RU2683385C2 - Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами - Google Patents
Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683385C2 RU2683385C2 RU2014152723A RU2014152723A RU2683385C2 RU 2683385 C2 RU2683385 C2 RU 2683385C2 RU 2014152723 A RU2014152723 A RU 2014152723A RU 2014152723 A RU2014152723 A RU 2014152723A RU 2683385 C2 RU2683385 C2 RU 2683385C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chymosin
- polypeptide
- seq
- variant
- amino acid
- Prior art date
Links
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title description 29
- 239000008267 milk Substances 0.000 title description 29
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 348
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 345
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 345
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims abstract description 310
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 299
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims abstract description 296
- 101000914103 Bos taurus Chymosin Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 claims abstract description 101
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 74
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 121
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 93
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 61
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 53
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 28
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 28
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 25
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 25
- 238000010411 cooking Methods 0.000 claims description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 claims 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 claims 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 130
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 88
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 33
- 102220198313 rs1057519973 Human genes 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 23
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 16
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 15
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 13
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 9
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 6
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 6
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 6
- 108010064037 prorennin Proteins 0.000 description 6
- 241000282828 Camelus bactrianus Species 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 4
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 4
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 4
- 102220087235 rs864622622 Human genes 0.000 description 4
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Chemical class OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000309464 bull Species 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 102220466243 Acyl-coenzyme A thioesterase MBLAC2_R170A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 2
- 244000303258 Annona diversifolia Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical compound OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220477021 Hexokinase-4_S411F_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220468791 Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2_Y167A_mutation Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101000914078 Ovis aries Chymosin Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 2
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 235000020248 camel milk Nutrition 0.000 description 2
- -1 chymosin amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 235000021001 fermented dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 2
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Chemical class 0.000 description 2
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- 102220285717 rs1555461680 Human genes 0.000 description 2
- 102220026086 rs397518426 Human genes 0.000 description 2
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 description 2
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020255 yak milk Nutrition 0.000 description 2
- PFMYVADTFJKUJF-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]benzene-1,2,3-triol Chemical compound [N+](=O)([O-])C1=CC=C(C=C1)N=NC1=C(C(=C(C=C1)O)O)O PFMYVADTFJKUJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 102100034713 C-type lectin domain family 18 member A Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100136353 Dictyostelium discoideum gpmA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004214 Fast Green FCF Substances 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000946283 Homo sapiens C-type lectin domain family 18 member A Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical class N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 210000001156 gastric mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010001845 prepepsinogen Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical class [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
- A23C9/1209—Proteolytic or milk coagulating enzymes, e.g. trypsine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C11/00—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions
- A23C11/02—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins
- A23C11/10—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins
- A23C11/103—Milk substitutes, e.g. coffee whitener compositions containing at least one non-milk component as source of fats or proteins containing or not lactose but no other milk components as source of fats, carbohydrates or proteins containing only proteins from pulses, oilseeds or nuts, e.g. nut milk
- A23C11/106—Addition of, or treatment with, microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0326—Rennet produced by fermentation, e.g. microbial rennet; Rennet produced by genetic engineering
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C20/00—Cheese substitutes
- A23C20/02—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates
- A23C20/025—Cheese substitutes containing neither milk components, nor caseinate, nor lactose, as sources of fats, proteins or carbohydrates mainly containing proteins from pulses or oilseeds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
- A23L11/40—Pulse curds
- A23L11/45—Soy bean curds, e.g. tofu
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
- A23L11/60—Drinks from legumes, e.g. lupine drinks
- A23L11/65—Soy drinks
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6483—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23004—Chymosin (3.4.23.4), i.e. rennin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен выделенный вариант полипептида химозина, включающий изменение в положении 117 относительно последовательности бычьего химозина, где указанный вариант имеет активность химозина, а исходный полипептид по меньшей мере на 90% идентичен зрелому полипептиду верблюжьего химозина. Предложен способ получения указанного варианта полипептида химозина путем осуществления изменений в указанных положениях исходного полипептида. Предложены способ приготовления пищевого продукта и способ приготовления кормового продукта с использованием указанного варианта полипептида химозина. Группа изобретений позволяет получить вариант верблюжьего химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами (с более высоким соотношением C/P) по сравнению с верблюжьим химозином. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 8 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к вариантам химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами.
Уровень техники
Ферментативная коагуляция молока под действием молокосвертывающих ферментов, таких как химозин и пепсин, представляет собой один из наиболее важных процессов при приготовлении сыров. Ферментативная коагуляция молока представляет собой двухфазный процесс: первую фазу, где протеолитический фермент, химозин или пепсин, атакует κ-казеин, что дает в результате метастабильное состояние структуры казеиновых мицелл, и вторую фазу, где молоко впоследствии коагулирует и образует коагулум.
Химозин (EC 3.4.23.4) и пепсин (EC 3.4.23.1), молокосвертывающие ферменты желудка млекопитающих, представляют собой аспарагинпротеазы, принадлежащие к широкому классу пептидаз.
Когда они продуцируются в клетках слизистой желудка, химозин и пепсин существуют как ферментативно неактивные пре-прохимозин и пре-пепсиноген соответственно. Когда химозин экскретируется, N-конечный пептидный фрагмент, пре-фрагмент (сигнальный пептид) отщепляется с получением прохимозина, содержащего про-фрагмент. Прохимозин находится по существу в неактивной форме фермента, который, однако, становится активным при кислотных условиях, превращаясь в активный химозин посредством аутокаталитического удаления про-фрагмента. Эта активация осуществляется in vivo в полости желудка при соответствующих условиях pH или in vitro при кислотных условиях.
Структурные и функциональные характеристики бычьего, то есть Bos taurus, пре-прохимозина, прохимозина и химозина широко исследуются. Пре-часть молекулы бычьего пре-прохимозина содержит остатков 16 aa и про-часть соответствующего прохимозина имеет длину остатка 42 aa (аминокислоты). Активный бычий химозин содержит 323 aa и представляет собой смесь двух форм, A и B, обе она являются активными.
Химозин продуцируется в природе у некоторых видов млекопитающих, таких как жвачные животные, верблюдовые, козы, буйволы, овцы, свиньи, люди, обезьяны и крысы.
Бычий химозин является коммерчески доступным для молочной промышленности в течение ряда лет.
WO 02/36752A2 (Chr. Hansen) описывает рекомбинантное продуцирование верблюжьего химозина.
Ссылки, перечисленные здесь ниже, могут в настоящем контексте рассматриваться как ссылки, описывающие мутанты химозина:
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterization of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M. G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Vallllphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
Ни одна из литературных ссылок, рассмотренных выше, не описывает прямо и однозначно ни одного из мутантов/вариантов химозина, как описано/заявляется ниже в настоящем документе.
Сущность изобретения
Проблема, которая должна решаться с помощью настоящего изобретения, заключается в получении вариантов химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами.
Как обсуждается в рабочих примерах в настоящем документе, авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд улучшенных вариантов верблюжьего (см. пример 6 в настоящем документе) и бычьего (см. пример 7 в настоящем документе) химозина.
На основе сравнительного анализа верблюжьего и бычьего вариантов авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд дополнительных положений аминокислот, которые являются важными в настоящем документе в том смысле, что посредством получения варианта в одном или нескольких из этих положений можно получить улучшенный вариант химозина (см. пример 8 в настоящем документе).
Как известно из литературы, различные последовательности природного полипептида химозина дикого типа, полученного от различных видов млекопитающих (таких, например, как жвачные животные, верблюдовые, овцы, свиньи или крысы), имеют относительно высокое сходство/идентичность последовательностей. На фигуре 1 в настоящем документе это иллюстрируется посредством выравнивания последовательностей релевантных для настоящего документа различных последовательностей химозина.
С учетом этого относительно близкого соотношения последовательностей предполагается, что 3D структуры различных природных химозинов дикого типа также являются относительно похожими друг на друга.
В настоящем контексте полученный природный химозин дикого типа (такой как бычий химозин или верблюжий химозин) в настоящем документе может представлять собой пример исходного полипептида, то есть исходного полипептида, в который вносят изменения для получения варианта полипептида химозина по настоящему изобретению.
Не ограничиваясь теорией, предполагается, что обсуждаемые в настоящем документе родственные положения аминокислот химозина имеют общее значение для любого релевантного для настоящего документа фермента химозина, представляющего интерес (например, для химозинов, например, жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней, крыс и тому подобное), в том смысле, что при получении варианта в одном или нескольких из этих положений можно получить улучшенный в целом вариант химозина (например, улучшенный вариант химозина жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс).
Как обсуждается в настоящем документе, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты исходного полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобное), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность препрохимозина бычьего химозина B (Genbank accession number P00794; описано в настоящем документе как SEQ ID NO: 1).
Препрохимозин бычьего химозина B SEQ ID NO: 1 может альтернативно называться в настоящем документе бычий (Bos bovis) химозин B или просто бычий химозин. Последовательность показана также на фигуре 1 в настоящем документе.
Другая релевантная для настоящего документа последовательность химозина представляет собой общеизвестную последовательность химозина Camelius dromedarius, в настоящем документе SEQ ID NO: 2. Она может альтернативно называться в настоящем документе верблюжьим химозином. Эта последовательность показана также на фигуре 1 в настоящем документе.
В настоящем контексте считается, что исходный полипептид химозина (например, от овец или крыс), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), может рассматриваться в настоящем документе как достаточно родственный структурно, например, бычьему или верблюжьему химозину, для улучшения посредством получения варианта любых из положений аминокислот, как описано в настоящем документе.
Соответственно, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения варианта выделенного полипептида химозина, включающему стадии:
(a): осуществление изменений в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1.
Как известно из литературы, специалист в данной области может, основываясь на своих обычных общих знаниях, рутинным образом получать и очищать химозин и варианты химозина.
Говоря другими словами, когда специалист в данной области обладает релевантным для настоящего документа исходным полипептидом, имеющим активность химозина, представляющего интерес (например, от жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс), рутинной работой для специалиста в данной области является получение варианта такого исходного химозина, представляющего интерес.
Второй аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, полученного с помощью способа по первому аспекту, или к любым релевантным для настоящего документа его вариантам осуществления.
Термин "полученный" по отношению ко второму аспекту выше должен пониматься таким образом, что выделенный вариант полипептида химозина получают с помощью способа первого аспекта или любых его релевантных для настоящего документа вариантов осуществления.
Соответственно, термин "полученный" по отношению ко второму аспекту не может пониматься как тот, который может, в принципе, быть получен.
Как обсуждается в настоящем документе в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычий) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе вариантами бычьего химозина.
Соответственно, третий аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Как обсуждается в настоящем документе в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьего химозина) в качестве исходного полипептида; такой вариант может в настоящем документе называться вариантом верблюжьего химозина.
Соответственно, четвертый аспект настоящего изобретения относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
Выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, может использоваться в соответствии с литературными данными, например, для приготовления пищевого или кормового продукта, представляющего интерес (такого, например, как продукт на основе молока, представляющий интерес, который, например, может представлять собой сырный продукт).
Соответственно, пятый аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в пищевой или кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.
Вариант осуществления настоящего изобретения описан ниже в качестве только лишь примеров.
Определения
Все определения терминов, релевантных для настоящего документа, находятся в соответствии с тем, что понималось бы специалистом в данной области по отношению к релевантному для настоящего документа техническому контексту.
Термин "химозин" относится к ферменту класса EC 3.4.23.4. Химозин имеет высокую специфичность, и он сворачивает молоко посредством расщепления одинарной связи 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 в каппа-цепи казеина. Альтернативное наименование, используемое в данной области, представляет собой «реннин».
Термин "активность химозина" относится к активности химозина для фермента химозина, как понимается специалистом в настоящем контексте.
Специалист в данной области знает, как определить релевантную для настоящего документа активность химозина. В рабочем примере 4 в настоящем документе предлагается пример стандартного способа определения удельной активности химозина, альтернативно называемой активностью свертывания или молокосвертывающей активностью.
В рабочем примере 5 в настоящем документе предлагается пример стандартного способа определения протеолитической активности.
Как известно из литературы, релевантное для настоящего документа так называемое отношение C/P определяется посредством деления удельной активности свертывания (C) на протеолитическую активность (P).
Как известно из литературы, более высокое отношение C/P означает, как правило, что потери белка во время, например, приготовления сыра из-за неспецифичной деградации белка уменьшается, то есть выход сыра улучшается, и что развитие горького вкуса у сыра во время его созревания уменьшается.
Термин "выделенный вариант" означает вариант, который модифицируется руками человека. В одном из аспектов вариант является чистым, по меньшей мере, на 1%, например, чистым, по меньшей мере, на 5%, чистым, по меньшей мере, на 10%, чистым, по меньшей мере, на 20%, чистым, по меньшей мере, на 40%, чистым, по меньшей мере, на 60%, чистым, по меньшей мере, на 80% и чистым, по меньшей мере, на 90%, как определено с помощью SDS PAGE.
Термин "зрелый полипептид" означает пептид в его конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-конечный процессинг, C-конечный процессинг, гликозилирование, фосфорилирование и тому подобное. В настоящем контексте релевантный для настоящего документа зрелый полипептид химозина можно рассматривать как активную последовательность полипептида химозина, то есть без последовательностей пре-части и/или про-части. Релевантные для настоящего документа примеры зрелого полипептида представляют собой, например, зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1, или зрелый полипептид SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2.
Термин "исходный" или "исходный полипептид, имеющий активность химозина" означает полипептид, в котором осуществляют изменения для получения вариантов ферментов по настоящему изобретению. «Исходный» может представлять собой встречающийся в природе полипептид (дикого типа) или его вариант.
Термин "идентичность последовательности" относится к соотносимости между двумя последовательностями аминокислот или между двумя последовательностями нуклеотидов.
Для целей настоящего изобретения уровень идентичности последовательностей между двумя последовательностями аминокислот определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры представляют собой штраф за внесение делеции в выравнивание 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и подстановочную матрицу EBLOSUM62 (EMBOSS version of BLOSUM62). Результат Needle, отмечаемый как "самая обширная идентичность" (полученная с использованием опции -nobrief) используют как процент идентичности и вычисляют следующим образом:
(Идентичные остатки × 100)/(длина выравнивания последовательностей - общее количество разрывов при выравнивании последовательностей).
Для целей настоящего изобретения уровень идентичности последовательности между двумя последовательностями деоксирибонуклеотидов определяют с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman и Wunsch, 1970, выше), как осуществляется для программы Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней. Необязательные используемые параметры представляют собой штраф за внесение делеции в выравнивание 10, штраф за продолжение делеции 0,5 и подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4). Выходные данные Needle, отмечаемые как "самая обширная идентичность" (полученная с использованием опции - nobrief), используют как процент идентичности и вычисляют следующим образом:
(Идентичные деоксирибонуклеотиды × 100)/(длина выравнивания последовательностей - общее количество разрывов при выравнивании последовательностей).
Термин "вариант" означает пептид, имеющий активность химозина, содержащий изменение, например, замещение, инсерцию, и/или делецию, в одном или нескольких положениях. «Замещение» означает замену аминокислоты, занимающей некоторое положение, другой аминокислотой; «делеция» означает удаление аминокислоты, занимающей некоторое положение; и «инсерция» означает добавление 1-3 аминокислот рядом с аминокислотой, занимающей некоторое положение.
Аминокислота может представлять собой природные или искусственные аминокислоты, например, замещение, например, в частности, D-изомерами (или D-формами), например, D-аланина могло бы быть возможным теоретически.
Термин «пептид химозина дикого типа» означает химозин, экспрессируемый встречающимся в природе организмом, например, млекопитающим (например, верблюдицей или коровой), встречающимся в природе.
Чертежи
Фигура 1: выравнивание релевантных для настоящего документа различных последовательностей химозина. Показанный "Bos_bovis_chymosin_B" в настоящем документе представляет собой бычий химозин SEQ ID NO: 1, и показанный "Camelus_dromedarius" в настоящем документе представляет собой верблюжий химозин SEQ ID NO: 2. Используя бычий химозин SEQ ID NO: 1 в качестве эталонной последовательности, как описано в настоящем документе, можно, например, увидеть, что бычий химозин имеет "V" в положении 10, а верблюжий химозин имеет "A" в этом же положении 10. Можно, например, также увидеть, что жвачные животные/крысы имеют "Q" в положении 352, а верблюд/C._bactrianus имеет "E" в том же положении 352.
Относительно последовательностей химозина, показанных на фигуре 1, овца имеет 94,5% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; C._bactrianus имеет 83,2% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; Camelus_dromedarius (верблюжий химозин SEQ ID NO: 2) имеет 84% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; свинья имеет 80,3% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1, и крыса имеет 71,9% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1.
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантные для настоящего документа проценты идентичности последовательностей для последовательностей зрелых полипептидов, например для химозина овцы, C._bactrianus, верблюда, свиньи или крысы со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином то есть положения аминокислот от 59 до 381 SEQ ID NO: 1), являются относительно сходными с рассмотренными выше процентами идентичности последовательностей.
Фигура 2: 3D структура бычьего химозина. 3D структура является общедоступной. В качестве примера показано, где именно в бычьем химозине присутствуют положения аминокислот 296 и 294.
Подробное описание изобретения
Определение положения аминокислот химозина, представляющего интерес
Как обсуждается выше в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюда, овцы, жвачных животных и тому подобного), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность бычьего химозина, описанную в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.
Для целей настоящего изобретения полипептид, описанный как SEQ ID NO: 1 (бычий химозин), используют для определения соответствующего остатка аминокислоты в другом полипептиде химозина. Последовательность аминокислот другого полипептида химозина выравнивается с полипептидом, описанным как SEQ ID NO: 1, и на основании выравнивания последовательностей определяют количество положений аминокислот, соответствующих любому остатку аминокислоты в полипептиде, описанном как SEQ ID NO: 1, с использованием алгоритма ClustalW, как описано в рабочем примере 1 в настоящем документе.
Идентификация соответствующего остатка аминокислоты в другом полипептиде химозина может быть подтверждена с использованием алгоритма Needleman-Wunsch (Needleman и Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), как осуществляется в программе Needle из пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16:276-277), предпочтительно версии 3.0.0 или более поздней.
Основываясь на приведенных выше хорошо известных компьютерных программах, для специалиста в данной области является рутинной работой определение положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюда, овцы, жвачных животных и тому подобного).
На фигуре 1 в настоящем документе показан пример выравнивания последовательностей.
Только в качестве примера на фигуре 1 можно, например, увидеть, что используемая в настоящем документе эталонная бычья последовательность SEQ ID NO: 1 имеет "G" в положении 50, и последовательность "Camelus_dromedarius" (SEQ ID NO: 2 в настоящем документе) имеет "A" в этом же положении 50.
Номенклатура вариантов
При описании вариантов настоящего изобретения номенклатура, описанная ниже, адаптируется для простоты упоминания. Используют принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращенные наименования аминокислот.
Конкретные варианты, обсуждаемые в настоящем разделе "номенклатура" ниже, могут не представлять собой релевантные для настоящего документа варианты настоящего изобретения, то есть раздел "номенклатура" предназначен просто для описания релевантной для настоящего документа используемой номенклатуры как таковой.
Замещения. Для замещения аминокислот используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, замещенная аминокислота. Соответственно, теоретическое замещение треонина аланином в положении 226 обозначается как "Thr226Ala" или "T226A". Множество мутаций разделяются знаками плюс ("+"), например, "Gly205Arg + Ser411Phe" или "G205R + S411F", что представляет собой замещения в положениях 205 и 411 глицина (G) аргинином (R) и серином (S) с фенилаланином (F) соответственно. Замещение, обозначенное, например, "226A", относится к замещению исходной аминокислоты (например, T, Q, S или другой исходной аминокислоты) аланином в положении 226.
Делеции. Для делеций аминокислоты используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, *. Соответственно, делеция глицина в положении 195 обозначается как "Glyl95*" или "G195*". Множество делеций разделяются с помощью знаков плюс ("+"), например, "Glyl95* + Ser411*" или "G195* + S411*".
Инсерции. Для инсерции аминокислоты используют следующую номенклатуру: исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота. Соответственно, инсерция лизина после глицина в положении 195 обозначается как "Glyl95Glylys" или "G195GK". Инсерция множества аминокислот обозначается (исходная аминокислота, положение, исходная аминокислота, вставленная аминокислота № 1, вставленная аминокислота № 2; и тому подобное). Например, инсерция лизина и аланина после глицина в положении 195 обозначается "Glyl95GlylysAla" или "G195GKA".
В таких случаях вставленные остатки аминокислоты нумеруются посредством добавления строчных букв в номер положения остатка аминокислоты перед вставленным остатком (остатками) аминокислоты. В указанном выше примере, таким образом, последовательность должна представлять собой:
| Сходный | Вариант |
| 195 | 195 195a 195b |
| G | G-K-A |
Множественные изменения. Варианты, содержащие множественные изменения, разделяются с помощью знаков плюс ("+"): например, "Argl70Tyr+Glyl95Glu" или "R170Y+G195E" представляет собой замещение тирозина и глутаминовой кислоты вместо аргинина и глицина в положениях 170 и 195 соответственно.
Различные замещения. Когда в некоторые положения могут вводиться различные замещения, эти различные замещения разделяются запятой: например, "Arg170Tyr,Glu" или "R170Y,E" представляет замещение аргинина тирозином или глутаминовой кислотой в положении 170. Таким образом, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" или "Y167G,A+R170G,A" обозначает следующие варианты:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" и "Tyr167Ala+Arg170Ala".
Способ получения выделенного варианта полипептида химозина
Как обсуждается выше, как известно в данной области, специалист на основе своих обычных общих знаний может рутинно получить и очистить химозин и варианты химозина.
Говоря другими словами, после того как специалист в данной области будет обладать релевантным для настоящего документа исходным полипептидом, имеющим активность химозина, представляющего интерес (например, жвачных животных, верблюдовых, овец, свиней или крыс), для специалиста в данной области является рутинной работой получение варианта такого исходного химозина, представляющего интерес.
Пример способа, пригодного для использования при получении и выделении химозина (варианта или исходного), может представлять собой хорошо известную технологию, например, технологию на основе грибкового рекомбинантного экспрессирования/продуцирования, как описано, например, в WO 02/36752A2 (Chr. Hansen).
Для специалиста в данной области также является рутинной работой осуществление изменений в одном или нескольких положениях в исходном полипептиде, имеющем активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты.
Как известно специалисту в данной области, это может сделать, например, с помощью так называемого сайт-направленного мутагенеза и технологии на основе рекомбинантного экспрессирования/продуцирования.
Также рутинной работой для специалиста в данной области является определение того, имеет ли релевантный для настоящего документа исходный полипептид (например, верблюжий или бычий химозин дикого типа) и/или релевантный для настоящего документа вариант активность химозина или нет.
Как известно из литературы, активность химозина может быть определена с помощью так называемого отношения C/P, которое определяется посредством деления удельной активности свертывания (C) на протеолитическую активность (P).
Как известно из литературы, более высокое отношение C/P означает, как правило, что потери белка в течение, например, приготовления сыра из-за неспецифичной деградации белка уменьшаются, то есть выход сыра улучается, и что развитие горького вкуса в сыре во время созревания уменьшается.
В рабочем примере 4 в настоящем документе описывается соответствующий способ для определения удельной активности свертывания (C), а в рабочем примере 5 в настоящем документе описывается соответствующий способ определения протеолитической активности (P).
Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P, по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 1, в настоящем документе.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2, в настоящем документе.
Более предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет
- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 1, в настоящем документе; и
- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2, в настоящем документе.
Как обсуждается выше, в качестве эталонной последовательности для определения положения аминокислоты релевантного для настоящего документа полипептида химозина, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобного), в настоящем документе используют общеизвестную последовательность бычьего химозина, описанную в настоящем документе как SEQ ID NO: 1.
Как обсуждается выше, основываясь, например, на компьютерных программах выравнивания последовательностей для последовательностей, обсуждаемых в настоящем документе, для специалиста в данной области является рутинной работой определение положения аминокислоты, релевантной для настоящего документа полипептида химозина, релевантного для настоящего документа, представляющего интерес (например, верблюдовых, овец, жвачных животных и тому подобного).
Термин "исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин)", например, способа первого аспекта, в настоящем документе может рассматриваться как относящийся к ограничению на основе последовательности исходного полипептида химозина, используемого для получения его варианта, релевантного для настоящего документа.
Говоря другими словами, зрелый исходный полипептид химозина (например, овцы или свиньи), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым бычьим химозином, как считается, является достаточно структурно идентичным, например, бычьему или верблюжьему химозину, чтобы быть релевантным для настоящего документа, то есть в настоящем контексте считается, что зрелый исходный полипептид химозина (например, от овцы или крысы), который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), может рассматриваться в настоящем документе как достаточно структурно родственный, например, бычьему или верблюжьему химозину, чтобы его можно было улучшать посредством получения варианта в любом положении аминокислот, как описано в настоящем документе.
Полипептид верблюжьего химозина SEQ ID NO: 2 имеет 84% идентичность последовательностей с бычьим полипептидом SEQ ID NO: 1 (то есть с полной последовательностью SEQ ID NO: 1 от положения 1 до 381, которая включает пре и про последовательность).
Как понятно специалисту в данной области, в настоящем контексте релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, может уже представлять собой, например, вариант, например, соответствующего химозина дикого типа.
Например, вариант верблюжьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями), по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2 по-прежнему будет исходным полипептидом, который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим), как требуется, например, в первом аспекте в настоящем документе.
Говоря другими словами, релевантный для настоящего документа выделенный вариант полипептида химозина может содержать изменения (например, замещения) в положении ином, чем положение, например, первого аспекта в настоящем документе.
По отношению к последовательностям химозина, показанным на фигуре 1 в настоящем документе, овца имеет 94,5% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; C._bactrianus имеет 83,2% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1; свинья имеет 80,3% идентичность последовательностей с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1, и крыса имеет 71,9% идентичность последовательности с бычьей последовательностью SEQ ID NO: 1.
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантные для настоящего документа проценты идентичности последовательностей, например, зрелого химозина овцы, C._bactrianus, верблюда, свиньи или крысы со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином; то есть положения 59-381 аминокислот SEQ ID NO: 1) являются относительно подобными рассмотренным выше процентам идентичности последовательностей.
Предпочтительные варианты
Как обсуждается выше, например, первый аспект относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина представляет собой вариант, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, если исходный полипептид химозина уже имеет, например, "V" в положении 156, тогда нет смысла говорить об осуществлении замещения 156V для этого конкретного исходного полипептида химозина. Как можно увидеть на фигуре 1 в настоящем документе, химозин крысы дикого типа имеет "V" в положении 156; замещение 156V может рассматриваться в настоящем документе как иррелевантное для конкретной последовательности полипептида химозина крыса на фигуре 1.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, если исходный полипептид химозина не имеет, например, "D" в положении 156, тогда нет смысла говорить об осуществлении замещения D156V для этого конкретного исходного полипептида химозина. Как можно увидеть на фигуре 1 в настоящем документе, химозин крысы дикого типа имеет "V" в положении 156; замещение D156V может, следовательно, рассматриваться в настоящем документе как иррелевантное для конкретной последовательности полипептида химозина крысы на фигуре 1.
В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H 134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G или
Q141 E + I143F.
Предпочтительный исходный полипептид, имеющий активность химозина
Предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 70% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Просто в качестве примера соответствующий, релевантный для настоящего документа исходный полипептид может представлять собой, например, бычий химозин A, как известно в данной области, бычий химозин A может иметь только единственное отличие в аминокислотах по сравнению с бычьим химозином B SEQ ID NO: 1 в настоящем документе.
Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантами бычьего химозина».
Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином). Может быть предпочтительным, чтобы исходный полипептид представлял собой зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, может уже представлять собой, например, вариант, например, соответствующего химозина дикого типа.
Например, вариант бычьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению со зрелым полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 по-прежнему будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий) имеет 323 аминокислоты в длину соответственно, вариант бычьего химозина, например, с 25 замещениями аминокислот по сравнению со зрелым полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 не будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Говоря другими словами, и в целом релевантный для настоящего документа выделенный вариант полипептида химозина может содержать изменения (например, замещения) в положениях иных, чем положения, например, первого аспекта в настоящем документе.
Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе вариантом верблюжьего химозина.
Соответственно, в предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином). Может быть предпочтительным, чтобы исходный полипептид представлял собой зрелый полипептид SEQ ID NO: 2 (верблюжий химозин).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим), по-прежнему находится в пределах требований идентичности последовательностей по отношению к SEQ ID NO: 1 (бычьему) пункта (ii) первого аспекта в настоящем документе; то есть он будет представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Выделенный вариант бычьего химозина
Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычьего) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантом бычьего химозина».
Как обсуждается выше, третий аспект, соответственно, относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Описанные выше определения и предпочтительные варианты осуществления являются также релевантными для этого аспекта.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида бычьего химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1.
В предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 92% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, выделенный вариант химозина может содержать изменения (например, замещения) в положениях аминокислот иных, чем приведено выше.
Например, вариант бычьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению с полипептидом бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1 будет по-прежнему представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 30 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 20 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 10 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант бычьего химозина содержал менее 5 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, термин "выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином)" пункта (iii) выше относится к тому, что описанный в настоящем документе выделенный вариант бычьего химозина, разумеется, не должен содержать последовательность полипептидов, которая является на 100% идентичной общеизвестной последовательности бычьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 1.
Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида бычьего химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина представляет собой вариант, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; или
Q141E + I143F.
Выделенный вариант верблюжьего химозина
Как обсуждается выше в рабочих примерах в настоящем документе, получают варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином) в качестве исходного полипептида; такой вариант может называться в настоящем документе «вариантом верблюжьего химозина».
Как обсуждается выше, четвертый аспект, соответственно, относится к выделенному варианту полипептида химозина, содержащему:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином); и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
Описанные выше определения и предпочтительные варианты осуществления являются также релевантными для этого аспекта.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида верблюжьего химозина, как описано в настоящем документе, представляет собой вариант, где вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
В предпочтительном варианте осуществления исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 92% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), и еще более предпочтительно исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, выделенный вариант «химозин» может содержать изменения (например, замещения) в положениях аминокислот иных, чем приведено выше.
Например, вариант верблюжьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например, замещениями) по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2 будет по-прежнему представлять собой исходный полипептид, который имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
Может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 30 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 20 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный верблюжий вариант химозина содержал менее 10 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), или может быть предпочтительным, чтобы выделенный вариант верблюжьего химозина содержал менее 5 изменений аминокислот (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
Как понятно специалисту в данной области в настоящем контексте, термин "выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином)" пункта (iii) выше относится к тому, что описанный в настоящем документе выделенный вариант верблюжьего химозина, разумеется, не должен содержать последовательность полипептидов, которая является на 100% идентичной общеизвестной последовательности верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2.
Предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида верблюжьего химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Может быть предпочтительным, чтобы, по меньшей мере, одно изменение представляло собой замещение, то есть релевантный для настоящего документа предпочтительный вариант осуществления относится к выделенному варианту полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
Предпочтительно выделенный вариант полипептида химозина, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
Предпочтительно замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
В предпочтительном варианте осуществления замещение представляет собой такое замещение, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S 132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; или
Q141E + I143F.
Способ приготовления продукта на основе молока
Как обсуждается выше, выделенный вариант полипептида химозина, как описано в настоящем документе, может использоваться в соответствии с литературой, например, для приготовления продукта на основе молока, представляющего интерес (такого, например, как сырный продукт).
Как обсуждается выше, один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в пищевые или кормовые ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.
Предпочтительно пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока, и способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина, как описано в настоящем документе, в молоко и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением продукта на основе молока.
Молоко может, например, представлять собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.
Продукт на основе молока может представлять собой, например, ферментированный молочный продукт, столовый творог или сыр.
Аспекты/варианты осуществления в настоящем документе представлены в формате формулы изобретения
Описанные в настоящем документе аспекты и предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения могут быть представлены/описаны в так называемом формате формулы изобретения; это продемонстрировано ниже.
1. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина, включающий стадии:
(a): осуществления изменения в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) и с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 65% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1.
2. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 1, где выделенный вариант полипептида химозина имеет:
- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1; и
- активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
3. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
4. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
5. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
6. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
7. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 6, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
8. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
9. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 8, где замещение представляет собой H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
10. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 4, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; или
Q141E + I143F.
11. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 75% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
12. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по п. 11, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
13. Способ получения варианта выделенного полипептида химозина по любому из пп. 1-10, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2.
14. Выделенный вариант полипептида химозина, полученный способом по любому из пп. 1-13.
15. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 1; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
16. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 15, где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P бычьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 1.
17. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-16, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
18. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-17, где выделенный вариант бычьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замещения) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином).
19. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-18, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
20. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 15-19, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
21. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
22. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141 E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
23. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 22, где замещение представляет собой 134Q, 141 E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
24. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 22, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
25. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 20, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; или
Q141E + I143F.
26. Выделенный вариант полипептида химозина, содержащий:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
27. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 26, где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
28. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-27, где исходный полипептид имеет, по меньшей мере, 97% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
29. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-28, где выделенный вариант верблюжьего химозина содержит менее 10 изменений аминокислот (например, замещения) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
30. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-29, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
31. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 26-30, где изменение включает замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 и 353.
32. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где изменение содержит замещение в положении, по меньшей мере, одной аминокислоты, соответствующем любому из положений 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 и 353.
33. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где замещение представляет собой 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 2411, 279M, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
34. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 33, где замещение представляет собой 134Q, 141E, 143F, 2801, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 3111, 352L, 352Q, 353L или 353Q.
35. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 33, где замещение представляет собой D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L или K353Q.
36. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 31, где замещение представляет собой:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I + D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G или
Q141E + I143F.
37. Способ приготовления пищевого или кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 14-36 в пищевой или кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого или кормового продукта.
38. Способ приготовления пищевого или кормового продукта по п. 37, где продукт представляет собой продукт на основе молока и где способ включает добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 14-36 в молоко и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением продукта на основе молока.
39. Способ приготовления продукта на основе молока по п. 38, где молоко представляет собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, буйволиное молоко, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.
40. Способ приготовления продукта на основе молока по любому из пп. 38-39, где продукт на основе молока представляет собой ферментированный молочный продукт, столовый творог или сыр.
Примеры
Пример 1
Выравнивание и нумерация последовательностей белков химозина и последовательностей вариантов
Последовательности белков химозина совмещаются с использованием алгоритма ClustalW, как предусматривается EBI (EBI, инструменты, множественное выравнивание последовательностей, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) и как описано в Larkin M.A, Blackshields G, Brown N.P, Chenna R, McGettigan P.A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I.M, Wilm A, Lopez R, Thompson J.D, Gibson T.J, Higgins D.G (2007). Bio-informatics 23(21), 2947-2948.
Настройки ClustalW2 для множественного выравнивания последовательностей, для последовательностей, представляют собой Protein weight Matrix = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION = 0,05, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ
В качестве эталонной последовательности для бычьего химозина B используют препрохимозин (Gen-bank accession number P00794 описывается в настоящем документе как SEQ ID NO: 1), где N-конечный метионин имеет номер 1 (MRCL…) и где C-конечный изолейцин (в последовательности белка …LAKAI) имеет номер 381. Варианты совмещаются по сравнению с бычьим препрохимозином B, и остатки нумеруются в соответствии с соответствующим остатком бычьего химозина.
Пример 2
Конструирование вариантов химозина
Варианты химозина конструируют с использованием различных стратегий.
Когда здесь упоминается верблюжий химозин, здесь упоминается верблюжий химозин, содержащий полипептиды SEQ ID NO: 2 в настоящем документе.
Верблюжий химозин SEQ ID NO: 2 можно рассматривать как релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, используемый для получения его вариантов верблюжьего химозина.
Когда здесь упоминается бычий химозин, здесь упоминается бычий химозин, содержащий полипептид SEQ ID NO: 1 в настоящем документе.
Бычий химозин SEQ ID NO: 1 можно рассматривать как релевантный для настоящего документа исходный полипептид, имеющий активность химозина, используемый для получения его вариантов бычьего химозина в настоящем документе.
Варианты верблюжьего химозина конструируют на основе выравнивания последовательностей большого множества общеизвестных последовательностей аспарагинпротеазы, имеющих идентичность 25% или больше, по сравнению с бычьим химозином B.
Изменения, как правило, вводятся в гипервариабельных областях, в то время как консервативные области не изменяются. Множество изменений вводят в каждый конструкт варианта, обеспечивая то, что каждая отдельная мутация присутствует во множестве конструктов вариантов (относительно обсуждения результатов - см. пример 6 ниже).
Варианты бычьего химозина конструируют на основе сравнения бычьего и верблюжьего химозина. Бычьи остатки, например, изменяют на соответствующие им верблюжьи остатки (относительно обсуждения результатов - см. пример 7 ниже).
Пример 3
Приготовление ферментативного материала для вариантов химозина
Все варианты химозина синтезируют как синтетические гены и клонируют в грибковый вектор экспрессии, соответствующий в основном pGAM pR-C (описан в WO 02/36752 A2).
Векторы трансформируют в E. Coli, и плазмиду ДНК очищают с использованием стандартных протоколов молекулярной биологии, известных специалистам в данной области.
Плазмиды вариантов индивидуально трансформируют в штамм Aspergillus niger, и белок продуцируют в основном, как описано в WO 02/36752A2, и очищают с использованием стандартных хроматографических методик.
Как известно из литературы, специалист в данной области может основываться на этих общедоступных общих знаниях; продуцируют и очищают химозин и варианты химозина, такие как описанные в настоящем документе варианты бычьего и верблюжьего химозина.
Пример 4
Определение удельной активности химозина
4.1 Определение активности свертывания
Молокосвертывающую активность определяют с использованием метода REMCAT, который представляет собой стандартный метод, разработанный International Dairy Federation (метод IDF). Молокосвертывающую активность определяют по времени, необходимому для видимой флоккуляции стандартного субстрата молока, полученного из порошка обезжиренного молока низкотемпературной сушки с помощью раствора хлорида кальция, 0,5 г на литр (pH≈6,5). Время свертывания для образца сычужного фермента сравнивают со временем для эталонного стандарта, имеющего известную молокосвертывающую активность и имеющего такую же композицию ферментов согласно IDF Standard 110B, в качестве образца. Образцы и эталонные стандарты измеряют при идентичных химических и физических условиях. Образцы вариантов доводят приблизительно до 3 IMCU/мл с использованием 84 мМ буфера на основе уксусной кислоты, pH 5,5. Затем 200 мкл фермента добавляют к 10 мл предварительно нагретого молока (32°C) в стеклянной пробирке, помещенной на водяную баню, способную поддерживать постоянную температуру 32°C±1°C, при постоянном перемешивании.
Общую молокосвертывающую активность (крепость) сычужного фермента вычисляют в International Milk-Clotting Units (IMCU) на мл по отношению к стандарту, имеющему такую же композицию ферментов, как образец, в соответствии с формулой:
Крепость в IMCU/мл = Sstandard × Tstandard × Dsample
Dstandard × Tsample
| Sstandard: | Молокосвертывающая активность международного эталонного стандарта для сычужного фермента |
| Tstandard: | Время свертывания в секундах, полученное для стандартного разбавления |
| Dsample: | Коэффициент разбавления для образца |
| Dstandard: | Коэффициент разбавления для стандарта |
| Tsample: | Время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного фермента от добавления фермента до времени флоккуляции |
4.2 Определение общего содержания белка
Общее содержание белка определяют с использованием Pierce BCA Protein Assay Kit от Thermo Scientific, следуя инструкциям производителя.
4.3 Вычисление удельной активности свертывания
Удельную активность свертывания (IMCU/мг белка в целом) определяют посредством деления активности свертывания (IMCU/мл) на общее содержание белка (мг белка в целом на мл).
Пример 5
Определение протеолитической активности
Общую протеолитическую активность измеряют с использованием флуоресцентно меченого казеина Bodipy-FL в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Производные казеина, сильно меченые pH-нечувствительным зеленым-флуоресцентным Bodipy-FL, дают в результате почти полное гашение флуоресценции конъюгата. Гидролиз, катализируемый протеазой, высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что является главным для этого эксперимента, поскольку CHYMAX M имеет самую низкую общую протеолитическую активность из всех коагулянтов, известных к настоящему времени.
Анализ осуществляют в 0,2 M фосфатном буфере, доведенном до желаемого значения pH, при конечной концентрации субстрата 0,04 мг/мл. Перед смешиванием 1 части субстрата с 1 частью фермента обе приготавливают в фосфатном буфере, все варианты ферментов нормируют на 50 IMCU/мл (в соответствии с примером 4). Субстрат и фермент смешивают в 96-луночных планшетах для микротитрования Nunc Fluoro, герметизируют и инкубируют при 32°C в течение 60 мин. После инкубирования герметизацию снимают и флуоресценцию регистрируют на флуориметре.
Пример 6
Оценка вариантов верблюжьего химозина
Для всех вариантов удельную активность свертывания (IMCU/мг белка в целом) определяют при pH 6,5 в соответствии с примером 4. Варианты ранкируют с использованием следующей стратегии. Вариант с самой низкой удельной активностью дает один пункт, второй снизу дает два пункта, и так далее.
Такую же стратегию ранкирования осуществляют для отношения C/P. Отношение C/P определяют для всех вариантов при pH 6,5 посредством деления удельной активности свертывания (IMCU/мг) на протеолитическую активность.
Определяют общее количество пунктов для каждого варианта с использованием обеих стратегий ранкирования, и конечное ранкирование осуществляют на основе суммы пунктов.
В качестве эталона включены верблюжий ген дикого типа и бычий ген дикого типа.
Термин "X" обозначает отсутствие изменений, то есть отсутствие мутации.
Поскольку все варианты включают множество мутаций, данные по ранкированным вариантам исследуют более подробно с использованием статистических методов и 3D структурного анализа для определения индивидуальных изменений аминокислот, которые имеют положительное или отрицательное воздействие. В этом исследовании также оцениваются/включаются бычьи варианты, обсуждаемые в примере 7, ниже.
Идентифицируются следующие мутации:
| D117N | ++ Основной сегмент |
| H134Q | ++ Открытый сегмент |
| L280I | ++ В углублении |
| D156V | + Основной |
| V241I | + Основной |
| D325M | + Основной |
| R374L | -- Основной |
| K289N | -- Загнутый край с другой стороны |
| V279K | -- В углублении |
| G302D | -- Загнутый край |
| L353K | - Bход в углубление |
| L311I | ++ Нижняя часть углубления |
| G309W | + Наружный малый сегмент |
| G309D | + |
| V279M | + |
Термин "+" относится к положительному изменению аминокислоты, то есть "++" является более положительным, чем "+".
Термин "-" относится к отрицательному изменению аминокислоты, то есть "--" является более отрицательным, чем "-".
Описания в правом столбце таблицы относятся к тому, где именно находятся индивидуальные мутации в 3D структуре бычьего химозина. 3D структура бычьего химозина является общедоступной. В качестве примера на фигуре 2 показано, где именно положения 296 и 294 аминокислот присутствуют в бычьем химозине.
Выводы
Приведенные выше результаты демонстрируют, что следующие мутации в верблюжьем химозине являются положительными (то есть улучшают отношение C/P по сравнению с верблюжьим химозином дикого типа):
D117N
H134Q
L280I
D156V
V241I
D325M
L311I
G309W
G309D
V279M
Пример 7
Оценка вариантов бычьего химозина
Варианты бычьего химозина оценивают на основе их отношения C/P только при pH 6,5.
| Мутации, бычий → верблюжий | Протеолитическая активность | Aктивность свертывания/мг | С/P | |
| 3 | K279V, V281F | 127,237 | 37 | 0,3 |
| 4 | Q298E, Q300R | 59,942 | 241 | 4,0 |
| 6 | H350N, Q352E, K353L | 106,417 | 191 | 1,8 |
| 7 | D307N, D309G | 56,349 | 47 | 0,8 |
| 8 | Q141E, I143F | 91,011 | 176 | 1,9 |
| Бычий (3327) | Нет | 124,237 | 157 | 1,3 |
| Верблюжий (А01) | Нет | 53,354 | 197 | 3,7 |
Поскольку все варианты включают множество мутаций, то и данные ранкированных вариантов исследуют более подробно с использованием статистических методов и 3D структурного анализа, для определения индивидуальных изменений аминокислот, которые имеют положительное или отрицательное воздействие. В этом исследовании также оцениваются/включаются верблюжьи варианты, обсуждаемые в примере 6.
Идентифицируют следующие положительные мутации бычьего химозина:
| Q298E | ++ |
| Q300R | ++ |
| H350N | + |
| K353L | + |
| Q141E | + |
| I143F | + |
Термин "+" относится к положительному изменению аминокислоты, то есть "++" является более положительным, чем "+".
Термин "-" относится к отрицательному изменению аминокислоты, то есть "--"является более отрицательным, чем "-".
Выводы
Приведенные выше результаты демонстрируют, что следующие мутации в бычьем химозине являются положительными (то есть улучшают отношение C/P по сравнению с бычьим химозином дикого типа):
Q300R
H350N
K353L
Q141E
I143F
Пример 8
Положения для получения положительной мутации в химозине
Сравнительная оценка результатов, описанных в примерах 6 и 7, дает в результате следующие данные.
Область каталитического углубления 279-281
Как показано в примере 7, двойная мутация K279V и V281F в бычьем химозине дает в результате отрицательное воздействие на отношение C/P. В верблюжьем химозине мутация V279K также дает в результате отрицательный результат (пример 6). Следовательно, можно сделать вывод, что оптимальная аминокислота в положении 281 представляет собой V. Наблюдается также, что мутация L280I у верблюда имеет положительное воздействие.
Область малого сегмента 298-300
Как показано в примере 7, двойная мутация Q298E и Q300R в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.
Область каталитического углубления 350-353
Как показано в примере 7, тройная мутация H350N, Q352E и K353L в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.
В верблюжьем химозине наблюдают (пример 6), что L353Q имеет положительное воздействие, в то время как L353K имеет отрицательное воздействие.
Область малого сегмента 307-311
Как показано в примере 7, двойная мутация D307N и D309G в бычьем химозине имеет отрицательное воздействие на отношение C/P.
В верблюжьем химозине G309D и G309W имеют положительное воздействие. Это означает, что мутация D307N в бычьем химозине является ответственной за отрицательное воздействие. В верблюжьем химозине мутация L311I, как показано, имеет положительные воздействия.
Область основного сегмента 134-143
Как показано в примере 7, двойная мутация Q141E и I143F в бычьем химозине имеет положительное воздействие на отношение C/P.
Изменение H134 в Q в верблюжьем химозине, как показано, имеет полезное воздействие
| Положение | Предпочтительные аминокислоты |
| 280 | I |
| 281 | V |
| 298 | E |
| 300 | R |
| 352 | Q (менее предпочтительная L) |
| 309 | D или W |
| 307 | D |
| 141 | E |
| 143 | F |
| 353 | Q |
| 352 | Q |
| 311 | I |
| 134 | Q |
Ссылки
1: WО 02/36752 A2 (Chr. Hansen)
2: Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71.
3: Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569.
4: van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Jour nal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
5: Pitts et al: Expression and characterization of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83.
6: M. G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering de sign and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997.
7: Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic char acterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Vallllphe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871.
8: Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139.
9: Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
Claims (25)
1. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина, включающий стадии:
(a): осуществления изменений в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117; и
(b): продуцирования и выделения измененного полипептида со стадии (a) с получением при этом выделенного варианта полипептида химозина, где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде, и
(ii): исходный полипептид имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и
где выделенный вариант полипептида химозина имеет:
активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
2. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по любому из предыдущих пунктов, где изменением является замещение в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117.
3. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 2, где замещение представляет 117N.
4. Способ получения выделенного варианта полипептида химозина по п. 2, где замещение представляет собой D117N.
5. Выделенный вариант полипептида химозина, включающий:
(a): изменение в одном или нескольких положениях исходного полипептида, имеющего активность химозина, где изменение включает замещение, делецию или инсерцию в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117; и
(b): где вариант имеет активность химозина;
и где
(i): положение аминокислоты исходного полипептида определяют посредством выравнивания последовательностей исходного полипептида с полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим химозином), то есть полипептид SEQ ID NO: 1 используют для определения соответствующей последовательности аминокислот в исходном полипептиде; и
(ii): исходный полипептид имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином), который содержит аминокислоты от положения аминокислоты 59 до положения аминокислоты 381 SEQ ID NO: 2; и
(iii): выделенный вариант полипептида имеет менее чем 100% идентичность последовательностей со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином); и
где выделенный вариант имеет активность химозина, дающую более высокое отношение C/P по сравнению с отношением C/P верблюжьего химозина, содержащего зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
6. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 5, где выделенный вариант верблюжьего химозина содержит менее 10 аминокислотных изменений (например, замещений) по сравнению со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 2 (верблюжьим химозином).
7. Выделенный вариант полипептида химозина по любому из пп. 5, 6, где изменением является замещение в положении по меньшей мере одной аминокислоты, соответствующем положению 117.
8. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 7, в котором замещением является 117N.
9. Выделенный вариант полипептида химозина по п. 8, в котором замещением является D117N.
10. Способ приготовления пищевого продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 5-9 в пищевой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением пищевого продукта.
11. Способ приготовления кормового продукта, включающий добавление эффективного количества выделенного варианта полипептида химозина по любому из пп. 5-9 в кормовой ингредиент (ингредиенты) и осуществление дополнительных стадий приготовления с получением кормового продукта.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12169503 | 2012-05-25 | ||
| EP12169503.5 | 2012-05-25 | ||
| PCT/EP2013/060460 WO2013174840A1 (en) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108268A Division RU2019108268A (ru) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014152723A RU2014152723A (ru) | 2016-07-20 |
| RU2683385C2 true RU2683385C2 (ru) | 2019-03-28 |
Family
ID=48577692
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108268A RU2019108268A (ru) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
| RU2014152723A RU2683385C2 (ru) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2019108268A RU2019108268A (ru) | 2012-05-25 | 2013-05-22 | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9930899B2 (ru) |
| EP (3) | EP3929288A1 (ru) |
| JP (3) | JP2015518718A (ru) |
| KR (2) | KR102245756B1 (ru) |
| CN (2) | CN104487572B (ru) |
| AU (2) | AU2013265343B2 (ru) |
| BR (2) | BR122021019895B1 (ru) |
| CA (3) | CA3201812A1 (ru) |
| DK (2) | DK3604509T3 (ru) |
| ES (1) | ES2741723T5 (ru) |
| FI (1) | FI2855674T4 (ru) |
| HK (1) | HK1202894A1 (ru) |
| MX (3) | MX366610B (ru) |
| NZ (4) | NZ742660A (ru) |
| PL (2) | PL2855674T5 (ru) |
| RU (2) | RU2019108268A (ru) |
| TR (1) | TR201910420T4 (ru) |
| UA (2) | UA126330C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013174840A1 (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3929288A1 (en) | 2012-05-25 | 2021-12-29 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| KR102494645B1 (ko) | 2014-02-26 | 2023-02-06 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체 |
| WO2016128476A1 (en) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | Chr. Hansen A/S | Blends of chymosins with improved milk-clotting properties |
| DK3310914T3 (da) * | 2015-06-22 | 2022-06-20 | Chr Hansen As | Chymosinvarianter med forbedrede egenskaber |
| CA2995755A1 (en) * | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| WO2017198810A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10961524B2 (en) * | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| CN106754840B (zh) * | 2016-12-22 | 2019-06-21 | 江南大学 | 一种酶活及热稳定性改善的凝乳酶突变体 |
| JP7455062B2 (ja) | 2018-01-15 | 2024-03-25 | セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ | ホスホリパーゼを用いた発酵乳製品及びその調製物 |
| CN111172139B (zh) * | 2020-02-27 | 2021-11-30 | 武汉轻工大学 | 一种小牛皱胃凝乳酶及基因与菌株和应用 |
| CN113801867B (zh) * | 2021-11-18 | 2022-03-18 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 骆驼凝乳酶原突变蛋白及其编码基因和应用 |
| AU2023249315A1 (en) | 2022-04-06 | 2024-09-26 | Chr. Hansen A/S | Aspartic protease, methods and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2192137C2 (ru) * | 2000-08-07 | 2002-11-10 | Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" | Способ производства сыра |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0123928A3 (en) | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
| US7390936B1 (en) | 1999-08-23 | 2008-06-24 | Sembiosys Genetics Inc. | Commercial production of chymosin in plants |
| DK2365069T3 (en) | 2000-11-06 | 2018-04-23 | Eidgenoessisch Technische Hochschule Zuerich | Process for the preparation of non-bovine chymosin and its use |
| KR20100109969A (ko) | 2002-10-02 | 2010-10-11 | 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 | 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법 |
| ES2609102T3 (es) | 2003-06-27 | 2017-04-18 | Bioren, LLC | Mutagénesis por revisión |
| WO2005094185A2 (en) | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Sudershan Biotech Limited | Recombinant calf-chymosin and a process for producing the same |
| WO2008098973A1 (en) | 2007-02-13 | 2008-08-21 | Chr. Hansen A/S | Coagulation of milk |
| JP2010046034A (ja) | 2008-08-22 | 2010-03-04 | Toyota Central R&D Labs Inc | 変異体のスクリーニング方法 |
| ES2445710T3 (es) | 2009-03-24 | 2014-03-04 | Meito Sangyo Co., Ltd. | Proteasa coagulante de la leche de tipo mejorado derivada de un microorganismo |
| WO2013164481A1 (en) | 2012-05-03 | 2013-11-07 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved enzyme variants |
| EP3929288A1 (en) | 2012-05-25 | 2021-12-29 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| KR102494645B1 (ko) | 2014-02-26 | 2023-02-06 | 시에이치알. 한센 에이/에스 | 개선된 응유 특성을 갖는 키모신 변이체 |
| WO2016128476A1 (en) | 2015-02-10 | 2016-08-18 | Chr. Hansen A/S | Blends of chymosins with improved milk-clotting properties |
| DK3310914T3 (da) | 2015-06-22 | 2022-06-20 | Chr Hansen As | Chymosinvarianter med forbedrede egenskaber |
| CA2995755A1 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved properties |
| WO2017198810A1 (en) | 2016-05-19 | 2017-11-23 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
| US10961524B2 (en) | 2016-05-19 | 2021-03-30 | Chr. Hansen A/S | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |
-
2013
- 2013-05-22 EP EP21164270.7A patent/EP3929288A1/en active Pending
- 2013-05-22 CA CA3201812A patent/CA3201812A1/en active Pending
- 2013-05-22 RU RU2019108268A patent/RU2019108268A/ru unknown
- 2013-05-22 EP EP19174281.6A patent/EP3604509B1/en active Active
- 2013-05-22 CA CA2874214A patent/CA2874214C/en active Active
- 2013-05-22 CN CN201380039107.0A patent/CN104487572B/zh active Active
- 2013-05-22 DK DK19174281.6T patent/DK3604509T3/da active
- 2013-05-22 KR KR1020147036631A patent/KR102245756B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-22 PL PL13727539.2T patent/PL2855674T5/pl unknown
- 2013-05-22 ES ES13727539T patent/ES2741723T5/es active Active
- 2013-05-22 KR KR1020217011988A patent/KR102419515B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-22 AU AU2013265343A patent/AU2013265343B2/en active Active
- 2013-05-22 BR BR122021019895-0A patent/BR122021019895B1/pt active IP Right Grant
- 2013-05-22 TR TR2019/10420T patent/TR201910420T4/tr unknown
- 2013-05-22 JP JP2015513145A patent/JP2015518718A/ja active Pending
- 2013-05-22 NZ NZ742660A patent/NZ742660A/en unknown
- 2013-05-22 NZ NZ742745A patent/NZ742745A/en unknown
- 2013-05-22 PL PL19174281T patent/PL3604509T3/pl unknown
- 2013-05-22 FI FIEP13727539.2T patent/FI2855674T4/fi active
- 2013-05-22 DK DK13727539.2T patent/DK2855674T4/da active
- 2013-05-22 CN CN201911082253.7A patent/CN110714001A/zh active Pending
- 2013-05-22 RU RU2014152723A patent/RU2683385C2/ru active
- 2013-05-22 WO PCT/EP2013/060460 patent/WO2013174840A1/en active Application Filing
- 2013-05-22 NZ NZ725398A patent/NZ725398A/en unknown
- 2013-05-22 US US14/402,567 patent/US9930899B2/en active Active
- 2013-05-22 EP EP13727539.2A patent/EP2855674B2/en active Active
- 2013-05-22 UA UAA201808552A patent/UA126330C2/uk unknown
- 2013-05-22 NZ NZ702030A patent/NZ702030A/en unknown
- 2013-05-22 UA UAA201413887A patent/UA118956C2/uk unknown
- 2013-05-22 MX MX2014014300A patent/MX366610B/es active IP Right Grant
- 2013-05-22 CA CA3100606A patent/CA3100606C/en active Active
- 2013-05-22 BR BR112014029012-1A patent/BR112014029012B1/pt active IP Right Grant
-
2014
- 2014-11-24 MX MX2019008255A patent/MX2019008255A/es active IP Right Grant
- 2014-11-24 MX MX2020011941A patent/MX2020011941A/es unknown
-
2015
- 2015-04-09 HK HK15103493.9A patent/HK1202894A1/xx unknown
-
2018
- 2018-02-20 US US15/900,603 patent/US10806157B2/en active Active
- 2018-06-06 JP JP2018108935A patent/JP2018148926A/ja active Pending
-
2019
- 2019-05-21 AU AU2019203589A patent/AU2019203589B2/en active Active
- 2019-12-18 JP JP2019228446A patent/JP2020058367A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2192137C2 (ru) * | 2000-08-07 | 2002-11-10 | Открытое акционерное общество "Уфамолагропром" | Способ производства сыра |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| JUNKO SUZUKI et al. ALTERATION OF CATALYTIC PROPERTIES OF CHYMOSIN BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS, PROTEIN ENGINEERING Vol.2, NO.7, pp. 563-569, 1989. * |
| JUNKO SUZUKI et al. Site-directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering Vol.4, NO.1, pp. 69-71, 1990. * |
| JUNKO SUZUKI et al. Site-directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering Vol.4, NO.1, pp. 69-71, 1990. JUNKO SUZUKI et al. ALTERATION OF CATALYTIC PROPERTIES OF CHYMOSIN BY SITE-DIRECTED MUTAGENESIS, PROTEIN ENGINEERING Vol.2, NO.7, pp. 563-569, 1989. VAN DEN BRINK H. et al. Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of Biotechnology Vol.125, Issue 2, pp. 304-310, 2006. PITTS J.E. et al. Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei, Journal of Biotechnology Vol.28, Issue 1, pp. 69-83, 1993. WILLIAMS M.G. et al. Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein Engineering Design and Selection Vol.10, Issue 9, pp. 991-997, 1997. STROP P. et al. Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0-.ANG. resolution of Val111Phe site-mutated ca * |
| KAPPELER S.R. et al. Characterization of recombinant camel chymosin reveals superior properties for the coagulation of bovine and camel milk, Biochemical and Biophysical Research Communications Vol.342, Issue 2, pp. 647-654, 2006. * |
| PITTS J.E. et al. Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Trichoderma reesei, Journal of Biotechnology Vol.28, Issue 1, pp. 69-83, 1993. * |
| STROP P. et al. Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0-.ANG. resolution of Val111Phe site-mutated calf chymosin, Biochemistry Vol.29, NO.42, pp. 9863-9871, 1990. * |
| SUPANNEE CHITPINITYOL et.al. Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry Vol.62, Issue 2, pp. 133-139, 1998. * |
| VAN DEN BRINK H. et al. Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of Biotechnology Vol.125, Issue 2, pp. 304-310, 2006. * |
| WILLIAMS M.G. et al. Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein Engineering Design and Selection Vol.10, Issue 9, pp. 991-997, 1997. * |
| ZHANG Y. et al. Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA. PROTEIN STRUCTURE AND MOLECULAR ENZYMOLOGY Vol.1343, NO. 2, pp. 278-286, 1997. * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2683385C2 (ru) | Варианты химозина с улучшенными молокосвертывающими свойствами | |
| US11827913B2 (en) | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties | |
| JP7395251B2 (ja) | 改善された凝乳特性を有するキモシン変異体 | |
| JP7084317B2 (ja) | 改善された凝乳特性を有するキモシン変異体 | |
| AU2022200663B2 (en) | Variants of chymosin with improved milk-clotting properties |