KR102419515B1 - 개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체 - Google Patents
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Abstract
개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체.
Description
본 발명은 개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체에 관한 것이다.
키모신 및 펩신과 같은 응유(milk-clotting) 효소에 의한 밀크의 효소적 응집은 치즈 제조시 가장 중요한 과정 중 하나이다. 효소적 밀크 응집은: 단백질분해 효소인 키모신 또는 펩신이 카파-카제인을 공격하여 카제인 미셀 구조의 준안정 상태를 야기하는 제1 페이즈 및 후속적으로 밀크가 응집하여 응고물(coagulum)을 형성하는 제2 페이즈로 되는 2-페이즈 프로세스이다.
포유동물 위장의 응유 효소인 키모신 (EC 3.4.23.4) 및 펩신 (EC 3.4.23.1)은 광범한 펩티다제에 속하는 아스파틱 프로테아제이다.
위점막 세포에서 생산되면, 키모신과 펩신은 각각 효소적으로 불활성적인 프리-프로키모신과 프리-펩시노겐으로서 생성된다. 키모신이 분비되면, N-말단 펩타이드 단편인 프리-단편 (시그널 펩타이드)가 절단되어 나와 프로-단편을 포함하는 프로키모신이 된다. 프로키모신은 이 효소의 실질적으로 불활성적인 형태이지만, 산성 조건 하에서 프로-단편의 자가촉매적 제거에 의해 활성 키모신으로 된다. 이 활성화는 적절한 pH 조건 하에 위 루멘(gastric lumen) 의 생체내 또는 산성 조건 하에서 시험관내에서 일어난다.
소, 즉 Bos taurus의 구조적 및 기능적 특징, 프리-프로키모신, 프로키모신 및 키모신은 집중적으로 연구되어 왔다. 소 프리-프로키모신 분자의 프리-파트는 16개의 aa 잔기를 포함하고 대응하는 프로키모신의 프로-파트는 42개 aa 잔기 길이를 갖는다. 활성적인 소 키모신은 323 aa를 포함하는데 이것은 2가지 형태인 A형과 B형의 혼합물로서 이들 두 가지 형태는 모두 활성적이다.
키모신은 소, 낙타, 염소, 버팔로, 양, 돼지, 인간, 원숭이 및 래트와 같은 포유동물 중에서 자연적으로 생산된다.
소 키모신은 낙농업 분야에서 수년전부터 시판되어 왔다.
WO02/36752A2 (Chr. Hansen)에는 낙타 키모신의 재조합 생산에 대해 설명되어 있다.
하기 참고문헌들은 키모신의 돌연변이들을 설명하는 문헌들로서 고려될 수 있다:
- Suzuki 등: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 및 Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki 등: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink 등: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts 등: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams 등: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop 등: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Supannee 등: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang 등: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
전술한 선행기술문헌들 중 어떤 것도 본 발명에 따라 다음에 설명될 키모신 돌연변이/변이체에 대해 직접적으로는 물론 모호하게나마 설명하고 있지 않다.
발명의 개요
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 개선된 응유 특성을 갖는 키모신의 변이체를 제공하는 것이다.
본 명세서의 실시예란에서 설명되겠지만, 본 발명자들은 개선된 낙타(실시예 6 참조) 및 소(실시예 7 참조)의 키모신 변이체들을 몇 가지 동정하였다.
이들 낙타와 소의 변이체의 비교 분석에 기초하여 - 본 발명자들은 몇몇 아미노산 위치를 추가로 동정해냈는데 이들 위치들중 하나 이상에서 변이체를 만듦으로써 향상된 키모신 변이체를 얻을 수 있다는 점에서 이들 위치는 매우 중요하다 (실시예 8 참조).
서로 다른 포유동물 종(예컨대 소, 낙타, 양, 돼지, 또는 래트)으로부터 수득되는 서로 다른 천연의 야생형 키모신 폴리펩타이드 서열들이 비교적 높은 서열 유사성/동일성을 갖는 다는 것이 기술 분야에 잘 알려져 있다.
이와 같은 비교적 밀접한 서열 관계에 비추어 볼 때 서로 다른 천연의 야생형 키모신들의 3D 구조 역시도 비교적 유사할 것으로 믿어진다.
이와 같은 개념에 근거해서, 자연적으로 수득된 야생형 키모신 (예컨대 소 키모신 또는 낙타 키모신)은 본 발명에서 모 폴리펩타이드(parent polypeptide) - 즉 본 발명의 변이체 키모신 폴리펩타이드를 생산하기 위해 변경이 가해지는 모 폴리펩타이드의 일례일 수 있다.
여기서 논의되는 키모신과 관련된 아미노산 위치들은 관련된 여하한 키모신 효소(예컨대 소, 낙타, 양, 돼지, 래트 등의 키모신)의 어느 하나 이상의 위치에서 변이를 일으킴으로써 일반적으로 개선된 키모신 변이체 (예컨대 개선된 소, 낙타, 양, 돼지 또는 쥐의 키모신 변이체)를 얻을 수 있다는 점에서 일반적으로 중요한 것으로 믿어진다.
본 발명에서 논의되는 바와 같이, 관심대상(of interest) 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서는 공지의 소 키모신 B 프리프로키모신 서열 (Genbank 수탁번호 P00794 - 본 발명에서 SEQ ID NO: 1로 개시됨)이 사용되었다.
SEQ ID NO: 1의 소 키모신 B 프리프로키모신은 본 명세서에서 소(Bovine (Bos bovis)) 키모신 B 또는 간단히 소 키모신(bovine chymosin)이라 칭해질 수 있다. 이의 서열 역시 도 1에 나타내었다.
본 발명에서 관련있는 또 다른 키모신 서열은 공지의 SEQ ID NO: 2의 Camelius dromedarius 키모신 서열이다. 이것은 본 명세서에서 낙타 키모신(camel chymosin)이라고도 칭해진다. 이것의 서열 역시 도 1에 나타내었다.
본 발명에서 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 모 키모신 폴리펩타이드(예컨대 양 또는 래트 유래)이면 본 발명에 설명된 여하한 아미노산 위치에서 변이체를 만듦으로써 개선시키는데 있어서 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 구조적으로 충분히 연관된 것으로 볼 수 있을 것으로 믿어진다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 다음 단계를 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에 변경을 가하는 단계로서 상기 변경은 아미노산 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 또는 353에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계; 및
(b): 상기 단계 (a)의 변경된 폴리펩타이드를 생산 및 분리함으로써, 키모트립신 활성을 갖는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 수득하는 단계를 포함하며:
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)와 정렬시킴으로써 결정되고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드 내의 대응하는 아미노산 서열을 결정하고; 및
(ii): 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 것이다.
기술 분야에 알려진 바와 같이 - 통상의 기술자는 그의 일반 상식에 기초하여 키모신 및 키모신 변이체를 어렵지 않게 생산 및 정제할 수 있을 것이다. 달리 말하면, 통상의 기술자가 일단 관심대상 키모신 활성을 갖는 관련된 모 폴리펩타이드(예컨대 소, 낙타, 양, 돼지 또는 래트로부터)를 갖게 되기만 하면, 그 통상의 기술자가 관심대상 모 키모신과 같은 변이체를 만드는 것은 어렵지 않은 일이다.
본 발명의 제2 측면은 제1 측면의 방법 또는 본 발명의 관련 구체예에 의해 수득된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다.
제2 측면과 관련된 "수득된(obtained)"이라는 용어는 그 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 제1 측면의 방법 또는 본 발명의 관련 구체예에 의해 얻어진 것으로 이해되어야 한다.
따라서, 제2 측면과 관련된 "수득된"이라는 용어는 수득가능한(obtainable)으로 이해되어서는 아니된다.
본 발명의 실시예에서 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소)를 이용하여 변이체를 만들었다 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
따라서, 본 발명의 제3 측면은:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 가지며 상기 변경은 아미노산 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 또는 353에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변경을 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체
에 관한 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이며;
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래하는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것이다.
본 발명의 실시예에서 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 (낙타 키모신)를 이용하여 변이체가 만들어졌으며 - 이러한 변이체는 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
따라서, 본 발명의 제4 측면은
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 가지며 상기 변경은 아미노산 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 또는 353에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변경을 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체
에 관한 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이며;
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래하는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것이다.
본 발명에 설명된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 공지기술에 따라 - 예컨대 관심대상 식품 또는 사료 제품(예컨대 치즈 제품일 수 있는 관심대상 유제품)을 만드는데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제5 측면은 본 발명에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 구체예를 단지 예시 목적으로 이하에 설명한다.
정의
본 발명의 모든 관련 용어의 정의는 관련 기술 맥락에서 통상의 기술자에게 이해되는 바에 따른다.
용어 "키모신"은 EC 3.4.23.4 클래스의 효소에 관한 것이다. 키모신은 높은 특이성을 가지며 카제인의 카파-사슬 내의 하나의 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 결합을 절단함으로써 밀크를 응고시킨다. 기술분야에서 사용되는 이것의 또 다른 이름은 레닌이다.
용어 "키모신 활성"은 본 발명의 문맥 상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 키모신 효소의 키모신 활성에 관한 것이다.
통상의 기술자는 어떻게 관련 있는 키모신 활성을 결정하는지 알고 있을 것이다. 본 발명의 실시예 4에는 특이적인 키모신 활성 - 달리 응고 활성 또는 응유 활성이라고도 함 - 을 결정하는 스탠다드방법이 예시되어 있다.
실시예 5에는 단백질분해 활성을 결정하는 스탠다드방법이 예시되어 있다.
기술분야에 알려진 바와 같이 - 관련된 소위 C/P 비율은 특이적인 응고 활성 (C)를 단백질분해 활성 (P)로 나눈 값이다.
기술분야에 알려진 바와 같이 - C/P 비율이 높을수록 일반적으로 예컨대 치즈 제조시 비특이적인 단백질 분해로 인한 단백질 손실이 줄어들며, 즉, 치즈 수율이 증가하며, 치즈가 숙성되는 동안 쓴맛의 발달도 줄어든다.
용어 "분리된 변이체(isolated variant)"는 인간에 의해 변형된 변이체를 가리킨다. 일 측면에서, 변이체는 SDS PAGE로 측정시 적어도 1% 순수, 예컨대, 적어도 5% 순수, 적어도 10% 순수, 적어도 20% 순수, 적어도 40% 순수, 적어도 60% 순수, 적어도 80% 순수, 및 적어도 90% 순수하다.
용어 "성숙한 폴리펩타이드"는 번역 및 기타 번역후 변형, 예컨대 N 말단 프로세싱, C 말단 트렁케이션, 글리코실화, 포스포릴화 등을 거친 최종 형태의 펩타이드를 의미한다. 본 문맥상
관련된 성숙한 키모신 폴리펩타이드는 활성 키모신 폴리펩타이드 서열 - 프리-파트 및/또는 프로-파트 서열들이 없는 서열인 것으로 볼 수 있다. 관련된 성숙한 폴리펩타이드의 예로는 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신), 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)을 들 수 있다.
용어 "모(parent)" 또는 "키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드"는 본 발명의 효소 변이체를 생산하도록 변경이 가해지는 폴리펩타이드를 의미한다. 모 폴리펩타이드는 자연발생적인(야생형) 폴리펩타이드 또는 그의 변이체일 수 있다.
용어 "서열 동일성(Sequence Identity)"은 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 관련도와 연관된다.
본 발명의 목적 상, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (좋기로는 버전 3.0.0 이상)의 Needle 프로그램에서 실시되는 바와 같은 니들만-분쉬 알고리듬 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) 을 이용하여 결정된다. 이용되는 임의 파라미터들은 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성(longest identity)" (노브리프 옵션을 이용하여 얻음)의 아웃풋을 퍼센트 동일성으로서 사용하며 다음과 같이 계산한다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 중 갭의 총 갯수)
본 발명의 목적상, 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 서열 간의 서열 동일성의 정도는
EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등., 2000, 상기문헌) (좋기로는 버전 3.0.0 이상)의 Needle 프로그램에서 실시되는 바와 같은 니들만-분쉬 알고리듬 (Needleman 및 Wunsch, 1970, 상기문헌) 을 이용하여 결정된다. 이용되는 임의 파라미터들은 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 표지된 "최장 동일성(longest identity)" (노브리프 옵션을 이용하여 얻음)의 아웃풋을 퍼센트 동일성으로서 사용하며 다음과 같이 계산한다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오타이드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 중 갭의 총 갯수)
용어 "변이체(variant)"는 하나 또는 그 이상 (수개)의 위치에서 변경, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 키모신 활성을 갖는 펩타이드를 의미한다. 치환은 어떤 위치를 점하는 아미노산을 다른 아미노산에 의한 대체를 의미하고; 결실은 어떤 위치를 점하는 아미노산의 제거를 의미하며; 삽입은 어떤 위치를 점하는 아미노산에 인접하여 1-3 아미노산을 부가하는 것을 의미한다.
아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있으며 - 예컨대 이론적으로 예컨대 D-알라닌의 D-이성질체(또는 D-형)에 의한 치환이 가능하다.
용어 "야생형" 키모신 펩타이드는 자연에서 포유동물(예컨대 낙타 또는 소)와 같은 자연발생적인 생명체에 의해 발현되는 키모신을 의미한다.
도 1: 관련된 상이한 키모신 서열들의 정렬. 도시된 "Bos_bovis_키모신_B"은 본 발명의 SEQ ID NO: 1의 소 키모신이고 도시된 "낙타us_dromedarius"는 본 발명의 SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신이다. 본 발명에 설명된 바와 같이 레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO: 1의 소 키모신을 사용할 경우 소 키모신은 위치 10에 "V"를 갖고 낙타 키모신은 동일한 위치 10에 "A"를 갖는 것으로 나타났다. 또한 소/래트는 위치 352에 "Q" 를 갖고 낙타/C._bactrianus는 동일한 위치 352에 "E"를 갖는다.
도 1에 도시된 키모신 서열과 관련하여 - 양은 소의 SEQ ID NO: 1과 94.5% 서열 동일성을 갖고; C._bactrianus는 소의 SEQ ID NO: 1과 83.2% 서열 동일성을 가지며; 낙타us_dromedarius (SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신)은 소의 SEQ ID NO: 1과 84% 서열 동일성을 갖고; 돼지는 소의 SEQ ID NO: 1과 80.3% 서열 동일성을 가지며 래트는 소의 SEQ ID NO: 1과 71.9% 서열 동일성을 갖는다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 예컨대 양, C._bactrianus, 낙타, 돼지 또는 래트 키모신의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신 - 즉 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 381)의 관련된 서열 동일성 백분율은 전술한 서열 동일성 백분율과 비교적 유사하다.
도 2: 소 키모신의 3D 구조 - 3D 구조는 공개적으로 입수가능하다. 일례로서 아미노산 위치 296 및 294 소 키모신 내에 존재하는 경우가 도시되어 있다.
도 1에 도시된 키모신 서열과 관련하여 - 양은 소의 SEQ ID NO: 1과 94.5% 서열 동일성을 갖고; C._bactrianus는 소의 SEQ ID NO: 1과 83.2% 서열 동일성을 가지며; 낙타us_dromedarius (SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신)은 소의 SEQ ID NO: 1과 84% 서열 동일성을 갖고; 돼지는 소의 SEQ ID NO: 1과 80.3% 서열 동일성을 가지며 래트는 소의 SEQ ID NO: 1과 71.9% 서열 동일성을 갖는다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 예컨대 양, C._bactrianus, 낙타, 돼지 또는 래트 키모신의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신 - 즉 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 381)의 관련된 서열 동일성 백분율은 전술한 서열 동일성 백분율과 비교적 유사하다.
도 2: 소 키모신의 3D 구조 - 3D 구조는 공개적으로 입수가능하다. 일례로서 아미노산 위치 296 및 294 소 키모신 내에 존재하는 경우가 도시되어 있다.
발명의 상세한 설명
관심대상 키모신의 아미노산 위치 결정
전술한 바와 같이 - 관심대상 관련된 키모신 폴리펩타이드(예컨대 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서, 본 발명에서 SEQ ID NO: 1 으로 개시된 공지의 소 키모신 서열을 이용한다.
본 발명의 목적 상, SEQ ID NO: 1에 개시된 폴리펩타이드 (소 키모신)를 이용하여 다른 키모신 폴리펩타이드 내의 대응하는 아미노산 잔기를 결정한다. 다른 키모신 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 1에 개시된 폴리펩타이드와 정렬시키고, 이 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 1에 개시된 폴리펩타이드 내의 여하한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 위치 번호를 본 발명의 실시예 1에 설명된 바와 같은 ClustalW 알고리듬을 이용하여 결정한다.
또 다른 키모신 폴리펩타이드 내의 대응하는 아미노산 잔기의 동정은 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 등., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (좋기로는 버전 3.0.0 이상)의 Needle 프로그램에서 실시되는 바와 같은 니들만-분쉬 알고리듬 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) 을 이용하여 확인가능하다.
잘 알려진 상기의 컴퓨터 프로그램들에 기초하여 - 관심대상 관련된 키모신 폴리펩타이드(예컨대 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하는 것은 통상의 기술자에게 일상적인 작업이다.
도 1에 정렬의 예가 제시되어 있다.
예시하자면, - 도 1에서 본 발명에 사용된 소의 레퍼런스 SEQ ID NO: 1은 위치 50에 "G"를 가지고 "Camelus_dromedarius" (본 발명에서 SEQ ID NO: 2)는 이 위치 50에 "A"를 갖는 것을 볼 수 있다.
변이체들의 명명법
본 발명의 변이체를 설명함에 있어서, 하기 설명된 명명법은 용이한 참조를 위해 채택된 것이다. 허용되는 IUPAC 단일문자 또는 3문자 약칭이 사용되었다.
하기 "명명법" 섹션에서 논의되는 특정 변이체는 본 발명의 관련된 변이체가 아닐 수 있다 - 즉 "명명법" 섹션은 본 명세서에서 관련하여 사용된 명명법을 그대로 설명하기 위한 것일 뿐이다.
치환(Substitutions) . 아미노산 치환에 있어서, 다음의 명명법이 사용된다: 오리지널 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 226에서 쓰레오닌의 알라닌에 의한 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로서 표시된다. 복수개의 돌연변이는 부가 마크 ("+")에 의해 분리되는데, 예컨대, "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"는, 각각 위치 205와 411에서 글리신 (G)의 아르기닌 (R)에 의한 치환 및 세린 (S)의 페닐알라닌 (F)에 의한 치환을 나타낸다. 예컨대 "226A"라는 표시는 위치 226에서 모 아미노산(예컨대 T, Q, S 또는 다른 모 아미노산)의 알라닌에 의한 치환을 가리킨다.
결실(Deletions) . 아미노산 결실에 있어서, 다음의 명명법이 사용된다: 오리지널 아미노산, 위치, *. 따라서, 위치 195에서의 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로서 표시된다. 복수개의 결실은 예컨대, "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"와 같이 부가 마크 ("+")에 의해 분리된다.
삽입 (Insertions) . 아미노산 삽입에 있어서는 다음의 명명법이 사용된다: 오리지널 아미노산, 위치, 오리지널 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서 위치 195의 글리신 다음에 리신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로서 표시된다. 복수개 아미노산의 삽입은 [오리지널 아미노산, 위치, 오리지널 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등]으로 나타내진다. 예를 들어, 위치 195의 글리신 다음에 리신과 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로서 표시된다.
이러한 경우 삽입된 아미노산 잔기(들)은 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 삽입함으로써 번호를 매긴다. 따라서 상기 예에서, 서열은 다음과 같이 표시될 것이다:
복수개의 변경(Multiple alterations) . 복수개의 변경을 포함하는 변이체들은 부가 마크 ("+")에 의해 분리되는데, 예컨대, "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 위치 170과 195에서 티로신과 글루탐산에 의한 아르기닌과 글리신의 치환을 나타낸다.
상이한 치환들(Different substitutions) . 하나의 위치에 여러가지 상이한 치환이 도입가능한 경우, 그 상이한 치환들은 콤마로 분리되는데, 예컨대 "Arg170Tyr,Glu" 또는 "R170Y,E"는 위치 170에서 아르기닌의 티로신 또는 글루탐산에 의한 치환을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" 또는 "Y167G,A + R170G,A"는 다음의 변이체를 표시하는 것이다:
"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly", 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법
전술한 바와 같이 - 기술분야에 알려진 바와 같이, 통상의 기술자는 그의 일반 기술상식에 의거하여 키모신과 키모신 변이체를 어렵지 않게 생산 및 정제할 수 있다.
이를 달리 설명하면, 일단 통상의 기술자가 관련된 관심대상 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드(예컨대 소, 낙타, 양, 돼지 또는 래트로부터 유래)를 갖기만 하면, 그 통상의 기술자는 관심대상 그러한 모 키모신의 변이체를 쉽게 만들 수 있다.
키모신 (변이체 키모신 또는 모 키모신)을 제조 및 분리하는 적절한 방법의 일례는 예컨대 WO02/36752A2 (Chr. Hansen)에 설명된 바와 같이 진균의 재조합 발현/생산에 기초한 기술을 이용하는 공지 기술이다.
통상의 기술자에게는 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 변경을 가하는 것이 일상적인 일이다.
통상의 기술자에게 알려진 바와 같이 - 이것은 예컨대 소위 위치 지향된(site directed) 돌연변이 및 재조합 발현/생산에 기반한 기술에 의해 수행될 수 있다.
또한 만일 관련된 모 폴리펩타이드 (예컨대 낙타 또는 소의 야생형 키모신) 및/또는 관련된 변이체가 키모신 활성을 갖는지 아닌지를 알아내는 것도 통상의 기술자에게는 일상적인 작업에 속한다.
기술분야에 알려진 바와 같이 - 키모신 활성은 특이적 응고 활성 (C)를 단백질분해 활성 (P)로 나눈 값인 소위 C/P 비율에 의해 결정된다.
기술분야에 알려진 바와 같이 - C/P 비율이 높을수록 일반적으로 예컨대 치즈 제조시 비특이적인 단백질 분해로 인한 단백질 손실이 줄어들며, 즉, 치즈 수율이 증가하며, 치즈가 숙성되는 동안 쓴맛의 발달도 줄어든다.
본문의 실시예 4에는 특이적 응고 활성 (C)을 결정하는 적절한 방법이 설명되어 있고 실시예 5에는 단백질분해 활성 (P)를 결정하는 적절한 방법이 설명되어 있다.
좋기로는, 본문에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 변이체, 즉, 본문의 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 변이체인 것이 바람직하다.
좋기로는, 본문에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가 변이체, 즉, 본문의 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 변이체인 것이 바람직하다.
더욱 좋기로는, 본문에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체가:
- 본문의 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성; 및
- 본문의 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성
을 갖는 변이체인 것이 바람직하다.
상기 논의된 바와 같이 - 관련된 관심대상 키모신 폴리펩타이드(예컨대 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 결정하기 위한 레퍼런스 서열로서 SEQ ID NO: 1에 개시된 바와 같은 공지의 소 키모신 서열을 이용한다.
전술한 바와 같이 - 예컨대 본문에서 논의된 컴퓨터 서열 정렬 프로그램에 기반하여 - 통상의 기술자는 관련된 관심대상 키모신 폴리펩타이드 (예컨대 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 루틴하게 결정할 수 있다.
본 발명의 제1 측면의 방법에서 "모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는다"라는 표현은 본 발명의 변이체를 만드는데 사용되는 모 키모신 폴리펩타이드의 서열 기반 제한으로서 고려될 수 있을 것이다.
이를 달리 설명하면 - 성숙한 소 키모신과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 성숙한 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대 양 또는 돼지)는 본 발명과 관계되도록 하는데 있어서 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 구조적으로 충분히 동일할 것으로 믿어진다 - 즉 이 문맥상 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 성숙한 모 키모신 폴리펩타이드 (예컨대 예컨대 양 또는 래트유래)는 본문에 설명된 바와 같이 아미노산 위치의 어느 곳에서든 변이체를 만듦으로써 향상될 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 구조적으로 충분히 연관된 것으로 볼 수 있을 것으로 믿어진다.
낙타 키모신 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드는 소의 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (즉 프리(pre) 및 프로(pro) 서열을 포함하여, 위치 1로부터 381까지의 완전한 SEQ ID NO: 1)와 84% 서열 동일성을 갖는다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 관련된 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드는 이미 예컨대 대응하는 야생형 키모신의 변이체일 수 있다.
예를 들어, 야생형 낙타 키모신 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드에 비해 5-10개의 변형(예컨대 치환)을 갖는 낙타 키모신 변이체는 여전히, 본 발명의 예컨대 제1 측면에서 요구되는 바와 같이 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소)와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드가 될 것이다.
이를 달리 설명하면 - 관련된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 예컨대 제1 측면의 위치와는 다른 위치에서 변경(예컨대 치환)을 가질 수도 있다.
도 1에 도시된 키모신 서열과 관련하여 - 양은 소의 SEQ ID NO: 1과 94.5% 서열 동일성을 갖고; C._bactrianus는 소의 SEQ ID NO: 1과 83.2% 서열 동일성을 가지며; 낙타us_dromedarius (SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신)은 소의 SEQ ID NO: 1과 84% 서열 동일성을 갖고; 돼지는 소의 SEQ ID NO: 1과 80.3% 서열 동일성을 가지며 래트는 소의 SEQ ID NO: 1과 71.9% 서열 동일성을 갖는다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 예컨대 양, C._bactrianus, 낙타, 돼지 또는 래트 키모신의 성숙한 폴리펩타이드 서열과 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신 - 즉 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 381)의 관련된 서열 동일성 백분율은 전술한 서열 동일성 백분율과 비교적 유사하다.
바람직한 변이체:
전술한 바와 같이 - 예컨대 제1 측면은 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 여기서 그 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이다.
바람직한 일 구체예는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 여기서 그 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이다.
적어도 하나의 변경이 치환인 것이 바람직할 수 있다 - 즉 관련된 바람직한 구체예는 그 변경이 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것이다.
좋기로는, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 그 변경이 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것이 바람직하다.
좋기로는, 그 치환이 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 만일 모 키모신 폴리펩타이드가 위치 156에 이미 예컨대 "V"를 갖는 경우라면 이 특정한 모 키모신 폴리펩타이드에 대해 치환 156V를 만드는 것에 관하여 논하는 것은 아무런 의미가 없다. 도 1에 도시된 바와 같이 - 래트 야생형 키모신은 위치 156에 "V"를 갖는데 - 여기서 치환 156V는 도 1의 특정 래트 키모신 폴리펩타이드 서열과 무관한 것으로 볼 수 있을 것이다
좋기로는, 치환은 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환은 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 만일 모 키모신 폴리펩타이드가 위치 156에서 예컨대 "D"를 갖지 않으면 이 특정한 모 키모신 폴리펩타이드에 대하여 치환 D156V에 대해 논아는 것은 아무런 의미가 없다. 도 1에 도시된 바와 같이 - 래트 야생형 키모신은 위치 156에 "V"를 가지므로 - 치환 D156V은 도 1의 특정 래트 키모신 폴리펩타이드 서열에 있어서 무관한 것으로 볼 수 있을 것이다.
바람직한 일 구체예에서, 치환은 H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것이 좋다.
바람직한 일 구체예에서, 치환은 다음의 치환인 것이 좋다:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F.
키모신 활성을 갖는 바람직한 모 폴리펩타이드:
좋기로는, 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하고, 더욱 좋기로는, 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다 .
오로지 예시 목적으로 - 여기서 적합한 관련 모 폴리펩타이드는 소 키모신 A일 수 있다 - 기술분야에 알려진 바와 같이 소 키모신 A는 SEQ ID NO: 1의 소 키모신 B와는 오직 하나의 아미노산만이 차이가 날 뿐이다.
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소)를 모 폴리펩타이드로서 이용하여 변이체들을 만들었으며 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
따라서, 바람직한 일 구체예에서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이 좋고, 더욱 좋기로는, 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 좋으며, 더더욱 좋기로는 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것이 좋다. 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)인 것이 바람직할 수 있다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 관련된 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드는 예컨대 이미 대응하는 야생형 키모신의 변이체일 수 있다.
예를 들어, 성숙한 야생형 소 키모신 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드에 비해 예컨대 5-10개의 변경(예컨대 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는 여전히, SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드일 수 있다.
SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소)는 323 아미노산 길이이며 - 따라서 성숙한 야생형 소 키모신 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드에 비해 예컨대 25개의 아미노산 치환을 갖는 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드가 되지 않을 것이다.
이를 달리 일반적으로 설명하면 - 관련된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는 예컨대 제1 측면의 위치와는 다른 위치에서 변경(예컨대 치환)을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 (낙타)를 모 폴리펩타이드로서 이용하여 변이체들을 만들었으며 - 이러한 변이체는 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
따라서, 바람직한 일 구체예에서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이 좋고, 더욱 좋기로는, 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 좋으며, 더더욱 좋기로는 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것이 좋다. 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)인 것이 바람직할 수 있다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타)와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드는 여전히 제1 측면의 항목 (ii)의 SEQ ID NO: 1 (소) 기반 서열 동일성 요구사항 내에 있는 것이며 - 즉, 이것은 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드가 될 것이다.
소 키모신의 분리된 변이체:
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소)를 모 폴리펩타이드로서 이용하여 변이체들을 만들었으며 - 이러한 변이체는 본 발명에서 소 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
전술한 바와 같이 - 따라서 제3 측면은:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 가지며 상기 변경은 아미노산 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 또는 353에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변경을 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체
에 관한 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이며;
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래하는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것이다.
전술한 정의와 바람직한 구체예들은 이 측면과도 관련이 있다.
좋기로는, 전술한 바와 같은 분리된 소 키모신 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율에 비해 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 변이체인 것이 바람직하다.
바람직한 일 구체예에서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하고, 더욱 좋기로는 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하며 더더욱 좋기로는 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 분리된 키모신 변이체는 상기 주어진 아미노산 위치와는 다른 위치에서 변경(예컨대 치환)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 야생형 소 키모신 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드에 비해 5-10개 변경(예컨대 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는 여전히, SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드가 될 수 있다.
분리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)에 비해 30개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 소 키모신 변이체는 변경(예컨대 치환) ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)에 비해 20개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 소 키모신 변이체는 변경(예컨대 치환) ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)에 비해 10개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 소 키모신 변이체는 변경(예컨대 치환) ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)에 비해 5개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 전술한 항목(iii)과 관련하여 "분리된 변이체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다"라는 표현은 당연한 일이지만, 설명된 분리된 소 키모신 변이체가, 공지의 SEQ ID NO: 1의 야생형 소 키모신 서열과 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖지 않음을 가리키는 것이다.
바람직한 일 구체예는 분리된 소 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 그 변경이 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이다.
적어도 하나의 변경이 치환인 것이 바람직하며 - 즉 관련된 바람직한 구체예가, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 그 변경이 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것에 관한 것이다.
좋기로는, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서, 그 변경이 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 변경인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것이 바람직하다.
바람직한 일 구체예에서, 치환은:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F
인 것이 바람직하다.
낙타 키모신의 분리된 변이체:
전술한 바와 같이 - 본 발명의 실시예에서 모 폴리펩타이드로서 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드 (낙타 키모신)를 이용하여 변이체가 만들어졌으며 - 이러한 변이체는 본 발명에서 낙타 키모신 변이체라 칭해질 수 있다.
전술한 바와 같이 - 따라서, 본 발명의 제4 측면은:
(a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 가지며 상기 변경은 아미노산 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 또는 353에 대응하는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 변경을 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체
에 관한 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것이며;
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것이다.
전술한 정의와 바람직한 구체예들은 이 측면과도 관련된 것이다.
좋기로는, 전술한 바와 같은 분리된 낙타 키모신 폴리펩타이드 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율에 비해 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 변이체인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서 - 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 적어도 92% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하고, 더욱 좋기로는, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하며, 더더욱 좋기로는, 모 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 분리된 키모신 변이체는 상기 주어진 아미노산 위치와는 다른 위치에서 변경(예컨대 치환)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 야생형 낙타 키모신 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드에 비해 5-10개 변경(예컨대 치환)을 갖는 낙타 키모신 변이체는 여전히, SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 모 폴리펩타이드가 될 수 있다.
분리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)에 비해 30개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)에 비해 20개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 낙타 키모신 변이체는 변경(예컨대 치환) ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)에 비해 10개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하거나 또는 분리된 낙타 키모신 변이체는 변경(예컨대 치환) ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)에 비해 5개 미만의 아미노산 변경(예컨대 치환)을 포함하는 것이 바람직하다.
본 문맥상 통상의 기술자에게 이해되는 바와 같이 - 전술한 항목(iii)과 관련하여 "분리된 변이체 폴리펩타이드가 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는다"라는 표현은 당연한 일이지만, 설명된 분리된 낙타 키모신 변이체가, 공지의 SEQ ID NO: 2의 야생형 낙타 키모신 서열과 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 갖지 않음을 가리키는 것이다.
바람직한 일 구체예는 분리된 낙타 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 그 변경이 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이다.
적어도 하나의 변경이 치환인 것이 바람직하며 - 즉 관련된 바람직한 구체예가, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체에 관한 것으로, 그 변경이 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것에 관한 것이다.
좋기로는, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서, 그 변경이 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 변경인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것이 바람직하다.
좋기로는, 치환이 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것이 바람직하다.
바람직한 일 구체예에서, 치환은:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F
인 것이 바람직하다.
밀크 기반 제품의 제조방법
전술한 바와 같이 - 본 명세서에 설명된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 공지기술에 따라 이용함으로써 - 예컨대 목적하는 밀크 기반 제품(예컨대 치즈 제품)을 만들 수 있다.
전술한 바와 같이 - 본 발명의 일 측면은 본 발명에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것이다.
좋기로는, 식품 또는 사료 제품은 밀크 기반 제품이고 여기서 상기 방법은 본 발명에 설명된 바와 같은 분리된 키모신 폴리펩타이드의 유효량을 밀크에 첨가하는 것과 본 발명자들의 추가 제조 단계를 실시하여 밀크 기반 제품을 얻는 것이다.
밀크는 두유, 양젖, 염소젖, 버팔로젖, 야크젖, 라마젖, 낙타젖 또는 우유일 수 있다.
밀크 기반 제품은 예컨대 발효유제품, 쿠아르크(quark) 또는 치즈일 수 있다.
본 발명의 측면/구체예 - 청구항 형식으로 제시됨
전술한 본 발명의 여러 측면과 바람직한 구체예를 소위 청구항 형식으로 이하에 제시/설명한다.
1. (a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에 변경을 가하는 단계로서, 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계; 및
(b): 단계 (a)의 변경된 폴리펩타이드를 생산 및 분리하고 이에 의해 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 수득하는 단계로서 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인 단계
를 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법으로서;
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)와 정렬시킴으로써 결정되고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드 내의 대응하는 아미노산 서열을 결정하고; 및
(ii): 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 65% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
- SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성; 및
- SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성
을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
3. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
4. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
5. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
6. 제4항에 있어서, 치환은 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
7. 제6항에 있어서, 치환은 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
8. 제4항에 있어서, 치환은 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 치환은 H134Q, Q141E, I143F, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
10. 제4항에 있어서, 치환은:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F
인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
11. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
12. 제11항에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
13. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래한, SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의하여 수득된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
15. (a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 포함하되, 여기서 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서:
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래하는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것인,
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
16. 제15항에 있어서, 상기 분리된 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
17. 제15항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 분리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드 (소 키모신)와 비교할 때 아미노산 변경(예컨대 치환)을 10개 미만으로 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
21. 제20항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
22. 제20항에 있어서, 상기 치환은 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
23. 제22항에 있어서, 상기 치환은 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
24. 제22항에 있어서, 상기 치환은 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
25. 제20항에 있어서, 상기 변경은:
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F
인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
26. (a): 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드의 하나 이상의 위치에서 변경을 포함하되, 여기서 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것이고; 및
(b): 여기서 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서:
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드의 아미노산 위치는 모 폴리펩타이드를 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드 (소 키모신)과 정렬시켜 결정하는 것이고 - 즉 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 이용하여 모 폴리펩타이드의 대응하는 아미노산 서열을 결정하는 것이고; 및
(ii): 상기 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래하는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것이고; 및
(iii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것인,
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
27. 제26항에 있어서, 상기 분리된 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율보다 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
28. 제26항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
29. 제26항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 분리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드 (낙타 키모신)와 비교할 때 아미노산 변경(예컨대 치환)을 10개 미만으로 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
30. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
31. 제26항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 변경은 위치 117, 134, 141, 143, 156, 241, 279, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 325, 350, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
32. 제31항에 있어서, 상기 변경은 위치 134, 141, 143, 280, 281, 298, 300, 307, 309, 311, 352 및 353의 여하한 위치에 대응하는 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
33. 제31항에 있어서, 상기 치환은 117N, 134Q, 141E, 143F, 156V, 241I, 279M, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 325M, 350N, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
34. 제33항에 있어서, 상기 치환은 134Q, 141E, 143F, 280I, 281V, 298E, 300R, 307D, 309D, 309W, 311I, 352L, 352Q, 353L 또는 353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
35. 제33항에 있어서, 상기 치환은 D117N, H134Q, Q141E, I143F, D156V, V241I, V279M, L280I, F281V, Q298E, Q300R, N307D, G309D, G309W, L311I, D325M, H350N, Q352L, E352L, E352Q, K353L 또는 K353Q인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
36. 제31항에 있어서, 상기 치환은::
F281V + V306I + I321L;
H134Q + I154L + D216S;
V261A + V263I + G309W + L311I + Y326F;
D156V + G309D + M314L + V317I;
H134Q + L280I + G309W;
R119Q + D156V + V375L;
Y79S + R119S + H204R;
Y79S + H134Q + Y365F + V375L;
Y194I + R213Q + G309D;
Y79S + D117N + I321L;
Y185F + D325M + E352Q;
Y79S + L224V + L311I;
S132F + H134Q + M200I + M215L + G221E;
F281V + G309W + S331Y + D337E;
D156V + G309D + M314L + V317I;
G128D + L188I + Y326F;
R119S + V241I + L280I + L311I +D325M;
R119Q + S284T + T297S + V306I + G309W
K279V + V281F;
Q298E + Q300R;
H350N + Q352E + K353L;
D307N + D309G; 또는
Q141E + I143F
인 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드.
37: 제14항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료 제품의 제조방법.
38: 제37항에 있어서, 상기 제품은 밀크 기반 제품이고 상기 방법은 제14항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 밀크에 첨가한 다음 밀크 기반 제품 식품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료 제품의 제조방법.
39: 제38항에 있어서, 밀크는 두유, 양젖, 염소젖, 버팔로젖, 야크젖, 라마젖, 낙타젖 또는 우유인 것인 밀크 기반 제품의 제조방법.
40: 제38항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 밀크 기반 제품은 발효유제품, 쿠아르크 또는 치즈인 것인 밀크 기반 제품의 제조방법.
실시예
실시예 1: 키모신 단백질 서열 및 변이체 서열들의 정렬 및 넘버링
EBI에 의해 제공된 ClustalW 알고리듬(EBI, tools, 다중 서열 정렬, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)을 이용하고 문헌 [Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948]에 설명된 바와 같이 키모신 단백질 서열을 정렬하였다.
다중 서열 정렬을 위한 ClustalW2 세팅은 단백질 중량 매트릭스 = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION= 0,05, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ이었다.
레퍼런스 서열로서 N-말단 메티오닌의 번호가 1(MRCL....)이고 C-말단 이소류신 (단백질 서열 ...LAKAI에서)의 번호가 381인, 소 키모신 B 프리프로키모신을 이용하였다(Genbank 수탁번호 P00794 - 본 발명에 SEQ ID NO: 1로 개시됨). 변이체들을 소의 B 프리-프로-키모신에 대해 정렬시키고 잔기들을 대응하는 소 키모신 잔기에 대응하게 넘버링하였다.
실시예 2: 키모신 변이체들의 디자인
여러가지 상이한 전략을 이용하여 키모신 변이체를 설계하였다.
낙타 키모신이라 하면 SEQ ID NO: 2의 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신을 가리킨다.
SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신은 그의 낙타 키모신 변이체를 만드는데 사용되는 키모신 활성을 갖는, 관련된 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드로서 고려될 수 있다.
소 키모신이라 하면 SEQ ID NO: 1의 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신을 가리킨다.
SEQ ID NO: 1의 소 키모신은 그의 소 키모신 변이체를 만드는데 사용되는 키모신 활성을 갖는, 관련된 키모신 활성을 갖는 모 폴리펩타이드로서 고려될 수 있다.
소 키모신 B에 비해 25% 이상의 동일성을 갖는 공지의 커다란 아스파틱 프로테아제 세트의 정렬에 기초하여 낙타 키모신의 변이체를 설계하였다.
변이는 일반적으로 고도로 가변적인(hypeervariable) 영역 내로 도입된 반면, 보존된 영역은 변하지 않았다. 복수개의 변이가 각 변이체 구축물 내로 도입됨으로 해서, 각각의 단일 돌연변이가 복수개의 변이체 구축물 내에 존재하도록 하였다 (결과 논의는 하기 실시예 6 참조).
소 키모신의 변이체를 소 키모신과 낙타 키모신을 비교한 것에 기초하여 설계하였다. 소 잔기들을 예컨대 대응하는 낙타의 대응부로 변화시켰다 (결과 논의는 하기 실시예 7 참조).
실시예 3
:
키모신 변이체 효소 물질의 제조
모든 키모신 변이체들을 합성 유전자로서 합성하고 이를 본질적으로 pGAMpR-C (WO02/36752A2에 설명됨)에 대응하는 진균 발현 벡터 내로 클로닝하였다.
이 벡터들을 E. coli로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 통상의 기술자에게 공지인 스탠다드 분자생물학 프로토콜을 이용하여 정제하였다.
변이체 플라스미드를 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주로 개별적으로 형질전환시키고 단백질을 본질적으로 WO02/36752A2에 설명된 바와 같이 제조한 다음 스탠다드 크로마토그래피 기술을 이용하여 정제하였다.
기술분야에 알려진 바와 같이 - 통상의 기술자는 그의 일반기술 상식에 의해 본 발명에 설명된 바와 같은 소 및 낙타 키모신 변이체들과 같은 키모신 및 키모신 변이체를 생산 및 정제할 수 있을 것이다.
실시예 4: 특이적인 키모신 활성의 결정
4.1 응고 활성의 결정
국제낙농연합 (International Dairy Federation)에 의해 개발된 스탠다드법(IDF법)인 REMCAT 방법을 이용하여 응유 활성을 결정하였다.
응유 활성은 리터 당 (pH ∼ 6.5) 0.5 g의 염화칼슘 용액을 이용하여 저온, 저지방 분유로부터 조제된 스탠다드 밀크 기질의 응집을 육안으로 볼 수 있는데 걸리는 시간으로부터 결정하였다. 렌넷 샘플의 응유 기간을 공지의 응고 활성을 가지며 샘플로서 IDF Standard 110B에 의해 동일한 효소 조성을 갖는 레퍼런스 스탠다드의 그것과 비교하였다. 샘플 및 레퍼런스 스탠다드들을 동일한 이화학적 조건 하에서 측정하였다. 84 mM 아세트산 pH 5.5 완충액을 이용하여 변이체 샘플을 약 3 IMCU/ml으로 조정하였다.그 후, 200 ㎕ 효소를 지속적인 교반 하에, 32℃±1℃의 항온을 유지할 수 있는 수조 내에 위치한 유리 시험관 중 10 ml의 예열된 밀크(32℃)에 첨가하였다.
렌넷의 총 응유 활성(강도)을 샘플로서 동일한 효소 조성을 갖는 스탠다드에 상대적으로, 다음 공식에 따라 ml 당 국제응유단위(IMCU: International Milk-Clotting Units)로서 계산하였다:
S스탠다드: 렌넷에 대한 국제적인 레퍼런스 스탠다드의 응유 활성
T스탠다드: 스탠다드 희석에 대해 얻어진 초 단위의 응고 시간
D샘플: 샘플에 대한 희석 인자
D스탠다드: 스탠다드에 대한 희석 인자
T샘플: 효소 첨가로부터 응집 시간까지의 희석된 렌넷 샘플에 대해 얻어진 초 단위의 응고 시간
4.2 총 단백질 함량의 결정
제조자 지침에 따라 Thermo Scientific사의 Pierce BCA Protein Assay Kit를 이용하여 총 단백질 함량을 결정하였다.
4.3 특정 응고 활성의 계산
응고 활성 (IMCU/ml)을 총 단백질 함량(ml 당 총 단백질 mg)으로 나눔으로써 특정한 응고 활성(IMCU/mg 총 단백질)을 구하였다.
실시예 5: 단백질분해 활성의 결정
기질(EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638)로서 형광 표지된 Bodipy-FL 카제인을 이용하여 일반적인 단백질분해 활성을 측정하였다. pH-둔감성 녹색-형광 Bodipy-FL로 무겁게(heavily) 표지된 카제인 유도체들은 컨쥬게이트의 형광을 거의 완전히 소강시키는 결과를 나타내었다. 프로테아제에 의해 촉매된 가수분해는 형광 Bodipy-FL을 방출한다. 이 방법은 매우 민감하며 이 실시예에 필수적인데 이는 CHYMAX M이 오늘날까지 알려진 모든 응고제들 중 가장 낮은 일반적인 단백질분해 활성을 나타내기 때문이다.
이 분석은 0.04 mg/ml의 최종 기질 농도로 원하는 pH로 조정된 0.2M 인산염 완충액에서 실시하였다. 기질 1부를 효소 1부와 혼합하기 전에 (두 가지 모두 포스페이트 완충액 중에 준비됨), 모든 효소 변이체들을 50 IMCU/ml으로 정규화하였다(실시예 4에 따름). 기질과 효소를 96-웰 Nunc Fluoro 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하고, 밀봉한 다음 32℃에서 60분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후 씰링을 제거하고 형광을 형광계로 기록하였다.
실시예 6
:
낙타 키모신 변이체들의 평가
모든 변이체들에 대해 특이적인 응고 활성(IMCU/mg 총 단백질)을 실시예 4에 따라 pH 6.5에서 결정하였다. 변이체들을 다음 전략에 따라 랭크하였다. 가장 낮은 특이 활성을 갖는 변이체에게는 1점을, 활성이 두 번째로 낮은 변이체에게는 2점을 부여하는 방식으로 랭킹을 매겼다.
동일한 랭킹 전략을 C/P 비율에 대해서 수행하였다. 특이적인 응고 활성(IMCU/mg)을 단백질분해 활성으로 나눔으로써 pH 6.5에서 모든 변이체에 대해 C/P 비율을 결정하였다.
두 가지 모두의 랭킹 전략을 이용하여 각 변이체에 대한 총점을 결정하고 점수 합산에 기초해서 마지막 랭킹을 실시하였다.
레퍼런스로서 낙타 야생형 유전자와 소의 야생형 유전자를 포함시켰다.
모든 변이체들이 복수개의 돌연변이를 포함함에 따라, 랭크된 변이체들의 데이터를 통계방법과 3D 구조 분석을 이용하여 보다 상세히 조사하여, 양성 또는 음성 효과를 갖는 개별적인 아미노산 변화를 결정하였다. 이 조사에서는 하기 실시예 7에서 논의된 소 변이체도 평가하고/포함시켰다.
다음 돌연변이가 동정되었다:
표의 우측 컬럼은 소 키모신의 3D 구조에서 개별적인 돌연변이가 나타난 곳과 관련된 것이다. 소 키모신의 3D 구조는 공지이며 입수가능하다. 아미노산 위치 296과 294가 소 키모신 내에 위치하는 일례가 도 2에 도시되어 있다.
결론:
전술한 결과들은 낙타 키모신 중 다음의 돌연변이들이 양성적이었음을 입증한다(즉, 낙타의 야생형 키모신에 비해 개선된 C/P 비율을 가짐):
D117N
H134Q
L280I
D156V
V241I
D325M
L311I
G309W
G309D
V279M
실시예 7
:
소 키모신 변이체의 평가
소 키모신 변이체들을 pH 6.5에서만 그들의 C/P 비율에 기초하여 평가하였다.
모든 변이체들이 복수개의 돌연변이를 포함하였으므로, 랭크된 변이체들의 데이터가 통계방법과 3D 구조 분석을 통해 보다 자세히 검토하여 양성 또는 음성 효과를 갖는 개별적인 아미노산 변화를 알아보았다. 이 조사에는 실시예 6에서 논의된 낙타 변이체도 평가/포함시켰다.
소 키모신에 대해 다음의 양성 돌연변이가 동정되었다:
결론:
전술한 결과들은 소 키모신에 있어서 다음의 돌연변이들이 양성적이었음을 입증하는 것이다 (즉 소의 야생형 키모신에 비해 증가된 C/P 비율을 가짐):
Q300R
H350N
K353L
Q141E
I143F
실시예 8
:
키모신에 있어서 양성 돌연변이를 만들기 위한 위치
실시예 6 및 7에서 설명된 결과들의 상대 평가에 의해 다음의 데이터가 결과되었다.
촉매적 클레프트 영역 279-281
실시예 7에 나타난 바와 같이, 소 키모신의 이중 돌연변이 K279V 및 V281F는C/P 비율에 있어서 음성적인 효과를 결과시켰다. 낙타 키모신에 있어서 돌연변이 V279K 역시도 음성 결과를 초래하였다(실시예 6). 따라서, 위치 281에 있어서의 최적 아미노산은 V로 결론지어진다. 낙타에 있어서 L280I 돌연변이도 양성 효과를 나타낸 것으로 관찰되었다.
스몰 로브 영역 298-300
실시예 7에 나타난 바와 같이, 소 키모신의 이중 돌연변이 Q298E 및 Q300R는 C/P 비율에 대해 양성적인 효과를 결과시켰다.
촉매적 클레프트 영역 350-353
실시예 7에 나타난 바와 같이, 소 키모신의 삼중 돌연변이 H350N, Q352E 및 K353L은 C/P 비율에 대해 양성적인 효과를 결과시켰다.
낙타 키모신에 있어서는 L353Q은 양성 효과를 나타낸 것으로 관찰된 반면(실시예 6) L353K는 음성적인 효과를 가졌다.
스몰 로브 영역 307-311
실시예 7에 나타난 바와 같이, 소 키모신의 이중 돌연변이 D307N 및 D309G는 C/P 비율에 대해 음성적인 효과를 결과시켰다.
낙타 키모신에 있어서 G309D 및 G309W는 양성 효과를 나타내었다. 이것은 소 키모신에 있어서 D307N 돌연변이가 음성 효과에 책임이 있음을 시사하는 것이다.
낙타 키모신에 있어서 L311I 돌연변이는 이로운 효과를 갖는 것으로 나타났다.
백본 영역 134-143
실시예 7에 나타난 바와 같이, 소 키모신의 이중 돌연변이 Q141E 및 I143F는 C/P 비율에 대해 양성 효과를 나타내었다.
낙타 키모신에서 H134를 Q로 변화시키면 이로운 효과를 갖는 것으로 나타났다.
참고문헌
1: WO02/36752A2 (Chr. Hansen)
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3: Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569
4: van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
5: Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83
6: M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997
7: Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871
8: Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139
9: Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
SEQUENCE LISTING
<110> Chr. Hansen A/S
<120> Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
<130> P4629PC00
<160> 2
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1
<211> 381
<212> PRT
<213> Bos taurus
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..381
<223> /mol_type="protein"
/organism="Bos taurus"
<400> 1
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Val Phe Ala Leu Ser Gln Gly
1 5 10 15
Ala Glu Ile Thr Arg Ile Pro Leu Tyr Lys Gly Lys Ser Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu His Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Lys Gln Gln
35 40 45
Tyr Gly Ile Ser Ser Lys Tyr Ser Gly Phe Gly Glu Val Ala Ser Val
50 55 60
Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Leu
65 70 75 80
Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu Phe Asp Thr Gly Ser Ser
85 90 95
Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Ala Cys Lys Asn
100 105 110
His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Gln Asn Leu Gly
115 120 125
Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Gln Gly Ile Leu
130 135 140
Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Ile Gln Gln Thr
145 150 155 160
Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp Val Phe Thr Tyr Ala Glu
165 170 175
Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr
180 185 190
Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn Arg His Leu Val Ala Gln
195 200 205
Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Glu Ser Met Leu
210 215 220
Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp
225 230 235 240
Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val
245 250 255
Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu Gly Gly Cys Gln Ala Ile
260 265 270
Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu
275 280 285
Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln Asn Gln Tyr Gly Glu Phe
290 295 300
Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met Pro Thr Val Val Phe Glu
305 310 315 320
Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Gln
325 330 335
Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Ser Glu Asn His Ser Gln
340 345 350
Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe
355 360 365
Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
<210> 2
<211> 381
<212> PRT
<213> Camelus dromedarius
<220>
<221> SOURCE
<222> 1..381
<223> /mol_type="protein"
/organism="Camelus dromedarius"
<400> 2
Met Arg Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ser Gln Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Thr Arg Ile Pro Leu His Lys Gly Lys Thr Leu Arg Lys
20 25 30
Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Arg Gln Gln
35 40 45
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Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Ile
65 70 75 80
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Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Phe Thr Tyr Ser Glu
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile
370 375 380
Claims (12)
- (a): 키모신 활성을 갖는 모(母) 폴리펩타이드의 2 이상의 위치에 변경을 가하는 단계로서, 상기 변경은 V90L, R125Q, G128D, G128N, L188I, S190A, M215L, L280I, K289N, G309D 및 L353K 중에서 선택되는 2 이상의 치환을 포함하는 것인 단계; 및
(b): 단계 (a)의 변경된 폴리펩타이드를 생산 및 분리하고 이에 의해 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체를 수득하는 단계로서, 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인 단계
를 포함하는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법으로서;
모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2(낙타 키모신)의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 키모신 활성을 갖는 폴리펩타이드이고,
상기 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체는:
- SEQ ID NO: 1의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 소 키모신의 C/P 비율과 비교하여 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성; 또는
- SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율과 비교하여 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 가지는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 변경은 하기 치환의 조합을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 제조방법:
G128D + L188I + Y326F;
V90L + L188I + R203Q + L280I + D337E;
R119S + R125Q + K289N; 또는
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T. - 제1항 또는 제4항에 기재된 방법에 의해 수득되는 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체.
- (a): 키모신 활성을 갖는 모(母) 폴리펩타이드의 2 이상의 위치에서 변경을 포함하고, 상기 변경은 V90L, R125Q, G128D, G128N, L188I, S190A, M215L, L280I, K289N, G309D 및 L353K 중에서 선택되는 2 이상의 치환을 포함하는 것이고; 및
(b): 상기 변이체는 키모신 활성을 갖는 것인
분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체로서:
여기서:
(i): 모 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2(낙타 키모신)의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381인 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 키모신 활성을 갖는 폴리펩타이드인 것이고; 및
(ii): 상기 분리된 변이체 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 2(낙타 키모신)의 성숙한 폴리펩타이드와 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것이며,
상기 분리된 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율과 비교하여 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 갖고; 및
상기 분리된 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙한 폴리펩타이드를 포함하는 낙타 키모신의 C/P 비율과 비교하여 더 높은 C/P 비율을 제공하는 키모신 활성을 가지는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체. - 삭제
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 변경은 하기 치환의 조합을 포함하는 것인, 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체:
G128D + L188I + Y326F;
V90L + L188I + R203Q + L280I + D337E;
R119S + R125Q + K289N; 또는
R125Q + G128N + H204R + Q246E + S284T. - 제5항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료 제품의 제조방법으로서,
상기 제품은 밀크 기반 제품이고 상기 방법은 제5항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 밀크에 첨가한 다음 밀크 기반 제품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는 것이고; 및
상기 밀크는 두유, 양젖, 염소젖, 버팔로젖, 야크젖, 라마젖, 낙타젖 또는 우유인 것이며; 및
상기 밀크 기반 제품은 발효유제품, 쿠아르크 또는 치즈인 것인 식품 또는 사료 제품의 제조방법. - 제6항 또는 제9항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는, 식품 또는 사료 제품의 제조방법으로서,
상기 제품은 밀크 기반 제품이고 상기 방법은 제6항 또는 제9항에 기재된 분리된 키모신 폴리펩타이드 변이체의 유효량을 밀크에 첨가한 다음 밀크 기반 제품을 얻기 위하여 추가 제조 단계를 수행하는 것을 포함하는 것이고; 및
상기 밀크는 두유, 양젖, 염소젖, 버팔로젖, 야크젖, 라마젖, 낙타젖 또는 우유인 것이며; 및
상기 밀크 기반 제품은 발효유제품, 쿠아르크 또는 치즈인 것인 식품 또는 사료 제품의 제조방법. - 삭제
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|---|---|---|---|
| EP12169503 | 2012-05-25 | ||
| EP12169503.5 | 2012-05-25 | ||
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