BR112018073274B1 - Variante de polipeptídeo quimosina isolada, seu método de produção e seu uso, alimento ou produto alimentício, e seu método de produção - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a variantes de quimosina com propriedades de coagulação de leite aperfeiçoadas.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a variantes de quimosina com propriedades de coagulação de leite aperfeiçoadas.
[0002] A quimosina (EC 3.4.23.4) e a pepsina (EC 3.4.23.1), as enzimas de coagulação do leite do estômago dos mamíferos, são proteases aspárticas pertencentes a uma ampla classe de peptidases.
[0003] Quando produzidas nas células mucosais gástricas, a quimosina e a pepsina ocorrem como pré-proquimosina e pré- pepsinogênio enzimaticamente inativos, respectivamente. Quando a quimosina é excretada, um fragmento de peptídeo N-terminal, o pré- fragmento (peptídeo de sinal) é clivado para fornecer proquimosina incluindo um pró-fragmento. A proquimosina é uma forma substancialmente inativa da enzima que, no entanto, se torna ativada sob condições ácidas na quimosina ativa através de remoção autocatalítica do pró-fragmento. Esta ativação ocorre in vivo no lúmen gástrico sob condições de pH apropriadas ou in vitro sob condições ácidas.
[0004] As características estruturais e funcionais de pré- proquimosina, proquimosina e quimosina bovinas, isto é, Bos taurus, têm sido estudadas extensivamente. A pré-parte da molécula de pré- proquimosina bovina compreende 16 resíduos aa e a pró-parte da proquimosina correspondente tem um comprimento de 42 resíduos aa. A quimosina bovina ativa compreende 323 aa.
[0005] A quimosina é produzida naturalmente em espécies mamíferas tais como bovinos, camelos, caprinos, búfalos, ovelha, porcos, humanos, macacos e ratos.
[0006] Quimosina bovina e de camelo tem estado comercialmente disponível por vários anos para a indústria de laticínios.
[0007] Coagulação enzimática de leite por enzimas de coagulação do leite, tais como quimosina e pepsina, é um dos processos mais importantes na fabricação de queijos. Coagulação enzimática do leite é um processo de duas fases: uma primeira fase onde uma enzima proteolítica, quimosina ou pepsina, ataca K-caseína, resultando em um estado metastável da estrutura de micela da caseína e uma segunda fase, onde o leite coagula subsequentemente e forma um coágulo (referência 1).
[0008] O WO02/36752A2 (Chr. Hansen) descreve produção recombinante de quimosina de camelo.
[0009] O WO2013/174840A1 (Chr. Hansen) descreve mutantes/variantes de quimosina bovina e de camelo.
[0010] O WO2013/164479A2 (DSM) descreve mutantes de quimosina bovina.
[0011] A referência listada imediatamente abaixo pode, no presente contexto, ser vista como referências descrevendo mutantes de quimosina:
[0012] - Suzuki e outros: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, Janeiro de 1990, páginas 69-71;
[0013] - Suzuki e outros: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, Maio de 1989, páginas 563-569;
[0014] - van den Brink e outros: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, Setembro de 2006, páginas 304-310;
[0015] - Pitts e outros: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, Março de 1993, páginas 69-83;
[0016] - M.G. Williams e outros: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, Setembro de 1997, páginas 991-997;
[0017] - Strop e outros: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, Outubro de 1990, páginas 9863-9871;
[0018] - Chitpinityol e outros: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, Junho de 1998, páginas 133-139;
[0019] - Zhang e outros: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, Dezembro de 1997, páginas 278-286.
[0020] Nenhuma das referências à técnica anterior mencionadas acima descreve diretamente e sem ambiguidade qualquer uma das variantes de quimosina com atividade de coagulação específica aperfeiçoada ou razões de C/P aumentadas comparado com a origem da qual a variante é derivada, como descrito abaixo.
[0021] O problema a ser resolvido pela presente invenção é prover variantes de quimosina que, quando comparadas com o polipeptídeo de origem, têm uma atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) que é pelo menos 110% da atividade de coagulação específica de seu polipeptídeo de origem e/ou pelo menos 200% da razão de C/P de seu polipeptídeo de origem como aqui ilustrado.
[0022] Com base em projeto inteligente e análises comparativas de variantes diferentes, os presentes inventores identificaram várias posições de aminoácido que são importantes aqui no sentido de que ao produzir uma variante em uma ou mais dessas posições em um peptídeo de origem pode ser obtida uma variante de quimosina melhorada ou com atividade de coagulação específica aumentada ou razões de C/P aumentadas ou ambas.
[0023] A numeração de aminoácido como aqui usado para especificar a variante é baseada no peptídeo maduro. Como conhecido na técnica - sequências de polipeptídeo quimosina do tipo selvagem natural diferente obtidas de espécies de mamífero diferentes (tais como, por exemplo, bovinos, camelos, ovelha, porcos ou ratos) estão tendo uma similaridade/identidade de sequência relativamente alta. Na Figura 1 isso é exemplificado por um alinhamento de sequências de quimosina diferentes relevantes aqui. Em vista desta relação de sequência relativamente próxima - é acreditado que as estruturas 3D de quimosinas do tipo selvagem naturais diferentes sejam também relativamente similares.
[0024] No presente contexto - uma quimosina do tipo selvagem naturalmente obtida (tal como quimosina bovina ou quimosina de camelo) pode ser aqui um exemplo de um polipeptídeo de origem - isto é, um polipeptídeo de origem no qual uma alteração é feita para produzir um polipeptídeo quimosina variante da presente invenção.
[0025] Sem ser limitado pela teoria - é acreditado que as posições de aminoácido relacionadas à quimosina discutidas aqui sejam de importância geral em qualquer enzima quimosina aqui relevante de interesse (por exemplo, quimosinas de, por exemplo, bovinos, camelos, ovelha, porcos, ratos, etc.) - no sentido que ao produzir uma variante em uma ou mais dessas posições pode ser obtida uma variante de quimosina melhorada em geral (por exemplo, uma variante de quimosina bovina, de camelo, ovelha, porco ou rato melhorada).
[0026] Como aqui discutido - como uma sequência de referência para determinação da posição de aminoácido de um polipeptídeo quimosina de origem de interesse (por exemplo, camelo, ovelha, bovina, etc.) é aqui usada a sequência de quimosina madura de Camelius dromedarius conhecida pública de SEQ ID NO: 2. Ela pode ser aqui alternativamente chamada quimosina de camelo. A sequência é também mostrada na Figura 1 aqui.
[0027] No presente contexto, é acreditado que um polipeptídeo quimosina de origem (por exemplo, de ovelha ou rato) que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo) possa ser aqui visto como estruturalmente suficientemente relacionado com, por exemplo, quimosina bovina ou de camelo a fim de ser aperfeiçoado através da produção de uma variante em qualquer uma das posições de aminoácido como descrito aqui.
[0028] As modalidades da presente invenção são descritas abaixo.
[0029] Todas as definições de termos aqui relevantes estão de acordo com o que seria compreendido pelo versado na técnica em relação ao contexto técnico aqui relevante.
[0030] O termo “quimosina” refere-se a uma enzima da classe EC 3.4.23.4. A quimosina tem alta especificidade e predominantemente coagula leite através de clivagem de uma ligação 104-Ser-Phe-|-Met- Ala-107 única na cadeia K de caseína. Como uma atividade colateral, a quimosina também cliva a-caseína principalmente entre Phe23 e Phe24 e ß-caseina principalmente entre Leu192 e Tyr193 (referências 2, 3). Os peptídeos resultantes aS1(1-23) e ß(193-209) serão degradados mais por proteases de culturas microbianas adicionadas ao queijo em maturação (referência 4). Um nome alternativo de quimosina usada na técnica é renina.
[0031] O termo “atividade de quimosina” refere-se à atividade de quimosina de uma enzima quimosina como entendido pelo versado no presente contexto.
[0032] O versado sabe como determinar aqui atividade de quimosina relevante.
[0033] Como conhecido na técnica - a chamada razão de C/P relevante aqui é determinada dividindo a atividade de coagulação específica (C) pela atividade proteolítica (P).
[0034] Como conhecido na técnica - uma razão de C/P maior implica geralmente que a perda de proteína durante, por exemplo, fabricação do queijo devido à degradação de proteína não específica é reduzida, o que pode levar a melhorias em rendimento do queijo.
[0035] O termo “variante isolada” significa uma variante que é modificada pela ação do homem. Em um aspecto, a variante é pelo menos 1% pura, por exemplo, pelo menos 5% pura, pelo menos 10% pura, pelo menos 20% pura, pelo menos 40% pura, pelo menos 60% pura, pelo menos 80% pura e pelo menos 90% pura, conforme determinado através de SDS PAGE.
[0036] O termo “polipeptídeo maduro” significa um peptídeo em sua forma final seguindo tradução e quaisquer modificações pós- traducionais, tais como processamento N-terminal, truncamento C- terminal, glicosilação, fosforilação, etc. No presente contexto, um polipeptídeo quimosina maduro relevante aqui pode ser visto como a sequência de polipeptídeo quimosina ativo - isto é, sem as sequências de pré-parte e/ou pró-parte. Aqui, exemplos relevantes de um polipeptídeo maduro aqui são, por exemplo, o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 (quimosina bovina), que é de uma posição de aminoácido 59 até a posição de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 1 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo), que é da posição de aminoácido 59 até a posição de aminoácido 381 de SEQ ID NO: 2.
[0037] O termo “origem” ou “polipeptídeo de origem tendo atividade de quimosina” significa um polipeptídeo no qual uma alteração é feita para produzir as variantes de enzima da presente invenção. A origem pode ser um polipeptídeo de ocorrência natural (tipo selvagem) ou uma variante do mesmo.
[0038] O termo “Identidade de sequência” refere-se à relação entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo. Para propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice e outros., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de “identidade mais longa” classificada em Needle (obtida usando a opção “nobrief”) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Lacunas em Alinhamento)
[0039] Para propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice e outros., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de “identidade mais longa” classificada em Needle (obtida usando a opção “nobrief”) é usado como a identidade percentual e é calculado como segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Lacunas no Alinhamento)
[0040] O termo “variante” significa um peptídeo tendo atividade de quimosina compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção e/ou deleção, em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido ocupando uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção de um aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de 1-3 aminoácidos adjacentes a um aminoácido ocupando uma posição. O aminoácido pode ser aminoácidos naturais ou não naturais - por exemplo, substituição com, por exemplo, particularmente isômeros D- (ou formas D-) de, por exemplo, D-alanina, poderia ser teoricamente possível.
[0041] O termo peptídeo do “tipo selvagem” refere-se a uma sequência de nucleotídeo ou sequência de peptídeo como ela ocorre na natureza, isto é, sequência de nucleotídeo ou sequência de peptídeo que não foi submetida a mutações direcionadas pela ação do homem.
[0042] Figura 1: um alinhamento de sequências de quimosina diferentes relevantes aqui. Como compreendido pelo versado na técnica no presente contexto - porcentagens de identidade de sequência relevantes aqui de sequências de polipeptídeo maduro de, por exemplo, quimosina de ovelha, C. bactrianus, camelo, porco ou rato com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina - isto é, posições de aminoácido 59 a 381 de SEQ ID NO: 3) são relativamente similares às porcentagens de identidade de sequência mencionadas acima.
[0043] Figura 2: estrutura 3D de quimosina de camelo (detalhe, PDB: 4AA9) com um modelo de K-caseína ligada mostrado em estrutura de formato em bastão verde. K-caseína é posta na fenda de ligação de substrato de quimosina com a ligação côncava entre os resíduos 105 e 106. As mutações R242E, Y243E, N249D, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E, F282E são destacadas em azul.
[0044] Figura 3: estrutura 3D de quimosina bovina (PDB: 4AA8) com um modelo de K-caseína ligada mostrado em estrutura em formato de bastão, verde. K-caseína é posta na fenda de ligação de substrato de quimosina com a ligação côncava entre resíduos 105 e 106. As posições H292 e Q294 estão destacadas em amarelo.
[0045] Figura 4: estrutura 3D de quimosina de camelo (detalhe, PDB: 4AA9). Os resíduos Y11, L12 e D13 do terminal N da proteína bem como a contraparte de interação de Y11 potencial D290 são destacados em estrutura em formato de bastão púrpura.
[0046] Como discutido acima - como uma sequência de referência para determinação da posição de aminoácido de um polipeptídeo quimosina aqui relevante de interesse (por exemplo, camelo, ovelha, bovina, etc.) é aqui usada a sequência de quimosina de camelo conhecida pública revelada como SEQ ID NO: 2 aqui.
[0047] A sequência de aminoácido de um outro polipeptídeo quimosina é alinhada com o polipeptídeo revelado na SEQ ID NO: 2 e, com base no alinhamento, o número da posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo revelado na SEQ ID NO: 2 é determinado usando o algoritmo ClustalW como descrito no Exemplo 1 de trabalho aqui.
[0048] Com base nos programas de computador bem conhecidos acima - é trabalho de rotina para o versado na técnica determinar a posição de aminoácido de um polipeptídeo quimosina aqui relevante de interesse (por exemplo, camelo, ovelha, bovino, etc.).
[0049] Na Figura 1 aqui é mostrado um exemplo de um alinhamento. Apenas como um exemplo - na Figura 1 pode, por exemplo, ser visto que a SEQ ID NO: 3 de referência de bovino usada aqui tem um “G” na posição 50 e “Camelus_dromedarius” (SEQ ID NO: 2 aqui) tem um “A” nesta posição 50.
[0050] Na descrição das variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita abaixo é adaptada para facilidade de referência. As abreviações de aminoácido de letra única ou três letras IUPAC aceitas são empregadas. As variantes específicas discutidas nesta seção “nomenclatura” abaixo podem não ser aqui variantes relevantes da presente invenção - isto é, esta seção “nomenclatura” é apenas para descrever a nomenclatura relevante usada aqui.
[0051] Substituições. Para uma substituição de aminoácido, a nomenclatura que segue é usada: aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Desta maneira, uma substituição teórica de treonina com alanina na posição 226 é chamada “Thr226Ala” ou “T226A”. Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly205Arg + Ser411Phe” ou “G205R + S411F”, representando substituições nas posições 205 e 411 de glicina (G) com arginina (R) e serina (S) com fenilalanina (F), respectivamente. Uma substituição, por exemplo, chamada “226A” refere-se a uma substituição de um aminoácido de origem (por exemplo, T, Q, S ou um outro aminoácido de origem) com alanina na posição 226.
[0052] Deleções. Para uma deleção de aminoácido, a nomenclatura que segue é usada: aminoácido original, posição, *. Desta maneira, a deleção de glicina na posição 195 é chamada “Gly195*” ou “G195*”. Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Gly195* + Ser411*” ou “G195* + S411*”.
[0053] Inserções. Para uma inserção de aminoácido, a nomenclatura que segue é usada: aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Desta maneira, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é chamada “Gly195GlyLys” ou “G195GK”. Uma inserção de aminoácidos múltiplos é chamada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido No. 1, aminoácido inserido No. 2, etc.]. Por exemplo, uma inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como “Gly195GlyLysAla” ou “G195GKA”.
[0054] Em tais casos o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s) é/são numerado(s) pela adição de letras minúsculas ao número da posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria então:
[0055] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo alterações múltiplas são separadas por sinais de adição (“+”), por exemplo, “Arg170Tyr+Gly195Glu” ou “R170Y+G195E” representando uma substituição de arginina e glicina por tirosina e ácido glutâmico nas posições 170 e 195, respectivamente.
[0056] Substituições diferentes. Onde substituições diferentes puderem ser introduzidas em uma posição, as substituições diferentes são separadas por uma vírgula, por exemplo, “Arg170Tyr,Glu” ou “R170Y,E” representa uma substituição de tirosina ou ácido glutâmico por arginina na posição 170. Desta maneira, “Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala” ou “Y167G,A + R170G,A” designa as variantes que seguem: “Tyr167Gly+Arg170Gly”, “Tyr167Gly+Arg170Ala”, “Tyr167Ala+Arg170Gly” e “Tyr167Ala+Arg170Ala”.
[0057] Preferivelmente, o polipeptídeo de origem tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina) e/ou SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
[0058] Apenas como um exemplo - um polipeptídeo de origem relevante adequado aqui poderia ser, por exemplo, quimosina A bovina - como conhecido na técnica quimosina A bovina pode ter apenas uma diferença de aminoácido comparado com quimosina B bovina da SEQ ID NO: 3 aqui.
[0059] Em uma modalidade preferida - o polipeptídeo de origem tem pelo menos 90% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina), mais preferivelmente o polipeptídeo de origem tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina) e ainda mais preferivelmente o polipeptídeo de origem tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina). Pode ser preferido que o polipeptídeo de origem seja o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina).
[0060] Como compreendido pelo versado no presente contexto - um polipeptídeo de origem relevante aqui tendo atividade de quimosina já pode ser, por exemplo, uma variante de, por exemplo, uma quimosina do tipo selvagem correspondente.
[0061] Por exemplo, uma variante de quimosina bovina com, por exemplo, 5-10 alterações (por exemplo, substituições) comparado com polipeptídeo quimosina bovina do tipo selvagem maduro de SEQ ID NO: 3 pode ser ainda um polipeptídeo de origem que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 3 (quimosina bovina).
[0062] Como compreendido pelo versado na técnica no presente contexto - um polipeptídeo de origem pode ser um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (camelo). Em uma modalidade preferida - o polipeptídeo de origem tem pelo menos 92% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3, mais preferivelmente o polipeptídeo de origem tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 e/ou SEQ ID NO: 3 e ainda mais preferivelmente o polipeptídeo de origem tem pelo menos 97% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Pode ser preferido que o polipeptídeo de origem seja o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
[0063] Dito em outras palavras e em geral - uma variante de polipeptídeo quimosina isolada relevante aqui pode compreender alterações (por exemplo, substituições) em outras posições que não as posições afirmadas aqui. Por exemplo, uma variante de quimosina bovina com, por exemplo, 5-10 alterações (por exemplo, substituições) comparado com polipeptídeo quimosina de camelo do tipo selvagem de SEQ ID NO: 2 será ainda um polipeptídeo de origem que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[0064] Pode ser preferido que a variante de quimosina bovina isolada compreenda menos de 30 alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) comparado com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo) ou pode ser preferido que a variante de quimosina de camelo isolada compreenda menos do que 20 alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) comparado com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou pode ser preferido que a variante de quimosina bovina isolada compreenda menos do que 10 alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) comparado com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou pode ser preferido que a variante de quimosina de camelo isolada compreenda menos do que 5 alterações de aminoácido (por exemplo, substituições) comparado com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
[0065] Como discutido acima - como conhecido na técnica, o versado pode, com base em seu conhecimento geral comum, produzir e purificar rotineiramente quimosina e variantes de quimosina. Dito em outras palavras, uma vez o versado estando de posse de um polipeptídeo de origem relevante aqui tendo atividade de quimosina de interesse (por exemplo, de bovinos, camelos, ovelha, porcos ou ratos) é trabalho de rotina para o versado produzir uma variante de tal quimosina de origem de interesse quando guiado pela presente invenção.
[0066] Um exemplo de um método adequado para produzir e isolar uma quimosina (variante ou de origem) pode ser através de, por exemplo, tecnologia baseada em expressão/produção recombinante fúngica bem conhecida como, por exemplo, descrito no WO02/36752A2 (Chr. Hansen).
[0067] É também trabalho de rotina para o versado fazer alteração em uma ou mais posições em um polipeptídeo de origem tendo atividade de quimosina, onde a alteração compreende uma substituição, uma deleção ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido como aqui revelado.
[0068] Como conhecido do versado - isso pode, por exemplo, ser feito através da chamada mutagênese direcionada a sítio e tecnologia baseada em expressão/produção recombinante.
[0069] É também trabalho de rotina para o versado determinar se um polipeptídeo de origem relevante aqui (por exemplo, quimosina do tipo selvagem de camelo ou bovina) e/ou uma variante relevante aqui tem atividade de quimosina ou não.
[0070] Como conhecido na técnica - especificidade de quimosina pode ser determinada pela chamada razão de C/P, que é determinada dividindo a atividade de coagulação específica (C) pela atividade proteolítica (P). Como conhecido na técnica, uma razão de C/P maior implica geralmente que a perda de proteína durante, por exemplo, fabricação de queijo devido à degradação de proteína não específica é reduzida, isto é, o rendimento de queijo é melhorado.
[0071] Atividade de coagulação do leite pode ser determinada usando o método REMCAT, que é o método-padrão desenvolvido pela International Dairy Federation (método IDF). Atividade de coagulação do leite é determinada a partir do tempo necessário para uma floculação visível de um substrato de leite padrão preparado a partir de um leite em pó com baixo teor de gordura, baixo aquecimento, com uma solução de cloreto de cálcio de 0,5 g por litro (pH ~ 6,5). O tempo de coagulação de uma amostra de coalho é comparado com aquele de um padrão de referência tendo atividade de coagulação de leite conhecida e tendo a mesma composição de enzima pelo Padrão IDF 110B que a amostra. Amostras e padrões de referência são medidos sob condições químicas e físicas idênticas. Amostras de variante são ajustadas para aproximadamente 3 IMCU/ml usando um tampão de ácido acético 84 mM pH 5,5. Em seguida, 20 µl de preparação de enzima são adicionados a 1 ml de leite preaquecido (32° C) em um tubo de teste de vidro posto em um banho de água, capaz de manter uma temperatura constante de 32° C ± 1° C sob agitação constante. A atividade de coagulação do leite total (força) de um coalho é calculada em Unidades Internacionais de Coagulação do Leite (IMCU) por ml em relação a um padrão tendo a mesma composição de enzima que a amostra de acordo com a fórmula:
[0072] PadrãoS: a atividade de coagulação do leite do padrão de referência internacional para coágulo
[0073] PadrãoT: tempo de coagulação em segundos obtido para a diluição padrão
[0074] AmostraD: fator de diluição para a amostra
[0075] PadrãoD: fator de diluição para o padrão
[0076] AmostraT: tempo de coagulação em segundos obtido para a amostra de coágulo diluída desde adição de enzima até o momento da floculação
[0077] Para determinação da atividade de coagulação o método µlMCU pode ser usado ao invés do método REMCAT. Comparado com REMCAT, o tempo de floculação de variantes de quimosina no ensaio µlMCU é determinado através de medições de OD em placas de microtitulação de 96 cavidades a 800 nm em uma leitora de placa de UV/VIS. Uma curva padrão de várias diluições de um padrão de referência com força de coagulação conhecida é registrada em cada placa. Amostras são preparadas diluindo enzima em tampão de acetato 84 mM, Triton X-100 0,1%, pH 5,5. Reação a 32° C é iniciada adicionando 250 uL de um substrato de leite padrão contendo 4% (p/p) de leite em pó com baixo teor de gordura, baixo aquecimento, e 7,5% (p/p) de cloreto de cálcio (pH ~ 6,5) à amostra de enzima 25 uL. Atividade de coagulação do leite de variantes de quimosina em Unidades Internacionais de Coagulação do Leite (IMCU) por ml é determinada com base em tempo de floculação de amostra em relação à curva padrão.
[0078] O teor de proteína total pode ser preferivelmente determinado usando o Pierce BCA Protein Assay Kit da Thermo Scientific seguindo as instruções dos fornecedores.
[0079] Atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) foi determinada dividindo a atividade de coagulação (IMCU/ml) pelo teor de proteína total (mg de proteína total por ml).
[0080] Atividade proteolítica geral pode ser preferivelmente medida usando caseína fluorescentemente marcada com Bodipy-FL como um substrato (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Derivados de caseína fortemente marcados com Bodipy-FL verde fluorescente insensível ao pH resultam em extinção da fluorescência do conjugado. Hidrólise catalisada por protease libera Bodipy-FL fluorescente. Este método é muito sensível, o que foi essencial para este experimento uma vez que a referência tem a atividade proteolítica geral mais baixa de todos os coagulantes conhecidos até agora. Uma solução de substrato de 0,04 mg/ml é preparada em tampão de fosfato 0,2M pH 6,5, contendo NaCl 100 mM, glicerol 5% e Brij 0,1%. Variantes de quimosina são dissolvidas em tampão de malonato 20 mM, contendo NaCl 100 mM, glicerol 5% e Brij 0,1%. De ambas soluções de referência e variante de quimosina, 20 µL são misturados em uma placa de microtitulação de poliestireno de fundo plano Corning de 384 cavidades preta e fluorescência foi continuamente registrada em um fluorômetro a 32° C por 10 horas. Declínios da parte linear de mudança em fluorescência são usados para determinar atividade proteolítica geral.
[0081] A razão de C/P é calculada dividindo a atividade de coagulação (C) pela atividade proteolítica (P).
[0082] Uma abordagem de aprendizado de máquina estatística e análise baseada em PCA podem ser preferivelmente usadas para determinar os efeitos de mutações únicas presentes nas variantes de multissubstituição, isto é, atividade de coagulação do leite específica, bem como sobre a razão de coagulação e atividade proteolítica geral (C/P).
[0083] Como mostrado acima e ilustrado nos exemplos abaixo, os inventores da presente invenção fizeram várias variantes de polipeptídeo quimosina preferidas com atividade de coagulação e/ou razão de C/P aperfeiçoada quando comparado com o polipeptídeo de origem correspondente sob condições comparáveis.
[0084] Em um aspecto preferido, a presente invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo quimosina isolada caracterizada por:
[0085] (a) a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) que é pelo menos 110% da atividade de coagulação específica de seu polipeptídeo de origem e/ou
[0086] (b) a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma razão de C/P que é pelo menos 200% da razão de C/P de seu polipeptídeo parental.
[0087] O polipeptídeo de origem pode ter pelo menos 80%, tal como pelo menos, por exemplo, 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%, de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
[0088] A variante de polipeptídeo quimosina isolada preferida pode ter uma atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) de pelo menos 110% da atividade de coagulação específica de polipeptídeo de origem e compreende uma substituição em uma ou mais (várias) das posições que seguem especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: R242, L222, D59, S273, K19, V309, S132, N249, I96, L166, H76, G251, Q280, Q56, M157, K231, M256, N291, mais especificamente a substituição pode ser R242E, L222I, D59N, S273Y, K19T, V309I, S132A, N249D, I96L, N249E, L166V, H76Q, N249D, G251D, Q280E, Q56H, M157L, K231N, M256L, N291Q.
[0089] Opcionalmente, a variante de polipeptídeo quimosina isolada pode compreender ainda substituições que alteram o padrão de glicosilação, tal como, por exemplo, substituições em uma ou mais de posições N100, N252 e/ou N291, mais especificamente N100Q, N252Q e/ou N291Q.
[0090] A variante preferida pode compreender uma ou mais das combinações de substituições que seguem e onde cada substituição é especificada em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2:
[0091] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
[0092] Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;
[0093] Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;
[0094] Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
[0095] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0096] K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
[0097] K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0098] K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
[0099] Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0100] D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0101] D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
[0102] H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0103] D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;
[0104] Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
[0105] K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0106] K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
[0107] H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
[0108] D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
[0109] Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
[0110] H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
[0111] D59N, H76Q, S164G, L166V, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
[0112] D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
[0113] K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
[0114] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
[0115] K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
[0116] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273;
[0117] K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
[0118] K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
[0119] I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
[0120] N249D, N100Q, N291Q;
[0121] R242E, N100Q, N291Q;
[0122] R242E, G251D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0123] R242E, N252D, N100Q, N291Q;
[0124] R242E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0125] R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0126] R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0127] R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0128] N252D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0129] G251D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0130] Y243E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0131] Q56H, N252Q, N291Q;
[0132] R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
[0133] R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
[0134] R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
[0135] R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N;
[0136] R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q ou
[0137] R67Q, L130I, M157L, R242E, M256L, N292H.
[0138] Em uma modalidade relacionada, a variante de polipeptídeo quimosina isolada preferida da presente invenção tem uma razão de C/P de pelo menos 200% da razão de C/P de seu polipeptídeo de origem e compreende uma substituição em uma ou mais das posições que seguem especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L222, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291, mais especificamente R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q.
[0139] A variante de polipeptídeo quimosina isolada preferida de acordo com a presente invenção pode compreender também uma ou mais das combinações de substituições que seguem e onde cada substituição é especificada em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2:
[0140] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
[0141] L253I; Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D,
[0142]
[0143] G251D; Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E; Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E,
[0144] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0145]
[0146]
[0147] Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y; H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y; K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0148] S273Y; Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D,
[0149] S273Y; D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D,
[0150]
[0151]
[0152] H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I; D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, R242E, G251D; H76Q, S164G, L166V, L222I, S226T, S273Y;
[0153] S273Y; D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, N249D, G251D,
[0154]
[0155] K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y; D59N, H76Q, S164G, L222I, R242E, S273Y, V309I;
[0156]
[0157] S273Y; H76Q, I96L, S164G, G251D, S273Y, V309I; D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, R242E, G251D,
[0158] S273Y; D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L222I, S226T, G251D,
[0159]
[0160] D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y; D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
[0161]
[0162] K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D; D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;
[0163] D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0164] K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
[0165] K19T, D59N, S164G, L166V, L222I, S226T, G251D, S273Y;
[0166] Y21S, D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;
[0167] K19T, Y21S, D59N, H76Q, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;
[0168] D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
[0169] H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
[0170] D59N, H76Q, L130I, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y, V309I;
[0171] K19T, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;
[0172] D59N, H76Q, L130I, S164G, G251D, V309I;
[0173] K19T, Y21S, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S273Y;
[0174] K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
[0175] Y21S, D59N, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y, V309I;
[0176] D59N, H76Q, S226T, R242E, G251D, S273Y;
[0177] Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
[0178] K19T, Y21S, H76Q, S164G, L222I, G251D, S273Y;
[0179] K19T, D59N, H76Q, I96L, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
[0180] Y21S, D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;
[0181] Y21S, D59N, H76Q, S164G, L166V, N249D, G251D, S273Y;
[0182] Y11I, K19T, I96L, S164G, L222V, R242E, G251D;
[0183] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0184] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;
[0185] Y11V, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, L253I, I263L;
[0186] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
[0187] Y11V, K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D;
[0188] K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
[0189] I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, I263L;
[0190] K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
[0191] I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
[0192] K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, I263V;
[0193] K19T, I96L, S164G, R242E, L253I;
[0194] Y11V, K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;
[0195] D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;
[0196] I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;
[0197] K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
[0198] K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242D, G251D, I263V;
[0199] I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, I263L;
[0200] K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D, L253I;
[0201] D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
[0202] K19T, D59N, I96V, S164G, L166V, L222I, R242E, I263L;
[0203] Y11I, K19T, D59N, S164G, L222I, G251D, I263V;
[0204] K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L;
[0205] Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I, I263L;
[0206] K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;
[0207] K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;
[0208] K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V;
[0209] Y11V, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D, L253V;
[0210] Y11I, K19T, D59N, I96V, L222I, R242D, G251D;
[0211] K19T, E83T, I96L, S164G, L222I, R242E, L253V;
[0212] K19S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;
[0213] K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
[0214] K19T, I96L, S164N, L222I, R242E, I263L;
[0215] K19T, D59N, E83T, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D;
[0216] K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I;
[0217] Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;
[0218] K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
[0219] K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, N249D, I263L;
[0220] K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, G251D, L253V;
[0221] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164N, L166I, L222I, G251D;
[0222] R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0223] R242E, N252D, N100Q, N291Q;
[0224] R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0225] R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0226] V32L, R67Q, L130I, M157L, K231N, M256L;
[0227] R67Q, L130I, M157L, D158S, R242E, N291Q;
[0228] R67Q, V136I, M157L, L222I, V248I;
[0229] Y11V, R67Q, L130I, M157L, L222I, R242E;
[0230] R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
[0231] R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q;
[0232] R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
[0233] R67Q, L130I, L222I, R242E, M256L;
[0234] R67Q, G70D, M157L, R242E, V248I;
[0235] R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
[0236] R67Q, I96L, N100Q, L130I, M157L, N292H;
[0237] I45V, L130I, M157L, K231N, R242E ou
[0238] R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N.
[0239] Métodos preferidos para produção de variantes de polipeptídeo quimosina isoladas
[0240] A presente invenção refere-se ainda a métodos para produção de um polipeptídeo isolado de acordo com a presente descrição.
[0241] Os ditos métodos preferidos podem compreender as etapas que seguem:
[0242] (a): realização de uma alteração em uma ou mais posições na sequência de DNA codificando o polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2, onde a alteração compreende uma substituição, uma deleção ou uma inserção em pelo menos uma posição de aminoácido;
[0243] (b): produção e isolamento do polipeptídeo variante da etapa (a).
[0244] O polipeptídeo de origem pode ter pelo menos 85%, 95%, 97%, 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
[0245] Em uma modalidade preferida adicional, a presente invenção refere-se a um método para produção de um polipeptídeo quimosina isolado onde a variante compreende uma ou mais das substituições que seguem, especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2:D59, V309, S132, N249, L166, N249, Q56, M157, M256, R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, S273, Q280, F282, L295, N252, R254, Q294, G70, V136, L222, K231, N291 tal como, por exemplo, D59N, V309I, S132A, N249E, L166V, N249D, Q56H, M157L, M256L, R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, Q294E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q.
[0246] Em ainda uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se a um método para produção de uma variante de polipeptídeo quimosina isolada onde:
[0247] a variante compreende uma ou mais das combinações das substituições que seguem e onde cada substituição é especificada em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2:
[0248] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
[0249] Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;
[0250] Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;
[0251] Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
[0252] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0253] K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
[0254] K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0255] K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
[0256] Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0257] D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0258] D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
[0259] H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0260] D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;
[0261] K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
[0262] Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
[0263] K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
[0264] D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
[0265] H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
[0266] Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
[0267] H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
[0268] D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
[0269] Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
[0270] K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
[0271] K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
[0272] H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
[0273] K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
[0274] K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
[0275] I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
[0276] R242E, N252D, N100Q, N291Q;
[0277] R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0278] R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
[0279] R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
[0280] R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
[0281] R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
[0282] R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
[0283] R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N ou
[0284] R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q.
[0285] Um aspecto relacionado adicional da presente invenção refere-se a um método para produção de um alimento ou produto alimentício compreendendo adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo quimosina isolada como aqui descrito ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e realização de etapas de fabricação adicionais para obter o alimento ou produto alimentício, em particular onde o alimento ou produto alimentício é um produto à base de leite ou um alimento ou produto alimentício compreendendo um polipeptídeo quimosina da presente invenção.
[0286] Um aspecto relacionado adicional da presente invenção refere-se a uma variante de polipeptídeo quimosina de acordo com a presente invenção em um processo para produção de um produto à base de leite tal como, por exemplo, queijo, tal como, por exemplo, massa filada, cheddar, queijos do tipo continental, queijo macio ou queijo branco em salmoura. Como discutido acima - uma variante de polipeptídeo quimosina isolada como aqui descrito pode ser usada de acordo com a técnica - por exemplo, para produzir um produto à base de leite de interesse (tal como, por exemplo, um produto de queijo).
[0287] Como discutido acima - um aspecto da invenção refere-se a um método para produção de um alimento ou produto alimentício compreendendo adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo quimosina isolada como aqui descrito ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e realização de etapas de fabricação adicionais para obter o alimento ou produto alimentício.
[0288] Preferivelmente, o alimento ou produto alimentício é um produto à base de leite e onde o método compreende adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo quimosina isolada como aqui descrito a leite e realização de etapas de fabricação adicionais para obter o produto à base de leite.
[0289] O leite pode, por exemplo, ser leite de soja, leite de ovelha, leite de cabra, leite de búfala, leite de iaque, leite de Ihama, leite de camelo ou leite de vaca.
[0290] O produto à base de leite pode, por exemplo, ser um produto de leite fermentado tal como um quark ou queijo.
[0291] Como conhecido na técnica, o crescimento, purificação, teste e manuseamento geral podem influenciar o desempenho de enzimas e desta maneira também a enzima da presente invenção. Desta maneira a presente invenção refere-se a variantes de polipeptídeo quimosina, métodos de produção das mesmas e produtos contendo as mesmas, onde a variante de polipeptídeo quimosina tem uma atividade de coagulação e/ou razão de C/P melhorada quando comparado com o polipeptídeo de origem correspondente sob condições comparáveis e preferivelmente após ser produzida e de outra maneira manuseada sob condições comparáveis.
[0292] Sequências de proteína quimosina foram alinhadas usando o algoritmo ClustalW conforme fornecido pelo EBI (EBI, ferramentas, alinhamento de sequências múltiplas, CLUSTAL”, http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) e como descrito em Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948.
[0293] Ajustes ClustalW2 para alinhamentos de sequências múltiplas foram Matriz de peso da proteína = BLOSUM, ABERTURA DE LACUNA = 10, EXTENSÃO DE LACUNA = 0,5, DISTÂNCIAS DE LACUNA = 8, Sem Lacunas nas Extremidades, ITERAÇÂO = nenhuma, NUMITER = 1, AGRUPAMENTO = NJ.
[0294] Como uma sequência de referência a pré-proquimosina de quimosina B bovina foi usada (número de acesso Genbank P00794 - revelada aqui como SEQ ID NO: 1), onde a Metionina N-terminal tem número 1 (MRCL...) e a Isoleucina C-terminal (na sequência de proteína ...LAKAI) tem número 381. Variantes foram alinhadas contra a pré- proquimosina bovina B e os resíduos foram numerados de acordo com o resíduo de quimosina bovina correspondente.
[0295] Variantes de quimosina foram projetadas usando estratégias diferentes.
[0296] Quando referência é feita à quimosina de camelo, é referida uma quimosina de camelo compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 aqui. Quimosina de camelo de SEQ ID NO: 2 pode ser vista como um polipeptídeo de origem relevante aqui tendo atividade de quimosina usado para produzir variantes de quimosina de camelo do mesmo.
[0297] Quando referência é feita à quimosina bovina, é referida uma quimosina bovina compreendendo o polipeptídeo de SEQ ID NO: 1 aqui. Quimosina bovina de SEQ ID NO: 1 pode ser vista como um polipeptídeo de origem relevante tendo atividade de quimosina usado para produzir variantes de quimosina bovina do mesmo.
[0298] As variantes 180 a 269 e 367 a 461 de quimosina de camelo foram projetadas com base em um alinhamento de um conjunto grande de sequências de protease aspártica conhecidas públicas tendo uma identidade de 25% ou mais comparado com quimosina B bovina. Variações foram geralmente introduzidas em regiões com um nível alto de variação de aminoácido entre espécies, enquanto regiões conservadas não foram mudadas. Substituições de aminoácido foram escolhidas com base em informação filogenética, estrutural e experimental para identificar mudanças com alta probabilidade de mostrar efeitos benéficos sobre atividade de coagulação específica e a razão de C/P. Variações múltiplas foram introduzidas em cada construto de variante, assegurando que cada mutação única estivesse presente em construtos de variante múltiplos para minimizar o efeito de covariação entre várias substituições. Aprendizagem de máquina e análise estatística de dados experimentais foram usadas para determinar as contribuições relativas das substituições de aminoácido para desempenho de coagulante medido nas variantes de quimosina (referências 14, 15).
[0299] As variantes 271 a 366 foram projetadas com base em análise estrutural detalhada de quimosina bovina (código PDB: 4AA8) e quimosina de camelo (código PDB: 4AA9). Variações foram escolhidas com base na natureza química das respectivas cadeias laterais de aminoácido e seu impacto esperado sobre ou ligação de substrato de caseína ou propriedades de enzima gerais. A maioria das substituições de aminoácido nas variantes 271 a 346 foi feita em posições de sequência ou dentro da ou em proximidade estrutural grande com a fenda de ligação de substrato ou em elementos estruturais secundários que contatam o substrato de caseína ligado. Ainda, mudanças foram feitas em posições na superfície da proteína que alteram o perfil de carga dessas regiões (referência 5) e são então esperadas ter um impacto no desempenho da enzima. As variantes 347 a 366 foram feitas com base na conformação estrutural diferente da sequência N-terminal em quimosina bovina e de camelo. Substituições de aminoácido foram feitas em posições dentro da fenda de ligação de substrato que interagem com o terminal N em quimosina de camelo.
[0300] Todas as variantes de quimosina foram sintetizadas como genes sintéticos e clonadas em um vetor de expressão fúngica tal como, por exemplo, pGAMpR-C (descrito no WO02/36752A2).
[0301] Os vetores foram transformados em E. coli e DNA de plasmídeo foi purificado usando protocolos de biologia molecular padrão, conhecidos do versado na técnica. Os plasmídeos variantes foram individualmente transformados em uma linhagem de Aspergillus niger ou Aspergillus nidulan e proteína foi produzida essencialmente como descrito no WO02/36752A2 e purificada usando técnicas de cromatografia padrão. Para avaliação de biblioteca de enzima, todas as variantes de quimosina foram produzidas em fermentações de 20-60 mL. Para caracterização mais detalhada de variantes 433, 436, 453 e 457, as respectivas enzimas foram fermentadas novamente em escala de 70 L.
[0302] Como conhecido na técnica - o versado pode, com base em seu conhecimento geral comum, produzir e purificar quimosina e variantes de quimosina - tais como variantes de quimosina bovina e de camelo descritas aqui.
[0303] Atividade de coagulação do leite foi determinada usando o método REMCAT, que é o método-padrão desenvolvido pela International Dairy Federation (método IDF). Atividade de coagulação do leite é determinada a partir do tempo necessário para uma floculação visível de um substrato de leite padrão preparado a partir de um leite em pó com baixo teor de gordura, baixo aquecimento, com uma solução de cloreto de cálcio de 0,5 g por litro (pH ~ 6,5). O tempo de coagulação de uma amostra de coalho é comparado com aquele de um padrão de referência tendo atividade de coagulação do leite conhecida e tendo a mesma composição de enzima pelo IDF Standard 110B que a amostra. Amostras e padrões de referência foram medidos sob condições químicas e físicas idênticas. Amostras de variante foram ajustadas para aproximadamente 3 IMCU/ml usando um tampão de ácido acético 84 Mm pH 5,5. Em seguida, 20 µl de preparação de enzima foram adicionados a 1 ml de leite preaquecido (32° C) em um tubo de teste de vidro posto em um banho de água, capaz de manter uma temperatura constante de 32° C ± 1° C sob agitação constante. A atividade de coagulação do leite total (força) de um coalho foi calculada em Unidades Internacionais de Coagulação do Leite (IMCU) por ml em relação a um padrão tendo a mesma composição de enzima que a amostra de acordo com a fórmula:
[0304] PadrãoS: a atividade de coagulação do leite do padrão de referência internacional para coágulo
[0305] PadrãoT: tempo de coagulação em segundos obtido para a diluição padrão
[0306] AmostraD: fator de diluição para a amostra
[0307] PadrãoD: fator de diluição para o padrão
[0308] AmostraT: tempo de coagulação em segundos obtido para a amostra de coágulo diluída desde adição de enzima até o momento da floculação
[0309] Para determinação da atividade de coagulação das variantes das bibliotecas 1 e 3 bem como variantes através de projeto estrutural, o método µlMCU foi usado ao invés do método REMCAT. Comparado com REMCAT, tempo de floculação de variantes de quimosina no ensaio µIMCU foi determinado através de medições de OD em placas de microtitulação de 96 cavidades a 800 nm em uma leitora de placa de UV/VIS. Uma curva padrão de várias diluições de um padrão de referência com força de coagulação conhecida foi registrada em cada placa. As amostras foram preparadas diluindo enzima em tampão de acetato 84 mM, Triton X-100 0,1%, pH 5,5. Reação a 32° C foi iniciada com a adição de 250 uL de um substrato de leite padrão contendo 4% (p/p) de leite em pó com baixo teor de gordura, baixo aquecimento (p/p) e 7,5% (p/p) de cloreto de cálcio (pH ~ 6,5) à amostra de enzima 25 uL. Atividade de coagulação do leite de variantes de quimosina em Unidades Internacionais de Coagulação do Leite (IMCU) por ml foi determinada com base em tempo de floculação de amostra com relação à curva-padrão.
[0310] O teor de proteína total foi determinado usando o Pierce BCA Protein Assay Kit da Thermo Scientific seguindo as instruções dos fornecedores.
[0311] Atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) foi determinada dividindo a atividade de coagulação (IMCU/ml) pelo teor de proteína total (mg de proteína total por ml).
[0312] Atividade proteolítica geral foi medida usando caseína fluorescentemente marcada com Bodipy-FL como um substrato (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). Derivados de caseína fortemente marcados com Bodipy-FL verde fluorescente insensível a pH resultaram em extinção da fluorescência do conjugado. Hidrólise catalisada por protease libera Bodipy-FL fluorescente. Este método é muito sensível, o que foi essencial para este experimento uma vez que CHYMAX M tem a atividade proteolítica geral mais baixa de todos os coagulantes conhecidos até agora.
[0313] Uma solução de substrato de 0,04 mg/ml foi preparada em tampão de fosfato 0,2 M pH 6,5, contendo NaCl 100 mM, glicerol 5% e Brij 0,1%. Variantes de quimosina foram dissolvidas em tampão de malonato 20 mM, contendo NaCl 100 mM, glicerol 5% e Brij 0,1%. De ambas as soluções de substrato e variante de quimosina, 20 µL foram misturados em uma placa de microtitulação de poliestireno de fundo plano Corning de 384 cavidades e fluorescência foi continuamente registrada em um fluorômetro a 32° C por 10 horas. Declínios da parte linear de mudança de fluorescência foram usados para determinar a atividade proteolítica geral.
[0314] Uma abordagem de aprendizagem de máquina estatística e análise baseada em PCA foram usadas para determinar os efeitos de todas as mutações únicas presentes nas variantes de bibliotecas de multissubstituição 1 a 3 sobre a clivagem de K-caseína entre as posições Phe105 e Met106, isto é, atividade de coagulação do leite, bem como sobre a razão de coagulação e atividade proteolítica geral (C/P).
[0315] Variantes de quimosina de camelo, cada uma tendo substituições múltiplas comparado com tipo selvagem, foram geradas e analisadas como descrito acima. Todas as variantes têm uma sequência de aminoácido idêntica à quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2), exceto pelas variações mencionadas na tabela. Quimosina de camelo (CHY- MAX M) é incluída como referência.
[0316] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 1. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 180-222. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M)
[0317] Na Tabela 1 são mostradas variantes de quimosina de camelo com dados de atividade de coagulação específica (C), atividade proteolítica não específica (P) bem como a razão de C/P. Das 43 variantes 17 revelaram entre 10% e 50% de atividade de coagulação específica aumentada comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). Todas as variantes têm razões de C/P significantemente aumentadas, com a melhor, 190, mostrando uma melhora de 15x comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem.
[0318] Uma análise estatística dos efeitos posicionais e mutacionais sobre atividade de coagulação específica (C) e a razão de C/P foi realizada com base nos dados proteolíticos da biblioteca 1. As mutações mais benéficas para coagulação específica e C/P aumentadas são mostradas nas Tabelas 2 e 3, respectivamente. Tabela 2. Contribuições mutacionais (média) para atividade de coagulação específica aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0319] Com base nos resultados mostrados na Tabela 2 é concluído que as mutações K19T, D59N, I96L, S132A, L222I, R242E, N249D, S273Y e V309I aumentam a atividade de coagulação específica de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações permitam uma dosagem menor de quimosina em fabricação de queijo. Tabela 3. Contribuições mutacionais (média) para razão de C/P aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0320] Com base nos resultados mostrados na Tabela 3 é concluído que as mutações H76Q, I96L, S164G, R242E, G251D e S273Y aumentam a razão de C/P de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações resultem em rendimentos aumentados durante fabricação de queijo usando as respectivas variantes de quimosina.
[0321] Um outro conjunto de variantes de quimosina de camelo, cada uma tendo substituições múltiplas comparado com tipo selvagem, foi gerado e analisado como acima descrito. Todas as variantes têm uma sequência de aminoácido idêntica à quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2), exceto pelas variações mencionadas na tabela. Quimosina de camelo (CHY-MAX M) é incluída como referência.
[0322] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método REMCAT. Tabela 4. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 223-269. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M)
[0323] Na Tabela 4 são mostradas variantes de quimosina de camelo com dados sobre atividade de coagulação específica (C), atividade proteolítica não específica (P) bem como a razão de C/P. Das 47 variantes, 8 revelaram entre 10% e 78% de atividade de coagulação específica aumentada comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). Enquanto 43 variantes têm razões de C/P significantemente aumentadas, a melhor, 253, mostra uma melhora de 33x comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem.
[0324] Uma análise estatística dos efeitos posicionais e mutacionais sobre atividade de coagulação específica (C) e a razão de C/P foi realizada com base nos dados proteolíticos da biblioteca 2. As mutações mais benéficas para coagulação específica e C/P aumentadas são mostradas nas Tabelas 5 e 6, respectivamente. Tabela 5. Contribuições mutacionais (média) para atividade de coagulação específica aumentada e desvios padrão (sd) com base em análise estatística
[0325] Com base nos resultados mostrados na Tabela 5 é concluído que mutações D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, N249D, N249E e S273Y aumentam a atividade de coagulação específica de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações permitam uma dosagem menor de quimosina em fabricação de queijo. Tabela 6. Contribuições mutacionais (média) para razão de C/P aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0326] Com base nos resultados mostrados na Tabela 6 é concluído que mutações Y11I, Y11V, K19T, H76Q, I96L, S164G, L166I, L222V, R242D, R242E, G251D e S273Y aumentam a razão de C/P de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações resultem em rendimentos aumentados durante fabricação de queijo usando as respectivas variantes de quimosina.
[0327] Variantes de quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2) foram feitas com mudanças de aminoácido em posições determinadas através de análise estrutural de proteína (Tab. 7). As mutações N100Q e N291Q foram introduzidas em ambos os sítios de N-glicosilação dessas variantes e na quimosina de camelo de referência (CamUGly) para fornecer amostras de proteína homogêneas, não glicosiladas.
[0328] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 7. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 271-308. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo não glicosilada (CamUGly)
[0329] Com base nos resultados mostrados na Tabela 7 é concluído que as mutações Y21S, S74D, R242E, Y243E, N249D, G251D, S273D, Q280E, F282E e L295K aumentam a razão de C/P de quimosina. As mutações R242E e N249D também resultam em atividade de coagulação específica aumentada. Sete de dez variantes com razões de C/P aumentadas mostradas na Tabela 7 carregam mutações (R242E, N249D, G251D, Y243E, S273D, Q280E, F282E) em uma região distinta na superfície da proteína que está localizada próximo da fenda de ligação como visto na Figura 2. Esta região foi sugerida apoiar ligação do substrato de K-caseína através de interação com sua sequência positivamente carregada Arg96 até His102 (referências 5, 16-18) nas posições P10 a P4 (referência 10). As cargas negativas introduzidas com as mutações podem reforçar essas interações, resultando em especificidade aumentada para K-caseína (C/P). Os resultados mostram que substituições de aminoácido únicas nesta região podem aumentar C/P significantemente.
[0330] Mais variantes de quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2) foram feitas com combinações de mutações que introduzem cargas negativas na região de superfície descrita acima (R242E, Y243E, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E). As mutações N100Q e N291Q foram introduzidas em ambos os sítios de N-glicosilação dessas variantes e na quimosina de camelo de referência (CamUGly) para fornecer amostras de proteína homogêneas, não glicosiladas (Tab. 8).
[0331] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 8. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 309-323. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo não glicosilada (CamUGly)
[0332] Todas as variantes mostradas na Tabela 8 revelaram razões de C/P aumentadas comparado com quimosina de camelo não glicosilada. Várias dessas variantes (309, 310, 321, 322, 323) tinham C/P ainda maior do que a melhor variante com mutação de carga negativa única (286). É concluído que o efeito de aumento de C/P, causado por introdução de cargas negativas em região de interação de P10-P4 na estrutura da quimosina, pode ser aumentado mais através de combinações das respectivas mutações.
[0333] Variantes de quimosina bovina (SEQ ID NO: 1) foram feitas com mudanças em aminoácido em posições determinadas através de análise estrutural de proteína (Tabela 9). As mutações N252Q e N291Q foram introduzidas em ambos os sítios de N-glicosilação dessas variantes e na quimosina bovina de referência (BovUGly) para fornecer amostras de proteína homogêneas, não glicosiladas.
[0334] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 9. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina bovina 325-346. Os números são dados em clivagem % de quimosina bovina não glicosilada (BovUGly)
[0335] Os dados na Tabela 9 demonstram que as variações Q56H, Y134G e K295L levaram à atividade de coagulação específica aumentada e as variações H292N e Q294E resultaram em razões de C/P aumentadas. Ambas as H292 e Q294 estão localizadas em uma alça cobrindo parcialmente a fenda de ligação de substrato (Fig. 3), que explica o impacto observado das respectivas mutações nessas posições na especificidade de substrato de caseína (C/P). Notadamente, enquanto as substituições H292N aumentaram a C/P e D249N bem como K295L diminuíram a C/P de quimosina bovina, efeitos inversos sobre C/P foram observados pelas respectivas mutações reversas N292H, N249D e L295K em quimosina de camelo (Tabela 7). Isso demonstra que essas mudanças de aminoácido exercem efeitos similares sobre especificidade de quimosina nas espécies.
[0336] Variantes de quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2) foram feitas com mudanças de aminoácido em posições determinadas através de análise estrutural de proteína das interações moleculares da sequência N-terminal Y11-D13 dentro da fenda de ligação de substrato (Tab. 10). As mutações N100Q e N291Q foram introduzidas em ambos os sítios de N-glicosilação dessas variantes e na quimosina de camelo de referência (CamUGly) para fornecer amostras de proteína homogêneas, não glicosiladas.
[0337] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 10. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 347-366. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo não glicosilada (CamUGly)
[0338] Análise das variações guiadas por estrutura de quimosina de camelo na sequência N-terminal Y11-D13 bem como na posição D290, uma contraparte de interação potencial de Y11 (Fig. 4). Uma vez que substratos de caseína competem com a sequência de quimosina N- terminal para ligação dentro da fenda de ligação, substituições de aminoácido que mudam interações entre fenda de ligação e o motivo Y11-D13 são esperadas impactar a atividade enzimática em relação a vários substratos de caseína e, então, a razão de C/P. Os resultados das respectivas variantes 347-366 mostram variação forte de ambas atividade de coagulação específica e C/P. Notadamente, as variantes 353 e 355 revelam razões de C/P aumentadas. É então concluído que substituições de aminoácido Y11I e Y11V resultam em razões de C/P aumentadas. Uma vez que a fenda de ligação de quimosina consiste principalmente em aminoácidos hidrofóbicos (referência 9), ambas as mutações aumentariam a ligação do terminal N na fenda de ligação através de interações hidrofóbicas aperfeiçoadas e, desta maneira, inibiriam ligação não específica e hidrólise de caseínas (P).
[0339] Um outro conjunto de variantes de quimosina de camelo, cada uma tendo substituições múltiplas comparado com tipo selvagem, foi gerado e analisado como descrito acima. Todas as variantes têm uma sequência de aminoácido idêntica à quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2), exceto as variações mencionadas na tabela. Quimosina de camelo (CHY-MAX M) está incluída como referência.
[0340] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método µlMCU. Tabela 11. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 367-416. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M)
[0341] Na Tabela 11 são mostradas variantes de quimosina de camelo com dados sobre atividade de coagulação específica (C), atividade proteolítica não específica (P) bem como a razão de C/P. Das 50 variantes 6 revelaram entre 10% e 29% de atividade de coagulação específica aumentada comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). Enquanto 23 variantes têm mais de 10% de razões de C/P aumentadas, a melhor, 411, mostra uma melhora de cerca de 6x comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M).
[0342] Uma análise estatística dos efeitos posicionais e mutacionais sobre atividade de coagulação (C) e a razão de C/P foi realizada com base nos dados proteolíticos da biblioteca 3. As mutações mais benéficas para coagulação e C/P aumentadas são mostradas nas Tabelas 12 e 13, respectivamente. Tabela 12. Contribuições mutacionais (média) para atividade de coagulação aumentada e desvios padrão (sd) com base em análises estatísticas
[0343] Com base nos resultados mostrados na Tabela 12 é concluído que as mutações I96L, S132A, M157L, K231N, R242E, M256L e N291Q aumentam a atividade de coagulação específica de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações permitam uma dosagem menor de quimosina em fabricação de queijo. Tabela 13. Contribuições mutacionais (média) para razão de C/P aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0344] Com base nos resultados mostrados na Tabela 13 é concluído que as mutações Y11V, G70D, I96L, V136I, L222I, K231N, R242E e N291Q aumentam a razão de C/P de quimiocina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações resultem em rendimentos aumentados durante fabricação de queijo usando as respectivas variantes de quimosina.
[0345] Um outro conjunto de variantes de quimosina de camelo, cada uma tendo substituições múltiplas comparado com tipo selvagem, foi gerado e analisado como descrito acima. Todas as variantes têm uma sequência de aminoácido idêntica à quimosina de camelo (SEQ ID NO: 2), exceto as variações mencionadas na tabela. Quimosina de camelo (CHY-MAX M) é incluída como referência.
[0346] Atividades de coagulação foram determinadas usando o método REMCAT. Tabela 14. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo 417-461. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M)
[0347] Na Tabela 14 são mostradas variantes de quimosina de camelo com dados sobre atividade de coagulação específica (C), atividade proteolítica não específica (P) bem como a razão de C/P. Das 45 variantes 11 revelaram entre 14% e 53% de atividade de coagulação específica aumentada comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). Enquanto todas as 45 variantes têm mais de 10% de razões de C/P aumentadas, a melhor, 450, mostra uma melhora de cerca de 17x comparado com a quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M).
[0348] Uma análise estatística dos efeitos posicionais e mutacionais sobre atividade de coagulação (C) e a razão de C/P foi realizada com base nos dados proteolíticos da biblioteca 4. As mutações mais benéficas para coagulação e C/P aumentadas são mostradas nas Tabelas 15 e 16, respectivamente. Tabela 15. Contribuições mutacionais (média) para atividade de coagulação aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0349] Com base nos resultados mostrados na Tabela 15 é concluído que as mutações Y11V, D59N, L166V, L222I, R242E, N249E e G251D aumentam a atividade de coagulação específica de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações permitam uma dosagem menor de quimosina em fabricação de queijo. Tabela 16. Contribuições mutacionais (média) para razão de C/P aumentada e desvios-padrão (sd) com base em análise estatística
[0350] Com base nos resultados mostrados na Tabela 16 é concluído que as mutações Y11I, Y11V, K19T, I96L, S164G, R242E, N249E e L253I aumentam a razão de C/P de quimosina. Pode ser consequentemente esperado que essas mutações resultem em rendimentos aumentados durante fabricação de queijo usando as respectivas variantes de quimosina.
[0351] Variantes selecionadas da biblioteca de multissubstituição 4 foram fermentadas novamente em 70 L seguido por purificação e caracterização com relação ao seu perfil proteolítico (Tabela 17). Tabela 17. Atividades enzimáticas de variantes de quimosina de camelo selecionadas de fermentação de 70L. Os números são dados em clivagem % de quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M)
[0352] Na Tabela 17 são mostradas variantes de quimosina de camelo de fermentação de 70 L com dados sobre atividade de coagulação específica (C), atividade proteolítica não específica (P) bem como a razão de C/P. Todas as 4 variantes revelaram entre 51% e 117% de atividade de coagulação específica aumentada comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). Enquanto todas as 4 variantes têm razões de C/P aumentadas mais de 13 vezes, a melhor, 457, mostra uma melhora de cerca de 30x comparado com quimosina de camelo do tipo selvagem (CHY-MAX M). REFERÊNCIAS 1. A. Kumar, S. Grover, J. Sharma, V. K. Batish, Crit. Rev. Biotechnol. 2010, 30, 243-258. 2. M. W. B0rsting, K. B. Qvist, M.Rasmussen, J. Vindel0v, F. K. Vogensen, Y. Ardo, Dairy Sci. 2012, 92, 593-612. 3. K. Kastberg M0ller, F. P. Rattray, Y. Ardo, J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 11421-11432. 4. P. L. H. McSweeney, Int. J. Dairy Technol. 2004, 57, 127-144. 5. J. Langholm Jensen, A. M0lgaard, J.-C. Navarro Poulsen, M. K. Harboe, J. B. Simonsen, A. M. Lorentzen, K. Hjern0, J. M. van den Brink, K. B. Qvist, S. Larsen, Acta Cryst. 2013, D69, 901-913. 6. S. Chitpinityol, D. Goode, M. J. C. Crabbe, Food Chem. 1998, 62, 133-139. 7. G. L. Gilliland, E. L. Winborne, J. Nachman, A. Wlodawer, Proteins 1990, 8, 82-101. 8. D. S. Palmer, A. U. Christensen, J. S0rensen, L. Celik, K. Bruun Qvist, B. Schi0tt, Biochemistry 2010, 49, 2563-2573. 9. J. S0rensen, D. S. Palmer, B. Schi0tt, J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 7949-7959. 10. I. Schechter, A. Berger, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967, 425, 497-502. 11. L. K. Creamer, N. F. Olsen, J. Food Sci. 1982, 47:631-636 12. N. Bansal, M. A. Drake, P. Piraino, M. L. Broe, M. Harboe, P. F. Fox, P. L. H. McSweeney, Int. Dairy J. 2009, 19:510-517. 13. A. C. Moynihan, S. Govindasamy-Lucey, J. J. Jaeggi, M. E. Johnson, J. A. Lucey, P. L. H. McSweeney, J. Dairy Sci. 2014, 97:85-96. 14. J. Ehren, S. Govindarajan, B. Moron, J. Minshull, C. Khosla, Prot. Eng. Des. Sel. 2008, 21, 699-707. 15. S. Govindarajan, B. Mannervik, J. A. Silverman, K. Wright, D. Regitsky, U. Hegazy, T. J. Purcell, M. Welch, J. Minshull, C. Gustafsson, ACS Synth. Biol. 2015, 4, 221-227. 16. M. Newman, M. Safro, C. Frazao, G. Khan, A. Zdanov, I. J. Tickle, T. L. Blundell, N. Andreeva, J. Mol. Biol. 1991, 221, 1295-1309. 17. E. Gustchina, L. Rumsh, L. Ginodman, P. Majer, N. Andreeva, FEBS Lett. 1996, 379, 60-62. 18. S. Visser, C. J. Slangen, P. J. van Rooijen, Biochem. J. 1987, 244, 553-558.
Claims (16)
1. Variante de polipeptídeo quimosina isolada, caracterizada pelo fato de que (a) a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) que é 110% ou mais da atividade de coagulação específica de seu polipeptídeo de origem e/ou (b) a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma razão de C/P que é 200% ou mais da razão de relação entre atividade de coagulação e atividade proteolítica (C/P) de seu polipeptídeo de origem, a variante de polipeptídeo quimosina isolada compreende uma substituição que segue especificada em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: N249E, em que o polipeptídeo de origem tem a sequência de acordo com o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (quimosina de camelo).
2. Variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma atividade de coagulação específica (IMCU/mg de proteína total) de 110% ou mais da atividade de coagulação específica do peptídeo de origem e compreende uma substituição adicional em uma ou mais posições que seguem especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: S164, R242, L222, D59, S273, K19, V309, S132, I96, L166, H76, G251, Q280, Q56, M157, K231, M256, N291.
3. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as substituições são uma ou mais das substituições especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2:K19T, Q56H, D59N, H76Q, I96L, S132A, M157L, S164G, L166V, L222I, K231N, R242E, G251D, M256L, S273Y, Q280E, N291Q, V309I.
4. Variante de polipeptídeo de quimosina isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a variante é: K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D; K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V; ou K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L.
5. Variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante de polipeptídeo quimosina isolada tem uma razão de C/P de 200% ou mais da razão de C/P de seu polipeptídeo parental e compreende uma substituição em uma ou mais das posições que seguem especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: R242, I96, H76, S164, S273, G251, L222, L166, K19, Y21, S74, Y243, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291.
6. Variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que as substituições são uma ou mais das substituições especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: R242E ou R242D, I96L, H76Q, S164G, S273Y ou S273D, G251D, L222V ou L222I, , L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, , K231N, N291Q.
7. Variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a variante é: K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D; K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V ; ou K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L.
8. Método para produção de uma variante de polipeptídeo quimosina isolada, de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas que seguem: (a): realização de uma alteração em uma ou mais posições na sequência de DNA codificando o polipeptídeo que tem a sequência de acordo com a SEQ ID NO: 2, onde a alteração compreende uma substituição adicional em uma ou mais posições que seguem especificadas em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2; (b): produção e isolamento do polipeptídeo variante da etapa (a), em que a variante compreende uma ou mais das substituições que seguem, onde a substituição é específica em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: N249E.
9. Método para produção de uma variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: (a) a variante compreende uma ou mais das substituições que seguem, onde a substituição é específica em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: S164, D59, V309, S132, L166, Q56, M157, M256, R242, I96, H76, S164, S273, G251, K19, Y21, S74, Y243, S273, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291.
10. Método para produção de uma variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo facto de que a variante compreende uma ou mais das substituições que seguem, onde a substituição é específica em relação à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2: K19T, Y21S, Q56H, D59N, G70D, S74D, H76Q, I96L, S132A, V136I, M157L, S164G, L166V ou L166I, L222V ou L222I, K231N, R242E ou R242D, Y243E, G251D, N252D, R254E, M256L, S273Y ou S273D, Q280E, F282E, N291Q, L295K, V309I.
11. Método para produção de uma variante de polipeptídeo quimosina isolada, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que: (a) a variante é: K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D; K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V ; ou K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L.
12. Método para produção de um alimento ou produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende adição de uma quantidade eficaz da variante de polipeptídeo quimosina isolada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ao alimento ou ingrediente(s) alimentício(s) e realização de etapas de fabricação adicionais para obter o alimento ou produto alimentício.
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o alimento ou produto alimentício é um produto à base de leite.
14. Alimento ou produto alimentício, caracterizado pelo fato de que compreende variante de polipeptídeo quimosina, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
15. Uso de uma variante de polipeptídeo quimosina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser em um processo para produção de queijo.
16. Uso de uma variante de polipeptídeo quimosina, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de ser em um processo para produção de massa filada, cheddar, queijos do tipo continental, queijo macio ou queijo branco em salmoura.
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