JP2015518718A - 凝乳特性が改善されたキモシン変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
− Suzuki他:部位特異的突然変異誘発によりキモシンにおけるThr218、Lys220、Asp304の機能上の寄与が明らかになる、Protein Engineering、第4巻、1990年1月、69〜71ページ;
− Suzuki他:部位特異的突然変異誘発によるキモシンの触媒特性の変化、 Protein Engineering、第2巻、1989年5月、563〜569ページ;
− van den Brink他:グリコシル化によるキモシンの生産増大、Journal of biotechnology、第125巻、2006年9月、304〜310ページ;
− Pitts他:Tricoderma reeseiの中で産生されるキモシンpH最適化突然変異体の発現とキャラクテリゼーション、Journal of biotechnology、第28巻、1993年3月、69〜83ページ;
− M.G. Williams他:ウシキモシンの点突然変異体の突然変異誘発、生化学的キャラクテリゼーション、X線構造分析、Protein engineering design and selection、第10巻、1997年9月、991〜997ページ;
− Strop他:酵素サブサイト特異性の操作:Val111phe部位が突然変異した子ウシキモシンの調製、動的キャラクテリゼーション、2.0 ANG分解能でのX線分析、Biochemistry、第29巻、1990年10月、9863〜9871ページ;
− Supannee他:凝乳活性に影響を与える子ウシキモシンBの部位特異的突然変異、Food Chemistry、第62巻、1998年6月、133〜139ページ;
− Zhang他:組み換えプロキモシンにおけるジスルフィド結合Cys45−Cys50の機能上の意味、Biochimica et biophysica acta、第1343巻、1997年12月、278〜286ページ。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に、変異として、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352、353のいずれかに対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を形成する工程と;
(b)工程(a)の変異ポリペプチドを生産して単離することにより、キモシン活性を有する単離されたキモシンポリペプチド変異体を取得する工程を含んでいて;さらに、
(i)親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され;
(ii)親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸位置59からアミノ酸位置381までに対応する成熟ポリペプチド(ウシキモシン)との配列同一性が少なくとも65%である。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異として、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352、353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち;かつ
(b)この変異体はキモシン活性を持ち;さらに、
(i)親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され;
(ii)親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸位置59からアミノ酸位置381までに対応する成熟ポリペプチド(ウシキモシン)との配列同一性が少なくとも90%であり;
(iii)この単離された変異ポリペプチドは、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)との配列同一性が100%未満である。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異として、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352、353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち;
(b)この変異体はキモシン活性を持ち;さらに、
(i)親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され;
(ii)親ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸位置59からアミノ酸位置381までに対応する成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と配列同一性が少なくとも90%であり;
(iii)この単離された変異ポリペプチドは、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)との配列同一性が100%未満である。
(一致する残基×100)/(アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの合計数)。
(一致するデオキシリボヌクレオチド×100)/(アラインメントの長さ-アラインメントにおけるギャップの合計数)。
− 本明細書の配列番号1の成熟ポリペプチドを含むウシキモシンのC/P比よりも大きなC/P比を与えるキモシン活性と;
− 本明細書の配列番号2の成熟ポリペプチドを含むラクダキモシンのC/P比よりも大きなC/P比を与えるキモシン活性
を有する変異体であることがより好ましい。
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W;
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;
Q141E+I143F
のいずれかである。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異として、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352、353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち;かつ
(b)この変異体はキモシン活性を持ち;さらに、
(i)親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され;
(ii)親ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸位置59からアミノ酸位置381までに対応する成熟ポリペプチド(ウシキモシン)との配列同一性が少なくとも90%であり;
(iii)この単離された変異ポリペプチドは、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)との配列同一性が100%未満である。
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W;
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;
Q141E+I143F
のいずれかである。
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異として、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352、353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における置換又は欠失又は挿入を含む変異を持ち;
(b)この変異体はキモシン活性を持ち;さらに、
(i)親ポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドを使用して親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列が決定され;
(ii)親ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸位置59からアミノ酸位置381までに対応する成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と配列同一性が少なくとも90%であり;
(iii)この単離された変異ポリペプチドは、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)との配列同一性が100%未満である。
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W;
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;
Q141E+I143F
のいずれかである。
ここで記載する本発明の側面及び好ましい態様は、いわゆる項目の形式で提示/記載されてもよい。以下を参照されたい。
1.
単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法であって、以下の工程:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異を形成する工程、ここで当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかに対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む;及び
(b)工程(a)の変異ポリペプチドを生産及び単離することにより、単離キモシンポリペプチド変異体を取得する工程、ここで当該変異体はキモシン活性を有する;
を含み、そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)と65%以上の配列同一性を有する;
当該方法。
2.
当該単離キモシンポリペプチド変異体が:
−配列番号1の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性;及び
−配列番号2の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性;
を有する、項目1に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
3.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む、項目1又は2に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
4.
前記変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換含む、項目1〜3のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
5.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換含む、項目1〜4のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
6.
前記置換が、117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L又は353Qである、項目4に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
7.
前記置換が、134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L又は353Qである、項目6に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
8.
前記置換が、D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、項目4に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
9.
前記置換が、H134Q、Q141E、I143F、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、項目8に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
10.
前記変異が1又は2以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I +D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、項目4に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
11.
前記親ポリペプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して75%以上の配列同一性を有する、項目1〜10のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
12.
配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して95%以上の配列同一性を有する、項目11に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
13.
前記親ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)に対して95%以上の配列同一性を有する、項目10に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
14.
項目1〜13のいずれか1項に記載の方法により生産された単離キモシンポリペプチド。
15.
単離キモシンポリペプチド変異体であって:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異を有し、当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み;且つ
(b)当該変異体がキモシン活性を有し;
ここで、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)と90%以上の配列同一性を有し;及び
(iii):当該単離変異ポリペプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して100%未満の配列同一性を有する;
当該単離キモシンポリペプチド変異体。
16.
配列番号1の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性を有する、項目15に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
17.
前記親ポリペプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して97%以上の配列同一性を有する、項目15又は16に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
18.
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して、10個未満のアミノ酸変異(例えば置換)を含む、項目15〜17のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
19.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、項目15〜18のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
20.
前記変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目15〜19のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
21.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目20に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
22.
前記置換が、117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L又は353Qである、項目20に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
23.
前記置換が、134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L又は353Qである、項目22に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
24.
前記置換が、D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、項目22に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
25.
前記変異が、1又は2以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I +D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、項目20に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
26.
単離キモシンポリペプチド変異体であって、
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置における変異を有し、ここで当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み;且つ
(b)当該変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸配列位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と90%以上の配列同一性を有し;及び
(iii):当該単離変異ポリペプチドが、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)に対して100%未満の配列同一性を有する;
当該単離キモシンポリペプチド変異体。
27.
配列番号2の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性を有する、項目26に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
28.
前記親ポリペプチドが、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と97%以上の配列同一性を有する、項目26又は27に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
29.
配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と比較して10アミノ酸未満の変異(例えば置換)を有する、項目26〜28のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
30.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における、置換、欠失又は挿入を含む、項目26〜29のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
31.
前記変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目26〜30のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
32.
前記変異が、位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及び353のいずれかに対応する1つ以上のアミノ酸位置における置換を含む、項目31に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
33.
前記置換が、117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L又は353Qである、項目31に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
34.
前記置換が、134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L又は353Qである、項目33に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
35.
前記置換が、D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、項目33に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
36.
前記置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、項目31に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
37.
食品又は飼料製品を生産する方法であって、
項目14〜36のいずれか1項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を食品又は試料成分に添加すること、及び、食品又は飼料製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含む、当該方法。
38.
前記製品が乳製品(milk−based product)であり、前記方法が、乳に項目14〜36のいずれか1項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を添加すること、及び、当該乳製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含む、項目37に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
39.
前記乳が、豆乳、又は羊、山羊、バッファロー、ヤク、リャマ、ラクダ又は牛の乳である、項目38に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
40.
前記乳製品が、発酵乳製品、クワルク(quark)又はチーズである、項目38又は39に記載の食品又は飼料製品を生産する方法。
http://www.ebi.uk/Tools/msa/clstlw2/)が提供していてLarkin M.A.、Blackshields G.、Brown N.P.、Chenna R.、McGettigan P.A.、McWilliam H.、Valentin F.、Wallace I.M.、Wilm A.、Lopez R.、Thompson J.D.、Gibson T.J.、Higgins D.G.(2007年)、Bioinformatics、第23巻(21)、2947〜2948ページに記載されているClustalWアルゴリズムを用いてキモシンタンパク質配列をアラインメントした。
強度(単位はIMCU/ml)=S基準×T基準×Dサンプル/D基準×Tサンプル
S基準:レンネットに関する国際基準の凝乳活性
T基準:基準希釈液で得られた凝固時間(単位は秒)
Dサンプル:サンプルの希釈因子
D基準:基準の希釈因子
Tサンプル:希釈したレンネット・サンプルに関し、酵素の添加から凝集までに要した凝固時間(単位は秒)。
“−”は、マイナスのアミノ酸置換を意味する。即ち“−−”は“−”よりもマイナスが大きい。
この表の右欄の説明は、個々の突然変異がウシキモシンの3D構造のどこに位置するかに関係している。ウシキモシンの3D構造は公開されている。一例として、図2に、アミノ酸位置296と294がウシキモシンのどこに存在しているかを示す。
D117N
H134Q
L280I
D156V
V241I
D325M
L311I
G309W
G309D
V279M
“−”は、マイナスのアミノ酸置換を意味する。即ち“−−”は“−”よりもマイナスが大きい。
Q300R
H350N
K353L
Q141E
I143F
Claims (15)
- 単離キモシンポリペプチド変異体を生産する方法であって、以下の工程:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異を形成する工程、ここで当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかに対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含む;及び
(b)工程(a)の変異ポリペプチドを生産及び単離することにより、単離キモシンポリペプチド変異体を取得する工程、ここで当該変異体はキモシン活性を有する;
を含み、そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)と65%以上の配列同一性を有する;
当該方法。 - 当該単離キモシンポリペプチド変異体が:
−配列番号1の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性;及び
−配列番号2の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性;
を有する、請求項1に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。 - 前記変異が1又は2以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が、134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L又は353Qである、請求項1又は2に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
- 前記置換が、H134Q、Q141E、I143F、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、請求項3に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
- 前記変異が1又は2以上のアミノ酸位置の置換を含み、当該置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I +D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。 - 前記親ポリペプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して95%以上の配列同一性を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
- 前記親ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)に対して95%以上の配列同一性を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離キモシンポリペプチド変異体の生産方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法により生産された単離キモシンポリペプチド。
- 単離キモシンポリペプチド変異体であって:
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置に変異を有し、当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み;且つ
(b)当該変異体がキモシン活性を有し;
ここで、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号1のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)と90%以上の配列同一性を有し;及び
(iii):当該単離変異ポリペプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して100%未満の配列同一性を有し;そして、
配列番号1の成熟ポリペプチドを含有するウシキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性を有する、当該単離キモシンポリペプチド変異体。 - 前記親ポリぺプチドが、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して97%以上の配列同一性を有し;かつ
前記単離されたウシキモシン変異体が、配列番号1の成熟ポリペプチド(ウシキモシン)に対して、10個未満のアミノ酸変異(例えば置換)を含む、請求項9に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。 - 前記変異が、1又は2以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が、D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L又はK353Qである、請求項9又は10に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。
- 前記変異が、1又は2以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I +D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、請求項9又は10に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。 - 単離キモシンポリペプチド変異体であって、
(a)キモシン活性を有する親ポリペプチド中の1又は2以上の位置における変異を有し、ここで当該変異が、位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及び353のいずれかの位置に対応するアミノ酸位置における、置換、欠失、又は挿入を含み;且つ
(b)当該変異体がキモシン活性を有し;
そして、
(i)前記親ポリペプチドのアミノ酸配列位置が、配列番号1のポリペプチド(ウシキモシン)と親ポリペプチドとのアラインメントにより決定され、即ち、配列番号1のポリペプチドが、親ポリペプチド中の対応するアミノ酸配列を決定するのに使用され;及び
(ii)当該親ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸位置59〜アミノ酸位置381に対応する、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)と90%以上の配列同一性を有し;及び
(iii):当該単離変異ポリペプチドが、配列番号2の成熟ポリペプチド(ラクダキモシン)に対して100%未満の配列同一性を有し;そして、
配列番号2の成熟ポリペプチドを含有するラクダキモシンのC/P比と比較してより高いC/P比をもたらすキモシン活性を有する、当該単離キモシンポリペプチド変異体。 - 前記変異が1又は2以上のアミノ酸位置における置換を含み、当該置換が:
F281V+V306I+I321L;
H134Q+I154L+D216S;
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F;
D156V+G309D+M314L+V317I;
H134Q+L280I+G309W;
R119Q+D156V+V375L;
Y79S+R119S+H204R;
Y79S+H134Q+Y365F+V375L;
Y194I+R213Q+G309D;
Y79S+D117N+I321L;
Y185F+D325M+E352Q;
Y79S+L224V+L311I;
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E;
F281V+G309W+S331Y+D337E;
D156V+G309D+M314L+V317I;
G128D+L188I+Y326F;
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M;
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F;
Q298E+Q300R;
H350N+Q352E+K353L;
D307N+D309G;又は
Q141E+I143F
である、請求項13に記載の単離キモシンポリペプチド変異体。 - 食品又は飼料製品を生産する方法であって、
請求項8〜14のいずれか1項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を食品又は試料成分に添加すること、及び、食品又は飼料製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含み;
当該製品(milk−based product)が乳製品であり、当該方法が、乳に請求項8〜14のいずれか1項に記載の有効量の単離キモシンポリペプチド変異体を添加すること、及び、当該乳製品を取得するための更なる生産工程を実施することを含み;かつ
当該乳が、豆乳、又は羊、山羊、バッファロー、ヤク、リャマ、ラクダ若しくは牛の乳であり;かつ
当該乳製品が、発酵乳製品、クワルク(quark)又はチーズである、方法。
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