CN113831323A - 芳杂环酰胺类化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了芳杂环酰胺类化合物及其用途，具体地，这类化合物可有效抑制ASK1激酶活性，其为式(I)至(III)所示化合物，或者式(I)至(III)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：

Description

芳杂环酰胺类化合物及其用途
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体地，本发明涉及芳杂环酰胺类化合物作为ASK1抑制剂，更具体地，本发明涉及芳杂环酰胺类化合物作为ASK1抑制剂及其制备方法，以及其在制备药物中的用途。
背景技术
细胞凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，也叫丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(mitogen-activated proteinkinase kinase kinase 5，MAP3K5)，属于MAP3K家族成员之一。ASK1可被氧化应激、钙内流、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、以及多种细胞因子如肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)等上游因子调节，激活下游c-Jun氨基末端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38-MAPK激酶信号传导通路，通过调控细胞生长、分化、炎症和凋亡对应激作出应答。
ASK1激活及其信号通路在心血管疾病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病、炎症、代谢性疾病和癌症等发生发展过程中发挥着重要作用。阿尔茨海默症的病理特征是β-淀粉样肽(Aβ肽)的沉积和神经纤维缠结，倪军等人研究发现ASK1在Aβ诱导的原代大脑内皮细胞死亡中起到重要作用；环境中MPRP物质是引起帕金森病的原因之一，能激活ASK1同时伴有下游激酶的磷酸化，使细胞损伤。环境因素引起的帕金森病与ASK1的活化有着密切关系。ASK1可促进血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚、心脏重构、间质纤维化以及冠状动脉重构等；可促进脑缺血再灌注后神经元-小神经胶质细胞的死亡，从而恶化脑卒中疾病的发展。TeradaY等人在缺血再灌注诱导的急性肾损伤模型中发现ASK1被显著激活。倪军等人还发现ASK1信号通路也参与自身免疫反应，在ASK1基因敲除的脾细胞和骨髓源性树突状细胞中，LPS诱导的p38信号通路显著减弱，并且细胞中的炎性因子明显减少；在动物研究中，ASK1基因敲除小鼠比野生型能更有效抗LPS诱导的感染性休克。Eapen MS等人发现ASK1在非慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的气道平滑肌中比非COPD有更高的表达，用靶向ASK1的siRNA处理气道平滑肌细胞能阻止有丝分裂原诱导的细胞生长，ASK1的抑制具有抗有丝分裂作用，可以靶向减少或预防COPD中过度的气道平滑肌增生。Wilkins MR等人发现，在肺动脉高压中，ASK1抑制减少了肺血管和右心室的病理性重塑，并在肺动脉高压的啮齿动物模型中阻止了疾病进展。在小鼠模型中，高脂肪饮食引起肝脂肪变性，最终导致脂肪堆积和脂肪酸氧化，这导致ROS的产生，其引起肝细胞功能障碍和死亡；另外TNF通过ASK1-JNK途径对肝细胞凋亡至关重要，TNF缺乏小鼠表现出的肝脂肪变性和肝纤维化程度降低，在高脂饮食诱导的Ⅱ型糖尿病以及肝脏脂肪变性模型中，ASK1起到了明显的促进作用。
调节ASK1的活性在治疗或预防广泛的疾病中可能具有有益的效果，因此开发ASK1小分子抑制剂是调节ASK1活性的有效方法。近年来多项研究发现ASK1抑制剂对于慢性肾脏疾病(糖尿病肾病、终末肾病、肾纤维化等)、心血管疾病(心衰等)、神经退行性疾病(如阿尔茨海默尔症、帕金森症)、肺部疾病(例如肺动脉高压、肺纤维化)以及肿瘤等疾病具有潜在的治疗价值，尤其以ASK1为靶点的药物在慢性肝脏疾病如非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化等方面的研究有着重要的临床意义，并且取得了一定的临床疗效。
文献中报道的部分ASK1激酶小分子抑制剂具有分子水平活性较差，ASK1靶点选择性欠佳，化合物的类药性差等潜在问题，部分化合物具有化学稳定性和体内代谢稳定性的潜在问题。因此仍有待进一步开发新型的效果更好的ASK1小分子抑制剂。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种化合物，其为式(I)所示化合物，或者式(I)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、盐或前药：
Figure BDA0003127624940000021
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自卤素、C1-C3烷基；
R1独立选自氢，无取代或任选被一个或多个Rb取代的以下基团：C1-C6烷基、C3-C6环烷基；所述Rb选自卤素、C1-C3烷基；
R2选自卤素，被卤素取代的C1-C6烷基，无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：C2-C6烷基、4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、-C(O)-NH-Rd、氧代；Rd选自氢、C1-C6烷基；优选地，所述4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基以N与X所在的芳基或杂芳基连接；
R3选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基。
根据本发明示例性的实施方案，式(I)中，
X选自-N＝、-C(F)＝；
R1独立选自异丙基、环丙基；
R2选自无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：4元含N杂环基、哌啶基、吗啉基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、甲基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH-CH3、氧代；
R3选自异丙基、被氟取代的异丙基。
根据本发明示例性的实施方案，式(I)中，
R2选自
Figure BDA0003127624940000031
Figure BDA0003127624940000032
R3选自
Figure BDA0003127624940000033
根据本发明的实施方案，本发明化合物包含下式所示化合物，或其互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure BDA0003127624940000034
Figure BDA0003127624940000041
根据本发明的第二方面，本发明提出了一种化合物，其为式(II)所示化合物，或者式(II)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、盐或前药：
Figure BDA0003127624940000042
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；
R1独立选自氢，无取代或任选被一个或多个Rb取代的以下基团：C1-C6烷基、C3-C6环烷基；所述Rb选自卤素、C1-C3烷基；优选地，R1选自异丙基、环丙基；
R2选自氢，卤素，被卤素取代的C1-C6烷基，无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：C2-C6烷基、4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、-C(O)-NH-Rd、氧代；Rd选自氢、C1-C6烷基；优选地，所述4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基以N与X所在的芳基或杂芳基连接；
环A选自无取代或任选被一个或多个Re取代的以下基团：环烷基和杂环基；Re选自氟、氯、溴、C1-C3烷基。
根据本发明示例性的实施方案，式(II)中，
X选自-N＝、-C(F)＝；
R1选自环丙基；
R2选自氢、
Figure BDA0003127624940000051
环A选自无取代或任选被一个或多个Re取代的5-6元杂环烷基。
根据本发明的实施方案，本发明化合物还包含下式所示化合物，或其互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure BDA0003127624940000052
根据本发明的第三方面，本发明提出了一种化合物，其为式(III)所示化合物，或者式(III)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、盐或前药：
Figure BDA0003127624940000053
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；优选地，X选自-N＝、-C(F)＝；
Y选自单键、-C(＝O)-、
Figure BDA0003127624940000054
Z选自-O-或-C(Rb)2-；每个Rb独立选自氢、卤素、C1-C3烷基；
m选自0-6的整数；
R1选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；
R2、R3、R4选自氢、卤素、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；
当Z为-C(Rb)2-时，R2还可以与Rb相连，形成环烷基或杂环烷基。
根据本发明示例性的实施方案，式(III)所示化合物可进一步优选为式(IV)所示化合物：
Figure BDA0003127624940000061
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；优选地，X选自-N＝、-C(F)＝；
m选自0-6的整数；n选自0-6的整数；
R1选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；优选地，R1选自环丙基、异丙基、被1个氟取代的环丙基。
根据本发明的实施方案，所述式(III)所示化合物选自如下所示化合物：
Figure BDA0003127624940000062
本发明化合物可以存在互变异构现象。本发明包括化合物的所有互变异构形式，无论处于平衡状态还是一种形式占优势，本发明均包含每种互变异构形式。
根据本发明的第四方面，本发明还提出了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药。
“药物组合物”表示一种或多种文本所述化合物或其生理学/药学上可接受的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，其它组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
本发明还提供一种治疗ASK1相关疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药中的至少一种。
本发明还提供一种治疗ASK1相关疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的本发明所述化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药或其药物组合物。
本发明还提供了式(I)至(IV)所示化合物，及式I-1至I-10、式II-1至II-3、式III-1所示化合物，其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药，或含有式(I)至(IV)所示化合物，及式I-1至I-10、式II-1至II-3、式III-1所示化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的药物组合物在制备治疗与ASK1相关疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述的ASK1相关疾病选自心脑血管疾病、慢性肾脏疾病、肺部疾病、慢性肝脏疾病、多发性硬化症、代谢性疾病、结石、神经退行性疾病和癌症。
在一些实施方案中，所述的ASK1相关疾病选自心肌梗塞、中风、血栓、糖尿病肾病、终末肾病、肾纤维化、胆固醇结石、胆结石病、肺动脉高压、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性肺损伤、脂肪肝炎、肝纤维化、胆汁酸紊乱、原发性硬化性胆管炎、糖尿病、阿尔茨海默症、帕金森症、胃癌、肝癌、息肉病、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌等过度增殖性疾病。
术语定义和说明
除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。
除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。
除非另有说明，否则采用本领域技术范围内的常规方法，如质谱、NMR、IR和UV/Vis光谱法和药理学方法。除非提出具体定义，否则本文在分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学的有关描述中采用的术语是本领域已知的。可在化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，以及对患者的治疗中使用标准技术。例如，可利用厂商对试剂盒的使用说明，或者按照本领域公知的方式或本申请的说明来实施反应和进行纯化。通常可根据本说明书中引用和讨论的多个概要性和较具体的文献中的描述，按照本领域熟知的常规方法实施上述技术和方法。在本说明书中，可由本领域技术人员选择基团及其取代基以提供稳定的结构部分和化合物。当通过从左向右书写的常规化学式描述取代基时，该取代基也同样包括从右向左书写结构式时所得到的在化学上等同的取代基。举例而言，CH2O等同于OCH2。
本申请说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围被理解为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“1～6的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5和6的每一个整数。当该数值范围被理解为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“1～10的数”应当被理解为不仅记载了1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指药学上可接受的无毒酸或碱的盐，包括无机酸和碱、有机酸和碱的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于Al、Ca、Li、Mg、K、Na和Zn形成的金属盐；衍生自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺或叔胺的盐，包括天然存在的取代或未取代的胺、环胺和碱性离子交换树脂，例如铵、异丙基胺、三甲基胺、二乙胺、三乙胺、三丙基胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、咖啡碱、普鲁卡因、胆碱、甜菜碱、苯明青霉素、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶或聚胺树脂形成的有机盐；衍生自无机酸和有机酸的盐包括但不限于硫酸、磷酸、硝酸、氢溴酸、盐酸、甲酸、乙酸、丙酸、苯磺酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸、褐藻酸、氨茴酸、樟脑酸、柠檬酸、乙烯磺酸、蚁酸、富马酸、糠酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、乙醇酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、粘液酸、双羟萘酸、泛酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对甲苯磺酸、丙二酸、2-羟基丙酸、草酸、羟乙酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、枸橼酸、赖氨酸、精氨酸、门冬氨酸、肉桂酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸或三氟甲磺酸等形成的有机盐。
除了药学可接受的盐外，本发明还考虑其他盐。它们可以在化合物纯化中或在制备其它药学上课接受的盐中充当中间体或可用于本发明化合物的鉴别、表征或纯化。
术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体，包括顺反异构体、对映异构体、非对应异构体和构象异构体。本发明使用的立体化学定义和惯例大体上按照S.P.Parker，Ed.，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company，New York；and Eliel，E.and Wilen，S.，“Stereochemistryof Organic Compounds”，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1994来定义。
依据原料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物的形式存在，例如作为纯旋光异构体，或作为异构体混合物，如作为外消旋和非对映异构体混合物，这取决于不对称碳原子的数量。当描述具有光学活性的化合物时，使用前缀D和L或R和S来表示就分子中的手性中心(或多个手性中心)而言分子的绝对构型。前缀D和L或(+)和(–)是用于指定化合物所致平面偏振光旋转的符号，其中(–)或L表示化合物是左旋的。前缀为(+)或D的化合物是右旋的。就给定的化学结构而言，除了这些立体异构体互为镜像外，这些立体异构体是相同的。具体的立体异构体也可称为对映异构体，并且所述异构体的混合物通常称作对映异构体的混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋体，当在化学反应或方法中没有立体选择性或立体特异性时，可出现所述外消旋混合物或外消旋体。烯烃、C＝N双键等的许多几何异构体也可以存在于本文所述的化合物中，且所有这种稳定的异构体在本发明中均被考虑。当本文所描述化合物含有烯双键时，除非另外说明，否则，这种双键包括E和Z几何异构体。如果化合物中含有二取代的环烷基，环烷基的取代基可能为顺式或反式(cis-或trans-)构型。
当将本发明式中与手性碳的键描写直成线时，应当理解为，手性碳的(R)和(S)两种构型和由此产生的其对映体纯的化合物和混合物两者包括在该通式范围内。本文中消旋体或者对映体纯的化合物的图示法来自Maehr，J.Chem.Ed.1985，62:114-120。除非另有说明，用楔形键和虚线键表示一个立体中心的绝对构型。
旋光性的(R)-或(S)-异构体可使用手性合成子或手性制剂制备，或使用常规技术拆分。含有不对称取代的碳原子的本发明化合物能够以旋光活性形式或外消旋形式分离。化合物的外消旋混合物的拆分可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来进行。示例性方法包括使用手性拆分酸的分级重结晶，该手性拆分酸是旋光活性的成盐有机酸。用于分级重结晶方法的适合的拆分剂例如是旋光活性酸，例如酒石酸、二乙酰基酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或各种旋光活性樟脑磺酸如β-樟脑磺酸的D和L形式。适合于分级结晶方法的其它的拆分剂包括立体异构纯形式的α-甲基-苄胺(例如，S和R形式或者非对映异构纯形式)、2-苯基甘氨醇、降麻黄碱、麻黄碱、N-甲基麻黄碱、环己基乙胺、1，2-二氨基环己烷等。外消旋混合物的拆分还可以通过在填充有旋光活性拆分剂(例如，二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸)的柱子上洗脱来进行。可以采用高效液相色谱(HPLC)法也可以采用超临界流体色谱法(SFC)进行。具体方法的选择以及洗脱条件、色谱柱的选择可以由本领域技术人员根据化合物的结构以及试验结果选择。进一步的，还可以使用已知构型的光学纯的起始原料或试剂，通过立体有机合成，获得本发明所描述化合物的任何对映体或非对映体。
术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。本发明化合物可表现出互变异构现象。互变异构的化合物可以存在两种或多种可相互转化的种类。质子移变互变异构体来自两个原子之间共价键合的氢原子的迁移。互变异构体一般以平衡形式存在，尝试分离单一互变异构体时通常产生一种混合物，其理化性质与化合物的混合物是一致的。平衡的位置取决于分子内的化学特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型占优势；而在酚中，烯醇型占优势。本发明包含化合物的所有互变异构形式。
术语“药物组合物”表示一种或多种文本所述化合物或其生理学/药学上可接受的盐或前体药物与其它化学组分的混合物，其它组分例如生理学/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物体的给药。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”、“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
术语“溶剂化物”指本发明化合物或其盐包括以分子间非共价力结合的化学计量或非化学计量的溶剂，当溶剂为水时，则为水合物。
术语“前药”是指可以在生理条件下或者通过溶剂解转化为具有生物活性的本发明化合物。本发明的前药通过修饰在该化合物中的功能基团来制备，该修饰可以按常规的操作或者在体内被除去，而得到母体化合物。前药包括本发明化合物中的一个羟基或者氨基连接到任何基团上所形成的化合物，当本发明化合物的前药被施予哺乳动物个体时，前药被割裂而分别形成游离的羟基、游离的氨基。
本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚(3H)，碘-125(125I)或C-14(14C)。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
术语“辅料”是指可药用惰性成分。术语“赋形剂”的种类实例非限制性地包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂和稀释剂等。赋形剂能增强药物制剂的操作特性，即通过增加流动性和/或粘着性使制剂更适于直接压缩。适用于上述制剂的典型的“药学上可接受的载体”的实例为：糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉类，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙类，例如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸碱土金属盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸钙；硬脂酸；植物油类，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和负离子表面活性剂；乙二醇聚合物；脂肪醇类；和谷物水解固形物以及其它无毒的可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧剂、润滑剂、着色剂等在药物制剂中常用到的辅料。
术语“C1-C6烷基”应理解为优选表示具有1～6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基；术语“C2-C6烷基”应理解为表示具有2、3、4、5或6个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5、6个碳原子(“C1-C6烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(“C1-C3烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
本文所用术语“卤代基”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。
“卤代烷基”指包括具有特定数目的碳原子、被一或多个卤素取代的支链和直链的饱和脂族烃基(如-CvFw，其中v＝1至3，w＝1至(2v+1))。卤代烷基的实例包括，但不限于三氟甲基、三氯甲基、五氟乙基、五氯乙基、2，2，2-三氟乙基、七氟丙基和七氯丙基。
术语“C3-C6环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～6个碳原子，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基。
术语“4-6元含氮杂环基”应理解为饱和的一价单环或双环烃环，其包含4-6个环原子且至少1个环原子为N，此外还可能包含0-5个独立选自N、O和S的杂原子。特别地，所述杂环基可以包括但不限于：4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基。根据本发明，所述杂环基是无芳香性的。
术语“螺环基”应理解为单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环集团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环基分为单螺环基、双螺环基或多螺环基，螺环基的非限制性实施例包括：
Figure BDA0003127624940000111
上述对术语“螺环基”的定义同样适用于含有其的其他术语，如术语“7-10元含氮螺环基”等。
术语“7-10元含氮螺环基”应理解为含有7-10个环原子(其中至少一个环原子为N)的螺环基，包括“7-10元饱和含氮螺环基”和“7-10元不饱和含氮螺环基”。任选地，环状结构中的环原子(例如碳原子或硫原子)可以被氧代。
术语“芳基”应理解为任何稳定的6-10元单环或双环芳香族基团，例如：苯基、萘基、四氢萘基、2,3-二氢化茚基或联苯基等。
术语“杂芳基”是指至少1个环上的碳原子被选自氮、氧或硫的杂原子置换所形成的芳香环基团，其可为5-12元杂芳基，优选的，可为5-7元单环结构或7-12元双环结构，优选5-6元杂芳基。例如：吡啶基、嘧啶基、哒嗪-3(2H)-酮基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、恶唑基、异恶唑基、1,2,5-恶二唑基、1,2,4-恶二唑基、1,2,4-三氮唑基、1,2,3-三氮唑基、四氮唑基、吲唑基、异吲唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并[d][1,3]二氧戊环基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基等。
有益效果
发明人惊讶地发现，本发明制备的化合物具有显著的ASK1抑制活性。并且相对于现有化合物其活性有明显改善。与其他ASK1抑制剂相比，本发明的代表性实施例化合物对HSC细胞的α-SMA和COL1A1基因表达具有更好的抑制作用，本发明的化合物还具有更为优良的肝代谢稳定性，在人体内代谢更慢，暴露量更高。与对照化合物相比，本发明化合物表现出更弱的CYP抑制活性，更好的成药性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明的实施例提供了制备式(I)至(IV)所示化合物，及式I-1至I-10、式II-1至II-3、式III-1所示化合物，其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药的方法，及式(I)至(IV)所示化合物，及式I-1至I-10、式II-1至II-3、式III-1所示化合物或其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物或前药在制备治疗与ASK1相关疾病的药物中的用途。
本发明所述的各反应步骤所使用的反应溶剂没有特别限制，任何在一定程度上能溶解起始原料并且不抑制反应的溶剂均包含在本发明中。另外，本领域的许多类似改动，等同替换，或等同于本发明所描述的溶剂，溶剂组合，及溶剂组合的不同比例，均视为本发明的包含范围。
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)和/或液质联用(LC-MS)来确定的。NMR位移的单位为10-6(ppm)。NMR测定的溶剂为氘代二甲基亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇等，内标为四甲基硅烷(TMS)。
液质联用(LC-MS)由WatersAcquityH-classUplc-QDA质谱仪测定，使用ACQUITYUPLCBEHC18，2.1*50mm，1.7μm色谱柱监测。梯度洗脱条件：以1.0mL/min流速，95—5％溶剂A1和5-95％溶剂B1，然后95％B1和5％A1保持0.5min，百分数为某一溶剂占总溶剂体积的体积百分数。其中溶剂A1：0.1％甲酸的水溶液；溶剂B1：0.1％甲酸的乙腈溶液。百分数为溶质占溶液的体积百分数。
本发明的缩写定义如下：
符号或单位：
IC50：半数抑制浓度，指达到最大抑制效果一半时的浓度
M：mol/L，例如1M氢氧化钠水溶液表示摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠水溶液
试剂：
AcOH：醋酸
DIPEA：也可写为DIEA，二异丙基乙胺，亦即N,N-二异丙基乙胺
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
iPrNH2：异丙胺
K2CO3：碳酸钾
KI：碘化钾
MeOH：甲醇
Pd/C、Pd-C：钯碳
Pd(dppf)Cl2：[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯
THF：四氢呋喃
除非作出相反的指示，本文例举的化合物使用ChemBioDraw Ultra 13.0命名和编号。
对比例1：对照化合物及其制备
Figure BDA0003127624940000141
对照化合物参考专利申请WO2013112741A1合成。
下文测试例的对照化合物均指对比例1所述化合物。
实施例1：目标化合物I-1的合成
5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(化合物I-1)
Figure BDA0003127624940000142
目标化合物I-1合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000143
第一步：2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(I-1B)的合成
0℃下，将3-甲基-3-羟基氮杂环丁烷盐酸盐(0.63g,5mmol)分批加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(1.1g,5mmol)，DIEA(0.97g,7.5mmol)的THF(15mL)溶液中。0℃下搅拌1h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(1.5g,4.4mmol,产率88％)。
第二步：5-氨基-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(I-1C)的合成
将Pd-C(150mg)小心加入到含有2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(1.5g,4.4mmol)的MeOH(20ml)的溶液中，在氢气氛围下，室温反应过夜。原料反应完后，过滤，滤液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-氨基-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(1.2g,4.7mmol)。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(I-1D)的合成
将含有5-氨基-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(1.0g,3.9mmol)，2-溴-1-环丙基乙酮(1.27g,7.8mmol)，KI(129mg,0.8mmol)，K2CO3(1.1g,7.8mmol)的DMF(10mL)反应液置于70℃搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(1.0g,3.0mmol,产率76％)。
第四步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(I-1E)的合成
将5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(1.0g,3.0mmol)溶于甲酰胺(5ml,1.550mmol)，微波加热至180℃，搅拌60min。反应完后，反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(200mg,0.58mmol,产率19.3％)。
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(I-1)的合成
将叔丁醇钾(260mg,2.32mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(200mg,0.58mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(141mg,0.70mmol)的DMF(3ml)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.30(d,1H),8.87(s,1H),8.17(d,1H),8.01(t,1H),7.85(d,1H),7.60(s,1H),7.53(d,1H),7.06(s,1H),6.55(d,1H),5.61-5.54(m,1H),5.51(s,1H),3.45(dd,4H),1.87-1.83(m,1H),1.46(d,6H),1.33(s,3H),0.83-0.79(m,2H),0.70-0.66(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):517.4[M+H]+。
实施例2：目标化合物I-2的制备
Figure BDA0003127624940000161
目标化合物I-2合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000162
第一步：2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(I-2B)的合成
0℃下，将N-甲基哌啶-4-羧酰胺盐酸盐(5.18g,29.0mmol)滴加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(6g,27.6mmol)，DIEA(7.86g,60.8mmol)的THF(80mL)溶液中,0℃下搅拌2h。反应完后，加入水(80mL)稀释，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(5g,产率53.3％)。
LC-MS,M/Z(ESI):340.3[M+H]+。
第二步：5-氨基-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(I-2C)的合成
将Pd/C(0.5g,10％)小心加入含有2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)-5-硝基苯甲酸甲酯(5.0g,14.74mmol)的甲醇(30mL)溶液中，在氢气氛围下，室温反应16h。反应完后，过滤后将反应液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-氨基-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.8g,产率17.6％)。
LC-MS,M/Z(ESI):310.3[M+H]+。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(I-2D)的合成
将2-溴-1-环丙基乙酮(1.16g,6.47mmol)滴加到含有5-氨基-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.8g，2.59mmol)，碘化钾(0.472g,2.84mmol)，碳酸钾(0.536g,6.47mmol)的DMF(10mL)溶液中。在70℃下反应16h。反应完后，加入水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.77g，产率76％)。
LC-MS,M/Z(ESI):392.4[M+H]+。
第四步：5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(I-2E)的合成
氮气保护下，将5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.77g,1.967mmol)溶于乙酸(6mL)中，加入硫氰化钾(0.382g,3.93mmol)。在110℃下搅拌反应过夜。反应完后，加入水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得到黄色固体5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.7g,产率82％)。
LC-MS,M/Z(ESI):433.4[M+H]+。
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(I-2F)的合成
将5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.7g,1.967mmol)溶于乙酸(6mL)中，加入水(1mL)，随后缓慢滴加双氧水(0.367g,3.24mmol,30％)。在50℃下搅拌反应1h。反应完后，加入水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(0.47g,产率72.5％)。
LC-MS,M/Z(ESI):401.4[M+H]+。
第六步：1-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟-4-((6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)-N-甲基哌啶-4-甲酰胺(I-2)的合成
将叔丁醇钾(135mg,1.199mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(120mg,0.300mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(73.8mg,0.360mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌2h。反应完后，加入水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶板纯化得1-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟-4-((6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)-N-甲基哌啶-4-甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.87(s,1H),8.19(d,1H),8.02(t,1H),7.90–7.82(m,2H),7.73(d,1H),7.61(d,1H),7.23(s,1H),7.10(d,1H),5.67–5.59(m,1H),2.92(d,2H),2.63–2.52(m,5H),2.22–2.10(m,1H),1.90–1.83(m,1H),1.68–1.54(m,4H),1.44(d,6H),0.84–0.77(m,2H),0.72–0.66(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):572.5[M+H]+
实施例3：目标化合物I-3的制备
Figure BDA0003127624940000181
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000191
第一步：2-氯-4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶(I-3B)的合成
依次将8-羟基喹啉(0.338g,2.331mmol)，碳酸铯(11.39g,35.0mmol)，碘化亚铜(0.167g,1.165mmol)加到含有2-氯-5-氟-4-碘吡啶(3g,11.65mmol)，4-环丙基-1H-咪唑(1.386g,12.82mmol)的正丁腈(50ml)溶液中。氮气保护下，65℃搅拌16h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(70mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(50mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体2-氯-4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶(0.9g,3.79mmol,产率32.5％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(s,1H),7.90(s,1H),7.36(d,J＝4.0Hz,1H),7.09(d,J＝4.0Hz,1H),1.88-1.92(m,1H),0.90-0.94(m,2H),0.82-0.89(m,2H).
第二步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶腈(I-3C)的合成
依次将Zn(CN)2(0.415g,3.53mmol)，Pd(Ph3P)4(0.583g,0.505mmol)加到含有2-氯-4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶(1.2g,5.05mmol)的DMF(10ml)溶液中。氮气保护下，120℃微波搅拌40min。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶腈(0.7g,3.07mmol,产率60.7％)。
LC-MS,M/Z(ESI):229.2[M+H]+。
第三步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸(I-3D)的合成
将4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶腈(750mg,3.29mmol)的浓盐酸(4438μL,52.6mmol)溶液加热至70℃，搅拌3h。反应完后，反应液直接浓缩得到黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸(700mg,2.83mmol)，粗产品直接用于下一步反应。
第四步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸甲酯(I-3E)的合成
在0℃下，将氯化亚砜(0.413ml,5.66mmol)滴加到4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸(700mg,2.83mmol)的MeOH(10mL)中，50℃下搅拌5h.反应完后，直接减压浓缩除去大部分溶剂。残留物用用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到淡黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸甲酯(410mg,1.569mmol,产率55.4％)。
LC-MS,M/Z(ESI):262.3[M+H]+。
第五步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)吡啶甲酸甲酯(I-3F)的合成
依次将3-甲基氮杂环丁烷-3-醇(284mg,2.297mmol，盐酸盐)，K2CO3(529mg,3.83mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸酯(200mg,0.766mmol)的DMF(3ml)溶液中，90℃搅拌16h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)吡啶甲酸甲酯(135mg,0.411mmol,产率53.7％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.03(s,1H),7.69(s,2H),7.15(d,J＝4.0Hz,1H),5.56(s,1H),3.81(s,3H),3.57(dd,J＝8.0Hz,12.0Hz4H),1.81-1.88(m,1H),1 1.34(s,3H),0.78-0.83(m,2H),0.66-0.69(m,2H).
第六步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶甲酰胺(I-3)的合成
将叔丁醇钾(54.7mg,0.487mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)吡啶甲酸甲酯(40mg,0.122mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(29.7mg,0.146mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(s,1H),8.90(s,1H),8.31(d,J＝8.0Hz,1H),8.10(s,1H),8.05(t,J＝8.0Hz,1H),7.85(d,J＝4.0Hz,1H),7.82(s,1H),7.74(s,1H),7.72(s,1H),5.57(s,1H),5.43-5.50(m,1H),3.60(dd,J＝8.0Hz,16.0Hz4H),1.86(m,1H),1.51(d,J＝4.0Hz,6H),1.36(s,3H),0.81-0.84(m,2H),0.69-0.72(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):500.3[M+H]+。
实施例4：目标化合物I-4的制备
Figure BDA0003127624940000211
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000212
第一步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)吡啶甲酸甲酯(I-4B)的合成
依次将N-甲基哌啶-4-羧酰胺盐酸盐(137mg,0.766mmol)，碳酸钾(265mg,1.914mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸酯(100mg,0.383mmol)的DMF(5mL)溶液中，90℃搅拌16h。反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)吡啶甲酸甲酯(70mg,产率47.7％)。
LC-MS,M/Z(ESI):384.3[M+H]+。
第二步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-5-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)吡啶酰胺(I-4)的合成
Figure BDA0003127624940000213
氮气保护下，将叔丁醇钾(82mg,0.730mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)吡啶甲酸甲酯(70mg,0.183mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(40.8mg,0.201mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌2h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶板纯化得4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-5-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)吡啶酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.87(s,1H),8.19(d,1H),8.02(t,1H),7.90-7.82(m,2H),7.73(d,1H),7.61(d,1H),7.23(s,1H),7.10(d,1H),5.67-5.59(m,1H),2.92(d,2H),2.63-2.52(m,5H),2.20-2.10(m,1H),1.90-1.83(m,1H),1.67-1.55(d,4H),1.44(d,6H),0.84-0.77(m,2H),0.72-0.65(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):572.5[M+H]+。
实施例5：目标化合物I-5的制备
Figure BDA0003127624940000221
目标化合物I-5合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000222
第一步：2-氟-5-硝基-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(I-5B)的合成
合成步骤参考实施例11中间体1-11B的合成。
第二步：5-氨基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(I-5C)的合成
将Pd-C(570mg,5.36mmol)小心加入到含有2-氟-5-硝基-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(5.7g,19.24mmol)的MeOH(20mL)的溶液中，在氢气氛围下，室温反应过夜。原料反应完后，过滤，滤液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-氨基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(540mg,2.028mmol,产率10.54％)。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(I-5D)的合成
将含有5-氨基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(490mg,1.840mmol)，2-溴-1-环丙基乙酮(600mg,3.68mmol)，KI(367mg,2.208mmol)，K2CO3(381mg,2.76mmol)的DMF(10ml)反应液置于70℃搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(570mg,1.636mmol,产率89％)。
LC-MS,M/Z(ESI):349.3[M+H]+。
第四步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(I-5E)的合成
将5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(540mg,1.550mmol)溶于甲酰胺(5ml,1.550mmol)，微波加热至180℃，搅拌60min。反应完后，反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酸甲酯(280mg,0.783mmol,产率50.5％)。
LC-MS,M/Z(ESI):358.4[M+H]+
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酰胺(I-5)的合成
将叔丁醇钾(54.7mg,0.487mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酰胺(150mg,0.420mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(85mg,0.420mmol)的DMF(3mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.33(d,J＝4.0Hz,1H),8.86(s,1H),8.16(d,J＝8.0Hz,1H),8.00(d,J＝4.0Hz,1H),6.54(d,J＝16.0Hz,1H),5.53-5.60(s,1H),4.60(s,4H),3.78(s,4H),1.82-1.89(m,1H),1.44(d,J＝8.0Hz,6H),0.81-0.83(m,2H),0.68-0.72(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):529.4[M+H]+。
实施例6：目标化合物I-6的制备
Figure BDA0003127624940000241
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000242
第一步：2-氟-5-硝基-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(I-6B)的合成
0℃下，将2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-1-酮盐酸盐(1.85g,9.7mmol)滴加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(2.1g,9.7mmol)，DIEA(1.88ml,14.6mmol)的THF(30mL)溶液中。0℃下搅拌1h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体2-氟-5-硝基-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(3.0g,8.5mmol,产率88％)。
第二步：5-胺基-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(I-6C)的合成
将Pd-C(300mg)小心加入到含有2-氟-5-硝基-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(3.0g,8.5mmol)的MeOH(30ml)的溶液中，在氢气氛围下，室温反应过夜。原料反应完后，过滤，滤液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-胺基-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(2.0g,6.2mmol,产率73.2％)。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(I-6D)的合成
将含有5-胺基-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(2.0g,6.2mmol)，2-溴-1-环丙基乙酮(2.0g,12.4mmol)，KI(514mg,3.1mmol)，K2CO3(1.28g,9.3mmol)的DMF(10mL)反应液置于70℃搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(1.6g,4.0mmol,产率70％)。
第四步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(I-6E)的合成
将5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(1.6g,4.0mmol)溶于甲酰胺(5mL)，微波加热至180℃，搅拌60min。反应完后，反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(41mg,0.099mmol,产率2.5％)。
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酰胺(I-6)的合成
将叔丁醇钾(44mg,0.40mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酸甲酯(41mg,0.099mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(20mg,0.099mmol)的DMF(3mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(1-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸烷-8-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.62(s,1H),8.83(s,1H),8.15(d,1H),7.99(t,1H),7.85(d,2H),7.57(d,2H),7.21(s,1H),7.08(s,1H),5.63-5.57(m,1H),3.12(t,2H),2.86(d,2H),2.25(t,2H),1.91-1.88(m,3H),1.68-1.64(m,2H),1.40(d,6H),1.29(d,2H),0.79-0.75(m,2H),0.66-0.64(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):584.5[M+H]+。
实施例7：目标化合物I-7的制备
Figure BDA0003127624940000261
目标化合物I-7合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000262
第一步：2-氟-5-硝基-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(I-7B)的合成
0℃下，将2,8-二氮杂螺[4.5]癸-3-酮(3.73g,24.2mmol)加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(5g,23.0mmol)，二异丙基乙基胺(3.27g,25.3mmol)的四氢呋喃(80mL)溶液中。0℃下搅拌2h。反应完后，加入水(80mL)稀释，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体2-氟-5-硝基-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(6g,产率74.2％)。
LC-MS,M/Z(ESI):352.3[M+H]+。
第二步：5-氨基-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(I-7C)的合成
将Pd/C(0.6g，10％)小心加入含有2-氟-5-硝基-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(6.0g,17.18mmol)的甲醇(30mL)溶液中，在氢气氛围下，室温反应16h。反应完后，过滤后将反应液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-氨基-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(4.1g,产率74.7％)。
LC-MS,M/Z(ESI):322.3[M+H]+。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(I-7D)的合成
将2-溴-1-环丙基乙酮(2.54g,15.56mmol)滴加到含有5-氨基-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(2g,6.22mmol)，碘化钾(1.14g,6.85mmol)，碳酸钾(2.15g,15.56mmol)的DMF(10mL)溶液中。在70℃下反应16h。反应完后，加入水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(0.41g,产率16.3％)。
LC-MS,M/Z(ESI):404.4[M+H]+。
第四步：5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(I-7E)的合成
氮气保护下，将5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(0.77g,1.01mmol)溶于乙酸(6mL)中，加入硫氰化钾(0.2g,2.03mmol)，在110℃下搅拌反应过夜。反应完后，加入水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得到黄色固体5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(0.33g,产率73.1％)。
LC-MS,M/Z(ESI):445.5[M+H]+。
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(I-7F)的合成
将5-(4-环丙基-2-巯基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(0.33g,0.732mmol)溶于乙酸(6mL)中，加入水(1mL)，随后缓慢滴加双氧水(0.5mL,30％)。在50℃下搅拌反应1h。反应完后，加入水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(0.18g,产率58.8％)。
LC-MS,M/Z(ESI):413.4[M+H]+。
第六步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(3-氧代-2,8-二氮螺环[4.5]癸-8-基)苯甲酰胺(I-7)的合成
将叔丁醇钾(54.4mg,0.485mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-氧代-2,8-二氮杂螺[4.5]癸-8-基)苯甲酸甲酯(50mg,0.121mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(27.1mg,0.133mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌2h。反应完后，加入水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶板纯化得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(3-氧代-2,8-二氮螺环[4.5]癸-8-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.65(s,1H),8.86(s,1H),8.18(d,1H),8.01(t,1H),7.86(d,1H),7.62(d,1H),7.52(s,1H),7.28(s,1H),7.10(d,1H),5.68–5.56(m,1H),3.03(s,2H),2.75–2.65(m,4H),2.05(s,2H),1.90–1.80(m,1H),1.54(s,4H),1.43(d,6H),0.86–0.78(m,2H),0.72–0.64(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):584.4[M+H]+。
实施例8：目标化合物I-8的制备
Figure BDA0003127624940000281
目标化合物I-8合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000282
第一步：6-氨基吡嗪-2-碳酰肼(I-8B)的合成
将6-氨基吡嗪-2-羧酸甲酯(2g,13.06mmol)溶于甲醇中，随后加入水合肼(2.45g,39.2mmol)，反应加热至80℃，在此温度下搅拌4小时。缓慢冷却至室温后，将反应液中析出的固体过滤，收集滤饼，得到标题化合物黄色固体6-氨基吡嗪-2-碳酰肼(1.6g,产率80％)。
LC-MS,M/Z(ESI)：154.2[M+H]+。
第二步：(E)-N’-(6-(2-((E)-(二甲氨基)亚甲基)肼-1-羰基]吡嗪-2-基)-N,N-二甲基甲酰胺(I-8C)的合成
室温下，将上一步6-氨基吡嗪-2-碳酰肼溶于N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(40mL)中，加热回流下，搅拌18小时，反应体系冷却至室温后，减压浓缩得到粗品(E)-N’-(6-(2-((E)-(二甲氨基)亚甲基)肼-1-羰基]吡嗪-2-基)-N,N-二甲基甲酰胺(2.3g)，未经纯化直接用于下一步。
LC-MS,M/Z(ESI):264.3[M+H]+。
第三步：6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡嗪-2-胺(I-8D)的合成
将上一步(E)-N’-(6-(2-((E)-(二甲氨基)亚甲基)肼-1-羰基]吡嗪-2-基)-N,N-二甲基甲酰胺粗品(2.3g,8.85mmol)溶于乙腈(30mL)中，再依次加入醋酸(4mL)和异丙胺(2.62g,44.2mol),在加热回流下搅拌过夜。反应体系冷却后减压浓缩有机溶剂，再往反应瓶中依次加入四氢呋喃(20mL)和1M氢氧化钠水溶液调节pH至8.0，在室温下搅拌过夜。减压除去有机溶剂，水相用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，减压浓缩有机溶剂后柱层析分离得到标题化合物6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡嗪-2-胺(0.3g，收率16.6％)。
LC-MS,M/Z(ESI)：205.2[M+H]+。
第四步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡嗪-2-基)-4-甲基苯甲酰胺(I-8)的合成
将叔丁醇钾(188mg,1.68mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-甲基苯甲酸甲酯(115mg,0.42mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡嗪-2-胺(85mg,0.420mmol)的DMF(3ml)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡嗪-2-基)-4-甲基苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.36(s,1H),9.04(s,1H),8.93(s,1H),8.29(b,1H),7.67-7.64(m,2H),7.47(d,1H),7.15(s,1H),5.50-5.44(m,1H),2.22(s,3H),1.83-1.78(m,1H),1.42(d,6H),0.78-0.75(m,2H),0.67-0.65(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI)：447.4[M+H]+。
实施例9：目标化合物I-9的制备
Figure BDA0003127624940000301
目标化合物I-9合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000302
第一步：2-氟-5-硝基-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(I-9B)的合成
0℃下，将2,6-二氮杂螺环[3.4]辛烷-7-酮盐酸盐(1g,6.15mmol)加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(1.26g,5.8mmol)，二异丙基乙基胺(0.83g,6.4mmol)的四氢呋喃(15mL)溶液中。室温下搅拌20h。反应完后，加入水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体2-氟-5-硝基-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(1.5g,产率80％)。
LC-MS,M/Z(ESI):324.3[M+H]+。
第二步：5-氨基-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(I-9C)的合成
将钯碳(0.6g，10％)小心加入含有2-氟-5-硝基-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(1.5g,4.64mmol)的乙醇(20mL)溶液中，在氢气氛围下，室温反应16h。反应完后，过滤后将反应液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-氨基-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(0.32g,产率23.5％)。
LC-MS,M/Z(ESI):294.3[M+H]+。
第三步：5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(7-氧代2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(I-9D)的合成
将2-溴-1-环丙基乙酮(0.27g,1.48mmol)滴加到含有5-氨基-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(0.29g,0.99mmol)，碳酸钾(0.18g,1.29mmol)的DMF(10mL)溶液中。在70℃下反应16h。反应完后，加入水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体5-((2-环丙基-2-氧乙基)氨基)-2-氟-4-(7-氧代2,6-二氮杂螺[3.4]辛-2-基)苯甲酸甲酯(0.25g,产率67.4％)。
LC-MS,M/Z(ESI):376.4[M+H]+。
第四步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酸甲酯(I-9E)的合成
将5-((2-环丙基-2-氧代乙基)氨基)-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酸甲酯(200mg,0.53mmol)溶于甲酰胺(2mL)，微波加热至180℃，搅拌60min。反应完后，反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到黄色固体5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酸甲酯(70mg,0.18mmol,产率34.4％)。
第五步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酰胺(I-9)的合成
将叔丁醇钾(80mg,0.72mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酸甲酯(70mg,0.18mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(37mg,0.18mmol)的DMF(1mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(7-氧代-2,6-二氮杂螺[3.4]辛烷-2-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.32(d,1H),8.85(s,1H),8.15(d,1H),7.98(t,1H),7.82(d,2H),7.59(d,1H),7.50(d,1H),7.05(s,1H),6.55(d,1H),5.59-5.52(m,1H),3.57(dd,4H),3.34(s,2H),2.36(s,2H),1.84-1.80(m,1H),1.43(d,6H),0.79-0.77(m,2H),0.68-0.65(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):556.3[M+H]+。
实施例10：目标化合物I-10的制备
Figure BDA0003127624940000311
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000321
第一步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-6基)吡啶甲酸甲酯(I-10B)的合成
依次将2-氧-6-氮杂螺环[3.3]庚烷半草酸盐(500mg,1.91mmol)，碳酸钾(1.32g,9.57mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟吡啶甲酸酯(200mg,0.766mmol)的DMF(15mL)溶液中，90℃搅拌16h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(30mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-6基)吡啶甲酸甲酯(0.3g,产率46.1％)。
LC-MS,M/Z(ESI):341.4[M+H]+。
第二步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-5-(2-氧杂6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)吡啶啉酰胺(I-10)的合成
Figure BDA0003127624940000322
将叔丁醇钾(396mg,3.53mmol)加到含有4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-6基)吡啶甲酸甲酯(300mg,0.881mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(29.7mg,0.146mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-(3-羟基-3-甲基吡咯烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.34(s,1H),8.90(s,1H),8.31(dd,1H),8.10(s,1H),8.05(t,1H),7.86(dd,1H),7.82(s,1H),7.74(d,1H),7.21(d,1H),5.54-5.38(m,1H),4.63(s,4H),3.96(s,4H),1.93-1.82(m,1H),1.51(d,6H),0.87-0.80(m,2H),0.76-0.67(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):512.4[M+H]+。
实施例11：目标化合物I-11的制备
Figure BDA0003127624940000331
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000332
第一步：2-氟-5-硝基-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(I-11B)的合成
0℃下，将2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷半草酸盐(6.6g,23mmol)滴加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(5.0g,23mmol)，DIEA(4.5g,34.5mmol)的THF(15mL)溶液中。0℃下搅拌1h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得黄色固体2-氟-5-硝基-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(4.0g,13.5mmol,产率58.7％)。
第二步：5-胺基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(I-11C)的合成
将Pd-C(400mg)小心加入到含有2-氟-5-硝基-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(4.0g,13.5mmol)的MeOH(40mL)的溶液中，在氢气氛围下，室温反应过夜。原料反应完后，过滤，滤液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得黄色固体5-胺基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(3.7g,13.9mmol)。
第三步：5-溴-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(I-11D)的合成
将含有5-胺基-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(500mg,1.9mmol)，溶于四氢呋喃(10mL)中，0℃下慢慢滴加亚硝酸叔丁酯(290mg，2.8mmol)滴加完毕后保持稳定搅拌30分钟，然后向体系中加入溴化铜(629mg，2.8mmol)，室温搅拌过夜，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得5-溴-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(370mg,1.1mmol,产率59％)。
第四步：2-氟-5-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(I-11E)的合成
将5-溴-2-氟-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(370mg,1.1mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)中，加入1-异丙基-1H-吡唑-4-硼酸频那醇酯(312mg，1.3mmol)，Pd(dppf)Cl2(80mg，0.11mmol)和碳酸钾(228mg，1.7mmol)微波加热至100℃，搅拌30min。反应完后，反应完后，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得到固体2-氟-5-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(345mg,0.96mmol,产率87.3％)。
第五步：2-氟-5-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酰胺(I-11)的合成
将叔丁醇钾(187mg,1.7mmol)加到含有2-氟-5-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酸甲酯(150mg,0.42mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(85mg,0.420mmol)的DMF(3mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得2-氟-5-(1-异丙基-1H-吡唑-4-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-4-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基)苯甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.22(d,1H),8.84(s,1H),8.16(d,1H),7.98(t,1H),7.86(s,1H),7.82(d,1H),7.50(s,1H),7.45(d,1H),6.44(d,1H),5.61-5.54(m,1H),4.61(s,4H),4.56-4.49(m,1H),3.81(s,4H),1.44(dd,12H).
LC-MS,M/Z(ESI):531.4[M+H]+。
实施例12：目标化合物II-1的制备
Figure BDA0003127624940000341
目标化合物II-1合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000351
第一步：4-溴吡啶甲酸(II-1B)的合成
在4-溴吡啶甲酸甲酯(2g,9.26mmol)的四氢呋喃(30mL),甲醇(10mL)和水(10mL)的混合溶液中加入一水合氢氧化锂(1.554g,37mmol)，室温下搅拌过夜。反应完后，加入水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得白色固体4-溴吡啶甲酸(1.6g,产率87％)。
第二步：4-氯-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶酰胺(II-1C)的合成
在4-溴吡啶甲酸(366g,1.81mmol)的烧瓶中加入二氯亚砜(20mL),85℃反应2h。随后，将反应液直接浓缩，依次加入四氢呋喃(10mL)，6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-胺(0.3g,1.39mmol)和吡啶(2mL)，并在45℃下反应过夜，反应完后，加入蒸馏水(30mL)稀释，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化得黄色固体4-氯-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶酰胺(260mg,产率46.7％)。
LC-MS m/z：400.2[M+H]+。
第三步：4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶酰胺(II-1)的合成
氮气保护下，在含有碘化亚铜(10.7mg,0.056mmol)、8-羟基喹啉(16.4mg,0.113mmol)、碳酸钾(97mg,0.705mmol)、4-环丙基-1H-咪唑(61mg,0.564mmol)和4-氯-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶酰胺(1.410g,8.65mmol)的烧瓶中加入二甲亚砜(6mL)溶液中。在110℃下反应过夜。反应完后，加入蒸馏水(20mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(20mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶板纯化得4-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)吡啶酰胺。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.39(s,1H),8.72(d,1H),8.45-8.40(m,1H),8.32(d,1H),8.15-8.07(m,1H),8.02(d,1H),7.92(t,1H),7.50(dd,1H),7.24(d,1H),5.18-5.11(m,1H),3.14-2.99(m,3H),2.49-2.42(m,1H),1.96-1.89(m,1H),1.34-1.19(m,3H),0.97-0.91(m,2H),0.88–0.83(m,2H).
实施例13：目标化合物II-2的制备
Figure BDA0003127624940000361
目标化合物合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000362
第一步：5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(II-2)的合成
将叔丁醇钾(130mg,1.16mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)苯甲酸甲酯(100mg,0.29mmol)，6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-胺(70mg,0.32mmol)的DMF(3ml)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(3-羟基-3-甲基氮杂环丁烷-1-基)-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.21(d,1H),8.09(d,1H),7.93(t,1H),7.80(d,1H),7.55(s,1H),7.47(d,1H),7.02(s,1H),6.00(d,1H),5.50(s,1H),5.11-5.07(m,1H),3.40(dd,4H),3.78(s,4H),2.97-2.84(m,3H),2.29(t,1H),1.81(b,1H),1.32-1.29(m,6H),0.77-0.75(m,2H),0.64-0.63(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):529.4[M+H]+。
实施例14：目标化合物II-3的制备
Figure BDA0003127624940000371
目标化合物II-3合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000372
第一步：1-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟-4-((6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)-N-甲基哌啶-4-甲酰胺(II-3)的合成
将叔丁醇钾(117mg,1.043mmol)加到含有5-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-2-氟-4-(4-(甲基氨基甲酰基)哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(100mg,0.261mmol)，6-(5-甲基-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑-3-基)吡啶-2-胺(67.4mg,0.313mmol)的DMF(2mL)溶液中，室温搅拌2h。反应完后，加入水(10mL)稀释，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶板纯化得1-(2-(4-环丙基-1H-咪唑-1-基)-5-氟-4-((6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)氨基甲酰基)苯基)-N-甲基哌啶-4-甲酰胺。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.56(s,1H),8.12(d,1H),7.95(t,1H),7.867.78(m,2H),7.72-7.67(m,1H),7.56(d,1H),7.20(s,1H),7.07(d,1H),5.15-5.08(m,1H),4.46-4.29(m,1H),3.02-2.79(m,5H),2.59-2.48(m,4H),2.32-2.25(m,1H),2.16-2.07(m,1H),1.87-1.79(m,1H),1.63-1.49(m,4H),1.29(d,3H),0.80-0.74(m,2H),0.69-0.62(m,2H).
LC-MS,M/Z(ESI):584.5[M+H]+。
实施例15：目标化合物III-1的制备
Figure BDA0003127624940000373
目标化合物III-1合成路线如下所示：
Figure BDA0003127624940000381
第一步：1-(5-氟-4-甲甲酸甲酯)-2硝基苯基)氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯(III-1B)的合成0℃下，将2-氮杂环丁烷-1-羧酸甲酯盐酸盐(1.7g,11.0mmol)滴加到含有2,4-二氟-5-硝基苯甲酸甲酯(2.0g,9.2mmol)，DIEA(1.8g,13.8mmol)的DMF(15mL)溶液中。0℃下搅拌1h。反应完后，加入蒸馏水(50mL)稀释，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(70mL×2)洗，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝3:1)得固体1-(5-氟-4-甲甲酸甲酯)-2硝基苯基)氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯(3.0g,9.6mmol)。
第二步：7-氟-3-羰基-2,2a，3,4-四氢-1H-氮杂环丁烷并[1,2-a]喹喔啉-6-甲酸甲酯(III-1C)的合成
将Pd-C(300mg)小心加入到含有1-(5-氟-4-甲甲酸甲酯)-2硝基苯基)氮杂环丁烷-2-甲酸甲酯(3.0g,9.6mmol)的MeOH(30mL)的溶液中，在氢气氛围下，室温反应过夜。原料反应完后，过滤，滤液直接浓缩。残留物用硅胶柱纯化(石油醚:乙酸乙酯(V/V)＝1:1)得固体5-胺基-4-(2-甲酰胺氮杂环丁烷-1-基)-2-氟苯甲酸甲酯(1.0g,4.0mmol,产率41.6％)。
第三步：7-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-3-羰基-2,2a，3,4-四氢-1H-氮杂环丁烷并[1,2-a]喹喔啉-6-甲酸甲酯(III-1)的合成
将叔丁醇钾(269mg,2.4mmol)加到含有7-氟-3-羰基-2,2a，3,4-四氢-1H-氮杂环丁烷并[1,2-a]喹喔啉-6-甲酸甲酯(150mg,0.60mmol)，6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-胺(122mg,0.60mmol)的DMF(3mL)溶液中，室温搅拌3h。反应完后，加入蒸馏水(10mL)稀释，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并有机相，有机相用饱和食盐水(10mL)洗涤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，残留物用硅胶柱纯化(二氯甲烷:甲醇(V/V)＝10:1)得7-氟-N-(6-(4-异丙基-4H-1,2,4-三唑-3-基)吡啶-2-基)-3-羰基-2,2a,3,4-四氢-1H-氮杂环丁烷并[1,2-a]喹喔啉-6-甲酸甲酯。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.50(s,1H),10.31(d,1H),8.85(s,1H),8.17(d,1H),7.99(t,1H),7.84(d,1H),7.13(d,1H),6.60(d,1H),5.63-5.56(m,1H),4.82(t,1H),4.29(dd,1H),3.86-3.80(m,1H),2.89-2.85(m,1H),2.75-2.72(m,1H),1.42(d,6H).
LC-MS,M/Z(ESI):422.3[M+H]+。
生物学活性及相关性质测试例
测试例1：化合物对ASK1激酶活性抑制试验
化合物对ASK1激酶活性抑制试验采用ADP-Glo发光检测法(Promege,Cat.No.v9102/3)进行检测。
首先将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液，然后分三次使用DMSO梯度稀释至所需要的10个浓度点，作为化合物工作液，使用生物工作站取50nL化合物工作液转移至384孔板中，另转移50nL的DMSO至空的孔中，作为阴性对照孔和阳性对照孔，以上各浓度点进行复孔操作。
配制激酶实验缓冲液(20mM HEPES,pH 7.5；0.01％Triton X-100；25mM MgCl2)，使用激酶实验缓冲液配制浓度为2倍终浓度(15nM)的ASK1激酶(eurofins,Cat.No.14-606M)溶液，作为ASK1酶工作溶液；转移2.5μL的ASK1激酶工作溶液至384孔板的各反应孔中，其中阴性对照孔以2.5μL的激酶实验缓冲液代替。混匀384孔板。
使用激酶实验缓冲液配制浓度为4倍终浓度的MBP(Active Motif,Cat.No.31314)和ATP(Sigma,Cat.No.A7699-1G，终浓度218μM)，作为底物工作溶液；转移2.5μL的底物工作溶液至384孔板的各反应孔中，混匀384孔板，启动反应。
37℃孵育60分钟后，加入5μL的ADP-Glo试剂，37℃继续孵育180分钟。孵育结束后，加入5μL的激酶检测试剂，室温平衡30分钟后，使用Envision采集相对光单位(relativelight unit，RLU)数据，将RLU值转换为百分比抑制值。抑制百分比＝(阳性对照值-样品对照值)/(阳性对照值-阴性对照值)*100。
使用Excel自带的曲线拟合工具XLFit(5.4.0.8版本)计算IC50值。
表1 测试化合物对ASK1激酶活性抑制结果
Figure BDA0003127624940000391
Figure BDA0003127624940000401
实验结果表明，本发明化合物对ASK1激酶具有很好的抑制作用；与对照化合物相比，显示出更优良的ASK1激酶抑制活性。
测试例2：化合物对α-SMA和COL1A1基因表达的抑制试验
将肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)细胞培养收集。以1×105细胞/mL密度将细胞接种至Ⅰ型胶原包被的96孔板中，每孔接种100μL。设置100μL不含细胞的培养基作为阴性对照孔。培养板在37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。过夜后，将培养板取出，更换新鲜的无血清培养基，置于培养箱继续培养4小时。
将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液，使用DMSO稀释至合适的浓度，然后使用细胞培养基稀释至所需浓度(DMSO含量不超过0.3％)，作为化合物工作液。
移除培养板的培养基，加入50μL化合物工作液，阴性对照以含DMSO的培养基代替，每个浓度三个重复。将培养板继续在37℃、5％CO2培养箱中孵育30分钟。30分钟后每孔加入50μL的20ng/mL的用培养基稀释的TGF-β溶液。化合物的终浓度为10nM和20nM。
继续培养48小时后，培养板用冷PBS洗涤细胞。每孔加入50μL按1：100稀释的DNaseI裂解液，混合5次。培养板在室温(19-25℃)下孵育5分钟。每孔加入5μL终止液，混合5次。培养板再次在室温下孵育2分钟。
在冰上按照35μL反转录混合物和15μL细胞裂解液的比例配制反转录工作液，放入PCR仪(Biometra TAdvanced 96SG)按照37℃、1小时，95℃、5分钟，4℃无限循环的程序进行实验，反应结束后将反转录产物放入-20℃保存，待进一步检测。
在湿冰上，使用
Figure BDA0003127624940000402
Gene Expression Cells-to-CTTM试剂盒配制含有GAPDH基因探针(Invitrogen，4448489)和α-SMA基因探针(Invitrogen，4331182)的实时PCR反应混合物，每种基因每样品三个重复，轻轻振摇。反应混合物放入PCR仪，根据试剂盒说明书设置程序进行反应。COL1A1基因(Invitrogen，4331182)的检测同α-SMA基因。
根据Quant Studio 5软件的默认设置自动计算CT值。使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt＝Ct(目的基因)–Ct(GAPDH)
相关基因表达＝2-ΔCt
表达倍数＝样品组2(-ΔCt)/阴性对照组2(-ΔCt)
根据目的基因的相对表达水平计算抑制率。
表2 测试化合物对α-SMA和COL1A1基因表达的抑制率
Figure BDA0003127624940000411
实验结果表明，与对照化合物相比，本发明化合物对HSC细胞的α-SMA和COL1A1基因表达具有更好的抑制作用。
测试例3：人肝微粒体稳定性试验
人肝微粒体稳定性试验采用化合物与人肝微粒体体外共孵育进行检测。首先将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液，随后使用乙腈将化合物稀释至0.5mM。使用PBS稀释人肝微粒体(Corning)成微粒体/缓冲液溶液，并使用该溶液稀释0.5mM的化合物成为工作溶液，工作溶液中化合物浓度为1.5μM，人肝微粒体浓度为0.75mg/ml。取深孔板，每孔加入30μL工作溶液，然后加入15μL预热好的6mM NADPH溶液启动反应，37℃孵育。在孵育的0、5、15、30、45分钟时，加入135μL乙腈至相应的孔中终止反应。在最后45分钟时间点用乙腈终止反应后，深孔板涡旋振动10分钟(600rpm/min)，然后离心15分钟。离心后取上清，1:1加入纯化水后进行LC-MS/MS检测，获得每个时间点化合物峰面积与内标峰面积比值，将5、15、30、45分钟时化合物的峰面积比值与0分钟时的峰面积比值进行比较，计算每个时间点化合物的剩余百分比，使用Excel计算T1/2。
表3 人肝微粒体稳定性试验结果
Figure BDA0003127624940000421
注：∞表示无穷大，代表该化合物在人肝微粒体中代谢非常少。
实验结果表明，与对照化合物相比，本发明化合物表现出更为优良的肝代谢稳定性，在人体内代谢更慢，暴露量更高。
测试例4：化合物对细胞色素P450的抑制试验
检测化合物对细胞色素P450(CYP450)亚型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4(2种底物咪达唑仑和睾酮)的抑制潜力。首先将待测化合物在DMSO溶剂中配制成10mM的储备液，CYP2C9抑制剂磺胺苯吡唑、CYP2D6抑制剂奎尼丁、CYP3A4抑制剂酮康唑分别在DMSO溶剂中配制成10mM、2.5mM、2.5mM的储备液。用乙腈将待测化合物和酮康唑稀释至400倍终浓度(化合物：10μM，酮康唑：2.5μM)，用DMSO将磺胺苯吡唑和奎尼丁稀释至400倍终浓度(磺胺苯吡唑：10μM，奎尼丁：2.5μM)。
用磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制4倍终浓度的NADPH辅因子(10mL磷酸钾缓冲液中加入66.7mg NADPH)和底物，CYP2C9底物双氯酚酸的终浓度为40μM，CYP2D6底物丁呋洛尔的终浓度为40μM，CYP3A4底物咪达唑仑终浓度为320μM，CYP3A4底物睾酮终浓度为20μM。
在冰上用磷酸钾缓冲液配制人肝微粒体溶液，浓度为0.2mg/mL。在冰上用人肝微粒体溶液配制2倍终浓度的待测化合物和对照抑制剂。向测试孔中分别加入30μL的待测化合物和对照抑制剂溶液，并加入15μL底物，进行复孔操作。在37℃下孵育96孔测定板和NADPH溶液5分钟，将15μL预热的8mM NADPH溶液添加到测定板中以启动反应。CYP2C9和CYP2D6测定板分别在37℃下预孵育10分钟，CYP3A4测定板37℃下预孵育5分钟。加入120μL乙腈终止反应，淬灭后，在振动器(IKA，MTS 2/4)上摇动平板10分钟(600rpm/min)，然后离心15分钟。离心后取上清，1:1加入纯化水后进行LC-MS/MS检测，获得化合物峰面积与内标峰面积比值，化合物的峰面积比值与对照抑制剂的峰面积比值进行比较，计算抑制率。
表4 测试化合物对CYP450酶抑制试验结果
Figure BDA0003127624940000431
实验结果表明，与对照化合物相比，本发明化合物表现出更弱的CYP450酶抑制活性，更好的成药性。

Claims (14)

1.一种化合物，其为式(I)所示化合物，或者式(I)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure FDA0003127624930000011
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自卤素、C1-C3烷基；
R1独立选自氢，无取代或任选被一个或多个Rb取代的以下基团：C1-C6烷基、C3-C6环烷基；所述Rb选自卤素、C1-C3烷基；
R2选自卤素，被卤素取代的C1-C6烷基，无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：C2-C6烷基、4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、-C(O)-NH-Rd、氧代；Rd选自氢、C1-C6烷基；优选地，所述4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基以N与X所在的芳基或杂芳基连接；
R3选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
X选自-N＝、-C(F)＝；
R1独立选自异丙基、环丙基；
R2选自无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：4元含N杂环基、哌啶基、吗啉基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、甲基、-C(O)-NH2、-C(O)-NH-CH3、氧代；
R3选自异丙基、被氟取代的异丙基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中：
R2选自
Figure FDA0003127624930000012
Figure FDA0003127624930000013
R3选自
Figure FDA0003127624930000014
4.下式所示化合物，或其互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure FDA0003127624930000021
5.一种化合物，其为式(II)所示化合物，或者式(II)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure FDA0003127624930000031
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；
R1独立选自氢，无取代或任选被一个或多个Rb取代的以下基团：C1-C6烷基、C3-C6环烷基；所述Rb选自卤素、C1-C3烷基；优选地，R1选自异丙基、环丙基；
R2选自氢，卤素，被卤素取代的C1-C6烷基，无取代或任选被一个或多个Rc取代的以下基团：C2-C6烷基、4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基；所述Rc选自氢、卤素、羟基、C1-C6烷基、-C(O)-NH-Rd、氧代；Rd选自氢、C1-C6烷基；优选地，所述4-6元含氮杂环基、7-10元含氮螺环基以N与X所在的芳基或杂芳基连接；
环A选自无取代或任选被一个或多个Re取代的以下基团：环烷基和杂环基；Re选自氟、氯、溴、C1-C3烷基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中：
X选自-N＝、-C(F)＝；
R1选自环丙基；
R2选自氢、
Figure FDA0003127624930000032
环A选自无取代或任选被一个或多个Re取代的5-6元杂环烷基。
7.根据权利要求5所述的化合物，其选自：
Figure FDA0003127624930000033
8.一种化合物，其为式(III)所示化合物，或者式(III)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure FDA0003127624930000041
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；优选地，X选自-N＝、-C(F)＝；
Y选自单键、-C(＝O)-、
Figure FDA0003127624930000042
Z选自-O-或-C(Rb)2-；每个Rb独立选自氢、卤素、C1-C3烷基；
m选自0-6的整数；
R1选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；
R2、R3、R4选自氢、卤素、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；
当Z为-C(Rb)2-时，R2还可以与Rb相连，形成环烷基或杂环烷基。
9.根据权利要求8所述的化合物，其为式(IV)所示化合物，或者式(IV)所示化合物的互变异构体、立体异构体、水合物、溶剂化物、药学可接受的盐或前药：
Figure FDA0003127624930000043
其中：
X选自-N＝、-C(Ra)＝；所述Ra选自氢、卤素、C1-C3烷基；优选地，X选自-N＝、-C(F)＝；
m选自0-6的整数；n选自0-6的整数；
R1选自氢、C1-C6烷基、被1个或多个卤素取代的C1-C6烷基；优选地，R1选自环丙基、异丙基、被1个氟取代的环丙基。
10.根据权利要求8所述的化合物，其选自：
Figure FDA0003127624930000051
11.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～10中任一项所述的化合物。
12.权利要求1～10中任一项所述化合物，或权利要求11所述的药物组合物在制备治疗与ASK1相关疾病的药物中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述的ASK1相关疾病选自心脑血管疾病、慢性肾脏疾病、肺部疾病、慢性肝脏疾病、多发性硬化症、代谢性疾病、结石、神经退行性疾病和癌症。
14.根据权利要求12所述的用途，其中所述的ASK1相关疾病选自心肌梗塞、中风、血栓、糖尿病肾病、终末肾病、肾纤维化、胆固醇结石、胆结石病、肺动脉高压、肺纤维化、慢性阻塞性肺病、急性肺损伤、脂肪肝炎、肝纤维化、胆汁酸紊乱、原发性硬化性胆管炎、糖尿病、阿尔茨海默症、帕金森症、胃癌、肝癌、息肉病、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、食管癌等过度增殖性疾病。
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