UA126330C2 - Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями - Google Patents
Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями Download PDFInfo
- Publication number
- UA126330C2 UA126330C2 UAA201808552A UAA201808552A UA126330C2 UA 126330 C2 UA126330 C2 UA 126330C2 UA A201808552 A UAA201808552 A UA A201808552A UA A201808552 A UAA201808552 A UA A201808552A UA 126330 C2 UA126330 C2 UA 126330C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- chymosin
- amino acid
- polypeptide
- milk
- variant
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 369
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 366
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 366
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 title claims abstract description 309
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 299
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 title claims abstract description 296
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 59
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 55
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 127
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 claims description 116
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 111
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims description 100
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 99
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 80
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 62
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 21
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 18
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 17
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 8
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 claims description 8
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 claims description 6
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 claims description 6
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000020255 yak milk Nutrition 0.000 claims description 6
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 claims 2
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 claims 2
- 241000283725 Bos Species 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 135
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 103
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 26
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 22
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 20
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical class OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Chemical class 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005502 Aspartic proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035101 Aspartic proteases Human genes 0.000 description 1
- 241001132374 Asta Species 0.000 description 1
- 241001300938 Brya Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101150107341 RERE gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- YLBMNMLHAAOXAL-UHFFFAOYSA-N aziv Chemical compound O1C(C)=C(O)C(=O)CC1OC1C2(C)CCC3(C)C4(C)CCC5C(C)(CO)C(OC6C(C(O)C(O)C(O6)C(O)=O)OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)O)CCC5(C)C4CC=C3C2CC(C)(C)C1 YLBMNMLHAAOXAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- -1 chymosin amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000006448 coagulant property Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000001693 membrane extraction with a sorbent interface Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010001845 prepepsinogen Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- XUPZAARQDNSRJB-SJDTYFKWSA-N trans-dothiepin hydrochloride Chemical compound [Cl-].C1SC2=CC=CC=C2C(=C/CC[NH+](C)C)/C2=CC=CC=C21 XUPZAARQDNSRJB-SJDTYFKWSA-N 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940026385 zzip Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
- A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
- A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
- A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
- A23C11/106—Addition of, or treatment with, microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0326—Rennet produced by fermentation, e.g. microbial rennet; Rennet produced by genetic engineering
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C20/00—Cheese substitutes
- A23C20/02—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates
- A23C20/025—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates mainly containing proteins from pulses or oilseeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
- A23C9/1209—Proteolytic or milk coagulating enzymes, e.g. trypsine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
- A23L11/40—Pulse curds
- A23L11/45—Soy bean curds, e.g. tofu
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
- A23L11/60—Drinks from legumes, e.g. lupine drinks
- A23L11/65—Soy drinks
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
Abstract
Винахід стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями та способу його отримання.
Description
(56) Спіїріпіусо! Бираппее єї а), 5не-зресійс тшиайнопв ої са! спутовіп В м/пісй іпйцепсе тіїк-сіоціпу асіїмну / зЗГраппее Спіїріпнуо!, ОєгеКк Сооде, М. датез С.
Старь // Роса спетівігу. - 01.06.1998. - мої. 62. - по. 2. - Р. 133 - 139
Карреїег 5. НВ. еї аї, Спагасієгігайоп ої гесотбріпапі сатеї! спутовіп геуєаіз зирегіог ргорепієевз Гог Ше соадшіайоп ої роміпе ага сатеї! тіїк / Біетап В.
Карреїег, Напз (У.) М. Мап Оеп ВгіпК, Неппк
Вапрек-МівїЇзеп, 7акКагпа Раган, 7денко Ринап,
Едоп Вес Напзеп, Епіс допапзеп // Віоспетісаї апа ріорпузіса! гезеатсп соттипісайіопв. -
Асадетіс Ргезв ІМС. Опапао. - РІ, 05. 07.04.20060. - мої. 342. - по. 2. - Р. 647 - 654
АЗІ У78, ОпіРгої Ассеззіоп Мо. АЗІ У78, 01.10.2000
ІІнтернет-публікація|, пере //ламли. ипіргої. огд/ипіргої/ АЗІ 78 (знайдено 26.10.2016)
О9М1РБ, ОпіРгої Ассеззіоп Мо. О9МІ1РБ, 01.10.2000 (Інтернет-публікація|, пере //ламли. ипіргої. огоа/ипіргої/09М1РБ (знайдено 26.10.2016)
Р18276, ОпіРгої Ассеззіоп Мо. Р18276, 01.11.1990
ІІнтернет-публікація|, пере /Лимлу. ипіргої ого/ипіргоу/Р 18276 (знайдено 26.10.2016)
АЗЕ4МА, ОпіРгої Ассеззіоп Мо. АЗЕАМА, 20.03.2007 (Інтернет-публікація|,
Рере /Ллимли. ипіргої. огд/ипіргої/ АЗЕ4МА (знайдено 26.10.2016) 2 папу У. еї а)ї, Рипсіопаї ітріїсайопз ої аізиає ропа, Суз4а5-Суз5о, іп гесотбріпапі ргоспутозвіп /
МУиуїпду 2папо, Нопозпап Гі, Ниа УМи, Міспепд оп,
Міапіцап Чи, Каїуи Мапа // Віоспітіса еї Віорпузіса
АСТА. Ргоївіп взігисійге апа тоіІесшаг епгутоіоду. -
Атвіегаат, МІ.. - 05.12.1997. -моїЇ. 1343. - по. 2. -
Р. 278 - 286 (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ВИДІЛЕНОГО ВАРІАНТА ПОЛІПЕПТИДУ ХІМОЗИНУ З ПОЛІПШЕНИМИ
МОоОЛОКОЗГОРТАЛЬНИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ (57) Реферат:
Винахід стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину 3 поліпшеними молокозгортальними властивостями та способу його отримання.
Галузь техніки, до якої належить винахід
Даний винахід стосується варіантів хімозину із поліпшеними молокозгортальними властивостями.
Рівень техніки
Ферментативна коагуляція молока під дією молокозгортальних ферментів, таких, як хімозин і пепсин, являє собою один з найбільш важливих процесів при приготуванні сирів.
Ферментативна коагуляція молока являє собою двофазний процес: першу фазу, де протеолітичний фермент, хімозин або пепсин, атакує к-казеїн, що дає в результаті метастабільний стан структури казеїнових міцел, і другу фазу, де молоко згодом коагулює і утворює коагулум.
Хімозин (ЕС 3.4.23.4) і пепсин (ЕС 3.4.23.1), молокозгортальні ферменти шлунку ссавців, являють собою аспарагінпротеази, що належать до широкого класу пептидаз.
Коли вони продукуються в клітинах слизової шлунку, хімозин і пепсин існують як ферментативно неактивні пре-прохімозин і препепсиноген відповідно. Коли хімозин екскретується, М-кінцевий пептидний фрагмент, пре-фрагмент (сигнальний пептид) відщеплюється з одержанням прохімозину, що містить про-фрагмент. Прохімозин знаходиться по суті в неактивній формі ферменту, який, однак, стає активним при кислотних умовах, перетворюючись в активний хімозин за допомогою аутокаталітичного видалення про- фрагмента. Ця активація здійснюється іп мімо в порожнині шлунку при відповідних умовах рн або іп міго при кислотних умовах.
Структурні і функціональні характеристики бичачого, тобто Во5 їайги5, пре-прохімозину, прохімозину і хімозину широко досліджуються. Пре-частина молекули бичачого пре-прохімозину містить залишків 16 аа і про-частина відповідного прохімозину має довжину залишку 42 аа (амінокислоти). Активний бичачий хімозин містить 323 аа і являє собою суміш двох форм, А і В, обидві вони є активними.
Хімозин продукується в природі у деяких видів ссавців, таких, як жуйні тварини, верблюдові, кози, буйволи, вівці, свині, люди, мавпи і щури.
Бичачий хімозин є комерційно доступним для молочної промисловості протягом ряду років.
УМО 02/36752А2 (Спг. Напзеп) описує рекомбінантне продукування верблюжого хімозину.
Посилання, перераховані тут нижче, можуть в даному контексті розглядатися як посилання, які описують мутанти хімозину: - Зи2иКі еї а!: 5йе дігесівєд тиїадепевів гтемеаїв Типсійопа! сопігіршіоп ої Тнг218, Гуз220 апа
А5рЗоО4 іп спутовіп, Ргоївїп Епдіпеегіпоу, моі!.4, дапиагу 1990, радез 69-71; - 5Би2икі єї а!: АМегаїйоп ої саїа|уїс ргорепієз ої спутозіп Бу віїе-дігесієдй титадепевів, Ргоївїп
Епдіпеегіпо, мої. 2, Мау 1989, радев 563-569; - мап деп ВіїйК еї аї.: Істеазей ргодисіоп ої сПпутовзіп Бу діусовзуїайоп, дошцгтаї! ої
Біотесппоіоду, мої. 125, Зеріетбрег 2006, радез 304-310; - Рій5 еї а!: Ехрге5в5іоп апі сНагасієгігайоп ої спутовіп рН оріїта тшиїапі5 ргоодисей іп
Тісодепта геезеї, Чошгпаї ої Біотесппоіоду, мої. 28, Магсп 1993, раде5 69-83; - М. а. М/ПШатзв еї аі.: Митадепевів, Біоспетіса! спагасієгігайоп апа Х-гау вігисішга! апаїувів ої роїпі титапів ої роміпе спутозвіп, Ргоївіп епдіпеегіпу дезідп апа з5еїесійоп, мої. 10, Зеріетьег 1997, радев 991-997; - ігор єї аї).: Епдаіпеєегіпд епгуте зиЇбБ5іїе зресіїспу: ргерагаїйоп, Кіпеїйїс сНагасієгігайоп, апа х- гау апаїузіз аї 2.0 АМС гезоїшіоп ої МаШрне зйе тиїагей саїї спутозіп, Віоспетівігу, мої. 29,
Осіобег 1990, радез 9863-9871; - Зираппеє сеї аї!.: 5пе-5ресіїїс тиїайопв ої саїї спутовіп В у/лпісн іпїшепсе тіїк-сіоніпу асіїміту,
Еоса Спетівігу, мої. 62, дипе 1998, радез 133-139; - йпапа еї а: Еицпсійопа! ітріїсайоп5 ої аівийіаеє Бропа, Суз45-Сувб50, іп тесотбіпапі роспутозвзіп, Віоспітіса єї Біорпузіса асіа, мої. 1343, Оесетрбрег 1997, раде5 278-286.
Жодне з літературних посилань, розглянутих вище, не описує прямо і однозначно жодного з мутантів/варіантів хімозину, як описано/заявлено нижче в цьому документі.
Суть винаходу
Проблема, яка повинна вирішуватися за допомогою даного винаходу, полягає в одержанні варіантів хімозину із поліпшеними молокозгортальними властивостями.
Як обговорюється в робочих прикладах в цьому документі, автори даного винаходу ідентифікували ряд поліпшених варіантів верблюжого (див. приклад б в цьому документі) і бичачого (див. приклад 7 в цьому документі) хімозину.
На основі порівняльного аналізу верблюжого і бичачого варіантів автори даного винаходу ідентифікували ряд додаткових положень амінокислот, які є важливими в цьому документі в 60 тому значенні, що за допомогою одержання варіанта в одному або декількох з цих положень можна одержати поліпшений варіант хімозину (див. приклад 8 в цьому документі).
Як відомо з літератури, різні послідовності природного поліпептиду хімозину дикого типу, одержаного від різних видів ссавців (таких, наприклад, як жуйні тварини, верблюдові, вівці, свині або щури), мають відносно високу схожість/ідентичність послідовностей. На фігурі 1 в цьому документі це ілюструється за допомогою вирівнювання послідовностей релевантних для цього документа різних послідовностей хімозину.
З урахуванням цього відносно близького співвідношення послідовностей передбачається, що ЗО структури різних природних хімозинів дикого типу також є відносно схожими одна на одну.
У даному контексті одержаний природний хімозин дикого типу (такий, як бичачий хімозин або верблюжий хімозин) в цьому документі може являти собою приклад вихідного поліпептиду, тобто вихідного поліпептиду, в який вносять зміни для одержання варіанта поліпептиду хімозину за даним винаходом.
Не обмежуючись теорією, передбачається, що споріднені положення амінокислот, які обговорюються в цьому документі хімозину мають загальне значення для будь-якого релевантного для цього документа ферменту хімозину, що становить інтерес (наприклад, для хімозинів, наприклад, жуйних тварин, верблюдових, овець, свиней, щурів і т. ін.), в тому сенсі, що при одержанні варіанта в одному або декількох з цих положень можна одержати поліпшений загалом варіант хімозину (наприклад, поліпшений варіант хімозину жуйних тварин, верблюдових, овець, свиней або щурів).
Як обговорюється в цьому документі, як еталонна послідовність для визначення положення амінокислоти вихідного поліпептиду хімозину, що становить інтерес (наприклад, верблюдових, овець, жуйних тварин і т. ін.), в цьому документі використовують загальновідому послідовність пре-прохімозину бичачого хімозину В (СепрапК ассеб55іоп питрег РОО794; описано в даному документі як ЗЕО ІО МО:1).
Пре-прохімозин бичачого хімозину В ЗЕО ІЮ МО:1 може альтернативно називатися в цьому документі бичачий (Во5 ромі5) хімозин В або просто бичачий хімозин. Послідовність показана також на фігурі 1 в цьому документі.
Інша релевантна для цього документа послідовність хімозину являє собою загальновідому
Зо послідовність хімозину Сатеїїйи5 аготеадагіи5, в цьому документі ЗЕО ІЮ МО:2. Вона може альтернативно називатися в цьому документі верблюжим хімозином. Ця послідовність показана також на фігурі 1 в цьому документі.
У даному контексті вважається, що вихідний поліпептид хімозину (наприклад, від овець або щурів), який має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ
МО:1 (бичачим хімозином), може розглядатися в цьому документі як достатньо споріднений структурно, наприклад, бичачому або верблюжому хімозину, для поліпшення за допомогою одержання варіанта будь-яких з положень амінокислот, як описано в цьому документі.
Відповідно, перший аспект даного винаходу стосується способу одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину, що включає стадії: (а): здійснення змін в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (Б): продукування і виділення зміненого поліпептиду зі стадії (а) з одержанням при цьому виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де варіант має активність хімозину; іде (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (їй: вихідний поліпептид має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:1.
Як відомо з літератури, фахівець в даній галузі може, основуючись на своїх звичайних загальних знаннях, рутинним способом одержувати і очищувати хімозин і варіанти хімозину.
Кажучи іншими словами, коли фахівець в даній галузі має релевантний для даного документа вихідний поліпептид, що має активність хімозину, який становить інтерес (наприклад, від жуйних тварин, верблюдових, овець, свиней або щурів), рутинною роботою для фахівця в даній галузі є одержання варіанта такого вихідного хімозину, що становить інтерес. бо Другий аспект даного винаходу стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину,
одержаного за допомогою способу за першим аспектом, або будь-яких релевантних для цього документа його варіантів здійснення.
Термін "одержаний" відносно другого аспекту вище повинен розумітися таким чином, що виділений варіант поліпептиду хімозину одержують за допомогою способу першого аспекту або будь-яких його релевантних для цього документа варіантів здійснення.
Відповідно, термін "одержаний" відносно другого аспекту не може розумітися як той, який може, в принципі, бути одержаний.
Як обговорюється в цьому документі в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду ЗЕО ІЮО МО: 1 (бичачий) як вихідного поліпептиду; такий варіант може називатися в цьому документі варіантами бичачого хімозину.
Відповідно, третій аспект даного винаходу стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, що містить: (а): зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (р): де варіант має активність хімозину; іде (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІО МО:1; і (ії): виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачим хімозином).
Як обговорюється в цьому документі в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжого хімозину) як вихідного
Зо поліпептиду; такий варіант може в цьому документі називатися варіантом верблюжого хімозину.
Відповідно, четвертий аспект даного винаходу стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, що містить: (а): зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (р): де варіант має активність хімозину; іде (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:2; і (ії): виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:2 (верблюжим хімозином).
Виділений варіант поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, може використовуватися відповідно до літературних даних, наприклад, для приготування харчового або кормового продукту, що становить інтерес (такого, наприклад, як продукт на основі молока, який становить інтерес, який, наприклад, може являти собою сирний продукт).
Відповідно, п'ятий аспект даного винаходу стосується способу приготування харчового або кормового продукту, що включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, в харчовий або кормовий інгредієнт (інгредієнти) і здійснення додаткових стадій приготування з одержанням харчового або кормового продукту.
Варіант здійснення даного винаходу описаний нижче тільки як приклади.
Визначення
Всі визначення термінів, релевантних для цього документа, знаходяться відповідно до того, бо що розумілося б фахівцем у даній галузі відносно релевантного для цього документа технічного контексту.
Термін "хімозин" стосується ферменту класу ЕС 3.4.23.4. Хімозин має високу специфічність, і він згортає молоко за допомогою розщеплення одинарного зв'язку 105-5ег-РНе-|І-Меї-АїІа-108 в каппа-ланцюгу казеїну. Альтернативна назва, що використовується в даній галузі, являє собою "ренін".
Термін "активність хімозину" стосується активності хімозину для ферменту хімозину, як розуміється фахівцем в даному контексті.
Фахівець у даній галузі знає, як визначити релевантну для цього документа активність хімозину. У робочому прикладі 4 в цьому документі пропонується приклад стандартного способу визначення питомої активності хімозину, яка альтернативно називається активністю згортання або молокозгортальною активністю.
У робочому прикладі 5 в цьому документі пропонується приклад стандартного способу визначення протеолітичної активності.
Як відомо з літератури, релевантне для цього документа так зване співвідношення С/Р визначається за допомогою ділення питомої активності згортання (С) на протеолітичну активність (Р).
Як відомо з літератури, вище співвідношення С/Р означає, як правило, що втрати білка під час, наприклад, приготування сиру через неспецифічну деградацію білка зменшуються, тобто вихід сиру поліпшується, і що розвиток гіркого смаку у сирі під час його дозрівання зменшується.
Термін "виділений варіант" означає варіант, який модифікується руками людини. В одному з аспектів варіант є чистим щонайменше на 1 95, наприклад, чистим щонайменше на 5 95, чистим щонайменше на 10 956, чистим щонайменше на 20 95, чистим щонайменше на 40 95, чистим щонайменше на 60 95, чистим щонайменше на 80 95 і чистим щонайменше на 90 95, як визначено за допомогою 505 РАСЕ.
Термін "зрілий поліпептид" означає пептид в його кінцевій формі після трансляції і будь-яких посттрансляційних модифікацій, таких, як М-кінцевий процесинг, С-кінцевий процесинг, глікозилування, фосфорилування і т. ін. У даному контексті релевантний для цього документа зрілий поліпептид хімозину можна розглядати як активну послідовність поліпептиду хімозину, тобто без послідовностей пре-частини і/або про-частини. Релевантні для цього документа приклади зрілого поліпептиду являють собою, наприклад, зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО 1 (бичачий хімозин), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО, або зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжий хімозин), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ
МО:2.
Термін "вихідний" або "вихідний поліпептид, який має активність хімозину" означає поліпептид, в якому здійснюють зміни для одержання варіантів ферментів за даним винаходом. "Вихідний" може являти собою поліпептид, який зустрічається в природі (дикого типу), або його варіант.
Термін "ідентичність послідовності" стосується співвідношення між двома послідовностями амінокислот або між двома послідовностями нуклеотидів.
Для цілей даного винаходу рівень ідентичності послідовностей між двома послідовностями амінокислот визначають із використанням алгоритму МееаІєтап-УУШп5сп (Меедієтап апа
МуУспбсй, 1970, у). Мої. Віої. 48:443-453), як здійснюється в програмі Меєдіє пакету ЕМВО55 (ЕМВО55: Тне Еигореап Моїіеєсшіаг Віоосду Ореп боїймаге 5ийе, Вісе еї а!., 2000, Ттепаз Сепвеїі. 16:276-277), переважно версії 3.0.0 або пізнішої. Необов'язкові використовувані параметри являють собою штраф за внесення делеції у вирівнюванні 10, штраф за продовження делеції 0,5 і підстановкову матрицю ЕВ О5ИОМб2 (ЕМВО55 мегзіоп ої ВГОБОМб2). Результат Мееаіе, що відмічається як "найбільш широка ідентичність" (одержана з використанням опції -побгієї) використовують як процент ідентичності і обчислюють таким чином: (Ідентичні залишки х 100)//довжина вирівнювання послідовностей - загальна кількість розривів при вирівнюванні послідовностей).
Для цілей даного винаходу рівень ідентичності послідовності між двома послідовностями дезоксирибонуклеотидів визначають з використанням алгоритму Меедіетап-УУипв5сй (Меедіетап і УМУсп5сп, 1970, вище), як здійснюється для програми Меедіє з пакету ЕМВО55 (ЕМВО55: Тпе Еигореап МоїІесшаг Віоїсду Ореп БЗойумаге Зийе, Кісе еї аїЇ., 2000, вище), переважно версії 3.0.0 або пізнішої. Використовувані необов'язкові параметри являють собою штраф за внесення делеції у вирівнювання 10, штраф за продовження делеції 0,5 і підстановкову матрицю ЕОМАРИОЇ С (ЕМВО55 мегзіоп ої МСВІ МОСА.4). Вихідні дані Мееайе, що відмічаються як "найбільш широка ідентичність" (одержана з використанням опції -побргієї), бо використовують як процент ідентичності і обчислюють таким чином:
(Ідентичні дезоксирибонуклеотиди х 100)/довжина вирівнювання послідовностей - загальна кількість розривів при вирівнюванні послідовностей).
Термін "варіант" означає пептид, що має активність хімозину, що містить зміну, наприклад, заміщення, інсерцію, і/або делецію, в одному або декількох положеннях. «Заміщення» означає заміну амінокислоти, яка займає деяке положення, іншою амінокислотою; "делеція" означає видалення амінокислоти, що займає деяке положення; і «інсерція» означає додавання 1-3 амінокислот поруч з амінокислотою, що займає деяке положення.
Амінокислота може являти собою природні або штучні амінокислоти, наприклад, заміщенні, наприклад, зокрема, ЮО-ізомерами (або Ю-формами), наприклад, Ю-аланіну могло би бути можливим теоретично.
Термін "пептид хімозину дикого типу" означає хімозин, який експресується організмом, що зустрічається в природі, наприклад, ссавцем (наприклад, верблюдицею або коровою), що зустрічається в природі.
Креслення
Фігура 1: вирівнювання релевантних для цього документа різних послідовностей хімозину.
Показаний "Во5 ромі5 спутовзіп В" в цьому документі являє собою бичачий хімозин 5ЕО І
МО:1, і показаний "Сатеїц5 аготеаагіиє" в цьому документі являє собою верблюжий хімозин
ЗЕО ІЮО МО:2. Використовуючи бичачий хімозин ЗЕО ІЮО МО:1 як еталонну послідовність, як описано в цьому документі, можна, наприклад, побачити, що бичачий хімозин має "М" в положенні 10, а верблюжий хімозин має "А" в цьому ж положенні 10. Можна, наприклад, також побачити, що жуйні тварини/щури мають "О" в положенні 352, а верблюд/С. Басігпапи5 має "Е" в тому ж положенні 352.
Відносно послідовностей хімозину, показаних на фігурі 1, вівця має 94,5 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1; С. расіпапи5 має 83,2 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1; СатеїЇн5 аготедаги5 (верблюжий хімозин 5ЕО ІЮ МО:2) має 84 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІЮ
МО:1; свиня має 80,3 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІЮ МО-1, їі щур має 71,9 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1.
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, релевантні для цього документа проценти ідентичності послідовностей для послідовностей зрілих поліпептидів, наприклад, для хімозину вівці, С. расігіапих, верблюда, свині або щура зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином, тобто положення амінокислот від 59 до 381 5ЕО ІЮ МО:1), є відносно схожими з розглянутими вище процентами ідентичності послідовностей.
Фігура 2: ЗО структура бичачого хімозину. ЗО структура є загальнодоступною. Як приклад показано, де саме в бичачому хімозині присутні положення амінокислот 296 і 294.
Докладний опис винаходу
Визначення положення амінокислот хімозину, що становить інтерес
Як обговорюється вище, як еталонну послідовність для визначення положення амінокислоти релевантного для цього документа поліпептиду хімозину, що становить інтерес (наприклад, верблюда, вівці, жуйних тварин і т. ін-), в цьому документі використовують загальновідому послідовність бичачого хімозину, описану в цьому документі як ЗХЕО ІЮ МО:1.
Для цілей даного винаходу поліпептид, описаний як 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), використовують для визначення відповідного залишку амінокислоти в іншому поліпептиді хімозину. Послідовність амінокислот іншого поліпептиду хімозину вирівнюється з поліпептидом, описаним як ЗЕО ІЮ МО:1, ії на основі вирівнювання послідовностей визначають кількість положень амінокислот, відповідних будь-якому залишку амінокислоти в поліпептиді, описаному як ЗЕО ІЮ МО, з використанням алгоритму СіиетамуУ, як описано в робочому прикладі 1 в цьому документі.
Ідентифікація відповідного залишку амінокислоти в іншому поліпептиді хімозину може бути підтверджена з використанням алгоритму МееаІєтап-Умип5сп (Меєаіетап і УМипзсп, 1970, 5.
Мої. Віої. 48:443-453), як здійснюється в програмі Меєдіє з пакету ЕМВО55 (ЕМВО55: Те
Ейгтореап Моїесшіаг Віоїсду Ореп боймаге Зиїйе, Вісе єї аі., 2000, Ттепаз Сепеї. 16:276-277), переважно версії 3.0.0 або пізнішої.
Основуючись на наведених вище добре відомих комп'ютерних програмах, для фахівця в даній галузі є рутинною роботою визначення положення амінокислоти релевантного для цього документа поліпептиду хімозину, що становить інтерес (наприклад, верблюда, вівці, жуйних тварин і т. ін.).
На фігурі 1 в цьому документі показаний приклад вирівнювання послідовностей.
Тільки як приклад на фігурі 1 можна, наприклад, побачити, що еталонна бичача бо послідовність зБЕО ІЮ МО, що використовується в цьому документі, має "с" в положенні 50, і послідовність "Сатеїи5 аготедагив" (ЗЕБЕО ІЮ МО:2 в цьому документі) має "А" в цьому ж положенні 50.
Номенклатура варіантів
При описі варіантів даного винаходу номенклатура, описана нижче, адаптується для простоти згадування. Використовують прийняті ІШРАС однобуквені або трибуквені скорочені найменування амінокислот.
Конкретні варіанти, які обговорюються в даному розділі "номенклатура" нижче, можуть не являти собою релевантні для цього документа варіанти даного винаходу, тобто розділ "номенклатура" призначений просто для опису релевантної для цього документа використовуваної номенклатури як такої.
Заміщення. Для заміщення амінокислот використовують наступну номенклатуру: вихідна амінокислота, положення, заміщена амінокислота. Відповідно, теоретичне заміщення треоніну аланіном у положенні 226 позначається як "Тпг226бАїа" або "Т226А". Множина мутацій розділяються знаками плюс ("-"), наприклад, "СІу205Агд ж Зег411Р пе" або "5205 я 54111", що являє собою заміщення в положеннях 205 і 411 гліцину (С) аргініном (К) і серином (5) з фенілаланіном (Е) відповідно. Заміщення, позначене, наприклад, "226А", стосується заміщення вихідної амінокислоти (наприклад, Т, 0, З або іншої вихідної амінокислоти) аланіном в положенні 226.
Делеції. Для делецій амінокислоти використовують наступну номенклатуру: вихідна амінокислота, положення, ". Відповідно, делеція гліцину в положенні 195 позначається як "СІУЮ5"" або "51957". Множина делецій розділяються за допомогою знаків плюс ("я"), наприклад, "СІуУ95" ж Бег4117" або "51957 - 5411",
Інсерції. Для інсерції амінокислоти використовують наступну номенклатуру: вихідна амінокислота, положення, вихідна амінокислота, вставлена амінокислота. Відповідно, інсерція лізину після гліцину в положенні 195 позначається як "СІую5сїуув5" або "51950К". Інсерція множини амінокислот позначається (вихідна амінокислота, положення, вихідна амінокислота, вставлена амінокислота Мо 1, вставлена амінокислота Мо 2 і т. ін.). Наприклад, інсерція лізину і аланіну після гліцину в положенні 195 позначається "СІу95Сс1уузАїа" або "51950 КА".
У таких випадках вставлені залишки амінокислоти нумеруються за допомогою додавання
Зо малих букв у номер положення залишку амінокислоти перед вставленим залишком (залишками) амінокислоти. У вказаному вище прикладі, таким чином, послідовність повинна являти собою:
Множинні зміни. Варіанти, що містять множинні зміни, розділяються за допомогою знаків плюс (73): наприклад, "Аго!Ї7ОТуг-сїІую95сбІи" або "К170у-5195Е" являє собою заміщення тирозину і глутамінової кислоти замість аргініну і гліцину в положеннях 170 і 195 відповідно.
Різні заміщення. Коли в деякі положення можуть вводитися різні заміщення, ці різні заміщення розділяються комою: наприклад, "Аг917ОТуг, Сі" або "К170У, Е" представляє заміщення аргініну тирозином або глутаміновою кислотою в положенні 170. Таким чином, "Туг167С1у, АІа ї- Ага17001у, АІа" або "У1670, АїК1700, А" означає наступні варіанти: "Туг167с1ІухАго170СІу", "Тугп167СІукАго17 Аа", "Туг167АЇІатАгоа17001у" і "Тут1167АїЇІа-Ага17оАЇїа".
Спосіб одержання виділеного варіанта поліпептиду хімозину
Як обговорюється вище, як відомо в даній галузі, фахівець на основі своїх звичайних загальних знань може рутинно одержати і очистити хімозин і варіанти хімозину.
Кажучи іншими словами, після того як фахівець в даній галузі буде мати релевантний для цього документа вихідний поліпептид, що має активність хімозину, що становить інтерес (наприклад, жуйних тваринних, верблюдових, овець, свиней або щурів), для фахівця у даній галузі є рутинною роботою одержання варіанта такого вихідного хімозину, що становить інтерес.
Приклад способу, придатного для використання при одержанні і виділенні хімозину (варіанта або вихідного), може являти собою добре відому технологію, наприклад, технологію на основі грибкового рекомбінантного експресування/продукування, як описано, наприклад, в
МО 02/36752А2 (Снг. Напзеп).
Для фахівця в даній галузі також є рутинною роботою здійснення змін в одному або декількох положеннях у вихідному поліпептиді, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти.
Як відомо фахівцеві в даній галузі, це можна зробити, наприклад, за допомогою так званого сайт-направленого мутагенезу і технології на основі рекомбінантного експресування/продукування.
Також рутинною роботою для фахівця в даній галузі є визначення того, чи має релевантний для цього документа вихідний поліпептид (наприклад, верблюжий або бичачий хімозин дикого типу) і/або релевантний для цього документа варіант активність хімозину або ні.
Як відомо з літератури, активність хімозину може бути визначена за допомогою так званого співвідношення С/Р, яке визначається за допомогою ділення питомої активності згортання (С) на протеолітичну активність (Р).
Як відомо з літератури, вище співвідношення С/Р означає, як правило, що втрати білка протягом, наприклад, приготування сиру через неспецифічну деградацію білка зменшуються, тобто вихід сиру покращується, і що розвиток гіркого смаку в сирі під час дозрівання зменшується.
У робочому прикладі 4 в цьому документі описується відповідний спосіб для визначення питомої активності згортання (С), а в робочому прикладі 5 в цьому документі описується відповідний спосіб визначення протеолітичної активності (Р).
Переважно виділений варіант поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, являє собою варіант, де варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р, порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид з послідовністю 5ЕО ІЮ
МО:1, в цьому документі.
Переважно виділений варіант поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, являє собою варіант, де варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид з послідовністю
ЗЕО ІЮО МО:2, в цьому документі.
Переважніше виділений варіант поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, являє собою варіант, де варіант має: - активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1, в цьому документі; і - активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид з послідовністю 5ЕО ІЮ МО:2, в цьому документі.
Як обговорюється вище, як еталонну послідовність для визначення положення амінокислоти релевантного для цього документа поліпептиду хімозину, що становить інтерес (наприклад, верблюдових, овець, жуйних тварин і т. ін.), в цьому документі використовують загальновідому послідовність бичачого хімозину, описану в цьому документі як ЗХЕО ІЮ МО:1.
Як обговорюється вище, основуючись, наприклад, на комп'ютерних програмах вирівнювання послідовностей для послідовностей, що обговорюються в цьому документі, для фахівця в даній галузі є рутинною роботою визначення положення амінокислоти, релевантної для цього документа поліпептиду хімозину, релевантного для цього документа, що становить інтерес (наприклад, верблюдових, овець, жуйних тварин і т. ін.).
Термін "вихідний поліпептид має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: 1 (бичачий хімозин)", наприклад, способу першого аспекту, в даному документі може розглядатися як такий, що стосується обмеження на основі послідовності вихідного поліпептиду хімозину, що використовується для одержання його варіанта, релевантного для цього документа.
Кажучи іншими словами, зрілий вихідний поліпептид хімозину (наприклад, вівці або свині), який має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим бичачим хімозином, як вважається, є достатньо структурно ідентичним, наприклад, бичачому або верблюжому хімозину, щоб бути релевантним для цього документа, тобто в даному контексті вважається, що зрілий вихідний поліпептид хімозину (наприклад, від вівці або щура), який має щонайменше 65
Фо ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), може розглядатися в цьому документі як достатньо структурно споріднений, наприклад, бичачому або верблюжому хімозину, щоб його можна було поліпшувати за допомогою одержання варіанта в будь-якому положенні амінокислот, як описано в цьому документі.
Поліпептид верблюжого хімозину ЗЕО ІЮ МО:2 має 84 95 ідентичність послідовностей з бичачим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (тобто з повною послідовністю 5ЕО ІЮ МО 1 від положення 1 до 381, яка включає пре- і про-послідовність).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі, в даному контексті релевантний для цього документа 60 вихідний поліпептид, що має активність хімозину, може вже являти собою, наприклад, варіант,
наприклад, відповідного хімозину дикого типу.
Наприклад, варіант верблюжого хімозину, наприклад, із 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями), порівняно з поліпептидом верблюжого хімозину дикого типу 5ЕО ІЮ МО2 як і раніше буде вихідним поліпептидом, який має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі Зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим), як потрібно, наприклад, в першому аспекті в цьому документі.
Кажучи іншими словами, релевантний для цього документа виділений варіант поліпептиду хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в положенні іншому, ніж положення, наприклад, першого аспекту в цьому документі.
Відносно послідовностей хімозину, показаних на фігурі 1 в цьому документі, вівця має 94,5
Фо ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІО МО:1; С. расіпапих5 має 83,2 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю ЗЕО ІЮ МО:1; свиня має 80,3 95 ідентичність послідовностей з бичачою послідовністю 5ЕБО І МО:1, і щур має 71,9 965 ідентичність послідовності з бичачою послідовністю ЗЕО 1ІЮ МО:1.
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, релевантні для цього документа проценти ідентичності послідовностей, наприклад, зрілого хімозину вівці, С. Басігіапив, верблюда, свині або щурів зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО (бичачим хімозином; тобто положення 59-381 амінокислот 5ЕО ІО МО:1) є відносно подібними розглянутим вище процентам ідентичності послідовностей.
Переважні варіанти
Як обговорюється вище, наприклад, перший аспект стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353.
Переважний варіант здійснення стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Може бути переважним, щоб щонайменше одна зміна являла собою заміщення, тобто релевантний для цього документа переважний варіант здійснення стосується виділеного
Зо варіанта поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353.
Переважно виділений варіант поліпептиду хімозину являє собою варіант, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141Е, 143Б, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, зООВ, 3070, 3090, ЗО9М, 3111, З25М, З5ОМ, 3521, 3520, 353І або 3530.
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, якщо вихідний поліпептид хімозину вже має, наприклад, "М" в положенні 156, тоді немає значення говорити про здійснення заміщення 156М для цього конкретного вихідного поліпептиду хімозину. Як можна побачити на фігурі 1 в цьому документі, хімозин щура дикого типу має "М" в положенні 156; заміщення 156 може розглядатися в цьому документі як ірелевантне для конкретної послідовності поліпептиду хімозину щура на фігурі 1.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 1340), 141Е, 143Е, 2801, 281МУ, 298Е, ЗО0ОВ, 3070, 3090, ЗО9МУ, 3111, 3521, 3520, 3531 або 3530.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 0117М,
НІ340, О141Е, І14З3Е, 0156М, М241І, М279М, І1280І, гГ281М, 0298Е, ОЗ00В, М3070, 3090,
СЗООМУ, І 3111, 0325М, НЗБОМ, 03521, ЕЗ52І, ЕЗ352О, КЗ53І або К3530.
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, якщо вихідний поліпептид хімозину не має, наприклад, "ОО" в положенні 156, тоді немає значення говорити про здійснення заміщення 0156М для цього конкретного вихідного поліпептиду хімозину. Як можна побачити на фігурі 1 в цьому документі, хімозин щура дикого типу має "М" в положенні 156; заміщення 0156 може, отже, розглядатися в цьому документі як ірелевантне для конкретної послідовності поліпептиду хімозину щура на фігурі 1.
У переважному варіанті здійснення заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою НІ340, О141Е, 1143, 12801, г281У, О298Е, ОЗ0ОВ, М3070, 13090, ЗОМ, І 3111,
О352І., Е352І., Е3520, КЗ53І. або К3530).
У переважному варіанті здійснення заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення 60 являє собою:
Е281М 4 МЗО6І -- ІЗ2ТІ;
НІ340 4 1541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 СЗО9МУ 4 1 3111 4 326; р15б6мМ 4 23090 4 М314Ї -- М3171;
НІ1340 4 12801 4 ЗО9МУ;
В1190 - 0156М 4 М375І ;
У795 -- 81195 -- НгО48В;
У795 -- Н 1340 - УЗ65Е я М375І;
У1941 4 2130 - 3090;
У795--0117М - ІЗ2ТІ ;
МУ185Е 4 0325М - ЕЗ352О);
У795 4 1 224М 41 3111; 5132Е 4 НІ340 4 М200І 4 М215І. я с221Е;
Е281М 4 аЗО09Му - 5331 - 0337Е; р15б6мМ 4 23090 4 М314Ї -- М3171; сет1280 411881 - М326Б;
В1195 4 М2411 412801 - 3111 -0325М;
В1190 - 52841 -- 2975 4 М306І - СЗО9МУ
К279М - М281нЕ;
О298Е - ОЗООВ;
НЗБОМ 4 0352Е -- КЗ5ЗІ; 0307М - 03090 або
О141 Е --. 1143Б.
Переважний вихідний поліпептид, що має активність хімозину
Переважно вихідний поліпептид має щонайменше 70 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 75 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином).
Просто як приклад відповідний, релевантний для цього документа, вихідний поліпептид може являти собою, наприклад, бичачий хімозин А, як відомо в даній галузі, бичачий хімозин А може мати тільки єдину відмінність в амінокислотах порівняно з бичачим хімозином В ЗЕО ІЮ
МО/:1 в цьому документі.
Як обговорюється вище в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачого) як вихідного поліпептиду; такий варіант може називатися в цьому документі "варіантами бичачого хімозину".
Відповідно, в переважному варіанті здійснення вихідний поліпептид має щонайменше 90 905 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), і ще більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином). Може бути переважним, щоб вихідний поліпептид являв собою зрілий поліпептид
ЗЕО ІЮ МО 1 (бичачий хімозин).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, релевантний для цього документа вихідний поліпептид, що має активність хімозину, може вже являти собою, наприклад, варіант, наприклад, відповідного хімозину дикого типу.
Наприклад, варіант бичачого хімозину, наприклад, із 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями) порівняно зі зрілим поліпептидом бичачого хімозину дикого типу 5ЕО ІЮ МО:1 як і раніше буде являти собою вихідний поліпептид, який має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачим хімозином).
БО Зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий) має 323 амінокислоти в довжину відповідно, варіант бичачого хімозину, наприклад, із 25 заміщеннями амінокислот порівняно зі зрілим поліпептидом бичачого хімозину дикого типу ЗЕО ІЮ МО:1 не буде являти собою вихідний поліпептид, який має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом
ЗЕО ІЮ МО 1 (бичачим хімозином).
Кажучи іншими словами, і загалом релевантний для цього документа виділений варіант поліпептиду хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в положеннях інших, ніж положення, наприклад, першого аспекту в цьому документі.
Як обговорюється вище в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:С2 (верблюжого) як вихідного поліпептиду; такий варіант бо може називатися в цьому документі варіантом верблюжого хімозину.
Відповідно, в переважному варіанті здійснення вихідний поліпептид має щонайменше 90 905 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), і ще більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином). Може бути переважним, щоб вихідний поліпептид являв собою зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжий хімозин).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, вихідний поліпептид, який має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО І МО2 (верблюжим), як і раніше знаходиться в межах вимог ідентичності послідовностей відносно 5ЕО
ІО МО:1 (бичачому) пункту (ії) першого аспекту в цьому документі; тобто він буде являти собою вихідний поліпептид, який має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІО МО:1 (бичачим хімозином).
Виділений варіант бичачого хімозину
Як обговорюється вище в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду ЗЕО ІЮО МО:1 (бичачого) як вихідного поліпептиду; такий варіант може називатися в цьому документі «варіантом бичачого хімозину».
Як обговорюється вище, третій аспект, відповідно, стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, що містить: (а); зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (р): де варіант має активність хімозину; і де (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот в вихідному поліпептиді; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІО МО:1; і (ії): виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачим хімозином).
Описані вище визначення і переважні варіанти здійснення є також релевантними для цього аспекту.
Переважно виділений варіант поліпептиду бичачого хімозину, як описано в цьому документі, являє собою варіант, де варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ
МО:1.
У переважному варіанті здійснення вихідний поліпептид має щонайменше 92 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачим хімозином), більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом
ЗЕО ІЮ МО 1 (бичачим хімозином), і ще більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, виділений варіант хімозину може містити зміни (наприклад, заміщення) в положеннях амінокислот інших, ніж наведено вище.
Наприклад, варіант бичачого хімозину, наприклад, із 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями) порівняно з поліпептидом бичачого хімозину дикого типу 5ЕО ІЮ МО:1 буде, як і раніше, являти собою вихідний поліпептид, який має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІО МО:1 (бичачим хімозином).
Може бути переважним, щоб виділений варіант бичачого хімозину містив менше 30 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений варіант бичачого хімозину містив менше 20 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений варіант бичачого хімозину містив менше 10 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО
ІО МОЛ (бичачим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений варіант бичачого хімозину містив менше 5 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим 60 поліпептидом 5ЕО ІО МО:1 (бичачим хімозином).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, термін "виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ
МО:1 (бичачим хімозином)" пункту (ії) вище стосується того, що описаний в цьому документі виділений варіант бичачого хімозину, зрозуміло, не повинен містити послідовність поліпептидів, яка є на 100 95 ідентичною загальновідомій послідовності бичачого хімозину дикого типу ЗЕО ІЮ
МО:1.
Переважний варіант здійснення стосується виділеного варіанта поліпептиду бичачого хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Може бути переважним, щоб щонайменше одна зміна являла собою заміщення, тобто релевантний для цього документа переважний варіант здійснення стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353.
Переважно виділений варіант поліпептиду хімозину являє собою варіант, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141Е, 143Б, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, зООВ, 3070, 3090, ЗО9М, 3111, З25М, З5ОМ, 3521, 3520, 353І або 3530.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 1340), 141Е, 143БЕ, 2801, 281МУ, 298Е, ЗООК, 3070, 3090, ЗО9МУ, 3111, 3521, 3520, 3531 або 3530).
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 0117М,
НІ340, О141Е, І14ЗЕ, 0156М, М241І, М279М, І1280І, Б281М, 0298Е, ОЗ00В, М3070, с3090,
СЗО9МУ, І 3111, 0325М, НЗ5БОМ, 93521, ЕЗ352І, Е3520О, КЗ53І або К3530.
У переважному варіанті здійснення заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою:
Е281М - МЗОбІ з ІЗ;
Коо) НІ1340 - 11541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 309 я І 3111 - У326Е; р1і1Б56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171;
Н1340 - 12801 4 309;
В1190 - 0156М - 3751;
У795 - 81195 -- Н2гО4в;
У795 - НІ340 я УЗ365Е - М375І;
У1941 4 82130 - 23090;
У795 - 0117 з ІЗАТІ ;
У185Е «4 0325М -- ЕЗ52О;
У795 - 1224М 1 3111;
З132Е 4 НІ340 я М200І 4 М215І - с221Е;
Е281М 4 2З309МУ - 5331 - 0337Е; р1і1Б56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171; сет1280 11881 - У326Е; 81195 4 М241І 412801 я І 3111 4 0325М; 81190 я 5284 «4 Т2975 - М30О6І 4 ЯЗО9Му
К279М - М281нК;
О298Е - ОЗООВ;
НЗ5БОМ 4 О9352Е - КЗ5ЗІ ; рз307М - 03090; або
ОСТАТЕ 4 1143Б.
Виділений варіант верблюжого хімозину
Як обговорюється вище в робочих прикладах в цьому документі, одержують варіанти з використанням поліпептиду ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином) як вихідного поліпептиду; такий варіант може називатися в цьому документі "варіантом верблюжого хімозину".
Як обговорюється вище, четвертий аспект, відповідно, стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, що містить: (а); зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї 60 амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281,
298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (р): де варіант має активність хімозину; і де (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮО МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:2 (верблюжим хімозином); і (ії): виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином).
Описані вище визначення і переважні варіанти здійснення є також релевантними для цього аспекту.
Переважно виділений варіант поліпептиду верблюжого хімозину, як описано в цьому документі, являє собою варіант, де варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО:2.
У переважному варіанті здійснення вихідний поліпептид має щонайменше 92 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом
ЗЕБЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), і ще більш переважно вихідний поліпептид має щонайменше 97 905 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕБЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, виділений варіант «хімозин» може містити зміни (наприклад, заміщення) в положеннях амінокислот інших, ніж наведено вище.
Наприклад, варіант верблюжого хімозину, наприклад, із 5-10 змінами (наприклад, заміщеннями) порівняно з поліпептидом верблюжого хімозину дикого типу ЗЕО ІЮО МО:2 буде, як і раніше, являти собою вихідний поліпептид, який має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином).
Зо Може бути переважним, щоб виділений варіант верблюжого хімозину містив менше 30 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений варіант верблюжого хімозину містив менше 20 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ
МО:2 (верблюжим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений верблюжий варіант хімозину містив менше 10 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), або може бути переважним, щоб виділений варіант верблюжого хімозину містив менше 5 змін амінокислот (наприклад, заміщень) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином).
Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в даному контексті, термін "виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ
МО:2 (верблюжим хімозином)" пункту (ії) вище стосується того, що описаний в цьому документі виділений варіант верблюжого хімозину, зрозуміло, не повинен містити послідовність поліпептидів, яка є на 100 95 ідентичною загальновідомій послідовності верблюжого хімозину дикого типу ЗЕО ІЮ МО:2.
Переважний варіант здійснення стосується виділеного варіанта поліпептиду верблюжого хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Може бути переважним, щоб щонайменше одна зміна являла собою заміщення, тобто релевантний для цього документа переважний варіант здійснення стосується виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353.
Переважно виділений варіант поліпептиду хімозину, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353.
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141Е, 143Б, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, зООВ, 3070, 3090, ЗО9М, 3111, З25М, З5ОМ, 3521, 3520, 353І або 3530. 60 Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 1340), 141Е,
143БЕ, 2801, 281МУ, 298Е, ЗООК, 3070, 3090, ЗО9МУ, 3111, 3521, 3520, 3531 або 3530).
Переважно заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою 0117М,
НІ340, О141Е, І14З3Е, 0156М, М241І, М279М, І1280І, гГ281М, 0298Е, ОЗ00В, М3070, 3090,
СІЗО9МУ, 3111, 0325М, НЗ5БОМ, 93521, ЕЗ352І, Е3520, КЗ53І або К3530.
У переважному варіанті здійснення заміщення являє собою таке заміщення, де заміщення являє собою:
Е281М - МЗОбІ з ІЗ;
НІ1340 - 11541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 309 я І 3111 - У326Е; р1і1Б56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171;
Н1340 - 12801 4 309;
В1190 - 0156М - 3751;
У795 - 81195 -- Н2гО4в;
У795 - НІ340 я УЗ365Е - М375І;
У1941 4 82130 - 23090;
У795 - 0117 з ІЗАТІ ;
У185Е «4 0325М -- ЕЗ52О;
У795 - 1224М 1 3111;
З 132Е 4 НІ340 4 М200І 4 М215І я с221Е;
Е281М 4 ЗО9МУ - 5331 - 0337Е; р1і1Б56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171; сет1280 11881 - У326Е; 81195 4 М241І 412801 я 1 311І -0325М; 81190 я 5284 «4 Т2975 - М30О6І 4 ЯЗО9Му
К279М - М281нК;
О298Е - ОЗ0ОВ;
НЗ5БОМ 4 О9352Е - КЗ5ЗІ ; рз307М - 03090; або
ОСТАТЕ 4 1143Б.
Зо Спосіб приготування продукту на основі молока
Як обговорюється вище, виділений варіант поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, може використовуватися відповідно до літератури, наприклад, для приготування продукту на основі молока, що становить інтерес (такого, наприклад, як сирний продукт).
Як обговорюється вище, один з аспектів даного винаходу стосується способу одержання харчового або кормового продукту, що включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, в харчові або кормові інгредієнти і здійснення додаткових стадій приготування з одержанням харчового або кормового продукту.
Переважно харчовий або кормовий продукт являє собою продукт на основі молока, і спосіб включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину, як описано в цьому документі, в молоко і здійснення додаткових стадій приготування з одержанням продукту на основі молока.
Молоко може, наприклад, являти собою соєве молоко, овече молоко, козяче молоко, буйволяче молоко, молоко яка, молоко лами, верблюже молоко або коров'яче молоко.
Продукт на основі молока може являти собою, наприклад, ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
Аспекти/варіанти здійснення в цьому документі представлені в форматі формули винаходу
Описані в цьому документі аспекти і переважні варіанти здійснення даного винаходу можуть бути представлені/описані в так званому форматі формули винаходу; це продемонстровано нижче. 1. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину, що включає стадії: (а): здійснення зміни в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 3521 353: і (Б): продукування і виділення зміненого поліпептиду зі стадії (а) і з одержанням при цьому виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де варіант має активність хімозину; і де (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто 60 поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 65 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:1. 2. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 1, де виділений варіант поліпептиду хімозину має: - активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1; і - активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:2. 3. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 4. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353. 5. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх пунктів, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 6. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 4, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141Е, 143, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, ЗО0Р, 3070, 3090, ЗО9МУ, 3111, 325М, З5ОМ, 3521, 3520, 353І. або 3530. 7. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 6, де заміщення являє собою 1340), 141Е, 143Р, 2801, 281М, 298Е, З0О0Р, 3070, 3090, З09МУ, 3111, 3521, 3520, 353. або 3530). 8. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 4, де заміщення являє собою 0117М, НІ1І340, О141Е, І143Е, 0Б156М, М241І, М279М, 1280І, Б281М, О298Е, ОЗОН,
Зо М3070, 53090, СЗО9МУ, І 3111, 0325М, НЗ5БОМ, 03521, Е352І, Е3520, КЗ3531 або К3530. 9. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 8, де заміщення являє собою НІ340, О0141Е, І14З3Е, 1280І, РГ281М, О0298Е, ОЗО00ОВ, М3070, 3090, СЗО9МУ, І 3111, 03521, Е352І, Е3520, КЗ353ІЇ або К3530. 10. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 4, де заміщення являє собою:
Е281М -- МЗОбІ - ІЗ21І;
НІ340 4 1541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 СЗО9МУ 4 1 3111 - 326; р15б6мМ 4 23090 4 М314Ї -- М3171;
НІ1340 4 12801 4 ЗО9МУ;
В1190 - 0156М 4 М375І ;
У795 -- 81195 - Н2гО48;
У795 -- НІЗ340 4 УЗ365Е 4 УЗ375І;
У1941 4 2130 - 3090;
У795 4. 0117М 4 ІЗ2ТІ;
МХ185Е 4 0325М -- ЕЗ352О;
У795 4 1224М 41 3111; 5132Е 4 НІ340 4 М200І 4 М215І. я с221Е;
Е281М 4 аЗО09Му - 5331 - 0337Е; р15б6мМ 4 23090 4 М314Ї -- М3171; сет1280 411881 - М326Б;
В1195 4 М2411 412801 4. І 3111 -0325М;
В1190 -- 52841 4 Т2975 -- М3О6І 4 ЯЗО9МУ
К279М я М281Б1;
О298Е - ОЗООВ;
НЗБОМ 4 0352Е -- КЗ5ЗІ; 0р307М - 03090; або
ОАЕ 4 1143Б. 11. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за будь-яким з попередніх 60 пунктів, де вихідний поліпептид має щонайменше 75 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІО МО:1 (бичачим хімозином). 12. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за п. 11, де вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ
МО:1 (бичачим хімозином). 13. Спосіб одержання варіанта виділеного поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 1-10, де вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом
ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:2. 14. Виділений варіант поліпептиду хімозину, одержаний способом за будь-яким з пп. 1-13. 15. Виділений варіант поліпептиду хімозину, що містить: (а): зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (Б): де варіант має активність хімозину; іде (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (її: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:1; і (ії): виділений варіант поліпептиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачим хімозином). 16. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 15, де виділений варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО:1. 17. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 15-16, де вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО 1 (бичачим хімозином). 18. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 15-17, де виділений варіант бичачого хімозину містить менше 10 змін амінокислот (наприклад, заміщення) порівняно зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО 1 (бичачим хімозином). 19. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 15-18, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 20. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 15-19, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353. 21. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 20, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 22. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 20, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141 Е, 143БЕ, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, ЗО, 3070, 3090, З0О9МУ, 3111, 325М, З5ОМ, 3521, 3520, 353Ї або 3530. 23. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 22, де заміщення являє собою 1340), 141
Е, 143Е, 2801, 281М, 298Е, ЗООБ, 3070, 3090, З09ММ, 3111, 3521, 3520, 353ІЇ. або 3530. 24. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 22, де заміщення являє собою 0117М,
НІ340, О141Е, І14З3Е, 0156М, М241І, М279М, 1280І, г281М, 0О298Е, ОЗО00В, М3070, 3090,
ЗОМ, 3111, 0325М, НЗБОМ, 03521, Е352І, ЕЗ3520О, КЗ53І. або К3530. 25. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 20, де заміщення являє собою:
Е281М -- МЗОбІ - ІЗ21І;
НІ340 4 1541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 СЗО9ММ 4 1 3111 - У326Е; 0156М 4 23090 4 МЗ314ї. 4 М3171;
НІ1340 4 12801 4 ЗО9МУ;
В1190 -- 0156М - М375І;
У795 -- 81195 - Н2гО48; бо У795 -- НІЗ340 4 УЗ365Е 4 УЗ375І;
У1941 4 2130 - 3090;
У795 4. 0117М 4 ІЗ2ТІ;
МХ185Е 4 0325М -- ЕЗ352О;
У795 4 1224М 41 3111; 5З132Е 4 НІ340 4 М200І 4 М215І я с221Е;
Е281М 4 аЗО09Му - 5331 - 0337Е; р15б6мМ 4 23090 4 М314Ї -- М3171; сет1280 411881 - М326Б;
В1195 - М2411 412801 4 1 3111 4 0325М;
В1190 -- 52841 4 Т2975 -- М3О6І 4 ЯЗО9МУ
К279М я М281Б1;
О298Е - ОЗООВ;
НЗБОМ 4 0352Е -- КЗ5ЗІ; 0307М - 03096; або
ОАЕ 4 1143Б. 26. Виділений варіант поліпептиду хімозину, що містить: (а): зміну в одному або декількох положеннях вихідного поліпептиду, що має активність хімозину, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353; і (р): де варіант має активність хімозину; іде (): положення амінокислоти вихідного поліпептиду визначають за допомогою вирівнювання послідовностей вихідного поліпептиду з поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:1 (бичачим хімозином), тобто поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1 використовують для визначення відповідної послідовності амінокислот у вихідному поліпептиді,; і (їй: вихідний поліпептид має щонайменше 90 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином), який містить амінокислоти від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:2; і (ії): виділений варіант поліпептгиду має менше ніж 100 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином). 27. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 26, де виділений варіант має активність хімозину, що дає вище співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮ МО:2. 28. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 26-27, де вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовностей зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином). 29. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 26-28, де виділений варіант верблюжого хімозину містить менше 10 змін амінокислот (наприклад, заміщення) порівняно зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжим хімозином). 30. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 26-29, де зміна включає заміщення, делецію або інсерцію в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 31. Виділений варіант поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 26-30, де зміна включає заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 і 353. 32. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 31, де зміна містить заміщення в положенні щонайменше однієї амінокислоти, відповідному будь-якому з положень 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 і 353. 33. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 31, де заміщення являє собою 117М, 1340, 141Е, 143, 156М, 2411, 279М, 2801, 281М, 298Е, ЗО0ОВ, 3070, 3090, ЗО9МУ, 3111, З325М, ЗБОМ, 3521, 3520, 353Ї або 3530. 34. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 33, де заміщення являє собою 1340), 141Е, 143Е, 2801, 281М, 298Е, ЗООБ, 3070, 3090, З09ММУ, 3111, 3521, 3520, 353Ї або 3530). 35. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 33, де заміщення являє собою 0117М,
НІ340, О1А41Е, І14З3Е, 0156М, М241І, М279М, 1280І, г281М, 0298Е, ОЗ00В, М3070, 3090,
СЗО9МУ, 3111, 0325М, НЗБОМ, 03521, Е352І, ЕЗ520О, КЗ53їЇ. або К3530. 36. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 31, де заміщення являє собою:
Е281М 4 МЗО6І -- ІЗ2ТІ; бо НІ340 4 1541 4 02165;
М261А 4 М263І 4 309 я І 3111 - У326Е; р1і1Б56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171;
НІ1340 - 12801 - аСЗО9МУ;
В1190 - 0156М - 3751;
У795 - 81195 -- Н2гО4в;
У795 - НІ340 я УЗ365Е - М375І;
У1941 4 82130 - 23090;
У795 - 0117 з ІЗАТІ ;
У185Е «4 0325М -- ЕЗ52О;
У795 - 1224М 1 3111;
З132Е 4 НІ340 я М200І 4 М215І - с221Е;
Е281М 4 2З309МУ - 5331 - 0337Е; р1іБ56мМ 4 43090 4 МЗ3141. я М3171; сет1280 11881 - У326Е; 81195 4 М241І 412801 я І 3111 4 0325М; 81190 я 5284 «4 Т2975 - М30О6І 4 ЯЗО9Му
К279М - М281нК;
О298Е - ОЗ0ОВ;
НЗ5БОМ 4 О9352Е - КЗ5ЗІ ; рз307М - 03095 або
ОСТАТЕ 4 1143Б. 37. Спосіб приготування харчового або кормового продукту, що включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-36 в харчовий або кормовий інгредієнт (інгредієнти) і здійснення додаткових стадій приготування з одержанням харчового або кормового продукту. 38. Спосіб приготування харчового або кормового продукту за п. 37, де продукт являє собою продукт на основі молока і де спосіб включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за будь-яким з пп. 14-36 в молоко і здійснення додаткових стадій приготування з одержанням продукту на основі молока.
Зо 39. Спосіб приготування продукту на основі молока за п. 38, де молоко являє собою соєве молоко, овече молоко, козяче молоко, буйволяче молоко, молоко яка, молоко лами, верблюже молоко або коров'яче молоко. 40. Спосіб приготування продукту на основі молока за будь-яким з пп. 38-39, де продукт на основі молока являє собою ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
Приклади
Приклад 1
Вирівнювання і нумерація послідовностей білків хімозину і послідовностей варіантів
Послідовності білків хімозину поєднуються з використанням алгоритму СіиеїаіМУ, як передбачається ЕВІ (ЕВІ, інструменти, множинне вирівнювання послідовностей, "СІ ОЗТАЇ МУ", пЕру//лммли.ебі.ас.ик/Гооі5/тза/сіивіам/2/) і як описано в І агкіп М.А, ВіІаск5Ппієїй5 (с, Вгом/п М.Р,
Спеппа К, МссСейідап Р.А, МсУміат Н, МаІепііп Е, УмаїІасе І.М, Уміт А, Горе? К, Тпотрзоп 9.0, сірзоп Т./, Ніддіпв О.С (2007). Віо-іпіогтаїйсв 23(21), 2947-2948.
Налаштування СіІибіаїмМ/2 для множинного вирівнювання послідовностей, для послідовностей, являють собою Ргоїеіп уеідні Маїйїх - ВІОБОМ, САР ореп - 10, САР
ЕХТЕМ5ІОМ - 0,05, ЩАР ОІЗТАМСЕ - 8, Мо Епа Сарзо, ІТЕВАТІОМ - попе, МОМІТЕВ - 1,
СГО5ТЕВІМа - МУ
Як еталонну послідовність для бичачого хімозину В використовують пре-прохімозин (сСеп- рапк ассеззіоп питрег РОО794 описується в цьому документі як ХЕО ІЮ МО:1), де М-кінцевий метіонін має номер 1 (МЕСІ....) ї де С-кінцевий ізолейцин (в послідовності білка ...| АКАЇ) має номер 381. Варіанти поєднуються порівняно з бичачим пре-прохімозином В, і залишки нумеруються відповідно до відповідного залишку бичачого хімозину.
Приклад 2
Конструювання варіантів хімозину
Варіанти хімозину конструюють із використанням різних стратегій.
Коли тут згадується верблюжий хімозин, тут згадується верблюжий хімозин, що містить поліпептиди 5ЕО ІО МО:2 в цьому документі.
Верблюжий хімозин ЗЕО ІЮ МО:2 можна розглядати як релевантний для цього документа вихідний поліпептид, що має активність хімозину, що використовується для одержання його варіантів верблюжого хімозину. 60 Коли тут згадується бичачий хімозин, тут згадується бичачий хімозин, що містить поліпептид
ЗЕО ІО МО:1 в цьому документі.
Бичачий хімозин 5ЕО ОО МО:1 можна розглядати як релевантний для цього документа вихідний поліпептид, що має активність хімозину, що використовується для одержання його варіантів бичачого хімозину в цьому документі.
Варіанти верблюжого хімозину конструюють на основі вирівнювання послідовностей великої множини загальновідомих послідовностей аспарагінпротеази, що мають ідентичність 25 95 або більше, порівняно з бичачим хімозином В.
Зміни, як правило, вводяться у гіперваріабельних областях, в той час як консервативні області не змінюються. Множину змін вводять в кожний конструкт варіанта, забезпечуючи те, що кожна окрема мутація присутня у множині конструктів варіантів (відносно обговорення результатів - див. приклад 6 нижче).
Варіанти бичачого хімозину конструюють на основі порівняння бичачого і верблюжого хімозину. Бичачі залишки, наприклад, змінюють на відповідні їм верблюжі залишки (відносно обговорення результатів - див. приклад 7 нижче).
Приклад З
Приготування ферментативного матеріалу для варіантів хімозину
Всі варіанти хімозину синтезують як синтетичні гени і клонують в грибковий вектор експресії, відповідний в основному РАМ ркК-С (описаний в МО 02/36752А2).
Вектори трансформують в Е. Соїї, і плазміду ДНК очищують з використанням стандартних протоколів молекулярної біології, відомих фахівцям в даній галузі.
Плазміди варіантів індивідуально трансформують у штам Аврегойи5 підег, і білок продукують в основному, як описано в М/О 02/36752А2, і очищують з використанням стандартних хроматографічних методик.
Як відомо з літератури, фахівець в даній галузі може основуватися на цих загальнодоступних загальних знаннях; продукують і очищують хімозин і варіанти хімозину, такі, як описані в цьому документі варіанти бичачого і верблюжого хімозину.
Приклад 4
Визначення питомої активності хімозину 4.1 Визначення активності згортання
Зо Молокозгортальну активність визначають із використанням методу КЕМСАТ, який являє собою стандартний метод, розроблений Іпіегпайопа! Оаїгу Редегайоп (метод ОБ).
Молокозгортальну активність визначають за часом, необхідним для видимої флокуляції стандартного субстрату молока, одержаного з порошку знежиреного молока низькотемпературного сушіння за допомогою розчину хлориду кальцію, 0,5 г на літр (рНе-б,5).
Час згортання для зразка сичужного ферменту порівнюють згодом для еталонного стандарту, що має відому молокозгортальну активність і що має таку ж композицію ферментів згідно з ІЮЄЕ зіапдага 1108, як зразок. Зразки і еталонні стандарти вимірюють при ідентичних хімічних і фізичних умовах. Зразки варіантів доводять приблизно до З ІМСО/мл з використанням 84 мМ буфера на основі оцтової кислоти, рН 5,5. Потім 200 мкл ферменту додають до 10 мл попередньо нагрітого молока (32 С) в скляній пробірці, вміщеній на водяну баню, здатну підтримувати постійну температуру 32:11 "С, при постійному перемішуванні.
Загальну молокозгортальну активність (міцність) сичужного ферменту обчислюють в
Іптегпайопа! МІіїК-Сіойіпд Опії5 (ІМС) на мл відносно стандарту, що має таку ж композицію ферментів, як зразок, відповідно до формули:
Міцність в ІМСО/мл - З5іападага х Теїапаага х Озатріє реїапаага х Тзатріє сичужного ферменту ферменту від додавання ферменту до часу флокуляції 4.2 Визначення загального вмісту білка
Загальний вміст білка визначають із використанням Ріегсе ВСА Ргоївіп Аззау Кії від Тпегто
Зсіепійіс, слідуючи інструкціям виробника. 4.3 Обчислення питомої активності згортання
Питому активність згортання (ІМСОМ/мг білка загалом) визначають за допомогою розподілу активності згортання (ІМСИО/мл) на загальний вміст білка (мг білка загалом на мл).
Приклад 5
Визначення протеолітичної активності
Загальну протеолітичну активність вимірюють із використанням флуоресцентно міченого казеїну Водіру-РЇ як субстрата (Еп;Спек; МоїІесшіаг Віоргоре5, Еб638). Похідні казеїну, сильно мічені рН-нечутливим зеленим-флуоресцентним Водадіру-РІ, дають в результаті майже повне гасіння флуоресценції кон'югату. Гідроліз, який каталізується протеазою, вивільняє флуоресцентний Водіру-РЇ. Цей спосіб є дуже чутливим, що є головним для цього експерименту, оскільки СНУМАХ М має найнижчу загальну протеолітичну активність з усіх коагулянтів, відомих до теперішнього часу.
Аналіз здійснюють в 0,2 М фосфатному буфері, доведеному до бажаного значення рн, при кінцевій концентрації субстрат 0,04 мг/мл. Перед змішуванням 1 частини субстрату з 1 частиною ферменту обидві готують у фосфатному буфері, всі варіанти ферментів нормують на 50
ІМСОШ/мл (відповідно до прикладу 4). Субстрат і фермент змішують в 96-ямкових планшетах для мікротитрування Мипс БіІйого, герметизують і інкубують при 32 "С протягом 60 хв. Після інкубування герметизацію знімають і флуоресценцію реєструють на флуориметрі.
Приклад 6
Оцінка варіантів верблюжого хімозину
Для всіх варіантів питому активність згортання (ІМСО/мг білка загалом) визначають при рн 6,5 відповідно до прикладу 4. Варіанти ранкірують з використанням наступної стратегії. Варіант з найнижчою питомою активністю дає один пункт, другий знизу дає два пункти, і так далі.
Таку ж стратегію ранкірування здійснюють для співвідношення С/Р. Співвідношення С/Р визначають для всіх варіантів при рН 6,5 за допомогою ділення питомої активності згортання (ІМС И/мг) на протеолітичну активність.
Визначають загальну кількість пунктів для кожного варіанта з використанням обох стратегій ранкірування, і кінцеве ранкірування здійснюють на основі суми пунктів.
Як еталон включені верблюжий ген дикого типу і бичачий ген дикого типу.
НОо5-3 42453 Б281М Мм3061 13211. х х 213 5601-14 42419 нНІЗАО 11541 02165 Ух х 210 с010-2 42492 МУ261А М2631 сЗ09М 13111 У326Е 204 дО9-2 42478 0156М 053090 0 М314Ї М317И1 х 203
ЕО1-1 42416 НІЗ4О 12801 ОЗ09М хх х 200 003-2 42436 К1190 0156М УМУЗ375|Ї х х 197 во6-2 42455 Ж У795 К1195 Й Щ Н2О0Я4К х х 195 во9-2 42479 У795 НІЗА4О УЗ М3751Ї х 194 002-1 42427 У1941 К2130 03090 ж х х 194 с-504-1 42444 У795 О0117М 13211 х х 193 нОо2-1 42428 хМ1855 0325М ЕЗ3520 х х 189
А04-2 42438 У795 ІЇ224М 13111 х х 186
НІО-2 42493 5132РЕ НІЗ40О0 М2001 М2151 (0221Е 186
НОо8-1 42477 г281М О309М/ 53317 0О33/Е х 185
АОЗО-2 42478 0р156М 03090 М314Ї УМ317И1 х 184
НО1ІЇ-1 42420 01280 11881 326 х х 182 с911-1 42500 КІ1195 2 УМ24А11 2801 Г3111 разом 181
НІ1-2 42501 КІ190 52841 12975 УМ3061І сзО09М 178
Верблюд 42404 х х х х х 174 с508-2 42476 024А6Е 03090 53298 033УЕ х 174 с506-1 42460 0156М М2151 М2411 х х 170 нО-1 42485 КІ1І1250 01288 Н2045 0246Е 52847 168
НО7-2 42469 0117М М2631 12801 М3061 х 167
ЕО6-2 42458 01280 12445 13111 х х 151 сСо3-2 42431 Мм90 11541 5335М х х 148 в07-1 42463 М1941 М279М 12801 52841 х 147
АО03-2 42429 хМ1855 К2130 0246Е х х 146
Е05-2 42450 0117М 5329Р 73425 Х х 145
НОоб-2 42461 0128М К3125 5313 УЗ2бР х 145 вВ03-2 42430 К1250 М279М М314Ї х х 143
В10-1 42487 02165 1224М М2631 г281мМ о3090 143
Р01-1 42417 мМм90І К1190 Нг204К х х 143
ЕО3-3 42433 НІЗ40 К289М 03020 х х 142
АО2-2 42421 11541 0221Е М279М х х 136 07-2 42467 12975 13211 0325М 13425 х 135
С11-2 42496 01280 11541 1258М 0325М 0337Е 132 ро2-1 42424 М261А 5331 1353К х х 132 до4-2 42438 У795 Г224М 13111 х х 131
В01-1 42413 МІОВ8К 12801 53137 юю х х 131 012-1 42506 5190А М279М 5313У 5331 Мм375І 130 дО9-2 42478 0156Мм 03090 М314Ї УМ3171 х 129 г09-1 42483 МмОо0 Е3520О кК3741Ї М375Ї х 129
В12-1 42504 МІОВК 0117М М2151Ї М3141Ї с3475 128 011-141 42497 0156уМ нН2г204К М261А 13211 5329рР 128 го6-2 42459 0117М М261А К3125 Х х 125
НІ2-1 42502 МО І1881 22030 12801 р337Е 124 рої4-2 42441 11881 0221Е УЗ65Б х х 123
Е07-2 42466 КІ1190 М279К К?289М 0325М х 123
Со2-2 42423 В1195 ВК1250 2 К289М х х 122 ро5-1 42449 К1195 1224М 712975 Х х 122
Со8-1 42472 Б281М К289М 13111 53135 юю х 117 802-1 42422 5132Р 5180А К2030О0 х х 115
Термін "Х" означає відсутність змін, тобто відсутність мутації.
Оскільки всі варіанти включають множину мутацій, дані за ранкірованими варіантами досліджують детальніше з використанням статистичних методів і ЗО структурного аналізу для визначення індивідуальних змін амінокислот, які мають позитивний або негативний вплив. У цьому дослідженні також оцінюються/включаються бичачі варіанти, що обговорюються в прикладі 7, нижче.
Ідентифікуються наступні мутації:
ВІН Основний сегмент
С НВЯЮ 00000001 Відкритий сегмент
ОВО 00000001 У заглибленні
ОО ВІБУ 00000000 Основний 0000 Бе,
ВАМ 00 ж Основний 83741 -- Основний к2гво9М -- Загнутий край з іншого боку
У279К -- В заглибленні азо2го -- Загнутий край
С 353К - Вхід у заглиблення
ВЕ 00000001 -- Нижня частина заглиблення
БМ 00000000 я Зовнішніймалий сегмент 00000000
У279М ни
Термін "-" стосується позитивної зміни амінокислоти, тобто "ї-- є більш позитивним, ніж "ж".
Термін "-" стосується негативної зміни амінокислоти, тобто "--" є більш негативним, ніж "-".
Описи в правому стовпчику таблиці стосуються того, де саме знаходяться індивідуальні мутації в ЗО структурі бичачого хімозину. ЗО структура бичачого хімозину є загальнодоступною.
Як приклад на фігурі 2 показано, де саме положення 296 і 294 амінокислот присутні в бичачому хімозині.
Висновки
Наведені вище результати демонструють, що наступні мутації у верблюжому хімозині є позитивними (тобто поліпшують співвідношення С/Р порівняно з верблюжим хімозином дикого типу): р117М
НІз40
І 2801 р1і156у
УгАІ рзгомМ
ІГЗ111
ЗОМ сезо090
У279М
Приклад 7
Оцінка варіантів бичачого хімозину
Варіанти бичачого хімозину оцінюють на основі їх співвідношення С/Р тільки при рн 6,5. у Ци | п | ле верблюжий активність згортання/мг 7.6 | назбомоз52Е, КкзБа | 706417 | 7191777 118 1777 | оз07морзояя | 777 56,6949,.777..ЙДГ/.|...юЮюЮю4ї7 шюик: ові 78 фомЕ лаз 7/7 90 17777111117677777 118 ін 00100101 3327 Немає 124,237 157 1,3
Пій НРУ НИ НО БРЯ (АО1) Немає 53,354 197 3,7
Оскільки всі варіанти включають множину мутацій, то і дані ранкірованих варіантів досліджують детальніше з використанням статистичних методів і ЗО структурного аналізу, для визначення індивідуальних змін амінокислот, які мають позитивний або негативний вплив. У цьому дослідженні також оцінюються/включаються верблюжі варіанти, що обговорюються в прикладі 6.
Ідентифікують наступні позитивні мутації бичачого хімозину: 5 Ши
Ан о ше 0: ШЕ
Термін "к" стосується позитивної зміни амінокислоти, тобто "ї-- є більш позитивним, ніж "ж".
Термін "-" стосується негативної зміни амінокислоти, тобто "--" є більш негативним, ніж "-".
Висновки
Наведені вище результати демонструють, що наступні мутації в бичачому хімозині є позитивними (тобто поліпшують співвідношення С/Р порівняно з бичачим хімозином дикого типу):
Оз
НЗБОоМ
КЗ5ЗІ.
СТА1Е 143
Приклад 8
Положення для одержання позитивної мутації в хімозині
Порівняльна оцінка результатів, описаних в прикладах 6 і 7, дає в результаті наступні дані.
Ділянка каталітичного заглиблення 279-281
Як показано в прикладі 7, подвійна мутація К279М ії М281Е в бичачому хімозині дає в результаті негативний вплив на співвідношення С/Р. У верблюжому хімозині мутація М279К також дає в результаті негативний результат (приклад 6). Отже, можна зробити висновок, що оптимальна амінокислота в положенні 281 являє собою У. Спостерігається також, що мутація 2801 у верблюда має позитивний вплив.
Ділянка малого сегмента 298-300
Як показано в прикладі 7, подвійна мутація О298Е і ОЗ00ОК в бичачому хімозині має позитивний вплив на співвідношення С/Р.
Ділянка каталітичного заглиблення 350-353
Як показано в прикладі 7, потрійна мутація НЗ5ОМ, О352Е і КЗ353І. в бичачому хімозині має позитивний вплив на співвідношення С/Р.
У верблюжому хімозині спостерігають (приклад 6), що 3530) має позитивний вплив, в той час як Г353К має негативний вплив.
Ділянка малого сегмента 307-311
Зо Як показано в прикладі 7, подвійна мутація Ю307М і 03090 в бичачому хімозині має негативний вплив на співвідношення С/Р.
У верблюжому хімозині 53090 і З309УМ мають позитивний вплив. Це означає, що мутація 0307М в бичачому хімозині є відповідальною за негативний вплив. У верблюжому хімозині мутація І 3111Ї, як показано, має позитивні впливи.
Ділянка основного сегмента 134-143
Як показано в прикладі 7, подвійна мутація 2141ЄЕ і І143Е в бичачому хімозині має позитивний вплив на співвідношення С/Р.
Зміна Н134 в О у верблюжому хімозині, як показано, має корисний вплив аю 1 10 (Ф) тла п в 1711119 з» 10000019 нити но о я 1
Джерела інформації: 1: УМО 02/36752А2 (Спг. Напзеп) 2: ЗМи2 Кі єї аіІ: 5йе дігесієй титадепевів гемеаї!5 Шпсійопа! сопігіршіоп ої ТНг218, І уз220 апа А5ріО4 іп спутозвіп, Ргоївїп Епдіпеегіпа, мої. 4, дапиагу 1990, радез 69-71.
З: Зи2икі єї а!.: АМегаїйоп ої саїа|уїйс ргорепієв ої спутовіп Бу віїе-дігесієд титадепевів, Ргоївїп
Епдіпеегіпо, мої. 2, Мау 1989, радез 563-569. 4: мап деп ВіїпК еї аїЇ.: Іпстеазей ргодисіоп ої спутовзіп ру діусозуїайоп, уошк паї! ої
Біотесппоіоду, мої. 125, Зеріетбрег 2006, радез 304-310. 5: РІН5 еї а!: Ехргезвіоп апа сНагасієгігайоп ої спутовіп рН оріїта тшиїапібє ргодиседй іп
Тісодепта геезеї, Чошгпаї ої Біотесппо!оду, мої. 28, Магсп 1993, радез 69-83. 6: М. а. М/ПШіатв єї аі-: Митадепезів, Біоснетісаї сНнагасієгіганоп апа Х-гау зігисішга! апапувзів ої роїпі тиїапів ої роміпе спутовіп, Ргоїєїп епдіпеегіпа де 5ідп апа зеїесійоп, мої. 10, Зеріетрег 1997, радез 991-997. 7: з Мор еї а).: Епдіпеегіпд епгуте з5ибрзіїе 5ресіїісну: ргерагайоп, Кіпеїїс сНаг асієгігайоп, апа х-тау апаїузів аї 2.0 АМаї гезоїшіоп ої МашШрне 5ійе тшиїаїеа саїї спутовіп, Віоспетівігу, мої. 29,
Осіобрег 1990, радез 9863-9871. 8: Бираппее єї а|.: Зпе-5ресіїйс тиїайопв ої саїї спутозіп В уллісн іпїнепсе тіїк-сіоціпа асіїмпу,
Еоса Спетівігу, мої. 62, дипе 1998, радез 133-139. 9: йНапду єї аї: Еицпсійопа! ітріїсайоп5 ої адівийіае Бропа, Суз45-Сувб5О0, іп тесотрбріпапі роспутозіп, Віоспітіса єї Біорпузіса асіа, мої. 1343, Оесетрбег 1997, радез 278-286.
СИС ЛОСЛІДОВЕОСТЕЙ
«1ї10з Спо Напзев В; «180» БАРБІВДНЕМ КІМОВМИНУ З ПЮПІПВЕННМИ МОЛОКОБГОВтТАЛЬНИМИ ВЛАСТМВОСТеМНи «130» РЕБЕЗРСОЮ х«1а40п» г «їіт7оз БібвБВАР 1.8 «вій ЕЕ «еІ11з вві «Вій Білак ««віЗз Всв бвикце «ЕЕ «еЕ1з ДЖЕРЕНО «вай» Ю.О ЗБЕ «ЕЕ бтип молекули" білоюк" осрганішвшне"Бовз Бацпцштцав" «апа
Ме дта Св Бех Чаї Уві Ббем Го дів Уві ББе дів Бе бек біп бі і Ек) їй 15
Віва зі, І1ве п Ата Ті бїхЗз Гео ТУук о був Бі Був бетї Бей Вк Буч о 5 5 вів Бен Бу85 Бій пів бі їеч Гей біс В5б БЕБЕ беч бів був біп обі
Кз 40 ав
ТУух Бі Ті дех веІ Бує ТУух Бех бі ВББе 551 біз Маї віз бдех Чаї во 5 ва
Еко Бай ТУ Вп оТУух Ген о бяр Бех бій; Жук РББе бів Ббсте Х1е ЖвЕ Тев та ТЕ 85 бі Твх РкЕо бхос бів біс Бе ТБ Уві Без РБеє Абе ТБІ бі Бех Бах
Б ща 25 вАвЕш ЮКе Ттв Уві Вухо йет Ізе Тух Су Був ет Бап о А'їв Ст Був дек
За 105 їі15 пів Зі: дкц Бе бо Бхб Бк бух Бек бек ТБЕ Ба о біп йвп о бей 5-53 115 їй 125
БПув Вхо Бе бек Ті Яіє ТУух Зі Так бік Бек Ме зЗіп піУу Хі Пец 14й їз І-ї
Бі Тех Ав Так Чаї Так Хаї Бех дав Хі Уві Ам І1е бів бін ТЕ 155 155 155 їЕЗ
Чаї 5-3 вв обех Тв бів Бі бЕо біт вйвр очуві ЕБе ТБІ Тк вів Бій їк5 ї1т9 ї75
Епе вче іт КХ1ів Бец бі Меб діа Тук Вхо бек без Аза Бвк осіб Тут ї5о 185 із бек її» Ркса Зві ББе йвр оба Ме Кв Асп дкд о Нія Гей Уві Аз зів 135 ОО 2055
АБ Ба Ре бех Маї ТУук МеБб Аза дк Аза о біт Біл 5ій Бек Меб Ге кажи 715 го
ТпЕ їн біс Вів Ті Вар о бкхо БбвІ ТУук ЖХУх ТБЕ бі Ббвтх Бецп Ні ТКко
Б Зо гяБ тай чі Рхс Уві Жах Уві бів Бі Те Ткхробіп БЕБе ТБх Уаї деп о бек Уаї та5 5 255
Тпх о т1зіе бетх Бі Уаї Ч8-в1 Ма)їі діва Сує СбІз 51 бі Су біз дід Із ай а што
БГецз Ав ТвЕ Зі Тьж бек Був Ге; о Зві іч Бко бвх беж дав лів Бе та 8 ак
Вп о ТтТ3Зе Сів Зіп Аза Ті б3У іа Тпк о біп вВев о біп Тух бі 16 ЗБа зб Ва зо
Аве Ізі2 бвв осСжв зо б5пв об Бек Тут Меб Ехо Тпх о бтві Уві бе бів зав 818 ЗІ зе
І1е Ап опіу був Меб Тут Еко їв; Тк о бжо бек Ві5 Тух Тк бех бів
ЗБ зи за
БАявЕ -ірв сі Ба Су ТБкЕ Бех 1 ЕБпе біп бек СЕМ Аяп лів Шви іп 843 45 ЗБ
Був Ттв тів бесп 53Уу АвБр оХаї Бе Ті вхц бін ЖЕ Туїт дет Уві БвББе за а зве
АвБЕ дж Вів Бзп йяв Бер ові Бі Бееб; ВлЕ Гоє АвБд о ї3зе
ЗО зт во хЕїйв г «ії 351 «шій» Білою «ід» Свшеійе Ягомаесйвкітя «ВД «вгші» ДЖЕРЕЛО соши»м її. .ЗвІ «Іа» гитип молекмлис біла"
Ісбганізм-"Сащеіїня бйхошейакінва" «пом
Меб дк бує Бва Маї Чаї Бена їбей; Бі азів їМеос АкБ Ган бек бія Біа 1 5 15 15 век 5іт ті Жвх Ак Іі Бхо бви Чі Був Сі бує ТВБХх Пес ВкЕс Був га 25 Ка
БВЕ1в Ген Бе 15 Атеразі Без бец о їхій Вчю Бе бен сіп ВЕЩш бік осіб за 42 З
Тух Аза бві бех Бех їГме Тух Бех бак бе; Бі був Мах Аза хе ші
ВО Б в
БЕхо Без ТБк о бех Тух Беб; вАврвобех бід Ту Бе о Біу їде Ті Тух ІЗ
ЕВ то тв ях біу Тв Еко бБкхб бів обі Впе ТБ обві таї ББе вБ5воїБпх біб Бех БвЕ а 5
Аве їн ТЕБ Уві Бжхо бек Бї3е Тух Стуг Без дет аАзпоУаї Пує ЯУув Вяв ї2по 155 116
Ні нів БкЕд Рпе дз Рхо Вт бує бек бек ТБЕ Спа» йте дев оБбец біс 115 ЕФ 125
Тж5 о Вко Бен о бех Ті Ніє ЖЕ бі Так Сім бек Мебсб бій Зі Вде Гех їі30 335 ї155
Зі» Ттх взв тТвх Маї Тіт Уаії бек Авв о їїе баї Азов ро Ва біп ТБ 135 158 155 ЇМ
Уві бів Бес бек Тк обі: біп Вус їі бів Уві Рпє ТВБх Тук о бек зів 1ЕБ Іа І
ЕБЕпе йчзр Бі Те їзи; 51 Бех Віз Тут Ето бек Бей АвБа бек біб Тех
Ії8О ї85 135
Бек Уваї Рка Уві Бве й5р Ач) Ме Кеж Ар вк Бі Бай Уві 815 дк 155 лу Б
Жаею їз ЕББе Бех Уві Тк Маб Ази йхо Ачп о біт Сіпосіу Ббвк Меб їй щіВ т15 Ей тах опе Бі Взіа Ії ввр Вко Бех ТчЕ Тут ТБтІ іш Бех Бен» онів Їх -Е5 ще 235 гай
Уві ро баї ТпЕх Ббецп обів бів Тух ТЕр сія ЕБЕБе ТЖТпУ Уаї вав о бех Маї та За 255
Тпх Іза» дБв обі баї Вів Уві віз був Уві Біт Ес Су ів Атд Т3є
БУ їв тв
ТГез йев ТвЕ Сі Тпх бек Маї Гей Ба бі Рез бвк Бех Азв ліве їз; шт БО ЕЕ
Туз Іза біп Мер Аха 118 5315 діва Так бі дв ойжа Тухїх сі зій ББе вер о УВА бат о сСуя СІіУ бат бецп Бо Звке Ме Єко тйх ТВі Уві Бде вл
Тіз Аввозі Ажхт Авю о Тух Ехо Бец бек Ехо Бек В1Е Тух Тк Бех Буг вЗаю щжітп сі Жде УхвО Бак дех д5і Епе Зіп о пл ВЕ: деп обаеп дек тій
Гео їх їі їз о зіч Вер о Заі Бе тів Ахо пі Тех ТУуї Зех Зві Бе йжшт деко вів БВ Аве вит Уві Зіу Бе: Вів ГПож Вів Її
Claims (30)
1. Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину, який включає: (а) продукування варіанта поліпептиду хімозину, що має зміну в одному або декількох положеннях його амінокислотної послідовності, порівняно з вихідним поліпептидом, що має активність хімозину, де вихідний поліпептид має щонайменше 65 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), де зміна включає заміщення в положенні амінокислоти, відповідному положенню 311, визначеному за допомогою вирівнювання амінокислотної послідовності вихідного поліпептиду з амінокислотною послідовністю поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), і (р) виділення варіанта поліпептиду зі стадії (а) з одержанням виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де варіант має менше ніж 30 змін амінокислот в області від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381, порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 ЗЕО ІО МО 1 (бичачий хімозин) або порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжий хімозин), як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності варіанта з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1 або 5ЕО ІО МО:2, відповідно, і має активність хімозину.
2. Спосіб за п. 1, в якому виділений варіант поліпептиду хімозину має: активність хімозину, що дає більш високе співвідношення активності згортання і протеолітичної активності (С/Р) порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид ЗЕО ІЮО МО:1; і активність хімозину, що дає більш високе співвідношення С/Р порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:2.
3. Спосіб отримання за п. 1, в якому зміна включає амінокислотне заміщення 1 3111.
4. Спосіб за п. 1, в якому зміна включає амінокислотні заміщення У795, І 3111 ії ІЗ21Ї..
Б. Спосіб за п. 1, в якому вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮО МО:1 (бичачий хімозин).
б. Спосіб за п. 1, в якому вихідний поліпептид має щонайменше 95 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІО МО:2 (верблюжий хімозин).
7. Виділений варіант поліпептиду хімозину, отриманий способом, який включає: (а) продукування варіанта поліпептиду хімозину, що має зміну в одному або декількох положеннях його амінокислотної послідовності порівняно з вихідним поліпептидом, що має активність хімозину, де вихідний поліпептид має щонайменше 65 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), де зміна включає заміщення в положенні амінокислоти, відповідному положенню 311, як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності вихідного поліпептиду з амінокислотною послідовністю поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин); і (р) виділення варіанта поліпептиду зі стадії (а) з одержанням виділеного варіанта поліпептиду хімозину, де варіант має менше ніж 30 змін амінокислот в області від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381, порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин) або порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:2
(верблюжий хімозин), як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності варіанта з амінокислотною послідовністю ЗЕО І МО: або 5ЕО ІЮО МО:2, відповідно, і має активність хімозину.
8. Виділений варіант поліпептиду хімозину, що має зміну в одному або декількох положеннях його амінокислотної послідовності порівняно з вихідним поліпептидом, що має активність хімозину, де вихідний поліпептид має щонайменше 90 595 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), де зміна включає заміщення в положенні амінокислоти, відповідному положенню 311, як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності вихідного поліпептиду з амінокислотною послідовністю поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), де: варіант має активність хімозину; варіант має менше ніж 100 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом 5ЕО ІЮ МО: (бичачий хімозин); і варіант має менше ніж 30 змін амінокислот в області від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381, порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 ЗЕО ІО МО: 1 (бичачий хімозин), як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності варіанта з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1.
9. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 8, де вихідний поліпептид має щонайменше 97 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом ЗЕО ІЮ МО 1 (бичачий хімозин); і виділений варіант поліпептиду хімозину містить менше ніж 10 змін амінокислот в області від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381, порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІО МО:1 (бичачий хімозин), як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності варіанта з амінокислотною послідовністю 5ЕО ІЮ МО:1.
10. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 8, де зміна включає амінокислотне заміщення І 3111.
11. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 8, де зміна включає амінокислотні заміщення У1795, Г3111 їі ІЗ211.. Зо
12. Виділений варіант поліпептиду хімозину, що має зміну в одному або декількох положеннях його амінокислотної послідовності порівняно з вихідним поліпептидом, що має активність хімозину, де вихідний поліпептид має щонайменше 90 595 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮО МО:2 (верблюжий хімозин), де зміна включає заміщення в положенні амінокислоти, відповідному положенню 311, як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності вихідного поліпептиду з амінокислотною послідовністю поліпептиду 5ЕО ІЮ МО:1 (бичачий хімозин), де варіант має активність хімозину; і варіант має менше ніж 100 95 ідентичність послідовності зі зрілим поліпептидом 5ЕО І МО:2 (верблюжий хімозин); і варіант має менше ніж 30 змін амінокислот в області від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381, порівняно зі зрілим поліпептидом від положення амінокислоти 59 до положення амінокислоти 381 5ЕО ІЮ МО:2 (верблюжий хімозин), як визначено вирівнюванням амінокислотної послідовності варіанта з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:2.
13. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 12, де зміна включає амінокислотні заміщення У1795, Г3111 їі ІЗ211..
14. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока, що включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за п. 8 в харчовий інгредієнт (інгредієнти), що містить молоко.
15. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока за п. 14, де молоко вибране з групи, яка складається з соєвого молока, овечого молока, козячого молока, буйволячого молока, молока яка, молока лами, верблюжого молока і коров'ячого молока.
16. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока за п. 14, де продукт на основі молока являє собою ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
17. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока, який включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за п. 8 в кормовий інгредієнт (інгредієнти), що містить молоко.
18. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока за п. 17, де молоко вибране з групи, яка складається з соєвого молока, овечого молока, козячого молока, буйволячого 60 молока, молока яка, молока лами, верблюжого молока і коров'ячого молока.
19. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока за п. 17, де продукт на основі молока являє собою ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
20. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока, який включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за п. 12 в харчовий інгредієнт (інгредієнти), що містить молоко.
21. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока за п. 20, де молоко вибране з групи, яка складається з соєвого молока, овечого молока, козячого молока, буйволячого молока, молока яка, молока лами, верблюжого молока і коров'ячого молока.
22. Спосіб приготування харчового продукту на основі молока за п. 20, де продукт на основі молока являє собою ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
23. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока, який включає додавання ефективної кількості виділеного варіанта поліпептиду хімозину за п. 12 в кормовий інгредієнт (інгредієнти), що містить молоко.
24. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока за п. 23, де молоко вибране з групи, яка складається з соєвого молока, овечого молока, козячого молока, буйволячого молока, молока яка, молока лами, верблюжого молока і коров'ячого молока.
25. Спосіб приготування кормового продукту на основі молока за п. 24, де продукт на основі молока являє собою ферментований молочний продукт, столовий сир або сир.
26. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 8, який відрізняється тим, що варіант має активність хімозину, що дає більш високе співвідношення активності згортання і протеолітичної активності (С/Р) порівняно зі співвідношенням С/Р бичачого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:1.
27. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 12, який відрізняється тим, що варіант має активність хімозину, що дає більш високе співвідношення активності згортання і протеолітичної активності (С/Р) порівняно зі співвідношенням С/Р верблюжого хімозину, що містить зрілий поліпептид 5ЕО ІЮ МО:С2.
28. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 12, в якому зміна включає амінокислотне заміщення І 3111.
29. Спосіб за п. 1, в якому зміна включає амінокислотне заміщення 3111. Зо
30. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 8, в якому зміна включає амінокислотне заміщення 3111.
31. Виділений варіант поліпептиду хімозину за п. 12, в якому зміна включає амінокислотне заміщення 3111.
1 ВО Ва: Бохіє хімезнно ВО ВЕСТУУТЦЬАИ КАТЛОЄМЧАВІЇ ВІВЬУКОКІ ВКАІКККОГЬ БОРІВ т Т Вівня МЕС УТОЬАМ ЕАТБОСАВІТ ВІРЬХЕСКРО ВЕДСКЕВОВИ БОРБОЮЮКО Я Басітівшня МВСІУУвЬАА їАСдОоДаЛІТ ВІВИВКОКТО ВКАЖЕ.
Єаюшедїн: йгепейатів: МАСІУУЬЬДА ПВоЕОВЕСІТ ВІВБЬНКСКТО ВКАСКЕВОВЕ
Щур МЕСЕУТИ кої, ВиТЬКЕЄХН.
БОБІВ АНОХВ.
БНов ев хімознноВО ПІШКХАЮИ ЗАЕС ОЗІБЕОВЕІМЬ КЕВТОББОЕМУ Бівня ЗУШОКУЩО: сКІЖО СТРЕКЕЖЕУ: КОТОМ У Є Васнпізних У5ЗЗКУВІМ УВЕЕВІТЕХІЬ ОС КОКІЖІ СТРВОЕКРУФ КОТОДЕВСКМ Сатеїне йгзпейвиня СДКУВСК УАБС ПЯСХРОСКІЖХ СЕКООЕВТУУ ЕТВОВВОСИМ ТНтв БлЕКМЕМІСОМ УАБКРВЬІМУЬ ПЕБЖУРОЬІЖМ ОКВЕОКЕКУУ КОТОЄБВІЖУ НЕ 155 Воз боті зімозни ВО БЗІУСКОМАС КМНОВКОРВХ ОДТкОНІСсКР ІВІНУСТОВМ ООІЇТІВУЄ Віння вБІТСВаМмаС кМмисВвИЕвК БУТКО паІВЖОотТОовМ СІМ С Васпізшнюи ВІ СКИМАС КУБНВЕПЕВИ ЗаТЕВМІКР ІБІНЖСТОВІ БОРІШТОТУЄ Я лшвеїи5 Ягоейвтій ЕВПпІТСКАЕММС ПИВ ЦЕНЯ БЕРЕ МІКЖКВК СИНУ М ВБІК УХ с Свиня ГЕУХСКЗОДС ОМНННЕМРЕЖ БЕТЕЄВИ.ОКР БЕШТОКОТОБІ стро ТУМ ЖШев РЕУХУСЕЗКУС ВМИНМАРОРЕЖ БЕТЕДМОВКР БЕУУСТОШУ БОБЦАЖОЖУТ 151 п Боб їннах хімоазнни БО ОБМТУВТОН УСІШТОЕРВСО МЕТІВЕЕЗОЇ ТОМАШ АЕ ЕЗЕТВУЄОНМ Бінця ЗБ5БІУОТКя УсСрЕгОвРОоВ УтЕВЕКОЗї зоМмАХаківАЕ вУдУВУКЄОНИМ Є Басітівних сМІУрРМОТ УСЬШТЕОРВСЕ УШТЕУоКЕКОСЇІ ГСОДУКБІАЗ ЕХОМЕУЕВЩМ Єашейне бФгошейатів: УсМІУреМИОТ УСЬбТЕОРОЕ УБРЖЕВУНОСЇ ісрБАХеВАВ БХБУВУКНУМ Свиня УАЗІУПАНОЇ УЗЬБТеВО ІЖТЕНЕКІхІ БОС УЕЕСАВ БУТУКУКОМЕ БШіув УБОІУУЮНОР ЗшЬВЕТЕЕРШВ ІЖТТЕРЕІЮІ 1СсТДУРТЕВА КХЕУРІБОЩИ 2ЦІ 230 Воз Ботіх хзімознн ВО МНН УАОЮІ.
ГОХУМОВМОс ВЕМБТЬЗАТП РЕЖЖТОВЬНИ ХРУТУЄЄЮО Вівця МОББТУАСИ.
ГУМОК; ПОМОТІШАТО ВНЕЖЖТОВІНЯ ТКУТОКЕКО ЄС фасітівняи5: МОЖНІВАВІШ.
БЕБУХМОВМОЮ СЕМЬТІСАТО КшУЖжТОВеНВ Бут юКО ЄСашеїнз Чгошийарих МОКНІтТАВО: КЕУХМІЩНЄ СЕМОТЬСАТО БЕЖУТОБСНУЯ УВО т Єщиня МИВНІВОНИ. гАУЖМшНВМОВ СМ ТЬОАЧТІ РБЖЖТОВЕНИ УБУТКУ Шур МУВНІУВОПІ.
РБУЖХМОВНІХ ПОМІВЬОАТО СОЗЖУЕТЛЕСНЮ УРКБУЄЮТЄКО Наз Бохізв хімозино МО БТУПУТІВСС МУАЮБІМОО АІББТЕШТИКИи УСВАВОТІКІ ОСОАЛОАКОМО Вівця ОКТУОВУТІВС ВрОВСВЕсСО АІЇТЛТСТаКІ.
УСРЕЕОТМІ озаІсАтТИМе Є Басііаних УТУПВУВІМО УАсАСУСОСО АТЦВТОЖИУ.
ВБОБиЕБВТОКІ оМмаІісатеМВ їй: бгоншейагів ОТУОПУТІКС УВУАСУСССО АІБОТОТЕМО КОСБИЩОТБКІ СМАТСАТВЕВ Щур ЕТУПВІТІМО БУМАОСССВСВ ВУБОТСТАСЬ ТОБОВОТСЬКІ ВАТА ОгОа зві зча Но бах хімознн о ВО УскЕСІОСИМ БОХМРТМУКЕ ІКСКМУРИТВ БАЖТЕСТВЮ СсІВОКОЗЕМН С ізсігізнох ЖХОБКОтУНОСсІ БЕдМРІУУЮВ ЇМОВОКБІОА? ВАЖТЕКІСНВ СЕ ВИХ Євіпейшє йгожиєарі сирим заОМЕТУЄЕЬ ІЇМСНОХРІВЕ ВАЖТЕЕОИВ СТВ УН ЄСвинп УОБРОГОСНИ ПЗИМОРУУЕЬ ІЇБСНМЖРЕВР ШАЖТМОПСНІЮ СТЕСЕООСПЕК Штр ВЕТО ХмЕМЕТУЄБВЕ Же КЕКрО паж СДС ЕВ. . БНІ
351 ХВ.
Бо5 Бохів хімозни ВО сОохмІіЇ ЗОМ ТЕБУУЕУВИОВ АММЬУЦІ АКА
Вівця НОТІ ОУК ІВББЖУНУКОВ АХМБУЦІАКА І
С Ваєтбізних СЕБВІЇБОПУК Ірак Осв ДИВО АКА Є
Сан бгешесйатнх ОСОБІ ОЦУК ЇВБУКВУРОВ АММВУСІ АХА І йвння ХОБКІСОЗУК ГОБУХВУКОВ АЕЕВУСІАКА Ї
Шев сОомБІТУК ЇБЕБУДУКОВ АКЕВУСЬККА Ї оОтг.1
Ж ее, - З ї й їх ий Во Як х їх КУ о ЩЕ Шо т й х. и и ОВ Зк. ОО Е БУ
У . а че а нн СДН оо НИ рова н щої що М І Ж КН «В МЕН сив Ж НН НН Є Рейн у кВ, Ж В Ж М М ХХ и В у му Кор КУМ КК о КУ, УК чЧНЗ Ж КИ У ОК ОЇ» СОМКех і; З : ОТ Енн - НЕ НІ я зд й КИ До А НЕ У Ї що КАК М Ж и СХ Ех З МНВК КАК ОХ пен яд інве ьо я о М ни С НН в: НІ ШИ 5 шк ШИ ШНН ее Й | КУ з Я Ж» ОМВК Х. і Ж В Б х Х зм КИ КК оон си ши І М ЛЯ оди у Ще у Кн М З МК І З я і Шк ШИ М в ВМ «Б а и он КО С З і й У, а ОХ я Би МН вл Б В НН НИ НН: в о 5 й о с ОВ В й З ВА КО КК пора М ЦИ «КОН Ше НЕ З о Й Я й Й Манн СХ ХО Но» ОН В В КО о КК Ж Б й ис у ве а а МОХ а КУ Б х ї дО Ж КК осо, Об за о ж й пе сао о М и Не
0. ШК и с ше БИ хо З й: СЯ ОКО СОУ х ок ав ее «КЕ ЕЕ ВУХ ОА С ОН Кия Да х ще «й и х і жах че Шо Кк Полаження 2961294 в вичачому хімознні
Фіг. 2 а
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12169503 | 2012-05-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA126330C2 true UA126330C2 (uk) | 2022-09-21 |
Family
ID=48577692
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201808552A UA126330C2 (uk) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями |
| UAA201413887A UA118956C2 (uk) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варіант хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201413887A UA118956C2 (uk) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варіант хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9930899B2 (uk) |
| EP (3) | EP3929288A1 (uk) |
| JP (3) | JP2015518718A (uk) |
| KR (2) | KR102245756B1 (uk) |
| CN (2) | CN104487572B (uk) |
| AU (2) | AU2013265343B2 (uk) |
| BR (2) | BR122021019895B1 (uk) |
| CA (3) | CA3201812A1 (uk) |
| DK (2) | DK3604509T3 (uk) |
| ES (1) | ES2741723T5 (uk) |
| FI (1) | FI2855674T4 (uk) |
| HK (1) | HK1202894A1 (uk) |
| MX (3) | MX366610B (uk) |
| NZ (4) | NZ742660A (uk) |
| PL (2) | PL2855674T5 (uk) |
| RU (2) | RU2019108268A (uk) |
| TR (1) | TR201910420T4 (uk) |
| UA (2) | UA126330C2 (uk) |
| WO (1) | WO2013174840A1 (uk) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3929288A1 (en) | 2012-05-25 | 2021-12-29 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| KR102494645B1 (ko) | 2014-02-26 | 2023-02-06 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체 |
| WO2016128476A1 (en) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | Chr. Hansen A/S | Blends of chymosins with improved milk-clotting properties |
| DK3310914T3 (da) * | 2015-06-22 | 2022-06-20 | Chr Hansen As | Chymosinvarianter med forbedrede egenskaber |
| CA2995755A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| WO2017198810A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10961524B2 (en) * | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| CN106754840B (zh) * | 2016-12-22 | 2019-06-21 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性改善的凝乳酶突变体 |
| JP7455062B2 (ja) | 2018-01-15 | 2024-03-25 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ホスホリパーゼを用いた発酵乳製品及びその調製物 |
| CN111172139B (zh) * | 2020-02-27 | 2021-11-30 | 武汉轻工大学 | 一种小牛皱胃凝乳酶及基因与菌株和应用 |
| CN113801867B (zh) * | 2021-11-18 | 2022-03-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因和应用 |
| AU2023249315A1 (en) | 2022-04-06 | 2024-09-26 | Chr. Hansen A/S | Aspartic protease, methods and uses thereof |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0123928A3 (en) | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
| US7390936B1 (en) | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
| RU2192137C2 (ru) * | 2000-08-07 | 2002-11-10 | Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" | Способ производства сыра |
| DK2365069T3 (en) | 2000-11-06 | 2018-04-23 | Eidgenoessisch Technische Hochschule Zuerich | Process for the preparation of non-bovine chymosin and its use |
| KR20100109969A (ko) | 2002-10-02 | 2010-10-11 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법 |
| ES2609102T3 (es) | 2003-06-27 | 2017-04-18 | Bioren, LLC | Mutagénesis por revisión |
| WO2005094185A2 (en) | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Sudershan Biotech Limited | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| WO2008098973A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Chr. Hansen A/S | Coagulation of milk |
| JP2010046034A (ja) | 2008-08-22 | 2010-03-04 | Toyota Central R&D Labs Inc | 変異体のスクリーニング方法 |
| ES2445710T3 (es) | 2009-03-24 | 2014-03-04 | Meito Sangyo Co., Ltd. | Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo |
| WO2013164481A1 (en) | 2012-05-03 | 2013-11-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved enzyme variants |
| EP3929288A1 (en) | 2012-05-25 | 2021-12-29 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| KR102494645B1 (ko) | 2014-02-26 | 2023-02-06 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체 |
| WO2016128476A1 (en) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | Chr. Hansen A/S | Blends of chymosins with improved milk-clotting properties |
| DK3310914T3 (da) | 2015-06-22 | 2022-06-20 | Chr Hansen As | Chymosinvarianter med forbedrede egenskaber |
| CA2995755A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| WO2017198810A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10961524B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
-
2013
- 2013-05-22 EP EP21164270.7A patent/EP3929288A1/en active Pending
- 2013-05-22 CA CA3201812A patent/CA3201812A1/en active Pending
- 2013-05-22 RU RU2019108268A patent/RU2019108268A/ru unknown
- 2013-05-22 EP EP19174281.6A patent/EP3604509B1/en active Active
- 2013-05-22 CA CA2874214A patent/CA2874214C/en active Active
- 2013-05-22 CN CN201380039107.0A patent/CN104487572B/zh active Active
- 2013-05-22 DK DK19174281.6T patent/DK3604509T3/da active
- 2013-05-22 KR KR1020147036631A patent/KR102245756B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-22 PL PL13727539.2T patent/PL2855674T5/pl unknown
- 2013-05-22 ES ES13727539T patent/ES2741723T5/es active Active
- 2013-05-22 KR KR1020217011988A patent/KR102419515B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-22 AU AU2013265343A patent/AU2013265343B2/en active Active
- 2013-05-22 BR BR122021019895-0A patent/BR122021019895B1/pt active IP Right Grant
- 2013-05-22 TR TR2019/10420T patent/TR201910420T4/tr unknown
- 2013-05-22 JP JP2015513145A patent/JP2015518718A/ja active Pending
- 2013-05-22 NZ NZ742660A patent/NZ742660A/en unknown
- 2013-05-22 NZ NZ742745A patent/NZ742745A/en unknown
- 2013-05-22 PL PL19174281T patent/PL3604509T3/pl unknown
- 2013-05-22 FI FIEP13727539.2T patent/FI2855674T4/fi active
- 2013-05-22 DK DK13727539.2T patent/DK2855674T4/da active
- 2013-05-22 CN CN201911082253.7A patent/CN110714001A/zh active Pending
- 2013-05-22 RU RU2014152723A patent/RU2683385C2/ru active
- 2013-05-22 WO PCT/EP2013/060460 patent/WO2013174840A1/en active Application Filing
- 2013-05-22 NZ NZ725398A patent/NZ725398A/en unknown
- 2013-05-22 US US14/402,567 patent/US9930899B2/en active Active
- 2013-05-22 EP EP13727539.2A patent/EP2855674B2/en active Active
- 2013-05-22 UA UAA201808552A patent/UA126330C2/uk unknown
- 2013-05-22 NZ NZ702030A patent/NZ702030A/en unknown
- 2013-05-22 UA UAA201413887A patent/UA118956C2/uk unknown
- 2013-05-22 MX MX2014014300A patent/MX366610B/es active IP Right Grant
- 2013-05-22 CA CA3100606A patent/CA3100606C/en active Active
- 2013-05-22 BR BR112014029012-1A patent/BR112014029012B1/pt active IP Right Grant
-
2014
- 2014-11-24 MX MX2019008255A patent/MX2019008255A/es active IP Right Grant
- 2014-11-24 MX MX2020011941A patent/MX2020011941A/es unknown
-
2015
- 2015-04-09 HK HK15103493.9A patent/HK1202894A1/xx unknown
-
2018
- 2018-02-20 US US15/900,603 patent/US10806157B2/en active Active
- 2018-06-06 JP JP2018108935A patent/JP2018148926A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-21 AU AU2019203589A patent/AU2019203589B2/en active Active
- 2019-12-18 JP JP2019228446A patent/JP2020058367A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA126330C2 (uk) | Спосіб отримання виділеного варіанта поліпептиду хімозину з поліпшеними молокозгортальними властивостями | |
| JP7144470B2 (ja) | 改善された凝乳特性を有するキモシンの変異体 | |
| KR20190010601A (ko) | 우유-응고 특성이 개선된 키모신 변이체 | |
| KR20190010602A (ko) | 우유-응고 특성이 개선된 키모신 변이체 | |
| KR20180038569A (ko) | 특성이 개선된 키모신 변이체 | |
| AU2022200663B2 (en) | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties | |
| EA040360B1 (ru) | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами | |
| EA040259B1 (ru) | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |