BR122021019895B1 - Variantes de polipeptídeo de quimosina isolada, seu método de produção método para a fabricação de um alimento ou produto alimentício - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a variantes de quimosina com propriedades melhoradas de coagulação do leite.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a variantes de quimosina com propriedades melhoradas de coagulação do leite.
TÉCNICA ANTECEDENTE
[002] A coagulação enzimática do leite por enzimas de coagulação do leite, tais como a quimosina e a pepsina, é um dos processos mais importantes na fabricação dos queijos. A coagulação enzimática do leite é um processo bifásico: uma primeira fase em que uma enzima proteolítica, quimosina ou pepsina, ataca a K-caseína, o que resulta em um estado metaestável da estrutura de micela da caseína e uma segunda fase em que o leite coagula subsequentemente e forma um coágulo.
[003] A quimosina (EC 3.4.23.4) e a pepsina (EC 3.4.23.1), as enzimas de coagulação do leite do estômago de mamíferos, são proteases aspárticas que pertencem a uma ampla classe de peptidases.
[004] Quando produzidas nas células da mucosa gástrica, a quimosina e a pepsina ocorrem como pré-pró-quimosina e pré-pepsi- nogênio enzimaticamente inativos, respectivamente. Quando a quimosina é excretada, um fragmento de peptídeo do N-terminal, o pré- fragmento (peptídeo de sinal) é eliminado por clivagem para obter a pró- quimosina incluindo um pró-fragmento. A pró-quimosina é uma forma substancialmente inativa da enzima que, no entanto, se torna ativada sob condições ácidas à quimosina ativa pela remoção autocatalítica do pró-fragmento. Essa ativação ocorre in vivo no lúmen gástrico sob condições de pH apropriado ou in vitro sob condições ácidas.
[005] As características estruturais e funcionais da pre-pró- quimosina, pró-quimosina e quimosina bovina, isto é, Bos taurus, foram estudadas extensivamente. A pré-parte da molécula de pré-pró- quimosina bovina compreende 16 resíduos de aminoácidos e a pró- parte da pró-quimosina correspondente tem um comprimento de 42 resíduos de aminoácidos. A quimosina bovina ativa que compreende 323 aminoácidos é uma mistura de duas formas, A e B, ambas as quais são ativas.
[006] A quimosina é produzida naturalmente em espécies de mamíferos tais como bovinos, camelos, caprinos, búfalos, carneiros, porcos, seres humanos, macacos e ratos.
[007] A quimosina dos bovinos tem estado comercialmente disponível à indústria de laticínios há muitos anos.
[008] O documento de patente WO02/36752A2 (Chr. Hansen) descreve a produção recombinante da quimosina de camelo.
[009] As referências listadas imediatamente a seguir podem ser vistas no presente contexto como as referências que descrevem mutantes da quimosina:
[010] Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, páginas 69-71;
[011] Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, páginas 563-569;
[012] van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, páginas 304-310;
[013] Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, páginas 69-83;
[014] M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, páginas 991-997;
[015] Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, páginas 9863-9871;
[016] Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, páginas 133-139;
[017] Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45- Cys50, in recombinant pro-chymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, páginas 278-286.
Nenhuma das referências da técnica anterior mencionadas acima descreve diretamente e de maneira não ambígua qualquer um dos mutantes/variantes de quimosina tal como descrito/reivindicado a seguir na presente invenção. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[018] O problema a ser resolvido pela presente invenção consiste na obtenção de variantes de quimosina com propriedades melhoradas de coagulação do leite.
[019] Tal como discutido nos exemplos práticos na presente invenção - os autores da presente invenção identificaram uma série de variantes de quimosina de camelos (vide o Exemplo 6 na presente invenção) e de bovino (vide o Exemplo 7 na presente invenção) melhoradas.
[020] Com base em uma análise comparativa das variantes de camelos e de bovino - os autores da presente invenção identificaram uma série de outras posições de aminoácidos que são importantes na presente invenção no sentido de que, ao produzir uma variante em uma ou mais dessas posições, é possível obter uma variante de quimosina melhorada (vide o Exemplo 8 na presente invenção).
[021] Tal como é sabido no estado da técnica, diferentes sequências de polipeptídeo de quimosina do tipo selvagem obtidas a partir de espécies de mamíferos diferentes (tais como, por exemplo, bovinos, camelos, carneiros, porcos, ou ratos) estão tendo uma similaridade/identidade de sequência relativamente elevada.
[022] Na Figura 1 na presente invenção isto é exemplificado por um alinhamento de sequências de quimosina diferentes relevantes na presente invenção.
[023] Em vista dessa relação de sequência relativamente próxima, acredita-se que as estruturas 3D de quimosinas do tipo selvagem naturais diferentes também sejam relativamente similares.
[024] No presente contexto atual, uma quimosina do tipo selvagem obtida natural (tal como a quimosina bovina ou a quimosina de camelo) pode ser na presente invenção um exemplo de um polipeptídeo pai, isto é, um polipeptídeo pai no qual uma alteração é feita para produzir um polipeptídeo de quimosina variante da presente invenção.
[025] Sem ficar limitado à teoria, acredita-se que as posições de aminoácidos relacionados à quimosina discutidas na presente invenção discutidas sejam de importância geral em qualquer enzima de quimosina relevante na presente invenção de interesse (por exemplo, as quimosinas de, por exemplo, bovinos, camelos, carneiros, porcos, ratos, etc.), no sentido que, ao produzir uma variante em uma ou mais dessas posições, é possível obter a uma variante de quimosina melhorada em general (por exemplo, uma variante de quimosina bovina, camelos, dos carneiros, porcos ou ratos melhorada).
[026] Tal como discutido na presente invenção - como uma sequência de referência para determinar a posição de aminoácido de um polipeptídeo de quimosina pai de interesse (por exemplo, de camelos, carneiros, bovinos, etc.) é usada na presente invenção a sequência de pré-pró-quimosina de quimosina B de bovino de conhecimento do público (número de acesso P00794 no Genbank - indicada coma SEQ ID NO.: 1 na presente invenção).
[027] A pré-pró-quimosina de quimosina B de bovino da SEQ ID NO.: 1 pode ser na presente invenção chamada alternativamente de quimosina B de bovino (Bos bovis) ou simplesmente quimosina bovina. A sequência também é mostrada na Figura 1 na presente invenção.
[028] Uma outra sequência de quimosina relevante na presente invenção é a sequência de quimosina de Camelius dromedarius publicamente conhecida da SEQ ID NO.: 2 na presente invenção. Na presente invenção ela pode ser alternativamente chamada de quimosina de camelo. A sequência também é mostrada na Figura 1 na presente invenção.
[029] No presente contexto, acredita-se que um polipeptídeo de quimosina pai (por exemplo, de carneiros ou de ratos) que tenha uma identidade de sequência de pelo menos 65% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) pode ser visto na presente invenção como relacionado estruturalmente suficiente a, por exemplo, quimosina bovina ou de camelos a fim de ser melhorado a fim de produzir uma variante em qualquer uma das posições de aminoácidos tal como descrito na presente invenção.
[030] Por conseguinte, um primeiro aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, que compreende as etapas de:
[031] (a): realização de uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[032] (b): produção e isolamento do polipeptídeo alterado da etapa (a) e desse modo a obtenção da variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a variante tem a atividade de quimosina;
[033] e em que:
[034] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) - isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[035] (ii): o polipeptídeo pai tem uma identidade de sequência de pelo menos 65% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 1.
[036] Tal como é sabido no estado da técnica, o elemento versado na técnica, com base em seu conhecimento geral comum, pode produzir e purificar rotineiramente a quimosina e variantes da quimosina. Dito em outras palavras, uma vez que o elemento versado na técnica está de posse de um polipeptídeo pai relevante da presente invenção que tem a atividade de quimosina de interesse (por exemplo, de bovino, camelos, carneiros, porcos, ou ratos) é trabalho de rotina para o elemento versado na técnica a produção de uma variante de tal quimosina pai de interesse.
[037] Um segundo aspecto da invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada obtida pelo método do primeiro aspecto ou de quaisquer de duas modalidades relevantes na presente invenção.
[038] O termo "obtido" com relação ao segundo aspecto acima deve ser compreendido como que a variante de polipeptídeo de quimosina isolada foi obtida pelo método do primeiro aspecto ou de quaisquer de suas modalidades relevantes na presente invenção. Por conseguinte, o termo "obtido" com relação ao segundo aspecto não deve ser compreendido como obtenível.
[039] Tal como discutido na presente invenção, nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (de Bovino) como polipeptídeo pai - tal variante pode ser chamada na presente invenção de variante de quimosina bovina.
[040] Por conseguinte, um terceiro aspecto da invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada que compreende:
[041] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[042] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[043] e em que:
[044] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) - isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[045] (ii): o polipeptídeo pai tem uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 1; e
[046] (iii): o polipeptídeo variante isolada tem uma identidade de sequência de menos de 100% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[047] Tal como discutido na presente invenção, nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo) como polipeptídeo pai, tal variante pode ser chamada na presente invenção de variante de quimosina de camelo.
[048] Por conseguinte, um quarto aspecto da invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada que compreende:
[049] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[050] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[051] e em que:
[052] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) - isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[053] (ii): o polipeptídeo pai tem uma identidade de sequência de pelo menos 90% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 2; e
[054] (iii): o polipeptídeo variante isolada tem uma identidade de sequência de menos de 100% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[055] Uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção pode ser usada de acordo com a técnica, por exemplo, para produzir um alimento ou produto alimentício de interesse (tal como, por exemplo, um produto à base de leite de interesse que pode ser, por exemplo, ser um produto de queijo).
[056] Por conseguinte, um quinto aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de um alimento ou produto alimentício, o qual compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e a execução das outras etapas de fabricação para obter o alimento ou produto alimentício.
[057] A modalidade da presente invenção é descrita a seguir, apenas a título de exemplos.
DEFINIÇÕES
[058] Todas as definições de termos relevantes na presente invenção estão de acordo com o que deve ser compreendido pelo elemento versado na técnica com relação ao contexto técnico relevante na presente invenção.
[059] O termo "quimosina" refere-se a uma enzima da classe EC 3.4.23.4. A quimosina tem uma alta especificidade e coagula o leite por meio da clivagem de uma única ligação 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 na cadeia kapa da caseína. Um nome alternativo usado no estado da técnica é renina.
[060] O termo "atividade de quimosina" refere-se à atividade de quimosina de uma enzima de quimosina tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto.
[061] O elemento versado na técnica sabe determinar na presente invenção a atividade de quimosina relevante.
[062] No Exemplo prático 4 na presente invenção é fornecido um exemplo de um método padrão para determinar a atividade de quimosina específica - chamada alternativamente de atividade de coagulação ou atividade de coagulação do leite.
[063] No Exemplo prático 5 é fornecido na presente invenção um exemplo de um método padrão para determinar a atividade proteolítica.
[064] Tal como é conhecido no estado da técnica, a chamada relação C/P relevante é determinada ao dividir a atividade de coagulação específica (C) pela atividade proteolítica (P).
[065] Tal como é conhecido no estado da técnica, uma relação C/P mais elevada implica de modo geral que a perda da proteína durante, por exemplo, a fabricação do queijo devida à degradação não específica da proteína é reduzida, isto é, o rendimento do queijo é melhorado, e que o desenvolvimento do gosto amargo no queijo durante a maturação é reduzido.
[066] O termo "variante isolada" significa uma variante que é modificada pela mão do homem. Em um aspecto, a variante é pelo menos 1% pura, por exemplo, pelo menos 5% pura, pelo menos 10% pura, pelo menos 20% pura, pelo menos 40% pura, pelo menos 60% pura, pelo menos 80% pura e pelo menos 90% pura, tal como determinado por SDS PAGE.
[067] O termo "polipeptídeo maduro" significa um peptídeo em sua forma final depois da translação e de todas as modificações pós- translacionais, tal como o processamento de terminal N, o truncamento de C, a glicosilação, a fosforilação, etc., do terminal C. No presente contexto, um polipeptídeo de quimosina maduro relevante na presente invenção pode ser visto como a sequência de polipeptídeo de quimosina ativa - isto é sem as sequências pré-parte e/ou pró-parte. Na presente invenção, os exemplos relevantes de um polipeptídeo maduro incluem, por exemplo, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.:1 ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 2.
[068] O termo "pai" ou "polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina" significa um polipeptídeo no qual uma alteração é feita para produzir as variantes de enzima da presente invenção. O pai pode ser um polipeptídeo natural (do tipo selvagem) ou uma variante do mesmo.
[069] O termo "identidade de sequência" refere-se à relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos.
[070] Para as finalidades da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinado ao usar o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são a penalidade aberta da abertura 10, a penalidade da extensão de abertura 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). A saída da "identidade mais longa" rotulada com Needle (obtida ao usar a opção nobrief) é usada como a porcentagem de identidade e calculada tal como segue:
[071] (Desoxiribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de aberturas no alinhamento)
[072] Para as finalidades da presente invenção, o grau de identidade da sequência entre duas sequências de desoxiribonucleotídeos é determinado ao usar o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) tal como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), de preferência a versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são a penalidade aberta de abertura 10, a penalidade da extensão de abertura 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (a versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída da "identidade mais longa" rotulada com Needle (obtida ao usar a opção nobrief) é usada como a porcentagem de identidade e calculada tal como segue: (Desoriribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número tota de aberturas no alinhamento).
[073] O termo "variante" significa um peptídeo que tem a atividade de quimosina que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, uma inserção, e/ou uma eliminação, em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção de um aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa a adição de 1 a 3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido ocupando uma posição.
[074] O aminoácido pode ser um aminoácido natural ou não natural - por exemplo, a substituição por, por exemplo, em particular de D-isômeros (ou D-formas) de, por exemplo, D-alanina pode ser teoricamente possível.
[075] O termo peptídeo de quimosina "do tipo selvagem" significa um quimosina expressa por um organismo natural, tal como um mamífero (por exemplo, camelo ou bovino) encontrado na natureza.
DESENHOS
[076] Figura 1: Um alinhamento de sequências de quimosina diferentes relevantes na presente invenção. A "Bos_bovis_quimosina_B" mostrada é a quimosina bovina da SEQ ID NO.: 1 na presente invenção e a de "Camelus_dromedarius" mostrada é a quimosina de camelo da SEQ ID NO.: 2 na presente invenção. Ao usar a quimosina bovina da SEQ ID NO.: 1 como a sequência de referência tal como descrito na presente invenção pode ser visto, por exemplo, que a quimosina bovina tem "V" na posição 10 e o quimosina de camelo tem "A" na mesma posição 10. Por exemplo, também pode ser visto que bovino/Rato têm "Q" na posição 352 e Camel/C._bactrianus ter "E" na mesma posição 352.
[077] Com relação às sequências de quimosina mostradas na Figura 1 - a de carneiro tem 94,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino: 1; C._bactrianus tem 83,2% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino; Camelus_dromedarius (quimosina de camelo da SEQ ID NO.: 2) tem 84% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino; o porco tem 80,3% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino e o rato tem 71,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino.
[078] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, as porcentagens de identidades de sequências relevantes de sequências de polipeptídeos maduros de, por exemplo, quimosina de carneiro, C._bactrianus, camelo, porco ou rato com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina - isto é, as posições de aminoácidos 59 a 381 da SEQ ID NO.: 1) são relativamente similares às porcentagens de identidade de sequência acima mencionadas.
[079] Figura 2: A estrutura 3D da quimosina bovina - a estrutura 3D é publicamente disponível. Como um exemplo, é mostrado onde as posições de aminoácidos 296 e 294 estão presentes na quimosina bovina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Determinação da posição de aminoácido de uma quimosina de interesse
[080] Tal como discutido acima - como uma sequência de referência para determinar a posição de aminoácido de um polipeptídeo de quimosina relevante na presente invenção de interesse (por exemplo, de camelo, carneiro, bovinos etc.) é usada na presente invenção a sequência de quimosina bovina publicamente conhecida indicada como SEQ ID NO.: 1 na presente invenção.
[081] Para as finalidades da presente invenção, o polipeptídeo indicado na SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) é usado para determinar o resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo de quimosina. A sequência de aminoácido de um outro polipeptídeo de quimosina é alinhada com o polipeptídeo indicado na SEQ ID NO.:1. e baseado no alinhamento, e o número de posição de aminoácido que corresponde a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo indicado na SEQ ID NO.: 1 é determinado ao usar o algoritmo de ClustalW tal como descrito no Exemplo prático 1 na presente invenção.
[082] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em um outro polipeptídeo de quimosina pode ser confirmada ao usar o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), de preferência a versão 3.0.0 ou posterior.
[083] Com base nos programas de computador bem conhecidos acima, é trabalho de rotina para um elemento versado na técnica a determinação da posição de aminoácido de um polipeptídeo de quimosina relevante na presente invenção de interesse (por exemplo, de camelo, carneiro, bovino, etc.).
[084] Na Figura 1, é mostrado na presente invenção um exemplo de um alinhamento.
[085] Apenas como um exemplo, na Figura 1 pode ser visto, por exemplo, que a SEQ ID NO.: 1 de referência de bovino usada na presente invenção tem um "G" na posição 50 e "Camelus_dromedarius" (SEQ ID NO.: 2 na presente invenção) tem um "A" nessa posição 50.
Nomenclatura das variantes
[086] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita a seguir é adaptada para fins de facilitar a referência. As abreviações de aminoácidos de uma só letra ou de três letras IUPAC aceitas são empregadas.
[087] As variantes específicas discutidas nesta seção de "nomenclatura" a seguir podem não ser neste casa variantes relevantes da presente invenção, isto é, esta seção de "nomenclatura" é apenas para descrever a nomenclatura usada na presente invenção relevante com tal.
[088] Substituições. Para uma substituição de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Por conseguinte, uma substituição teórica de treonina por alanina na posição 226 é designada como "Thr226Ala" ou "T226A". As mutações múltiplas são separadas pelas marcas de adição ("+"), por exemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" ou "G205R + S411F", representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) por arginina (R) e de serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente. Uma substituição, por exemplo, designada "226A" refere-se a uma substituição de um aminoácido pai (por exemplo, T, Q, S ou um outro aminoácido pai) por alanina na posição 226.
[089] Eliminações. Para uma eliminação de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, *. Por conseguinte, a eliminação de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". As eliminações múltiplas são separadas pelas marcas de adição ("+"), por exemplo, "Gly195* + Ser411*" ou "G195* + S411*".
[090] Inserções. Para uma inserção de aminoácido, a seguinte nomenclatura é usada: aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. A inserção de lisina após a glicina na posição 195 é designada "Gly195GlyLys" ou "G195GK". Uma inserção de aminoácidos múltiplos é designada [aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido # 1, aminoácido inserido # 2; etc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após a glicina na posição 195 é indicada como "Gly195GlyLysAla" ou "G195GKA".
[091] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácidos inseridos é numerado pela adição de letras minúsculas ao número da posição do resíduo de aminoácido que precede o(s) resíduo(s) de aminoácidos inseridos. No exemplo acima, a sequência deve desse modo ser:
Figure img0001
[092] Alterações múltiplas. As variantes que compreendem alterações múltiplas são separadas pelas marcas de adição ("+"), por exemplo, "Arg170Tyr+Gly195Glu" ou "R170Y+G195E" que representam uma substituição de tirosina e ácido glutâmico para a arginina e a glicina nas posições 170 e 195, respectivamente.
[093] Substituições diferentes. Onde substituições diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as substituições diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, "Arg170Tyr, Glu" ou "R170Y, E" representa uma substituição de arginina por tirosina ou por ácido glutâmico na posição 170. Desse modo, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" ou "Y167G,A + R170G,A" designam as seguintes variantes:
[094] "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".
Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada
[095] Tal como discutido acima, tal como é conhecido no estado da técnica, o elemento versado na técnica pode, com base em seu conhecimento geral comum, produzir e purificar rotineiramente a quimosina e as variantes de quimosina.
[096] Dito em outras palavras, uma vez que o elemento versado na técnica esteja de posse de um polipeptídeo pai relevante na presente invenção que tem a atividade de quimosina de interesse (por exemplo, de bovino, camelos, carneiros, porcos, ou ratos) é trabalho rotineiro para o elemento versado na técnica a produção de uma variante de tal quimosina pai de interesse.
[097] Um exemplo de um método apropriado para produzir e isolar um quimosina (variante ou pai) pode ser, por exemplo, pela tecnologia bem conhecida, por exemplo, baseada na expressão/produção recombinante fungal tal como, por exemplo, descrito no documento de patente WO02/36752A2 (Chr. Hansen).
[098] Também é trabalho rotineiro para o elemento versado na técnica a execução da alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido.
[099] Tal como também é sabido pelo elemento versado na técnica, isto pode por exemplo, ser feito pela chamada mutagênese dirigida ao sítio e a tecnologia baseada na expressão/produção recombinante.
[0100] Também é trabalho rotineiro para o elemento versado na técnica a determinação se um polipeptídeo pai relevante na presente invenção (por exemplo, quimosina do tipo selvagem de camelo ou de bovino) e/ou uma variante relevante na presente invenção tem ou não a atividade de quimosina.
[0101] Tal como conhecido no estado da técnica, a atividade de quimosina pode ser determinada pela chamada relação C/P, a qual é determinada ao dividir a atividade de coagulação específica (C) pela atividade proteolítica (P).
[0102] Tal como é conhecido no estado da técnica, uma relação C/P mais elevada implica em geral que a perda de proteína durante, por exemplo, a fabricação do queijo devida à degradação de proteína não específica é reduzida, isto é, o rendimento do queijo é melhorado, e que o desenvolvimento do gosto amargo no queijo durante a maturação é reduzido.
[0103] No Exemplo prático 4 na presente invenção é descrito um método apropriado para determinar a atividade de coagulação específica (C) e no Exemplo prático 5 na presente invenção é descrito um método apropriado para determinar a atividade proteolítica (P).
[0104] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção é uma variante, em que a variante tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina bovina que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 na presente invenção.
[0105] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção é uma variante, em que a variante tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 na presente invenção.
[0106] Com mais preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção é uma variante, em que a variante tem
[0107] - uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina bovina que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 na presente invenção; e
[0108] - uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 na presente invenção.
[0109] Tal como discutido acima - como uma sequência de referência para determinar a posição de aminoácido de um polipeptídeo de quimosina relevante na presente invenção de interesse (por exemplo, de camelo, carneiro, bovino, etc.) é usada na presente invenção a sequência de quimosina bovina publicamente conhecida indicada como SEQ ID NO.: 1 na presente invenção.
[0110] Tal como discutido acima - com base, por exemplo, nos programas de alinhamento de sequências de computador discutidos na presente invenção - é trabalho rotineiro para o elemento versado na técnica a determinação da posição de aminoácido na presente invenção relevante de um polipeptídeo de quimosina relevante na presente invenção de interesse (por exemplo, de camelo, carneiro, bovino, etc.).
[0111] A expressão "o polipeptídeo pai tem apelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina)" por exemplo, do método do primeiro aspecto na presente invenção pode ser vista como relacionada a uma limitação baseada na sequência do polipeptídeo de quimosina pai usado para produzir uma variante relevante na presente invenção do mesmo.
[0112] Dito em outras palavras, acredita-se que um polipeptídeo de quimosina pai maduro (por exemplo, de carneiro ou porco) que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com a quimosina madura de bovino seja estruturalmente idêntico o suficiente, por exemplo, à quimosina bovina ou de camelo a fim de ser relevante na presente invenção, isto é no presente contexto acredita-se que um polipeptídeo de quimosina pai maduro (por exemplo, de carneiro ou de rato) que tenha pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) pode na presente invenção ser visto como relacionado estruturalmente o suficiente, por exemplo, à quimosina bovina ou de camelo a fim de ser melhorado ao produzir uma variante em qualquer uma das posições de aminoácidos tal como descrito na presente invenção.
[0113] O polipeptídeo de quimosina de camelo da SEQ ID NO.: 2 tem 84% de identidade de sequência com o polipeptídeo de bovino da SEQ ID NO.: 1 (isto é, a SEQ ID NO.: 1 completa da 1 posição 1 à 381, que inclui a sequência pré e pró).
[0114] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, um polipeptídeo pai relevante na presente invenção que tem a atividade de quimosina já pode ser, por exemplo, uma variante, por exemplo, de uma quimosina do tipo selvagem correspondente.
[0115] Por exemplo, uma variante de quimosina de camelo com, por exemplo, 5 a 10 alterações (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo de quimosina de camelo do tipo selvagem da SEQ ID NO.: 2 ainda será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (Bovino) tal como necessário, por exemplo, no primeiro aspecto da presente invenção.
[0116] Dito em outras palavras, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada relevante na presente invenção pode compreender alterações (por exemplo, substituições) em uma outra posição do que nas posições, por exemplo, do primeiro aspecto da presente invenção.
[0117] Com relação às sequências de quimosina mostradas na Figura 1 na presente invenção, o carneiro tem 94,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino; C._bactrianus tem 83,2% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino; o porco tem 80,3% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino e o rato tem 71,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO.: 1 de bovino.
[0118] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica, no presente contexto as porcentagens de identidade de sequência relevantes na presente invenção, por exemplo, de quimosina madura de carneiro, de C._bactrianus, de camelo, de porco ou de rato com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimisona de bovino, ou seja, posições de aminoácidos 59 a 381 da SEQ ID NO.: 1) são relativamente similares às porcentagens de identidade de sequência acima mencionadas.
Variantes preferidas:
[0119] Tal como discutido acima, por exemplo, o primeiro aspecto refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0120] Uma modalidade preferida refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0121] Pode ser preferível que pelo menos uma alteração seja uma substituição, isto é, uma modalidade preferida relevante na presente invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0122] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0123] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0124] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, se o polipeptídeo de quimosina pai já tiver, por exemplo, "V" na posição 156, então não faz sentido falar sobre executar a substituição 156V para este polipeptídeo de quimosina pai específico. Tal como pode ser visto na Figura 1 na presente invenção, a quimosina do tipo selvagem de rato tem "V" em posição 156 - a substituição 156V pode ser vista como irrelevante na presente invenção para a sequência específica de polipeptídeo de quimosina de rato da Figura 1.
[0125] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0126] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0127] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, se o polipeptídeo de quimosina pai não tiver, por exemplo, "D" na posição 156, então não faz sentido falar sobre fazer a substituição D156V para este polipeptídeo de quimosina pai específico. Tal como pode ser visto na Figura 1 na presente invenção, a quimosina do tipo selvagem de rato tem "V" na posição 156 - a substituição D156V pode, portanto, ser vista como irrelevante na presente invenção para a sequência específica de polipeptídeo de quimosina de rato da Figura 1.
[0128] Em uma modalidade preferida, a substituição é aquela em que a substituição é H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0129] Em uma modalidade preferida, a substituição é aquela em que a substituição é:
[0130] F281V + V306I + I321L;
[0131] H134Q + I154L + D216S;
[0132] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0133] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0134] H134Q + L280I + G309W;
[0135] R119Q + D156V + V375L;
[0136] Y79S + R119S + H204R;
[0137] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0138] Y194I + R213Q + G309D;
[0139] Y79S + D117N + I321L;
[0140] Y185F + D325M + E352Q;
[0141] Y79S + L224V + L311I;
[0142] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0143] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0144] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0145] G128D + L188I + Y326F;
[0146] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0147] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0148] K279V + V281F;
[0149] Q298E + Q300R;
[0150] H350N + Q352E + K353L;
[0151] D307N + D309G; ou
[0152] Q141E + I143F.
Polipeptídeo pai preferido que tem atividade de quimosina:
[0153] De preferência, o polipeptídeo pai tem pelo menos 70% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), e com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 75% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0154] Apenas como um exemplo, um polipeptídeo pai relevante na presente invenção apropriado pode ser, por exemplo, a quimosina A de bovino - tal como é conhecido no estado da técnica, a quimosina A de bovino só pode ter uma diferença de aminoácido em comparação com a quimosina B de bovino da SEQ ID NO.: 1 na presente invenção.
[0155] Tal como discutido acima, nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (Bovino) como polipeptídeo pai - tal variante pode ser chamada na presente invenção de variante de quimosina bovina.
[0156] Por conseguinte, em uma modalidade preferida o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), e ainda com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina). Pode ser preferível que o polipeptídeo pai seja o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0157] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, um polipeptídeo pai relevante na presente invenção que tem a atividade de quimosina já pode, por exemplo, ser uma variante, por exemplo, de um quimosina do tipo selvagem correspondente.
[0158] Por exemplo, uma variante de quimosina bovina com, por exemplo, 5 a 10 alterações (por exemplo, substituições) em comparação com o polipeptídeo de quimosina bovina do tipo selvagem maduro da SEQ ID NO.: 1 ainda será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0159] O polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (Bovino) tem 323 aminoácidos de comprimento - por conseguinte, uma variante de quimosina bovina com, por exemplo, 25 substituições de aminoácidos em comparação ao polipeptídeo de quimosina bovina do tipo selvagem maduro da SEQ ID NO.: 1 não será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0160] Dito em outras palavras e de modo general, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada relevante na presente invenção pode compreender alterações (por exemplo, substituições) em outras posições que não as posições, por exemplo, do primeiro aspecto na presente invenção.
[0161] Tal como discutido acima - nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 2 (camelo) como polipeptídeo pai - tal variante pode ser chamado na presente invenção de variante de quimosina de camelo.
[0162] Por conseguinte, em uma modalidade preferida o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), e ainda com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos de identidade de sequência 97% com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo). Pode ser preferível que o polipeptídeo pai seja o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0163] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto - um polipeptídeo pai que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (camelo) ainda está dentro da SEQ ID NO.: 1 (Bovino) com base no requisito de identidade de sequência do ponto (ii) do primeiro aspecto na presente invenção - isto é, será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
Uma variante isolada de quimosina bovina:
[0164] Tal como discutido acima - nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (Bovino) como polipeptídeo pai - tal variante pode ser chamada na presente invenção de variante de quimosina bovina.
[0165] Tal como discutido acima - o terceiro aspecto refere-se por conseguinte a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada que compreende:
[0166] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[0167] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[0168] e em que:
[0169] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) - isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[0170] (ii): o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 1; e
[0171] (iii): o polipeptídeo de variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0172] As definições descritas acima e as modalidade preferidas também são relevantes para este aspecto.
[0173] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção é uma variante em que a variante tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina bovina que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1.
[0174] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo pai tem pelo menos 92% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina) e ainda com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0175] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto - uma variante isolada de quimosina pode compreender alterações (por exemplo, substituições) em outras posições de aminoácidos que não aquelas fornecidas acima.
[0176] Por exemplo, uma variante de quimosina bovina com, por exemplo, 5 a 10 alterações (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo de quimosina do tipo selvagem de bovino da SEQ ID NO.: 1 ainda será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0177] Pode ser preferível que a variante isolada de quimosina bovina compreenda menos de 30 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina bovina compreenda menos de 20 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina bovina compreenda menos de 10 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina bovina compreenda menos de 5 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0178] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto - o termo "o polipeptídeo de variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina)" do ponto (iii) acima refere-se ao fato que a variante de quimosina bovina isolada descrita na presente invenção não terá naturalmente uma sequência de polipeptídeo que é 100% idêntica à sequência de quimosina bovina do tipo selvagem publicamente conhecida da SEQ ID NO.: 1.
[0179] Uma modalidade preferida refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina bovina isolada, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0180] Pode ser preferível que pelo menos uma alteração seja uma substituição - isto é, uma modalidade preferida relevante na presente invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0181] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0182] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0183] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0184] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0185] Em uma modalidade preferida, a substituição é aquela em que a substituição é:
[0186] F281V + V306I + I321L;
[0187] H134Q + I154L + D216S;
[0188] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0189] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0190] H134Q + L280I + G309W;
[0191] R119Q + D156V + V375L;
[0192] Y79S + R119S + H204R;
[0193] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0194] Y194I + R213Q + G309D;
[0195] Y79S + D117N + I321L;
[0196] Y185F + D325M + E352Q;
[0197] Y79S + L224V + L311I;
[0198] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0199] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0200] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0201] G128D + L188I + Y326F;
[0202] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0203] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0204] K279V + V281F;
[0205] Q298E + Q300R;
[0206] H350N + Q352E + K353L;
[0207] D307N + D309G; ou
[0208] Q141E + I143F.
Uma variante isolada de quimosina de camelo:
[0209] Tal como discutido acima, nos exemplos práticos na presente invenção foram produzidas as variantes ao usar o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo) como polipeptídeo pai - tal variante pode ser chamada na presente invenção de variante de quimosina de camelo.
[0210] Tal como discutido acima, o quarto aspecto refere-se por conseguinte a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada que compreende:
[0211] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[0212] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[0213] e em que:
[0214] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[0215] (ii): o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo); e
[0216] (iii): o polipeptídeo de variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0217] As definições descritas acima e as modalidade preferidas também são relevantes para este aspecto.
[0218] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina de camelo isolada tal como descrito na presente invenção é uma variante, em que a variante tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P da quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2.
[0219] Em uma modalidade preferida o polipeptídeo pai tem pelo menos 92% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo) e ainda com mais preferência o polipeptídeo pai tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0220] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, uma variante isolada de quimosina pode compreender alterações (por exemplo, substituições) em outras posições de aminoácidos que não aquelas fornecidas acima.
[0221] Por exemplo, uma variante de quimosina de camelo com, por exemplo, 5 a 10 alterações (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo de quimosina do tipo selvagem de camelo da SEQ ID NO.: 2 ainda será um polipeptídeo pai que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0222] Pode ser preferível que a variante isolada de quimosina de camelo compreenda menos de 30 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina de camelo compreenda menos de 20 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina de camelo compreenda menos de 10 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), ou pode ser preferível que a variante isolada de quimosina de camelo compreenda menos de 5 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0223] Tal como é compreendido pelo elemento versado na técnica no presente contexto, o termo "o polipeptídeo de variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo)" do ponto (iii) acima refere-se ao fato que a variante de quimosina de camelo isolada descrita na presente invenção não terá naturalmente uma sequência de polipeptídeo que é 100% idêntico à sequência de quimosina do tipo selvagem de camelo publicamente conhecida da SEQ ID NO.: 2.
[0224] Uma modalidade preferida refere-se a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de camelo, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0225] Pode ser preferível que pelo menos uma alteração seja uma substituição, isto é, que uma modalidade preferida na presente invenção relevante esteja relacionada a uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0226] De preferência, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0227] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0228] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0229] De preferência, a substituição é aquela em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0230] Em uma modalidade preferida, a substituição é aquela em que a substituição é:
[0231] F281V + V306I + I321L;
[0232] H134Q + I154L + D216S;
[0233] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0234] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0235] H134Q + L280I + G309W;
[0236] R119Q + D156V + V375L;
[0237] Y79S + R119S + H204R;
[0238] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0239] Y194I + R213Q + G309D;
[0240] Y79S + D117N + I321L;
[0241] Y185F + D325M + E352Q;
[0242] Y79S + L224V + L311I;
[0243] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0244] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0245] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0246] G128D + L188I + Y326F;
[0247] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0248] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0249] K279V + V281F;
[0250] Q298E + Q300R;
[0251] H350N + Q352E + K353L;
[0252] D307N + D309G; ou
[0253] Q141E + I143F.
Método para a produção de um produto à base de leite
[0254] Tal como discutido acima, uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção pode ser usada de acordo com a técnica, por exemplo, para obter um produto à base de leite de interesse (tal como, por exemplo, um produto de queijo).
[0255] Tal como discutido acima, um aspecto da invenção refere-se a um método para a produção de um alimento ou produto alimentício, o qual compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e a execução de outras etapas de fabricação para obter o alimento ou produto alimentício.
[0256] De preferência, o alimento ou produto alimentício é um produto à base de leite e em que o método compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada tal como descrito na presente invenção ao leite e a execução de outras etapas de fabricação para obter o produto à base de leite.
[0257] O leite pode ser, por exemplo, leite de soja, leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala, leite de iaque, leite de lhama, leite de camela ou leite de vaca.
[0258] O produto à base de leite pode ser, por exemplo, um produto de leite fermentado, uma ricota ou um queijo.
Aspectos/modalidades da presente invenção - apresentados no formato de reivindicação
[0259] Os aspectos na presente invenção descritos e as modalidade preferidas da invenção podem ser apresentados/descritos em um chamado formato de reivindicação - isto é feito a seguir.
[0260] Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, o qual compreende as etapas de:
[0261] (a): execução de uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[0262] (b): produção e isolamento do polipeptídeo alterado da etapa (a) e desse modo a obtenção da variante de polipeptídeo de quimosina isolada, em que a variante tem a atividade de quimosina;
[0263] e em que:
[0264] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[0265] (ii): o polipeptídeo pai tem pelo menos 65% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 1.
[0266] 2. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 1, em que a variante de polipeptídeo de quimosina isolada tem:
[0267] - uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina bovina que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1; e
[0268] - uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2.
[0269] 3. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0270] 4. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0271] 5. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0272] 6. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 4, em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0273] 7. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 6, em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0274] 8. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 4, em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0275] 9. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 8, em que a substituição é H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0276] 10. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 4, em que a substituição é:
[0277] F281V + V306I + I321L;
[0278] H134Q + I154L + D216S;
[0279] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0280] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0281] H134Q + L280I + G309W;
[0282] R119Q + D156V + V375L;
[0283] Y79S + R119S + H204R;
[0284] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0285] Y194I + R213Q + G309D;
[0286] Y79S + D117N + I321L;
[0287] Y185F + D325M + E352Q;
[0288] Y79S + L224V + L311I;
[0289] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0290] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0291] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0292] G128D + L188I + Y326F;
[0293] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0294] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0295] K279V + V281F;
[0296] Q298E + Q300R;
[0297] H350N + Q352E + K353L;
[0298] D307N + D309G; ou
[0299] Q141E + I143F.
[0300] 11. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o polipeptídeo pai tem pelo menos 75% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0301] 12. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 11, em que o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0302] 13. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o polipeptídeo pai tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 2.
[0303] 14. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada obtida pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
[0304] 15. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada, a qual compreende:
[0305] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem a atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[0306] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[0307] e em que:
[0308] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[0309] (ii): o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 1; e
[0310] (iii): o polipeptídeo variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0311] 16. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 15, em que a variante isolada tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina bovina que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1.
[0312] 17. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 15 a 16, em que o polipeptídeo pai tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0313] 18. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 15 a 17, em que a variante isolada de quimosina bovina compreende menos de 10 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina).
[0314] 19. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 15 a 18, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0315] 20. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 15 a 19, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0316] 21. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 20, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0317] 22. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 20, em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0318] 23. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 22, em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0319] 24. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 22, em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0320] 25. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 20, em que a substituição é:
[0321] F281V + V306I + I321L;
[0322] H134Q + I154L + D216S;
[0323] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0324] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0325] H134Q + L280I + G309W;
[0326] R119Q + D156V + V375L;
[0327] Y79S + R119S + H204R;
[0328] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0329] Y194I + R213Q + G309D;
[0330] Y79S + D117N + I321L;
[0331] Y185F + D325M + E352Q;
[0332] Y79S + L224V + L311I;
[0333] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0334] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0335] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0336] G128D + L188I + Y326F;
[0337] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0338] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0339] K279V + V281F;
[0340] Q298E + Q300R;
[0341] H350N + Q352E + K353L;
[0342] D307N + D309G; ou
[0343] Q141E + I143F.
[0344] 26. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada, a qual compreende:
[0345] (a): uma alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo pai que tem atividade de quimosina, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353; e
[0346] (b): em que a variante tem a atividade de quimosina;
[0347] e em que:
[0348] (i): a posição de aminoácido do polipeptídeo pai é determinada por um alinhamento do polipeptídeo pai com o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 (quimosina bovina), isto é, o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 é usado para determinar a sequência de aminoácido correspondente no polipeptídeo pai; e
[0349] (ii): o polipeptídeo pai tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo), que vai da posição de aminoácido 59 à posição de aminoácido 381 da SEQ ID NO.: 2; e
[0350] (iii): o polipeptídeo variante isolada tem menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0351] 27. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 26, em que a variante isolada tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2.
[0352] 28. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 26 a 27, em que o polipeptídeo pai tem pelo menos 97% de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0353] 29. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que a variante isolada de quimosina de camelo compreende menos de 10 alterações de aminoácidos (por exemplo, substituições) em comparação ao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2 (quimosina de camelo).
[0354] 30. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 26 a 29, em que a alteração compreende uma substituição, uma eliminação ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0355] 31. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de qualquer uma das reivindicações 26 a 30, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 e 353.
[0356] 32. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 31, em que a alteração compreende uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido que corresponde a qualquer uma das posições 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 e 353.
[0357] 33. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 31, em que a substituição é 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0358] 34. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 33, em que a substituição é 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L ou 353Q.
[0359] 35. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 33, em que a substituição é D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L ou K353Q.
[0360] 36. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada da reivindicação 31, em que a substituição é:
[0361] F281V + V306I + I321L;
[0362] H134Q + I154L + D216S;
[0363] V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
[0364] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0365] H134Q + L280I + G309W;
[0366] R119Q + D156V + V375L;
[0367] Y79S + R119S + H204R;
[0368] Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
[0369] Y194I + R213Q + G309D;
[0370] Y79S + D117N + I321L;
[0371] Y185F + D325M + E352Q;
[0372] Y79S + L224V + L311I;
[0373] S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
[0374] F281V + G309W + S331Y + D337E;
[0375] D156V + G309D + M314L + V317I;
[0376] G128D + L188I + Y326F;
[0377] R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
[0378] R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
[0379] K279V + V281F;
[0380] Q298E + Q300R;
[0381] H350N + Q352E + K353L;
[0382] D307N + D309G; ou
[0383] Q141E + I143F.
[0384] 37. Método para a fabricação de um alimento ou produto alimentício, o qual compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 36 ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e a execução de outras etapas de fabricação para obter o alimento ou produto alimentício.
[0385] 38. Método para a produção de um alimento ou produto alimentício da reivindicação 37, em que o produto é um produto à base de leite e em que o método compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 36 ao leite e a execução de outras etapas de fabricação para obter o produto à base de leite.
[0386] 39. Método para a produção de um produto à base de leite da reivindicação 38, em que o leite é leite de soja, leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala, leite de iaque, leite de lhama, leite de camela ou leite de vaca.
[0387] 40. Método para a produção de um produto à base de leite de qualquer uma das reivindicações 38 a 39, em que o produto à base de leite é um produto de leite fermentado, uma ricota ou um queijo.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: alinhamento e numeração de sequências de proteína de quimosina e de sequências de variantes
[0388] As sequências de proteína de quimosina foram alinhadas ao usar o algoritmo de ClustalW tal como fornecido por EBI (EBI, ferramentas, alinhamento de múltiplas sequências, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) e tal como descritas em Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948.
[0389] Os ajustes ClustalW2 para alinhamentos de múltiplas sequências eram matriz do peso da proteína = BLOSUM, ABERTURA aberta = 10, EXTENSÃO DA ABERTURA = 0,05, DISTÂNCIAS DA ABERTURA = 8, Nenhuma Abertura de Extremidade, ITERAÇÃO = nenhuma, NUMITER = 1, AGLOMERAÇÃO = NJ.
[0390] Como uma sequência de referência, foi usada a pré-pró- quimosina B de quimosina bovina (número de acesso P00794 no Genbank - indicada na presente invenção como SEQ ID NO.: 1), onde a metionina do N-terminal tem o número 1 (MRCL ) e a isoleucina do C-terminal (na sequência de proteína . ..LAKAI) tem o número 381. As variantes foram alinhadas versus a pré-pró-quimosina B de bovino e os resíduos foram numerados de acordo com o resíduo de quimosina bovina correspondente.
EXEMPLO 2: Desenho de variantes de quimosina
[0391] As variantes de quimosina foram desenhadas ao usar estratégias diferentes.
[0392] Quando é feita referência a quimosina de camelo, é feita referência à quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 2 na presente invenção.
[0393] A quimosina de camelo da SEQ ID NO.: 2 pode ser vista como um polipeptídeo pai relevante na presente invenção que tem a atividade de quimosina usada para produzir as suas variantes de quimosina de camelo.
[0394] Quando é feita referência a quimosina bovina, é feita referência à quimosina bovina que compreende o polipeptídeo da SEQ ID NO.: 1 na presente invenção.
[0395] A quimosina bovina da SEQ ID NO.: 1 pode ser vista como um polipeptídeo pai relevante na presente invenção que tem a atividade de quimosina usada para produzir as suas variantes de quimosina bovina.
[0396] As variantes de quimosina de camelo foram desenhadas com base em um alinhamento de um grande conjunto de sequências de protease aspártica publicamente conhecidas que têm uma identidade de 25% ou mais em comparação à quimosina B de bovino.
[0397] As variações foram introduzidas em geral em regiões hipervariáveis, ao passo que as regiões conservadas não foram alteradas. Múltiplas variações foram introduzidas em cada construto de variante, assegurando que cada mutação simples etivesse presente em múltiplos construtos de variantes (para uma discussão sobre os resultados, vide o Exemplo 6 a seguir).
[0398] As variantes de quimosina bovina foram desenhadas com base em uma comparação de quimosina bovina e de camelo. Os resíduos de bovino, por exemplo, foram mudados para as contrapartes de camelo (para uma discussão sobre os resultados, vide o Exemplo 7 a seguir).
EXEMPLO 3: Preparação do material da enzima variante de quimosina
[0399] Todas as variantes de quimosina foram sintetizadas como genes sintéticos e clonadas em um vetor de expressão de fungo que corresponde essencialmente a pGAMpR-C (descrito no documento de patente WO02/36752A2).
[0400] Os vetores foram transformados em E. coli e o DNA do plasmídio foi purificado ao usar protocolos de biologia molecular padrão, conhecidos de um elemento versado na técnica.
[0401] Os plasmídios de variantes foram transformados individualmente em uma cepa de Aspergillus niger e a proteína foi produzida essencialmente tal como descrito no documento de patente WO02/36752A2 e purificada ao usar técnicas de cromatografia padrão.
[0402] Tal como é conhecido no estado da técnica, o elemento versado na técnica pode, baseado em seu conhecimento geral comum, produzir e purificara quimosina e as variantes de quimosina - tais como as variantes de quimosina bovina e de camelo descritas na presente invenção.
EXEMPLO 4: Determinação da atividade específica de quimosina 4.1 Determinação da atividade de coagulação
[0403] A atividade de coagulação do leite foi determinada ao usar o método de REMCAT, que é o método padrão desenvolvido pela International Dairy Federation (método da IDF). A atividade coagulação do leite é determinada a partir do momento necessário para uma floculação visível de um substrato de leite padrão preparado a partir de um leite em pó de baixo teor de gordura e baixa caloria com uma solução de cloreto de cálcio de 0,5 g por litro (pH ~ 6,5). O tempo de coagulação de uma amostra de Rennet é comparado àquele de um padrão de referência que tem uma atividade de coagulação do leite conhecida e tem a mesma composição de enzima pela Norma IDF 110B como amostra. As amostras e os padrões de referência foram medidos sob condições químicas e físicas idênticas. As amostras de variantes foram ajustadas em cerca de 3 IMCU/ml ao usar 84 mM de tampão de ácido acético com pH 5,5. Em seguida, 200 μl de enzima foram adicionados a 10 ml de leite pré-aquecido (32°C) em um tubo de ensaio de vidro colocado em um banho de água, capaz de manter uma temperatura constante de 32°C ± 1°C sob agitação constante.
[0404] A atividade total de coagulação do leite (força) de um Rennet foi calculada em Unidades de Coagulação do Leite Internacionais (IMCU) por ml em relação a um padrão que tem a mesma composição de enzima que a amostra de acordo com a fórmula:
Figure img0002
[0405] Spadrão: A atividade de coagulação do leite do padrão de referência internacional para Rennet.
[0406] Tpadrão: Tempo de coagulação em segundos obtido para a diluição padrão.
[0407] Damostra: Fator de diluição para a amostra.
[0408] Dpadrão: Fator de diluição para o padrão
[0409] Tamostra: Tempo de coagulação em segundos obtido para a amostra de Rennet diluída, da adição da enzima ao momento de floculação
[0410] 4.2 Determinação do teor de proteína total
[0411] O teor de proteína total foi determinado ao usar o Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA da Thermo Scientific ao seguir as instruções dos fornecedores.
[0412] 4.3 Cálculo da atividade de coagulação específica
[0413] A atividade de coagulação específica (proteína total em IMCU/mg) foi determinada ao dividir a atividade de coagulação (IMCU/ml) pelo teor de proteína total (mg de proteína total por ml).
EXEMPLO 5: Determinação da atividade proteolítica
[0414] A atividade proteolítica geral foi medida ao usar a caseina Bodipy-FL etiquetada de maneira fluorescente como um substrato (EnzChek; Bioprobes Molecular, E6638). Derivados de casein etiquetados pesadamente com Bodipy-FL fluorescente verde insensível ao pH- resultam na extinção quase completa da fluorescência do conjugado. A hidrólise catalisada pela protease libera Bodipy-FL fluorescente. Este método é muito sensível, o que era essencial para este experimento, uma vez que CHYMAX M tem uma atividade proteolítica geral mais baixa de todos os coagulantes conhecidos até a presente data.
[0415] O ensaio foi realizado em um tampão fosfato a 0,2 M ajustado no pH desejado a uma concentração final do substrato de 0,04 mg/ml. Antes de misturar 1 parte do substrato com 1 parte da enzima, ambos preparados no tampão de fosfato, todas as variantes da enzima foram normalizadas em 50 IMCU/ml (de acordo com o Exemplo 4). O substrato e a enzima foram misturados em placas de microtítulo de 96 cabidades Nunc Fluoro, lacrados e incubados a 32°C por 60 minutos. Depois da incubação a vedação foi removida e a fluorescência foi registrada em um fluorímetro.
EXEMPLO 6: Avaliação de variantes de quimosina de camelo
[0416] Para todas as variantes, a atividade de coagulação específica (IMCU/mg da proteína total) foi determinada a um pH 6,5 de acordo com o Exemplo 4. As variantes foram classificadas ao usar a seguinte estratégia. A variante com a atividade específica mais baixa obteve um ponto, a segunda mais baixa dois pontos, etc.
[0417] A mesma estratégia de classificação foi feita para a relação C/P. A relação C/P foi determinada para toda variante a um pH 6,5 ao dividir a atividade de coagulação específica (IMCU/mg) pela atividade proteolítica.
[0418] Os pontos totais para cada variante ao usar ambas as estratégias de classificação foram determinados e uma classificação final foi feita, com base na soma dos pontos.
[0419] Como uma referência, um gene de camelo do tipo selvagem e um gene de bovino do tipo selvagem foram incluídos.
Figure img0003
Figure img0004
[0420] O termo "X" não denota nenhuma mudança - isto é, nenhuma mutação.
[0421] Uma vez que todas as variantes incluíram múltiplas mutações, os dados das variantes classificadas foram investigados em mais detalhes ao usar métodos estatísticos e análise da estrutura 3D, para determinar as mudanças de aminoácidos individuais que têm um efeito positivo ou negativo. Nesta investigação também foram avaliadas/incluídas as variantes de bovino discutidas no Exemplo 7 a seguir.
[0422] D117N As seguintes mutações foram identificadas:
Figure img0005
[0423] O termo "+" refere-se a uma troca de aminoácido positiva, isto é, "+ +" é mais positivo do que "+"
[0424] O termo "-" refere-se a uma troca de aminoácido negativa, isto é, "- -" é mais negativo do que "-".
[0425] As descrições da coluna direita da tabela referem-se a onde as mutações individuais estão localizadas na estrutura 3D de quimosina bovina. A estrutura 3D de quimosina bovina está publicamente disponível. Como um exemplo, na Figura 2 é mostrado onde as posições de aminoácidos 296 e 294 estão presentes no quimosina bovina.
Conclusões:
[0426] Os resultados acima demonstram que as mutações seguintes na quimosina de camelo foram positivas (isto é, com relação C/P melhorada em comparação à quimosina de camelo do tipo selvagem):
[0427] D117N
[0428] H134Q
[0429] L280I
[0430] D156V
[0431] V241I
[0432] D325M
[0433] L311I
[0434] G309W
[0435] G309D
[0436] V279M
EXEMPLO 7: Avaliação de variantes de quimosina bovina
[0437] As variantes de quimosina bovina foram avaliadas com base em sua relação C/P apenas a um pH 6,5.
Figure img0006
[0438] Uma vez que todas as variantes incluiram múltiplas mutações e os dados das variantes classificadas foram investigados em mais detalhes, ao usar métodos estatísticos e análise da estrutura 3D, para determinar as mudanças de aminoácidos individuais que têm um efeito positivo ou negativo. Nesta investigação também foram avaliadas/incluídas as variantes de camelo discutidas no Exemplo 6.
[0439] As seguintes mutações positivas para o quimosina bovina foram identificadas:
Figure img0007
[0440] O termo "+" refere-se a uma troca de aminoácido positiva, isto é, "+ +" é mais positivo do que "+".
[0441] O termo "-" refere-se a uma troca de aminoácido negativa , isto é, "- -" é mais negativo do que "-".
Conclusões:
[0442] Os resultados acima demonstram que as mutações seguintes em quimosina bovina foram positivas (isto é, com relação C/P melhorada em comparação à quimosina bovina do tipo selvagem):
[0443] Q300R
[0444] H350N
[0445] K353L
[0446] Q141E
[0447] I143F
EXEMPLO 8: Posições para fazer a mutação positiva em quimosina
[0448] Uma avaliação comparativa dos resultados descritos nos Exemplos 6 e 7 resulta nos seguintes dados.
Região de fissura catalítica 279-281
[0449] Tal como mostrado no Exemplo 7, a mutação dupla K279V e V281F na quimosina bovina resultou em um efeito negativo na relação C/P. Na quimosina de camelo a mutação V279K também resultou em um resultado negativo (Exemplo 6). Portanto, a conclusão é que o aminoácido ideal na posição 281 é um V. Também foi observado que a mutação L280I no camelo teve um efeito positivo.
[0450] Região de líbulo pequeno 298-300
[0451] Tal como mostrado no Exemplo 7, a mutação dupla Q298E e Q300R na quimosina bovina teve um efeito positivo na relação C/P.
Região de fissura catalítica 350-353
[0452] Tal como mostrado no Exemplo 7, a mutação tripla H350N, Q352E e K353L na quimosina bovina teve um efeito positivo na relação C/P.
[0453] Na quimosina de camelo foi observado (Exemplo 6) que uma L353Q teve um efeito positivo ao passo que uma L353K teve um efeito negativo.
Região de lóbulo pequeno 307-311
[0454] Tal como mostrado no Exemplo 7, a mutação dupla D307N e D309G na quimosina bovina teve um efeito negativo na relação C/P.
[0455] Na quimosina de camelo, G309D e G309W tiveram um efeito positivo. Isto implica que a mutação D307N na quimosina bovina é responsável pelo efeito negativo
[0456] Na quimosina de camelo foi verificado que uma mutação L311I tem efeitos benéficos.
[0457] Região do osso da espinha 134-143
[0458] Tal como mostrado no Exemplo 7, a mutação dupla Q141E e I143F na quimosina bovina teve um efeito positivo na relação C/P.
[0459] Foi verificado que a mudança de H134 para Q na quimosina de camelo tem um efeito benéfico
Figure img0008
Figure img0009
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Claims (9)

1. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a): produzir uma variante de polipeptídeo de quimosina tendo uma alteração em uma ou mais posições em sua sequência de aminoácidos em relação a um polipeptídeo parental com atividade de quimosina, em que o polipeptídeo parental possui a sequência do polipeptídeo maduro da posição de aminoácido 59 ao aminoácido posição 381 da SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo), em que a alteração é uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido correspondente à posição L311I, conforme determinado por um alinhamento da sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo) e (b): isolar a variante de polipeptídeo da etapa (a), obtendo assim a variante de polipeptídeo de quimosina isolada; em que: - a variante de polipeptídeo de quimosina isolada tem: uma atividade de quimosina que resulta em uma relação entre atividade de coagulação e atividade proteolítica (C/P) mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2.
2. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que alteração é pelo menos uma substituição adicional de aminoácido, além da substituição de aminoácido L311I, correspondente à posição, 141, 143, , 300 ou 307.
3. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que alteração é pelo menos uma substituição adicional de aminoácido, além da substituição de aminoácido L311I, correspondente à posição 307D.
4. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a alteração é pelo menos uma substituição adicional de aminoácido, além da substituição de aminoácido L311I, correspondente à posição N307D.
5. Método para a produção de uma variante de polipeptídeo de quimosina isolada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a alteração é a substituição de aminoácidos: V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F; Y79S + L224V + L311I; ou R119S + V241I + L280I + L311I +D325M.
6. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada tendo uma alteração em uma ou mais posições em sua sequência de aminoácidos em relação a um polipeptídeo parental com atividade de quimosina, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo parental possui a sequência do polipeptídeo maduro da posição de aminoácido 59 ao aminoácido posição 381 da SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo), em que a alteração é uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido correspondente à posição L311I, conforme determinado por um alinhamento da sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com a sequência de aminoácidos do polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo), em que a variante isolada tem uma atividade de quimosina que resulta em uma relação C/P mais elevada em comparação à relação C/P de quimosina de camelo que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO.: 2.
7. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a alteração é pelo menos uma substituição adicional de aminoácido, além da substituição de aminoácido L311I, correspondente à posição D117N, L280I, N307D, ou G309D.
8. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a alteração é uma substituição em pelo menos uma posição de aminoácido e em que a substituição é: V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F; Y79S + L224V + L311I; ou R119S + V241I + L280I + L311I +D325M.
9. Método para a fabricação de um alimento ou produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e a execução de outras etapas de fabricação para obter o alimento ou produto alimentício; e em que o produto é um produto à base de leite e em que o método compreende a adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo de quimosina isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 ao leite e a execução de outras etapas de fabricação para obter o produto à base de leite; e em que o leite é leite de soja, leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala, leite de iaque, leite de lhama, leite de camela ou leite de vaca; e em que o produto à base de leite é um produto de leite fermentado, uma ricota ou um queijo.
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