JP2015083696A - セルロース誘導体微粒子、その分散液、その分散体及び診断薬 - Google Patents

Abstract

【課題】粒径が小さく親水性のセルロース誘導体微粒子、その分散液およびその分散体を提供すること、並びに保存安定性に優れ、乳化剤や界面活性剤などの余分な成分を必要とせず、かつ、親水性粒子から構成される診断薬を提供すること。【解決手段】セルロースの水酸基の一部が置換基で置換されたセルロース誘導体からなり、平均粒径が９〜１０００ｎｍであることを特徴とするセルロース誘導体微粒子、並びに該セルロース誘導体微粒子に検査対象物質と特異的に結合する物質を担持させてなる診断薬。【選択図】図１

Description

本発明は水酸基の一部が誘導体化されたセルロース微粒子とその分散体、及びそれを用いた診断薬に関する。

現在、ナイロン、ポリエチレン、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、セルロースなど数多くの高分子微粒子が様々な用途に用いられている。その具体的な用途を挙げようとすれば数限りないが、例えば滑り性付与剤、トナー、塗料用艶消し剤、光拡散用の添加剤、包装材のブロッキング防止材、絶縁フィラー、結晶核剤、クロマトグラフィー用充填剤、研磨剤及びその他の各種添加剤等である。さらに近年では液晶ディスプレーのスペーサー、分析機器の校正用標準粒子及び多孔膜の検定用標準粒子、診断薬用担体等の用途も拡大している。

これら高分子微粒子の中でもセルロースは、その他の合成高分子にはない様々な特徴を有している。その特徴の具体例としては（１）化学的に比較的安定であり溶解しにくいこと、（２）耐熱性を有し高温でも溶解しないこと、（３）吸水性、吸油性の両方を有する両親媒性ポリマーであること、（４）天然物由来であり、人体に対し無害であるとみなされていること、（５）賦型性、成形性を有していること、（６）蛋白質などの物質との相互作用を起こしにくく吸着を起こさないこと、（７）水酸基を多く有し化学修飾が容易であること、（８）容易に燃焼し有害物の発生がないこと、（９）生分解性のポリマーであり環境に対し無害であると見なされていること、等が挙げられる。

上記（１）〜（９）の特徴を生かしセルロース微粒子は様々な用途に適応されている。具体的な用途を記載しようとすれば数限りないが、例えば、各種分画用カラム充填剤、酵素支持体、微生物培養担体、細胞培養担体、濾材、吸着剤、医薬物賦型材、医薬物崩壊材、医薬物増量剤、増粒基材、食品用増粘調整剤、チキソ性付与材、分散安定剤、プラスチック増量剤、フィラー、化粧用ファウンデーション基材、外装塗料用改質材、コート剤、焼成法触媒製造用成型剤、繊維壁用素材、感圧複写紙用配合剤、等の多方面に及んでいる。

セルロースはβ-グルコース分子からなる重合体であり、β-グルコース分子が持つ３つの水酸基がその特徴に大きく影響している。そしてその水酸基の一部を他の構造に変換したものはセルロース誘導体と呼ばれる。このセルロース誘導体は置換する構造の種類、置換の程度を表す置換度、などに応じて様々な特徴を持つ。このセルロース誘導体もセルロース同様にその特徴を生かした様々な用途に用いられている。

本願発明者らは過去に、微粒子の粒径が小さく、かつ微粒子を構成するセルロースの平均重合度が充分に高いという特徴を併せ持ったセルロース微粒子を見出している。そして驚くべきことに、粒径の小さなセルロース微粒子は界面活性剤を加えることなく水や様々な媒体中で凝集を起こしにくく、長期の分散安定性に優れることも見出している。それらは上記セルロースの特徴と小さな粒径を併せ持つ有用な微粒子であり、様々な用途への応用が期待できる。しかしながら、粒径が小さいセルロース誘導体の微粒子となると、非常に限られた種類のものしか明らかになっていない。

現在明らかになっている粒径が小さいセルロース誘導体微粒子としては、特許文献１および特許文献２に記載のものが挙げられる。これらはいずれもセルロースを予め誘導体化しておき、それをナノサイズの小さな粒子状に成形したものである。セルロースは水や有機溶媒またはその混合物に対して基本的に溶解しないのに対し、誘導体化により可溶性にすることが可能で、溶解した溶液を利用して粒子状に成形することができる。しかしながらこれらの文献に記載された方法で得られたセルロース誘導体微粒子は、基本的に水溶性であり水の中では溶解してしまうため、利用することができる用途が非常に限られたものになってしまう。また水酸基のほとんどを置換してしまえば非水溶性となりうることも考えられるが、そのようなセルロース誘導体微粒子はセルロースの特徴である親水性を生かすことができない。この場合も用途が非常に限定され、更には微粒子自体が水の中で凝集してしまうことが予想される。
すなわち、粒径が小さく、水の中でも溶解せず、かつ安定的に分散して存在できるセルロース誘導体微粒子は未だ明らかになっていない。このようなセルロース誘導体微粒子はセルロース微粒子同様に様々な用途への展開が期待される。そのうちの一つの例として診断薬用担体が挙げられる。

診断薬とは、生物の体内にある分子を分析して体内の異常や変化を検出するための試薬を指す。代表的なものとしては免疫血清検査、血液検査、細胞検査および遺伝子検査などが挙げられる。また生物の体内にある分子を分析するわけではないが、ペプチドアレイや蛋白質アレイなど、アミノ酸の配列を調べる検査も広義では診断薬に含まれると言える。いずれにせよこれらの検査は検査対象物質と特異的に相互作用する物質を利用するものである。診断薬の中でも最も代表的なものが免疫血清検査であり、イムノアッセイとも呼ばれる。イムノアッセイは抗原と抗体の特異的反応を利用した検査法であり、癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭおよび凝固・線溶等の検査対象物質を検出することを目的とするものである。このような診断薬はその簡便性と迅速性から臨床検査の分野において実際に広く用いられている。そしてより微量の検査対象物質を測定できる高感度化が求められているのが現状である。

微粒子を用いた診断薬は、検査対象物質と特異的に相互作用する物質を微粒子に担持させ、検査対象物質が存在した場合に生じる変化を検出することで診断を行う。診断薬用担体としては金コロイドと呼ばれる金のナノ微粒子やポリスチレン製のナノ微粒子が一般的に用いられている。例えば特許文献３に記載の金のナノ微粒子を用いるイムノクロマト法、特許文献４に記載のポリスチレンのナノ微粒子を用いるラテックス法などである。

しかしながらこれらのナノ微粒子は一般的に疎水性であるため、保存安定性が低く微粒子同士が凝集・沈降してしまう、検査対象物質以外の物質とも相互作用を起こしてしまう非特異吸着が発生する、などの問題が存在している。また保存安定性を改良するために界面活性剤などの安定剤を用いる場合もあるが、この安定剤自体が非特異吸着の原因になってしまう。また金やポリスチレン製のナノ微粒子の多くは製造段階で還元剤や乳化剤を用いて製造されるが、これら成分が残留し非特異吸着の原因になってしまう。それら様々な問題を解決するため、一般的にはアルブミンなどのブロッキング剤によって微粒子表面を親水性物質で覆うなどの対策が取られている。しかしながらその効果も決して充分なものであるとは言えないのが現状である。非特許文献１には、微粒子の表面を徹底的に親水化することによって、非特異吸着を抑える手法が記載されている。しかしこの手法も微粒子の製造に手間がかかり合理的とは言えない。

このように免疫血清検査に用いる微粒子には親水性の微粒子が求められる場合がある。そして免疫血清検査に限らず、診断薬分野全般においても親水性の微粒子が求められる場合もある。また生体に占める水の割合が非常に高く、生体内における分子の反応の多くは水が関係する環境下で行われることを考えても、バイオメディカル向けの用途においては親水性の微粒子が有用であると予測される。しかしながら現在の一般的なナノ微粒子は金属、無機物および重合性ポリマーなど疎水性であることが多い。このような状況から親水性のナノ微粒子は診断薬用途だけでなく様々な用途においても求められていると言える。

特表２００１−５０３１０１号公報 特開２００７−５２８４３６号公報 特開平１０−６８７３０号公報 特開２０００−３５５５５３号公報

高分子論文集, Ｖｏｌ．５０, Ｎｏ．５, Ｐ４３１−４３５（５月, １９９３）

本発明は、上記現状に鑑み、非水溶性かつ親水性の粒径の小さいセルロース誘導体微粒子、その分散液およびその分散体の提供を目的とするものである。また、検査対象物質と特異的に相互作用する物質を当該セルロース誘導体微粒子に担持させることで、親水性が高く、保存安定性に優れ、かつ乳化剤や界面活性剤などの余分な成分を必要としないという優れた特長を持つ診断薬を提供することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、本発明者らが既に報告している国際公開第２００８／０８４８５４号パンフレットに記載のセルロース微粒子の水酸基の一部を誘導体化し、その置換度を調整することで、水に溶解せず、しかも親水性も高いという特徴を併せ持ったセルロース誘導体微粒子を得ることに成功した。さらに、誘導体化された置換基を利用して、検査対象物質と特異的に相互作用する物質をこのセルロース誘導体微粒子に担持させることで、診断薬用担体として用いることもできることを見出し、本発明に至った。すなわち本発明は以下のとおりである。

（１）セルロースの水酸基の一部が置換基で置換されたセルロース誘導体からなり、平均粒径が９〜１０００ｎｍであることを特徴とするセルロース誘導体微粒子。
（２）前記置換の置換度が２．５以下であることを特徴とする上記（１）に記載のセルロース誘導体微粒子。
（３）前記置換の置換度が１．０以下であることを特徴とする上記（２）に記載のセルロース誘導体微粒子。
（４）前記置換基が、カルボキシル基、アミノ基、４級アンモニウム基、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、シアノエチル基、硫酸基、および少なくとも２つ以上の水酸基同士を結合する架橋基のいずれか１種類以上を含んでいることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子。
（５）セルロース以外の成分が化学結合または物理吸着を介して担持されていることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子。
（６）担持される前記セルロース以外の成分が他の成分と特異的に相互作用する物質を含むことを特徴とする上記（５）に記載のセルロース誘導体微粒子。
（７）担持される前記セルロース以外の成分が生体材料を含むことを特徴とする上記（５）または（６）に記載のセルロース誘導体微粒子。
（８）生体材料が抗原または抗体を含むことを特徴とする上記（７）に記載のセルロース誘導体微粒子。
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子を含むことを特徴とする診断薬。
（１０）セルロース誘導体微粒子が上記（５）〜（８）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子であって、担持されるセルロース以外の成分が検査対象物質と特異的に相互作用する物質を含むことを特徴とする上記（９）に記載の診断薬。
（１１）セルロース誘導体微粒子のＣＶ値が３０％以下であることを特徴とする上記（９）または（１０）に記載の診断薬。
（１２）診断が免疫血清診断であることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の診断薬。
（１３）上記（９）〜（１２）のいずれかに記載の診断薬と検体とを混合し、検体中の検査対象物質を検出することを特徴とする検体検出方法。
（１４）診断薬が上記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の診断薬であり、セルロース誘導体微粒子の凝集度合いから検体中の検査対象物質を検出することを特徴とする上記（１３）に記載の検体検出方法。
（１５）上記（１）〜（８）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子が液体に分散していることを特徴とする分散液。
（１６）上記（１）〜（８）のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子が固体表面に固定または固体中に分散されていることを特徴とする成型体。

本発明のセルロース誘導体微粒子は従来にない小さな粒径を有するセルロース誘導体微粒子であり、更に、親水性が高く、保存安定性が高く、乳化剤や界面活性剤などの余分な成分を必要としない、などの特徴を併せ持っている。また、セルロース誘導体の置換基を利用し、検査対象物質と特異的に相互作用する物質をセルロース誘導体微粒子に担持させることで、優れた特長を持つ診断薬を提供することができる。

実施例１で得られたカルボキシル化セルロース微粒子の電子顕微鏡写真であり、撮影倍率は２万倍でスケールバーは１μｍである。 実施例１６における診断薬評価結果を示した図である（横軸：抗原濃度、縦軸：吸光度変化）。

以下、本願発明について具体的に説明する。
本発明におけるセルロース誘導体微粒子とはセルロース誘導体からなる微粒子であり、その製造方法は特に限定されない。例えば、セルロースを微粒子状に成型した後に誘導体化を行う、予め誘導体化されたセルロース誘導体を微粒子状に成形する、など任意の方法で作製することができる。当然、原料となるセルロースも特に限定されるものではなく、再生セルロース、精製セルロース及び天然セルロース等のセルロースを用いることができる。本発明では、天然セルロースを銅アンモニア溶液に溶解し、凝固液と混合することでミクロ相分離を生起させ、粒子濃厚相を微粒子として取り出す方法によりセルロースを微粒子状に成形し、その後微粒子の誘導体化を行った。

本発明におけるセルロース誘導体とは、セルロースの持つ水酸基の一部が別の異なった置換基に置換されたものを指す。その置換基の種類は特に限定されるものではない。具体的には、カルボキシル基、１級、２級または３級のアミノ基、４級アンモニウム基、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、シアノエチル基、硫酸基、アミド基、アルデヒド基、ニトロ基、硝酸基、トシル基、フェニルカルバニレート基、トリチル基、および少なくとも２つ以上の水酸基同士を結合する架橋基などの置換基を含む基が挙げられる。なお、本発明における架橋とは、セルロースの水酸基同士を何らかの化合物で連結させることを指す。その架橋の方法および種類は特に限定されるものではないが、例えばエピクロルヒドリン、ホルマリン、シランカップリング剤、エポキシ変性シリコーン系架橋剤、グリオキザール系レジン、等の水酸基と反応する部分を２つ以上持つ化合物を用いる事で架橋を行う事ができる。後述の実施例ではグリオキザール系レジンやエピクロルヒドリンを用いて架橋を行った。また、セルロースの染色を行う反応性染料も水酸基との反応を利用しており、染料も置換基の一つと言える。診断薬として用いる場合は抗体等の生体材用との結合のしやすさを考えてカルボキシル基やアミノ基を有することが特に好ましい。これは、抗体に限らず生体材料は様々なアミノ酸から構成されており、アミノ酸が持つカルボキシル基やアミノ基とアミド結合を形成させることができるためである。また置換基の種類が異なるものを併用してもよく、様々な組み合わせで置換することも可能である。例えばセルロース誘導体微粒子を診断薬として用いる際には、微粒子表面の改質や膨潤度合いの改質などの目的で、その他の置換基の導入や架橋などの化学修飾を行ってもかまわない。本発明では、セルロース微粒子を苛性ソーダと混合することでアルカリセルロースを調整し、さらに反応剤を加えることで誘導体化を行った。例えば反応剤としてクロロ酢酸ナトリウムを加え、さらに反応終了後に塩酸で処理することによりカルボキシル化が可能であり、反応剤として２−クロロエチルアミンを用いることにより１級アミノ化が可能であり、さらに反応剤としてエピクロルヒドリンを加えてエポキシ活性化を行い、その後アンモニア水を加えエポキシ基を開裂させることによりアミノ化と架橋を同時に行うことが可能である。またグリオキザール系レジンとそれに適した触媒を用いることで架橋を行うことが可能である。反応剤の種類を変えれば様々な誘導体化が調整でき、様々なセルロース誘導体微粒子を得ることが可能である。

本発明におけるセルロース誘導体の置換の程度は置換度で表され、置換度が高いほどより多くの水酸基が置換されたことを示す。置換度はセルロースのグルコース単位当りどれだけ水酸基が置換されたかを指し、三つの水酸基が全て置換された場合は置換度３、一つ置換された場合は置換度１、まったく置換されていない場合は置換度０で表す。なお、あくまで置換度はセルロースを構成する全てのグルコースの置換度を平均した値である。
本発明におけるセルロース誘導体の置換度は特に限定されるものではない。しかしながら親水性であるためには置換度が２．５以下であることが好ましい。これ以上置換度が高いと本発明の目的である親水性が達成できなくなる場合がある。また置換度が２．５以下でも置換基の種類によっては水溶性であり、水の中での使用が困難になる場合もある。そのような場合には目的の置換基に加え架橋構造を導入してやる事ができる。これによりセルロースを水に不溶化させることができる。置換基の種類、置換する水酸基の位置などにより親水性の度合いが変化するため、親水性であるための置換度を一概に規定することは難しいが、より好ましくは２．０以下、さらに好ましくは１．５以下、特に好ましくは１．０以下、最も好ましくは０．５以下である。

本発明における平均粒径とは、電子顕微鏡にてセルロース誘導体微粒子を撮影し、得られた画像を画像解析することによって得られる体積換算メジアン径を指す。その測定個数は１００個以上とする。電子顕微鏡で撮影した画像は平面画像であり、必ずしも微粒子の立体的形状を表すものではないが、微粒子の観察個数を１００個以上とすることで、立体的な形状を平均値として判断できる。ただし微粒子を電子顕微鏡で観察するには液体に分散した状態の粒子を乾燥させる必要がある。この乾燥時に微粒子が凝集してしまっては、見かけ上の平均粒径が変わってしまうため注意が必要である。乾燥条件の確認のためには、動的光散乱式の粒度分布装置を用いてネバードライの状態での粒径と比較しながら乾燥条件を決定する事が望ましい。なお本発明において微粒子の乾燥は、メタルコンタクト法による凍結乾燥を用いた。また得られた体積換算粒径分布の標準偏差を平均粒径で割った値がＣＶ値（Coefficient of Variationの略）であり、微粒子の均一性を表す指標として用いられる。

本発明における微粒子とは、上記電子顕微鏡による微粒子の画像解析において、微粒子の短径と長径の比（長径／短径）が充分に小さいものを指す。この比が大きすぎる棒状、繊維状または網目状のものは微粒子には含まれない。微粒子としての機能を発揮するためには微粒子１００個の平均値の長径／短径＝１０．０以下、好ましくは５．０以下、特に好ましくは３．０以下、更に好ましくは２．０以下である。この値が小さいほど微粒子の形状は真球状に近くなる。また誘導体化の置換度が高すぎる場合、得られた微粒子は粒子形状が維持できない場合があり、ＩＰＡなどの有機溶媒に微粒子を分散させた状態から粒子を乾燥させた場合は長径／短径が充分小さいのに対し、水に分散させた状態から乾燥させた微粒子は長径／短径が大きくなる場合がある。このような場合、得られているものは微粒子とは言えず、水中で用いる際に問題が生じてしまう。

平均粒径の測定に動的光散乱方式による粒度分布測定ではなく電子顕微鏡画像を用いる理由は、セルロース誘導体は水中で膨潤が起こりやすいためである。これは誘導体化によりセルロースの水素結合が弱まることに起因し、その程度は誘導体化の置換度、種類によって大きく異なるため、それぞれを相対評価することは困難である。

本発明におけるセルロース誘導体微粒子の平均粒径は９〜１０００ｎｍ、好ましくは９〜７００ｎｍである。平均粒径がこの範囲であれば長期保存による沈降が生じにくく、診断薬にも適する。診断薬として用いる場合は２０〜７００ｎｍであることが好ましい。平均粒径が２０ｎｍ以下になると検査対象物質との結合による凝集を検出しにくくなってしまう。逆に、平均粒径が７００ｎｍより大きくなると、液体中で保存する際に粒子の沈降が起こりやすくなってしまう。より好ましくは５０〜５００ｎｍである。ただし診断薬としての感度を向上させるために、分球による均一化を行ってもかまわない、また２種類以上の平均粒径のセルロース誘導体微粒子を混合して用いてもかまわない。

セルロース誘導体微粒子が水に溶けるかどうかは、その置換基の種類、置換度、置換する水酸基の位置、さらには担持させる物質の種類などが影響し、その置換度を一概に定義することは不可能である。例えば、ナトリウム塩型のカルボキシメチル化セルロースの場合は、一般的に置換度０．４までは水不溶、置換度０．６以上で水可溶と言われる。また、２位と３位の水酸基が優先的にカルボキシルメチル化されたものは置換度０．３でも水可溶と言われる。さらにメチル化セルロースの場合は、一般的に１．６〜２．０で水可溶と言われる。このように水不溶なセルロース誘導体の置換度は様々な条件によって大きく異なるため、一概に規定することはできない。

本発明におけるＣＶ値とは、Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎの略で、微粒子の均一性を表す指標として一般的に用いられる。これはセルロース微粒子分散液の粒度分布における分散度を体積基準で表したもので下記式によって定義される。この値が小さいほど粒度分布がシャープであることを示し、それだけセルロース微粒子の大きさが揃っていることを意味する。またその単位は（％）で表される。
ＣＶ値＝（電子顕微鏡画像より求めた体積粒度分布における標準偏差）／（電子顕 微鏡画像より求めた体積平均メジアン径）×１００
本発明におけるセルロース誘導体微粒子のＣＶ値は特に規定されるものではない。ただし診断薬として用いる場合は３０％以下が好ましい。ＣＶ値が３０％を超えると、診断薬としての診断の正確性に悪影響が出る。より好ましくは２５％以下であり、更に好ましくは２０％以下である。一般的にＣＶ値が小さければ診断の正確性は向上するが、ＣＶ値が小さくなりすぎると製造の手間やコストが大きくなってしまう。コストと正確性のバランスを考えると１％以上が好ましい。

本発明におけるセルロース誘導体微粒子は、化学結合または物理吸着を介してセルロース以外の成分を担持させて利用することもできる。化学結合または物理吸着の一例としては、共有結合、イオン結合、配位結合、金属結合、水素結合、親水吸着、疎水吸着、ファンデルワールス結合などが挙げられるがそれらに限定されるものではない。上記のような様々な力によってセルロース誘導体微粒子にセルロース以外の成分を担持させることにより、セルロース誘導体にはない機能を持った微粒子を調整することが可能である。セルロースを誘導体化させていないセルロース微粒子でも、セルロース以外の成分を担持させることは可能だが、置換基の種類を任意に変えることで、より様々な種類の成分を担持させることができる。

本発明におけるセルロース誘導体微粒子に担持させる成分とは、セルロース誘導体以外の様々な物質を指し、その種類は特に限定されない。それらの一例としては、界面活性剤、無機微粒子、有機微粒子、生体材料、染料、イオン性物質、水溶性低分子、ブロッキング剤、等が挙げられるがそれらに限定されるものではない。
本発明におけるセルロース誘導体に担持させる生体材料とは生体から得られる様々な材料を指し、その種類は特に限定されない。それらの一例としては、コラーゲン、ゼラチン、フィブロイン、へパリン、ヒアルロン酸、デンプン、キチン、キトサン、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、炭水化物、脂肪酸、テルペノイド、カロテノイド、テトラピロール、補因子、ステロイド、フラボノイド、アルカノイド、ポリケチド、配糖体、酵素、抗体、抗原、などが挙げられる。それらをセルロース誘導体微粒子に担持させることで、セルロース誘導体微粒子の生体適合性の向上や診断薬としての利用等が可能となる。

本発明においては、セルロース誘導体微粒子に、検査対象物質と特異的に結合する物質を担持させることにより、セルロース誘導体微粒子を診断薬として用いることが可能となる。
本発明における検査対象物質とは、免疫血清検査、血液検査、細胞検査、遺伝子検査、などの検査などにおける測定対象を指しその種類は特に限定されない。例えば、癌マーカー、ホルモン、感染症、自己免疫、血漿蛋白、ＴＤＭ、凝固・線溶、アミノ酸、ペプチド、蛋白、遺伝子、細胞、などが挙げられる。より具体的には、ＣＥＡ、ＡＦＰ、フェリチリン、β２マイクロ、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、ＢＦＰ、エラスターゼ１、ペプシノーゲン１・２、便潜血、尿中β２マイクロ、ＰＩＶＫＡ−２、尿中ＢＴＡ、インスリン、Ｅ３、ＨＣＧ、ＨＰＬ、ＬＨ、ＨＣＶ抗原、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗原、ＨＢｅ抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、ＨＩＶ抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒、ＡＳＯ、Ａ型インフルエンザ抗原、Ａ型インフルエンザ抗体、Ｂ型インフルエンザ抗原、Ｂ型インフルエンザ抗体、ロタ抗原、アデノウィルス抗原、ロタ・アデノウィルス抗原、Ａ群レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、カンジダ抗原、ＣＤ菌、クリプトロッカス抗原、コレラ菌、髄膜炎菌抗原、顆粒菌エラスターゼ、ヘリコバクターピロリ抗体、Ｏ１５７抗体、Ｏ１５７抗原、レプトスピラ抗体、アスペルギルス抗原、ＭＲＳＡ、ＲＦ、総ＩｇＥ、ＬＥテスト、ＣＲＰ、ＩｇＧ，Ａ，Ｍ、ＩｇＤ、トランスフェリン、尿中アルブミン、尿中トランスフェリン、ミオグロビン、Ｃ３・Ｃ４、ＳＡＡ、ＬＰ（ａ）、α１−ＡＣ、α１−Ｍ、ハプトグロビン、マイクロトランスフェリン、ＡＰＲスコア、ＦＤＰ、Ｄダイマー、プラスミノーゲン、ＡＴ３、α２ＰＩ、ＰＩＣ、ＰＡＩ−１、プロテインＣ、凝固第Ｘ３因子、ＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸、ＧＨｂＡ１ｃ、各種抗原、各種抗体、各種ウィルス、各種菌、各種アミノ酸、各種ペプチド、各種蛋白質、各種ＤＮＡ、各種細胞、等が挙げられる。

本発明における検査対象物質と特異的に相互作用する物質とは、上記検査対象物質に対し、選択的に吸着や結合を行う物質を指し、その種類は特に限定されない。例えば、抗原、抗体、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、塩基配列、などが挙げられる。特に抗体を用いた場合は免疫血清検査における各種抗原の存在を検出することが可能になる。例えば抗体を用いる場合であれば、その由来も特に限定されず、またポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。さらにそれら担持物質の結合方式も特に限定されるものではなく、物理吸着および化学結合のいずれであってもよい。担持させる際の手間を考えると物理吸着のほうが好ましく、担持後の安定性から考えると化学結合のほうが好ましい。

本発明において、セルロース誘導体微粒子を診断薬として用いる際に、担持させる物質の担持量は一概に規定できるものではない。検査対象物質の種類、サイズおよび検体中への存在量、担持物質の種類およびサイズ、並びに担持するセルロース誘導体微粒子のサイズ、置換度および置換基の種類など様々な条件に応じて適宜調整して使用することが可能である。
本発明においてセルロース誘導体微粒子を診断薬として用いると、検査対象物質が存在した場合に生じる変化を検出することで診断を行うことが可能になる。その変化は測定原理に応じて様々なものがあり、濁度、色調、粒径、電位、吸光度、光透過度、他物質との相互作用、など様々な変化を測定に用いる事ができる。またその変化の検出方法もそれぞれに応じたものを選択する事ができ、機器を用いた読み取りや目視判断などが利用できる。本発明では後述するように紫外可視分光光度計を用いて特定波長の吸光度変化を測定した。

紫外可視分光光度計を用いて特定波長の吸光度変化を測定するにあたり、診断薬となるセルロース誘導体微粒子と検体とを混合し、セルロース誘導体微粒子の凝集度合いから、検体中の検査対象物質を定量することができる。この検出方法において、セルロース誘導体微粒子がナノサイズの特定粒子径を有する微粒子であり、親水性であり、凝集することが少なく、安定に分散し、かつ、微粒子の粒子サイズが揃っていることが好ましい要件である。この要件を満足すると、高精度かつバラツキの無い検査対象物質の検出が可能となる。特にＣＶ値が小さいセルロース誘導体微粒子を用いると、検査対象物質の量と粒径変化がより均一化されるため、診断薬としてより正確な測定が可能となる。ＣＶ値の値としては３０％以下が好ましく、より好ましくは２５％以下であり、更に好ましくは２０％以下である。

本発明においてセルロース誘導体微粒子を診断薬として用いる際に、様々な溶液中にセルロース微粒子誘導体を分散させて用いることができるが、好ましくはＰＨ＝５．０〜９．０の緩衝液中が好ましい。例えばリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、等が挙げられる。またその緩衝液の濃度も特に限定されるものではなく、一般的に緩衝液として用いられる様々な濃度のものを用いることができる。またその溶液中におけるセルロース誘導体微粒子濃度も特に限定されるものではなく、検査対象物質の種類、性質、濃度、などに応じて適宜調整して使用することが可能である。一般的には０．０１〜１０ｗｔ％程度が好ましく、より好ましくは０．１〜１．０ｗｔ％である。

本発明においてセルロース誘導体微粒子を診断薬として用いる際に、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために様々な増感剤を用いてもかまわない。また検体中に存在する他の物質によって引き起こされる非特異吸着を抑制するためにブロッキング剤などを用いてもかまわない。
本発明におけるセルロース誘導体微粒子は、診断薬のように任意の液体中に分散させて用いることもできる。また、任意の固体中に分散させて用いることや、固体表面に微粒子を固定化させて用いること等も可能である。またセルロース誘導体微粒子を着色することにより、微粒子の視認性を向上させたり、検出感度を向上させたりすることも可能である。

さらに、本発明のセルロース誘導体微粒子を単独で従来の診断薬中に添加することによって、セルロースの親水性および安定性を生かし、試薬の安定性向上、測定感度の向上、反応時間の短縮、などの効果も期待できる。
また、例えばその他成分と特異的に相互作用する物質を担持させる例として診断薬について詳細に述べたが、診断薬以外に吸着剤、徐放剤およびカラム担体などにも応用できる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。特に記載のない限り全ての操作は２５℃の環境下で行った。
＜高圧ホモジナイザーによる分散処理＞
マイクロフルイディックス社製油圧式超高圧ホモジナイザーＭ−１１０−Ｅ／Ｈを用いた。その際の処理圧力は５０ＭＰａであり、高圧部であるチャンバーを１０回通す操作を行った。

＜平均粒径の測定＞
必要な倍率に応じて次の２種類の電子顕微鏡を用い、セルロース微粒子の観察を行った。日本電子株式社製透過型電子顕微鏡ＪＥＭ２０００ＥＸ（１００ｋＶの加速電圧および５万倍または１０万倍の倍率で観察）、日本電子株式会社製走査型電子顕微鏡ＪＳＭ−６３８０（１０ｋＶの加速電圧および２万倍の倍率で観察）を用いた。セルロース誘導体微粒子分散液から粉末状セルロース誘導体微粒子への乾燥は、特に記載のない限り、セルロース誘導体微粒子分散液を液体窒素で急速凍結し減圧させることで凍結減圧乾燥を行った。
上記のようにして得られた画像を、マウンテック社製画像解析式粒度分布測定ソフトウェアＭａｃ−Ｖｉｅｗ，Ｖｅｒ．３を用いて解析した。その測定個数は正確性を確保するために１００個以上とし、一枚の画像に映る粒子が１００個に満たない場合は２枚以上の画像を解析した。

＜セルロース微粒子のカルボキシル化の確認＞
上記と同様の方法で粉末状カルボキシル化セルロース微粒子を調整し、日本電子製核磁気共鳴測定装置ＪＮＭ−ＥＣＡ４００を用いて１Ｈ−核磁気共鳴スペクトルを測定した。スペクトルよりセルロース骨格のＣ１に結合しているプロトンと、カルボキシルメチル基のメチレンプロトンの積分値比を読み取り置換度を算出した。以下の条件にて測定を行った。
測定溶媒：１１ｗｔ％重苛性ソーダ溶液（重水および重苛性ソーダより調整）
Ｃ１プロトン出現位置：４．１３ｐｐｍ
メチレンプロトン出現位置：３．３７ｐｐｍ、３．６５ｐｐｍ
＜セルロース微粒子のアミノ化の確認＞
従来公知の方法でケルダール法による分析を行い、アミノ化セルロース微粒子中に含まれる窒素量を定量しアミノ化セルロースの分子量から置換度を算出した。ただし架橋構造を含み分子量が定義できないものに関しては置換度の算出が不可能なので行わなかった。
＜セルロース微粒子のその他誘導体化の確認＞
上記カルボキシル化の確認同様に、それぞれの置換基に応じた出現位置とＣ１プロトン出現位置の積分値を比較する事で置換度の算出を行った。
＜セルロース微粒子の架橋化の確認＞
架橋前のセルロース微粒子重量と架橋後のセルロース微粒子重量を測定し、重量の増量値より架橋の置換度の算出を行った。

＜診断薬としての性能評価＞
紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製、Ｖ−６３０）を用いて測定を行った。以下の条件にて測定を行った。
検体：３．０μｌ
希釈液：１６０μｌ
診断薬量：４０μｌ
測定波長：６００ｎｍ
測定ポイント：検体と混合直後と５分後の吸光度変化値を測定
反応温度：３７℃

＜実施例中に用いた試薬等の説明＞
アセトン：和光純薬工業株式会社製、特級
イソプロピルアルコール：キシダ化学株式会社製、特級
ジメチルスルホキシド：和光純薬工業株式会社製、特級
テトラヒドロフラン：和光純薬工業株式会社製、特級
クロロ酢酸ナトリウム：和光純薬工業株式会社製
２−クロロエチルアミン塩酸塩：和光純薬工業株式会社製
エピクロルヒドリン：和光純薬工業株式会社製
２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ緩衝液用）：株式会社同仁化学研究所製
リン酸二ナトリウム１２水和物（リン酸緩衝液用）：和光純薬工業株式会社製
リン酸二水素カリウム（リン酸緩衝液用）：和光純薬工業株式会社製
２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール塩酸塩（Ｔｒｉｓ緩衝液用）：Ｍｅｒｃｋ社製
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）：株式会社同仁化学研究所製
抗ＣＲＰ抗体：和光純薬工業株式会社製、Ａｎｔｉ Ｈｕｍａｎ ＣＲＰ モノクローナル抗体
ＣＲＰ抗原：和光純薬工業株式会社製、ＬＴ・ＣＲＰ−ＨＳキャリブレーターセットＴ
（抗原濃度５種類：０．４、１．２、３．５、１６．０、３５．０ｍｇ／ｄｌ）
その他実施例中に特に記載のない限り、和光純薬工業株式会社製の試薬を用いた。

［実施例１］
従来公知の方法で、セルロース濃度０．３７ｗｔ％、銅濃度０．１３ｗｔ％、アンモニア濃度１．００ｗｔ％の銅アンモニアセルロース溶液を調製した。さらにテトラヒドロフラン濃度８９．０ｗｔ％、水濃度１１．０ｗｔ％の凝固液を調製した。
マグネティックスターラーを用い凝固液５０００ｇをゆっくり攪拌しながら、調製しておいた銅アンモニアセルロース溶液５００ｇを添加した。５秒程度攪拌を継続したのちに１０ｗｔ％の硫酸１０００ｇを加え中和、再生を行い、セルロース微粒子を含有したスラリー６５００ｇを得た。
得られたスラリーを１００００ｒｐｍの速度で１０分間遠心分離した。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、脱イオン水を注入して攪拌し、再び遠心分離した。ＰＨが６．０〜７．０になるまでこの操作を数回繰り返し、その後高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、セルロース微粒子分散液１５０ｇを得た。得られたセルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６１ｎｍであった。またそのＣＶ値は１８％であった。

得られたセルロース微粒子分散液の一部に純水、イソプロピルアルコールを加え、分散媒体のイソプロピルアルコール：水の比が８５：１５となり、かつ分散媒体中の粒子濃度が０．２０ｗｔ％になるように調整し、１００ｇ（うちセルロース分は０．２ｇ）のセルロース微粒子分散液を用意した。セルロース微粒子分散液を回転子と共にナス型ガラスフラスコに入れ、ガラス製還流管を取り付けた。約１０℃の水道水を還流させ冷却しながら、セルロース微粒子分散液が５０℃となるようウォーターバスにて３０分間加熱した。なお加熱はマグネティックスターラーを用いて緩やかに攪拌させながら行った。さらに１１％の苛性ソーダ溶液を調整し、０．５４ｇ（セルロース：苛性ソーダのモル比が１．０：１．２）をセルロース微粒子分散液に攪拌しながら加えた。さらに３０分間攪拌を継続し、アルカリセルロースを調整した。アルカリセルロースの調整後、さらに攪拌を継続しながらクロロ酢酸ナトリウムを７０ｍｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：０．５）を加えた。

３時間の間、攪拌、および還流を継続し、セルロースのカルボキシル化を行った。３時間経過後、ウォーターバスによる加熱を止め、ナス型フラスコを氷水で冷やし、反応後スラリーの温度が２０℃になるまで冷却した。冷却後に攪拌を継続しながら、１０％塩酸を５．０ｇ加えて反応後スラリーのＰＨを酸性にした。前記と同様に遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈を数回繰り返し、ＰＨを６．０〜７．０とし、さらに高圧ホモジナイザーによる分散処理を行い、カルボキシル化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６４ｎｍだった。またそのＣＶ値は１９％であった。電子顕微鏡写真を図１に示す。さらに核磁気共鳴測定装置を用いて置換度を算出したところ、置換度は、０．０７８であった。

［実施例２］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加えるクロロ酢酸ナトリウムの量が１４０ｍｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：１．０）であること以外は実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行った。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６３ｎｍだった。またそのＣＶ値は２１％であった。置換度は、０．１５７であった。

［実施例３］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加えるクロロ酢酸ナトリウムの量が２８０ｍｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：２．０）であること以外は実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行った。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６６ｎｍだった。またそのＣＶ値は２２％であった。置換度は、０．３１２であった。

［実施例４］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加えるクロロ酢酸ナトリウムの量が５６０ｍｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：４．０）であること以外は実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行った。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２６９ｎｍだった。またそのＣＶ値は２２％であった。置換度は、０．４８６であった。

［比較例１］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加えるクロロ酢酸ナトリウムの量が７００ｍｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：５．０）であること以外は実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行った。得られたカルボキシル化セルロース微粒子の平均粒径を測定するために電子顕微鏡画像を撮影したところ、網目状の構造になっていることが確認された。なお置換度は、０．５４０であった。
セルロース誘導体がカルボキシル化セルロースの場合、置換度が０．５４になると水に溶解しやすくなり、粒子形状を保てなかった。

［比較例２］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加える１１％苛性ソーダの量が４．５０ｇ（セルロース：苛性ソーダのモル比が１．０：１０．０）、クロロ酢酸ナトリウムの量が７．０ｇ（セルロース：クロロ酢酸ナトリウムのモル比が１．０：５０．０）であること以外は実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行った。反応終了後に遠心分離機を用いた水洗を試みたが、生成したカルボキシル化セルロースが反応溶媒である８５％イソプロピルアルコール（１５％は水）に溶解してしまっており回収する事はできなかった。

［実施例５］
銅アンモニアセルロース溶液のアンモニア濃度が６．３ｗｔ％、凝固液がイソプロピルアルコールであること以外は実施例１と同様の方法で、平均粒径が９．２ｎｍ、ＣＶ値が２０％のセルロース微粒子を得た。さらに実施例３と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行い、平均粒径が９．８ｎｍ、ＣＶ値が２０％、置換度が０．３２０のカルボキシル化セルロース微粒子を得た。

［実施例６］
銅アンモニアセルロース溶液のアンモニア濃度が８．５％、凝固液がテトラヒドロフラン９０．０ｗｔ％、水１０．０ｗｔ％であること以外は実施例１と同様の方法で、平均粒径が５２１ｎｍ、ＣＶ値が２６％のセルロース微粒子を得た。さらに実施例１と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行い、平均粒径が５２４ｎｍ、ＣＶ値が２８％、置換度が０．１５１のカルボキシル化セルロース微粒子を得た。

［比較例３］
従来公知の方法でスプレードライ法により平均粒子径５１２１ｎｍ、ＣＶ値１０％のセルロース微粒子を得た。さらに実施例３と同様の方法でセルロースのカルボキシル化を行い、平均粒径が５０２０ｎｍ、ＣＶ値が１１％、置換度が０．３２５のカルボキシル化セルロース微粒子を得た。

実施例１〜６及び比較例１〜３から明らかなように、カルボキシル化の置換度は実施例１＜実施例２＜実施例３＜実施例４＜比較例１＜比較例２であり、用いる苛性ソーダの量と反応剤の量に応じて置換度をコントロールすることができた。また用いるセルロース微粒子の大きさを変えても同様に誘導体化が可能であった。

［実施例７］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を純水に分散し、水中の粒子濃度が１．０ｗｔ％になるように調整し、２０ｇ（内、セルロース分は０．２ｇ）のセルロース微粒子分散液を用意した。次いで、実施例１同様に温度を５０℃に調整し、攪拌しながら苛性ソーダを加え、水中の苛性ソーダ濃度が９．０ｗｔ％になるよう調整し、３０分攪拌を継続した。更に２−クロロエチルアミン塩酸塩４３０ｍｇ（セルロース：２−クロロエチルアミン塩酸塩のモル比が１．０：３．０）を加えた。３時間の間、攪拌および還流を継続し、セルロースの１級アミノ化を行った。３時間経過後に、実施例１と同様にして、１級アミノ化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られた１級アミノ化セルロース微粒子は平均粒径２５９ｎｍ、ＣＶ値１９％、置換度０．０９９であった。

［実施例８］
用いる２−クロロエチルアミン塩酸塩の量を１．４３ｇ（セルロース：２−クロロエチルアミン塩酸塩のモル比が１．０：１０．０）としたこと以外は、実施例７と同様の方法で１級アミノ化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られた１級アミノ化セルロース微粒子は平均粒径２７０ｎｍ、ＣＶ値１８％、置換度０．２０９であった。

［実施例９］
用いる２−クロロエチルアミン塩酸塩の量を７．１６ｇ（セルロース：２−クロロエチルアミン塩酸塩のモル比が１．０：３０．０）としたこと以外は、実施例７と同様の方法で１級アミノ化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られた１級アミノ化セルロース微粒子は平均粒径２６８ｎｍ、ＣＶ値２１％、置換度０．３２３であった。

［実施例１０］
用いる反応剤を２−クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド９．５６ｇ（セルロース：２−クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリドのモル比が１．０：５０．０）としたこと以外は実施例７と同様の方法で４級アミノ化セルロース微粒子を得た。得られた４級アミノ化セルロース微粒子は平均粒径２６５ｎｍ、ＣＶ値２２％であり、置換度０．１７８であった。また実施例７〜９と同様に、用いる反応剤の量を変えたところ、用いる反応剤の量に応じて置換度をコントロール可能であることを確認した。

［実施例１１］
用いる反応剤を２−クロロエタノール４．９７ｇ（セルロース：２−クロロエタノールのモル比が１．０：５０．０）としたこと以外は実施例７と同様の方法でヒドロキシエチル化セルロース微粒子を得た。得られたヒドロキシエチル化セルロース微粒子は平均粒径２６３ｎｍ、ＣＶ値２４％であり、置換度０．２５７であった。なお置換度の算出はＮＭＲにより行った。また実施例７〜９と同様に、用いる反応剤の量を変えたところ、用いる反応剤の量に応じて置換度をコントロール可能であることを確認した。

［実施例１２］
実施例１で調整した２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を用い、加える１１％苛性ソーダ溶液の量を２．２５ｇ（セルロース：苛性ソーダのモル比が１．０：５．０）にしたこと、反応剤としてクロロ酢酸ナトリウムの代わりに沃化メチル１７．５ｇ（セルロース：沃化メチルのモル比が１．０：１００．０）を用いたこと以外は実施例１と同様の方法でメチル化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られたメチル化セルロースは平均粒径２６４ｎｍ、ＣＶ値２０％、置換度０．９７２であった。なお置換度の算出はＮＭＲにより行った。また、実施例７〜９と同様に、用いる反応剤の量を変えたところ、用いる反応剤の量に応じて置換度をコントロール可能であることを確認した。

［実施例１３］
用いる反応剤をブロモエタン６．７３ｇ（セルロース：ブロモエタンのモル比が１．０：５０．０）としたこと以外は実施例１２と同様の方法でエチル化セルロース微粒子分散液を得た。得られたエチル化セルロース微粒子は平均粒径２５１ｎｍ、ＣＶ値２０％であり、置換度０．７４５であった。なお置換度の算出はＮＭＲにより行った。また実施例７〜９と同様に、用いる反応剤の量を変えたところ、用いる反応剤の量に応じて置換度をコントロール可能であることを確認した。
実施例７〜１３で明らかなように、用いる反応剤を変えることで置換基の種類を変えることが出来た。

［実施例１４］
実施例１で調整した平均粒径２６１ｎｍのセルロース微粒子分散液を純水に分散し、水中の粒子濃度が１０．０ｗｔ％になるように調整し、１００ｇのセルロース微粒子分散液を調整した（セルロース分１０ｇ）。分散液をマグネティックスターラーで攪拌させ、８０℃の環境下で還流を行いながら、グリオキザール系レジン加工剤「ベッカミンＬＦ-Ｘ」（大日本インキ化学工業社製）を５０ｇ、塩化マグネシウム系触媒「カタリストＭ」（大日本インキ化学工業社製）を１５ｇ加え、３０分攪拌を継続しセルロース微粒子の架橋を行った。得られた架橋セルロース微粒子分散液を実施例１と同様に遠心分離機を用いて、デカンテーション−脱イオン水による希釈を３回繰り返し、架橋セルロース微粒子分散液を得た。セルロースの重量変化より、架橋された置換基の割合を計算した。架橋された水酸基の割合を置換度で表すと０．３２であった。得られた架橋セルロース微粒子を比較例２と同様の方法でカルボキシル化を行ったところ、遠心分離機による処理で微粒子の回収ができ、カルボキシル化及び架橋化セルロース誘導体微粒子を得た。得られたカルボキシル化及び架橋化セルロース誘導体微粒子の平均粒径は２７５ｎｍ、ＣＶ値は２３％であった。また得られたカルボキシル化及び架橋化セルロース誘導体微粒子は１１％重苛性ソーダ溶液に溶解させることができなかったため、０．１％苛性ソーダ溶液にて中和滴定を行い、溶液のＰＨが７．０になった時の０．１％苛性ソーダ溶液の使用量よりカルボキシル化置換度を産出したところ、カルボキシル化置換度は２．１３であった。
比較例２と実施例の比較により、カルボキシル化に架橋構造を加えることで高いカルボキシル化置換度を持ちながらも水に不要な微粒子を得る事に成功した。

［実施例１５］
実施例７と同様に、セルロースの粒子濃度が１．０ｗｔ％、苛性ソーダ濃度が９．０ｗｔ％になるように調整し、反応剤としてエピクロルヒドリン２．２８ｇ（セルロース：エピクロルヒドリンのモル比が１．０：２０．０）を加えた。
３時間の間、攪拌および還流を継続し、セルロースの水酸基のエポキシ活性化を行った。３時間経過後、さらに２３ｗｔ％アンモニア水を９．１４ｇ（セルロース：アンモニアのモル比が１．０：１００．０）を加えてエポキシ基をアンモニアで開裂させ１級アミノ化と架橋を行った。反応終了後は実施例７と同様にして水洗を行い、アミノ化セルロース微粒子分散液１００ｇを得た。得られたアミノ化セルロース微粒子の平均粒径を測定した結果、２７０ｎｍだった。またそのＣＶ値は２０％であった。さらにケルダール法により、アミノ化セルロース中に含まれる窒素分を定量したところ、１．２１％であった。また実施例７〜９と同様に、用いる反応剤の量を変えたところ、用いる反応剤の量に応じて窒素分のコントロールが可能であることを確認した。このようにエピクロルヒドリンを用いることで、架橋とアミノ化を同時に行う事ができることを確認した。

以上の実施例１〜１５と比較例１〜３で得られたセルロース誘導体微粒子の置換基の種類、置換度、平均粒径、ＣＶ値、電子顕微鏡画像より分かる微粒子の形状をまとめて表１に示す。また実施例１、５、６の途中で得られている誘導体化を行う前のセルロース微粒子を、それぞれ比較例４〜６とし、平均粒径、ＣＶ値、微粒子の形状を表１に併せて示す。

得られたセルロース誘導体微粒子およびセルロース微粒子の分散安定性を評価したところ、比較例３を除きいずれも界面活性剤など添加することなく、安定な分散状態を保っていた。比較例３は粒径が大きいため、数時間の静置後に沈降が生じていた。

［実施例１６］
＜緩衝液の作製＞
以下３種類の緩衝液を作製した。作製方法は従来公知の方法で行い、ＭＥＳおよびＴｒｉｓ緩衝液のＰＨ調整は塩酸と苛性ソーダを用い、リン酸緩衝液はリン酸二ナトリウム１２水和物とリン酸二水素カリウムの量を調整しＰＨ調整を行った。また水は全て脱イオン水を用いた。
（１）ＭＥＳ緩衝液：ＰＨ＝５．０、ＭＥＳ濃度５０ｍＭ
（２）リン酸緩衝液：ＰＨ＝７．２、リン酸濃度５０ｍＭ
（３）Ｔｒｉｓ緩衝液：ＰＨ＝８．０、Ｔｒｉｓ濃度１０ｍＭ

＜カルボキシル化セルロース微粒子のカルボジイミド活性化＞
実施例１で得られたカルボキシル化セルロース微粒子分散液２．５ｇを１５，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行った。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、ＭＥＳ緩衝液を０．５ｇ加えて攪拌し、カルボキシル化セルロース微粒子をＭＥＳ緩衝液に分散させた。
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下カルボジイミドと言う）をＭＥＳ緩衝液に溶解させ、カルボジイミド濃度が２０ｗｔ％となるよう調整し、そのうちの０．５ｇをカルボキシル化セルロース微粒子分散液に加えた。恒温振盪槽を用い２５度の環境下で１時間反応させカルボジイミド活性化セルロース微粒子を調整した。反応終了後に１５，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行った。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、リン酸緩衝液を０．６７ｇ加えて攪拌し、カルボジイミド活性化セルロース微粒子をリン酸緩衝液に分散させた。

＜カルボジイミド活性化セルロース微粒子への抗ＣＲＰ抗体結合＞
さらに抗ＣＲＰ抗体水溶液７５μｌをカルボジイミド活性化セルロース微粒子分散液に加え、恒温振盪槽を用い２５℃の環境下で２０時間反応させ、抗ＣＲＰ抗体結合セルロース微粒子を調整した。反応終了後に１５，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行った。沈殿物をデカンテーションにより取り出し、Ｔｒｉｓ緩衝液を２ｇ加えた。１５，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離を行い、沈殿物をデカンテーションにより取り出す作業を２回行い、最終的に粒子濃度が０．４０ｗｔ％になるようＴｒｉｓ緩衝液を加えた。得られた分散液を超音波分散機（株式会社エスエムテー社製、ＵＨ−５０）によって処理し、抗ＣＲＰ抗体担持セルロース微粒子分散液を調整した。

＜微粒子への抗体結合量算出＞
上記とは別に、抗ＣＲＰ抗体をリン酸緩衝液に加え数種類の濃度のものを作製し、分光光度計（日本分光社製、Ｖ−６３０）を用いて２８０ｎｍの固定波長で吸光度を測定し、抗ＣＲＰ抗体の検量線を作成した。上記抗ＣＲＰ抗体との反応後にデカンテーションした際の上澄み液を同じく分光光度計で測定し、微粒子に担持されなかった抗ＣＲＰ抗体量を計量し、そこから逆算して微粒子に担持された抗ＣＲＰ抗体量を計算すると、粒子１ｍｇ当りの抗ＣＲＰ抗体担持量は１８０μｇであった。

＜ラテックスイノムアッセイ＞
得られた抗ＣＲＰ抗体担持セルロース微粒子分散液を用いて診断薬としての性能評価を行った。抗原濃度既知の５種類の検体に加え、Ｔｒｉｓ緩衝液のみと混合した検体（抗原濃度０ｍｇ／ｄｌに相当）の合計６種類の検体の測定を行った。その結果を図２に示す。
図２から明らかなように、抗ＣＲＰ抗体担持セルロース微粒子はＣＲＰ抗原の量によって凝集度合いが変化し、診断薬としての利用が可能であった。

［実施例１７］
抗ＣＲＰ抗体担持後に微粒子濃度５．０ｗｔ％の水分散体とすること以外は実施例１６と同様の方法で抗ＣＲＰ抗体担持セルロース微粒子分散液を調整した。得られた分散液をスライドグラス（松浪硝子工業社製、ＭＡＳコートスライドグラス）上に滴下し、２５℃の環境下で２４時間静置乾燥させた。滴下した部分を電子顕微鏡で観察したところ、ＣＲＰ抗体担持セルロース微粒子が表面に固定されていることが確認できた。

本発明のセルロース誘導体微粒子は粒径が小さく、親水性が高いため、界面活性剤などを必要とせず安定分散が可能である。また、多様な化合物を担持させることも可能である。例えば抗体を担持させることにより診断薬としての利用が可能である。

Claims (16)

1. セルロースの水酸基の一部が置換基で置換されたセルロース誘導体からなり、平均粒径が９〜１０００ｎｍであることを特徴とするセルロース誘導体微粒子。
2. 前記置換の置換度が２．５以下であることを特徴とする請求項１に記載のセルロース誘導体微粒子。
3. 前記置換の置換度が１．０以下であることを特徴とする請求項２に記載のセルロース誘導体微粒子。
4. 前記置換基が、カルボキシル基、アミノ基、４級アンモニウム基、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、シアノエチル基、硫酸基、および少なくとも２つ以上の水酸基同士を結合する架橋基のいずれか１種類以上を含んでいることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子。
5. セルロース以外の成分が化学結合または物理吸着を介して担持されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子。
6. 担持される前記セルロース以外の成分が他の成分と特異的に相互作用する物質を含むことを特徴とする請求項５に記載のセルロース誘導体微粒子。
7. 担持される前記セルロース以外の成分が生体材料を含むことを特徴とする請求項５または６に記載のセルロース誘導体微粒子。
8. 生体材料が抗原または抗体を含むことを特徴とする請求項７に記載のセルロース誘導体微粒子。
9. 請求項１〜８のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子を含むことを特徴とする診断薬。
10. セルロース誘導体微粒子が請求項５〜８のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子であって、担持されるセルロース以外の成分が検査対象物質と特異的に相互作用する物質を含むことを特徴とする請求項９に記載の診断薬。
11. セルロース誘導体微粒子のＣＶ値が３０％以下であることを特徴とする請求項９または１０に記載の診断薬。
12. 診断が免疫血清診断であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の診断薬。
13. 請求項９〜１２のいずれかに記載の診断薬と検体とを混合し、検体中の検査対象物質を検出することを特徴とする検体検出方法。
14. 診断薬が請求項１０〜１２のいずれかに記載の診断薬であり、セルロース誘導体微粒子の凝集度合いから検体中の検査対象物質を検出することを特徴とする請求項１３に記載の検体検出方法。
15. 請求項１〜８のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子が液体に分散していることを特徴とする分散液。
16. 請求項１〜８のいずれかに記載のセルロース誘導体微粒子が固体表面に固定または固体中に分散されていることを特徴とする成型体。