CN104487572B - 具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体 - Google Patents

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Abstract

具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体。

Description

具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体
发明领域
本发明涉及具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体。
发明背景
利用凝乳酶类(例如凝乳酶及胃蛋白酶)对乳的酶法凝固是奶酪生产中最重要工艺中的一个。酶法乳凝固是一个两阶段工艺：第一阶段，其中蛋白水解酶、凝乳酶或胃蛋白酶攻击κ-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态以及第二阶段，其中乳随后凝固并形成凝固物。
凝乳酶(EC 3.4.23.4)及胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)(哺乳动物胃中的凝乳酶类)是属于肽酶中一大类的天冬氨酸蛋白酶。
当在胃黏膜细胞中产生时，凝乳酶以及胃蛋白酶分别是以无酶学活性的凝乳酶原前体以及胃蛋白酶原前体存在。当分泌凝乳酶时，N-端肽片段，即片段前体(信号肽)被切除以产生包含片段原(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是一种基本上无活性形式的酶，但是，其在酸性条件下会因片段原的自催化移除而被激活成为活性凝乳酶。此激活在适宜的pH条件下在胃腔中体内发生或在酸性条件下体外发生。
已对牛(即Bos Taurus)的结构以及功能特征、凝乳酶原前体、凝乳酶原以及凝乳酶进行了深入地研究。牛凝乳酶原前体分子的前体部分(pre-part)包含16aa残基，对应的凝乳酶原的原体部分(pro-part)具有42aa残基的长度。活性牛凝乳酶包含323aa，是两种皆具有活性的形式A及B的混合物。
凝乳酶是在哺乳动物种中自然地产生的，所述种例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵羊、猪、人、猴以及大鼠。
多年来，牛凝乳酶可商用于乳品工业。
WO02/36752A2(Chr.Hansen)描述了骆驼凝乳酶之重组制造。
以下随即列出的参考文献可在本发明的上下文中视为描述凝乳酶的突变体的参考文献：
-Suzuki等:Site directed mutagenesis reveals functional contributionof Thr218,Lys220and Asp304in chymosin(定点诱变揭露凝乳酶中Thr218、Lys220以及Asp304的功能性分布),Protein Engineering,第4卷,1990年1月,69-71页；
-Suzuki等:Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis(通过定点诱变改变凝乳酶的催化性质),Protein Engineering,第2卷,1989年5月,563-569页；
-van den Brink等:Increased production of chymosin by glycosylation(通过糖基化增产凝乳酶),Journal of biotechnology,第125卷,2006年9月,304-310页；
-Pitts等:Expression and characterisation of chymosin pH optimamutants produced in Tricoderma reesei(瑞氏木霉中产生的凝乳酶pH最适宜突变体的表达以及表征),Journal of biotechnology,第28卷,1993年3月,69-83页；
-M.G.Williams等:Mutagenesis,biochemical characterization and X-raystructural analysis of point mutants of bovine chymosin(牛凝乳酶的点突变体的诱变、生化表征以及X-射线结构分析),Protein engineering design and selection,第10卷,1997年9月,991-997页；
-Strop等:Engineering enzyme subsite specificity:preparation,kineticcharacterization,and x-ray analysis at 2.0ANG resolution of Val111phe sitemutated calf chymosin(工程酶亚位点特异性：在Val111phe位点突变的小牛凝乳酶的2.0ANG分辨率下的制备、动力学表征、以及x-射线分析),Biochemistry,第29卷,1990年10月,9863-9871页；
-Supannee等:Site-specific mutations of calf chymosin B whichinfluence milk-clotting activity(影响凝乳活性的小牛凝乳酶B的位点特异性突变),Food Chemistry,第62卷,1998年6月,133-139页；
-Zhang等:Functional implications of disulfide bond,Cys45-Cys50,inrecombinant prochymosin(重组凝乳酶原中二硫键(Cys45-Cys50)的功能性含义),Biochimica et biophysica acta,第1343卷,1997年12月,278-286页。
上述现有技术的参考文献没有一篇直接并明确地描述了下文中所描述/要求保护 的任一凝乳酶突变体/变体。
发明内容
本发明要解决的问题是提供具有改善的凝乳性质的凝乳酶变体。
如文中工作实施例中所讨论——本发明者已鉴定出多种改善的骆驼(参见文中实施例6)以及牛(参见文中实施例7)凝乳酶变体。
基于骆驼以及牛变体的对比性分析-本发明者鉴定出了多个其它氨基酸位置，从通过制备这些位置中一个或多个的变体可得到改善的凝乳酶变体(参见文中实施例8)的意义上讲，这在文中是重要的。
如本领域中所知——获自不同的哺乳动物种(例如，比如，牛、骆驼、绵羊、猪、或大鼠)的不同天然野生型凝乳酶多肽序列具有相对高的序列类似性/同一性。
在文中图1中，这是通过文中相关的不同凝乳酶序列的比对例示的。
就此相对密切的序列关系而言——认为不同的天然野生型凝乳酶的3D结构也相对类似。
在本发明上下文中——天然获得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶)在文中可为亲本多肽的实例——即发生改变以得到本发明的变体凝乳酶多肽的亲本多肽。
不受理论限制——认为文中所述的凝乳酶相关的氨基酸位置在文中任意的所关注的相关凝乳酶(例如，例如牛、骆驼、绵羊、猪、大鼠等的凝乳酶)中具有普遍重要性——从通过制备这些位置中一个或多个的变体通常可得到改善的凝乳酶变体的意义上讲(例如，改善的牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠凝乳酶变体)。
如文中所述——在文中将公众已知的牛凝乳酶B凝乳酶原前体序列(Genbank登录号P00794——在文中以SEQ ID NO:1公开)用作参照序列以确定所关注(例如，骆驼、绵羊、牛等)的亲本凝乳酶多肽的氨基酸位置。
SEQ ID NO:1的牛凝乳酶B凝乳酶原前体在文中可另称为牛(Bos bovis)凝乳酶B或仅称为牛凝乳酶。序列也在文中图1中所示。
文中另一个相关的凝乳酶序列是公众已知的文中SEQ ID NO:2的单峰驼(Camelius dromedarius)凝乳酶序列。在文中可另称为骆驼凝乳酶。序列也在文中图1中所示。
在本发明上下文中，认为具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性的亲本凝乳酶多肽(例如，来自绵羊或大鼠的亲本凝乳酶多肽)在文中可视为与例如牛或骆驼凝乳酶有充分的结构相关性，从而可通过制备如文中所述的任一氨基酸位置的变体而加以改善。
因此，本发明的第一方面涉及一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：
(a)：在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置制造改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：制备并分离步骤(a)中改变的多肽，从而得到分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽比对确定的——即，将SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
如本领域中已知——技术人员可根据他的一般公知常识常规地制备并纯化凝乳酶以及凝乳酶变体。
换句话说，一旦技术人员拥有本文中所关注(例如，来自牛、骆驼、绵羊、猪、或大鼠)的具有凝乳酶活性的相关的亲本多肽，则对于技术人员来说制备该所关注的亲本凝乳酶的变体是常规工作。
本发明的第二方面涉及利用第一方面的方法或其任何的文中相关的实施方案获得的分离的凝乳酶多肽变体。
关于以上第二方面的术语“获得的”应被理解成分离的凝乳酶多肽变体已利用第一方面的方法或其任何的文中相关的实施方案获得。
因此，关于第二方面的术语“获得的”不应被理解成可获得的。
如文中所述——在文中工作实施例中，利用SEQ ID NO:1(牛)的多肽作为亲本多肽来制备变体——所述变体在文中可称为牛凝乳酶变体。
因此，本发明的第三方面涉及分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352以及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽比对来确定的——即，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性。
如文中所述——在文中工作实施例中，利用SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的多肽作为亲本多肽来制备变体——该变体在文中可称为骆驼凝乳酶变体。
因此，本发明的第四方面涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352以及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽比对来确定的——即，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽少于100％的序列同一性。
可根据本领域使用如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体——例如，用于生产所关注的食品或饲料产品(例如，比如，所关注的基于乳的产品，其可例如为奶酪产品)。
因此，本发明的第五方面涉及一种生产食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体加入食品或饲料成分中并进行进一步制作步骤以得到所述食品或饲料产品。
以下仅通过实施例来描述本发明的实施方案。
定义：
文中相关术语的所有定义是根据技术人员参照文中相关的技术上下文所理解的内容。
术语“凝乳酶”涉及EC 3.4.23.4类的酶。凝乳酶具有高特异性并且其是通过裂解酪蛋白的κ-链中单个105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108键来使乳凝固。本领域技术中所用的另一个名称是凝乳素(rennin)。
术语“凝乳酶活性”涉及技术人员在本发明上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活性。
技术人员知道如何确定文中相关的凝乳酶活性。
在文中工作实施例4中，提供了一个确定凝乳酶比活——另称为凝固活性或凝乳活性的标准方法的实例。
在文中工作实施例5中，提供了一个确定蛋白水解活性的标准方法的实例。
如本领域中已知——文中相关的所谓C/P比是通过凝固比活(C)除以蛋白水解活性(P)来确定的。
如本领域中已知——更高的C/P比通常意味着在(例如)奶酪生产期间因非特异性蛋白降解而导致的蛋白损失减少，也就是，奶酪产量得以提高，并且在熟化期间奶酪中的苦味的生成降低。
术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面中，利用SDS PAGE确定，变体具有至少1％纯度，例如，至少5％纯度，至少10％纯度，至少20％纯度，至少40％纯度，至少60％纯度，至少80％纯度，以及至少90％纯度。
术语“成熟的多肽”意指在翻译以及任何翻译后修饰(例如，N端加工、C端截断、糖基化、磷酸化等)后的最终形式的肽。在本发明上下文中，文中相关的成熟凝乳酶多肽可被视为活性凝乳酶多肽序列——也就是，没有前体部分的序列和/或原体部分的序列。成熟多肽的文中相关实例是例如SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽，其是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381；或者是SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽，其是从SEQ IDNO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
术语“亲本”或“具有凝乳酶活性的亲本多肽”意指对其进行改变以制得本发明的酶变体的多肽。亲本可为天然产生(野生型)的多肽或其变体。
术语“序列同一性”涉及两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关系。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度是利用如在优选3.0.0版本或更新版本的EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定的。所用的可选参数是开放空位罚分(gap open penalty)10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)置换矩阵。将Needle标记的“最长同一性”的输出结果(利用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并按如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
就本发明而言，两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性程度是利用如在优选3.0.0版本或更新版本的EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等,2000,如上所述)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch,1970,如上所述)确定的。所用的可选参数是开放空位罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)置换矩阵。将Needle标记的“最长同一性”的输出结果(利用-nobrief选项获得)用作百分比同一性并按如下计算：
(相同的脱氧核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
术语“变体”意指一种具有凝乳酶活性的包含一个或更多个(若干个)位置处的改变(也就是，置换、插入、和/或缺失)的肽。置换意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸替换；缺失意指占据一个位置的氨基酸的移除；而插入意指邻近占据一个位置的氨基酸加入1-3个氨基酸。
氨基酸可为天然或非天然氨基酸——例如，被例如D-丙氨酸的例如特定的D-异构体(或D-形式)置换在理论上是可行的。
术语“野生型”凝乳酶肽意指由天然产生的生物体(例如，自然界中可见的哺乳动物(例如，骆驼或牛))表达的凝乳酶。
附图说明
图1：文中相关的不同凝乳酶序列的比对。所示的“牛凝乳酶B”是文中SEQ ID NO:1的牛凝乳酶并且所示的“单峰驼”是文中SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶。将如文中所述的SEQID NO:1的牛凝乳酶用作参照序列，可例如看出牛凝乳酶在位置10中具有“V”而骆驼凝乳酶在同样的位置10中具有“A”。也(例如)可看出牛/大鼠在位置352中具有“Q”并且骆驼/双峰驼在相同的位置352中具有“E”。
根据图1中所示的凝乳酶序列——绵羊具有与牛SEQ ID NO:1的94.5％序列同一性；双峰驼(C.bacttrianus)具有与牛SEQ ID NO:1的83.2％序列同一性；单峰驼(SEQ IDNO:2的骆驼凝乳酶)具有与牛SEQ ID NO:1的84％序列同一性；猪具有与牛SEQ ID NO:1的80.3％序列同一性，大鼠具有与牛SEQ ID NO:1的71.9％序列同一性。
如技术人员在本发明上下文中所理解——(例如)绵羊、双峰驼、骆驼、猪或大鼠凝乳酶的成熟多肽序列与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶——也就是，SEQ ID NO:1的氨基酸位置59至381)的成熟多肽的文中相关的序列同一性百分比在相当程度上类似于上述序列同一性百分比。
图2：牛凝乳酶的3D结构——3D结构是公众可获得的。显示了其中氨基酸位置296及294存在于牛凝乳酶中的一个实例。
具体实施方式
确定所关注的凝乳酶的氨基酸位置
如上所讨论——在文中将文中以SEQ ID NO:1公开的公众已知的牛凝乳酶序列用作参考序列来确定所关注(例如，骆驼、绵羊、牛等)的文中相关的凝乳酶多肽的氨基酸位置。
就本发明而言，将以SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)公开的多肽用于确定另一种凝乳酶多肽中对应的氨基酸残基。使另一种凝乳酶多肽的氨基酸序列与以SEQ ID NO:1公开的多肽比对，并根据比对，利用文中工作实施例1中所描述的ClustalW算法，确定对应于以SEQID NO:1公开的多肽中任意氨基酸残基的氨基酸位置编号。
另一种凝乳酶多肽中对应的氨基酸残基的鉴定可通过利用如在优选3.0.0版本或更新版本的EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,Trends Genet.16:276-277)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)证实。
基于以上熟知的计算机程序——对于技术人员而言，确定所关注(例如，骆驼、绵羊、牛等)的文中相关凝乳酶多肽的氨基酸位置是常规工作。
在文中图1中显示了比对的一个实例。
只作为一个实例——在图1中，可(例如)看出，文中所用的牛参照SEQ ID NO:1在位置50中具有“G”，“单峰驼”(文中SEQ ID NO:2)在这个位置50中具有“A”。
变体的命名
在描述本发明变体中，为便于参考，采用以下所述的命名法。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。
在以下这个“命名”部分中所述的特定变体可以不是本发明文中相关变体——也就是，此“命名”部分只用于描述如此般文中相关所用的命名。
置换。对于氨基酸置换，使用以下命名：初始的氨基酸，位置，置换的氨基酸。因此，位置226处苏氨酸被丙氨酸在理论上的置换被表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变是通过加号(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，分别表示位置205及411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)以及丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)的置换。例如称为“226A”的置换指位置226处的亲本氨基酸(例如，T、Q、S或另一种亲本氨基酸)被丙氨酸的置换。
缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名：初始氨基酸，位置，*。因此，位置195处甘氨酸的缺失被表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失是通过加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名：初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸。因此，在位置195处的甘氨酸后插入赖氨酸被表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[初始氨基酸，位置，初始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸#2；等]。例如，在位置195处的甘氨酸后插入赖氨酸及丙氨酸被表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在这些情况中，插入的氨基酸残基是通过将小写字母加到所插入的氨基酸残基前的氨基酸残基的位置编号而编号的。在以上实施例中，序列因此为：
<u>亲本:</u> <u>变体:</u>
195 195195a 195b
G G-K-A
多个改变。包含多个改变的变体是通过加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，分别表示酪氨酸及谷氨酸置换位置170及195处的精氨酸及甘氨酸。
不同置换。当可在一位置处引入不同置换时，不同置换是通过逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”或“R170Y,E”，表示位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸的置换。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”或“Y167G,A+R170G,A”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法
如上所讨论——如本领域中已知，技术人员可根据他的一般公知常识常规地制备以及纯化凝乳酶以及凝乳酶变体。
换句话说，一旦技术人员拥有所关注(例如，来自牛、骆驼、绵羊、猪、或大鼠)的具有凝乳酶活性的文中相关的亲本多肽，则对于技术人员来说制备该所关注的亲本凝乳酶的变体是常规工作。
制备并分离凝乳酶(变体或亲本)的适宜方法的一个实例可为如(例如)WO02/36752A2(Chr.Hansen)中所述的熟知的(例如)基于真菌重组表达/制备的技术。
在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置制造改变对于技术人员来说也是常规工作，其中所述改变包含至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
如技术人员已知——此可(例如)通过基于所谓的定点诱变以及重组表达/制备的技术达成。
确定文中相关的亲本多肽(例如，骆驼或牛野生型凝乳酶)和/或文中相关的变体是否具有凝乳酶活性对于技术人员来说也是常规工作。
如本领域中所知——凝乳酶活性可通过所谓的C/P比确定，C/P比是通过将凝固比活(C)除以蛋白水解活性(P)确定的。
如本领域中已知——更高的C/P比通常意味着在(例如)奶酪生产期间因非特异性蛋白降解而导致的蛋白损失减少，也就是，奶酪产量得到提高，并且在熟化期间奶酪中的苦味的生成降低。
在文中工作实施例4中，描述了一种确定凝固比活(C)的适宜方法，在文中工作实施例5中，描述了一种确定蛋白水解活性(P)的适宜方法。
优选地，如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体是这样一种变体，其中该变体具有产生比包含文中SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
优选地，如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体是这样一种变体，其中该变体具有产生比包含文中SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
更优选地，如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体是这样一种变体，其中该变体具有
-产生比包含文中SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性；以及
-产生比包含文中SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
如上所讨论——在文中将文中以SEQ ID NO:1公开的公众已知的牛凝乳酶序列用作参照序列以确定所关注(例如，骆驼、绵羊、牛等)的文中相关凝乳酶多肽的氨基酸位置。
如上所讨论——基于(例如)文中所讨论的计算机序列比对程序——对于技术人员而言，确定所关注(例如，骆驼、绵羊、牛等)的文中相关凝乳酶多肽的文中相关氨基酸位置是常规工作。
(例如)文中第一方面的方法中术语“亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性”可视为涉及用于制备其文中相关变体的亲本凝乳酶多肽的基于序列的限制。
换句话说——具有与成熟牛凝乳酶至少65％序列同一性的成熟亲本凝乳酶多肽(例如，绵羊或猪)被认为与(例如)牛或骆驼凝乳酶的结构充分相同，从而是文中相关的——也就是，在本发明上下文中，认为具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性的成熟亲本凝乳酶多肽(例如，来自，例如，绵羊或大鼠)在文中可视为与(例如)牛或骆驼凝乳酶有充分的结构相关性，从而能够通过制备如文中所述的任意氨基酸位置的变体加以改善。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶多肽具有与SEQ ID NO:1的牛多肽(也就是，从位置1到381的完整SEQ ID NO:1，其包含前体和原体序列)84％序列同一性。
如技术人员在本发明上下文中所理解——具有凝乳酶活性的文中相关的亲本多肽可能已经是例如，(例如)相应野生型凝乳酶的变体。
例如，与SEQ ID NO:2的野生型骆驼凝乳酶多肽相比，具有(例如)5-10个改变(例如，置换)的骆驼凝乳酶变体仍会是如在(例如)文中第一方面中所需的具有与SEQ ID NO:1(牛)的成熟多肽至少65％序列同一性的亲本多肽。
换句话说，文中相关的分离的凝乳酶多肽变体可包含除(例如)文中第一方面的位置外的其他位置的改变(例如，置换)。
就文中图1中所示的凝乳酶序列而言——绵羊具有与牛SEQ ID NO:1的94.5％序列同一性；双峰驼具有与牛SEQ ID NO:1的83.2％序列同一性；猪具有与牛SEQ ID NO:1的80.3％序列同一性；大鼠具有与牛SEQ ID NO:1的71.9％序列同一性。
如技术人员在本发明上下文中所理解——(例如)成熟绵羊、双峰驼、骆驼、猪或大鼠凝乳酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽(牛凝乳酶——也就是，SEQ ID NO:1的氨基酸位置59至381)的文中相关的序列同一性百分比在相当程度上类似于上述序列同一性百分比。
优选变体：
如上所讨论——例如，第一方面涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
一个优选的实施方案涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
可以是优选地，至少一个改变是置换——也就是，文中相关的优选实施方案涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，置换为其中该置换是117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
如技术人员在本发明上下文中所理解——如果亲本凝乳酶多肽已经在位置156处具有(例如)“V”，则不能理解为对此特定亲本凝乳酶多肽制造了置换156V。如文中图1中所示——大鼠野生型凝乳酶在位置156处具有“V”——置换156V可视为对于图1中特定的大鼠凝乳酶多肽序列是文中无关的。
优选地，置换为其中该置换是134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
优选地，置换为其中该置换是D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
如技术人员在本发明上下文中所理解——如果亲本凝乳酶多肽在位置156处不具有(例如)“D”，则不能理解为对此特定亲本凝乳酶多肽制造了置换D156V。如在文中图1中所示——大鼠野生型凝乳酶在位置156处具有“V”——置换D156V因此可视为对于图1中特定的大鼠凝乳酶多肽序列是文中无关的。
在一个优选的实施方案中，置换为其中该置换是H134Q、Q141E、I143F、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
在一个优选的实施方案中，置换为其中该置换是：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
具有凝乳酶活性的优选亲本多肽：
优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少70％序列同一性，更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少75％序列同一性。
仅作为一个实例——文中适宜的相关亲本多肽可(例如)为牛凝乳酶A——如在本领域中已知，与文中SEQ ID NO:1的牛凝乳酶B相比，牛凝乳酶A可只具有一处氨基酸差异。
如上所讨论——在文中工作实施例中，将SEQ ID NO:1(牛)的多肽用作亲本多肽来制备变体——该变体在文中可称为牛凝乳酶变体。
因此，在一个优选的实施方案中——亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性以及甚至更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。优选地，亲本多肽可为SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽。
如技术人员在本发明上下文中所理解——具有凝乳酶活性的文中相关的亲本多肽可能已经是例如，(例如)相应野生型凝乳酶的变体。
例如，与SEQ ID NO:1的成熟野生型牛凝乳酶多肽相比，具有(例如)5-10个改变(例如，置换)的牛凝乳酶变体仍会是具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性的亲本多肽。
SEQ ID NO:1(牛)的成熟多肽的长度为323个氨基酸——因此，与SEQ ID NO:1的成熟野生型牛凝乳酶多肽相比，具有(例如)25个氨基酸置换的牛凝乳酶变体不会是具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性的亲本多肽。
换句话说并且一般来讲——文中相关的分离的凝乳酶多肽变体可包含除(例如)文中第一方面中位置外的其它位置的改变(例如，置换)。
如上所讨论——在文中工作实施例中，将SEQ ID NO:2(骆驼)的多肽用作亲本多肽来制备变体——该变体在文中可称为骆驼凝乳酶变体。
因此，在一个优选的实施方案中——亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性以及甚至更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。优选地，亲本多肽可为SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽。
如技术人员在本发明上下文中所理解——具有与SEQ ID NO:2(骆驼)的成熟多肽至少90％序列同一性的亲本多肽仍在文中第一方面的点(ii)中基于SEQ ID NO:1(牛)的序列同一性需求的范围内——也就是，其将是具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性的亲本多肽。
分离的牛凝乳酶的变体：
如上所讨论——在文中工作实施例中，将SEQ ID NO:1(牛)的多肽用作亲本多肽来制备变体——该变体在文中可称为牛凝乳酶变体。
如以上所讨论——因此，第三方面涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽的比对确定的——也就是，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)：分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性。
上述定义及优选实施方案也与此方面相关。
优选地，如文中所述的分离的牛凝乳酶多肽变体是这样一种变体，其中该变体具有产生比包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
在一个优选的实施方案中——亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少92％序列同一性，更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性以及甚至更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。
如技术人员在本发明上下文中所理解——分离的凝乳酶变体可包含除以上所给出氨基酸位置以外的其它氨基酸位置的改变(例如，置换)。
例如，与SEQ ID NO:1的野生型牛凝乳酶多肽相比，具有(例如)5-10个改变(例如，置换)的牛凝乳酶变体仍会为具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性的亲本多肽。
可以优选地，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于30个氨基酸改变(例如，置换)或可以优选地，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于20个氨基酸改变(例如，置换)或可以优选地，与SEQ IDNO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如，置换)或可以优选地，与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的牛凝乳酶变体包含少于5个氨基酸改变(例如，置换)。
如技术人员在本发明上下文中所理解——以上点(iii)中术语“分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性”涉及文中所述的分离的牛凝乳酶变体理所当然不应具有与SEQ ID NO:1的公众已知的野生型牛凝乳酶序列100％相同的多肽序列。
一个优选的实施方案涉及一种分离的牛凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
优选地，至少一个改变可为置换——也就是，文中相关的优选实施方案涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，置换为其中该置换是117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
优选地，置换为其中该置换是134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
优选地，置换为其中该置换是D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
在一个优选的实施方案中，置换为其中该置换是：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
分离的骆驼凝乳酶的变体：
如上所讨论——在文中工作实施例中，将SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的多肽用作亲本多肽来制备变体——该变体在文中可称为骆驼凝乳酶变体。
如上所讨论——因此，第四方面涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a):具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中该改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中该变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽的比对确定的——也就是，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性；以及
(iii)：分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性。
上述定义以及优选的实施方案也与此方面相关。
优选地，如文中所述的分离的骆驼凝乳酶多肽变体是这样一种变体，其中该变体具有产生比包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
在一个优选的实施方案中——亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少92％序列同一性，更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性以及甚至更优选地，亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。
如技术人员在本发明上下文中所理解——分离的凝乳酶变体可包含除以上给出氨基酸位置以外的其它氨基酸位置的改变(例如，置换)。
例如，与SEQ ID NO:2的野生型骆驼凝乳酶多肽相比，具有(例如)5-10个改变(例如置换)的骆驼凝乳酶变体仍会为具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性的亲本多肽。
优选地，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体可包含少于30个氨基酸改变(例如置换)或优选地，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体可包含少于20个氨基酸改变(例如置换)或优选地，与SEQ IDNO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体可包含少于10个氨基酸改变(例如置换)或优选地，与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，分离的骆驼凝乳酶变体可包含少于5个氨基酸改变(例如置换)。
如技术人员在本发明上下文中所理解——以上点(iii)中术语“分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性”涉及文中所述的分离的骆驼凝乳酶变体理所当然不应具有与SEQ ID NO:2的公众已知的野生型骆驼凝乳酶序列100％一致的多肽序列。
一个优选的实施方案涉及一种分离的骆驼凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
优选地，至少一个改变可为置换——也就是，文中相关的优选实施方案涉及一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，一种分离的凝乳酶多肽变体，其中改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
优选地，置换为其中该置换是117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
优选地，置换为其中该置换是134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
优选地，置换为其中该置换是D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
在一个优选的实施方案中，置换为其中该置换是：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
一种制作基于乳的产品的方法
如上所讨论——可根据本领域使用如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体——例如用于制作所关注的基于乳的产品(例如，比如，奶酪产品)。
如上所讨论——本发明的一个方面涉及一种制作食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体加入食品或饲料成分中并进行进一步制作步骤以获得食品或饲料产品。
优选地，食品或饲料产品是一种基于乳的产品并且其中该方法包括将有效量的如文中所述的分离的凝乳酶多肽变体加入乳中并进行进一步制作步骤以得到基于乳的产品。
乳可为(例如)豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊驼乳、骆驼乳或牛乳。
基于乳的产品可(例如)为发酵乳品、夸克或奶酪。
文中方面/实施方案——以权利要求形式呈现
本发明中本文中所述方面以及优选实施方案可以所谓的权利要求形式呈现/描述——见下述。
1.一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：
(a)：在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置制造改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：制备并分离步骤(a)中改变的多肽，从而得到分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽的比对确定的——也就是，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少65％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
2.如权利要求1所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述的分离的凝乳酶多肽变体具有：
-产生比包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性；以及
-产生比包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
3.如以上权利要求中任一项所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
4.如以上权利要求中任一项所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
5.如以上权利要求中任一项所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
6.如权利要求4所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述置换为117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
7.如权利要求6所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述置换为134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
8.如权利要求4所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述置换为D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
9.如权利要求8所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述置换为H134Q、Q141E、I143F、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
10.如权利要求4所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述置换为：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
11.如以上权利要求中任一项所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述的亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少75％序列同一性。
12.如权利要求11所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述的亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性。
13.如权利要求1至10中任一项所述的制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述的亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少95％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381。
14.一种通过权利要求1至13中任一项所述的方法得到的分离的凝乳酶多肽变体。
15.一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽的比对确定的——也就是，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:1的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)：分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性。
16.如权利要求15所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述的分离变体具有产生比包含SEQ ID NO:1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
17.如权利要求15至16中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述的亲本多肽具有与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。
18.如权利要求15至17中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中与SEQ IDNO:1(牛凝乳酶)的成熟多肽相比，所述的分离的牛凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如置换)。
19.如权利要求15至18中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
20.如权利要求15至19中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
21.如权利要求20所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
22.如权利要求20所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
23.如权利要求22所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
24.如权利要求22所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
25.如权利要求20所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
26.一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1(牛凝乳酶)的多肽的比对确定的——也就是，SEQ ID NO:1的多肽用于确定亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少90％序列同一性，所述成熟多肽是从SEQ ID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)：分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽少于100％序列同一性。
27.如权利要求26所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述的分离变体具有产生比包含SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性。
28.如权利要求26至27中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述的亲本多肽具有与SEQ ID NO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽至少97％序列同一性。
29.如权利要求26至28中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中与SEQ IDNO:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肽相比，所述的分离的骆驼凝乳酶变体包含少于10个氨基酸改变(例如置换)。
30.如权利要求26至29中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换、缺失或插入。
31.如权利要求26至30中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置117、134、141、143、156、241、279、280、281、298、300、307、309、311、325、350、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
32.如权利要求31所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含对应于位置134、141、143、280、281、298、300、307、309、311、352及353中任一个位置的至少一个氨基酸位置的置换。
33.如权利要求31所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为117N、134Q、141E、143F、156V、241I、279M、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、325M、350N、352L、352Q、353L或353Q。
34.如权利要求33所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为134Q、141E、143F、280I、281V、298E、300R、307D、309D、309W、311I、352L、352Q、353L或353Q。
35.如权利要求33所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为D117N、H134Q、Q141E、I143F、D156V、V241I、V279M、L280I、F281V、Q298E、Q300R、N307D、G309D、G309W、L311I、D325M、H350N、Q352L、E352L、E352Q、K353L或K353Q。
36.如权利要求31所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述置换为：
F281V+V306I+I321L；
H134Q+I154L+D216S；
V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
D156V+G309D+M314L+V317I；
H134Q+L280I+G309W；
R119Q+D156V+V375L；
Y79S+R119S+H204R；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
Y194I+R213Q+G309D；
Y79S+D117N+I321L；
Y185F+D325M+E352Q；
Y79S+L224V+L311I；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E；
F281V+G309W+S331Y+D337E；
D156V+G309D+M314L+V317I；
G128D+L188I+Y326F；
R119S+V241I+L280I+L311I+D325M；
R119Q+S284T+T297S+V306I+G309W
K279V+V281F；
Q298E+Q300R；
H350N+Q352E+K353L；
D307N+D309G；或
Q141E+I143F。
37.一种制作食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的如权利要求14至36中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体加入食品或饲料成分中并进行进一步制作步骤以得到食品或饲料产品。
38.如权利要求37所述的制作食品或饲料产品的方法，其中所述产品是基于乳的产品并且其中所述方法包括将有效量的如权利要求14至36中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体加入乳中并进行进一步制作步骤以得到基于乳的产品。
39.如权利要求38所述的制作基于乳的产品的方法，其中所述乳为豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊驼乳、骆驼乳或牛乳。
40.如权利要求38至39中任一项所述的制作基于乳的产品的方法，其中所述的基于乳的产品是发酵乳制品、夸克或奶酪。
实施例
实施例1：凝乳酶蛋白序列以及变体序列的比对及编号
利用EBI(EBI,tools,多序列比对,CLUSTALW”,http://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/clustalw2/)提供并在Larkin MA,Blackshields G,Brown NP,Chenna R,McGettiganPA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,Wilm A,Lopez R,Thompson JD,Gibson TJ,Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21),2947-2948中所述的ClustalW算法来比对凝乳酶蛋白序列。
多序列比对的ClustalW2设置为Protein weight Matrix＝BLOSUM，GAP open＝10，GAP EXTENSION＝0,05，GAP DISTANCES＝8，No End Gaps，ITERATION＝none，NUMITER＝1，CLUSTERING＝NJ。
将牛凝乳酶B凝乳酶原前体用作参照序列(Genbank登录号P00794——文中公开为SEQ ID NO:1)，其中N-端甲硫氨酸具有编号1(MRCL……)而C-端异亮氨酸(在蛋白序列中…LAKAI)具有编号381。使变体与牛B-凝乳酶原前体比对并按照对应的牛凝乳酶残基给残基编号。
实施例2：凝乳酶变体的设计
利用不同对策设计凝乳酶变体。
当指骆驼凝乳酶时，文中指包含SEQ ID NO:2的多肽的骆驼凝乳酶。
SEQ ID NO:2的骆驼凝乳酶可被视为用于制备其骆驼凝乳酶变体的具有凝乳酶活性的文中相关的亲本多肽。
当指牛凝乳酶时，文中指包含SEQ ID NO:1的多肽的牛凝乳酶。
SEQ ID NO:1的牛凝乳酶可被视为用于制备其牛凝乳酶变体的具有凝乳酶活性的文中相关的亲本多肽。
骆驼凝乳酶变体是基于具有与牛凝乳酶B 25％或更多的同一性的公众已知的一大组天冬氨酸蛋白酶序列的比对设计的。
一般将改变引入高变区，而不改变保守区。将多个改变引入每个变体构建体，确保每个单突变存在于多个变体构建体中(关于结果的讨论——参见以下实施例6)。
牛凝乳酶变体是基于对牛与骆驼的凝乳酶的比较设计的。例如，将牛残基改变成骆驼对应残基(关于结果的讨论——参见以下实施例7)。
实施例3：凝乳酶变体酶物质的制备
将所有凝乳酶变体以合成基因合成并克隆到基本上对应于pGAMpR-C的真菌表达载体中(WO02/36752A2中所述)。
将载体转化到大肠杆菌中并利用标准分子生物学实验规程纯化质粒DNA，这对于技术人员而言是已知的。
将变体质粒各自地转化到黑曲霉(Aspergillus niger)菌株中并基本上如WO02/36752A2中所述制备蛋白并利用标准层析技术纯化。
如本领域中已知——技术人员可根据他的一般公知常识制备并纯化凝乳酶及凝乳酶变体——例如文中所述的牛及骆驼凝乳酶变体。
实施例4：凝乳酶比活的确定
4.1凝固活性的确定
利用REMCAT法确定凝乳活性，该法为国际乳业联合会开发的标准方法(IDF法)。
凝乳活性是通过利用0.5克/升的氯化钙溶液(pH大约为6,5)由低热、低脂肪奶粉制得的标准乳底物的可看出的絮凝所需的时间确定的。利用IDF标准品110B作为样品，使凝乳素(rennet)样品的凝固时间与具有已知的凝乳活性并具有相同的酶组成的参照标准品的时间比较。样品及参照标准品在相同的化学及物理条件下测量。利用84mM醋酸pH 5.5缓冲液，将变体样品调节至约3IMCU/ml。然后，将200μl酶加入置于水浴中的玻璃试管中的10ml预先加热的乳(32℃)中，所述水浴能够在持续搅拌下维持32℃±1℃的恒定温度。
根据下式，相对于具有与样品相同酶组成的标准品，计算凝乳素的总凝乳活性(强度)，以国际凝乳单位(IMCU)/ml为单位。
强度(IMCU/ml)＝S标准x T标准x D样品
D标准x T样品
S标准：凝乳素的国际参照标准品的凝乳活性。
T标准：标准品稀释液所得到的凝固时间(秒)。
D样品：样品的稀释系数。
D标准：标准品的稀释系数。
T样品：从添加酶到絮凝时的稀释的凝乳酶样品所得到的凝固时间(秒)
4.2总蛋白含量的确定
利用Thermo Scientific的Pierce BCA蛋白测定试剂盒，按照供应商的说明书确定总蛋白含量。
4.3凝固比活的计算
通过将使凝固活性(IMCU/ml)除以总蛋白含量(mg总蛋白/毫升)来确定凝固比活(IMCU/mg总蛋白)。
实施例5：蛋白水解活性的确定
使用荧光标记的氟硼荧-FL酪蛋白作为底物来测定总蛋白水解活性(EnzChek；Molecular Bioprobes,E6638)。被pH-不敏感性绿色荧光氟硼荧-FL强烈标记的酪蛋白衍生物导致共轭物荧光的几乎完全淬灭。蛋白酶催化的水解释放荧光氟硼荧-FL。此方法敏感性非常强，这对于此试验是关键的，因为CHYMAX M具有迄今为止已知的所有凝结剂中最低的总蛋白水解活性。
测定是以0.04mg/ml的最终底物浓度在调节到所需pH的0.2M磷酸盐缓冲液中进行的。在将均在磷酸盐缓冲液中制备的1份底物与1份酶混合前，将所有酶变体标准化为50IMCU/ml(根据实施例4)。使底物及酶在96-孔Nunc Fluoro微滴定板中混合，密封并在32℃下孵育60min。孵育后，移除密封并在荧光计中记录荧光。
实施例6：骆驼凝乳酶变体的评价
对于所有变体，根据实施例4，确定pH 6.5下的凝固比活(IMCU/mg总蛋白)。利用以下对策，对变体分级。具有最低比活的变体得一分，仅次于最低的为两分，以此类推。
对C/P比进行同样的分级对策。通过将凝固比活(IMCU/mg)除以蛋白水解活性来确定pH 6.5下所有变体的C/P比。
利用两种分级策略确定每个变体的总分，并基于分值之和，进行最终的分级。
包含作为参照的骆驼野生型基因及牛野生型基因。
术语“X”表示没有变化——也就是，没有突变。
因为所有变体包含多个突变，所以利用统计法及3D结构分析，对分级的变体的数据进行了更详细地研究，以确定产生积极或消极作用的各氨基酸变化。在此研究中，也评价/包含了以下实施例7中所讨论的牛变体。
鉴定出了以下突变：
术语“+”指积极的氨基酸交换——也就是，“++”比“+”更积极。
术语“-”指消极的氨基酸交换——也就是，“--”比“-”更消极。
表右栏中的描述涉及各个突变位于牛凝乳酶的3D结构中的位置。牛凝乳酶的3D结构是公众可获得的。作为一个实例，图2中显示了氨基酸位置296及294存在于牛凝乳酶中的位置。
结论：
以上结果表明骆驼凝乳酶中的以下突变是积极的(也就是，与骆驼野生型凝乳酶相比，具有改善的C/P比)：
D117N
H134Q
L280I
D156V
V241I
D325M
L311I
G309W
G309D
V279M
实施例7：牛凝乳酶变体的评价
仅根据它们在pH 6.5下的C/P比，评价牛凝乳酶变体。
因为所有变体包含多个突变，所以利用统计法及3D结构分析，对分级的变体的数据进行更详尽地研究，以确定产生积极或消极作用的各氨基酸变化。在此研究中，也评价/包含实施例6中所讨论的骆驼变体。
鉴定出了牛凝乳酶的以下积极突变：
术语“+”指积极的氨基酸交换——也就是，“++”比“+”更积极。
术语“-”指消极的氨基酸交换——也就是，“--”比“-”更消极。
结论：
以上结果表明牛凝乳酶中以下突变是积极的(也就是，与牛野生型凝乳酶相比，具有改善的C/P比)：
Q300R
H350N
K353L
Q141E
I143F
实施例8：制造凝乳酶中阳性突变的位置
对实施例6及7中所述的结果的对比评价得出以下数据。
催化性缝区279-281
如实施例7中所示，牛凝乳酶中双突变K279V及V281F对C/P比产生消极作用。在骆驼凝乳酶中，突变V279K也产生了消极结果(实施例6)。因此，得出结论，位置281处的最佳氨基酸是V。也观察到，骆驼中的L280I突变具有积极作用。
小叶区298-300
如实施例7中所示，牛凝乳酶中双突变Q298E及Q300R对C/P比产生积极作用。
催化缝区350-353
如实施例7中所示，牛凝乳酶中三个突变H350N、Q352E及K353L对C/P比产生积极作用。
在骆驼凝乳酶中，观察到(实施例6)，L353Q具有积极作用而L353K具有消极作用。
小叶区307-311
如实施例7中所示，牛凝乳酶中双突变D307N及D309G对C/P比产生消极作用。
在骆驼凝乳酶中，G309D及G309W具有积极作用。此意味着牛凝乳酶中D307N突变导致了消极作用。
在骆驼凝乳酶中，L311I突变已被表明具有有益作用。
骨架区134-143
如实施例7中所示，牛凝乳酶中双突变Q141E及I143F对C/P比产生积极作用。
将骆驼凝乳酶中H134变成Q已被证实具有有益作用。
位置 优选氨基酸
280 I
281 V
298 E
300 R
352 Q(其次优选L)
309 D或W
307 D
141 E
143 F
353 Q
352 Q
311 I
134 Q
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Claims (4)

1.一种制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤：
(a)：在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置制造改变，其中所述亲本多肽是野生型哺乳动物凝乳酶并且其中所述改变包含对应于SEQ ID NO:1中位置134的至少一个氨基酸位置的置换以及其中所述置换为134Q；以及
(b)：制备并分离步骤(a)中改变的多肽，从而得到分离的凝乳酶多肽变体，其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：所述亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1的多肽的比对确定的——即，SEQ ID NO:1的多肽用于确定所述亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：所述亲本多肽是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381；
以及其中，与SEQ ID NO:2的成熟多肽相比，所述分离的凝乳酶多肽变体包含不多于5个的氨基酸改变，其中所述的分离的凝乳酶多肽变体具有：
-产生比包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性，
以及其中所述改变为如下氨基酸位置的置换：
H134Q+I154L+D216S；
H134Q+L280I+G309W；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E。
2.一种通过如权利要求1所述的方法得到的分离的凝乳酶多肽变体。
3.一种分离的凝乳酶多肽变体，其包含：
(a)：具有凝乳酶活性的亲本多肽中一个或多个位置处的改变，其中所述亲本多肽是野生型哺乳动物凝乳酶并且其中所述改变包含对应于SEQ ID NO:1中位置134的至少一个氨基酸位置的置换以及其中所述置换为134Q；以及
(b)：其中所述变体具有凝乳酶活性；
以及其中：
(i)：所述亲本多肽的氨基酸位置是通过使该亲本多肽与SEQ ID NO:1的多肽比对确定的——即，SEQ ID NO:1的多肽用于确定所述亲本多肽中对应的氨基酸序列；以及
(ii)：所述亲本多肽是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2的成熟多肽，所述成熟多肽是从SEQID NO:2的氨基酸位置59到氨基酸位置381；以及
(iii)：所述分离的变体多肽具有与SEQ ID NO:2的成熟多肽少于100％序列同一性；以及
其中所述分离的变体具有产生比包含SEQ ID NO:2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比更高的C/P比的凝乳酶活性；以及
其中，与SEQ ID NO:2的成熟多肽相比，所述分离的凝乳酶多肽变体包含不多于5个的氨基酸改变，以及
其中所述改变为如下氨基酸位置的置换：
H134Q+I154L+D216S；
H134Q+L280I+G309W；
Y79S+H134Q+Y365F+V375L；
S132F+H134Q+M200I+M215L+G221E。
4.一种制造食品或饲料产品的方法，其包括将有效量的如权利要求2或3所述的分离的凝乳酶多肽变体加入食品或饲料成分中并进行进一步制作步骤以得到所述食品或饲料产品；以及
其中所述产品是基于乳的产品并且其中所述方法包括将有效量的如权利要求2或3所述的分离的凝乳酶多肽变体加入乳中并进行进一步制作步骤以得到所述基于乳的产品；以及
其中所述乳为豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、羊驼乳、骆驼乳或牛乳；以及
其中所述的基于乳的产品是发酵乳制品、夸克或奶酪。
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