（１．０当量、０．５ｍｍｏｌ）を、新しく蒸留した酢酸エチル（５ｍＬ）に溶解し、この溶液を、０℃に冷却した。この溶液へ、トリエチルアミン（１．３当量、０．６５ｍｍｏｌ、０．０９ｍＬ）を、続いてジフェニルホスホリルアジド（１．１当量、０．５５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）を添加した。この反応物を、室温まで加温し、一晩撹拌した。次に、これを水で反応停止し、酢酸エチルで抽出した（２×２５ｍＬ）。有機層を水（２０ｍＬ）で、続いて鹹水（２０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、半分の体積まで濃縮した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、残りの酢酸エチルを、ロータリーエバポレーターの水浴の内部温度が３５℃を超えないようにして除去した。次に、このトルエン溶液（１０ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を、３〜４時間、還流下で加熱し、ＴＬＣで完了のモニタリングを行った。この溶液を室温まで冷却し、次の反応で直接用いた。

方法Ｂ
適切な酸（１．０当量、０．５ｍｍｏｌ）を、２滴の乾燥ＤＭＦを含んだ乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。この溶液へ、塩化オキサリル（１．３当量、０．６５ｍｍｏｌ、０．０６ｍＬ）を滴下した。この溶液を、室温で１時間撹拌し、ＴＬＣで完了のモニタリングを行った。アジドトリメチルシラン（２．０当量、１．０ｍｍｏｌ、０．１３ｍＬ）を添加し、２時間撹拌し、ＴＬＣで完了のモニタリングを行った。この反応物を、水で反応停止し、濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈した。有機層を水（２０ｍＬ）で、続いて鹹水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、半分の体積まで濃縮した。トルエン（１０ｍＬ）を添加し、残りの酢酸エチルを、ロータリーエバポレーターの水浴の内部温度が３５℃を超えないようにして除去した。次に、このトルエン溶液（１０ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を、３〜４時間還流し、ＴＬＣで完了のモニタリングを行った。この溶液を室温まで冷却し、次の反応で直接用いた。

酸１から５の合成による作製

酸１の合成
酸１の合成は、文献に報告されている（ＰＣＴ国際公開第２０１２／０４２４３３号パンフレット、２０１２年４月５日、Didiuk, Mary Theresa et al. Preparation of pyrazolospiroketone acetyl-CoA carboxylase）。

酸２の合成

中間体２ｂの作製：
ｎ‐プロパノール（１０ｍＬ）中の化合物２ａ（１．５ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）の溶液へ、ナトリウムｎＰｒＯＮａ（３．４ｍＬ、２Ｍ）を添加し、５０℃で４８時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、氷（１０ｇ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１０ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、化合物２ｂを得た（１．４ｇ、７９％）。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．４１（ｓ，１Ｈ），７．２０（ｓ，１Ｈ），４．２２−４．３５（ｍ，４Ｈ），１．７５−１．８２（ｍ，４Ｈ），０．９９−１．１５（ｍ，６Ｈ）

酸２の作製：
メタノール（１５ｍＬ）、水（７ｍＬ）中の化合物２ｂ（１．４８ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）の溶液へ、炭酸カリウム（１．６ｇ、１１．５９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、水（１５ｍＬ）で希釈し、ＫＨＳＯ４で酸性化し、固体をろ過し、乾燥した（２、９１０ｍｇ、７４％）。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．２１（ｂｒｓ，１Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．７６−１．８３（ｍ，２Ｈ），１．０１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）

酸３の合成

中間体３ａの作製：
乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の水素化ナトリウム（１１５ｍｇ、４．７９ｍｍｏｌ、１．０５当量）の溶液へ、２‐メトキシエタノールを０℃で滴下し、３０分間撹拌した。この溶液を、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）中の２，６‐ジクロロイソニコチン酸エチル（１．０ｇ、４．５７ｍｍｏｌ、１．０当量）へ室温で添加し、次に、５０℃で一晩加熱した。この反応物を、２ＮＨＣｌ（２．５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を添加することで中和した。溶媒を除去し、水（１０ｍＬ）を添加し、酢酸エチルで抽出した（３×１０ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、３ａを得た（６００ｍｇ、５１％）。１ＨＮＭＲ（ＭｅＯＤ）：δ ７．４２（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．４６−４．３５（ｍ，４Ｈ），３．７５（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ），１．４０（ｔ，３Ｈ）

酸３の作製：
メタノール（１０ｍＬ）、水（４ｍＬ）中の化合物３ａ（６００ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）の溶液へ、炭酸カリウム（６３５ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、水（１０ｍＬ）で希釈し、ＫＨＳＯ４で酸性化し、酢酸エチルで抽出した（３×１０ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、３を得た（３２０ｍｇ、５９％）。１ＨＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ ７．４１（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），４．４５（ｔ，２Ｈ），３．７４（ｔ，２Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）

酸４の合成

中間体４ａの作製：
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の化合物２ａ（２．５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）、エチルアミン（５．４５ｍＬ、２Ｍ）、ＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）の溶液へ、密封管中、７５℃で１６時間加熱した。溶媒を減圧除去し、水（１５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１５ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、粗化合物を得た。さらに、シリカゲルカラムを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、所望される化合物４ａを得た（４５０ｍｇ、１７％）。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ ７．０８（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）

中間体４ｂの作製：
ＴＨＦ（５ｍＬ）中の化合物４ａ（４００ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）の−１０℃の溶液へ、ＬＨＭＤＳ（２ｍＬ、１Ｍ）をゆっくり滴下した。３０分後、ＴＨＦ中の（Ｂｏｃ）２Ｏ（４４０ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）を添加し、ゆっくり室温とし、３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、飽和ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１０ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、化合物４ｂを得た（１．４ｇ、７９％）。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．１９（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．１Ｈｚ，２Ｈ），１．５４（ｓ，９Ｈ），１．３７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）

酸４の作製：
メタノール（１２ｍＬ）、水（３ｍＬ）中の化合物４ｂ（１．００ｇ、２．９５ｍｍｏｌ）の溶液へ、炭酸カリウム（８００ｍｇ、５．７９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、水（１５ｍＬ）で希釈し、ＫＨＳＯ４で酸性化し、固体をろ過し、乾燥して、所望される化合物４を得た（９１０ｍｇ、７４％）。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ ８．３１（ｓ，１Ｈ），７．５７（ｓ，１Ｈ），４．０２（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．２Ｈｚ，２Ｈ），１．５５（ｓ，９Ｈ），１．２５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）

酸５の合成

酸５の作製：
水（３ｍＬ）による化合物２ａ（１．０ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）、Ｎ‐エチルメチルアミン（１．５ｇ、２５．４２ｍｍｏｌ）の溶液へ、４８時間加熱して還流した。溶媒を減圧除去した。ＩＰＥおよびヘキサンで研和して、所望される化合物５（３００ｍｇ、２７％）を得た。１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３）δ １１．９０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），３．５９（ｑ，Ｊ＝６．９，１４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）

下記のピラゾロピリジン誘導体のイソシアネートとの反応のための一般手順
２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）エタン‐１‐オール：

乾燥ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のヒドラジン誘導体（１００ｍｇ、．３８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で撹拌し、ここへ、トルエン（１０ｍＬ）中の適切なイソシアネート（約１．３当量、．５ｍｍｏｌ）の溶液を滴下し、１２時間、またはＴＬＣのモニタリングによって完了と判断されるまで撹拌した。この粗反応物を濃縮し、１：１ジクロロメタン／酢酸エチルを溶出液として用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、所望される生成物を得た。

化合物３４の合成
Ｎ‐（２，６‐ジクロロピリジン‐４‐イル）‐２‐（２‐ヒドロキシプロピル）‐２‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジン‐１‐カルボキシアミド（化合物３４）：

２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）プロパン‐１‐オール

２‐ヒドラジノプロパノール（３．３５ｇ、３７．２ｍｍｏｌ）を、エタノール（２．５ｍＬ）中の１Ｈ‐６‐ブロモ‐４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチルピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン（５００ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ）の溶液へ添加し、還流下で一晩加熱した。冷却後、これを氷浴中で４時間撹拌した。この粗物質をろ過し、得られた固体を、５０％エタノール水溶液（５ｍＬ）で研和し、ろ過し、６０℃で減圧乾燥して、２‐（１‐（４‐イソプロピル‐１，３‐ジメチル‐１Ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン‐６‐イル）ヒドラジニル）プロパン‐１‐オール、Ｂ‐２を白色固体として得た（３００ｍｇ、収率５８％）。
１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ６．８９（１Ｈ，ｓ），４．９５（２Ｈ，ｂｓ），４．２８（１Ｈ，ｂｓ），３．９９（２Ｈ，ｍ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．５８（２Ｈ，ｔ），３．４８（１Ｈ，ｍ），２．５７（３Ｈ，ｓ），１．９３（２Ｈ，ｍ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．３１（３Ｈ，ｓ）

化合物３４

方法Ａ（８０ｍｇ、４５％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＭｅＯＤ‐４）δ ７．４７（２Ｈ，ｓ），６．５２（１Ｈ，ｓ），４．０６（２Ｈ，ｂｍ）３．９６−３．８０（２Ｈ，ｂｍ），３．８４（３Ｈ，ｓ），３．４４（２Ｈ，ｍ），３．３９（１Ｈ，ｂｓ），２．５１（３Ｈ，ｓ），１．２４（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４６６．１

化合物３５

方法Ａ（７５ｍｇ、４３％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．９１（１Ｈ，ｓ），７．０６（１Ｈ，ｓ），６．８５（１Ｈ，ｓ），６．６５（１Ｈ，ｓ），６．６０（１Ｈ，ｓ）４．４５（１Ｈ，ｂｓ），４．３０（２Ｈ，ｑｔ），４．１６（２Ｈ，ｍ），３．９０（３Ｈ，ｓ）３．５１（２Ｈ，ｍ），２．８０（１Ｈ，ｂｓ）２．６０（３Ｈ，ｓ），１．３１（６Ｈ，ｍ）１．２９（３Ｈ，ｍ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４６２．１

化合物３６

方法Ａ（８０ｍｇ、４５％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．９９（１Ｈ，ｓ），７．０５（１Ｈ，ｓ），６．８７（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｓ），６．６０（１Ｈ，ｓ）４．４５（１Ｈ，ｂｓ），４．１６０（２Ｈ，ｔ），４．１０（２Ｈ，ｍ），３．８７（３Ｈ，ｓ）３．４８（２Ｈ，ｍ），３．２０（１Ｈ，ｂｓ）２．５９（３Ｈ，ｓ），１．７５（２Ｈ，ｍ）１．３０（６Ｈ，ｄ）．９７（３Ｈ，ｔ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４７６．１

化合物３７

方法Ａ（８０ｍｇ、４４％、３工程）１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．９１（１Ｈ，ｓ），７．１１（１Ｈ，ｓ），６．８９（１Ｈ，ｓ），６．６２（１Ｈ，ｓ），６．５８（１Ｈ，ｓ）４．５５（１Ｈ，ｂｓ），４．５１（２Ｈ，ｍ），４．０９（２Ｈ，ｍ），３．９１（３Ｈ，ｓ），３．６７（２Ｈ，ｍ）３．４９（２Ｈ，ｍ），３．３９（３Ｈ，ｓ），２．７１（１Ｈ，ｂｓ）２．５９（３Ｈ，ｓ），１．３０（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４９２．１

化合物３８‐Ｂｏｃ

方法Ａ（１２０ｍｇ、５６％、３工程）１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ８．９６（１Ｈ，ｓ），７．５８（２Ｈ，ｄ），６．８１（１Ｈ，ｂｓ），６．６２（１Ｈ，ｓ），４．４９（１Ｈ，ｂｓ），４．１７−４．０６（２Ｈ，ｂｍ）３．９６（２Ｈ，ｍ），３．９１（３Ｈ，ｓ），３．４８（２Ｈ，ｍ），３．０３（１Ｈ，ｂｓ），２．６２（３Ｈ，ｓ），１．４８（９Ｈ，ｓ），１．３０（６Ｈ，ｄ），１．１７（３Ｈ，ｔ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝５６１．２

化合物３８‐ＨＣｌ塩

上記Ｂｏｃ誘導体を、ジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、氷浴中で０〜５℃に冷却し、エーテル（１ｍＬ）中の２ＭＨＣｌ溶液を添加し、一晩撹拌した。得られた固体をろ過し、真空オーブン中で乾燥して、６０ｍｇの塩酸塩を得た。１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＭｅＯＤ‐４）δ ７．３１（１Ｈ，ｓ），６．９９（１Ｈ，ｓ），６．７１（１Ｈ，ｂｓ），４．４９（１Ｈ，ｂｓ），４．０９−３．９９（２Ｈ，ｂｍ）３．９６（２Ｈ，ｍ），３．９３（３Ｈ，ｓ），３．６７（１Ｈ，ｍ），３．５３（２Ｈ，ｍ），３．３８（２Ｈ，ｍ），２．６４（３Ｈ，ｓ），１．３２（６Ｈ，ｄ）１．１２（３Ｈ，ｔ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４６１．１

化合物３９

方法Ａ（１１０ｍｇ、６１％、３工程）１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ ９．４７（１Ｈ，ｓ），８．９６（１Ｈ，ｂｓ），６．８８（１Ｈ，ｂｓ），６．６１（１Ｈ，ｓ），６．４９（１Ｈ，ｓ），５．３８，４．７３（１Ｈ，ｂｓ），４．１７−３．８６（２Ｈ，ｂｍ）３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８０−３．７１（２Ｈ，ｂｍ），３．４５（２Ｈ，ｍ），２．８９（３Ｈ，ｓ），２．５０（３Ｈ，ｓ），１．２３，（６Ｈ，ｄ），１．０３（３Ｈ，ｔ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４７５．１

化合物４０

方法Ｂ（５５ｍｇ、３２％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ９．０８（１Ｈ，ｓ），８．３５（１Ｈ，ｓ），８．２３（１Ｈ，ｓ），６．７０（１Ｈ，ｓ），６．６１（１Ｈ，ｓ），４．４９（１Ｈ，ｂｓ），４．１７−４．０６（２Ｈ，ｂｍ），３．９１（３Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），３．１１（１Ｈ，ｂｓ），２．６０（３Ｈ，ｓ），１．３０（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４５２．１

化合物４１

方法Ａ（９５ｍｇ、５５％、３工程）１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ９．０８（１Ｈ，ｓ），８．３６（１Ｈ，ｄ），８．２２（１Ｈ，ｄ），６．７１（１Ｈ，ｂｓ），６．６２（１Ｈ，ｓ），４．２９（１Ｈ，ｂｓ），４．２−４．１７（２Ｈ，ｂｍ）３．９６（２Ｈ，ｍ），３．４５１（２Ｈ，ｍ），３．１２（１Ｈ，ｂｓ），２．６０（３Ｈ，ｓ），１．３２（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４５２．１

化合物４２

方法Ａ（４５ｍｇ、２６％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ９．５４（１Ｈ，ｓ），６．８１（１Ｈ，ｂｓ），６．６０（１Ｈ，ｓ），６．２５（１Ｈ，ｓ），４．４５（１Ｈ，ｂｓ），４．１１−４．０８（２Ｈ，ｂｍ）３．８４（３Ｈ，ｓ），３．４９（２Ｈ，ｍ），２．８９（１Ｈ，ｂｓ），２．６０（３Ｈ，ｓ），１．３０（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４５７．０

化合物４３）

方法Ｂ（９０ｍｇ、５４％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＭｅＯＤ‐４）δ ６．４９（１Ｈ，ｂｓ），６．２１（１Ｈ，ｓ），４．１９−４．０６（２Ｈ，ｂｍ）３．８３（３Ｈ，ｓ），３．４８−３．３８（２Ｈ，ｂｍ）３．３５（１Ｈ，ｍ），２．４７（３Ｈ，ｓ），２．１６（３Ｈ，ｓ），１．１９（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４３７．１

化合物４４

方法Ａ（１１０ｍｇ、６０％、３工程）１Ｈ３００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＭｅＯＤ‐４）δ ９．１８（１Ｈ，ｓ），７．７６（１Ｈ，ｓ），７．６１（１Ｈ，ｓ），７．１９（１Ｈ，ｓ），６．５９（１Ｈ，ｓ），４．４３（１Ｈ，ｂｓ），４．０７−３．９２（２Ｈ，ｂｍ），３．８５（３Ｈ，ｓ），３．６０−３．４８（２Ｈ，ｍ），２．５４（３Ｈ，ｓ），１．２７（６Ｈ，ｄ）
ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４８５．１

化合物４５

方法Ｂ（９０ｍｇ、５８％、３工程）１Ｈ４００ＭＨｚＮＭＲ（ＣＤＣｌ３＋ＭｅＯＤ‐４）δ ６．５０（１Ｈ，ｂｓ），６．２２（１Ｈ，ｓ），４．３４（１Ｈ，ｂｓ），４．１７−４．０６（２Ｈ，ｂｍ），３．８２（３Ｈ，ｓ），３．４３（２Ｈ，ｍ），２．５２（３Ｈ，ｓ），１．２６（６Ｈ，ｄ）．ＥＳＩ＋（Ｍ＋Ｈ）ｍ／ｚ＝４０８．１

生体外結合親和性
本発明に従う上記で示したいくつかの化合物を試験し、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ５受容体に対する結合親和性を特定した（下記参照）。アンタゴニストの阻害パーセントの特定は、サンプル化合物を分析し、各プロファイリングされた（ＧＰＣＲ）について、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ５受容体との結合を評価するコントロール（ＥＣ８０）ウェルを参照とすることで得た。サンプルは、単一添加アッセイプロトコルを用いて分析した。プロトコルの設計は以下の通りである。

Ｉ．マスターストック溶液
特に断りのない限り、サンプル化合物は、すべての希釈物を含めて、１００％無水ＤＭＳＯで希釈した。化合物は、クエン酸塩（１分子あたり１当量）として試験した。サンプル化合物が異なる溶媒で提供される場合、マスターストック希釈はすべて、指定された溶媒で実施する。コントロールウェルはすべて、サンプル化合物ウェルと同じ溶媒最終濃度を有していた。

ＩＩ．化合物プレートアッセイ
サンプル化合物を、マスターストック溶液から、アッセイで用いるドータープレートに移した。各サンプル化合物を、アッセイバッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭプロベネシド、および０．４％脂肪酸フリーＢＳＡを含む１×ＨＢＳＳ）により適切な濃度に希釈して、最終の指定された濃度を得た。

ＩＩＩ．アンタゴニストアッセイフォーマット
刺激し、プレインキュベートしたサンプル化合物およびレファレンスアンタゴニスト（該当する場合）のすべてについて、リアルタイムで特定したＥＣ８０値を用いて、レファレンスアゴニストのＥＣ８０値と比較した。これらは、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡを用いて１８０秒間の読み取りを行った（このアッセイでは、対応するウェルにレファレンスアゴニストを添加し、次に蛍光測定値を取得して、ＩＣ５０値を算出した）。プレートはすべて、適切なベースライン補正に掛けた。ベースライン補正の処理後、最大蛍光値をエキスポートし、データ処理を行って、活性化パーセント、阻害パーセント、およびＺ’を算出した。結果を以下の表に示すが、これらの化合物が、予想外なことに、Ｓ１Ｐ２およびＳ１Ｐ５受容体の両方と結合することが示されている。

ＪＴＥ０１３および化合物‐１の血中濃度データ
ＪＴＥ０１３および化合物‐１の薬物動態を特定するために、３体の正常マウスの各々に、１ｍｇ／ｋｇの化合物をＩＶ注射し、表１の時間に血液を採取した。出発化合物の量の定量は、ＭＳ／ＭＳによる特定を用いた標準曲線によって行った。

（図１）

（図２）

（図３）

（図４）

（図５）

上記で示されるマウスへの１ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．投与後にＪＴＥ０１３および化合物‐１について測定した上記で報告した血中濃度から、化合物１を投与したマウスが経時での最も高い薬物血中レベルを有していたことから、化合物１が、ＳＰ１およびＳＰ２受容体に対するより大きい結合親和性を、従って、細胞増殖、遊走、および癌細胞の成長および増殖に必要な新しい毛細血管ネットワークを形成するための形態形成の阻害ならびに防止を介しての腫瘍性疾患の治療においてより大きい有効性を示すことが明らかに実証される。より長い期間にわたり、より高い血中レベルで維持されるその能力のために、その化合物は、受容体に対して親和性を有し、それと結合する可能性が高くなる。

生体外ＡＤＭＥ‐Ｔｏｘの概要
ＪＴＥ０１３および化合物１および化合物２のタンパク質結合および代謝に関するさらなる情報を得る目的で、生体外血漿タンパク質結合およびミクロソーム固有クリアランスの研究を完了した。結果を以下に示す。

ベラパミルは、代謝コントロールであり、ワルファリンは、非代謝コントロールである。

血漿タンパク質結合およびミクロソーム固有クリアランスを用いた初期生体外ＡＤＭＥ毒性研究から、公知のコントロールＪＴＥ０１３および化合物１が、両アッセイにおいて非常に類似の挙動を示し、一方化合物２については、肝ミクロソーム中での安定性が非常により高く、血漿タンパク質結合がより低いものであったことが明らかである。これらの分子の特性をさらに明らかにするために、マウスへの静脈注射後の化合物のクリアランスを調べた。化合物１は、ＪＴＥ０１３よりも大きく改善された薬物動態を示し、これは化合物２よりも良好であった（曲線下面積を参照）。受容体結合に対するより大きい効力およびより高い２時間後の血漿中薬物レベルにより、化合物１のより大きい生体内有効性が期待される。これら３つの化合物の生体内代謝および薬物動態の相違は、注目すべきものである。化合物１の強いタンパク質結合は、肝臓での代謝を相殺するはずである。化合物２の遊離カルボキシル基は、グルコロニレーション（glucoronylation）、および生体外代謝研究から示唆され得るよりも迅速な排出に繋がり得るものであり、またはタンパク質結合の低下は、有害である。

上記に挙げたＳ１Ｐ受容体アゴニストを含む医薬組成物は、血管透過性および血管内皮細胞アポトーシスに関連する障害の治療に用いられる追加の薬理剤を含んでよい。適切な追加の薬理剤としては、例えば、細胞傷害剤、化学療法剤、ホルモン、ステロイド系抗炎症薬（例：プレドニゾン、コルチコステロイドなど）、非ステロイド系抗炎症薬（例：ＮＳＡＩＤ、アスピリン、アセトアミノフェンなど）、および上述の追加の薬理剤のうちの１つ以上を含む組み合わせが挙げられる。

医薬組成物は、生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤の１つ以上を用いて製剤されてよい。従って、化合物、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入もしくは吹送（口もしくは鼻のいずれかを介して）、または経口、頬側、非経口、もしくは直腸内投与による投与用に製剤されてよい。

経口投与の場合、医薬組成物は、結合剤（例：アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例：ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例：ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例：ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；湿潤剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）；および上述の賦形剤のうちの１つ以上を含む組み合わせなどの薬理学的に許容される賦形剤と共に本技術分野で公知の手段によって作製される錠剤またはカプセルの形態を例えば取ってよい。錠剤は、本技術分野にて公知の方法でコーティングされてよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形態を取ってよく、または使用前に水もしくはその他の適切な媒体で構成するための乾燥品として提供されてもよい。そのような液体製剤は、懸濁剤（例：ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用油脂）；乳化剤（例：レシチンまたはアラビアガム）；非水性媒体（例：アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；保存剤（例：ｐ‐ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）；および上述の添加剤のうちの１つ以上を含む組み合わせなどの薬理学的に許容される添加剤と共に、従来の手段によって作製されてよい。製剤はまた、緩衝剤塩、香味剤、着色剤、または甘味剤も必要に応じて含有してよい。

経口投与用製剤は、活性化合物の制御放出が得られるように適切に製剤されてよい。頬側投与の場合、組成物は、本技術分野にて公知の技術によって製剤される錠剤またはロゼンジの形態を取ってよい。吸入による投与の場合、化合物は、ジ‐クロロ‐ジフルオロメタン、トリ‐クロロ‐フルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、またはその他の適切なガスを例とする適切な噴霧剤を用いて、加圧パックまたはネビュライザーからエアロゾルスプレーを提示する形態で送達されることが都合が良い。加圧エアロゾルの場合、単位用量の決定は、計量された量を送達するためのバルブを備えることで行われてよい。インヘラーまたはインサフレーターに用いるためのゼラチンを例とするカプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースの粉末ミックスを含有するように製剤されてよい。

化合物はまた、ボーラス注射または連続注入を例とする注射による非経口投与用に製剤されてもよい。注射用製剤は、例えばアンプルまたはマルチドーズ容器中の単位剤形として、保存剤が添加された状態で提供されてよい。組成物は、油性もしくは水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンなどの形態を取ってよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤化剤（formulatory agents）を含有してよい。別の選択肢として、活性成分は、滅菌パイロジェンフリー水を例とする適切な媒体で使用前に構成するための粉末形態であってもよい。

化合物はまた、カカオバターまたはその他のグリセリドなどの従来の座薬ベースを含有する例えば座薬または停留浣腸などの直腸用組成物として製剤されてもよい。これまでに記載した製剤に加えて、化合物はまた、デポー製剤として製剤されてもよい。そのような長期作用製剤は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与されてよい。従って、例えば、化合物は、適切なポリマーもしくは疎水性物質（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂と共に製剤されてよく、または、難溶性塩を例とする難溶性誘導体として製剤されてもよい。

本明細書では、従って、本発明のＳ１Ｐ２受容体選択性アンタゴニスト化合物が、上述の数多くのキャリア組成物のいずれか１つとしてのその薬理学的に許容される量の投与によって血管新生眼障害、腫瘍性眼疾患、および失明を治療するための、ならびに肺、腎臓、肝臓、および皮膚疾患の線維性障害を治療するための薬理学的に許容される量で、上述の組成物として製剤することができることが考慮される。

ＪＴＥ０１３は、癌、アテローム性動脈硬化症、およびその他の炎症性疾患における抗血管新生剤として有用である可能性を有する公知のスフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ_２）クラスのアンタゴニストである。本発明は、スフィンゴシン１‐リン酸２受容体（Ｓ１Ｐ_２）のシグナル伝達を遮断または阻害することによって有用なＳ１Ｐ_２アンタゴニストとして機能する、スフィンゴシン１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ_２）受容体誘導体の群の開発を含む。

化合物Ａ‐９の作製
化合物Ａ‐８（２５０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＥｔＯＨ（１ｍＬ）中の水溶性ＮＨ_２ＮＨ_２からなるアルコール溶液を、ＣＥＭＭｉｃｒｏｗａｖｅ中、１２０℃で１２時間撹拌した。この溶液を冷却し、酢酸エチルで抽出した。有機層を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濃縮して、粗化合物Ａ‐９を得た（２００ｍｇ）。

中間体４ａの作製：
化合物２ａ（２．５ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）の水溶液とエチルアミン（５．４５ｍＬ、２Ｍ）およびＴＨＦ（２０ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（２ｍＬ）を混合し、密封管中、７５℃で１６時間加熱した。溶媒を減圧除去し、水（１５ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（３×１５ｍＬ）。１つにまとめた抽出物を、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮して、粗化合物を得た。さらに、シリカゲルカラムを用いたカラムクロマトグラフィーで精製して、所望される化合物４ａを得た（４５０ｍｇ、１７％）。^１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．０８（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３１（ｑ，Ｊ＝７．２，１４．１Ｈｚ，２Ｈ），１．３９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．２４（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）

酸５の作製：
化合物２ａ（１．０ｇ、５．２０ｍｍｏｌ）およびＮ‐エチルメチルアミン（１．５ｇ、２５．４２ｍｍｏｌ）を水（３ｍＬ）中に混合し、４８時間加熱して還流した。溶媒を減圧除去した。ＩＰＥおよびヘキサンで研和して、所望される化合物５（３００ｍｇ、２７％）を得た。^１ＨＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １１．９０（ｂｒｓ，１Ｈ），７．０４（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），３．５９（ｑ，Ｊ＝６．９，１４．４Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），１．１７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）

^ａミクロソーム固有クリアランス
^ｂ半減期

Claims

以下の式のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物であって、

式中、Ｒ１は、−アリル、−ＣＨ３、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、または−ＣＨ２ＣＯ２Ｅｔであり、Ｒ３は、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジン、４‐置換‐２‐クロロ‐６‐ヒドロキシエチルピリジン、４‐置換‐２‐クロロ‐６‐ヒドロキシプロピルピリジン、４‐置換‐２‐（アミノエチル）‐６‐クロロピリジン、４‐置換‐２‐（アミノエチルメチル）‐６‐クロロピリジン、５‐置換‐２，３‐ジクロロチオフェンであるが、但し、Ｒ２が−Ｈである場合、Ｒ１は、−ＣＨ３ではないスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２（Ｓ１Ｐ２）アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−アリルであり、Ｒ２が、−Ｈであり、Ｒ３が、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＯ２Ｈであり、Ｒ３が、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２‐クロロ‐６‐ヒドロキシエチルピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２‐クロロ‐６‐ヒドロキシプロピルピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２‐（アミノエチル）‐６‐クロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、４‐置換‐２‐（アミノエチルメチル）‐６‐クロロピリジンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
Ｒ１が、−ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり、Ｒ３が、５‐置換‐２，３‐ジクロロチオフェンである請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
以下の式の：

スフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
以下の式の：

式中、Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨおよび−アリルから成る群より選択され、Ｒ２は、−Ｈであり、Ｒ３は、４‐置換‐２，６‐ジクロロピリジンであるスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニスト、ならびにその生理学的に許容される塩および溶媒和物。
１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、請求項２に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、請求項４に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
細胞傷害剤、化学療法剤、ホルモン、ステロイド系抗炎症薬、プレドニゾン、コルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アスピリン、アセトアミノフェン、およびこれらの混合物から成る群より選択される追加の薬理剤と組み合わせて請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
細胞傷害剤、化学療法剤、ホルモン、プレドニゾン、コルチコステロイドなどのステロイド系抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アスピリン、アセトアミノフェン、およびこれらの混合物から成る群より選択される追加の薬理剤と組み合わせて請求項２に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
細胞傷害剤、化学療法剤、ホルモン、プレドニゾン、コルチコステロイドなどのステロイド系抗炎症薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アスピリン、アセトアミノフェン、およびこれらの混合物から成る群より選択される追加の薬理剤と組み合わせて請求項４に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
吸入、吹送、経口、頬側、非経口、または直腸内投与用に製剤された、１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
吸入、吹送、経口、頬側、非経口、または直腸内投与用に製剤された、１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて請求項２に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
吸入、吹送、経口、頬側、非経口、または直腸内投与用に製剤された、１つ以上の生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて請求項４に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤；充填剤（例：ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例：ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、湿潤剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）；およびこれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて請求項１に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤；充填剤（例：ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例：ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、湿潤剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）；およびこれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて請求項２に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの結合剤；充填剤（例：ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例：ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、湿潤剤（例：ラウリル硫酸ナトリウム）；およびこれらの組み合わせから成る群より選択される１つ以上の生理学的に許容される賦形剤と組み合わせて請求項４に記載のスフィンゴシン‐１‐リン酸受容体２アンタゴニストを含む医薬組成物。
請求項１に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、線維性の肺、腎臓、肝臓、および皮膚疾患の治療のための方法。
請求項２に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、線維性の肺、腎臓、肝臓、および皮膚疾患の治療のための方法。
請求項４に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、線維性の肺、腎臓、肝臓、および皮膚疾患の治療のための方法。
請求項１に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、腫瘍性眼疾患の治療のための方法。
請求項２に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、腫瘍性眼疾患の治療のための方法。
請求項４に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、腫瘍性眼疾患の治療のための方法。
請求項１に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の血管新生異常を阻害するための方法。
請求項２に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の血管新生異常を阻害するための方法。
請求項４に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の血管新生異常を阻害するための方法。
請求項１に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の失明を予防するための方法。
請求項２に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の失明を予防するための方法。
請求項４に記載の化合物の薬理学的に許容される量を投与することによる、眼の失明を予防するための方法。