具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
如无特别说明,本发明的化合物均是通过核磁共振(NMR)和/或质谱(MS)来确定其结构的。NMR位移的单位为10-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等,内标为四甲基硅烷(TMS)。
本发明的缩写定义如下:
aq:水溶液
dioxane:1,4-二氧六环
DMF:N,N-二甲基甲酰胺
T3P:丙基磷酸三环酸酐,即2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三膦-2,4,6-三氧化物
N:当量浓度,例如1N盐酸表示1mol/L盐酸溶液
NMM:N-甲基吗啡啉
DIPEA:二异丙基乙胺,即N,N-二异丙基乙胺
HPLC:高效液相色谱
SFC:超临界流体色谱
DMSO:二甲基亚砜
NADPH:还原型辅酶II
HEPES:(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)
EGTA:乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸
IC50:半数抑制浓度,指达到最大抑制效果一半时的浓度。
除非作出相反的指示,本文例举的化合物使用ChemBioDraw Ultra 13.0命名和编号。
实施例1:目标化合物I-1的制备
2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(目标化合物I-1)
2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(目标化合物I-1)
目标化合物I-1的合成路线如下所示:
第一步:2-(丁-3-炔-1-基氧基)丙酸叔丁酯(1C)的合成
tert-butyl 2-(but-3-yn-1-yloxy)propanoate(1C)
在0℃下,将3-丁炔-1-醇(15g,214mmol)加入二氯甲烷(300mL)中,然后依次加入四丁基硫酸氢铵(7.27g,21.40mmol),氢氧化钠(300mL,3.57mmol,40%aq),2-溴丙酸叔丁酯(49.2g,235mmol),然后缓慢升到室温,在室温搅拌2小时,将反应混合物用水(300mL)稀释,然后用二氯甲烷(200mL×3)萃取,合并有机层,得到粗品。用硅胶柱分离纯化(石油醚)得无色油状化合物2-(丁-3-炔-1-基氧基)丙酸叔丁酯(1C)(35g,产率82%)。
第二步:2-(2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1D)的合成
tert-butyl 2-(2-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)ethoxy)propanoate(1D)
在氮气保护下,将2-(丁-3-炔-1-基氧基)丙酸叔丁酯(50g,252mmol)和碘化亚铜(I)(2.4g,12.6mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺(300mL)/甲醇(30mL)中的混合溶液中,在0℃下加入叠氮基三甲基硅烷(43.6g,378mmol),然后将混合物在90℃下搅拌18小时。冷却至室温,减压浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=10:1-5:1)得标题化合物2-(2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基)丙酸叔丁酯(1D)(40g,166mmol,65.7%产率)。
LC-MS,M/Z(ESI):242.2(M+1)
第三步:2-(2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基)丙酸(1E)的合成
2-(2-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)ethoxy)propanoic acid(1E)
在0℃下,向2-(2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基)丙酸叔丁酯(50g,207mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液中加入三氟乙酸(150mL),然后在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物,得到粗品2-(2-(1H-1,2,3-三唑-5-基)乙氧基)丙酸的三氟乙酸盐(62g,207mmol,100%产率)。直接用于下一步反应。
第四步:2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(化合物I-1)的合成
2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(化合物I-1)
室温下,将N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺盐酸盐(参考专利申请WO2014110000A1合成)(7g,21.5mmol)加至DMF(40mL)中,依次加入2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)丙酸,三氟乙酸盐(9.66g,32.3mmol)和DIEA(27.8g,215mmol),在0℃加入2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三膦-2,4,6-三氧化物(10.3g,32.3mmol,50%DMF溶液),然后缓慢升到室温,在室温搅拌12小时。TLC检测反应完全,反应液倒入搅拌的蒸馏水(150mL)中,析出来的固体用乙腈(50mL)打浆,过滤,得固体状化合物2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(8.1g,产率90%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(m,1H),7.45(s,1H),7.19-7.09(m,4H),5.53(s,1H),4.73-4.51(m,5H),4.18-4.15(m,1H),3.73-3.68(m,2H),3.53-3.29(m,2H),3.03-2.77(m,4H),1.19-1.15(m,3H)。
LC-MS,M/Z(ESI):420.3(M+1)。
实施例2:目标化合物I-1R的制备
(R)-2-(2-(1H-1,2,3-三氮唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(目标化合物I-1R)
(R)-2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydr o-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(目标化合物I-1R)
目标化合物I-1R的合成路线如下所示:
第一步:(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)丙酸(2C)的合成
(R)-2-(but-3-yn-1-yloxy)propanoic acid(2C)
将3-丁炔-1醇(350mg,5mmol)加入到DMF(5mL)中,冷却至0℃,加入NaH(400mg,10mmol,60%),并搅拌30分钟,0℃下加入原料(S)-2-溴丙酸(700mg,4.5mmol),同样温度下搅拌5h。0℃下将水(10mL)加入到反应液中,用盐酸(1N)调节pH=1~2,用乙酸乙酯(20mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=1:1)得标题化合物淡黄色液体(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)丙酸(002C)(390mg,产率60%)。
第二步:(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(2E)的合成
(R)-2-(but-3-yn-1-yloxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(2E)
室温下将原料(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)丙酸(56mg,4mmol)加入到DMF(2mL)中,分别加入原料N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺(100mg,4mmol)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(180mg,4.4mmol)和三乙胺(82mg,8mmol),将反应液加热至50℃,搅拌15h。将反应液冷却至室温,加入水(6mL),用乙酸乙酯(5mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)=10:1)得标题化合物黄色固体(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(80mg,53.9%)。
第三步:(R)-2-(2-(1H-1,2,3-三氮唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(化合物I-1R)的合成
(R)-2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydr o-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(化合物I-1R)
室温下将原料(R)-2-(丁基-3-炔-1-氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(80mg,0.21mmol)加入到DMF(2mL)和甲醇(0.5mL)中,氮气保护下分别加入叠氮基三甲基硅烷(37mg,0.32mmol)、碘化亚铜(5mg,0.025mmol),将反应液加热至80℃,搅拌15h。将反应液冷却至室温,加入水(8mL),用乙酸乙酯(5mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)=10:1)得标题化合物黄色固体(R)-2-(2-(1H-1,2,3-三氮唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙烷-1-酮(8mg,8.9%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31(d,1H),7.61(s,1H),7.57(s,1H),7.22(m,2H),7.16(m,2H),4.69-4.61(m,4H),4.55-4.53(m,1H),4.30-4.28(m,1H),3.68-3.64(m,2H),3.33-3.17(m,2H),2.91-2.85(m,4H),1.28-1.19(m,3H).
LC-MS,M/Z(ESI):420.2(M+1)
实施例3:目标化合物I-1R和目标化合物I-1S的制备
(R)-2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(目标化合物I-1R)
(R)-2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydr o-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(目标化合物I-1R)
(S)-2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(目标化合物I-1S)
(S)-2-(2-(1H-1,2,3-triazol-4-yl)ethoxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydr o-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)propan-1-one(目标化合物I-1S)
目标化合物通过SFC分离得到:
将消旋体2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(10.1g,24.1mmol)通过SFC分离,分离方法为:柱型:Chiralpak IC-350*4.6mm,3um,流动相:流动相A为CO2,流动相B为40%乙醇(含0.05%二乙胺);梯度洗脱:在CO2中的40%乙醇(含0.05%二乙胺);流速:3mL/min;波长:220nm;柱温:35℃;背压:100Bar。得到单一的异构体(R)-2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(目标化合物I-1R)(3.51g,100%ee,收率34.7%)和(S)-2-(2-(1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)丙-1-酮(目标化合物I-1S)(3.8g,97%ee,收率37.6%)。
通过手性HPLC对比,确定SFC拆分得到两个化合物的绝对构型。
目标化合物I-1R:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.7(bs,1H),8.32(bs,0.6H),8.27(bs,0.4H),7.67(bs,1H),7.55(t,J=12.0Hz,1H),7.21-7.13(m,4H),4.72-4.59(m,3H),4.55-4.49(m,1H),4.45-4.44(m,1H),4.33-4.27(m,1H),3.70-3.64(m,2H),3.28-3.18(m,2H),2.93-2.85(m,4H),1.27(dd,J=8.0,4.0Hz,3H)。
LC-MS,M/Z(ESI):420.3(M+1)。
保留时间:2.82min
目标化合物I-1S:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.5(bs,1H),8.32(bs,0.6H),8.27(bs,0.4H),7.63(bs,1H),7.55(t,J=12.0Hz,1H),7.22-7.13(m,4H),4.72-4.59(m,3H),4.54-4.49(m,1H),4.45-4.44(m,1H),4.33-4.27(m,1H),3.68-3.64(m,2H),3.32-3.22(m,2H),2.92-2.87(m,4H),1.27(dd,J=8.0,4.0Hz,3H)。
LC-MS,M/Z(ESI):420.3(M+1)。
保留时间:4.48min
实施例4:目标化合物I-2的制备
2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(目标化合物I-2)
2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2)
目标化合物I-2的合成路线如下所示:
第一步:2-(戊基-4-炔-2-氧基)乙酸叔丁酯(3A)的合成
tert-butyl 2-(pent-4-yn-2-yloxy)acetate(3A)
将原料4-戊炔-2-醇(84.0g,1.0mol)加入到1000mL干燥的四氢呋喃中,冷却至0℃,加入60%NaH(80.0g,2.0mol),并搅拌30分钟,0℃下加入原料2-溴乙酸叔丁酯(234.0g,1.2mol),自然升至室温,搅拌16h,0℃下将水(2000mL)加入到反应液中,用1N盐酸调节pH=1~2,用乙酸乙酯(2000mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得标题化合物淡黄色液体2-(戊基-4-炔-2-氧基)乙酸叔丁酯(3A)(180g,产率65%)。
第二步:(2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(3B)的合成
tert-butyl 2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetate(3B)
室温下将原料2-(戊基-4-炔-2-氧基)乙酸叔丁酯(40.0g,0.2mol)加入到400mLDMF和50mL甲醇中,氮气保护下分别加入叠氮基三甲基硅烷(34.6g,0.3mol)、碘化亚铜(8g,0.4mol),将反应液加热至90℃,搅拌15h。将反应液冷却至室温,加入水(1000mL),用乙酸乙酯(1200mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=1:1)得标题化合物黄色液体(2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(26.0g,53%)。
第三步:2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸(3C)的合成
2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetic acid(3C)
室温下将原料(2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(26.0g,0.11mol)加入到300mL DMF和100mL水中,加入NaOH(8.6g,0.22mol),室温下搅拌40h,加入水(300mL),将反应液用乙酸乙酯(150mL×3)萃取,水相浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)=5:1)得标题化合物黄色液体2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸(20g,85%)。
第四步:2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(目标化合物I-2)的合成
2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2)
室温下将原料2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸(20g,0.11mol)加入到400mL DMF中,0℃下加入N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺(参考专利申请WO2014110000A1合成)(12g,47.6mmol),T3P(45.4g,71.4mmol,50%乙酸乙酯溶液)和NMM(24g,238mmol),自然升至室温,搅拌16h,反应液过滤,滤液加入水(300mL),用乙酸乙酯(1500mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)=10:1)得标题化合物黄色固体2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(19.3g,92%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30(d,1H),7.64(b,1H),7.57(t,1H),7.22-7.20(m,2H),7.16-7.12(m,2H),4.65-4.59(m,3H),4.52(s,1H),4.42(s,1H),4.25-4.17(m,2H),3.87-3.81(m,1H),3.27-3.21(m,2H),2.90-2.85(m,4H),1.19(t,3H)
LC-MS,M/Z(ESI):420.2(M+1)
实施例5:目标化合物I-2S的制备
(S)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(目标化合物I-2S)
(S)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2S)
目标化合物I-2S的合成路线如下所示:
第一步:(S)-5-(三甲基硅基)戊基-4-炔基-2-醇(4A)的合成
(S)-5-(trimethylsilyl)pent-4-yn-2-ol(4A)
将三甲硅基乙炔锂四氢呋喃溶液(0.5M,52mL),加入三口瓶中,氮气保护下,冷却至-70℃,加入三氟化硼四氢呋喃(50%,2.4mL)溶液,然后慢慢滴加(S)-环氧丙烷(1.5g),滴加完毕后,保持温度搅拌1小时,加入饱和氯化铵水溶液(10mL)淬灭反应。升至室温后,分液,有机相干燥。浓缩至干得粗产物(2.0g)直接用于下一步反应。
第二步:(S)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(4B)的合成
tert-butyl(S)-2-((5-(trimethylsilyl)pent-4-yn-2-yl)oxy)acetate(4B)
将原料(S)-5-(三甲基硅基)戊基-4-炔基-2-醇(2.0g,12.8mmol)加入到10mL干燥的四氢呋喃中,冷却至0℃,加入60%NaH(0.49g,12.8mmol),并搅拌30分钟,0℃下加入原料2-溴乙酸叔丁酯(3.0g,15.4mmol),自然升至室温,搅拌16h。0℃下将水(20mL)加入到反应液中,用1N盐酸调节pH=1~2,用乙酸乙酯(20mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,过滤,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=3:1)得标题化合物淡黄色液体(S)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(4B)(2.1g,产率60.7%)。
第三步:(S)-(2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(4C)的合成
tert-butyl(S)-2-((1-(4-(trimethylsilyl)-1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetate(4C)
室温下将原料(S)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(1.0g,3.7mmol)加入到10mL DMF和5mL甲醇中,氮气保护下分别加入叠氮基三甲基硅烷(0.64g,5.5mmol)、碘化亚铜(0.14g,0.74mmol),将反应液加热至90℃,搅拌15h。将反应液冷却至室温,加入水(50mL),用乙酸乙酯(20mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=1:1)得标题化合物黄色液体(S)-(2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(0.6g,51.8%)。
第四步:(S)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸(4D)的合成(S)-2-((1-(4-(trimethylsilyl)-1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetic acid(4D)
室温下将原料(S)-(2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸叔丁酯(0.6g,1.9mmol)加入到1,4-二氧六环的氯化氢溶液中(4M,10mL),室温搅拌2小时,浓缩至干得(S)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸粗品直接用于下一步(0.5g,100%)。
第五步:(S)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙烷-1-酮(4E)的合成
(S)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)-2-((1-(4-(trimethylsilyl)-1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)ethan-1-one(4E)
室温下将原料(S)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙酸(0.5g,1.9mmol)加入到4mL DMF中,0℃下加入N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺(0.7g,2.1mmol),T3P(1.5g,2.3mmol,50%DMF溶液)和二异丙基乙胺(0.5g,3.8mmol),自然升至室温,搅拌16h,反应液过滤,滤液加入水(30ml),用乙酸乙酯(15mL×3)萃取,合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩得粗品(S)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙烷-1-酮(0.3g)。
第六步:(S)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-乙烷-1-酮(目标化合物I-2S)的合成
(S)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2S)
将(S)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-2-((1-(4-(三甲硅基)-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)乙烷-1-酮(0.3g)粗品加入四氢呋喃(10mL)中,再加入四丁基氟化铵三水合物(0.4g,1.2mmol),室温搅拌5小时,加入水(20mL),用乙酸乙酯萃取(20mL×3),合并有机相,用无水硫酸钠干燥,浓缩,剩余物用制备色谱分离后冻干得(S)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(68.3mg,两步收率8.4%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30(d,1H),7.64(b,1H),7.57(t,1H),7.22-7.20(m,2H),7.16-7.12(m,2H),4.65-4.59(m,3H),4.52(s,1H),4.42(s,1H),4.25-4.17(m,2H),3.87-3.81(m,1H),3.27-3.21(m,2H),2.90-2.85(m,4H),1.19(t,3H)
LC-MS,M/Z(ESI):420.4(M+1)
实施例6:目标化合物I-2R的制备
(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(目标化合物I-2R)
(R)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2R)
第一步:(R)-5-(三甲基硅基)戊基-4-炔基-2-醇(5A)的合成
(R)-5-(trimethylsilyl)pent-4-yn-2-ol(5A)
将三甲硅基乙炔(51.7g),乙醚(600mL)加入三口瓶中,氮气保护下,冷却至-78℃,慢慢滴加正丁基锂(2.5M,217mL),滴加完毕后,保温-78℃反应1小时,加入三氟化硼四氢呋喃(50%,30mL)溶液,缓慢滴加(R)-环氧丙烷(30g),滴加完毕后,保持温度搅拌1小时,加入饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)淬灭反应。升至室温后,分液,有机相干燥,拌硅胶,硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=10:1)得淡黄色液体化合物(R)-5-(三甲基硅基)戊基-4-炔基-2-醇(5A)得产物(34g,收率42.1%)。
第二步:(R)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(5B)的合成
tert-butyl(R)-2-((5-(trimethylsilyl)pent-4-yn-2-yl)oxy)acetate(5B)
将原料(R)-5-(三甲基硅基)戊基-4-炔基-2-醇(34g,218mmol)加入到340mL干燥的四氢呋喃中,冷却至0℃,加入60%NaH(10.44g,261mmol),并搅拌30分钟,0℃下加入原料2-溴乙酸叔丁酯(46.7g,239mmol),自然升至室温,搅拌16小时。0℃下将甲醇(20mL)加入到反应液中,拌硅胶,浓缩,硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=10:1)得淡黄色液体化合物(R)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(5B)(50g,产率85%)。
第三步:(R)-2-(戊-4-炔-2-基氧基)乙酸叔丁酯(5C)的合成
tert-butyl(R)-2-(pent-4-yn-2-yloxy)acetate(5C)
室温下将原料(R)-2-((5-(三甲硅基)戊基-4-炔-2-基)氧)乙酸叔丁酯(50g,185mmol)加入到500mL四氢呋喃中,再加入四丁基氟化铵(53.2g,203mmol),室温反应15小时。拌硅胶,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=10:1)得标题黄色液体化合物(R)-2-(戊-4-炔-2-基氧基)乙酸叔丁酯(27g,73.7%)。
第四步:(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧基)乙酸叔丁酯(5D)的合成
tert-butyl(R)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetate(5D)
室温下将原料(R)-2-(戊-4-炔-2-基氧基)乙酸叔丁酯(27g,136mmol)加入到150mL DMF和20mL甲醇中,氮气保护下分别加入叠氮基三甲基硅烷(23.53g,204mmol)、碘化亚铜(2.08g,10.89mmol),将反应液加热至90℃,搅拌15小时。将反应液冷却至40℃,浓缩干,二氯甲烷稀释拌硅胶,浓缩,残留物用硅胶柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)=1:1)得黄色油状化合物(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧基)乙酸叔丁酯(14g,42.6%)。
第五步:(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧)乙酸(5E)的合成
(R)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)acetic acid(5E)
室温下将原料(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧基)乙酸叔丁酯(14g,58mmol)加入到1,4-二氧六环的氯化氢溶液中(4mol/L,70mL),室温搅拌16小时,过滤,固体用甲基叔丁基醚洗涤,干燥得白色固体(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧)乙酸(9.2g,86%)。
第六步:(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-乙烷-1-酮(目标化合物I-2R)的合成
(R)-2-((1-(1H-1,2,3-triazol-5-yl)propan-2-yl)oxy)-1-(2-((2,3-dihydro-1H-inden-2-yl)amino)-5,7-dihydro-6H-pyrrolo[3,4-d]pyrimidin-6-yl)ethan-1-one(目标化合物I-2R)
室温下将原料(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三唑-5-基)丙-2-基)氧)乙酸(9.41g,42.5mmol),N-(2,3-二氢-1H-茚-2-基)-6,7-二氢-5H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-2-胺(9.2g,28.3mmol)加入到1000mL DMF中,0℃下加入T3P(50%DMF溶液)(27g,42.5mmol)和二异丙基乙胺(21.95g,170mmol),自然升至室温,搅拌16小时,反应液过滤,滤液加入水(3mL),浓缩干,残留物用硅胶柱分离纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)=10:1)得12g粗品,120mL乙酸异丙酯打浆10小时,过滤,干燥得到(R)-2-((1-(-1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-乙烷-1-酮(7.8g,收率65.7%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.30(d,1H),7.64(b,1H),7.57(t,1H),7.22-7.20(m,2H),7.16-7.12(m,2H),4.65-4.59(m,3H),4.52(s,1H),4.42(s,1H),4.25-4.17(m,2H),3.87-3.81(m,1H),3.27-3.21(m,2H),2.90-2.85(m,4H),1.19(t,3H)
LC-MS,M/Z(ESI):420.4(M+1)
实施例7:目标化合物I-2S和目标化合物I-2R的制备
目标化合物通过HPLC分离得到:
将消旋体2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基))乙烷-1-酮(22g,52.5mmol)通过HPLC分离,分离方法为:柱型:Chiralpak ID(ID00CD-QG003)4.6mm,I.D.×15cm L,流动相:100%甲醇;流速:1.0mL/min;波长:254nm;柱温:35℃;背压:10MPa。得到单一构型化合物,记为峰1(7.0g,100%ee,收率63.6%)和峰2(9.9g,97%ee,收率90.0%)。
通过对比SFC分析方法的保留时间,确定HPLC拆分得到两个化合物的绝对构型。
目标化合物I-2S:
SFC分析方法为:柱型:Chiralpak AY-3 50×4.6mm I.D.,3μm,流动相:乙醇(含0.05%二乙胺);梯度洗脱:在CO2中的60%乙醇(含0.05%二乙胺);流速:3.0mL/min;波长:254nm;柱温:35℃;背压:100Bar;
保留时间:0.964min。
目标化合物I-2R:
SFC分析方法为:柱型:Chiralpak AY-3 50×4.6mm I.D.,3μm,流动相:乙醇(含0.05%二乙胺);梯度洗脱:在CO2中的60%乙醇(含0.05%二乙胺);流速:3.0mL/min;波长:254nm;柱温:35℃;背压:100Bar;
保留时间:2.118min。
通过相同的SFC分析,得到峰1保留时间为1.006min,峰2保留时间为2.205min。通过对比保留时间,确定峰1对应的为化合物I-2S,即(S)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-乙烷-1-酮;峰2对应的为化合物I-2R,即(R)-2-((1-(1H-1,2,3-三氮唑-5-基)丙烷-2-基)氧)-1-(2-((2,3-二氢-1H-茚-2-基)氨基)-5,7-二氢-6H-吡咯并[3,4-d]嘧啶-6-基)-乙烷-1-酮。
实施例8:对照化合物及其制备
对照化合物参考专利申请WO2014110000A1合成。
下文测试例的对照化合物均指实施例8所述化合物。
测试例1:Autotaxin(ATX)酶活性抑制试验
化合物对Autotaxin酶的抑制活性采用Autotaxin Inhibitor Screening AssayKit(Cayman,700580)进行检测。首先将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液,然后使用DMSO梯度稀释8个浓度点,随后以试剂盒提供的Autotaxin Assay buffer(1×)将8个浓度点稀释成19×的化合物工作液(DMSO的含量为1.9%)。取出Autotaxin AssayReagent(10×)使用Autotaxin Assay Buffer(1×)稀释10倍。取出Autotaxin Substrate,加入1.2mL Autotaxin Assay Buffer(1×)溶解,混匀后室温静置。在96孔板中,每个浓度点所在的孔中,每孔加入150μL Autotaxin Assay Buffer(1×),10μL稀释好的19×的化合物工作液,10μL Autotaxin Assay Reagent(1×),20μL溶解的Autotaxin Substrate,混匀,37℃恒温震荡摇床,避光孵育30min;取出96孔板,置于酶标仪上读取OD405;实验结果输入GraphPad Prism软件,经拟合计算得到各化合物的IC50。
表1测试化合物对ATX酶活性抑制活性结果
测试化合物 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
对照化合物 |
2.60 |
化合物I-1 |
4.24 |
化合物I-1R |
2.67 |
化合物I-1S |
28.6 |
化合物1-2 |
1.35 |
化合物I-2S |
1.40 |
化合物I-2R |
1.59 |
实验结果表明,本发明化合物对ATX酶具有很好的抑制活性;能有效抑制ATX酶活性。
测试例2:人肝微粒体稳定性试验
人肝微粒体稳定性试验采用化合物与人肝微粒体体外共孵育进行检测。首先将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液,随后使用乙腈将化合物稀释至0.5mM。使用PBS稀释人肝微粒体(Corning)成微粒体/缓冲液溶液,并使用该溶液稀释0.5mM的化合物成为工作溶液,工作溶液中化合物浓度为1.5μM,人肝微粒体浓度为0.75mg/ml。取深孔板,每孔加入30μL工作溶液,然后加入15μL预热好的6mM NADPH溶液启动反应,37℃孵育。在孵育的0、5、15、30、45分钟时,加入135μL乙腈至相应的孔中终止反应。在最后45分钟时间点用乙腈终止反应后,深孔板涡旋振动10分钟(600rpm/min),然后离心15分钟。离心后取上清,1:1加入纯化水后进行LC-MS/MS检测,获得每个时间点化合物峰面积与内标峰面积比值,将5、15、30、45分钟时化合物的峰面积比值与0分钟时的峰面积比值进行比较,计算每个时间点化合物的剩余百分比,使用Excel计算T1/2。
表2:人肝微粒体稳定性试验结果
与对照化合物相比,本发明化合物表现出更为优良的肝代谢稳定性,在人体内代谢更慢,暴露量更高,本发明化合物肝微粒体稳定性的T1/2均优于对照化合物,甚至可达到对照化合物的2倍,可降低临床给药剂量和给药频次,降低临床给药的毒副作用,提高临床顺应性。
测试例3:全自动电生理膜片钳QPatch检测化合物对hERG的抑制作用
使用全自动电生理膜片钳QPatch检测化合物对hERG的抑制作用。本试验所用的细胞为转染有hERG cDNA与稳定表达hERG通道的CHO细胞系(由丹麦Sophion Bioscience公司提供),细胞代数为P24。细胞培养在含有下列成分的培养基中(皆来源于Invitrogen公司):Ham’s F12培养基,10%(v/v)灭活的胎牛血清,100μg/ml潮霉素B,100μg/ml Geneticin。CHO hERG细胞生长于含上述培养液的培养皿中,并在37℃、含5%CO2的培养箱中进行培养。
配制细胞外液(2mM CaCl2、1mM MgCl2、4mM KCl、145mM NaCl、10mM Glucose、10mMHEPES,pH约7.4,渗透压约305mOsm)和细胞内液(5.374mM CaCl2、1.75mM MgCl2、120mM KCl、10mM HEPES、5mM EGTA、4mM Na-ATP,pH约7.25,渗透压约295mOsm)。
将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液,并使用DMSO稀释化合物至3、1、0.3、0.1mM,然后使用细胞外液稀释化合物至30、10、3、1、0.3和0.1μM,除了30μM的化合物DMSO的最终浓度为0.3%外,其它浓度化合物溶液中DMSO的最终浓度都为0.1%。
将CHO hERG细胞经消化重悬后,加入全自动QPatch系统(Sophion,丹麦)中,按照如下预设的程序进行试验。
在初始阶段达成破膜的全细胞配置状态后,室温环境下(约25℃),记录全细胞电流,细胞记录至少120秒,以达到稳定,选取稳定细胞进行试验。在整个试验过程中,细胞钳制在-80mV的电压下,细胞钳制电压去极化到+20mV以激活hERG钾通道,2.5秒后再钳制到-50mV以消除失活并产生外向尾电流。尾电流峰值用作为hERG电流大小的数值。上述的电压模式每15秒被应用到细胞进行电生理试验。加含0.1%二甲基亚砜(溶剂)的外液到细胞,建立基线,再允许电流稳定3分钟。化合物溶液加入后细胞保持在测试环境中,直至该化合物的效果达到了稳定状态或以4分钟为限。在化合物不同浓度梯度的测试实验中,化合物由低到高浓度加至所钳制的细胞上。完成化合物测试后用外液清洗细胞直到电流恢复到稳定的状态。
试验数据由Sophion提供的Qpatch分析软件,Excel以及Graphpad Prism等进行分析。
表3:化合物对hERG的抑制作用结果
化合物 |
hERG IC<sub>50</sub>(μM) |
hERG IC<sub>50</sub>/ATX IC<sub>50</sub> |
对照化合物 |
6.69 |
6.69/2.60=2.6 |
化合物I-1 |
22.3 |
22.3/4.24=5.26 |
化合物I-1R |
22.0 |
22.0/2.67=8.24 |
化合物I-2S |
8.78 |
8.87/1.40=6.3 |
化合物I-2R |
9.48 |
9.48/1.59=6.0 |
与对照化合物相比,本发明化合物表现出更弱的hERG抑制活性,综合化合物对ATX酶活性抑制的IC50值,本发明化合物对hERG的抑制表现出更优的安全窗口,具有明显的心脏安全优势。
测试例4:热力学溶解度试验
配制pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)、pH5.8的FeSSIF溶液(含牛黄胆酸钠10mM,卵磷脂2mM,氢氧化钠81.65mM,氯化钠125.5mM,油酸钠0.8mM,单油酸甘油酯5mM,马来酸55.02mM)、pH1.6的FaSSGF溶液(1L溶液含牛黄胆酸钠80μM,卵磷脂20μM,胃蛋白酶0.1g,氯化钠34.2mM)。
精确称取化合物,加入配制好的pH7.4的磷酸盐缓冲液、pH5.8的FeSSIF溶液和pH1.6的FaSSGF溶液,配制成浓度为4mg/mL的溶液,以1000rpm的转速振摇1小时,然后室温孵育过夜。孵育后的溶液以12000rpm转速离心10分钟,去除未溶解的颗粒,上清液转移至新的离心管中。将上清液进行适当的稀释后,加入含内标的乙腈溶液,采用相同基质配制的标曲进行定量。
表4:热力学溶解度试验结果
实验结果表明,对照化合物的溶解度比较差,预计胃肠道的吸收会比较差,不利于开发成口服药。与对照化合物相比,本发明化合物在模拟胃液和模拟肠液以及中性条件下的热力学溶解度均显著提高,因而预计在人体内肠道吸收程度会大大提高,口服给药暴露量较高,可降低临床给药剂量,提高临床顺应性。
测试例5:药代动力学试验
大鼠体内药代动力学试验,采用雄性SD大鼠6只,180-240g,禁食过夜。取3只大鼠,口服灌胃给药10mg/kg,在给药前和在给药后15、30分钟以及1、2、4、8、24小时采血。取另外3只大鼠,静脉注射给药1mg/kg,在给药前和在给药后5、15、30分钟以及1、2、4、8、24小时采血。血液样品8000转/分钟4℃离心6分钟,收集血浆,于-20℃保存。取各时间点血浆,加入3-5倍量含内标的乙腈溶液混合,涡旋混合1分钟,13000转/分钟4℃离心10分钟,取上清液加入3倍量水混合,取适量混合液进行LC-MS/MS分析。主要药代动力学参数用WinNonlin 7.0软件非房室模型分析。
小鼠体内药代动力学试验,使用雄性ICR小鼠18只,20-25g,禁食过夜。取9只小鼠,口服灌胃给药10mg/kg,每个采血时间点3只小鼠,共9只小鼠交替采血;取另外9只小鼠,静脉注射给药1mg/kg,每个采血时间点3只小鼠,共9只小鼠交替采血。其余操作同大鼠药代动力学试验。
表5:小鼠体内药代动力学试验结果
表6:大鼠体内药代动力学试验结果
实验结果表明,与对照化合物相比,本发明化合物表现出更为优良的药代动力学性质。特别是大鼠体内,本发明化合物I-2R的清除率(CL)更低,约为对照化合物的1/4,说明化合物在体内比较稳定,其口服的Cmax和AUC0-t可分别达到对照化合物的6.1倍和4.2倍。
测试例6:人血浆中ATX酶活性抑制试验
采集健康志愿者的全血,使用肝素抗凝,采血管于3000rpm离心10分钟,取血浆存储在-80℃,备用。
化合物按照常规浓度要求使用DMSO进行系列稀释,然后取3μL加入96孔板,分别取147μL PBS加入含有3μL化合物的孔中,混匀后从中取出50μL加入新的96孔板。-80℃冰箱取出人血浆于37℃水浴锅中快速振荡解冻,取50μL人血浆加入含50μL稀释化合物的96孔板中(最终体系为1%DMSO)。设置不含有化合物的组别为阳性组。将96孔板振荡混匀,在37℃下孵育3小时;另设置空白组,空白组血浆保存在-80℃,空白组的作用是测定内源性LPA的基线浓度。
孵育结束后,将空白组在冰上解冻,并转移至孵育板中,在孵育板中加入过量的含有内标LPA17:0的乙腈沉淀血浆蛋白,涡旋离心后,取上清稀释,采用LC-MSMS质谱检测LPA18:2和内标LPA17:0的峰面积。
计算LPA18:2与内标LPA17:0的峰面积比,根据如下公式计算LPA18:2的生成抑制率:
抑制率(%)=100-(不同浓度化合物组-空白组)/(阳性组-空白组)*100
根据化合物不同浓度的抑制率,计算化合物对人血浆中ATX酶活性的抑制IC50值。
表7:测试化合物对人血浆中ATX酶活性抑制活性结果
测试化合物 |
IC<sub>50</sub>(nM) |
对照化合物 |
13.0 |
化合物I-1R |
12.0 |
化合物I-2S |
2.1 |
化合物I-2R |
4.7 |
实验结果表明,本发明化合物对人血浆中ATX酶具有很好的抑制活性,能有效抑制ATX酶活性,且明显优于对照化合物。
测试例7:大鼠博来霉素诱导IPF模型
采用雄性BN大鼠,180-240g,以5U/kg的剂量进行博来霉素诱导IPF模型(特发性肺纤维化模型)。造模后动物随机分组,溶媒对照组、GLPG-1690组(Galapagos公司临床III期化合物)、对照化合物组、化合物I-2S和化合物I-2R,造模后第二天开始每天两次口服灌胃给药,给药组一次给药剂量30mg/kg,溶媒对照组给予空白溶媒,连续给药21天。
给药期间,每三天称量一次体重。在给药第21天,第一次给药后2h进行肺泡灌洗,进行灌洗液中炎症细胞计数,并检测灌洗液上清中的相关生物标志物;灌洗后取大鼠左肺固定,采用Masson三色染色,进行纤维化病理评分,其余肺叶冻存。取化合物3组的肺泡灌洗液上清和新鲜冻存的肺组织,使用ELISA方法进行TGF-β1蛋白含量和总蛋白量的检测,计算每毫克总蛋白中TGF-β1的量。
实验结果显示,化合物I-2S和化合物I-2R的动物体重降低明显少于对照化合物组,本发明化合物的安全性更好(结果如图1所示);化合物I-2R的肺泡灌洗液上清和新鲜冻存的肺组织中TGF-β1的含量显著低于溶媒对照组,本发明化合物有显著的抗纤维化形成效果(结果如图2所示)。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。