KR20190010602A

KR20190010602A - 우유-응고 특성이 개선된 키모신 변이체

Info

Publication number: KR20190010602A
Application number: KR1020187036551A
Authority: KR
Inventors: 크리스티앙 잭켈; 마틴 룬트; 요하네스 마르텐 반 덴 브링크
Original assignee: 시에이치알. 한센 에이/에스
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2019-01-30
Also published as: WO2017198829A1; JP7084317B2; US10961524B2; AR108526A1; BR112018073274A2; CN109640677A; EP3457860A1; AU2017266397A1; JP2019526226A; CA3024211A1; US20190174783A1; EA201892531A1; KR102448390B1; MX2018013924A; AU2017266397B2

Abstract

우유 응고 특성이 개선된 키모신 변이체.

Description

우유-응고 특성이 개선된 키모신 변이체

본 발명은 우유-응고 특성이 개선된 키모신 변이체에 관한 것이다.

포유류 위(胃)의 우유 응고 효소들인 키모신 (EC 3.4.23.4) 및 펩신 (EC 3.4.23.1)은, 광범위한 펩티다제 클래스에 속하는 아스파르트산 프로테아제이다.

위 점막 세포에서 생성될 때, 키모신 및 펩신은 각각 효소 비활성인 프리-프로키모신 및 프리-펩시노겐으로 발생한다. 키모신이 분비될 때, N-말단 펩티드 단편인 프리-단편 (신호 펩티드)가 절단되고 프로-단편을 포함하는 프로키모신이 생성된다. 프로키모신은 효소의 실질적인 비활성 형태이지만, 이는 산성 조건하에서 프로-단편의 자가촉매적 제거에 의해 활성 키모신으로 활성화된다. 이러한 활성화는 적절한 pH 조건하의 위 내강의 인비보(in vivo) 또는 산성 조건하의 인비트로(in vitro)에서 일어난다.

소(bovine), 즉 보스 타우루스(Bos Taurus)의 프리-프로키모신, 프로키모신 및 키모신의 구조 및 기능적 특성은 광범위하게 연구되어왔다. 소 프리-프로키모신 분자의 프리-부분은 16aa 잔기를 포함하고, 상응하는 프로키모신의 프로-부분은 길이가 42 aa 잔기이다. 활성 소 키모신은 323 aa를 함유한다.

키모신은 소, 낙타, 염소, 버팔로, 양, 돼지, 사람, 원숭이 및 래트와 같은 포유류 종에서 자연적으로 생성된다.

소 및 낙타 키모신은 수년 동안 낙농 산업에 상업적으로 이용되어왔다.

키모신 및 펩신과 같은 우유-응고 효소에 의한 우유의 효소 응집은 치즈의 제조에서 가장 중요한 공정 중 하나이다. 우유의 효소 응집은 2 단계 공정: 단백질 분해 효소인 키모신 또는 펩신이 κ-카제인을 공격하여 카제인 미셀 구조가 준안정 상태가 되는 제1 단계, 및 우유가 순차적으로 응집하고 응고물을 형성하는 제2 단계로 구성된다 (참조 문헌 1).

WO02/36752A2 (Chr. Hansen)은 낙타 키모신의 재조합 생성을 기재하고 있다.

WO2013/174840A1 (Chr. Hansen)은 소 및 낙타 키모신의 돌연변이체/변이체를 기재하고 있다.

WO2013/164479A2 (DSM)은 소 키모신의 돌연변이체를 기재하고 있다.

바로 아래에 나열한 참조 문헌들은 본 문맥상 키모신의 돌연변이체를 설명하는 참조 문헌들로 볼 수 있다.

- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;

- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed muta-genesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;

- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;

- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants pro-duced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;

- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray struc-tural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;

- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic charac-terization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;

- Chitpinityol et al: Site-specific mutations of calf chymosin B which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;

- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombi-nant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.

위에서 언급한 선행 기술 참조 문헌들 중 어느 것도, 후술하는 바와 같이, 변이체가 유래된 모체에 비하여 고유 응고 활성(specific clotting activity)이 개선되거나 C/P 비율이 증가된 임의의 키모신 변이체를 직접적으로 그리고 분명하게 기재하고 있지 않다.

발명의 개요

본 발명에 의해 해결하려는 과제는, 모체 폴리펩티드와 비교할 때, 본원에 설명된 바와 같이 그의 모체 폴리펩티드의 고유 응고 활성의 적어도 110%인 고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)을 갖고, 및/또는 그의 모체 폴리펩티드의 C/P 비율의 적어도 200%인 C/P 비율을 갖는 키모신 변이체를 제공하고자 하는 것이다.

상이한 변이체들의 지적 설계 및 비교 분석에 기초하여, 본 발명자들은 모체 펩티드에서 이들 위치 중 하나 이상에서 변이체를 제조함으로써 고유 응고 활성이 증가하거나 C/P 비율이 증가한, 또는 둘 모두 증가한 개선된 키모신 변이체를 제조할 수 있다는 점에서 본원에서 중요한, 다수의 아미노산 위치를 동정하였다.

변이체를 특정하기 위하여 본원에서 사용된 아미노산 넘버링은 성숙 펩티드에 기초한다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 상이한 포유류 종 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지 또는 래트)으로부터 얻은 상이한 천연 야생형 키모신 폴리펩티드 서열은 비교적 높은 서열 유사성/동일성을 갖는다. 도 1에서, 이는 본원 관련 상이한 키모신 서열의 정렬에 의해 예시된다.

이러한 비교적 근접한 서열 관계를 고려하면 - 상이한 천연 야생형 키모신의 3D 구조 또한 비교적 유사하다고 믿어진다.

본 문맥상 - 자연적으로 얻은 야생형 키모신 (예컨대, 소 키모신 또는 낙타 키모신)은 본원에서 모체 폴리펩티드 - 즉, 본 발명의 변이체 키모신 폴리펩티드를 생성하기 위해 변경되는 모체 폴리펩티드의 일 예시일 수 있다.

이론에 구애받지 않고 - 본원에서 논의된 키모신 관련 아미노산 위치는, 이들 위치 중 하나 이상에서 변이체를 제조함으로써 일반적으로 개선된 키모신 변이체 (예컨대, 개선된 소, 낙타, 양, 돼지 또는 래트 키모신 변이체)를 얻을 수 있다는 점에서 - 관심 있는 임의의 본원 관련 키모신 효소 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지, 래트 등의 키모신)에서 일반적으로 중요하다고 믿어진다.

본원에서 논의된 바와 같이 - 관심 있는 모체 키모신 폴리펩티드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 탐지하기 위한 레퍼런스 서열로서, 본원 SEQ ID NO: 2의 공지된 카멜루스 드로메다리우스 (Camelius dromedarius) 성숙 키모신 서열이 본원에서 사용된다. 이는 본원에서 낙타 키모신이라고 대신 불릴 수 있다. 상기 서열은 또한 본원의 도 1에도 나타냈다.

본 분맥상, SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)과 서열 동일성이 적어도 80%인 모체 키모신 폴리펩티드 (예컨대, 양 또는 래트 유래)는, 본원에 기재된 바와 같은 임의의 아미노산 위치에서 변이체를 제조하여 개선되기 위해, 예컨대 소 또는 낙타 키모신과 충분한 구조적 관련성이 있는 것으로 본원에서 간주될 수 있다고 믿어진다.

본 발명의 구체예들을 아래에 설명하였다.

정의

본원 관련 용어들의 모든 정의는 본원 관련 기술 문맥과 관련하여 통상의 기술자가 이해할 수 있는 것에 따른다.

용어 "키모신(chymosin)"은 EC 3.4.23.4 클래스의 효소에 관한 것이다. 키모신은 특이성이 높고, 주로 카제인의 κ-사슬에서 단일 104-Ser-Phe-|-Met-Ala-107 결합을 절단함으로써 우유를 응고시킨다. 부작용으로, 키모신은 또한 주로 Phe23과 Phe24 사이의 α-카제인 및 주로 Leu192와 Tyr193 사이의 β-카제인을 절단한다 (참조 문헌 2, 3). 생성된 펩티드 αS1 (1-23) 및 β(193-209)는 숙성 치즈에 첨가된 미생물 배양체로부터 프로테아제에 의해 추가로 분해될 것이다 (참조 문헌 4). 당해 기술분야에서 사용되는 키모신의 다른 이름은 레닌(rennin)이다.

용어 "키모신 활성(chymosin activity)"은 본 문맥상 통상의 기술자가 이해하는 키모신 효소의 키모신 활성에 관한 것이다.

통상의 기술자는 본원 관련 키모신 활성을 탐지하는 방법을 알고 있다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 본원 관련 소위 C/P 비율은 고유 응고 활성 (C)을 단백질 분해 활성 (P)으로 나눔으로써 결정된다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 보다 높은 C/P 비율은 일반적으로 예컨대, 치즈 제조 동안 비-특이적 단백질 분해로 인한 단백질 손실이 감소되어, 치즈의 수율이 향상됨을 내포한다.

용어 "단리된 변이체(isolated variant)"는 사람의 행위에 의하여 변형된 변이체를 의미한다. 일 측면에서, 변이체는 SDS PAGE에 의해 탐지되는 바와 같이, 적어도 1% 순수, 예컨대, 적어도 5% 순수, 적어도 10% 순수, 적어도 20% 순수, 적어도 40% 순수, 적어도 60% 순수, 적어도 80% 순수, 및 적어도 90% 순수하다.

용어 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)"는 번역 및 임의의 번역 후 변형(post-translational modifications), 예컨대 N-말단 프로세싱, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등 후의 최종 형태의 펩티드를 의미한다. 본 문맥상, 본원 관련 성숙 키모신 폴리펩티드는 활성 키모신 폴리펩티드 서열 - 즉, 프리-부분 및/또는 프로-부분 서열이 없는 것으로 볼 수 있다. 본원 관련 성숙 폴리펩티드의 예시로는, 예컨대 SEQ ID NO: 1의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래된 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신), 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 위치 59 내지 아미노산 위치 381로부터 유래된 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)이 있다.

용어 "모체(parent)" 또는 "키모신 활성을 갖는 모체 폴리펩티드(parent polypeptide having chymosin activity)"는 본 발명의 효소 변이체를 생성하기 위해 변경된 폴리펩티드를 의미한다. 상기 모체는 자연 발생 (야생형) 폴리펩티드 또는 그의 변이체일 수 있다.

용어 "서열 동일성(Sequence Identity)"은 두 아미노산 서열 또는 두 뉴클레오티드 서열 사이의 관련성에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위하여, 두 아미노산 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)의 Needle 프로그램에서 실행된 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol . Biol . 48: 443-453), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상을 사용하여 탐지된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 패널티, 0.5의 갭 익스텐션 패널티 및 EBLOSUM62 (BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성(longest identity)" (nobrief 옵션을 사용하여 얻음)이라고 표시된 Needle의 아웃풋은 퍼센트 동일성으로 사용되며 다음과 같이 계산된다:

(동일한 잔기들 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내 갭들의 총 수)

본 발명의 목적을 위하여, 두 데옥시리보뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra)의 Needle 프로그램에서 실행된 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, supra), 바람직하게는 버전 3.0.0 이상을 사용하여 탐지된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 패널티, 0.5의 갭 익스텐션 패널티 및 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "가장 긴 동일성" (-nobrief 옵션을 사용하여 얻음)이라고 표시된 Needle의 아웃풋은 퍼센트 동일성으로 사용되며 다음과 같이 계산된다:

(동일한 데옥시리보뉴클레오티드들 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내 갭들의 총 수).

용어 "변이체(variant)"는 하나 이상의 (여러) 위치에서의 변경, 즉 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 키모신 활성을 갖는 펩티드를 의미한다. 치환은 위치를 차지하는 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미하고; 결실은 위치를 차지하는 아미노산을 제거하는 것을 의미하며; 및 삽입은 위치를 차지하는 아미노산에 인접하여 1-3 개의 아미노산을 첨가하는 것을 의미한다.

아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다 - 예를 들어, 예컨대 D-알라닌의 특정 D-이성질체 (또는 D-형태)로의 치환이 이론적으로 가능할 수 있다.

용어 "야생형(wild-type)"은 자연에서 발생하는 뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열, 즉 사람의 행위에 의해 표적화된 돌연변이의 대상이 되지 않은 뉴클레오티드 서열 또는 펩티드 서열을 지칭한다.

도 1: 본원 관련 상이한 키모신 서열의 정렬.
본 문맥상 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이 - 본원에서 예컨대, 양, C. 박트리아누스(C. bactrianus), 낙타, 돼지 또는 래트 키모신의 성숙 폴리펩티드 서열과 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신 - 즉, SEQ ID NO: 3의 아미노산 위치 59 내지 381)의 본원 관련 서열 동일성 퍼센트는 전술한 서열 동일성 퍼센트와 비교적 유사하다.
도 2:
녹색 막대-모양 구조로 표시된 결합된 κ카제인 모델을 갖는 낙타 키모신의 3D 구조 (상세, PDB: 4AA9). κ카제인은 잔기 105 및 106 사이의 잘리기 쉬운 결합 (shissile bond)으로 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 돌연변이 R242E, Y243E, N249D, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E, F282E를 파란색으로 강조 표시하였다.
도 3:
녹색 막대-모양 구조로 표시된 결합된 κ카제인 모델을 갖는 소 키모신의 3D 구조 (PDB: 4AA8). κ카제인은 잔기 105 및 106 사이의 잘리기 쉬운 결합으로 키모신 기질 결합 틈에 위치한다. 위치 H292 및 Q294를 노란색으로 강조 표시하였다.
도 4:
낙타 키모신의 3D 구조 (상세, PDB: 4AA9). 단백질 N-말단의 잔기 Y11, L12 및 D13뿐만 아니라 잠재적 Y11 상호 작용 파트너 D290을 보라색 막대-모양 구조로 강조 표시하였다.

발명의 상세한 설명

관심 있는 키모신의 아미노산 위치 탐지

상기 논의된 바와 같이 - 관심 있는 본원 관련 키모신 폴리펩티드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 탐지하기 위한 레퍼런스 서열로서, 본원에서 SEQ ID NO: 2에 개시된 공지된 낙타 키모신 서열을 본원에서 사용하였다.

또 다른 키모신 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2에 개시된 폴리펩티드로 정렬하였고, 상기 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 2에 개시된 폴리펩티드 내의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호를 본원의 실시예 1에 기재된 바와 같은 ClustalW 알고리즘을 사용하여 탐지하였다.

상기 잘 알려진 컴퓨터 프로그램에 기초하여 - 관심 있는 본원 관련 키모신 폴리펩티드 (예컨대, 낙타, 양, 소 등)의 아미노산 위치를 탐지하는 것은 통상의 기술자에게 일상적인 작업이다.

본원의 도 1에 정렬의 예시를 나타냈다.

단지 일 예시로서 - 도 1에서, 예컨대 본원에서 사용된 소 레퍼런스 SEQ ID NO: 3은 위치 50에 "G"를 갖고, "카멜루스_드로메다리우스(Camelus _ dromedarius)" (본원 SEQ ID NO: 2)는 이 위치 50에 "A"를 갖는다는 것을 알 수 있다.

변이체의 명명법

본 발명의 변이체를 설명함에 있어서, 아래에 기재된 명명법은 참고의 편이를 위하여 채택된 것이다. 허용된 IUPAC 단일 문자 또는 세 글자의 아미노산 약어가 사용된다.

아래의 이 "명명법" 섹션에서 논의되는 특정 변이체는 본 발명의 본원 관련 변이체가 아닐 수 있다 - 즉, 이 "명명법" 섹션은 본원과 관련하여 사용된 명명법을 설명하기 위한 것일 뿐이다.

치환(Substitutions). 아미노산 치환의 경우, 다음의 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서, 위치 226에서 트레오닌을 알라닌으로 이론상 치환하는 경우 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로 표시한다. 다중 돌연변이는 첨가 기호 ("+")로 구분하는데, 예를 들어, "Gly205Arg + Ser411Phe" 또는 "G205R + S411F"는 위치 205 및 411에서 각각 글리신 (G)을 아르기닌 (R)으로 및 세린 (S)을 페닐알라닌 (F)으로 치환하는 것을 나타낸다. 예컨대 "226A"로 표시된 치환은, 위치 226에서 모체 아미노산 (예컨대, T, Q, S 또는 다른 모체 아미노산)을 알라닌으로 치환하는 것을 지칭한다.

결실(Deletions). 아미노산 결실의 경우, 다음의 명명법이 사용된다: 원래의 아미노산, 위치, *. 따라서, 위치 195에서의 글리신의 결실은 "Gly195*" 또는 "G195*"로 표시한다. 다중 결실은, 예를 들어, "Gly195* + Ser411*" 또는 "G195* + S411*"와 같이 첨가 기호 ("+")로 구분한다.

삽입(Insertions). 아미노산 삽입의 경우, 다음의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입된 아미노산. 따라서, 위치 195에서 글리신 뒤에 라이신을 삽입하는 경우 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표시한다. 다중 아미노산의 삽입은 [원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2; 등]으로 표시한다. 예를 들어, 위치 195에서 글리신 뒤에 라이신 및 알라닌을 삽입하는 경우 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표시한다.

이러한 경우, 삽입된 아미노산 잔기(들)은 삽입된 아미노산 잔기(들)에 선행하는 아미노산 잔기의 위치 번호에 소문자를 첨가함으로써 넘버링된다. 위의 예시에서, 서열은 다음과 같다:

다중 변경(Multiple alterations). 다중 변경을 포함하는 변이체는 첨가 기호 ("+")로 구분하는데, 예를 들어, "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 위치 170 및 195에서 아르기닌 및 글리신을 각각 티로신 및 글루탐산으로 치환하는 것을 나타낸다.

상이한 치환(Different substitutions). 한 위치에 상이한 치환들이 도입될 수 있는 경우, 그 상이한 치환들은 콤마로 구분하는데, 예를 들어, "Arg170Tyr,Glu" 또는 "R170Y,E"는 위치 170에서 아르기닌을 티로신 또는 글루탐산으로 치환하는 것을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" 또는 "Y167G,A + R170G,A"는 다음의 변이체를 나타낸다:

"Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".

키모신 활성을 갖는 바람직한 모체 폴리펩티드

바람직하게는, 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3 (소 키모신) 및/또는 SEQ ID NO: 2 (낙타 키모신)의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99%이다.　

단지 일 예시로서 - 적합한 본원 관련 모체 폴리펩티드는, 예컨대 소 키모신 A일 수 있다 - 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 소 키모신 A는 본원의 SEQ ID NO: 3의 소 키모신 B와 비교하여 단지 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있다.

바람직한 일 구체예에서 - 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 서열 동이성이 적어도 90%이고, 더 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 서열 동일성이 적어도 95%이고, 더욱 더 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 서열 동일성이 적어도 97%이다. 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)인 것이 바람직하다.

본 문맥상 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이 - 키모신 활성을 갖는 본원 관련 모체 폴리펩티드는 이미 예컨대 상응하는 야생형 키모신의 예컨대 변이체일 수 있다.

예를 들어, SEQ ID NO: 3의 성숙 야생형 소 키모신 폴리펩티드와 비교하여 예컨대 5-10 가지 변경 (예컨대, 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는, 여전히 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드 (소 키모신)와 서열 동일성이 적어도 95%인 모체 폴리펩티드일 수 있다.

본 문맥상 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이 - 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타)와 서열 동일성이 적어도 80%인 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서 - 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 92%이고, 더 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 95%이고, 더욱 더 바람직하게는 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 및/또는 SEQ ID NO: 3의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 97%이다. 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)인 것이 바람직하다.

바꾸어 말하면 일반적으로 - 본원 관련 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 본원에서 청구된 위치 이외의 다른 위치에서의 변경 (예컨대, 치환)을 포함할 수 있다.

예를 들어, SEQ ID NO: 2의 야생형 낙타 키모신 폴리펩티드와 비교하여 예컨대 5-10 가지 변경 (예컨대, 치환)을 갖는 소 키모신 변이체는, 여전히 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드와 서열 동일성이 적어도 95%인 모체 폴리펩티드일 것이다.

단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 30 가지 미만의 아미노산 변경 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 바람직하고, 또는 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드와 비교하여 20 가지 미만의 아미노산 변경 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 바람직하고, 또는 단리된 소 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드와 비교하여 10 가지 미만의 아미노산 변경 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 바람직하고, 또는 단리된 낙타 키모신 변이체는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 비교하여 5 가지 미만의 아미노산 변경 (예컨대, 치환)을 포함하는 것이 바람직하다.

단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법

상기 논의된 바와 같이 - 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 통상의 기술자는 그의 일반 상식에 기초하여, 키모신 및 키모신 변이체를 일상적으로 생성 및 정제할 수 있다.

바꾸어 말하면, 일단 통상의 기술자가 관심 있는 키모신 활성을 갖는 본원 관련 모체 폴리펩티드 (예컨대, 소, 낙타, 양, 돼지 또는 래트로부터 유래한 것)를 가지고 있다면, 본 발명에 의해 안내될 경우 이러한 모체 키모신의 변이체를 제조하는 것은 통상의 기술자에게 일상적인 작업이다.

적합한 키모신 (변이체 또는 모체)의 생성 및 단리 방법의 일 예시로는, 잘 알려진, 예컨대 WO02/36752A2 (Chr. Hansen)에 기재된 예컨대 균류 재조합 발현/생산 기반 기술(fungal recombinant expression/production based technology)이 있을 수 있다.

키모신 활성을 갖는 모체 폴리펩티드의 하나 이상의 위치에서 변경을 가하는 것 또한 통상의 기술자에게 일상적인 작업이며, 여기서 변경은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다.

통상의 기술자에게 공지된 바와 같이 - 이는 예컨대 소위 부위 지정 돌연변이유발 (site directed mutagenesis) 및 재조합 발현/생산 기반 기술로 수행될 수 있다.

본원 관련 모체 폴리펩티드 (예컨대, 낙타 또는 소 야생형 키모신) 및/또는 본원 관련 변이체가 키모신 활성을 갖는지 여부를 탐지하는 것 또한 통상의 기술자에게 일상적인 작업이다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 키모신 특이성은 고유 응고 활성 (C)을 단백질 분해 활성 (P)으로 나눔으로써 결정되는, 소위 C/P 비율에 의해 탐지될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 보다 높은 C/P 비율은 일반적으로 예컨대, 치즈 제조 동안 비-특이적 단백질 분해로 인한 단백질 손실이 감소되어, 치즈의 수율이 향상됨을 내포한다.

우유 응고 활성의 탐지

우유 응고 활성은 국제낙농연맹(International Dairy Federation)에 의해 개발된 표준 방법인 (IDF 방법), REMCAT 방법을 사용하여 탐지할 수 있다.

우유 응고 활성은 리터 당 0.5 g의 염화칼슘 용액 (pH

6.5)으로 저열, 저지방 분유로부터 제조된 표준 우유 기질의 가시적 응집에 필요한 시간으로부터 탐지된다. 레닛(rennet) 샘플의 응고 시간을, 공지된 우유-응고 활성을 갖고 샘플과 동일한 IDF 표준 110B에 따른 효소 조성을 갖는 레퍼런스 표준의 응고 시간과 비교하였다. 샘플 및 레퍼런스 표준을 동일한 화학적 및 물리적 조건하에서 측정하였다. 변이체 샘플을 pH 5.5의 84 mM 아세트산 완충액을 사용하여 약 3 IMCU/ml로 조정하였다. 이후, 20 μl의 효소 제조물을, 일정한 교반하에서 32℃ ± 1℃의 일정한 온도를 유지할 수 있는 수조 내에 놓인 유리 시험관에서 예열된 1 ml의 우유 (32℃)에 첨가하였다.

레닛의 총 우유-응고 활성 (강도)은 다음의 공식에 따라 샘플과 동일한 효소 조성을 갖는 표준과 비교하여 ml 당 국제 우유-응고 단위 (International Milk-Clotting Units; IMCU)로 계산하였다:

강도 (IMCU/ml) = S표준 x T표준 x D샘플

D표준 x T샘플

S표준: 레닛에 대한 국제 레퍼런스 표준의 우유-응고 활성.

T표준: 표준 희석물에 대해 얻은 응고 시간 (초).

D샘플: 샘플에 대한 희석 인자

D표준: 표준에 대한 희석 인자

T샘플: 효소를 첨가하여 희석된 레닛 샘플에 대해 응집 시간까지 얻은 응고 시간 (초).

응고 활성 탐지를 위하여, REMCAT 방법 대신 μIMCU 방법을 사용할 수 있다. REMCAT과 비교하여, μIMCU 분석에서 키모신 변이체의 응집 시간은 UV/VIS 플레이트 판독기의 800nm에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서의 OD 측정에 의해 탐지된다. 공지된 응고 강도를 갖는 레퍼런스 표준의 다양한 희석 표준 곡선을 각 플레이트상에 기록하였다. 샘플은 효소를 84 mM 아세테이트 완충액, 0.1% 트리톤 X-100, pH 5.5로 희석함으로써 제조하였다. 32℃에서의 반응은 4% (w/w) 저열, 저지방 분유 및 7.5% (w/w) 염화칼슘 (pH

6.5)을 함유한 표준 우유 기질 250 uL를 25 uL의 효소 샘플에 첨가함으로써 개시된다. ml 당 국제 우유-응고 단위 (IMCU)의 키모신 변이체의 우유 응고 활성은 표준 곡선에 대한 샘플 응집 시간에 기초하여 탐지된다.

총 단백질 함량의 탐지

총 단백질 함량은 Thermo Scientific사의 Pierce BCA Protein Assay Kit를 제공 회사의 지시에 따라 사용하여 탐지하는 것이 바람직하다.

고유 응고 활성의 계산

고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)은 응고 활성 (IMCU/ml)을 총 단백질 함량 (mg 총 단백질/ml)으로 나눔으로써 결정된다.

단백질 분해 활성의 탐지

일반 단백질 분해 활성은 형광 표지된 Bodipy-FL 카제인을 기질로 사용하여 측정하는 것이 바람직하다 (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). pH-비감수성 녹색-형광 Bodipy-FL로 과하게 표지된 카제인 유도체는 컨쥬게이트의 형광을 퀀칭(quenching)시킨다. 프로테아제 촉매 가수분해는 형광 Bodipy-FL을 방출한다. 이 방법은 매우 민감하며, 레퍼런스가 현재까지 공지된 모든 응고제 중 가장 낮은 일반 단백질 분해 활성을 갖기 때문에 이 실험에 필수적이었다. 0.04 mg/ml 기질 용액을 100 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.1% Brij를 함유하는 0.2 M 인산 완충액 pH 6.5에서 제조하였다. 키모신 변이체는 100 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.1% Brij를 함유하는 20 mM 말론산 완충액에 용해시켰다. 레퍼런스 및 키모신 변이체 용액 모두의, 20 μL를 블랙 384-웰 Corning 플랫 바텀 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하고, 형광계에서 32℃에서 10 시간 동안 연속적으로 형광을 기록하였다. 형광 변화의 선형 부분의 기울기는 일반 단백질 분해 활성을 탐지하는 데 사용된다.

C/P 비율의 탐지

C/P 비율은 응고 활성 (C)을 단백질 분해 활성 (P)으로 나눔으로써 계산한다.

고유 응고 활성 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석

다중 치환 변이체에 존재하는 단일 돌연변이의 효과, 즉 고유 우유 응고 활성뿐만 아니라, 응고 및 일반 단백질 분해 활성의 비율 (C/P)에 대한 효과를 탐지하기 위하여 통계적 기계-학습 접근법 및 PCA-기반 분석을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예

위에서 개괄하고 아래의 실시예에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 비슷한 조건하에서 상응하는 모체 폴리펩티드와 비교할 때, 응고 활성 및/또는 C/P 비율이 개선된 다수의 바람직한 키모신 폴리펩티드 변이체를 제조하였다.

바람직한 일 측면에서, 본 발명은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체에 관한 것으로,

(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 고유 응고 활성의 적어도 110%인 고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)을 갖고, 및/또는

(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 C/P 비율의 적어도 200%인 C/P 비율을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 서열 동일성이 적어도 80%, 예컨대 적어도 80%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다.

바람직한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 모체 펩티드의 고유 응고 활성의 적어도 110%의 고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)을 가질 수 있으며, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 위치: R242, L222, D59, S273, K19, V309, S132, N249, I96, L166, H76, G251, Q280, Q56, M157, K231, M256, N291 중 하나 이상의 (여러) 위치에서의 치환을 포함하고, 보다 구체적으로는 상기 치환은 R242E, L222I, D59N, S273Y, K19T, V309I, S132A, N249D, I96L, N249E, L166V, H76Q, N249D, G251D, Q280E, Q56H, M157L, K231N, M256L, N291Q일 수 있다.

경우에 따라, 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 글리코실화 패턴을 변경시키는 치환, 예컨대 N100, N252 및/또는 N291 중 하나 이상의 위치에서의 치환, 보다 구체적으로는 N100Q, N252Q 및/또는 N291Q를 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 변이체는 다음의 치환 조합:

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, S164G, L166V, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

N249D, N100Q, N291Q;

R242E, N100Q, N291Q;

R242E, G251D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

N252D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

G251D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

Y243E, Q280E, N100Q, N291Q;

Q56H, N252Q, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N;

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q 또는

R67Q, L130I, M157L, R242E, M256L, N292H

중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 여기서 각 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.

관련 일 구체예에서, 본 발명의 바람직한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 C/P 비율의 적어도 200%의 C/P 비율을 가지며, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 위치: R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L222, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291 중 하나 이상의 위치에서의 치환, 보다 구체적으로는 R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q를 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 또한 다음의 치환 조합:

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, R242E, G251D;

H76Q, S164G, L166V, L222I, S226T, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, R242E, S273Y, V309I;

H76Q, I96L, S164G, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, S164G, L166V, L222I, S226T, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;

K19T, Y21S, D59N, H76Q, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, L130I, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y, V309I;

K19T, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, L130I, S164G, G251D, V309I;

K19T, Y21S, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, D59N, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y, V309I;

D59N, H76Q, S226T, R242E, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

K19T, Y21S, H76Q, S164G, L222I, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, I96L, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, S164G, L166V, N249D, G251D, S273Y;

Y11I, K19T, I96L, S164G, L222V, R242E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

Y11V, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, L253I, I263L;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

Y11V, K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, I263V;

K19T, I96L, S164G, R242E, L253I;

Y11V, K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;

D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242D, G251D, I263V;

I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D, L253I;

D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

K19T, D59N, I96V, S164G, L166V, L222I, R242E, I263L;

Y11I, K19T, D59N, S164G, L222I, G251D, I263V;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L;

Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I, I263L;

K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V;

Y11V, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D, L253V;

Y11I, K19T, D59N, I96V, L222I, R242D, G251D;

K19T, E83T, I96L, S164G, L222I, R242E, L253V;

K19S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

K19T, I96L, S164N, L222I, R242E, I263L;

K19T, D59N, E83T, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D;

K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I;

Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, N249D, I263L;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, G251D, L253V;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164N, L166I, L222I, G251D;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

V32L, R67Q, L130I, M157L, K231N, M256L;

R67Q, L130I, M157L, D158S, R242E, N291Q;

R67Q, V136I, M157L, L222I, V248I;

Y11V, R67Q, L130I, M157L, L222I, R242E;

R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, L130I, L222I, R242E, M256L;

R67Q, G70D, M157L, R242E, V248I;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, N100Q, L130I, M157L, N292H;

I45V, L130I, M157L, K231N, R242E 또는

R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N.

바람직한 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법

본 발명은 또한 본 발명에 따른 단리된 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.

상기 바람직한 방법은 다음 단계들:

(a): SEQ ID NO: 2와 서열 동일성이 적어도 80%인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 변경을 가하는 단계로서, 여기서 변경은 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계;

(b): 단계 (a)의 변이체 폴리펩티드를 생성 및 단리하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 서열 동일성이 적어도 85%, 95%, 97%, 98% 또는 적어도 99%일 수 있다.

또 다른 바람직한 일 구체예에서, 본 발명은 단리된 키모신 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것으로, 여기서 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환: D59, V309, S132, N249, L166, N249, Q56, M157, M256, R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, S273, Q280, F282, L295, N252, R254, Q294, G70, V136, L222, K231, N291, 예컨대 D59N, V309I, S132A, N249E, L166V, N249D, Q56H, M157L, M256L, R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, Q294E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q 중 하나 이상을 포함한다.

또 다른 일 구체예에서, 본 발명은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법에 관한 것으로, 여기서:

(a) 변이체는 다음의 치환 조합:

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;

Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;

Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;

Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;

Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;

H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;

D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;

K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;

D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;

H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;

Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;

H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;

D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;

Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;

K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;

K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;

H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;

K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;

K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;

I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;

R242E, N252D, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, Q280E, N100Q, N291Q;

R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;

R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;

R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;

R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;

R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N 또는

R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q

중 하나 이상을 포함하며, 여기서 각 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정된다.

또 다른 관련 일 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 제조 단계들을 추가로 수행하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것으로, 특히 여기서 식품 또는 사료 제품은 본 발명의 키모신 폴리펩티드를 포함하는 우유-기반 제품 또는 식품 또는 사료 제품이다.

또 다른 관련 일 측면에서, 본 발명은 우유 기반 제품, 예컨대 치즈, 예컨대 파스타필라타, 체다, 콘티넨탈 타입 치즈, 연질 치즈 또는 화이트 브라인 치즈의 제조 공정에서의 본 발명에 따른 키모신 폴리펩티드 변이체에 관한 것이다.

상기 논의된 바와 같이 - 본원에 기재된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 당해 기술분야에 따라 - 예컨대, 관심 있는 우유 기반 제품 (예컨대, 치즈 제품)을 제조하기 위하여 사용될 수 있다.

상기 논의된 바와 같이 - 본 발명의 일 측면은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 제조 단계들을 추가로 수행하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 식품 또는 사료 제품은 우유-기반 제품이고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 우유에 첨가하고 우유 기반 제품을 얻기 위한 제조 단계들을 추가로 수행하는 것을 포함한다.

우유는 예컨대 두유, 양 우유, 염소 우유, 버팔로 우유, 야크 우유, 라마 우유, 낙타 우유 또는 암소 우유일 수 있다.

우유 기반 제품은 예컨대 크박(quark) 또는 치즈와 같은 발효유제품일 수 있다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이, 증식, 정제, 시험 및 처리는 효소의 성능 및 이에 따라 본 발명의 효소에도 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명은 키모신 폴리펩티드 변이체, 이들의 제조 방법 및 이들을 함유하는 제품의 제조 방법에 관한 것으로, 여기서 키모신 폴리펩티드 변이체는 비슷한 조건하에서, 바람직하게는 비슷한 조건하에서 생성되고 처리된 후의 상응하는 모체 폴리펩티드와 비교할 때 개선된 응고 활성 및/또는 C/P 비율을 갖는다.

실시예

실시예 1: 키모신 단백질 서열 및 변이체 서열의 정렬 및 넘버링

키모신 단백질 서열을 EBI (EBI, 툴, 다중 서열 정렬, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)에 의해 제공되고, 문헌 Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Val-entin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948에 기재된 ClustalW 알고리즘을 사용하여 정렬하였다.

다중 서열 정렬을 위한 ClustalW2 설정은, Protein weight Matrix = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION = 0.5, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ 이었다.

레퍼런스 서열로서 소 키모신 B 프리프로키모신을 사용하였고 (Genbank 수탁 번호 P00794 - 본원에 SEQ ID NO: 1로 개시됨), 여기서 N-말단 메티오닌은 번호 1 (MRCL......)을 갖고 C-말단 이소류신 (단백질 서열에서 …LAKAI)은 번호 381을 갖는다. 변이체들을 소 B 프리-프로-키모신에 대해 정렬하였고, 잔기들은 상응하는 소 키모신 잔기에 따라 넘버링하였다.

실시예 2: 키모신 변이체의 설계

키모신 변이체를 상이한 전략들을 사용하여 설계하였다.

낙타 키모신에 대해 언급할 때, 본원에서 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드를 포함하는 낙타 키모신을 언급한다.

SEQ ID NO: 2의 낙타 키모신은 그의 낙타 키모신 변이체를 제조하는데 사용되는 키모신 활성을 갖는 본원 관련 모체 폴리펩티드로 볼 수 있다.

소 키모신에 대해 언급할 때, 본원에서 SEQ ID NO: 1의 폴리펩티드를 포함하는 소 키모신을 언급한다. SEQ ID NO: 1의 소 키모신은 그의 소 키모신 변이체를 제조하는데 사용되는 키모신 활성을 갖는 관련 모체 폴리펩티드로 볼 수 있다.

낙타 키모신의 변이체 180 내지 269 및 367 내지 461을 소 키모신 B와 비교하여 동일성이 25% 이상인 대규모의 공지된 아스파르트산 프로테아제 서열 세트의 정렬에 기초하여 설계하였다.

변이는 일반적으로 종 간 아미노산 변이 수준이 높은 지역에서 도입되었고, 보존 지역은 변하지 않았다. 아미노산 치환은 고유 응고 활성 및 C/P 비율에 유익한 효과를 나타내는 높은 확률의 변화를 확인하기 위하여, 계통발생학적, 구조적 및 실험적 정보에 기초하여 선택하였다. 다중 변이가 각 변이체 구조에 도입되어, 각 단일 돌연변이가 다중 변이체 구조에 존재하도록 하여 다양한 치환 간의 공변이(covariation)의 영향을 최소화하였다. 실험적 데이터의 통계적 분석 및 기계 학습을 아미노산 치환의 상대적 기여를 탐지하기 위해 사용하여, 키모신 변이체의 응고 성능을 측정하였다 (참조 문헌 14, 15).

변이체 271 내지 366을 소 키모신 (PDB 코드: 4AA8) 및 낙타 키모신 (PDB 코드: 4AA9)의 상세한 구조 분석에 기초하여 설계하였다. 변이는 각 아미노산 측쇄의 화학적 성질 및 카제인 기질 결합 또는 일반 효소 특성에 대한 이들의 예상되는 영향에 기초하여 선택하였다. 변이체 271 내지 346에서, 대부분의 아미노산 치환은 기질 결합 틈 내 또는 구조적으로 아주 인접한, 또는 결합 카제인 기질과 접촉하는 2차 구조 요소의 서열 위치에서 만들어졌다. 또한, 변화는 이들 영역의 전하 프로파일을 변경하는 단백질 표면의 위치에서 만들어졌으며 (참조 문헌 5), 따라서 효소 성능에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 변이체 347 내지 366은 소 및 낙타 키모신의 N-말단 서열의 상이한 구조적 형태에 기초하여 만들어졌다. 아미노산 치환은 낙타 키모신의 N-말단과 상호 작용하는 기질 결합 틈 내의 위치에서 만들어졌다.

실시예 3: 키모신 변이체 효소 물질의 제조

모든 키모신 변이체는 합성 유전자로서 합성하였고, 예컨대 pGAMpR-C와 같은 균류 발현 벡터에 클로닝하였다 (WO02/36752A2에 기재됨).

벡터를 대장균에 형질 전환시키고 플라스미드 DNA를 통상의 기술자에게 공지된 표준 분자 생물학 프로토콜을 사용하여 정제하였다.

변이체 플라스미드를 개별적으로 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 또는 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 균주에 형질 전환시키고 단백질을 WO02/36752A2에 기재된 바와 같이 본질적으로 제조하고 표준 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제하였다. 효소 라이브러리 스크리닝을 위하여, 모든 키모신 변이체를 20-60 mL 발효물에서 생성하였다. 변이체 433, 436, 453 및 457를 보다 상세하게 특성화하기 위하여, 각 효소를 70 L 스케일에서 다시 발효시켰다.

당해 기술분야에 공지된 바와 같이 - 통상의 기술자는 그의 일반 상식에 기초하여, 키모신 및 키모신 변이체 - 예컨대, 본원에 기재된 소 및 낙타 키모신 변이체를 생성 및 정제할 수 있다.

실시예 4: 고유 키모신 활성의 탐지

4.1 우유 응고 활성의 탐지

우유 응고 활성은 국제낙농연맹에 의해 개발된 표준 방법인 (IDF 방법), REMCAT 방법을 사용하여 탐지하였다.

우유 응고 활성은 리터 당 0.5 g의 염화칼슘 용액 (pH

6.5)으로 저열, 저지방 분유로부터 제조된 표준 우유 기질의 가시적 응집에 필요한 시간으로부터 탐지된다. 레닛 샘플의 응고 시간을, 공지된 우유-응고 활성을 갖고 샘플과 동일한 IDF 표준 110B에 따른 효소 조성을 갖는 레퍼런스 표준의 응고 시간과 비교하였다. 샘플 및 레퍼런스 표준을 동일한 화학적 및 물리적 조건하에서 측정하였다. 변이체 샘플을 pH 5.5의 84 mM 아세트산 완충액을 사용하여 약 3 IMCU/ml로 조정하였다. 이후, 20 μl의 효소 제조물을, 일정한 교반하에서 32℃ ± 1℃의 일정한 온도를 유지할 수 있는 수조 내에 놓인 유리 시험관에서 예열된 1 ml의 우유 (32℃에 첨가하였다.

레닛의 총 우유-응고 활성 (강도)은 다음의 공식에 따라 샘플과 동일한 효소 조성을 갖는 표준과 비교하여 ml 당 국제 우유-응고 단위 (IMCU)로 계산하였다:

강도 (IMCU/ml) = S표준 x T표준 x D샘플

D표준 x T샘플

S표준: 레닛에 대한 국제 레퍼런스 표준의 우유-응고 활성.

T표준: 표준 희석물에 대해 얻은 응고 시간 (초).

D샘플: 샘플에 대한 희석 인자

D표준: 표준에 대한 희석 인자

구조적 설계에 의한 변이체들뿐만 아니라 라이브러리 1 및 3 변이체의 응고 활성 탐지를 위하여, REMCAT 방법 대신 μIMCU 방법을 사용하였다. REMCAT과 비교하여, μIMCU 분석에서 키모신 변이체의 응집 시간은 UV/VIS 플레이트 판독기의 800nm에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트에서의 OD 측정에 의해 탐지하였다. 공지된 응고 강도를 갖는 레퍼런스 표준의 다양한 희석 표준 곡선을 각 플레이트상에 기록하였다. 샘플은 효소를 84 mM 아세테이트 완충액, 0.1% 트리톤 X-100, pH 5.5로 희석함으로써 제조하였다. 32℃에서의 반응은 4% (w/w) 저열, 저지방 분유 및 7.5% (w/w) 염화칼슘 (pH

6.5)을 함유한 표준 우유 기질 250 uL를 25 uL의 효소 샘플에 첨가함으로써 개시하였다. ml 당 국제 우유-응고 단위 (IMCU)의 키모신 변이체의 우유 응고 활성은 표준 곡선에 대한 샘플 응집 시간에 기초하여 탐지하였다.

4.2 총 단백질 함량의 탐지

총 단백질 함량은 Thermo Scientific사의 Pierce BCA Protein Assay Kit를 제공 회사의 지시에 따라 사용하여 탐지하였다.

4.3 고유 응고 활성의 계산

고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)은 응고 활성 (IMCU/ml)을 총 단백질 함량 (mg 총 단백질/ml)으로 나눔으로써 탐지하였다.

실시예 5 단백질 분해 활성의 탐지

일반 단백질 분해 활성을 형광 표지된 Bodipy-FL 카제인을 기질로 사용하여 측정하였다 (EnzChek; Molecular Bioprobes, E6638). pH-비감수성 녹색-형광 Bodipy-FL로 과하게 표지된 카제인 유도체는 컨쥬게이트의 형광을 퀀칭시킨다. 프로테아제 촉매 가수분해는 형광 Bodipy-FL을 방출한다. 이 방법은 매우 민감하며, CHYMAX M이 현재까지 공지된 모든 응고제 중 가장 낮은 일반 단백질 분해 활성을 갖기 때문에 이 실험에 필수적이었다.

0.04 mg/ml 기질 용액을 100 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.1% Brij를 함유하는 0.2 M 인산 완충액 pH 6.5에서 제조하였다. 키모신 변이체는 100 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.1% Brij를 함유하는 20 mM 말론산 완충액에 용해시켰다. 기질 및 키모신 변이체 용액 모두의, 20 μL를 블랙 384-웰 Corning 플랫 바텀 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 혼합하고, 형광계에서 32℃에서 10 시간 동안 연속적으로 형광을 기록하였다. 형광 변화의 선형 부분의 기울기는 일반 단백질 분해 활성을 탐지하는 데 사용되었다.

실시예 6 고유 응고 활성 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석

다중 치환 라이브러리 1 내지 3에 존재하는 모든 단일 돌연변이의 위치 Phe105 및 Met106 사이의 κ카제인 절단에 대한 효과, 즉 고유 우유 응고 활성뿐만 아니라, 응고 및 일반 단백질 분해 활성의 비율 (C/P)에 대한 효과를 탐지하기 위하여 통계적 기계-학습 접근법 및 PCA-기반 분석을 사용하였다.

결과

다중-치환 라이브러리 1

야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 갖는 낙타 키모신의 변이체를 전술한 바와 같이 생성 및 분석하였다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이를 제외하고, 낙타 키모신 (SEQ ID NO: 2)과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 레퍼런스로 포함되었다.

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 1: 낙타 키모신 변이체 180-222의 효소 활성. 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.

표 1에는 낙타 키모신 변이체들이 고유 응고 활성 (C), 비특이적 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 비율에 대한 데이터와 함께 제시되어 있다. 43 가지 변이체 중 17 가지가 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 10% 내지 50% 증가한 고유 응고 활성을 나타냈다. 모든 변이체들은 C/P 비율이 유의하게 증가하였는데, 가장 크게 증가한 변이체는 야생형 낙타 키모신과 비교하여 ca. 15x 향상을 나타낸 190이었다.

다중-치환 라이브러리 1의 돌연변이 분석

고유 응고 활성 (C) 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석을 라이브러리 1의 단백질 분해 데이터에 기초하여 수행하였다. 증가된 고유 응고 및 C/P에 대한 가장 유익한 돌연변이를 표 2 및 표 3에 각각 나타냈다.

표 2: 통계적 분석에 기초한 증가된 고유 응고 활성에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

표 2에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 K19T , D59N , I96L , S132A , L222I , R242E, N249D , S273Y 및 V309I는 키모신의 고유 응고 활성을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 치즈의 제조에서 키모신을 보다 적게 투여할 수 있도록 할 것으로 예상된다.

표 3: 통계적 분석에 기초한 증가된 C/P 비율에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

표 3에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 H76Q , I96L , S164G , R242E , G251D 및 S273Y는 키모신의 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 각 키모신 변이체를 사용하는 치즈 제조 동안 수율을 증가시킬 것으로 예상된다.

다중-치환 라이브러리 2

야생형과 비교하여 각각 다중 치환을 갖는 낙타 키모신 변이체의 또 다른 세트를 전술한 바와 같이 생성 및 분석하였다. 모든 변이체는 표에서 언급된 변이를 제외하고, 낙타 키모신 (SEQ ID NO: 2)과 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 낙타 키모신 (CHY-MAX M)은 레퍼런스로 포함되었다.

응고 활성을 REMCAT 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 4: 낙타 키모신 변이체 223-269의 효소 활성. 숫자는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)의 % 절단으로 주어진다.

표 4에는 낙타 키모신 변이체들이 고유 응고 활성 (C), 비특이적 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 비율에 대한 데이터와 함께 제시되어 있다. 47 가지 변이체 중 8 가지가 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 10% 내지 78% 증가한 고유 응고 활성을 나타냈다. 43 가지 변이체들이 C/P 비율이 유의하게 증가하였는데, 가장 크게 증가한 변이체는 야생형 낙타 키모신과 비교하여 ca. 33x 향상을 나타낸 253이었다.

다중-치환 라이브러리 2의 돌연변이 분석

고유 응고 활성 (C) 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석을 라이브러리 2의 단백질 분해 데이터에 기초하여 수행하였다. 증가된 고유 응고 및 C/P에 대한 가장 유익한 돌연변이를 표 5 및 표 6에 각각 나타냈다.

표 5: 통계적 분석에 기초한 증가된 고유 응고 활성에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

표 5에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 D59N , H76Q , L166V , L222I , R242E, N249D , N249E 및 S273Y는 키모신의 고유 응고 활성을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 치즈의 제조에서 키모신을 보다 적게 투여할 수 있도록 할 것으로 예상된다.

표 6: 통계적 분석에 기초한 증가된 C/P 비율에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

표 6에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 Y11I , Y11V , K19T , H76Q , I96L , S164G, L166I , L222V , R242D , R242E , G251D 및 S273Y는 키모신의 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 각 키모신 변이체를 사용하는 치즈 제조 동안 수율을 증가시킬 것으로 예상된다.

낙타 키모신의 구조-기반 변이

단백질 구조 분석에 의해 탐지된 위치에 아미노산 변화를 갖는 낙타 키모신 (SEQ ID NO: 2)의 변이체를 제조하였다 (표 7). 돌연변이 N100Q 및 N291Q를 이들 변이체 및 레퍼런스 낙타 키모신 (CamUGly)의 N-글리코실화 부위 모두에 도입하여 비-글리코실화된, 균질한 단백질 샘플을 수득하였다.

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 7: 낙타 키모신 변이체 271-308의 효소 활성. 숫자는 비- 글리코실화된 낙타 키모신 ( CamUGly )의 % 절단으로 주어진다.

표 7에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 Y21S , S74D , R242E , Y243E , N249D, G251D , S273D , Q280E , F282E 및 L295K는 키모신의 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 돌연변이 R242E 및 N249D는 또한 고유 응고 활성을 증가시킨다. 표 7에 나타낸 증가된 C/P 비율을 갖는 10 가지 변이체 중 7 가지는 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 결합 틈에 인접한 단백질 표면의 별개의 영역에서 돌연변이를 일으킨다 (R242E, N249D, G251D, Y243E, S273D, Q280E, F282E). 이 영역은 위치 P10 내지 P4에서 (참조 문헌 10) 양으로 하전된 서열 Arg96 내지 His102 (참조 문헌 5, 16-18)와 상호 작용함으로써 κ카제인 기질의 결합을 돕는 것으로 제안되었다. 돌연변이와 도입된 음전하는 이들 상호 작용을 강화시켜, κ카제인에 대한 특이성 (C/P)을 증가시킬 수 있다. 그 결과는 이 영역에서 단일 아미노산 치환이 C/P를 유의하게 증가시킬 수 있음을 보여준다.

낙타 키모신의 음전하 조합

전술한 표면 영역에 음전하를 도입하는 돌연변이 (R242E, Y243E, G251D, N252D, R254E, S273D, Q280E)의 조합으로 낙타 키모신 (SEQ ID NO: 2)의 변이체를 추가로 생성하였다. 돌연변이 N100Q 및 N291Q를 이들 변이체 및 레퍼런스 낙타 키모신 (CamUGly)의 N-글리코실화 부위 모두에 도입하여 비-글리코실화된, 균질한 단백질 샘플을 수득하였다.

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 8: 낙타 키모신 변이체 309-323의 효소 활성. 숫자는 비- 글리코실화된 낙타 키모신 ( CamUGly )의 % 절단으로 주어진다.

표 8에 나타낸 모든 변이체는 비-글리코실화된 낙타 키모신과 비교하여 C/P 비율이 증가하였다. 이들 변이체 중 몇 가지 (309, 310, 321, 322, 323)는 단일 음전하 돌연변이를 갖는 최상의 변이체 (286) 보다도 C/P가 훨씬 높았다. 키모신 구조상의 P10-P4 상호 작용 영역에 음전하를 도입함으로써 유발되는 C/P-증가 효과는, 각 돌연변이의 조합에 의해 더욱 증강될 수 있다고 결론지어진다.

소 키모신의 구조-기반 변이

단백질 구조 분석에 의해 탐지된 위치에 아미노산 변화를 갖는 소 키모신 (SEQ ID NO: 1)의 변이체를 제조하였다 (표 9). 돌연변이 N252Q 및 N291Q를 이들 변이체 및 레퍼런스 소 키모신 (BovUGly)의 N-글리코실화 부위 모두에 도입하여 비-글리코실화된, 균질한 단백질 샘플을 수득하였다.

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 9: 소 키모신 변이체 325-346의 효소 활성. 숫자는 비- 글리코실화된 소 키모신 ( BovUGly )의 % 절단으로 주어진다.

표 9의 데이터는 변이 Q56H , Y134G 및 K295L가 고유 응고 활성을 증가시키고, 변이 H292N 및 Q294E가 C/P 비율 증강시킨다는 것을 입증한다. H292 및 Q294는 모두 기질 결합 틈을 부분적으로 덮고 있는 루프 내에 위치하며 (도 3), 이는 카제인 기질 특이성 (C/P)에 대한 이들 위치에서의 각 돌연변이의 관찰된 영향을 설명한다. 특히, 치환 H292N은 소 키모신의 C/P를 증가시키고 D249N 및 K295L은 C/P를 감소시키는 한편, 낙타 키모신의 C/P에 대하여는 각각의 역돌연변이(reverse mutations) N292H, N249D, L295K에 의한 반대 효과가 관찰되었다 (표 7). 이는 이들 아미노산 변화가 종 전체에 걸쳐 키모신 특이성에 대하여 유사한 효과를 발휘한다는 것을 입증한다.

낙타 키모신 N-말단의 변이

기질 결합 틈 내 N-말단 서열 Y11-D13의 분자적 상호 작용에 대한 단백질 구조 분석에 의해 탐지된 위치에 아미노산 변화를 갖는 낙타 키모신 (SEQ ID NO: 2)의 변이체를 제조하였다 (표 10). 돌연변이 N100Q 및 N291Q를 이들 변이체 및 레퍼런스 낙타 키모신 (CamUGly)의 N-글리코실화 부위 모두에 도입하여 비-글리코실화된, 균질한 단백질 샘플을 수득하였다.

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 10: 낙타 키모신 변이체 347-366의 효소 활성. 숫자는 비- 글리코실화된 낙타 키모신 ( CamUGly )의 % 절단으로 주어진다.

낙타 키모신 구조의 분석은 N-말단 서열 Y11-D13 및 Y11의 잠재적 상호 작용 파트너인 위치 D290에서의 변이를 유도하였다 (도 4). 카제인 기질이 결합 틈 내에서의 결합을 위해 N-말단 키모신 서열과 경쟁하기 때문에, 결합 틈과 모티프 Y11-D13 사이의 상호 작용을 변화시키는 아미노산 치환은 다양한 카제인 기질에 대한 효소 활성, 및 이에 따른 C/P 비율에 영향을 줄 것으로 예상된다. 각 변이체 347-366의 결과는 고유 응고 활성 및 C/P 모두의 강력한 변이를 나타낸다. 특히, 변이체 353 및 355는 C/P 비율이 증가되었다. 따라서, 아미노산 치환 Y11I 및 Y11V는 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 키모신 결합 틈은 주로 소수성 아미노산으로 구성되어 있기 때문에 (참조 문헌 9), 두 돌연변이는 모두 증강된 소수성 상호 작용에 의한 결합 틈에서 N-말단의 결합을 향상시킬 수 있으며, 이에 따라, 카제인의 비특이적 결합 및 가수분해 (P)를 억제할 수 있다.

다중-치환 라이브러리 3

응고 활성을 μIMCU 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 11: 낙타 키모신 변이체 367-416의 효소 활성. 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.

표 11에는 낙타 키모신 변이체들이 고유 응고 활성 (C), 비특이적 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 비율에 대한 데이터와 함께 제시되어 있다. 50 가지 변이체 중 6 가지가 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 10% 내지 29% 증가한 고유 응고 활성을 나타냈다. 23 가지 변이체들이 C/P 비율이 10% 이상 증가하였는데, 가장 크게 증가한 변이체는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 ca. 6x 향상을 나타낸 411이었다.

다중-치환 라이브러리 3의 돌연변이 분석

고유 응고 활성 (C) 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석을 라이브러리 3의 단백질 분해 데이터에 기초하여 수행하였다. 증가된 응고 및 C/P에 대한 가장 유익한 돌연변이를 표 12 및 표 13에 각각 나타냈다.

표 12: 통계적 분석에 기초한 증가된 응고 활성에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

돌연변이	평균	sd
R242E	4.63E-01	4.21E-02
I96L	2.31E-01	4.82E-02
N291Q	1.67E-01	3.97E-02
K231N	1.34E-01	3.52E-02
M256L	1.28E-01	4.44E-02
S132A	1.04E-01	3.35E-02
M157L	7.99E-02	3.49E-02

표 12에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 I96L , S132A , M157L , K231N , R242E, M256L 및 N291Q는 키모신의 고유 응고 활성을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 치즈의 제조에서 키모신을 보다 적게 투여할 수 있도록 할 것으로 예상된다.

표 13: 통계적 분석에 기초한 증가된 C/P 비율에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

돌연변이	평균	sd
R242E	6.66E-01	4.23E-02
G70D	3.32E-01	5.72E-02
Y11V	2.06E-01	3.61E-02
K231N	1.45E-01	2.92E-02
L222I	1.09E-01	3.71E-02
V136I	1.02E-01	4.53E-02
I96L	9.84E-02	6.02E-02
N291Q	4.78E-02	4.20E-02

표 13에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 Y11V , G70D , I96L , V136I , L222I, K231N , R242E 및 N291Q는 키모신의 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 각 키모신 변이체를 사용하는 치즈 제조 동안 수율을 증가시킬 것으로 예상된다.

다중-치환 라이브러리 4

응고 활성을 REMCAT 방법을 사용하여 탐지하였다.

표 14: 낙타 키모신 변이체 417-461의 효소 활성. 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.

표 14에는 낙타 키모신 변이체들이 고유 응고 활성 (C), 비특이적 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 비율에 대한 데이터와 함께 제시되어 있다. 45 가지 변이체 중 11 가지가 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 14% 내지 53% 증가한 고유 응고 활성을 나타냈다. 45 가지 변이체들이 모두 C/P 비율이 10% 이상 증가하였는데, 가장 크게 증가한 변이체는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 ca. 17x 향상을 나타낸 450이었다.

다중-치환 라이브러리 4의 돌연변이 분석

고유 응고 활성 (C) 및 C/P 비율에 대한 위치 및 돌연변이 효과의 통계적 분석을 라이브러리 4의 단백질 분해 데이터에 기초하여 수행하였다. 증가된 응고 및 C/P에 대한 가장 유익한 돌연변이를 표 15 및 표 16에 각각 나타냈다.

표 15: 통계적 분석에 기초한 증가된 응고 활성에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

돌연변이	평균	sd
D59N	3.99E-01	3.48E-02
L222I	2.05E-01	2.64E-02
L166V	1.92E-01	2.39E-02
N249E	1.45E-01	1.88E-02
G251D	9.79E-02	2.29E-02
Y11V	8.54E-02	1.56E-02
R242E	5.14E-02	2.06E-02

표 15에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 Y11V , D59N , L166V , L222I , R242E, N249E 및 G251D는 키모신의 고유 응고 활성을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 치즈의 제조에서 키모신을 보다 적게 투여할 수 있도록 할 것으로 예상된다.

표 16: 통계적 분석에 기초한 증가된 C/P 비율에 대한 돌연변이 기여 (평균) 및 표준 편차 (sd).

돌연변이	평균	sd
S164G	7.51E-01	4.50E-02
K19T	2.85E-01	4.93E-02
I96L	2.43E-01	4.16E-02
R242E	2.25E-01	7.12E-02
L253I	2.22E-01	4.61E-02
Y11I	1.30E-01	4.93E-02
N249E	9.52E-02	3.86E-02
Y11V	9.49E-02	3.55E-02

표 16에 나타낸 결과에 기초하여, 돌연변이 Y11I , Y11V , K19T , I96L , S164G , R242E, N249E 및 L253I는 키모신의 C/P 비율을 증가시키는 것으로 결론지어진다. 결과적으로, 이들 돌연변이는 각 키모신 변이체를 사용하는 치즈 제조 동안 수율을 증가시킬 것으로 예상된다. 다중-치환 라이브러리 4로부터 선택되는 변이체들을 70 L에서 다시 발효한 후 정제하고 이들의 단백질 분해 프로파일에 관하여 특성화하였다 (표 17).

표 17: 70 L 발효로부터의 낙타 키모신 변이체의 효소 활성. 숫자는 야생형 낙타 키모신 ( CHY -MAX M)의 % 절단으로 주어진다.

표 17에는 70 L 발효로부터의 낙타 키모신 변이체들이 고유 응고 활성 (C), 비특이적 단백질 분해 활성 (P) 및 C/P 비율에 대한 데이터와 함께 제시되어 있다. 4 가지 변이체 모두 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 51% 내지 117% 증가한 고유 응고 활성을 나타냈다. 4 가지 변이체들이 모두 C/P 비율이 13-배 이상 증가하였는데, 가장 크게 증가한 변이체는 야생형 낙타 키모신 (CHY-MAX M)과 비교하여 ca. 30x 향상을 나타낸 457이었다.

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SEQUENCE LISTING <110> Chr. Hansen A/S <120> Variants of chymosin with improved milk-clotting properties <130> P6081PC00 <160> 5 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 969 <212> DNA <213> Camelus <400> 1 gggaaggtgg ccagggaacc cctgaccagc tacctggata gtcagtactt tgggaagatc 60 tacatcggga ccccacccca ggagttcacc gtggtgtttg acactggctc ctctgacctg 120 tgggtgccct ctatctactg caagagcaat gtctgcaaaa accaccaccg ctttgacccg 180 agaaagtcgt ccaccttccg gaacctgggc aagcccctgt ccatccatta cggcacgggc 240 agcatggagg gctttctggg ctacgacacc gtcaccgtct ccaacattgt ggaccccaac 300 cagactgtgg gcctgagcac cgagcaacct ggcgaggtct tcacctactc cgagtttgac 360 gggatcctgg ggctggccta cccctcgctt gcctccgagt actcggtgcc cgtgtttgac 420 aatatgatgg acagacacct ggtggcccga gacctgttct cggtttacat ggacaggaat 480 ggccagggga gcatgcttac actgggggcc attgacccgt cctactacac cggctccctg 540 cactgggtgc ccgtgacctt gcagcagtac tggcagttca ccgtggacag tgtcaccatc 600 aacggggtgg cagtggcctg tgttggtggc tgtcaggcca tcctggacac gggtacctcc 660 gtgctgttcg ggcccagcag cgacatcctc aaaattcaga tggctattgg agccacagag 720 aaccgatatg gtgagtttga cgtcaactgt gggaacctga ggagcatgcc caccgtggtc 780 ttcgagatca atggcagaga ctacccactg tccccctccg cctacacaag caaggaccag 840 ggcttctgca ccagtggctt tcaaggtgac aacaattccg agctgtggat cctgggggat 900 gtcttcatcc gggagtatta cagtgtcttt gacagggcca acaatcgcgt ggggctggcc 960 aaggccatc 969 <210> 2 <211> 323 <212> PRT <213> Camelus <400> 2 Gly Lys Val Ala Arg Glu Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Gly Lys Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val 20 25 30 Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys 35 40 45 Ser Asn Val Cys Lys Asn His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Thr Phe Arg Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly 65 70 75 80 Ser Met Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile 85 90 95 Val Asp Pro Asn Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu 100 105 110 Val Phe Thr Tyr Ser Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro 115 120 125 Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp 130 135 140 Arg His Leu Val Ala Arg Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn 145 150 155 160 Gly Gln Gly Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr 165 170 175 Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln 180 185 190 Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val 195 200 205 Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly 210 215 220 Pro Ser Ser Asp Ile Leu Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu 225 230 235 240 Asn Arg Tyr Gly Glu Phe Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met 245 250 255 Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro 260 265 270 Ser Ala Tyr Thr Ser Lys Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln 275 280 285 Gly Asp Asn Asn Ser Glu Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg 290 295 300 Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala 305 310 315 320 Lys Ala Ile <210> 3 <211> 323 <212> PRT <213> Bos <400> 3 Gly Glu Val Ala Ser Val Pro Leu Thr Asn Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr 1 5 10 15 Phe Gly Lys Ile Tyr Leu Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Leu 20 25 30 Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys 35 40 45 Ser Asn Ala Cys Lys Asn His Gln Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser 50 55 60 Thr Phe Gln Asn Leu Gly Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly 65 70 75 80 Ser Met Gln Gly Ile Leu Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile 85 90 95 Val Asp Ile Gln Gln Thr Val Gly Leu Ser Thr Gln Glu Pro Gly Asp 100 105 110 Val Phe Thr Tyr Ala Glu Phe Asp Gly Ile Leu Gly Met Ala Tyr Pro 115 120 125 Ser Leu Ala Ser Glu Tyr Ser Ile Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asn 130 135 140 Arg His Leu Val Ala Gln Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn 145 150 155 160 Gly Gln Glu Ser Met Leu Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr 165 170 175 Thr Gly Ser Leu His Trp Val Pro Val Thr Val Gln Gln Tyr Trp Gln 180 185 190 Phe Thr Val Asp Ser Val Thr Ile Ser Gly Val Val Val Ala Cys Glu 195 200 205 Gly Gly Cys Gln Ala Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Lys Leu Val Gly 210 215 220 Pro Ser Ser Asp Ile Leu Asn Ile Gln Gln Ala Ile Gly Ala Thr Gln 225 230 235 240 Asn Gln Tyr Gly Glu Phe Asp Ile Asp Cys Asp Asn Leu Ser Tyr Met 245 250 255 Pro Thr Val Val Phe Glu Ile Asn Gly Lys Met Tyr Pro Leu Thr Pro 260 265 270 Ser Ala Tyr Thr Ser Gln Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln 275 280 285 Ser Glu Asn His Ser Gln Lys Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg 290 295 300 Glu Tyr Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala Asn Asn Leu Val Gly Leu Ala 305 310 315 320 Lys Ala Ile <210> 4 <211> 1095 <212> DNA <213> Camelus <400> 4 agtgggatca ccaggatccc tctgcacaaa ggcaagactc tgagaaaagc gctgaaggag 60 cgtgggctcc tggaggactt tctgcagaga caacagtatg ccgtcagcag caagtactcc 120 agcttgggga aggtggccag ggaacccctg accagctacc tggatagtca gtactttggg 180 aagatctaca tcgggacccc accccaggag ttcaccgtgg tgtttgacac tggctcctct 240 gacctgtggg tgccctctat ctactgcaag agcaatgtct gcaaaaacca ccaccgcttt 300 gacccgagaa agtcgtccac cttccggaac ctgggcaagc ccctgtccat ccattacggc 360 acgggcagca tggagggctt tctgggctac gacaccgtca ccgtctccaa cattgtggac 420 cccaaccaga ctgtgggcct gagcaccgag caacctggcg aggtcttcac ctactccgag 480 tttgacggga tcctggggct ggcctacccc tcgcttgcct ccgagtactc ggtgcccgtg 540 tttgacaata tgatggacag acacctggtg gcccgagacc tgttctcggt ttacatggac 600 aggaatggcc aggggagcat gcttacactg ggggccattg acccgtccta ctacaccggc 660 tccctgcact gggtgcccgt gaccttgcag cagtactggc agttcaccgt ggacagtgtc 720 accatcaacg gggtggcagt ggcctgtgtt ggtggctgtc aggccatcct ggacacgggt 780 acctccgtgc tgttcgggcc cagcagcgac atcctcaaaa ttcagatggc tattggagcc 840 acagagaacc gatatggtga gtttgacgtc aactgtggga acctgaggag catgcccacc 900 gtggtcttcg agatcaatgg cagagactac ccactgtccc cctccgccta cacaagcaag 960 gaccagggct tctgcaccag tggctttcaa ggtgacaaca attccgagct gtggatcctg 1020 ggggatgtct tcatccggga gtattacagt gtctttgaca gggccaacaa tcgcgtgggg 1080 ctggccaagg ccatc 1095 <210> 5 <211> 365 <212> PRT <213> Camelus <400> 5 Ser Gly Ile Thr Arg Ile Pro Leu His Lys Gly Lys Thr Leu Arg Lys 1 5 10 15 Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Leu Glu Asp Phe Leu Gln Arg Gln Gln 20 25 30 Tyr Ala Val Ser Ser Lys Tyr Ser Ser Leu Gly Lys Val Ala Arg Glu 35 40 45 Pro Leu Thr Ser Tyr Leu Asp Ser Gln Tyr Phe Gly Lys Ile Tyr Ile 50 55 60 Gly Thr Pro Pro Gln Glu Phe Thr Val Val Phe Asp Thr Gly Ser Ser 65 70 75 80 Asp Leu Trp Val Pro Ser Ile Tyr Cys Lys Ser Asn Val Cys Lys Asn 85 90 95 His His Arg Phe Asp Pro Arg Lys Ser Ser Thr Phe Arg Asn Leu Gly 100 105 110 Lys Pro Leu Ser Ile His Tyr Gly Thr Gly Ser Met Glu Gly Phe Leu 115 120 125 Gly Tyr Asp Thr Val Thr Val Ser Asn Ile Val Asp Pro Asn Gln Thr 130 135 140 Val Gly Leu Ser Thr Glu Gln Pro Gly Glu Val Phe Thr Tyr Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Pro Ser Leu Ala Ser Glu Tyr 165 170 175 Ser Val Pro Val Phe Asp Asn Met Met Asp Arg His Leu Val Ala Arg 180 185 190 Asp Leu Phe Ser Val Tyr Met Asp Arg Asn Gly Gln Gly Ser Met Leu 195 200 205 Thr Leu Gly Ala Ile Asp Pro Ser Tyr Tyr Thr Gly Ser Leu His Trp 210 215 220 Val Pro Val Thr Leu Gln Gln Tyr Trp Gln Phe Thr Val Asp Ser Val 225 230 235 240 Thr Ile Asn Gly Val Ala Val Ala Cys Val Gly Gly Cys Gln Ala Ile 245 250 255 Leu Asp Thr Gly Thr Ser Val Leu Phe Gly Pro Ser Ser Asp Ile Leu 260 265 270 Lys Ile Gln Met Ala Ile Gly Ala Thr Glu Asn Arg Tyr Gly Glu Phe 275 280 285 Asp Val Asn Cys Gly Asn Leu Arg Ser Met Pro Thr Val Val Phe Glu 290 295 300 Ile Asn Gly Arg Asp Tyr Pro Leu Ser Pro Ser Ala Tyr Thr Ser Lys 305 310 315 320 Asp Gln Gly Phe Cys Thr Ser Gly Phe Gln Gly Asp Asn Asn Ser Glu 325 330 335 Leu Trp Ile Leu Gly Asp Val Phe Ile Arg Glu Tyr Tyr Ser Val Phe 340 345 350 Asp Arg Ala Asn Asn Arg Val Gly Leu Ala Lys Ala Ile 355 360 365

Claims

단리된 키모신 폴리펩티드 변이체로서,
(a) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 고유 응고 활성의 적어도 110%인 고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)을 갖고, 및/또는
(b) 상기 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 C/P 비율의 적어도 200%인 C/P 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제1항에 있어서, 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 서열 동일성이 적어도 80%, 예컨대 적어도 82%, 85%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 모체 펩티드의 고유 응고 활성의 적어도 110%의 고유 응고 활성 (IMCU/mg 총 단백질)을 가지며, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 위치: Y11, S164, L253, R242, L222, D59, S273, K19, V309, S132, N249, I96, L166, H76, G251, Q280, Q56, M157, K231, M256, N291 중 하나 이상의 (여러) 위치에서의 치환을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제3항에 있어서, 상기 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환: Y11I, Y11V, R242E, L222I, D59N, S273Y, K19T, V309I, S132A, N249D, I96L, N249E, L166V, H76Q, N249D, G251D, Q280E, Q56H, M157L, K231N, M256L, N291Q, S164G, L253I 중 하나 이상인 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제4항에 있어서, 변이체는 다음의 치환 조합:
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;
Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;
Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
D59N, H76Q, S164G, L166V, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273;
K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
N249D, N100Q, N291Q;
R242E, N100Q, N291Q;
R242E, G251D, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, N252D, N100Q, N291Q;
R242E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
N252D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
G251D, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
Y243E, Q280E, N100Q, N291Q;
Q56H, N252Q, N291Q;
R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N;
R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q 또는
R67Q, L130I, M157L, R242E, M256L, N292H
중 하나 이상을 포함하며, 여기서 각 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체는 그의 모체 폴리펩티드의 C/P 비율의 적어도 200%의 C/P 비율을 가지며, SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 위치: R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L222, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291 중 하나 이상의 위치에서의 치환을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제6항에 있어서, 상기 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환: R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q 중 하나 이상인 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제7항에 있어서, 변이체는 다음의 치환 조합:
Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;
Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, R242E, G251D;
H76Q, S164G, L166V, L222I, S226T, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, N249D, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, S164G, L222I, R242E, S273Y, V309I;
H76Q, I96L, S164G, G251D, S273Y, V309I;
D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;
D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;
D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
K19T, D59N, S164G, L166V, L222I, S226T, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y, V309I;
K19T, Y21S, D59N, H76Q, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, L130I, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, L130I, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y, V309I;
K19T, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S226T, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, L130I, S164G, G251D, V309I;
K19T, Y21S, D59N, H76Q, L130I, S164G, L222I, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
Y21S, D59N, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y, V309I;
D59N, H76Q, S226T, R242E, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
K19T, Y21S, H76Q, S164G, L222I, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, I96L, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, L130I, S132A, S164G, L222I, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, S164G, L166V, N249D, G251D, S273Y;
Y11I, K19T, I96L, S164G, L222V, R242E, G251D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;
Y11V, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, L253I, I263L;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
Y11V, K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, I263L;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, I263V;
K19T, I96L, S164G, R242E, L253I;
Y11V, K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;
D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;
I96L, S164G, L222I, R242E, G251D;
K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242D, G251D, I263V;
I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, I263L;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D, L253I;
D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
K19T, D59N, I96V, S164G, L166V, L222I, R242E, I263L;
Y11I, K19T, D59N, S164G, L222I, G251D, I263V;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, N249E, G251D, L253V, I263L;
Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I, I263L;
K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;
K19T, E83S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, N249D, G251D, L253I;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, N249E, G251D, I263V;
Y11V, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D, L253V;
Y11I, K19T, D59N, I96V, L222I, R242D, G251D;
K19T, E83T, I96L, S164G, L222I, R242E, L253V;
K19S, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
K19T, I96L, S164N, L222I, R242E, I263L;
K19T, D59N, E83T, S164G, L166V, L222I, R242D, G251D;
K19T, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, L253I;
Y11V, E83S, I96L, S164G, L222I, R242E, L253I, I263L;
K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
K19T, I96L, S164G, L166V, L222I, N249D, I263L;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, G251D, L253V;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164N, L166I, L222I, G251D;
R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, N252D, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
V32L, R67Q, L130I, M157L, K231N, M256L;
R67Q, L130I, M157L, D158S, R242E, N291Q;
R67Q, V136I, M157L, L222I, V248I;
Y11V, R67Q, L130I, M157L, L222I, R242E;
R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q;
R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
R67Q, L130I, L222I, R242E, M256L;
R67Q, G70D, M157L, R242E, V248I;
R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
R67Q, I96L, N100Q, L130I, M157L, N292H;
I45V, L130I, M157L, K231N, R242E 또는
R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N
중 하나 이상을 포함하며, 여기서 각 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 폴리펩티드의 제조 방법으로, 다음 단계들:
(a): SEQ ID NO: 2와 서열 동일성이 적어도 80%인 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 하나 이상의 위치에 변경을 가하는 단계로서, 여기서 변경은 적어도 하나의 아미노산 위치에서의 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 것인 단계;
(b): 단계 (a)의 변이체 폴리펩티드를 생성 및 단리하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 모체 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 (낙타 키모신)와 서열 동일성이 적어도 85%, 95%, 97%, 98% 또는 적어도 99%인 것인 방법.
제9항 또는 제10항에 있어서,
(a) 변이체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 다음의 치환: Y11, S164, L253, D59, V309, S132, N249, L166, N249, Q56, M157, M256, R242, I96, H76, S164, S273, G251, Y11, L166, K19, Y21, S74, Y243, N249, S273, Q280, F282, L295, N252, R254, G70, V136, L222, K231, N291 예컨대 Y11I, Y11V, S164G, L253I, D59N, V309I, S132A, N249E, L166V, N249D, Q56H, M157L, M256L, R242E, I96L, H76Q, S164G, S273Y, G251D, Y11I, R242D, L222V, Y11V, L166I, K19T, Y21S, S74D, Y243E, N249D, S273D, Q280E, F282E, L295K, N252D, R254E, G70D, V136I, L222I, K231N, N291Q 중 하나 이상을 포함하는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드의 제조 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서,
(a) 변이체는 다음의 치환 조합:
Y11I, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, G251D, L253I;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222V, R242E, N249E, L253I;
Y11I, I96L, S164G, L222I, R242E;
Y11I, K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, L222I, N249D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S132A, L222I, G251D, S273Y, V309I;
Y21S, H76Q, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, S132A, S164G, L222I, R242E, N249D, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, I96L, S132A, S164G, L166V, L222I, G251D, S273Y;
H76Q, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, S273Y;
D59N, H76Q, S132A, S164G, L166V, S273Y;
K19T, D59N, H76Q, S164G, R242E, N249D, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222I, G251D;
D59N, H76Q, S164G, L222I, S226T, R242E;
H76Q, L130I, L222I, S226T, G251D, S273Y;
Y21S, D59N, H76Q, I96L, L222I, S273Y;
H76Q, S164G, L222I, N249D, G251D, S273Y, V309I;
D59N, I96L, L166V, L222I, R242E, G251D;
Y11V, K19T, D59N, I96L, S164G, L166V, L222I, R242E, G251D, L253I;
K19S, D59N, I96L, S164G, L222I, R242E, N249E, G251D;
K19T, D59N, I96L, S164G, L166I, L222I, R242E, N249D;
H76Q, I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S273Y;
K19T, I96L, L222I, R242E, L253I;
K19T, D59N, I96L, S164G, L222V, R242E, N249D, L253I;
I96L, S164G, L222I, R242E, G251D, S274Y;
R242E, N252D, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, Q280E, N100Q, N291Q;
R242E, R254E, S273D, Q280E, N100Q, N291Q;
R67Q, S132A, L222I, K231N, R242E, V248I;
R67Q, I96L, L130I, M157L, K231N, R242E;
R67Q, M157L, L222I, K231N, V248I;
R67Q, I96L, M157L, L222I, K231N 또는
R67Q, G70D, M157L, L222I, N291Q
중 하나 이상을 포함하며, 여기서 각 치환은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열과 관련하여 특정되는 것인 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 제조 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 키모신 폴리펩티드 변이체의 유효량을 식품 또는 사료 성분(들)에 첨가하고 식품 또는 사료 제품을 얻기 위한 제조 단계들을 추가로 수행하는 것을 포함하는 식품 또는 사료 제품의 제조 방법.
제13항에 있어서, 상기 식품 또는 사료 제품은 우유-기반 제품인 것인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 키모신 폴리펩티드 변이체를 포함하는 식품 또는 사료 제품.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 키모신 폴리펩티드 변이체의 치즈 제조 공정에서의 용도.
제16항에 있어서, 키모신 폴리펩티드 변이체의 파스타필라타, 체다, 콘티넨탈 타입 치즈, 연질 치즈 또는 화이트 브라인 치즈 제조 공정에서의 용도.