ES2741723T3 - Variantes de quimosina con propiedades mejoradas de coagulación de leche - Google Patents

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Abstract

Un método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada que comprende las etapas: (a): hacer una alteración en una o más posiciones en un polipéptido parental que tiene actividad quimosina, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácido correspondiente a la posición 134; y (b): producir y aislar el polipéptido alterado de la etapa (a) y mediante ello obtener la variante polipeptídica de quimosina aislada, en donde la variante tiene actividad quimosina; y en donde: (i): la posición de aminoácido del polipéptido parental se determina mediante un alineamiento del polipéptido parental con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) - es decir, el polipéptido de SEQ ID NO: 1 se usa para determinar la correspondiente secuencia de aminoácidos en el polipéptido parental; y (ii): el polipéptido parental tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello), que es desde la posición de aminoácido 59 hasta la posición de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 2; y en donde la variante polipeptídica de quimosina aislada tiene: - una actividad quimosina que da un cociente C/P mayor en comparación con el cociente C/P de quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Variantes de quimosina con propiedades mejoradas de coagulación de leche
Campo de la invención
La presente invención se refiere a variantes de quimosina con propiedades mejoradas de coagulación de leche.
Antecedentes técnicos
La coagulación enzimática de la leche por las enzimas coagulantes de la leche, tal como quimosina y pepsina, es uno de los procesos más importantes en la fabricación de quesos. La coagulación enzimática de la leche es un proceso de dos fases: una primera fase donde una enzima proteolítica, quimosina o pepsina, ataca K-caseína, produciendo un estado metaestable de la estructura micelar de la caseína y una segunda fase, donde la leche posteriormente coagula y forma un coágulo.
La quimosina (EC 3.4.23.4) y la pepsina (EC 3.4.23.1), las enzimas coagulantes de la leche del estómago mamífero, son proteasas aspárticas que pertenecen a una clase amplia de peptidasas.
Cuando se producen en las células de la mucosa gástrica, la quimosina y la pepsina se producen como preproquimosina y pre-pepsinógeno enzimáticamente inactivas, respectivamente. Cuando la quimosina se excreta, un fragmento peptídico N-terminal, el fragmento pre (péptido señal) se corta para dar proquimosina que incluye un fragmento pro. La proquimosina es una forma sustancialmente inactiva de la enzima que, sin embargo, se activa en condiciones ácidas a la quimosina activa por eliminación autocatalítica del fragmento pro. Esta activación se produce in vivo en la luz gástrica en condiciones apropiadas de pH o in vitro en condiciones ácidas.
Las características estructurales y funcionales de la pre-proquimosina, proquimosia y quimosina bovinas, es decir de Bos taurus, se han estudiado extensamente. La parte pre de la molécula de pre-proquimosina bovina comprende 16 residuos de aa y la parte pro de la correspondiente proquimosina tiene una longitud de 42 residuos de aa. La quimosina bovina activa comprende 323 aa es una mezcla de dos formas, A y B, ambas de las cuales son activas.
La quimosina se produce de forma natural en especies de mamíferos tal como bovinos, camellos, caprinos, búfalos, oveja, cerdos, seres humanos, monos y ratas.
La quimosina bovina ha estado comercialmente disponible durante un número de años para la industria láctea.
El documento WO02/36752A2 (Chr. Hansen) describe la producción recombinante de quimosina de camello.
Las referencias enumeradas a continuación se pueden ver en el presente contexto como referencias que describen mutantes de quimosina:
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, Enero 1990, páginas 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol.
2, Mayo 1989, páginas 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, Septiembre 2006, páginas 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, Marzo 1993, páginas 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, Septiembre 1997, páginas 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Va1111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, Octubre 1990, páginas 9863­ 9871;
- Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, Junio 1998, páginas 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, Diciembre 1997, páginas 278-286.
El documento WO2013/164479A2 (DSM) divulga una variante de quimosina bovina H124Q (numerada H76Q).
Los artículos "J. of Agricultural and Food Chemistry, vol. 56, no. 22, 26 Noviembre 2008" y "Nucleic Acids Research, vol. 18, No. 15, 11 Agosto 1990, pp. 4602-4602" se refieren a secuencias de quimosina de tipo salvaje conocidas (polipéptido parental), tal como, por ejemplo, la secuencia de quimosina de oveja.
Ninguna de las referencias del estado de técnica mencionadas anteriormente describe de forma directa e inequívoca ninguno de los mutantes/variantes de quimosina como los descritos/reivindicados posteriormente en el presente documento.
Compendio de la invención
El problema que se va a resolver por la presente invención es proporcionar variantes de quimosina con propiedades de coagulación de leche mejoradas.
Como se discute en los ejemplos de trabajo en el presente documento - los presentes inventores han identificado un número de variantes mejoradas de quimosina de camello (véase el ejemplo 6 en el presente documento) y bovina (véase el ejemplo 7 en el presente documento).
Basándose en un análisis comparativo de las variantes de camello y bovina - los presentes inventores identificaron un número de posiciones de aminoácidos adicionales que son importantes en el presente documento en el sentido de que al hacer una variante en una o más de estas posiciones se puede conseguir una variante mejorada de quimosina (véase el ejemplo 8 en el presente documento).
Como se sabe en la técnica - diferentes secuencias polipeptídicas de quimosina de tipo salvaje naturales obtenidas de diferentes especies de mamíferos (tal como, por ejemplo, bovinos, camellos, oveja, cerdos o ratas) tienen una similitud/identidad de secuencia relativamente alta.
En la figura 1 en el presente documento esto se ejemplifica mediante un alineamiento de diferentes secuencias de quimosina relevantes en el presente documento.
En vista de esta relación de secuencia relativamente cercana - se cree que las estructuras 3D de diferentes quimosinas de tipo salvaje naturales también sean relativamente similares.
En el presente contexto - una quimosina de tipo salvaje obtenida natural (tal como quimosina bovina o quimosina de camello) puede ser en el presente documento un ejemplo de un polipéptido parental - es decir, un polipéptido parental al que se hace una alteración para producir un polipéptido de quimosina variante de la presente invención.
Sin querer estar limitado por la teoría - se cree que las posiciones de aminoácidos relacionadas de quimosina discutidas en el presente documento son de importancia general en cualquier enzima quimosina de interés relevante en el presente documento (por ejemplo, quimosinas de, por ejemplo, bovinos, camellos, oveja, cerdos, ratas, etc.) -en el sentido de que al hacer una variante en una o más de estas posiciones se puede conseguir una variante mejorada de quimosina en general (por ejemplo, una variante mejorada de quimosina bovina, de camello, oveja, cerdo o rata).
Como se discute en el presente documento -com o secuencia de referencia para determinar la posición de aminoácido de un polipéptido quimosina parental de interés (por ejemplo, camello, oveja, bovino, etc.) se usa en el presente documento la secuencia de preproquimosina de quimosina B bovina pública conocida (número de acceso de Genbank P00794 - divulgada como SEQ ID NO: 1 en el presente documento).
La preproquimosina de quimosina B bovina de SEQ ID NO: 1 se puede denominar alternativamente en el presente documento quimosina B bovina (Bos bovis) o simplemente quimosina bovina. La secuencia también se muestra en la figura 1 en el presente documento.
Otra secuencia de quimosina relevante en el presente documento es la secuencia de quimosina de Camelius dromedarius públicamente conocida de SEQ ID NO: 2 en el presente documento. Se puede denominar alternativamente en el presente documento quimosina de camello. La secuencia también se muestra en la figura 1 en el presente documento.
En el presente contexto se cree que un polipéptido de quimosina parental (por ejemplo, de oveja o rata) que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) se puede ver en el presente documento como suficiente estructuralmente relacionado con, por ejemplo, la quimosina bovina o de camello para ser mejorado al hacer una variante en cualquiera de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento.
Según esto, un primer aspecto de la invención se refiere a un método para hacer una variante de un polipéptido de quimosina aislado de la reivindicación 1.
Como se sabe en la técnica - el experto en la materia puede basar en su conocimiento general común producir y purificar rutinariamente quimosina y variantes de quimosina. Dicho en otras palabras, una vez que el experto en la materia está en posesión de un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina de interés (por ejemplo, de bovinos, camellos, oveja, cerdos, o ratas) es trabajo rutinario para el experto en la materia hacer una variante de tal quimosina parental de interés.
Como se discute en el presente documento - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 1 (bovino) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variantes de quimosina bovina.
Como se discute en el presente documento - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variante de quimosina de camello.
Según esto, un segundo aspecto de la invención se refiere a una variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 5.
Una variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento se puede usar según la técnica - por ejemplo, para hacer un producto alimenticio o de pienso de interés (tal como, por ejemplo, un producto basado en leche de interés que, por ejemplo, podría ser un producto de queso).
Según esto, un tercer aspecto de la invención se refiere a un método para hacer un producto alimenticio o de pienso que comprende añadir una cantidad eficaz de la variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento al ingrediente(s) del alimento o pienso y llevar a cabo etapas adicionales de fabricación para obtener el producto alimenticio o de pienso.
Se describe a continuación una forma de realización de la presente invención, a modo de ejemplos solo.
Definiciones
Todas las definiciones de términos relevantes en el presente documento son según lo que entendería el experto en la materia en relación al contexto técnico relevante en el presente documento.
El término “quimosina” se refiere a una enzima de la clase EC 3.1.23.4. La quimosina tiene una alta especificidad y coagula leche por corte de un único enlace 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 en la cadena kappa de la caseína. Un nombre alternativo usado en la técnica es renina.
El término “actividad quimosina” se refiere a la actividad quimosina de una enzima quimosina como entiende el experto en la materia en el presente contexto.
El experto en la materia sabe cómo determinar la actividad quimosina relevante en el presente documento. En el ejemplo de trabajo 4 en el presente documento se proporciona un ejemplo de un método estándar para determinar la actividad quimosina específica - alternativamente llamada actividad de coagulación o actividad de coagulación de la leche.
En el ejemplo de trabajo 5 en el presente documento se proporciona un ejemplo de un método estándar para determinar la actividad proteolítica.
Como se sabe en la técnica - e l denominado cociente C/P relevante en el presente documento se determina dividiendo la actividad de coagulación específica (C) por la actividad proteolítica (P).
Como se sabe en la técnica - un mayor cociente C/P implica en general que la pérdida de proteína durante, por ejemplo, la fabricación de queso debida a degradación no específica de proteína se reduce, es decir, el rendimiento del queso se mejora, y que el desarrollo de un sabor amargo en el queso durante la maduración se reduce.
El término “variante aislada” significa que está modificada por la mano del hombre. En un aspecto, la variante es al menos el 1% pura, por ejemplo, al menos el 5% pura, al menos el 10% pura, al menos el 20% pura, al menos el 40% pura, al menos el 60% pura, al menos el 80% pura, y al menos el 90% pura, determinado por SDS-PAGE.
El término “polipéptido maduro” significa un péptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesamiento N terminal, truncamiento C terminal, glucosilación, fosforilación, etc. En el presente contexto un polipéptido de quimosina maduro relevante en el presente documento se puede ver como la secuencia polipeptídica de quimosina activa - es decir, sin las secuencias de la parte pre y/o la parte pro. Los ejemplos relevantes en el presente documento de un polipéptido maduro son, por ejemplo, el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina), que es desde la posición de aminoácido 59 hasta la posición de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 1 o el polipéptido maduro de SEQ iD NO: 2 (quimosina de camello), que es desde la posición de aminoácido 59 hasta la posición de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 2.
El término “parental” o “polipéptido parental que tiene actividad quimosina” significa un polipéptido al que se hace una alteración para producir las variantes de enzima de la presente invención. El parental puede ser un polipéptido natural (de tipo salvaje) o una variante del mismo.
El término “identidad de secuencia” se refiere a la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos.
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (la versión de EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle marcada “la identidad más larga” (obtenida usando la opción nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de huecos en el alineamiento)
Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, anteriormente) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, anteriormente), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Los parámetros opcionales usados son penalización por apertura de hueco de 10, penalización por extensión de hueco de 0,5, y la matriz de sustitución EDnAf ULL (versión de EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle marcada “ la identidad más larga” (obtenida usando la opción nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula como sigue:
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de huecos en el alineamiento).
El término “variante” significa un péptido que tiene actividad quimosina que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.
El aminoácido puede ser aminoácidos naturales o no naturales - por ejemplo, la sustitución con, por ejemplo, particularmente isómeros D (o formas D) de, por ejemplo, D-alanina podría ser teóricamente posible.
El término péptido de quimosina “de tipo salvaje” significa una quimosina expresada por un organismo natural, tal como un mamífero (por ejemplo, camello o bovino) encontrado en la naturaleza.
Dibujos
Figura 1: Un alineamiento de las diferentes secuencias de quimosina relevantes en el presente documento. La “quimosina_B_Bos_bovis” es la quimosina bovina de SEQ ID NO: 1 en el presente documento y la “Camelus_dromedarius” mostrada es la quimosina de camello de SEQ ID NO: 2 en el presente documento. Usando la quimosina bovina de SEQ ID NO: 1 como secuencia de referencia como se describe en el presente documento se puede ver, por ejemplo, que la quimosina bovina tiene “V” en la posición 10 y la quimosina de camello tiene “A” en la misma posición 10. También se puede ver, por ejemplo, que bovina/rata tienen “Q” en la posición 352 y camello/C._bactrianus tienen “E” en la misma posición 352.
Respecto a las secuencias de quimosina mostradas en la figura 1 - oveja tiene un 94,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina; C._bactrianus tiene un 83,2% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina; Camelus_dromedarius (quimosina de camello de SEQ ID NO: 2) tiene un 84% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina; cerdo tiene un 80,3% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina y rata tiene un 71,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina.
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - los porcentajes de identidad de secuencia relevantes en el presente documento de las secuencias de polipéptidos maduros de, por ejemplo, quimosina de oveja, C._bactrianus, camello, cerdo o rata con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina - es decir, las posiciones de aminoácidos 59 a 381 e SEQ ID NO: 1) son relativamente similares a los porcentajes de identidad de secuencia mencionados anteriormente.
Figura 2: La estructura 3D de la quimosina bovina - la estructura 3D está públicamente disponible. Como ejemplo se muestran dónde están presentes las posiciones 296 y 294 en la quimosina bovina.
Descripción detallada de la invención
Determinación de la posición de aminoácidos de una quimosina de interés
Como se ha discutido anteriormente - como secuencia de referencia para determinar la posición de aminoácidos de un polipéptido de quimosina de interés relevante en presente documento (por ejemplo, camello, oveja, bovina, etc.) en el presente documento se usa la secuencia de quimosina bovina públicamente conocida divulgada como SEQ ID NO: 1 en el presente documento.
Para los fines de la presente invención, el polipéptido divulgado en SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) se usa para determinar el residuo de aminoácido correspondiente en otro polipéptido de quimosina. La secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de quimosina se alinea con el polipéptido divulgado en SEQ ID NO: 1, y basado en el alineamiento, se determina el número de la posición de aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido divulgado en SEQ ID NO: 1 usando el algoritmo ClustalW como se describe en el ejemplo de trabajo 1 en el presente documento.
La identificación del residuo de aminoácido correspondiente en otro polipéptido de quimosina se puede confirmar usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) implementada en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior.
Basado en los programas informáticos bien conocidos anteriores - es trabajo de rutina para el experto en la materia determinar la posición de aminoácidos de un polipéptido de quimosina de interés relevante en el presente documento (por ejemplo, de camello, oveja, bovina, etc.).
En la figura 1 en el presente documento se muestra un ejemplo de un alineamiento.
Solo como un ejemplo - en la figura 1 se puede ver, por ejemplo, que la SEQ ID NO: 1 de referencia bovina usada en el presente documento tiene una “G” en posición 50 y “Camelus_dromedarius” (SEQ ID NO: 2 en el presente documento) tiene una “A” en esta posición 50.
Nomenclatura de las variantes
Al describir las variantes de la presente invención, la nomenclatura descrita posteriormente se adapta para facilidad de referencia. Se emplean las abreviaturas de aminoácidos de única letra o de tres letras aceptadas por la IUPAC.
Las variantes específicas discutidas en esta sección de “nomenclatura” a continuación pueden no ser variantes relevantes en el presente documento de la presente invención - es decir, esta sección de “nomenclatura” es solo para describir la nomenclatura usada relevante en el presente documento como tal.
Sustituciones. Para una sustitución de aminoácidos, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Según esto, una sustitución teórica de treonina con alanina en la posición 226 se designa como “Thr226Ala” o “T226A”. Las mutaciones múltiples se separan por la adición de signos (“+”), por ejemplo, “Gly205Arg Ser411Phe” o “G205R S411F”, que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) y serina (S) con fenilalanina (F), respectivamente. Una sustitución designada, por ejemplo, “226A” se refiere a una sustitución de un aminoácido parental (por ejemplo, T, Q, S u otro aminoácido parental) con alanina en la posición 226.
Deleciones. Para una deleción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, *. Según esto, la deleción de la glicina en la posición 195 se designa como “Gly195*” o “G195*”. Las deleciones múltiples se separan por la adición de signos (“+”), por ejemplo, “Gly195* Ser411*” o “G195* S411*”.
Inserciones. Para una inserción de aminoácidos, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. Según esto, la inserción de lisina después de la glicina en posición 195 se designa “Gly195GlyLys” o “G195GK”. Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de la glicina en la posición 195 se indica como “Gly195GlyLysAla” o “G195GKA”.
En tales casos el/los residuo(s) de aminoácido(s) insertado(s) se numeran mediante la adición de letras minúsculas al número de la posición del residuo de aminoácidos que precede al/los residuo(s) de aminoácido(s) insertado(s). En el ejemplo anterior, la secuencia sería, por tanto:
Figure imgf000006_0001
Alteraciones múltiples. Las variantes que comprenden múltiples alteraciones se separan por la adición de signos por ejemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” o “R170Y+G195E” representa una sustitución de tirosina y ácido glutámico por arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, respectivamente.
Diferentes sustituciones. Donde se pueden introducir diferentes sustituciones en una posición, las diferentes sustituciones se separan por una coma, por ejemplo, “Arg170Tyr,Glu” o “R170Y,E” representa una sustitución de arginina con tirosina o ácido glutámico en la posición 170. Por tanto, “Tyr167Gly,Ala Arg170Gly, Ala” o “Y167G,A R170G,A” designa las siguientes variantes:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala Arg 170Gly", y "Tyr167Ala+Arg170Ala".
Un método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada
Como se ha discutido anteriormente - como se sabe en la técnica, el experto en la materia puede basar en su conocimiento general común producir y purificar rutinariamente quimosina y variantes de quimosina.
Dicho en otras palabras, una vez el experto en la materia está en posesión de un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina de interés (por ejemplo, de bovinos, camellos, oveja, cerdos o ratas) es trabajo de rutina para el experto en la materia hacer una variante de tal quimosina parental de interés. Un ejemplo de un método adecuado para producir y aislar una quimosina (variante o parental) puede ser por tecnología bien conocida, por ejemplo, basada en la expresión/producción recombinante en hongos como, por ejemplo, se describe en el documento WO02/36752A2 (Chr. Hansen).
También es trabajo de rutina para el experto en la materia producir una alteración en una o más posiciones en un polipéptido parental que tiene actividad quimosina, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácido.
Como sabe el experto en la materia - esto se puede hacer, por ejemplo, mediante la denominada mutagénesis dirigida y tecnología basada en expresión/producción recombinante.
También es trabajo de rutina para el experto en la materia determinar si un polipéptido parental relevante del presente documento (por ejemplo, quimosina de tipo salvaje de camello o bovina) y/o una variante relevante del presente documento tiene actividad quimosina o no.
Como se sabe en la técnica - la actividad quimosina se puede determinar mediante el denominado cociente C/P, que se determina dividiendo la actividad de coagulación específica (C) por la actividad proteolítica (P).
Como se sabe en la técnica - un mayor cociente C/P implica en general que la pérdida de proteína durante, por ejemplo, la fabricación de queso debida a degradación no específica de proteína se reduce, es decir, el rendimiento del queso se mejora, y que el desarrollo de un sabor amargo en el queso durante la maduración se reduce.
En el ejemplo de trabajo 4 en el presente documento se describe un método adecuado para determinar la actividad de coagulación específica (C) y en el ejemplo de trabajo 5 en el presente documento se describe un método adecuado para determinar la actividad proteolítica (P).
Una variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento es una variante, en donde la variante tiene una actividad quimosina que da un mayor cociente C/P comparado con el cociente C/P de la quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 en el presente documento.
Más preferiblemente, una variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento es una variante, en donde la variante tiene
- una actividad quimosina que da un cociente C/P mayor en comparación con el cociente C/P de la quimosina de bovina que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 en el presente documento; y
- una actividad quimosina que da un cociente C/P mayor en comparación con el cociente C/P de la quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 en el presente documento.
Como se ha discutido anteriormente - como secuencia de referencia para determinar la posición de aminoácidos de un polipéptido de quimosina de interés relevante del presente documento (por ejemplo, de camello, bovina, de oveja, etc.) se usa en el presente documento la secuencia de quimosina bovina pública conocida divulgada como SEQ ID NO: 1 en el presente documento.
Como se ha discutido anteriormente - basado en, por ejemplo, los programas de alineamiento de secuencia de ordenador discutidos en el presente documento - es trabajo de rutina para el experto en la materia determinar la posición de aminoácido relevante en el presente documento de un polipéptido de quimosina de interés relevante del presente documento (por ejemplo, de camello, bovina, de oveja, etc.).
El término “el polipéptido parental tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina)” se puede ver como que se refiere a una limitación basada en la secuencia del polipéptido de quimosina parental usado para hacer una variante del mismo relevante en el presente documento.
Dicho en otras palabras - un polipéptido de quimosina parental maduro (por ejemplo, de oveja o cerdo) que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con la quimosina bovina madura se cree que es suficiente estructuralmente idéntico a, por ejemplo, la quimosina bovina o de camello para ser relevante en el presente documento - es decir, en el presente contexto se cree que un polipéptido de quimosina parental maduro (por ejemplo, de por ejemplo, oveja o rata) que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) se puede ver en el presente documento como suficiente estructuralmente relacionado a, por ejemplo, quimosina bovina o de camello para ser mejorado al hacer una variante en cualquiera de las posiciones de aminoácidos descritas en el presente documento.
El polipéptido de quimosina de camello de SEQ ID NO: 2 tiene un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido bovina de SEQ ID NO: 1 (es decir, la SEQ ID NO: 1 completa desde la posición 1 a la 381, que incluye la secuencia pre y pro).
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina puede ser ya, por ejemplo, una variante de, por ejemplo, una quimosina de tipo salvaje correspondiente.
Por ejemplo, una variante de quimosina de camello con, por ejemplo, 5-10 alteraciones (por ejemplo, sustituciones) comparado con el polipéptido de quimosina de camello de tipo salvaje de SEQ ID NO: 2 será todavía un polipéptido parental que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (bovino). Dicho en otras palabras, una variante polipeptídica de quimosina aislada relevante en el presente documento puede comprender alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en otra posición diferente de las posiciones de, por ejemplo, el primer aspecto del presente documento.
Respecto a las secuencias de quimosina mostradas en la figura 1 en el presente documento - oveja tiene un 94,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina; C._bactrianus tiene un 83,2% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina; cerdo tiene un 80,3% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina y rata tiene un 71,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 bovina.
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - los porcentajes de identidad de secuencia relevantes en el presente documento de, por ejemplo, quimosina madura de oveja, C._bactrianus, camello, cerdo o rata con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina - es decir, las posiciones de aminoácidos 59 a 381 de SEQ ID NO: 1) son relativamente similares a los porcentajes de identidad de secuencia mencionados anteriormente. Variantes preferidas:
Como se ha discutido anteriormente - por ejemplo, el primer aspecto se refiere a una variante polipeptídica de quimosina aislada, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácidos correspondiente a cualquiera de la posición 134.
Se puede preferir que al menos una alteración sea una sustitución - es decir, una forma de realización preferida relevante en el presente documento se refiere a una variante polipeptídica de quimosina aislada, en donde la alteración comprende una sustitución en al menos una posición de aminoácido correspondiente a cualquiera de la posición 134. Preferiblemente, la sustitución es 134Q.
Preferiblemente, la sustitución es H134Q.
En una forma de realización preferida, la sustitución es:
H134Q I154L D216S;
H134Q L280I G309W;
Y79S H134Q Y365F V375L; o
S132F H134Q M200I M215L G221E.
Polipéptido parental preferido que tiene actividad quimosina
Solo como un ejemplo - un polipéptido parental relevante adecuado en el presente documento podría ser, por ejemplo, quimosina A bovina - como se sabe en la técnica la quimosina A bovina puede tener solo una diferencia de aminoácido en comparación con la quimosina B bovina de SEQ ID NO: 1 en el presente documento.
Como se ha discutido anteriormente - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de SEQ ID NO: 1 (bovino) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variantes de quimosina bovina.
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina puede ya, por ejemplo, ser una variante de, por ejemplo, una quimosina de tipo salvaje correspondiente.
Por ejemplo, una variante de quimosina bovina con, por ejemplo, 5-10 alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido de quimosina bovina de tipo salvaje maduro de s Eq ID NO: 1 será todavía un polipéptido parental que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina).
El polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (bovino) tiene 323 aminoácidos de longitud - según esto, una variante de quimosina madura con, por ejemplo, 25 sustituciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido maduro de quimosina bovina de tipo salvaje de SEQ ID NO: 1 no será un polipéptido parental que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina).
Dicho en otras palabras y en general - una variante polipeptídica de quimosina aislada relevante en el presente documento puede comprender alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en otras posiciones que las posiciones de, por ejemplo, el primer aspecto del presente documento.
Como se ha discutido anteriormente - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de SEQ ID NO: 2 (camello) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variantes de quimosina de camello.
Según esto, en una forma de realización preferida - el polipéptido parental tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) e incluso más preferiblemente el polipéptido parental tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello). Puede ser preferido que el polipéptido parental sea el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello).
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - un polipéptido parental que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (camello) todavía está dentro del requisito de identidad de secuencia basada en s Eq ID NO: 1 (bovino) del punto (ii) del primer aspecto en el presente documento - es decir, será un polipéptido parental que tiene al menos el 65% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina).
Una variante aislada de quimosina bovina
Como se ha discutido anteriormente - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de SEQ ID NO: 1 (bovino) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variantes de quimosina bovina.
Una variante aislada de quimosina de camello
Como se ha discutido anteriormente - en los ejemplos de trabajo en el presente documento se hicieron variantes usando el polipéptido de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) como polipéptido parental - tal variante se puede denominar en el presente documento variantes de quimosina de camello.
Como se ha discutido anteriormente - el segundo aspecto según esto se refiere a una variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 5.
Las definiciones y formas de realización preferidas descritas anteriormente también son relevantes para este aspecto.
Preferiblemente, una variante polipeptídica de quimosina de camello aislada como se describe en el presente documento es una variante, en donde la variante tiene una actividad quimosina que da un mayor cociente C/P en comparación con el cociente C/P de la quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.
En una forma de realización preferida - el polipéptido parental tiene al menos el 92% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello), más preferiblemente el polipéptido parental tiene al menos el 95% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) e incluso más preferiblemente el polipéptido parental tiene al menos el 97% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello).
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto -un a variante de quimosina aislada puede comprender alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en otras posiciones de aminoácidos que las dadas anteriormente.
Por ejemplo, una variante de quimosina de camello con, por ejemplo, 5-10 alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido de quimosina de camello de tipo salvaje de SEQ ID NO: 2 será todavía un polipéptido parental que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello).
Se puede preferir que la variante de quimosina de camello aislada comprenda menos de 30 alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) o se puede preferir que la variante de quimosina de camello aislada comprenda menos de 20 alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) o se puede preferir que la variante de quimosina de camello aislada comprenda menos de 10 alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello) o se puede preferir que la variante de quimosina de camello aislada comprenda menos de 5 alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello).
Como entiende el experto en la materia en el presente contexto - el término “el polipéptido variante aislado que tiene menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ Id NO: 2 (quimosina de camello)” del punto (iii) anteriormente se refiere que la variante de quimosina de camello aislada descrita en el presente documento, por supuesto, no tendrá una secuencia polipeptídica que sea el 100% idéntica a la secuencia de quimosina de camello de tipo salvaje pública conocida de SEQ ID NO: 2.
Una forma de realización preferida se refiere a una variante polipeptídica de quimosina de camello aislada, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácidos correspondiente a cualquiera de la posición 134.
Se puede preferir que al menos una alteración sea una sustitución - es decir, una forma de realización preferida relevante en el presente documento se refiere a una variante polipeptídica de quimosina aislada, en donde la alteración comprende una sustitución en al menos una posición de aminoácido correspondiente a cualquiera de la posición 134.
Preferiblemente, la sustitución es 134Q.
Preferiblemente, la sustitución es H134Q.
En una forma de realización preferida, la sustitución es:
H134Q I154L D216S;
H134Q L280I G309W;
Y79S H134Q Y365F V375L; o
S132F H134Q M200I M215L G221E.
Un método para hacer un producto basado en leche
Como se ha discutido anteriormente - una variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento se puede usar según la técnica - por ejemplo, para hacer un producto basado en leche de interés (tal como, por ejemplo, un producto de queso).
Como se ha discutido anteriormente - un aspecto de la invención se refiere a un método para hacer un producto alimenticio o de pienso que comprende añadir una cantidad eficaz de la variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento al/los ingrediente(s) alimenticio(s) o de pienso y llevar a cabo etapas de fabricación adicionales para obtener el producto alimenticio o de pienso.
Preferiblemente, el producto alimenticio o de pienso es un producto basado en leche y en donde el método comprende añadir una cantidad eficaz de la variante polipeptídica de quimosina aislada como se describe en el presente documento a leche y llevar a cabo etapas de fabricación adicionales para obtener el producto basado en leche.
La leche puede ser, por ejemplo, leche de soja, leche de oveja, leche de cabra, leche de búfalo, leche de yak, leche de llama, leche de camello o leche de vaca.
El producto basado en leche puede ser, por ejemplo, un producto de leche fermentada, un quark o un queso.
Ejemplos
Ejemplo 1: Alineamiento y numeración de secuencias de proteína quimosinas y secuencias variantes
Se alinearon las secuencias de proteínas quimosinas usando el algoritmo ClustalW proporcionado por el EBI (EBI, tools, múltiple sequence alignment, CLUSTALW”, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) y como se describe en Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bio-informatics 23(21), 2947-2948.
Los ajustes de ClustalW2 para alineamientos múltiples de secuencias fueron Matriz de ponderación de proteínas = BLOSUM, apertura de hueco = 10, extensión de hueco = 0,05, distancias de hueco = 8, sin huecos finales, Iteración = ninguna, NUMITER = 1, Agolpamiento = NJ.
Como secuencia de referencia se usó la preproquimosina de quimosina B bovina (número de acceso de Genbank P00794 - divulgado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), donde la metionina N-terminal tiene el número 1 (MRCL...) y la isoleucina C-terminal (en la secuencia de proteína ...LAKAI) tiene el número 381. Las variantes se alinearon frente a la pre-pro-quimosina B bovina y los residuos se numeraron según el correspondiente residuo de quimosina bovina.
Ejemplo 2: Diseño de variantes de quimosina
Las variantes de quimosina se diseñaron usando diferentes estrategias.
Cuando se hace referencia a la quimosina de camello se hace referencia a la quimosina de camello que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 2 en el presente documento.
La quimosina de camello de SEQ ID NO: 2 se puede ver como un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina usado para hacer variantes de quimosina de camello del mismo.
Cuando se hace referencia a la quimosina bovina se hace referencia a la quimosina bovina que comprende el polipéptido de SEQ ID NO: 1 en el presente documento.
La quimosina bovina de SEQ ID NO: 1 se puede ver como un polipéptido parental relevante en el presente documento que tiene actividad quimosina usado para hacer variantes de quimosina bovina del mismo.
Las variantes de quimosina de camello se diseñaron basadas en un alineamiento de un gran conjunto de secuencias de proteasas aspárticas conocidas públicas que tienen una identidad del 25% o más comparadas con la quimosina B bovina.
Las variaciones en general se introdujeron en las regiones hipervariables, mientras que las regiones conservadas no se cambiaron. Se introdujeron variaciones múltiples en cada construcción variante, asegurando que cada mutación individual estaba presente en construcciones variantes múltiples (para una discusión de los resultados - véase el ejemplo 6 posteriormente).
Las variantes de la quimosina bovina se diseñaron basándose en una comparación de quimosina bovina y de camello. Los residuos bovinos, por ejemplo, se cambiaron al homólogo de camello (para una discusión de los resultados -véase el ejemplo 7 posteriormente).
Ejemplo 3: Preparación de material de enzima variante de quimosina
Todas las variantes de quimosina se sintetizaron como genes sintéticos y se clonaron en un vector de expresión fúngico que corresponde esencialmente a pGAMpR-C (descrito en el documento WO02/36752A2).
Los vectores se transformaron en E. coli y el ADN plasmídico se purificó usando protocolos estándar de biología molecular, que conoce el experto en la materia.
Los plásmidos variantes se transformaron individualmente en una cepa de Aspergillus niger y la proteína se produjo esencialmente como se describe en el documento WO02/36752A2 y se purificó usando técnicas de cromatografía estándar.
Como se sabe en la técnica - el experto en la materia puede basar en su conocimiento general común producir y purificar quimosina y variantes de quimosina - tal como las variantes de quimosina bovina y de camello descritas en el presente documento.
Ejemplo 4: Determinación de la actividad específica de quimosina
4.1 Determinación de la actividad de coagulación
La actividad de coagulación de la leche se determinó usando el método REMCAT, que es el método estándar desarrollado por la Federación Lechera Internacional (método IDF, por sus siglas en inglés).
La actividad de coagulación de la leche se determina a partir del tiempo necesario para una floculación visible de un sustrato de leche estándar preparado de una leche en polvo baja en grasa, a baja temperatura con una solución de cloruro de calcio de 0,5 g por litro (pH “ 6,5). El tiempo de coagulación de una muestra de cuajo se compara con el de un estándar de referencia que tiene actividad de coagulación de la leche conocida y que tiene la misma composición enzimática mediante el Estándar de IDF 110B como la muestra. Las muestras y estándares de referencia se midieron en condiciones químicas y físicas idénticas. Las muestras variantes se ajustaron a aproximadamente 3 IMCU/ml usando un tampón de ácido acético 84 mM pH 5,5. Después de ello, se añadieron 200 |j¡ de enzima a 10 ml de leche precalentada (32°C) en un tubo de ensayo de vidrio colocado en un baño de agua, capaz de mantener una temperatura constante de 32°C ± 1°C con agitación constante.
La actividad coagulante de leche total (potencia) de un cuajo se calculó en Unidades Internacionales Coagulantes de Leche (IMCU) por ml relativa a un estándar que tiene la misma composición enzimática que la muestra según la fórmula:
Potencia en IMCU/ml = Sestándar x Testándar x Dmuestra
Destándar x Tmuestra
Sestándar La actividad coagulante de leche del estándar de referencia internacional para cuajo Testándar Tiempo de coagulación en segundos obtenido para la dilución del estándar
Dmuestra Factor de dilución para la muestra
Destándar Factor de dilución para el estándar
Tmuestra Tiempo de coagulación en segundos obtenido para la muestra de cuajo diluida desde la adición de la enzima hasta el tiempo de floculación
4.2 Determinación del contenido de proteína total
El contenido de proteína total se determinó usando el kit de ensayo de proteína Pierce BCA de Thermo Scientific según las instrucciones de los proveedores.
4.3 Calculo de la actividad específica de coagulación
La actividad específica de coagulación (IMCU/mg de proteína total) se determinó dividiendo la actividad de coagulación (IMCU/ml) por el contenido total de proteína (mg de proteína total por ml).
Ejemplo 5: Determinación de la actividad proteolítica
La actividad proteolítica general se midió usando Bodipy-FL caseína marcada con fluorescencia como sustrato (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Los derivados de caseína marcados fuertemente con Bodipy-FL fluorescente verde insensible al pH producen extinción casi completa de la fluorescencia del conjugado. La hidrólisis catalizada por proteasa libera Bodipy-FL fluorescente. Este método es muy sensible lo que era esencial para este experimento ya que CHYMAX M tiene la menor actividad proteolítica general de todos los coagulantes conocidos hasta la fecha. El ensayo se realizó en un tampón fosfato 0,2 M ajustado al pH deseado a una concentración final de sustrato de 0,04 mg/ml. Antes de mezclar 1 parte de sustrato con una parte de enzima, ambos preparados en el tampón fosfato, todas las variantes enzimáticas se normalizaron a 50 IMCU/ml (según el ejemplo 4). El sustrato y la enzima se mezclaron en placas de microtitulación de 96 pocillos Nunc Fluoro, se sellaron e incubaron a 32°C durante 60 min. Después de la incubación el sellado se eliminó y la fluorescencia se registró en un fluorímetro.
Ejemplo 6: Evaluación de variantes de quimosina de camello
Para todas las variantes la actividad coagulante específica (IMCU/mg de proteína total) se determinó a pH 6,5 según el ejemplo 4. Las variantes se clasificaron usando la siguiente estrategia. La variante con la menor actividad específica obtuvo un punto, la segunda menor dos puntos, etc.
La misma estrategia de clasificación se hizo para el cociente C/P. El cociente C/P se determinó para todas las variantes a pH 6,5 dividiendo la actividad coagulante específica (IMCU/mg) por la actividad proteolítica
Se determinaron los puntos totales para cada variante usando ambas estrategias de clasificación y se hizo una clasificación final, basada en la suma de los puntos.
Como referencia se incluyeron un gen de tipo salvaje de camello y un gen de tipo salvaje bovino.
H05-3 42453 F281V V306I 1321L x x 213 G01-1 42419 H134Q I154L D216S x x 210 G10-2 42492 V261A V263I G309W L311I Y326F 204 A09-2 42478 D156V G309D M314L V317I x 203 EOl-1 42416 H134Q L280I G309W x x 200 G03-2 42436 R119Q D156V V375L X x 197 B06-2 42455 Y79S R119S H204R X x 195 B09-2 42479 Y79S H134Q Y365F V375L x 194 G02-1 42427 Y194I R213Q G309D x x 194 G04-1 42444 Y79S D117N I321L x x 193 H02-1 42428 Y185F D325M E352Q x x 189 A04-2 42438 Y79S L224V L311I x x 186 H10-2 42493 S132F H134Q M200I M215L G221E 186 H08-1 42477 F281V G309W S331Y D337E x 185 A09-2 42478 D156V G309D M314L V317I x 184 HOl-1 42420 G128D L188I Y326F x x 182 G l l - 1 42500 R119S V241I L280I L31II D325M 181 H l l - 2 42501 R119Q S284T T297S V306I G309W 178 Camello 42404 x x X X x 174 G08-2 42476 Q246E G309D S329P D337E x 174 G06-1 42460 D156V M215L V241Í x X 170 H09-1 42485 R125Q G128N H204R Q246E S284T 168 H07-2 42469 D117N V263I L280I V306I x 167 E06-2 42458 G128D T244S L311I x x 151 C03-2 42431 V90L I154L S335N x x 148 B07-1 42463 V194I V279M L280I S284T x 147 A03-2 42429 Y185F R213Q Q246E x x 146 E05-2 42450 D117N S329P T342S x x 145 H06-2 42461 G128IM R312S S313Y Y326F x 145 B03-2 42430 R125Q V279M M314L x x 143 BlO-1 42487 D216S L224V V263I F281V G309D 143 FOl-1 42417 V90L R119Q H204R x x 143 E03-3 42433 H134Q K289N G302D x x 142 A02-2 42421 I154L G221E V279M x x 136 F07-2 42467 T297S I321L D325M T3425 x 135 C l l- 2 42496 G128D I154L I258V D325M D337E 132 D02-1 42424 V261A S331Y L353K x x 132 A04-2 42438 Y79S L224V L311I x x 131 BOl-1 42413 N108K L280I S313Y x x 131 D12-1 42506 S190A V279M S313Y S331Y V375L 130 A09-2 42478 D156V G309D M314L V317I x 129 F09-1 42483 V90L E352Q R374L V375L X 129
B12-1 42504 N108K D117N M215L M314L G347S 128
D I 1-1 42497 D156V H204R V261A I321L S329P 128
F06-2 42459 D117N V261A R312S X X 125
H12-1 42502 V90L L188I R203Q L280I D337E 124
D04-2 42441 L188I G221E Y365F X X 123
E07-2 42466 R119Q V279K K289N D325M X 123
C02-2 42423 R119S R125Q K289N X X 122
D05-1 42449 R119S L224V T297S X X 122
C08-1 42472 F281V K289N L311I S313Y X 117
B02-1 42422 S132F S180A R203Q X X 115
El término “X” indica sin cambio - es decir, sin mutación.
Como todas las variantes incluían mutaciones múltiples, los datos de las variantes clasificadas se investigaron en más detalle usando métodos estadísticos y análisis de estructura 3D, para determinar los cambios de aminoácidos individuales que tienen un efecto positivo o negativo. En esta investigación también se evaluaron/incluyeron las variantes bovinas discutidas en el ejemplo 7 a continuación.
Se identificaron las siguientes mutaciones
Lóbulo del esqueleto
Lóbulo expuesto
En hendidura
Esqueleto
Esqueleto
Esqueleto
Esqueleto
Aleta del otro lado
En hendidura
Aleta
Entrada de la hendidura
Figure imgf000014_0001
Fondo de la hendidura
Fuera del lóbulo pequeño
Figure imgf000014_0002
_ __
V279M
El término “+” se refiere a un intercambio de aminoácido positivo - es decir, “++” es más positivo que “+”.
El término “-” se refiere a un intercambio de aminoácido negativo - es decir, “--” es más negativo que “-”.
Las descripciones de la columna derecha de la tabla se refieren a dónde están situadas las mutaciones individuales en la estructura 3D de la quimosina bovina. La estructura 3D de la quimosina bovina está públicamente disponible. Como ejemplo, en la figura 2 se muestran dónde están presentes las posiciones de aminoácidos 296 y 294 en la quimosina bovina.
Conclusiones:
Los resultados anteriores demuestran que las siguientes mutaciones en la quimosina de camello eran positivas (es decir, con cociente C/P mejorado en comparación con la quimosina de tipo salvaje de camello):
D117N
H134Q
L280I
D156V
V241I
D325M
L311I
G309W
G309D
V279M
Ejemplo 7: Evaluación de variantes de quimosina bovina
Se evaluaron variantes de quimosina bovina basándose en su cociente C/P a pH 6,5 solo
Figure imgf000015_0001
Como todas las variantes incluían mutaciones múltiples y los datos de las variantes clasificadas se investigaron en más detalle, usando métodos estadísticos y análisis de estructura 3D, para determinar los cambios individuales de aminoácidos que tienen un efecto positivo o negativo. En esta investigación también se evaluaron/incluyeron las variantes de camello discutidas en ejemplo 6.
Se identificaron las siguientes mutaciones positivas para quimosina bovina:
Figure imgf000015_0002
El término “+” se refiere a un intercambio de aminoácido positivo - es decir, “++” es más positivo que “+”.
El término “-” se refiere a un intercambio de aminoácido negativo - es decir, “--” es más negativo que “-”.
Conclusiones:
Los resultados anteriores demuestran que las siguientes mutaciones en la quimosina bovina eran positivas (es decir, con cociente C/P mejorado en comparación con la quimosina de tipo salvaje bovina):
Q300R
H350N
K353L
Q141E
I143F
Ejemplo 8: Posiciones para hacer una mutación positiva en quimosina
Una evaluación comparativa de los resultados descritos en los ejemplos 6 y 7 produce los siguientes datos.
Región de la hendidura catalítica 279-281
Como se muestra en el ejemplo 7, la doble mutación K279V y V281F en la quimosina bovina produjo un efecto negativo en el cociente C/P. En la quimosina de camello la mutación V279K también produjo un resultado negativo (ejemplo 6). Por tanto, se concluye que el aminoácido óptimo en la posición 281 es una V. También se observó que la mutación L280I en camello tuvo un efecto positivo.
Región del lóbulo pequeño 298-300
Como se muestra en el ejemplo 7, la doble mutación Q298E y Q300R en la quimosina bovina tuvo un efecto positivo sobre el cociente C/P.
Región de la hendidura catalítica 350-353
Como se muestra en el ejemplo 7, la triple mutación H350N, Q352E y K353L en la quimosina bovina tuvo un efecto positivo sobre el cociente C/P.
En la quimosina de camello se observó (ejemplo 6) que L353Q tuvo un efecto positivo mientras que L353K tuvo un efecto negativo.
Región del lóbulo pequeño 307-311
Como se muestra en el ejemplo 7, la doble mutación D307N y D309G en la quimosina bovina tuvo un efecto negativo sobre el cociente C/P.
En quimosina de camello G309D y G309W tienen un efecto positivo. Esto implica que la mutación D307N en la quimosina bovina es responsable del efecto negativo.
En quimosina de camello se mostró que una mutación L311I tenía efectos beneficiosos.
Región esqueleto 134-143
Como se muestra en el ejemplo 7, la doble mutación Q141E e I143F en la quimosina bovina tuvo un efecto positivo sobre el cociente C/P.
Cambiar H134 a Q en quimosina de camello se mostró que tenía un efecto beneficioso.
Figure imgf000016_0001
Referencias
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4: van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, Septiembre 2006, páginas 304-310.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada que comprende las etapas:
(a) : hacer una alteración en una o más posiciones en un polipéptido parental que tiene actividad quimosina, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácido correspondiente a la posición 134; y
(b) : producir y aislar el polipéptido alterado de la etapa (a) y mediante ello obtener la variante polipeptídica de quimosina aislada, en donde la variante tiene actividad quimosina;
y en donde:
(i) : la posición de aminoácido del polipéptido parental se determina mediante un alineamiento del polipéptido parental con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) - es decir, el polipéptido de SEQ iD NO: 1 se usa para determinar la correspondiente secuencia de aminoácidos en el polipéptido parental; y
(ii) : el polipéptido parental tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello), que es desde la posición de aminoácido 59 hasta la posición de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 2; y
en donde la variante polipeptídica de quimosina aislada tiene:
- una actividad quimosina que da un cociente C/P mayor en comparación con el cociente C/P de quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.
2. El método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la alteración es una sustitución en al menos una posición de aminoácido correspondiente a la posición 134.
3. El método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 2 en donde la sustitución es 134Q.
4. El método para hacer una variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 2 en donde la sustitución es H134Q.
5. Una variante polipeptídica de quimosina aislada que comprende:
(a) : una alteración en una o más posiciones en un polipéptido parental que tiene actividad quimosina, en donde la alteración comprende una sustitución, una deleción o una inserción en al menos una posición de aminoácido correspondiente a la posición 134; y
(b) : en donde la variante tiene actividad quimosina;
y en donde:
(i) : la posición de aminoácido del polipéptido parental se determina mediante un alineamiento del polipéptido parental con el polipéptido de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina) - es decir, el polipéptido de SEQ ID NO: 1 se usa para determinar la correspondiente secuencia de aminoácidos en el polipéptido parental; y
(ii) : el polipéptido parental tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello), que es desde la posición de aminoácido 59 hasta la posición de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 2; y
(iii) : el polipéptido variante aislado tiene menos del 100% de identidad de secuencia con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello); y
en donde la variante aislada tiene una actividad quimosina que da un cociente C/P mayor en comparación con el cociente C/P de quimosina de camello que comprende el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2.
6. La variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 5, en donde la variante de quimosina de camello aislada comprende menos de 10 alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en comparación con el polipéptido maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camello).
7. La variante polipeptídica de quimosina aislada de cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, en donde la alteración es una sustitución en al menos una posición de aminoácido correspondiente a la posición 134.
8. La variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 7, en donde la sustitución es 134Q.
9. La variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 8, en donde la sustitución es H134Q.
10. La variante polipeptídica de quimosina aislada de la reivindicación 9, en donde la sustitución es:
H134Q I154L D216S;
H134Q L280I G309W;
Y79S H134Q Y365F V375L; o
S132F H134Q M200I M215L G221E.
11. Un método para hacer un producto alimenticio o de pienso que comprende añadir una cantidad eficaz de la variante polipeptídica de quimosina aislada según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 al ingrediente(s) de alimento o pienso y llevar a cabo etapas de fabricación adicionales para obtener el producto alimenticio o de pienso.
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