JP2015143282A - アジュバントとして減少した量の水中油型エマルションを有するインフルエンザワクチン - Google Patents

Abstract

【課題】アジュバントとして減少した量の水中油型エマルションを有するインフルエンザワクチンの提供。
【解決手段】水中油型エマルションアジュバントを有するインフルエンザワクチンは、公知である。インフルエンザワクチンに必要とされるエマルションアジュバントの量は、減少し得、それによってより多くのワクチンが所与の量のエマルションから作製されることを可能にし、そして／または所与の数のワクチン用量のために産生される必要があるエマルションの量を最小化する。これらのワクチンは、（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合することによって便宜的に作製され得る。１つの局面において、実質的に等しい体積の成分（ｉ）および成分（ｉｉ）が、使用され；別の局面において、過剰な体積の成分（ｉｉ）が、使用される。
【選択図】図３

Description

明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として援用される。

（技術分野）
本発明は、インフルエンザウイルス感染を防御するためのアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）されたワクチンの分野にある。

（背景技術）
現在、インフルエンザワクチンは、一般的使用においてアジュバントを含まない。これらのワクチンは、参考文献１の第１７章および第１８章においてさらに詳細に記載される。それらのワクチンは、生ウイルス（ｌｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）または不活化ウイルスに基づき、そして不活化ワクチンは、全ウイルス（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｕｓ）、「スプリット」ウイルス（「ｓｐｌｉｔ」ｖｉｒｕｓ）または精製された表面抗原（赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む）に基づき得る。赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、ＨＡレベルへの参照によって標準化され、そのワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含む。

流行性のインフルエンザ感染において、多数の用量のインフルエンザワクチンが必要とされるが、多大な要求を満たすためにワクチンの供給を増大させることは、困難である。したがって、より多くのワクチン抗原を産生するよりも、１株あたりより低い量の抗原を使用すること、および減少した抗原用量を補うためにアジュバントを使用することが、提案されている。大流行間期にこのアプローチを使用すること（例えば、製造レベルを増大させることなく集団をより広く網羅することを可能にすること）がまた、提案されている。

１つのアジュバント添加されたワクチンが、既に利用可能である（すなわち、ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品）。このワクチン中のアジュバントは、水中油型エマルションである。ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品において、上記抗原および上記エマルションアジュバントは、予め充填された注射器において予め混合された形式で供給される。上記製品のデータシートは、各用量が、０．５ｍｌの体積を有し、そして１株あたり１５μｇのＨＡ、９．７５ｍｇのスクアレン、１．１７５ｍｇのポリソルベート８０、１．１７５ｍｇのソルビタントリオレアート、０．６６ｍｇのクエン酸ナトリウム、０．０４ｍｇのクエン酸、および注射用水を含むことを示す。非特許文献１において開示されるように、上記ワクチンは、１×濃度にてエマルションおよび抗原の両方を含む最終溶液を与えるために、２×エマルションと２×抗原溶液とを１：１の体積比で混合することによって作製される。この１：１の混合比は、参考文献８の第１０章でさらに説明される。
Ｍｉｎｕｔｅｌｌｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９９年、第１７巻、ｐ．９９−１０４

水中油型アジュバントを有するさらなるインフルエンザワクチンおよび改良されたインフルエンザワクチン（流行中における使用および大流行の間の使用の両方のため）、ならびにそれらの調製のための方法を提供することが、本発明の目的である。

（発明の開示）
ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品に加えて、減少した抗原用量を有するワクチンを含む実験的なＭＦ５９アジュバント添加されたインフルエンザワクチンが、ヒトにおいて試験された。参考文献３および４において、例えば、Ｈ５Ｎ３株に基づくＭＦ５９アジュバント添加されたワクチンが、試験され、ここで、ＨＡは、通常用量（１５μｇ）、倍用量（３０μｇ）または半用量（７．５μｇ）のいずれかで存在した。しかし、全ての場合において、患者は、満量（ｆｕｌｌ ａｍｏｕｎｔ）（１×）のＭＦ５９アジュバントを含む０．５ｍｌ体積の予め混合されたワクチンを受容した。

ここで、本発明者は、満量の水中油型エマルションアジュバントが必ずしも必要ではない可能性があることを認識した。したがって、本発明によって、インフルエンザワクチンに必要とされるエマルションアジュバントの量は、減少し、それによってより多くのワクチンが所与の量のエマルションから作製されることを可能にし、そして／または所与の数のワクチン用量のために産生される必要があるエマルションの量を最小化する。多くの用量が早急に必要とされる状況において、エマルションアジュバントに対する全体的な必要量の減少は、有益である。

これらのワクチンは、当該分野において既に公知であるように、（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合することによって便宜的に作製され得る。しかし、本発明に関して、混合手順は、種々の手段において先行技術と異なり得る、そして手順の選択は、ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品と比較した場合、用量および体積に対して種々の効果を有し得る。例えば、以下である：
−先行技術のように、実質的に等しい体積の成分（ｉ）および成分（ｉｉ）が、使用され得る。しかし、その先行技術とは異なり、０．２５ｍｌ未満のエマルションを使用することによって、最終的なワクチンを作製するために必要とされる体積は、減少し得る。成分（ｉｉ）中の抗原濃度が体積の減少に対応して増大する場合、最終的なワクチン中の抗原の量は、維持され得（１株あたり１５μｇ）；成分（ｉｉ）中の抗原濃度が維持される場合（０．２５ｍｌについて１株あたり１５μｇ）、最終的なワクチンは、減少したＨＡ用量を有する。
−先行技術とは異なり、過剰な体積の成分（ｉｉ）が、使用され得る。上記抗原濃度が過剰な増大に対応して減少する場合、最終的なワクチン中の抗原の量は、維持され得（１株あたり１５μｇ）；抗原濃度が過剰な増大よりも多く減少する場合、最終的な抗原用量は、減少し（１株あたり１５μｇ未満）；そして抗原濃度が維持される場合（０．２５ｍｌについて１株あたり１５μｇ）、最終的なワクチンは、増大したＨＡ用量を有する（１株あたり１５μｇよりも多い）。

したがって、本発明は、実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、成分（ｉｉ）中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きい。等しい体積を混合することによって、混合後のＨＡ濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり３０μｇ／ｍｌよりも大きい。したがって、この方法は０．５ｍｌ体積中の最終ＨＡ濃度が１株あたり１５μｇよりも大きい組成物を与えるので、１株あたり１５μｇの用量が、０．５ｍｌ未満のこのワクチンを投与することによって達成され得る。

本発明はまた、実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記ワクチンは、０．５ｍｌ未満の体積を有する。上記体積は、０．０５ｍｌと０．４５ｍｌとの間、０．１ｍｌと０．４ｍｌとの間、０．２ｍｌと０．３ｍｌとの間などであり得る。したがって、上記体積は、約０．１ｍｌ、約０．１５ｍｌ、約０．２ｍｌ、約０．２５ｍｌ、約０．３ｍｌ、約０．３５ｍｌ、約０．４ｍｌ、または約０．４５ｍｌなどであり得る。成分（ｉｉ）中の赤血球凝集素の濃度が、１インフルエンザウイルス株あたり約６０μｇ／ｍｌである場合、上記ワクチンは、１インフルエンザウイルス株あたり約３０μｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を有するので、０．５ｍｌ未満の体積に関して、ＨＡ用量は、１株あたり１５μｇ／用量未満である。したがって、アジュバントおよび抗原の必要量は、減少する。

本発明はまた、（ａ）実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合して、バルクワクチン（ｂｕｌｋ ｖａｃｃｉｎｅ）を与える工程；および（ｂ）少なくとも１つの単位用量を上記バルクワクチンから取り出す工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで上記単位用量の体積は、上に記載されるように、０．５ｍｌ未満である。

したがって、本発明はまた、実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記ワクチン中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり３０μｇ／ｍｌ未満である。したがって、この方法は、標準的な０．５ｍｌ体積中の最終ＨＡ濃度が１株あたり１５μｇ未満である組成物を与える。上記ワクチンは、約０．５ｍｌの用量、または上に記載されるように、０．５ｍｌ未満の用量で投与され得る。

本発明はまた、第１体積の水中油型エマルションと第２体積のインフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記第２体積は、上記第１体積よりも大きい。いくつかの実施形態において、上記第２体積中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌ未満である。

これらの方法は、患者への投与のために配布され得る予め混合されたワクチンを与えるために、バルクの製造の間に行われ得る。その代わりとして、それらの方法は、患者に対する投与のための即時調製物を与えるために、使用時点において行われ得る。後者の場合において、本発明は、（ｉ）水中油型エマルションを含むアジュバント成分；と（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物を含む抗原成分；とを備えるキットを提供する。成分（ｉ）は、インフルエンザウイルス抗原を含まず、そして成分（ｉｉ）は、水中油型エマルションではない。上記キット成分は、実質的に等しい体積を有し得、その場合において、上記成分（ｉｉ）中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きいものであり得る。その代わりとして、キット成分（ｉｉ）は、成分（ｉ）よりも大きい体積を有し得、そして好ましくは、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌ未満の赤血球凝集素濃度を有する。いくつかの実施形態において、上記２つのキット成分は、各々、１：１混合後に０．５ｍｌ未満の最終体積（上に記載されるような）を与えるために０．２５ｍｌ未満の体積を有し得る。

本発明はまた、本発明の方法によって入手可能な組成物を提供する。これらの組成物は、水中油型エマルションとの混合物においてインフルエンザウイルス抗原を含む。これらの組成物中のＨＡ濃度は１株あたり３０μｇ／ｍｌよりも大きいものであり得る（例えば、本発明は、水中油型エマルションとインフルエンザウイルス抗原とを含む組成物を提供し、ここで、その組成物は、１インフルエンザウイルス株あたり１５μｇ／用量のＨＡを提供し、０．５ｍｌ未満の用量体積を有する）。

本発明はまた、水中油型エマルションとインフルエンザウイルス抗原とを含むワクチン組成物を提供し、ここで、上記ワクチンは、０．５ｍｌ未満の体積（上に記載されるような）を有する。本発明はまた、インフルエンザウイルス赤血球凝集素とスクアレンとを含むワクチン組成物を提供し、ここで、赤血球凝集素に対するスクアレンの重量比は、５０と２０００との間（例えば、１００と１０００との間）であり、そして上記ワクチンは、０．５ｍｌ未満の体積（上に記載されるような）を有する。上記ワクチン中のＨＡ濃度は、１株あたり３０μｇ／ｍｌよりも大きいものであり得る。

本発明はまた、インフルエンザウイルス赤血球凝集素とスクアレンとを含む組成物を提供し、ここで、赤血球凝集素に対するスクアレンの重量比は、５０と２０００との間（例えば、１００と１０００との間）であり、そして上記ＨＡ濃度は、１株あたり３０μｇ／ｍｌ未満である。免疫感作のためのこの組成物の単位用量は、約０．５ｍｌであり得るか、または上に記載されるように、０．５ｍｌ未満であり得る。

本発明はまた、水中油型エマルションとｎ種のインフルエンザウイルス株に由来する赤血球凝集素とを含む組成物を提供し、ここで、赤血球凝集素に対する油の重量比は、６４０／ｎ未満である。上記比は、例えば、６００／ｎ以下、５５０／ｎ以下、５００／ｎ以下、４５０／ｎ以下、４００／ｎ以下、３５０／ｎ以下、３００／ｎ以下、２５０／ｎ以下、２００／ｎ以下、１５０／ｎ以下、１００／ｎ以下、５０／ｎ以下などであり得る。ｎの値は、好ましくは、１、２、３または４である。上記油は、好ましくは、スクアレンを含む。免疫感作のためのこの組成物の単位用量は、約０．５ｍｌであり得るか、または上に記載されるように、０．５ｍｌ未満であり得る。

本発明はまた、実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）単一株に由来するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加された一価インフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記等しい体積は、０．２２ｍｌ未満（例えば、０．２１ｍｌ以下、０．２０ｍｌ以下、０．１９ｍｌ以下、０．１８ｍｌ以下、０．１６ｍｌ以下、０．１５ｍｌ以下、０．１４ｍｌ以下、０．１３ｍｌ以下、０．１２ｍｌ以下、０．１１ｍｌ以下、０．１０ｍｌ以下、０．０９ｍｌ以下、０．０８ｍｌ以下、０．０７ｍｌ以下、０．０６ｍｌ以下、０．０５ｍｌ以下など）である。対応するキットもまた、提供される。これらの一価組成物およびキットは、流行性インフルエンザ株に関して特に有用である（以下参照）。

本発明はまた、第１体積の水中油型エマルションと第２体積の単一株に由来するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加された一価インフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記第２体積は、上記第１体積よりも大きい。いくつかの実施形態において、赤上記第２体積中の血球凝集素の濃度は、６０μｇ／ｍｌ未満である。

本発明はまた、実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）単一株に由来するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加された一価インフルエンザワクチンを作製するための方法を提供し、ここで、上記エマルションは、３８ｍｇ／ｍｌ未満のスクアレン濃度を有する。したがって、混合後のスクアレン濃度は、１９ｍｇ／ｍｌ未満である。対応するキットもまた、提供され、その場合において、上記等しい体積は、好ましくは、約０．２５ｍｌである。これらの一価組成物およびキットは、流行性インフルエンザ株に関して特に有用である（以下参照）。成分（ｉ）中のスクアレン濃度は、例えば、３７ｍｇ／ｍｌ以下、３６ｍｇ／ｍｌ以下、３５ｍｇ／ｍｌ以下、３４ｍｇ／ｍｌ以下、３３ｍｇ／ｍｌ以下、３２ｍｇ／ｍｌ以下、３１ｍｇ／ｍｌ以下、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２９ｍｇ／ｍｌ以下、２８ｍｇ／ｍｌ以下、２７ｍｇ／ｍｌ以下、２６ｍｇ／ｍｌ以下、２５ｍｇ／ｍｌ以下、２４ｍｇ／ｍｌ以下、２３ｍｇ／ｍｌ以下、２２ｍｇ／ｍｌ以下、２１ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１９ｍｇ／ｍｌ以下、１８ｍｇ／ｍｌ以下、１７ｍｇ／ｍｌ以下、１６ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下、１４ｍｇ／ｍｌ以下、１３ｍｇ／ｍｌ以下、１２ｍｇ／ｍｌ以下、ｌｌｍｇ／ｍｌ以下、１０ｍｇ／ｍｌ以下、９ｍｇ／ｍｌ以下、８ｍｇ／ｍｌ以下、７ｍｇ／ｍｌ以下、６ｍｇ／ｍｌ以下、５ｍｇ／ｍｌ以下などであり得る。

（水中油型エマルションアジュバント）
水中油型エマルションは、インフルエンザウイルスワクチンにアジュバント添加する（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）のに使用するために特に適切であることが見出されている。種々のそのようなエマルションは、公知であり、そしてそれらは、代表的に、少なくとも１種の油および少なくとも１種の界面活性剤を含み、その油および界面活性剤は、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。上記エマルション中の油滴は、一般に、５μｍ未満の直径であり、そしてサブミクロンの直径でさえも有し得、これらの小さいサイズは、安定なエマルションを提供するために、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ）を用いて達成される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する小滴は、それらが濾過滅菌に供され得る場合に好ましい。

本発明は、油（例えば、動物（例えば、魚）または植物供給源由来の油）と一緒に使用され得る。植物油についての供給源としては、ナッツ類、種子類および穀物類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油が最も一般的に入手可能な代表的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油が使用され得る。種子油として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀物群において、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、小麦、燕麦、ライ麦、イネ、テフ、トリチカレなどの他のシリアル穀物類の油もまた使用され得る。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素の脂肪酸エステルは、種子油内には天然に存在しないが、ナッツ油および種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離およびエステル化により調製され得る。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は代謝可能であり、従って、本発明の実施において使用され得る。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化および他の方法に関する手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラの肝油、サメの肝油、および鯨ろうのようなクジラ油が代表的な種々の魚油であり、本明細書中において使用され得る。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドといわれる。サメの肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサンとして公知の分枝、不飽和テルペノイドを含み、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和アナログであるスクアランもまた好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法により得られ得る。他の好ましい油は、トコフェロール（以下参照）である。油の混合物が使用され得る。

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類され得る。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、そしてより好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎといわれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー（例えば、ＤＯＷＦＡＸ^ＴＭ商標名で販売される直線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー）；エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の繰返し数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）に関心がある；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭ ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）（例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ
３０））；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；およびソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）（例えば、ソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ ８５）およびソルビタンモノラウレート）を含む界面活性剤を用いて使用され得るが、これらに限定されない。エマルション中に含む好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、Ｓｐａｎ ８５（ソルビタントリオレアート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

界面活性剤の混合物は、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０／Ｓｐａｎ ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物が使用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ ８０））とオクトキシノール（例えば、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００））との組合せもまた、適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９にポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを加えたものを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、以下である：ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０）の０．０１〜１％（特に、約０．１％）；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズにおける他の洗浄剤）の０．００１〜０．１％（特に、０．００５〜０．０２％）；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）の０．１〜２０％（好ましくは、０．１〜１０％、そして特に、０．１〜１％または約０．５％）。

本発明に有用な特定の水中油型エマルションアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−スクアレン、Ｔｗｅｅｎ ８０、およびＳｐａｎ ８５のサブミクロンエマルション。体積によるエマルションの組成は、約５％のスクアレン、約０．５％のポリソルベート８０および約０．５％のＳｐａｎ ８５であり得る。重量の項目（ｔｅｒｍ）に関して、これらの比は、４．３％のスクアレン、０．５％のポリソルベート８０および０．４８％のＳｐａｎ ８５になる。このアジュバントは、参考文献８の第１０章および参考文献９の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９」［５〜７］として公知である。上記ＭＦ５９エマルションは、有益に、クエン酸イオン（例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を含む。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｗｅｅｎ ８０のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水を含み得る。またＳｐａｎ ８５（例えば、１％で）および／またはレシチンも含み得る。これらのエマルションは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％Ｔｗｅｅｎ ８０を有し得、より安定なエマルションを提供する場合、スクアレン：トコフェロールの重量比は、１以下が好ましい。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ ８０は、約５：２の体積比で存在し得る。そのようなエマルションの１つは、２％溶液を与えるためにＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ ８０を溶解し、次いでこの溶液９０ｍｌを（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍＬのスクアレンの）混合物とともに混合し、次いでこの混合物を微細流動化することにより作製され得る。この生じたエマルションは、サブミクロンの油滴（例えば、平均直径が１００ｎｍと２５０ｎｍの間、好ましくは約１８０ｎｍ）を有し得る。
−スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルション。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。そのエマルションは、リン酸緩衝液を含み得る。
−ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルション。そのエマルションは、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍＩのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）の質量比でこれら３つの成分を含み得、そしてこれらの濃度は、抗原由来のこれらの成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルションはまた、スクアレンを含み得る。そのエマルションはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照）を含み得る。その水相は、リン酸緩衝液を含み得る。
−スクアレン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１（「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ^ＴＭＬ１２１」）のエマルション。このエマルションは、リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４で処方され得る。このエマルションは、ムラミルジペプチドに有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバントにおいてトレオニル−ＭＤＰとともに使用される［１０］（０．０５〜１％ Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアレン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。「ＡＦ」アジュバントの場合、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでもまた使用され得る［１１］（５％スクアレン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。微細流動化が好ましい。
−０．５〜５０％油、０．１〜１０％リン脂質、および０．０５〜５％非イオン性界面活性剤を有するエマルション。参考文献１２に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの小滴サイズが有利である。
−代謝不可能な油（例えば、軽油）および少なくとも一種の界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ ８０またはＳｐａｎ ８０）のサブミクロン水中油型エマルション。添加物としては、ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−親油性物結合体（例えば、参考文献１３に記載される、グルクロン酸のカルボキシル基を介して脱アシルサポニンに脂肪族アミンを付加することにより産生されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンが挙げられ得る。
−サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がらせん状のミセルとして会合されるエマルション［１４］。
−鉱油、非イオン性の脂肪親和性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の親水性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１５］。
−鉱油、非イオン性の親水性エトキシル化脂肪アルコール、および非イオン性の脂肪親和性界面活性剤（例えば、エトキシル化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルション［１５］。

上記エマルションは、好ましくは、送達時、即時に抗原と混合される。従って、アジュバントおよび抗原は、代表的に包装されたワクチンまたは配布されたワクチンに別個に保たれ、使用時に最終処方物に準備される。この抗原は一般的に水性の形態であり、このワクチンは最終的に２つの液体の混合により調製される。成分の濃度が特定のエマルションの上記の説明において与えられる場合、これらの濃度は、代表的に、希釈されていない組成物についてのものであり、したがって、抗原溶液と混合した後の濃度は、減少する。

上記抗原およびアジュバントが混合された後、赤血球凝集素抗原は、一般に、水溶液中に残るが、その赤血球凝集素抗原は、それ自体、油／水界面付近に分布し得る。一般に、任意の赤血球凝集素が上記エマルションの油相に進入することは、ほとんどない。

組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはζトコフェロールのいずれかが使用され得るが、α−トコフェロールが好ましい。このトコフェロールは、いくつかの形態をとり得る（例えば、異なる塩および／または異性体）。塩として、有機塩（例えば、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩など）が挙げられる。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方が使用され得る。トコフェロールは、有益に、高齢患者（例えば、６０歳以上）において使用するためのワクチンに含まれる。なぜならば、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対するポジティブな効果［１６］を有することが報告されているからである。それらはまた、上記エマルションを安定化するために役立ち得る抗酸化剤特性を有する［１７］。好ましいα−トコフェロールはＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。そのコハク酸塩は、インビボでＴＮＦ関連リガンドと協同することが見出されている。さらに、コハク酸α−トコフェロールは、インフルエンザワクチンと適合性であり、そして水銀化合物に代わるものとして有用な保存剤であることが公知である［２３］。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。

（インフルエンザウイルス抗原）
本発明の組成物は、インフルエンザウイルス抗原を含む。上記抗原は、代表的に、インフルエンザビリオンから調製されるが、その代わりとして、赤血球凝集素などの抗原が、組換え宿主（例えば、バキュロウイルスベクターを使用した昆虫細胞株）において発現され、そして精製された形態で使用され得る［１８、１９］。しかし、一般に、抗原は、ビリオン由来である。

上記抗原は、生ウイルスの形態、またはより好ましくは、不活化ウイルスの形態をとり得る。ウイルスを不活化するための化学的手段としては、以下の因子の１種以上の有効量による処理が挙げられる：洗浄剤、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β−プロピオラクトン、またはＵＶ光。不活化のためのさらなる化学的手段としては、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）または任意のその組合せによる処理が挙げられる。ウイルス不活化の他の方法は、当該分野において公知である（例えば、第二級エチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはγ線照射など）。ＩＮＦＬＥＸＡＬ^ＴＭ製品は、全ビリオン（ｗｈｏｌｅ ｖｉｒｉｏｎ）不活化ワクチンである。

不活化ウイルスが使用される場合、上記ワクチンは、全ビリオン、スプリットビリオン（ｓｐｌｉｔ ｖｉｒｉｏｎ）、または精製された表面抗原（赤血球凝集素を含み、そして通常は、ノイラミニダーゼをまた含む）を含み得る。

ビリオンは、種々の方法によってウイルス含有流体から回収され得る。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊するための洗浄剤を含む直線ショ糖勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を含み得る。次いで、抗原は、必要に応じた希釈後に、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって精製され得る。

スプリットビリオンは、ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコール酸塩、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ９など）により処理（「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」分解（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）プロセスを含む）してサブビリオン調製物を産生することによって得られる。インフルエンザウイルスを分解する方法は、当該分野において周知である（例えば、参考文献２０〜２５などを参照のこと）。ウイルスの分解は、代表的に、破壊する濃度の分解剤（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）によって全ウイルスを破壊または断片化する（感染性であっても非感染性であってもよい）ことによって行われる。上記破壊は、ウイルスタンパク質の完全または部分的な可溶化をもたらし、ウイルスの完全性を変化させる。好ましい分解剤は、非イオン性界面活性剤およびイオン性（例えば、カチオン性）界面活性剤（例えば、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖（ａｃｙｌ ｓｕｇａｒ）、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド（Ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎ Ｎ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用な分解手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの継続的な効果を使用し、そして分解は、（例えば、ショ糖密度勾配溶液における）最初のビリオン精製の間に行われ得る。スプリットビリオンは、通常、リン酸ナトリウムによって緩衝化された等張塩化ナトリウム溶液に再懸濁され得る。ＢＥＧＲＩＶＡＣ^ＴＭ製品、ＦＬＵＡＲＩＸ^ＴＭ製品、ＦＬＵＺＯＮＥ^ＴＭ製品およびＦＬＵＳＨＩＥＬＤ^ＴＭ製品は、スプリットワクチン（ｓｐｌｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）である。

精製された表面抗原ワクチンは、インフルエンザ表面抗原の赤血球凝集素、および代表的には、ノイラミニダーゼをまた含む。精製された形態でこれらのタンパク質を調製するためのプロセスは、当該分野において周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮ^ＴＭ製品、ＡＧＲＩＰＰＡＬ^ＴＭ製品およびＩＮＦＬＵＶＡＣ^ＴＭ製品は、サブユニットワクチンである。

インフルエンザ抗原はまた、ＩＮＦＬＥＸＡＬ Ｖ^ＴＭ製品およびＩＮＶＡＶＡＣ^ＴＭ製品のように、ビロソーム［２０］（核酸を含まないウイルス様リポソーム粒子）の形態で提供され得る［２６］。

上記インフルエンザウイルスは、弱毒化され得る。上記インフルエンザウイルスは、温度感受性であり得る。上記インフルエンザウイルスは、低温適応性であり得る。これらの３つの可能性は、特に、生ウイルスに適合する。

ワクチンに使用するためのインフルエンザウイルス株は、季節により変化する。最近の大流行間期において、ワクチンは、代表的に、２種のインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１種のインフルエンザＢ型株を含み、そして三価ワクチンが、代表的である。本発明はまた、（特に、インフルエンザＡ型ウイルスの）Ｈ２サブタイプ株、Ｈ５サブタイプ株、Ｈ７サブタイプ株またはＨ９サブタイプ株などの流行株（すなわちワクチンのレシピエントおよび一般的なヒト集団が免疫学的にナイーブである株）に由来するウイルスを使用し得、そして流行株に対するインフルエンザワクチンは、一価であっても、流行株によって補充された通常の三価ワクチンに基づいてもよい。しかし、季節および上記ワクチンに含まれる抗原の性質に依存して、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡサブタイプであるＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１種以上を防御し得る。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプであるＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１種以上を防御し得る。

上記組成物に通常含まれ得る他の株は、抗ウイルス療法に対して抵抗性（例えば、オセルタミビル［２７］および／またはザナミビルに対して抵抗性）の株であり得、その株は、抵抗性の流行株を含む［２８］。

本発明のアジュバント添加組成物は、流行株に対して免疫感作するために特に有用である。流行の発生を引き起こす可能性をインフルエンザ株に与えるインフルエンザ株の特性は、以下である：（ａ）そのインフルエンザ株が、最近広まっているヒト株における赤血球凝集素と比較して新規の赤血球凝集素（すなわち、１０年以上にわたってヒト集団において顕性でない赤血球凝集素（例えばＨ２））を含むか、またはヒト集団において以前に全く見出されていない（例えば、一般には鳥類集団においてのみ見出されているＨ５、Ｈ６またはＨ９）ことにより、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）そのインフルエンザ株が、ヒト集団において水平伝播し得ること；および（ｃ）そのインフルエンザ株が、ヒトに対して病原性であること。Ｈ５型赤血球凝集素を有するウイルスは、流行性インフルエンザ（例えば、Ｈ５Ｎ１株）に対する免疫感作のために好ましい。他の可能性のある株としては、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、および任意の他の顕在する潜在的な流行株が挙げられる。Ｈ５サブタイプにおいて、ウイルスは、ＨＡクレード１、ＨＡクレード１’、ＨＡクレード２またはＨＡクレード３に分類され得［２９］、クレード１およびクレード３は、特に、関連性がある。

本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含む１種以上（例えば１種、２種、３種、４種またはそれ以上）のインフルエンザウイルス株由来の抗原を含み得る。ワクチンが、１種より多い株のインフルエンザを含む場合、それらの異なる株は、代表的に、別個に増殖され、かつそれらのウイルスが回収された後に混合され、そして抗原が、調製される。したがって、本発明の方法は、１種より多いインフルエンザ株由来の抗原を混合する工程を含み得る。２種のインフルエンザＡ型ウイルス株および１種のインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価ワクチンが、好ましい。本発明のいくつかの実施形態において、上記組成物は、単一のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種のインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得るが、但し、これらの２種の株は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ではない。いくつかの実施形態において、上記組成物は、２種より多いインフルエンザＡ型株由来の抗原を含み得る。

上記インフルエンザウイルスは、リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）株であり得、そして逆方向遺伝学技術によって得ることができた。逆方向遺伝学技術［例えば、３０〜３４］は、プラスミドを使用してインビトロで調製される所望のゲノムセグメントを有するインフルエンザウイルスを可能にする。代表的に、それは、（ａ）例えば、ｐｏｌＩプロモーターにより、所望のウイルスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を発現すること、および（ｂ）例えば、ｐｏｌＩＩプロモーターにより、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子を発現することを含むことで、細胞における両方の型のＤＮＡの発現が、完全なインタクト感染性ビリオンの構築を生じる。上記ＤＮＡは、好ましくは、全ての上記ウイルスＲＮＡおよびウイルスタンパク質の全てを提供するが、そのＲＮＡおよびタンパク質のいくつかを提供するためにヘルパーウイルスを使用することもまた、可能である。各ウイルスＲＮＡを産生するために別個のプラスミドを使用するプラスミドベースの方法が、好ましく［３５〜３７］、そしてこれらの方法はまた、上記ウイルスタンパク質の全てまたはいくつか（例えば、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質およびＮＰタンパク質だけ）を発現するためのプラスミドの使用を包含し、１２種のプラスミドが、いくつかの方法において使用される。

必要とされるプラスミドの数を減少させるために、最近のアプローチ［３８］は、（ウイルスＲＮＡ合成のための）同じプラスミド上の複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｖＲＮＡセグメントをコードする配列）と、別のプラスミド上のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種または８種全てのインフルエンザＡ型ｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を合わせる。参考文献３８の方法の好ましい局面は、以下を含む：（ａ）単一プラスミド上のＰＢ１ ｍＲＮＡコード領域、ＰＢ２ ｍＲＮＡコード領域およびＰＡ ｍＲＮＡコード領域；および（ｂ）単一プラスミド上の全８種のｖＲＮＡコードセグメント。１つのプラスミド上にＮＡセグメントおよびＨＡセグメントを含み、そして別のプラスミド上に６種の他のセグメントを含むこともまた、問題を容易にし得る。

上記ウイルスＲＮＡセグメントをコードするためにｐｏｌＩプロモーターを使用する代わりに、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターを使用することが、可能である［３９］。例えば、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼのためのプロモーターが、慣用的に使用され得る。ｐｏｌＩプロモーターの種特異性に起因して、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターは、多くの細胞型（例えばＭＤＣＫ）に関してより慣用的であり得るが、細胞はまた、外因性ポリメラーゼ酵素をコードするプラスミドによってトランスフェクトされる必要がある。

他の技術において、単一の鋳型に由来して上記ウイルスＲＮＡおよび発現可能なｍＲＮＡを同時にコードするために二重のｐｏｌＩプロモーターおよびｐｏｌＩＩプロモーターを使用することが、可能である［４０、４１］。

したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、特に、そのウイルスが卵において増殖される場合、Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント（代表的に、６セグメントは、Ａ／ＰＲ／８／３４に由来し、上記ＨＡセグメントおよびＮセグメントは、ワクチン株に由来する、すなわち、６：２リアソータント）を含み得る。それはまた、ワクチン調製物のためのリアソータントウイルスを産生するために、Ａ／ＷＳＮ／３３ウイルス由来の１種以上のＲＮＡセグメント、または有用な任意の他のウイルス株の１種以上のＲＮＡセグメントを含み得る。代表的に、上記株のゲノムは、通常、哺乳動物（例えば、ヒト）インフルエンザウイルスに由来する少なくとも１種のＲＮＡセグメントを含むので、本発明は、ヒト同士の伝染が可能である株から防御する。それは、鳥インフルエンザウイルスに由来するＮＳセグメントを含み得る。

上記抗原の供給源として使用されるウイルスは、卵（通常は、ＳＰＦ卵）または細胞培養物のいずれかにおいて増殖され得る。インフルエンザウイルス増殖についての現在の標準的な方法は、有胚の鶏卵を使用し、そのウイルスは、その卵の内容物（尿膜腔液）から精製される。しかし、さらに最近、ウイルスは、動物細胞培養物において増殖され、そして速さおよび患者のアレルギーの理由に起因して、この増殖方法が、好ましい。卵ベースのウイルス増殖が使用される場合、１種以上のアミノ酸がウイルスと一緒に卵の尿膜の流体中に導入され得る［２４］。

細胞基質は、代表的に、哺乳動物起源の細胞株である。適切な哺乳動物細胞の起源としては、ハムスター細胞、ウシ細胞、霊長類細胞（ヒト細胞およびサル細胞を含む）およびイヌ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腎細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞などのような種々の細胞型が、使用され得る。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣの名前を有する細胞株である。適切なサル細胞は、例えば、アフリカミドリザル細胞（例えば、Ｖｅｒｏ細胞株のような腎細胞）である。適切なイヌ細胞は、例えば、ＭＤＣＫ細胞株のような腎細胞株である。したがって、適切な細胞株としては、ＭＤＣＫ；ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；Ｖｅｒｏ；ＭＲＣ−５；ＰＥＲ．Ｃ６；ＷＩ−３８；などが挙げられるが、これらに限定されない。インフルエンザウイルスを増殖させるために好ましい哺乳動物細胞株としては、以下が挙げられる：Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞［４２〜４５］；アフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）腎臓に由来するＶｅｒｏ細胞［４６〜４８］；またはヒト胚性網膜芽細胞に由来するＰＥＲ．Ｃ６細胞［４９］。これらの細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［５０］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［５１］、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広範に入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−８１、ＣＣＬ−８１．２、ＣＲＬ−１５８６およびＣＲＬ−１５８７の種々の異なるＶｅｒｏ細胞を提供し、そしてＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ−３４のＭＤＣＫ細胞を提供する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０においてＥＣＡＣＣから入手可能である。哺乳動物細胞株のあまり好ましくない代替物として、ウイルスは、鳥類細胞株［例えば、参考文献５２〜５４］（鳥類胚性幹細胞［５２、５５］、およびアヒル（例えば、アヒル網膜）または雌鶏に由来する細胞株を含む）において増殖され得る。適切な鳥類胚性幹細胞としては、ニワトリ胚性幹細胞、ＥＢ４５、ＥＢ１４、およびＥＢ１４−０７４に由来するＥＢｘ細胞株［５６］が挙げられる。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）などもまた、使用され得る。

インフルエンザウイルスを増殖させるために最も好ましい細胞株は、ＭＤＣＫ細胞株である。元のＭＤＣＫ細胞株は、ＣＣＬ−３４としてＡＴＣＣから入手可能であるが、この細胞株の派生物もまた、使用され得る。例えば、参考文献４２は、懸濁培養物における増殖に適合したＭＤＣＫ細胞株（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ ３３０１６」）を開示する。同様に、参考文献５７は、無血清培養の懸濁物において増殖するＭＤＣＫ由来細胞株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）を開示する。参考文献５８は、非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞（「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ
ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＰＴＡ−６５０３）を含む）を開示する。参考文献５９は、感染に対して高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞株（「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２０４２）を含む）を開示する。任意のこれらのＭＤＣＫ細胞株が、使用され得る。

ウイルスが哺乳動物細胞株において増殖された場合、上記組成物は、有益に、卵タンパク質（例えばオボアルブミンおよびオボムコイド）およびニワトリＤＮＡを含まず、それによってアレルゲン性を減少させる。

ウイルスが細胞株において増殖された場合、増殖のための培養物、およびまた、培養を開始するために使用されるウイルス接種物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、および／またはパルボウイルスを含まない［６０］（すなわち、それらの培養物および接種物は、これらのウイルスについて試験され、そしてこれらのウイルスによる汚染についてネガティブな結果を得る）。単純ヘルペスウイルスが無いことは、特に好ましい。

ウイルスが細胞株において増殖された場合、上記組成物は、好ましくは、１用量あたり１０ｎｇ未満（好ましくは、１ｎｇ未満、およびより好ましくは、１００ｐｇ未満）の残留宿主細胞ＤＮＡを含むが、微量の宿主細胞ＤＮＡが、存在し得る。一般に、上記宿主細胞ＤＮＡ（それは、本発明の組成物から取り除くことが望ましい）は、１００ｂｐよりも長いＤＮＡである。

残留宿主細胞ＤＮＡの測定は、現在、生物製剤についての慣用的な管理要件（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）であり、そして当業者の通常の能力の範囲内である。ＤＮＡを測定するために使用されるアッセイは、代表的に、確認されたアッセイである［６１、６２］。確認されたアッセイの性能の特徴は、数学的項目および定量可能な項目において記載され得、そしてその考えられる誤差の供給源は、同定されている。上記アッセイは、一般に、正確度、精度、特異性などの特徴について試験された。一旦アッセイが、（例えば、宿主細胞ＤＮＡの既知の標準量に対して）較正され、そして試験された場合、定量的ＤＮＡ測定は、慣用的に行われ得る。ＤＮＡ定量についての以下の３つの主要な技術が、使用され得る：サザンブロットまたはスロットブロットなどのハイブリダイゼーション法［６３］；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ^ＴＭ Ｓｙｓｔｅｍなどのイムノアッセイ法［６４］；および定量的ＰＣＲ［６５］。これらの方法は全て、当業者によく知られているが、各方法の正確な特徴は、目的とする宿主細胞に依存し得る（例えば、ハイブリダイゼーションのためのプローブの選択、増幅のためのプライマーおよび／またはプローブの選択など）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＴｈｒｅｓｈｏｌｄ^ＴＭシステムは、ピコグラムレベルの全ＤＮＡについての定量的アッセイであり、そして生物製剤中の混入したＤＮＡのレベルをモニタリングするために使用されている［６４］。代表的なアッセイは、ビオチン化ｓｓＤＮＡ結合タンパク質と、ウレアーゼ結合体化抗ｓｓＤＮＡ抗体と、ＤＮＡとの間における反応複合体の配列非特異的形成を包含する。全てのアッセイ成分は、上記製造業者から入手可能である完全なＴｏｔａｌ ＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに含まれる。種々の商業的な製造業者は、残留宿主細胞ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲアッセイを提供する（例えば、ＡｐｐＴｅｃ^ＴＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＢｉｏＲｅｌｉａｎｃｅ^ＴＭ、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなど）。ヒトウイルスワクチンの宿主細胞ＤＮＡの混入を測定することについての化学発光ハイブリダイゼーションアッセイと全ＤＮＡ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ^ＴＭシステムとの比較は、参考文献６６に見出され得る。

混入したＤＮＡは、標準的な精製手順（例えば、クロマトグラフィーなど）を使用して、ワクチン調製の間に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによるヌクレアーゼ処理によって増強され得る。宿主細胞ＤＮＡの混入を減少させるために好都合な方法は、参考文献６７および６８に開示され、その方法は、最初に、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ））を使用し、次いで、ビリオンの破壊の間に使用され得るカチオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用する、２工程の処理を含む。アルキル化剤（例えば、β−プロピオラクトン）による処理がまた、宿主細胞ＤＮＡを除去するために使用され得、そしてまた、有益に、ビリオンを不活化するために使用され得る［６９］。

０．２５ｍｌ体積あたり＜１０ｎｇ（例えば＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、１５μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、好ましい。０．５ｍｌ体積あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンであるような、５０μｇの赤血球凝集素あたり＜１０ｎｇ（例えば、＜１ｎｇ、＜１００ｐｇ）の宿主細胞ＤＮＡを含むワクチンが、より好ましい。

任意の残留宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは５００ｂｐ未満（例えば、４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満など）であることが、好ましい。

細胞株（例えば、ＭＤＣＫ細胞）における増殖について、ウイルスは、懸濁物における細胞［４２、７０、７１］または付着培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ）中の細胞において増殖され得る。懸濁培養のための１つの適切なＭＤＣＫ細胞株は、ＭＤＣＫ ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された）である。代替物として、マイクロキャリア培養（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）が、使用され得る。

インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、無血清培地および／またはタンパク質を含まない培地において増殖される。培地は、ヒト起源または動物起源の血清に由来する添加物が存在しない本発明の文脈において、無血清培地と称される。タンパク質を含まないことは、上記細胞の増殖がタンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物および非血清タンパク質を排除して生じる培養を意味すると理解されるが、ウイルス増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る。そのような培養物において増殖する細胞は、細胞自体のタンパク質をもちろん含む。

インフルエンザウイルス複製を補助する細胞株は、好ましくは、例えば、ウイルス複製の間に、３７℃未満（例えば、３０〜３６℃、または約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃）で増殖される［７２］。

培養された細胞においてウイルスを増殖させるための方法は、一般に、その培養された細胞に培養されるべき株を接種する工程、ウイルス増殖（例えば、ウイルス力価または抗原発現によって決定される）のために所望の期間（例えば、接種の２４時間後と１６８時間後との間）にわたって、感染された細胞を培養する工程、および増殖されたウイルスを回収する工程を包含する。上記培養された細胞は、１：５００〜１：１、好ましくは、１：１００〜１：５、より好ましくは、１：５０〜１：１０の細胞比まで、ウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ_５０によって測定される）を接種される。上記ウイルスは、上記細胞の懸濁物に添加されるか、または上記細胞の単一層に適用され、そしてそのウイルスは、２５℃〜４０℃（好ましくは、２８℃〜３７℃）にて、少なくとも６０分間（しかし通常は、３００分未満（好ましくは、９０分間と２４０分間との間））にわたってその細胞上に吸着される。上記感染された細胞の培養物（例えば、単一層）は、回収される培養上清のウイルス含量を増大させるために、凍結解凍または酵素作用のいずれかによって除去され得る。次いで、上記回収された流体は、凍結されて不活化または保存のいずれかが行われる。培養された細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは、０．００２〜５、より好ましくは、０．００１〜２の感染多重度（「ｍ．ｏ．ｉ．」）にて感染され得る。よりさらに好ましくは、上記細胞は、約０．０１のｍ．ｏ．ｉにて感染される。感染された細胞は、感染後３０時間〜６０時間で回収され得る。好ましくは、上記細胞は、感染後３４時間〜４８時間で回収される。よりさらに好ましくは、上記細胞は、感染後３８時間〜４０時間で回収される。プロテアーゼ（代表的に、トリプシン）は、一般に、ウイルスの放出を可能にするために細胞培養の間に添加され、そしてそのプロテアーゼは、その培養の間の任意の適切な段階において添加され得る。

赤血球凝集素（ＨＡ）は、不活化インフルエンザワクチン中の主要な免疫原であり、そしてワクチン用量は、代表的に、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）アッセイによって測定されるようなＨＡレベルを参照することによって標準化される。ワクチンは、代表的に、１株あたり約１５μｇのＨＡを含むが、より低い用量がまた、例えば、小児のためかまたは流行性の状況において使用される。しかし、生ワクチンについて、投薬量は、ＨＡ含量よりもむしろ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）によって測定され、そして１株あたり１０^６と１０^８との間（好ましくは、１０^６．５〜１０^７．５の間）のＴＣＩＤ_５０が、代表的である。１／２（すなわち、１株あたり７．５μｇのＨＡ）、１／４および１／８のような分割量が、より高い用量（例えば、３×用量または９×用量［７５、７６］）を有する場合に使用されている［７３、７４］。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株あたり０．１μｇと１５０μｇとの間のＨＡ、好ましくは、０．１μｇと５０μｇとの間（例えば、０．１μｇ〜２０μｇ、０．１μｇ〜１５μｇ、０．１μｇ〜１０μｇ、０．１μｇ〜７．５μｇ、０．５μｇ〜５μｇなど）のＨＡを含み得る。特定の用量は、例えば、１株あたり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約１．９、約１．５などを含む。これらのより低い用量は、本発明のようにアジュバントがワクチン中に存在する場合、最も有用である。本発明のキットおよび方法の成分（例えば、それらの体積および濃度）は、最終混合産物中にこれらのＨＡ用量を提供するために選択され得る。

本発明で使用されるＨＡは、ウイルスにおいて見出されるような天然のＨＡであっても、改変されていてもよい。例えば、ウイルスを鳥類種において非常に病原性にする決定因子（例えば、ＨＡ１とＨＡ２との間の切断部位周辺の超塩基性領域（ｈｙｐｅｒ−ｂａｓｉｃ ｒｅｇｉｏｎ））を除去するためにＨＡを改変することが、公知である。なぜならば、これらの決定因子は、そうでなければウイルスが卵において増殖されることを妨げ得るからである。

本発明の組成物は、特に、スプリットワクチンまたは表面抗原ワクチンのために、洗浄剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎｓ」として公知である）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウム）を含み得る。上記洗浄剤は、微量でのみ存在し得る。したがって、上記ワクチンは、各々１ｍｇ／ｍｌ未満のオクトキシノール−１０、α−コハク酸水素トコフェロールおよびポリソルベート８０を含み得る。残りの他の微量成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。

不活化されている非全細胞ワクチン（例えば、ウイルス成分ワクチンまたは精製された表面抗原ワクチン）は、この抗原内に位置するさらなるＴ細胞エピトープからの利益を受けるために、マトリックスタンパク質を含み得る。したがって、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼを含む非全細胞ワクチン（特に、スプリットワクチン）は、Ｍ１および／またはＭ２マトリックスタンパク質をさらに含み得る。マトリックスタンパク質が存在する場合、検出可能なレベルのＭ１マトリックスタンパク質を含むことが、好ましい。核タンパク質もまた、存在し得る。

（２つの成分の混合）
本発明の方法は、以下の２つの成分を混合することを包含する：（ｉ）水中油型エマルションおよび（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物。第１の局面において、実質的に等しい体積の（ｉ）および（ｉｉ）が、使用され、そして成分（ｉｉ）は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きいＨＡ濃度を有する。第２の局面において、（ｉｉ）の過剰な体積が、使用される。上記第１の局面において、標準的な抗原用量は、ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品よりも低い用量体積によって達成され得る。上記第２の局面において、所与の量の抗原に必要とされるエマルションの体積は、減少し得る。両方の場合において、最終的なワクチンを得るために必要とされるエマルションの体積は、存在するＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品において使用されるものよりも小さい。

成分の混合は、バルクワクチンを与えるために、製造の間に行われ得るか、または投与のために調整するワクチンを与えるために、使用時点で行われ得る。混合が製造の間に行われる場合、混合される体積は、代表的に、１リットルよりも大きい（例えば、５リットル以上、１０リットル以上、２０リットル以上、５０リットル以上など）。混合が使用時点で行われる場合、混合される体積は、代表的に、１ミリリットルよりも小さい（例えば、０．６ｍｌ以下、０．５以下、０．４ｍｌ以下、０．３ｍｌ以下、０．２ｍｌ以下など）。

実質的に等しい体積のエマルションおよび抗原溶液が使用される場合、混合される体積の比は、実質的に、１：１（例えば、１．１：１と１：１．１との間、好ましくは、１．０５：１と１：１．０５との間、そしてより好ましくは、１．０２５：１と１：１．０２５との間）である。１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きいＨＡを使用することによって、本発明は、１株あたり１５μｇの標準的なＨＡ用量を送達するが、より低い投与体積であるワクチンを与え得る。ＦＬＵＡＤ^ＴＭ製品が、１株について１５μｇあたり０．２５ｍｌのエマルションを必要とすることからして、本発明は、必要とされるエマルションの量を減少させ得る。

過剰な体積の抗原溶液が使用される場合、過剰とは、一般に、少なくとも１．５：１（例えば、２：１以上、２．５：１以上、３：１以上、４：１以上、５：１以上、７．５：１以上、１０：１以上など）である。過剰とは、一般に、２５：１を超えない（例えば、２０：１以下、１５：１以下、１０：１以下など）。０．５ｍｌ用量の最終産物において１株あたり１５μｇの標準的なＨＡ用量が、上記抗原溶液中のＨＡ濃度を１株あたり６０μｇ／ｍｌ未満まで減少させることによって達成され得る。（例えば、過剰が３：１である場合、混合する前のＨＡ濃度は、０．５ｍｌ用量について１株あたり１５μｇの最終濃度を与えるために、１株あたり４０μｇ／ｍｌであるべきである）。

体積の過剰よりも大きく用量を減少させることによって、低い抗原用量のワクチンが、用量体積を維持しつつ達成され得る。例えば、３：１の過剰が、１ｍｌの溶液について１株あたり２０μｇと一緒に使用される場合、０．５ｍｌの用量体積は、１株あたり７．５μｇのＨＡ用量を提供する。

したがって、抗原濃度および過剰な体積比は、任意の望ましい最終抗原濃度および／または用量体積を与えるために、変えられ得る。例えば、０．５ｍｌについて１株あたり１５μｇの最終抗原用量を与えるために、１：ａの、アジュバント：抗原体積の比を使用する場合、上記水性抗原調製物中のＨＡ濃度は、３０（ａ＋１）／ａであるべきである。より低いＨＡ濃度は、０．５ｍｌについて１株あたり１５μｇ未満の最終抗原用量を提供する。

本発明の方法またはキットにおける抗原溶液が、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌ未満のＨＡ濃度を有する場合、そのレベルは、例えば、１株あたり５５μｇ／ｍｌ以下、１株あたり５０μｇ／ｍｌ以下、１株あたり４５μｇ／ｍｌ以下、１株あたり４０μｇ／ｍｌ以下、１株あたり３５μｇ／ｍｌ以下、１株あたり３０μｇ／ｍｌ以下、１株あたり２５μｇ／ｍｌ以下、１株あたり２０μｇ／ｍｌ以下、１株あたり１５μｇ／ｍｌ以下、１株あたり１０μｇ／ｍｌ以下などであり得る。任意の所与の状況において選択される正確な濃度は、また使用されるべき任意の体積の減少に対応して選択され得る。

（薬学的組成物）
本発明の組成物は、薬学的に受容可能である。それらの組成物は、抗原およびアジュバントに加えて、成分を含み得る（例えば、それらの組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含有する）。そのような成分の徹底的な考察は、参考文献７７において入手可能である。

上記組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含み得る。しかし、上記ワクチンは実質的に水銀物質を含まない（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）（例えば、チオメルサールを含まない）べき［２３、７８］であることが、好ましい。水銀を含まないワクチンが、より好ましい。保存剤を含まないワクチンが、特に好ましい。

張度を制御するために、生理的塩（例えば、ナトリウム塩）を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、その塩化ナトリウムは、１ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとの間で存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、二水素リン酸カリウム、無水二ナトリウムリン酸塩、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。

組成物は、一般に２００ｍＯｓｍ／ｋｇと４００ｍＯｓｍ／ｋｇとの間、好ましくは２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の浸透圧モル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内となる。浸透圧モル濃度は、ワクチン接種により引き起こされる痛みに対して影響を有しないことが以前に報告されている［７９］が、この範囲に浸透圧モル濃度を維持することが、やはり好ましい。

組成物は、１つ以上の緩衝剤を含有し得る。代表的な緩衝剤としては、以下が挙げられる：リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤。緩衝剤は、代表的に５〜２０ｍＭの範囲で含有される。

組成物のｐＨは、一般に、５．０と８．１との間、より代表的には６．０と８．０との間、例えば、６．５と７．５との間、または７．０と７．８との間である。したがって、本発明の方法は、包装前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を包含し得る。

上記組成物は、好ましくは、無菌である。上記組成物は、好ましくは、非発熱性である（例えば、１用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な測定単位）、そして好ましくは１用量あたり＜０．１ＥＵを含む）。上記組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

上記組成物は、単回免疫感作のための物質を含んでも、複数回免疫感作（すなわち、「複数回用量」キット）のための物質を含んでもよい。保存剤を含むことが、複数回用量の準備において好ましい。複数回用量組成物中に保存剤を含むことの代わりとして（またはそれに加えて）、その組成物は、物質を除去するための無菌のアダプターを有する容器中に含まれ得る。

インフルエンザワクチンは、代表的に、約０．５ｍｌの投薬体積で投与されるが、半用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が、小児に投与され得る。本発明の１つの利点は、本発明が、０．５ｍｌ未満の体積が容易に調製されることを可能にし得ることである。

組成物中の抗原およびエマルションは、代表的に、混合物中にあるが、それらは、最初に、即時混合のためにキットの分離した成分の形態で提供され得る。

組成物およびキットは、好ましくは、２℃と８℃との間にて保存される。それらは、凍結されるべきではない。それらは、理想的には、直接的な光から免れるべきである。

（本発明のキット）
上述の通り、本発明の組成物は、送達時において即座に調製され得る。したがって、本発明は、混合のために調整された種々の成分を備えるキットを提供する。上記キットは、上記水中油型エマルションおよび上記抗原が使用時まで別々に保持されることを可能にする。任意のさらなる成分は、これら２つのキット成分の一方に含まれても、第３のキット成分の部分であってもよい。

上記成分は、上記キット内で、互いから物理的に分離した形態であり、そしてこの分離は、種々の手段で達成され得る。例えば、上記成分は、分離したバイアルなどの容器中にあり得る。次いで、上記２つのバイアルの内容物は、例えば、一方のバイアルの内容物を取り出し、そしてそれらを他方のバイアルに添加すること、または両方のバイアルの内容物を別々に取り出し、そしてそれらを第３の容器中で混合することによって混合され得る。

好ましい構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、キット成分のうちの一方は、注射器中にあり、そして他方は、バイアルなどの容器中にある。注射器（例えば、針を有する）が、その内容物を混合のための第２の容器中に挿入するために使用され得、次いでその混合物は、その注射器中に引かれ得る。次いで、その注射器の混合された内容物は、代表的に、新規の滅菌針を通して患者に投与され得る。注射器中に１つの成分を包装することは、患者への投与のために別個の注射器を使用する必要性を排除する。

別の好ましい構成において、上記２つのキット成分は、同じ注射器（例えば、二重室注射器（ｄｕａｌ−ｃｈａｍｂｅｒ ｓｙｒｉｎｇｅ）（例えば、参考文献８０〜８７などに開示されるもの））において、一緒であるが分離して保持される。その注射器が、作動される場合（例えば、患者に対する投与の間）、その２つの室の内容物は、混合される。この構成は、使用時における別個の混合工程に対する必要性を回避する。

本発明が過剰な体積の抗原溶液を使用する場合、それに応じて、バイアル、注射器の区画などの体積は、変えられる。

種々のキット成分の内容は、一般には全て、水性形態である。いくつかの構成において、一方の成分（代表的に、エマルション成分よりもむしろ抗原成分）は、乾燥形態（例えば、凍結乾燥された形態）であり、他方の成分は、水性形態である。上記２つの成分は、上記乾燥成分を再活性化し、そして患者に対する投与のための水性組成物を得るために混合され得る。凍結乾燥された成分は、代表的に、注射器よりもむしろバイアル内におかれる。乾燥された成分は、安定剤（例えば、乳糖、ショ糖またはマンニトール、およびそれらの混合物（例えば、乳糖／ショ糖混合物、ショ糖／マンニトール混合物）など）を含み得る。１つの可能な構成は、予め充填された注射器中の水性エマルション成分およびバイアル中の凍結乾燥された抗原成分を使用する。

（組成物またはキット成分の包装）
本発明の組成物（またはキット成分）に適した容器としては、バイアル、注射器（例えば、使い捨て可能な注射器）、点鼻スプレーなどが挙げられる。これらの容器は、無菌であるべきである。

組成物／成分が、バイアル中におかれる場合、そのバイアルは、好ましくは、ガラス材料またはプラスチック材料から作製される。上記バイアルは、好ましくは、上記組成物がそのバイアルに添加される前に滅菌される。ラテックス感受性患者に関する懸案事項を回避するために、バイアルは、好ましくは、ラテックスを含まないストッパーによって密封され、そして全ての包装用物質中にラテックスが存在しないことが、好ましい。上記バイアルは、単回用量のワクチンを含み得るか、またはそのバイアルは、１つよりも多い用量（例えば１０用量）を含み得る（「複数回用量」バイアル）。好ましいバイアルは、無色のガラスから作製される
バイアルは、予め充填された注射器がそのキャップ中に挿入され得るように適合したキャップ（例えば、Ｌｕｅｒロック）を有し得、その注射器の内容物は、（例えば、その中の凍結乾燥された物質を再構成するために）そのバイアル中に排出され得、そしてそのバイアルの内容物は、その注射器中に戻され得る。上記バイアルから上記注射器を取り外した後、次いで針が、接続され得、そして組成物が、患者に投与され得る。上記キャップが、好ましくは、シールまたはカバーの内側に配置されて、そのシールまたはカバーは、そのキャップが接触され得る前に取り外される必要がある。バイアルは、特に、複数回用量バイアルに関して、その内容物の無菌的な取り出しを可能にするキャップを有し得る。

成分が、注射器中に包装される場合、その注射器は、それに接続された針を有し得る。針が接続されない場合、別個の針が、組み立ておよび使用のために注射器とともに提供され得る。そのような針は、シースで覆う（ｓｈｅａｔｈｅ）ことができる。安全針が、好ましい。１インチ２３ゲージの針、１インチ２５ゲージの針および５／８インチ２５ゲージの針が、代表的である。注射器には、その上に内容物のロット番号、インフルエンザの時期および使用期限日がプリントされ得る剥ぎ取りラベルが提供され得、記録維持を容易にする。上記注射器中のプランジャーは、好ましくは、ストッパーを有し、プランジャーが吸引の間に偶発的に外れることを防ぐ。上記注射器は、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有し得る。使い捨て可能な注射器は、単回用量のワクチンを含む。上記注射器は、一般に、針の接続前に先端を密封するために先端キャップを有し、そしてその先端キャップは、好ましくは、ブチルゴムから作製される。上記注射器と針とが別個に包装される場合、その針は、好ましくは、ブチルゴムシールドが取り付けられる。好ましい注射器は、商標名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」^ＴＭで市販されるものである。

容器は、半用量の体積を示して、例えば、小児に対する送達を容易にするために、標識され得る。例えば、０．５ｍｌ用量を含む注射器は、０．２５ｍｌ体積を示す標識を有し得る。

ガラス容器（例えば、注射器またはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラス製の容器よりもホウケイ酸ガラス製の容器を用いることが好ましい。

キットまたは組成物は、上記ワクチンの詳細（例えば、投与のための指示書、ワクチン内の抗原の詳細など）を含む印刷物と一緒に（例えば、同じ箱中に）含まれ得る。その指示書はまた、警告、例えば、ワクチン接種の後のアナフィラキシー反応の場合、直ちに利用できるようにアドレナリンの溶液を準備しておくことなどを含み得る。

（処置およびワクチンの投与の方法）
本発明の組成物は、ヒト患者への投与に適しており、そして本発明は、患者における免疫応答を惹起する方法を提供し、本発明の組成物をその患者に投与する工程を包含する。

本発明はまた、医薬として使用するための本発明のキットまたは組成物を提供する。

本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、実質的に等しい体積の（ｉ）１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きい赤血球凝集素濃度を有するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物；および（ｉｉ）水中油型エマルションアジュバントの使用を提供する。

本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、実質的に等しい体積の（ｉ）１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌ未満の赤血球凝集素濃度を有するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物；および（ｉｉ）水中油型エマルションアジュバントの使用を提供する。

本発明はまた、患者における免疫応答を惹起するための医薬の製造における、：（ｉ）第１体積を有するインフルエンザウイルス抗原の水性調製物；および（ｉｉ）第２体積を有する水中油型エマルションアジュバントの使用を提供し、上記第２体積は、第１体積よりも小さい。

これらの方法および使用によって惹起された免疫応答は、一般に、抗体応答（好ましくは、防御的な抗体応答）を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および防御を評価するための方法は、当該分野において周知である。ヒト研究は、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体力価が防御と相関することを示している（約３０〜４０の血清サンプル赤血球凝集−抑制力価は、同種のウイルスによる感染に対する約５０％の防御を与える）［８８］。抗体応答は、代表的に、赤血球凝集抑制、マイクロ中和、一次元放射状免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および／または単純放射溶血（ｓｉｎｇｌｅ ｒａｄｉａｌ ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ）（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は、当該分野において周知である。

本発明の組成物は、種々の手段で投与され得る。最も好ましい免疫感作経路は、筋肉内注射（例えば、腕または脚）によるものであるが、他の利用可能な経路としては、皮下注射、鼻腔内［８９〜９１］、経口［９２］、皮内［９３、９４］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［９５］などが挙げられる。

本発明に従って調製されるワクチンは、小児および成人の両方を処置するために使用され得る。インフルエンザワクチンは、最近、小児および成人の免疫感作における６月齢からの使用について推奨される。したがって、上記患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。上記ワクチンを受容するための好ましい患者は、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば５歳以下）、入院患者、医療従事者、国軍および軍人、妊婦、慢性疾患患者、免疫不全患者、そのワクチンを受容する前の７日間において抗ウイルス化合物（例えば、リン酸オセルタミビルなどのオセルタミビルまたはザナミビル化合物；以下を参照のこと）を摂取している患者、および海外渡航者である。上記ワクチンは、これらの群に対してのみ適しているわけではないが、より一般的には集団において使用され得る。流行株に関して、全ての年齢群に対する投与が、好ましい。

処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールによるものであり得る。複数回用量は、一次免疫感作スケジュールおよび／または追加免疫感作スケジュールにおいて使用され得る。複数回用量スケジュールにおいて、種々の用量は、同じかまたは異なる経路（例えば、非経口によるプライム（ｐｒｉｍｅ）および粘膜によるブースト（ｂｏｏｓｔ）、粘膜によるプライムおよび非経口によるブーストなど）によって与えられ得る。１つより多い用量（代表的に、２用量）の投与は、特に、免疫学的にナイーブな患者において有用である（例えば、以前にインフルエンザワクチンを受容したことがない者のためか、または新規のＨＡサブタイプに対してワクチン接種するため（流行の発生において））。複数回用量は、代表的に、少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）の間隔を空けて投与される。

本発明の好ましい組成物は、効力に関してＣＰＭＰ判定基準の１、２または３を満たす。成人（１８〜６０歳）において、これらの基準は、（１）７０％以上のセロプロテクション（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；（２）４０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２．５倍以上のＧＭＴ増加である。高齢者（＞６０歳）において、これらの判定基準は、（１）６０％以上のセロプロテクション；（２）３０％以上のセロコンバージョン；および／または（３）２倍以上のＧＭＴ増加である。これらの判定基準は、少なくとも５０人の患者による非盲検研究に基づく。

本発明のワクチンは、他のワクチン（麻疹ワクチン、流行耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体化ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば、四価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合体ワクチンなど）と実質的に同時（例えば、医療専門家への同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、特に、高齢患者において有用である。

同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、および特に、インフルエンザウイルスに対して活性な抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時（例えば、医療専門家による同一の医学的な対診または診察の間）に患者に対して投与され得る。これらの抗ウイルス剤としては、ノイラミニダーゼインヒビター（例えば、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸、または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸（そのエステル（例えば、エチルエステル）およびその塩（例えば、リン酸塩）を含む））が挙げられる。好ましい抗ウイルス剤は、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，ホスフェート（１：１）（リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ^ＴＭ）としても公知である）である。

（サイトカイン誘導剤）
本発明の組成物は、サイトカイン誘導剤を含み、そしてこの薬剤と水中油型エマルションとの組み合わせはＴ細胞応答に対する相乗効果を伴う予想外に有効な免疫原性組成物を与えることが、見出されている。Ｔ細胞応答は、抗体応答よりもインフルエンザウイルス抗原連続変異に抵抗することが報告されている。さらに、Ｔ細胞エフェクター機構は、高齢患者における重篤な疾病に対するワクチン誘導性の防御の重要な決定因子であり得［９６］、そしてインフルエンザに対する加齢性の感受性をより強力なインターフェロン−γ応答を誘導することによって減少させることが、可能であり得る［９７］。

本発明の組成物に含めるためのサイトカイン誘導剤は、患者に投与される場合、サイトカイン（インターフェロンおよびインターロイキンを含む）を放出する免疫系を誘発し得る。好ましい薬剤は、インターフェロン−γ；インターロイキン−１；インターロイキン−２；インターロイキン−１２；ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；およびＧＭ−ＣＳＦのうちの１つ以上の放出を誘発し得る。好ましい薬剤は、Ｔｈ１型免疫応答に関連したサイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−２）の放出を誘発する。インターフェロン−γおよびインターロイキン−２の両方の刺激が、好ましい。

これらの組成物を受容する結果として、それ故、患者は、インフルエンザ抗原によって刺激される場合に抗原特異的様式で所望のサイトカインを放出するＴ細胞を有する。例えば、それらの患者の血液から精製されたＴ細胞は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素にインビトロで曝された場合、γ−インターフェロンを放出する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるそのような応答を測定するための方法は、当該分野において公知であり、そしてその方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、フローサイトメトリーおよびリアルタイムＰＣＲが挙げられる。例えば、参考文献９８は、破傷風トキソイドに対する抗原特異的Ｔ細胞媒介性免疫応答（特に、γ−インターフェロン応答）がモニタリングされ、そしてＥＬＩＳＰＯＴが抗原特異的ＴＴ誘導性応答を自発的応答から区別する最も感度の高い方法であるが、フローサイトメトリーによる細胞質内サイトカイン検出が再刺激効果を検出するために最も効率的な方法であったことを見出した研究を報告する。

適切なサイトカイン誘導剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
−免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに結合された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）または二本鎖ＲＮＡを含むもの、あるいはパリンドローム配列を含むオリゴヌクレオチド、あるいはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチド）。
−３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（「ＭＰＬ^ＴＭ」としても公知である「３ｄＭＰＬ」）［９９〜１０２］。
−イミダゾキノリン化合物（例えば、イミキモッド（Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ８３７」）［１０３、１０４］、レシキモッド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）［１０５］、およびそれらのアナログ；ならびにそれらの塩（例えば、塩酸塩）。免疫刺激性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献１０６〜１１０に見出され得る。
−チオセミカルバゾン化合物（例えば、参考文献１１１に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献１１１に記載される。上記チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に有効である。
−トリプタントリン化合物（例えば、参考文献１１２に開示されるもの）。活性化合物についての処方、製造、およびスクリーニングの方法はまた、参考文献１１２に記載される。上記チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に有効である。
−（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

などのヌクレオシドアナログ、およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献１１３〜１１５に開示される化合物；（ｆ）式：

を有する化合物（ここで、
Ｒ_１およびＲ_２は、各々独立して、Ｈ、ハロ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−ＯＨ、Ｃ_１−６アルコキシ、置換Ｃ_１−６アルコキシ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、Ｃ_６−１０アリール、置換Ｃ_６−１０アリール、Ｃ_１−６アルキル、または置換Ｃ_１−６アルキルであり；
Ｒ_３は、存在しないか、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_６−１０アリール、置換Ｃ_６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
Ｒ_４およびＲ_５は、各々独立して、Ｈ、ハロ、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキルであるか、または一緒に結合されてＲ_４−５：

のような５員環を形成し、この結合は、

によって示される結合において達成され、Ｘ_１およびＸ_２は、各々独立して、Ｎ、Ｃ、Ｏ、またはＳであり；
Ｒ_８は、Ｈ、ハロ、−ＯＨ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、−ＯＨ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ_ｃ、−Ｏ−（Ｃ_１−６アルキル）、−Ｓ（Ｏ）_ｐＲ_ｅ、または−Ｃ（Ｏ）−Ｒ_ｄであり；
Ｒ_９は、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリルまたはＲ_９ａであり、Ｒ_９ａは、

であり、この結合は、

によって示される結合において達成され；
Ｒ_１０およびＲ_１１は、各々独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ_１−６アルコキシ、置換Ｃ_１−６アルコキシ、−ＮＲ_ａＲ_ｂ、または−ＯＨであり；
各々のＲ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、Ｃ_６−１０アリールであり；
各Ｒ_ｃは、独立して、Ｈ、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、Ｃ_１−６アルキル、または置換Ｃ_１−６アルキルであり；
各Ｒ_ｄは、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６アルコキシ、置換Ｃ_１−６アルコキシ、−ＮＨ_２、−ＮＨ（Ｃ_１−６アルキル）、−ＮＨ（置換Ｃ_１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ_１−６アルキル）_２、−Ｎ（置換Ｃ_１−６アルキル）_２、Ｃ_６−Ｉ０アリール、またはヘテロシクリルであり；
各Ｒ_ｅは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_６−１０アリール、置換Ｃ_６−１０アリール、ヘテロシクリル、または置換ヘテロシクリルであり；
各Ｒ_ｆは、独立して、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、置換Ｃ_１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ_ｄ、ホスフェート、ジホスフェート、またはトリホスフェートであり；
各ｎは、独立して、０、１、２、または３であり；
各ｐは、独立して、０、１、または２である）；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの薬学的に受容可能な塩、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの互変異性体、またはその互変異性体の薬学的に受容可能な塩。
−ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）［１１６］。
−参考文献１１７に開示される化合物（アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物［１１８、１１９］、ヒドラフタラミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン化合物、ピロール化合物［１２０］、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物、およびベンザゾール（Ｂｅｎｚａｚｏｌｅ）化合物［１２１］を含む）。
−参考文献１２２に開示される化合物。
−参考文献１２３に規定されるような、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ：

の化合物、あるいはその塩、例えば、「ＥＲ ８０３０５８」、「ＥＲ ８０３７３２」、「ＥＲ ８０４０５３」、「ＥＲ ８０４０５８」、「ＥＲ ８０４０５９」、「ＥＲ ８０４４４２」、「ＥＲ ８０４６８０」、「ＥＲ ８０４７６４」、「ＥＲ ８０４０５７」（以下に示される構造）：

またはＥＲ−８０３０２２（以下に示される構造）：

−アミノアルキルグルコサミニドグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９［１２４、１２５］）。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞におけるサイトカイン応答を刺激するＲＣ−５２９の能力は、参考文献１２６に報告される。
−例えば、参考文献１２７および１２８に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）などのホスファゼン。
−ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４［１２９、１３０］：

などの、ホスフェート含有非環式骨格に結合された脂質を含む化合物。
−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−エチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２５４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−ペンチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロプ−２−エニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−［（フェニルメチル）チオ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
１−（２−メチルプロピル）−２−（プロピルチオ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エタノール；
２−［［４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−イル］（メチル）アミノ］エチルアセテート；
４−アミノ−１−（２−メチルプロピル）−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン；
Ｎ２−ブチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−ブチル−Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−１−（２−メチルプロピル）−Ｎ４，Ｎ４−ビス（フェニルメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
１−｛４−アミノ−２−［メチル（プロピル）アミノ］−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル｝−２−メチルプロパン−２−オール；
１−［４−アミノ−２−（プロピルアミノ）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール；
Ｎ４，Ｎ４−ジベンジル−１−（２−メトキシ−２−メチルプロピル）−Ｎ２−プロピル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２，４−ジアミン；
などの低分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）。

本発明において使用するためのサイトカイン誘導剤は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のモジュレーターおよび／またはアゴニストであり得る。例えば、それらは、ヒトＴＬＲ１タンパク質、ヒトＴＬＲ２タンパク質、ヒトＴＬＲ３タンパク質、ヒトＴＬＲ４タンパク質、ヒトＴＬＲ７タンパク質、ヒトＴＬＲ８タンパク質、および／またはヒトＴＬＲ９タンパク質のうちの１つ以上のアゴニストであり得る。好ましい薬剤は、ＴＬＲ７のアゴニスト（例えば、イミダゾキノリン）および／またはＴＬＲ９のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である。これらの薬剤は、先天免疫経路を活性化するために有用である。

上記サイトカイン誘導剤は、上記組成物に、その組成物の産生の間の種々の段階において添加され得る。例えば、そのサイトカイン誘導剤は、抗原組成物内にあり得、次いでこの混合物は、水中油型エマルションに添加され得る。その代わりとして、そのサイトカイン誘導剤は、水中油型エマルション内にあり得、その場合において、その薬剤は、乳化前に上記エマルション成分に添加され得るか、またはそのサイトカイン誘導剤は、乳化後に上記エマルションに添加され得るかのいずれかである。同様に、上記薬剤は、エマルション小滴内にコアセルベート化され得る。最終組成物内の上記サイトカイン誘導剤の配置および分布は、そのサイトカイン誘導剤の親水／脂肪親和性に依存する（例えば、上記薬剤は、水相中、油相中、および／または油−水界面に位置し得る）。

上記サイトカイン誘導剤は、抗原などの別個の因子に結合体化され得る（例えば、ＣＲＭ１９７）。低分子に対する結合体化技術の総説は、参考文献１３１に提供される。その代わりとして、上記アジュバントは、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などによってさらなる因子と非共有結合され得る。

２つの好ましいサイトカイン誘導剤は、（ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）３ｄＭＰＬである。

（免疫刺激性オリゴヌクレオチド）
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド改変／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得、そして二本鎖であっても（ｄｓＲＮＡを除いて）一本鎖であってもよい。参考文献１３２、１３３および１３４は、可能なアナログ置換（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換）を開示する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１３５〜１４０においてさらに考察される。上記ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る（例えば、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ）［１４１］。上記ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導について特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド））か、またはその配列は、Ｂ細胞応答の誘導について、より特異的であり得る（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献１４２〜１４４において考察される。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その５’末端がレセプター認識を達成可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するようにそれらの３’末端において結合され得る。例えば、参考文献１４１および参考文献１４５〜１４７を参照のこと。有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅ^ＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知であるＣｐＧ７９０９である。

ＣｐＧ配列を使用する代わりか、またはそれに加えて、ＴｐＧ配列が、使用され得る［１４８］。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。

上記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンが豊富であり得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したチミジンヌクレオチド（例えば、参考文献１４８に開示されるようなＴＴＴＴ）を含み得るか、そして／または免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のチミジンを含むヌクレオチド組成を有し得る。例えば、その免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１個より多くの連続したシトシンヌクレオチド（例えば、参考文献１４８に開示されるようなＣＣＣＣ）を含み得るか、そして／またはその免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、＞２５％（例えば、＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）のシトシンを含むヌクレオチド組成を有し得る。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まない可能性がある。

免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、代表的に、少なくとも２０個のヌクレオチドを含む。それらは、１００個よりも少ないヌクレオチドを含み得る。

（３ｄＭＰＬ）
３ｄＭＰＬ（３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡまたは３−Ｏ−脱アシル−４’−モノホスホリルリピドＡとしても公知である）は、モノホスホリルリピドＡ中の還元末端グルコサミンの３位が脱アシル化されるアジュバントである。３ｄＭＰＬは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａのヘプトース欠損（ｈｅｐｔｏｓｅｌｅｓｓ）変異体から調製され、そして化学的にリピドＡに類似しているが、酸に不安定なホスホリル基および塩基に不安定なアシル基を欠いている。それは、単球／マクロファージ系統の細胞を活性化し、そして数種のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦを含む）の放出を刺激する（参考文献１２６もまた参照のこと）。３ｄＭＰＬの調製は、最初に、参考文献１４９に記載された。

３ｄＭＰＬは、それらのアシル化によって変動する（例えば、異なる長さであり得る３、４、５または６のアシル鎖を有する）関連分子の混合物の形態をとり得る。２つのグルコサミン（２−デオキシ−２−アミノ−グルコースとしても公知の）単糖は、それらの２位の炭素（すなわち、２位および２’位）でＮ−アシル化され、そしてまた３’位でＯ−アシル化されている。炭素２に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^１Ｒ^１’を有する。炭素２’に結合する基は、式−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^２Ｒ^２’を有する。炭素３’に結合する基は、式−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＲ^３Ｒ^３’を有する。代表的な構造は以下：

である。

基Ｒ^１、Ｒ^２およびＲ^３は、各々独立して−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＨ_３である。ｎの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、より好ましくは、９〜１２の間であり、そして最も好ましくは、１０である。

基Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’は、各々独立して、（ａ）−Ｈ；（ｂ）−ＯＨ；または（ｃ）−Ｏ−ＣＯ−Ｒ^４；であり得、ここでＲ^４は−Ｈまたは−（ＣＨ_２）_ｍ−ＣＨ_３のいずれかであり、ここでｍの値は、好ましくは、８〜１６の間であり、そしてより好ましくは、１０、１２または１４である。２位では、ｍは、好ましくは、１４である。２’位では、ｍは、好ましくは、１０である。３’位では、ｍは、好ましくは、１２である。したがって、基Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’は、好ましくは、ドデカン酸、テトラデカン酸またはヘキサデカン酸由来の−Ｏ−アシル基である。

Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のすべてが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは３つのアシル鎖のみを有する（２位、２’位および３’位の各々に１つ）。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のうち２つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは４つのアシル鎖を有し得る。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のうち１つのみが−Ｈである場合、上記３ｄＭＰＬは５つのアシル鎖を有し得る。Ｒ^１’、Ｒ^２’およびＲ^３’のいずれもが−Ｈではない場合、上記３ｄＭＰＬは、６つのアシル鎖を有し得る。本発明に従って用いられる３ｄＭＰＬアジュバントは、３〜６つのアシル鎖を備えたこれらの形態の混合物であり得るが、この混合物中に６つのアシル鎖をもつ３ｄＭＰＬを含むことが好ましく、そして特に６つのアシル鎖形態が総３ｄＭＰＬの少なくとも１０重量％、例えば、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上またはさらに多くを占めることが好ましい。６つのアシル鎖を備えた３ｄＭＰＬは、最もアジュバント活性な形態であることが見出された。

従って、本発明の組成物に含めるために３ｄＭＰＬの最も好ましい形態は、

である。

３ｄＭＰＬが混合物の形態で使用される場合、本発明の組成物中の３ｄＭＰＬの量または濃度に関する言及は、混合物中の合わせた３ｄＭＰＬ種をいう。

水性条件では、３ｄＭＰＬは、異なるサイズを備えた（例えば、直径＜１５０ｎｍまたは＞５００ｎｍを備えた）ミセル凝集体または粒子を形成し得る。これらのいずれか、または両方は、本発明とともに使用され得、そしてより良好な粒子が通常のアッセイによって選択され得る。より小さな粒子（例えば、３ｄＭＰＬの透明な水性懸濁物を与えるに十分小さい）が、より優れた活性［１５０］に起因して、本発明に従う使用に好ましい。好ましい粒子は、２２０ｎｍより小さいか、より好ましくは２００ｎｍより小さいか、１５０ｎｍより小さいか、あるいは１２０ｎｍより小さい平均直径を有し、１００ｎｍより小さい平均直径を有しさえし得る。しかしながら、大部分の場合において、この平均直径は、５０ｎｍより小さくはない。これらの粒子は、濾過滅菌に適するほどに十分小さい。粒子直径は、通常の動的光散乱法の技法によって評価され得、平均粒子直径が明らかとなる。粒子がｘｎｍの直径を有するといわれる場合、一般的にはおおよそこの平均の粒子の分布が存在するが、粒子の数で少なくとも５０％（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、またはそれより多く）がｘ±２５％の範囲内の直径を有する。

実質的に全ての３ｄＭＰＬは、好ましくは、上記エマルションの水相に位置する。

ワクチン中の３ｄＭＰＬの代表的な量は、１０〜１００μｇ／用量（例えば、約２５μｇまたは約５０μｇ）である。

３ｄＭＰＬはそれ自体でアジュバントとして使用され得るか、またはさらに１つ以上のアジュバント化合物と組み合わせて使用され得る。例えば、ＱＳ２１サポニン［１５１］（エマルション［１５２］を含む）、リン酸アルミニウム［１５３］、または水酸化アルミニウム［１５４］と組み合わせて３ｄＭＰＬを使用することが公知である。

（一般）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、専らＸからなり得るか、またはさらなる何かを含有し得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくても良い。必要である場合、語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。

数値ｘに関する用語「約」は、例えば、ｘ±１０％を意味する。

詳細に述べられていなければ、２つ以上の成分を混合する工程を含むプロセスは、混合の任意の特定の順序を要求しない。したがって、成分は任意の順序で混合され得る。３つの成分が存在するとき、そのときは、２つの成分が互いと組み合わされ得、そして次にこの組み合わせが、第３の成分と組み合わされ得るなどである。

動物（および特にウシ）材料が細胞の培養に使用される場合、それらを、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）のない、および特にウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）のない供給源から取得しなければならない。総合的に、動物に由来する材料の完全な非存在下で細胞を培養することが、好ましい。

化合物が、組成物の部分として投与される場合、その化合物は、代替的に、適切なプロドラッグによって置換され得る。

細胞基質が、リアソータント手順または逆方向遺伝学手順のために使用される場合、それは、好ましくは、例えば、Ｐｈ Ｅｕｒ総論（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｐｔｅｒ）５．２．３にあるようなヒトワクチン生産における使用について承認されているものである。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法であって、成分（ｉｉ）中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌよりも大きい、方法。
（項目２）
前記ワクチンの単位用量の体積は、０．５ｍｌ未満である、項目１に記載の方法。
（項目３）
実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法であって、該ワクチンの単位用量の体積は、０．５ｍｌ未満である、方法。
（項目４）
（ａ）実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合して、バルクワクチンを与える工程；および（ｂ）少なくとも１つの単位用量を該バルクワクチンから取り出す工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法であって、該単位用量の体積は、０．５ｍｌ未満である、方法。
（項目５）
成分（ｉｉ）中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり約６０μｇ／ｍｌである、項目３または項目４に記載の方法。
（項目６）
実質的に等しい体積の（ｉ）水中油型エマルションと（ｉｉ）インフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法であって、該ワクチン中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり３０μｇ／ｍｌ未満である、方法。
（項目７）
第１体積の水中油型エマルションと第２体積のインフルエンザウイルス抗原の水性調製物とを混合する工程を包含する、アジュバント添加されたインフルエンザワクチンを作製するための方法であって、該第２体積は、該第１体積よりも大きい、方法。
（項目８）
前記第２体積中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり約６０μｇ／ｍｌである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第２体積中の赤血球凝集素の濃度は、１インフルエンザウイルス株あたり６０μｇ／ｍｌ未満である、項目７に記載の方法。
（項目１０）
項目１〜９のいずれかに記載の方法によって入手可能である、組成物。
（項目１１）
水中油型エマルションとインフルエンザウイルス抗原とを含むワクチン組成物であって、該ワクチンは、０．５ｍｌ未満の体積を有する、ワクチン組成物。
（項目１２）
インフルエンザウイルス赤血球凝集素とスクアレンとを含むワクチン組成物であって、赤血球凝集素に対するスクアレンの重量比は、５０と２０００との間であり、そして該ワクチンは、０．５ｍｌ未満の体積を有する、ワクチン組成物。
（項目１３）
１株あたり約３０μｇ／ｍｌのＨＡ濃度を有する、項目１２に記載のワクチン。
（項目１４）
１株あたり３０μｇ／ｍｌよりも大きいＨＡ濃度を有する、項目１２に記載のワクチン。
（項目１５）
１株あたり３０μｇ／ｍｌ未満のＨＡ濃度を有する、項目１２に記載のワクチン。
（項目１６）
水中油型エマルションとｎ種のインフルエンザウイルス株由来の赤血球凝集素とを含む組成物であって、赤血球凝集素に対する油の重量比は、６４０／ｎ未満である、組成物。
（項目１７）
ｎの値は、１、２、３または４である、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記水中油型エマルションは、スクアレンを含む、項目１〜１７のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目１９）
前記水中油型エマルションは、ポリソルベート８０を含む、項目１〜１８のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目２０）
前記インフルエンザウイルス抗原は、不活化ウイルスである、項目１〜１９のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目２１）
前記インフルエンザウイルス抗原は、全ウイルス、スプリットウイルス、または精製された表面抗原を含む、項目２０に記載の方法または組成物。
（項目２２）
前記インフルエンザウイルス抗原は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９のインフルエンザＡ型ウイルスサブタイプ由来である、項目１〜２１のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目２３）
前記インフルエンザウイルス抗原は、卵において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜２２のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目２４）
前記インフルエンザウイルス抗原は、細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製される、項目１〜２３のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目２５）
前記細胞培養物は、ＭＤＣＫ細胞培養物である、項目２４に記載の方法または組成物。
（項目２６）
前記組成物は、オボアルブミン、オボムコイドおよびニワトリＤＮＡを含まない、項目２４に記載の方法または組成物。
（項目２７）
項目１０〜２６のいずれか１項に記載の組成物を調製するための、キット。

図１は、異なるエマルション：抗原体積の比を使用して調製された組成物についてのＨ１Ｎ１株に対する血清ＥＬＩＳＡ抗体力価（Ｌｏｇ_１０）を示す。 図２は、Ｈ３Ｎ２についての同じデータを示す。 図３は、インフルエンザＢ型ウイルス株についての同じデータを示す。

（本発明を実施するための様式）
インフルエンザサブユニットワクチンを、ＭＤＣＫ細胞培養物において増殖させたウイルスから調製した。株は、以下であった：（ｉ）Ａ／Ｗｙｏｍｉｎｇ Ｈ３Ｎ２；（ｉｉ）Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ Ｈ１Ｎ１；および（ｉｉｉ）Ｂ／Ｊｉａｎｇｓｕ。これらのワクチンを、使用して、１ワクチン用量について１株あたり０．２μｇのＨＡを使用して筋肉内経路によってマウスを免疫感作するためのアジュバント添加したワクチンを調製した。上記ワクチン中のアジュバントは、ＭＦ５９であった。上記アジュバントを、異なる比で水性ＨＡ抗原と混合した。上記マウスは、各場合において同体積の材料を受容し、そして上記水性ＨＡ抗原の量は、全ての実験について一定であった。しかし、ＭＦ５９の体積を、１：１の最大値から減少させた。０．７５、０．５０、０．２５および０．１０の体積比を、使用した。コントロールには、アジュバントを使用しなかった。

図１に示す通り、最大で１０分の１までＭＦ５９エマルションの量を減少させることは、全くかまたはほとんど、全体的な免疫原性に対して影響を有さなかった。したがって、インフルエンザワクチンに必要とされるエマルションアジュバントの量は、ＦＬＵＡＤ^ＴＭにおいて使用された１：１の比から減少させることができ、それによって、より多くのワクチンが所与の量のエマルションから作製されることを可能にする。

本発明は例示のみによって記載され、そして改変は本発明の範囲および精神の中にあるままでもなされ得ることが、理解される。

（参考文献（その内容は、本明細書によって参考として援用される））

［１０９］米国特許第４６８９３３８号、同第４９２９６２４号、同第５２３８９４４号、同第５２６６５７５号、同第５２６８３７６号、同第５３４６９０５号、同第５３５２７８４号、同第５３８９６４０号、同第５３９５９３７号、同第５４８２９３６号、同第５４９４９１６号、同第５５２５６１２号、同第６０８３５０５号、同第６４４０９９２号、同第６６２７６４０号、同第６６５６９３８号、同第６６６０７３５号、同第６６６０７４７号、同第６６６４２６０号、同第６６６４２６４号、同第６６６４２６５号、同第６６６７３１２号、同第６６７０３７２号、同第６６７７３４７号、同第６６７７３４８号、同第６６７７３４９号、同第６６８３０８８号、同第６７０３４０２号、同第６７４３９２０号、同第６８００６２４号、同第６８０９２０３号、同第６８８８０００号および同第６９２４２９３号．

Claims (1)

1. 明細書に記載された発明。

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