JP2014514358A - 高コレステロール血症の処置に使用するためのビフィドバクテリウム属に属する菌株 - Google Patents

高コレステロール血症の処置に使用するためのビフィドバクテリウム属に属する菌株 Download PDF

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Abstract

本発明は、高コレステロール血症の処置に使用するためのビフィドバクテリウム属に属する選択菌株に関する。特に、本発明は、該菌株をステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類および／またはグルコマンナンおよび／またはコンニャクガムおよび／またはプレバイオティク繊維および／または発酵赤米および／または燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および／または凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルと共に含む食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物に関する。

Description

本発明は、高コレステロール血症の処置に使用するためのビフィドバクテリウム属に属する選択された菌株に関する。特に、本発明は、該菌株をステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類および／またはグルコマンナンおよび／またはコンニャクガムおよび／またはプレバイオティク繊維および／または発酵赤米および／または燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および／または凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルと共に含む食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物に関する。
体内の全ての細胞はアセチルコエンザイムＡからコレステロールを合成できるが、ほとんどのコレステロールは、肝細胞のペルオキシソームで産生され、ペルオキソームがコレステロールを血中に移行させ、全身に運ばれるようにすることは周知である。
医学において“コレステロール”に言及するとき、化学製品としてのコレステロールを意味せず、むしろ、実は血中で循環するリポタンパク質群(輸送凝集体であるカイロミクロン類)について述べている。上記リポタンパク質群の濃度が血中コレステロールと呼ばれる。コレステロール、リン脂質類、タンパク質群、グリセリド類および脂肪酸類としてのその組成によって、これらの凝集体はさらにＶＬＤＬ(超低密度リポタンパク質群)、ＩＤＬ(中間密度リポタンパク質群)、ＬＤＬ(低密度リポタンパク質群)、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３の数群に分けられる(０.９８〜１.１７ｇ／cm３に相当する比重により)。
コレステロールの生合成は、エネルギーの浪費を避けるために必要な場合にのみコレステロールが合成されるように、コレステロールの細胞内濃度ならびにインスリンおよびグルカゴンであるホルモン類により制御されている。事実、インスリンおよびグルカゴンであるホルモン類と関連するコレステロールの高細胞内濃度は、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを阻害し、そうして新規コレステロール生合成を阻止する。このような理由で、合成されるコレステロール量は、食餌を介して摂取するコレステロール量と反比例する。
血漿コレステロール上昇性食餌(hypercholesterolaemic diet)の場合、コレステロール生合成を介して合成されるコレステロール量は減少するが、コレステロール検査パラメータはそれでも世界保健機関が推奨する閾値である総血中コレステロール２００mg／dl未満および総コレステロール／ＨＤＬ比５未満(男性)および４.５未満(女)を超え得る。おおよそ、次のように判断されるれる。
ｉ) ２００mg／dl未満の血中コレステロール値である、正常血中コレステロールレベル。
ii) ２００〜２４９mg／dlの値である、軽度高コレステロール血症。
iii) ２５０〜２９９mg／dlの値である、中程度高コレステロール血症。
iv) ３００mg／dlを超える値である、重度高コレステロール血症。
コレステロール検査パラメータの閾値(２００mg／dl)を超えたという事実は、多くの人に対して、食べることができる食事の選択肢および維持できるライフスタイルを制限する。これらの制限／剥奪はまた、高コレステロール含量の食事を食べるとの選択は、その後数日間を犠牲にすること、または、ある場合、“背いた”ことまたは血中コレステロール値を上げることに貢献したことに対する罪の意識を伴うことを自覚しているため、何を食べるかについての選択の自由を剥奪されたと自分自身を見る人にとっては、気分に対する影響も有し得る。
それ故に、時に高コレステロール食を飽食する人たちにとってコレステロール検査パラメータの正常化が可能である組成物を得ることは有用であり、かつ望ましい。
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの分子をコレステロール前駆体であるメバロン酸に変換する酵素である３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼに作用することにより内因性コレステロール合成を阻害するスタチンのような薬物の存在は周知である。
該薬物、例えばスタチンを摂取することに起因する問題は、内因性コレステロールのレベルの低下により、該薬物が細胞内コレステロール生合成の増加に寄与するとの事実にある。
細胞内コレステロール生合成増加は、例えば、患者がスタチン摂取を止めたとき、細胞内コレステロール生合成がスタチンの中断により直ぐに正常化(低下)せず、むしろ、患者がなお該薬物を摂取しているかのようであり続けることを意味する(“過去記憶”があると言われている)。
それ故に、例えば、スタチン摂取が中断されると、細胞内コレステロール生合成は正常化するまでに、すなわち該生合成がスタチン系薬物の摂取を始める前に示したレベルまで低下するまでに相当時間かかる。この未制御でかつ不必要なコレステロール産生は重大な欠点である。
それ故に、例えば、スタチンの代用であるが、それだけではない処置があるのが望ましい。求められる処置は、さらなるコレステロール産生なしに対象により自由に中断できるものでなければならない。実際的観点から、一方でコレステロールの内因性レベルを低下させ、他方で処置自体が中断された場合コレステロールの生理学的レベルを正常化するために細胞内コレステロール生合成を正常化できる、新規処置があることが望ましい。
出願人は、鋭意研究を重ねた結果、漸く、極めて広い範囲の菌株から、ビフィドバクテリウム属に属するえり抜きの菌株を同定し、上記要求に対する解決策を提供する。該菌株は、血中コレステロールレベル、特にＬＤＬコレステロールレベルを低下させる顕著な能力を示す。
本発明の対象は、ビフィドバクテリウム属に属し、添付する特許請求の範囲に開示する特徴を有する菌株に関する。
該菌株は、特定のビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する。出願人は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する多くの菌株に対して選択を行った。その特性について選択した菌株は次のものである。
(ｉ) ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24688)。
(ii) ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23731)。
出願人は、ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する多くの菌株に対して選択を行った。その特性について選択した菌株は次のものである。
(ｉ) ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23733)。
(ii) ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24690)。
出願人は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種に属する多くの菌株に対して選択を行った。その特性について選択した菌株はビフィドバクテリウム・ブレーベMB113(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23732)である。
出願人は、ビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する多くの菌株に対して選択を行った。その特性について選択した菌株はビフィドバクテリウム・インファンティスBI02(MB287)(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24687)である。
本発明の状況において、細菌はその単離された形態で存在しても、それぞれの上清と共に存在してもよい。それらは生菌の形でも死菌の形でもその成分でも、または細胞抽出物もしくは酵素抽出物の形態でもよい。
本発明の対象は、添付する特許請求の範囲に開示する特徴を有する食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物に関する。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、血中コレステロール、特にＬＤＬコレステロールレベルを低下させる能力を有する、ビフィドバクテリウム属に属する少なくとも１種の菌種から成る菌株の混合物を含む。
他の好ましい態様において、該少なくとも１種の菌株はビフィドバクテリウム・ビフィダム種、ビフィドバクテリウム・ラクティス種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種およびビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する菌株を含む群から選択される。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、
(１) ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24688)；および／または
(２) ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23731)；および／または
(３) ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23733)、および／または
(４) ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24690)；および／または
(５) ビフィドバクテリウム・ブレーベMB113(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１０年６月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM23732)；および／または
(６) ビフィドバクテリウム・インファンティスBI02(MB287)(Probiotical S.p.A of Novara (Italy)社により２０１１年３月２９日にDSMZに寄託、受託番号DSM24687)
から成る群を含む、あるいはこれらのものから成る群から選択される少なくとも１種の菌株から成る、菌株の混合物を含む。
本発明の対象は、高コレステロール血症の予防または治癒的処置において使用するための、(ｉ)コレステロールをその細胞壁表面に吸着できるビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも１種の菌株、および(ii)細胞内および／または細胞外レベルで胆汁酸塩類を加水分解できるビフィドバクテリウム・ラクティス種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種またはビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する少なくとも１種の菌株から成る細菌組成物を含む、食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物に関する。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、血中のＬＤＬコレステロールレベルを低下させるために使用することを意図する。さらに、該ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する菌株は、菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688および菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダム(MB109)DSM23731から成る群から選択される。さらに、該ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する菌株は、菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス(MB2409)DSM23733および菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)DSM24690から成る群から選択される。さらに、該ビフィドバクテリウム・ブレーベ種に属する菌株は菌株ビフィドバクテリウム・ブレーベ(MB113)DSM23732である。さらに、該ビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する菌株は菌株ビフィドバクテリウム・インファンティスBI02(MB287)DSM24687である。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、さらに、リノール酸(ＬＡ)から共役リノール酸(ＣＬＡ)を産生できるビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株を含む。さらに、該ビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株はビフィドバクテリウム・ロングム(BL04)DSM23233である。
本発明の対象は、高コレステロール血症の予防または治癒的処置において使用するための、ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも１種の菌株、ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する少なくとも１種の菌株およびビフィドバクテリウム・ロングムに属する少なくとも１種の菌株から成る細菌組成物を含む食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物に関する。該ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する菌株は菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688および菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダム(MB109)DSM23731から成る群から選択され、好ましくはそれは菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダム(MB109)DSM23731である。さらに、該ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する菌株は菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス(MB2409)DSM23733および菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)DSM24690から成る群から選択され、好ましくはそれは菌株ビフィドバクテリウム・ラクティス(MB2409)DSM23733である。さらに、該ビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株はビフィドバクテリウム・ロングム(BL04)DSM23233である。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物において、ステロール類またはフィトステロール類、スタノール類またはフィトスタノール類、グルコマンナン、コンニャクガムおよび／またはフラクトオリゴ糖類(ＦＯＳ)、ガラクトオリゴ糖類(ＧＯＳ)、キシロオリゴ糖類(ＸＯＳ)、イヌリン、カラマツ繊維またはアラビノガラクタンを含む群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維および／または発酵赤米および／または燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および／または凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む群から選択される少なくとも１種の植物物質が存在する。
食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物において、さらに、(ｉ)ステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類を含む群から選択される少なくとも１種の植物物質がグルコマンナン、コンニャクガム、発酵赤米、燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む群から選択される少なくとも１種の植物物質と共に；
(ii)ステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類を含む群から選択される少なくとも１種の植物物質がグルコマンナン、コンニャクガム、発酵赤米、燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む群から選択される少なくとも１種の植物物質と共にＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維またはアラビノガラクタンを含む群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維と共に存在する。
有利には、食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、少なくとも２種の菌株を含む、あるいは２種から成る菌株の混合物を含む。少なくとも一方の菌株は非特異的コレステロール吸着機構(細菌細胞壁表面へのコレステロール吸着)を有しなければならず、他方は菌株特異的ＢＳＨ(胆汁酸塩類加水分解酵素)酵素活性を有しなければならない。
本発明の食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、高コレステロールレベル、すなわち２００mg／dlを超えるコレステロールレベルと関連する障害または病状の予防または治癒的処置において；および高コレステロール血症の処置において有効に適用される。
本発明が関連する上記組成物は、血中コレステロール、特にＬＤＬコレステロールの低下において有効に適用される。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、さらに、ステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類を含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を含む。組成物の１日投与量あたりのステロール類／スタノール類の量は、０.８ｇより多くなければならず、好ましくは１〜３ｇ、例えば、１.５〜２.０ｇである。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、さらに、グルコマンナン、コンニャクガム、発酵赤米、燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を含む。組成物の１日投与量あたりのグルコマンナン／コンニャクガムの量は４ｇより多くなければならず、好ましくは５〜１０ｇ、例えば、６〜８ｇである。
燕麦、燕麦糠、大麦または大麦糠由来のベータグルカン類を使用するとき、正常血中コレステロールレベルの維持に寄与させるために、３グラム／日の摂取を確実にしなければならない。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物は、さらに、ステロール類およびスタノール類を含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を、グルコマンナンおよびコンニャクガムを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の他の植物起源の物質と共に含む。推奨１日投与量は上に示す。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、さらに、ＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳおよびイヌリンを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維を含む。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、さらに、ステロール類およびスタノール類を含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を、ＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳおよびイヌリンを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維と共に含む。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、さらに、グルコマンナンおよびコンニャクガムを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を、ＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳおよびイヌリンを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維と共に含む。
好ましい態様において、本発明の食品組成物またはサプリメント製品または医薬組成物は、さらに、ステロール類およびスタノール類を含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質を、グルコマンナンおよびコンニャクガムを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質と共に、ＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳ、イヌリンを含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維と共に含む。
上記組成物は、血中コレステロールレベルは正常範囲ではあるが、食事中の脂肪摂取量により時々上昇して、“一過性”高コレステロール血症を生じ得る健常対象の処置において有効に適用される。この場合、これらの対象による本発明の組成物の摂取は、過剰なコレステロールの低下により、血中コレステロールレベルを正常範囲に戻し得る。
さらに、上記組成物はまた常時血中コレステロールレベルが高い対象の処置において有効に適用される。この場合、これらの対象による本発明の組成物の摂取は、血中コレステロールレベルの上昇を制限し得る。
下記の酸性化曲線に示されるとおり、菌株BL04はＦＯＳ、カラマツ繊維またはアラビノガラクタンおよびＧＯＳ−Ｇａｌのような植物物質を好み、菌株MB2409はＦＯＳおよびＧＯＳ−Ｇａｌのような植物物質を好み、菌株MB109はＦＯＳおよびイヌリンのような植物物質を好む。
実験部分
出願人は、菌株の選択を目的として集中的研究を実施した。
インビボ研究
計３２匹のラットをケージで飼育した。数日間、通常食餌に順化させた後(Ｔ０)、全ラットに同じ１００％血漿コレステロール上昇性食餌(hypercholesterolemizing diet)を与えた。この食餌で１５日間後(Ｔ１５)、ラットを無作為に４つのサブグループに分けた(８ラット／サブグループ)。ラットはＴ１５から開始し、Ｔ４５まで異なる処置を受けた。これらの処置は、屠殺まで３０日間続けた(Ｔ４５)。
第１群：３０％血漿コレステロール上昇性食餌およびラクトバチルス・ロイテリNCIMB701359(Kandler et al.; 1982)、１×１０９／日(基準)。この菌株は、コレステロールレベルを低下させる能力が知られている(比較)；
第２群：３０％血漿コレステロール上昇性食餌およびプロバイオティクス[ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733(０.３３×１０９／日)、ビフィドバクテリウム・ブレーベMB113 DSM23732(０.３３×１０９／日)およびビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731(０.３３×１０９／日)の混合物]；
第３群：３０％血漿コレステロール上昇性食餌(対照)。
ラット１匹あたりの１日投与量は、上記菌株(１×１０９ＣＦＵ／ml)を含む懸濁液１mlであった。この量をラットに胃ゾンデにより投与した。
血液サンプルを、Ｔ０、Ｔ１５およびＴ４５に空腹時に採った。血清を得られた血液から分離し、次のａ)ＬＤＬコレステロール、ｂ)ＨＤＬコレステロール、ｃ)総コレステロールおよびｄ)グリセリド類の血清パラメータを測定した。
研究の相
第Ｉ相。７日間全ラットに通常の準備食餌(Ｔ−７)。
第II相。０日目(Ｔ０)〜１５日目(Ｔ１５)まで全ラットに１００％血漿コレステロール上昇性食餌。
第III相。１６日目から４５日目(Ｔ４５)まで４群について上記の異なる食餌。
実験結果
１)体重変化
最初に試験したパラメータは、正確な食品摂取を確認するためのラットの体重増加であった。データは、ラットが正しい方法で食品を摂取したことを証明する。
２)血漿コレステロール上昇性食餌の影響
第Ｉ相で全ラットに同じ食餌を与えていたため、全動物を一群にまとめていた。次いで、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、総コレステロールおよび血中トリグリセリドレベルを０時(Ｔ０)および１５日後(Ｔ１５)に比較した。ＨＤＬ／ＬＤＬ比も計算した(表１参照)。
統計的解析をスチューデントｔ検定で行った：°：ｐ＜０.０１；＊：ｐ＜０.００１。
表１に示すデータは、血漿コレステロール上昇性食餌がＬＤＬコレステロール(悪玉コレステロール)の顕著な上昇と、ＨＤＬコレステロール(善玉コレステロール)のさらに顕著な低下をもたらすことを示す。正常状態では３より大きいＨＤＬ／ＬＤＬ比が血漿コレステロール上昇性食餌により低下した。
３)ＬＤＬコレステロールに対する異なる処置の影響(第１〜３群)
処置１および２(第１群および第２群)は、Ｔ１５の値と比較してＬＤＬコレステロール(ｐ＜０.００１)の顕著な低下をもたらした。３０％血漿コレステロール上昇性食餌のみの処置３(第３群)において、ＬＤＬレベルはＴ１５と比較して変化しなかった。
コレステロール量は次の２つの機構を介して低下した。
ｉ)機構１：非特異的コレステロール吸着(細菌の細胞壁表面への)
ii)機構２：ＢＳＨ(胆汁酸塩類加水分解酵素)の特異的酵素活性。
出願人は、ＢＳＨの細胞内活性を評価することにより、莫大な細菌群のスクリーニングを行った。
事実上、各菌種を一夜、ＭＲＳ培養培地＋システイン０.０５重量％／体積で培養し、遠心分離して細胞ペレットを回収した。このペレットを０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６)で２回洗浄して、細胞外ＢＳＨを除去した。
細胞を１mlのリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６)に再懸濁し、ガラスビーズを用いて、最高速度で４℃の５分間Vortexおよび１０分間氷上のインキュベートの３サイクルで溶解した。３回目のサイクルの最後に、サンプルを１３０００rpmで５分間遠心分離し、全胞残屑および巨大分子を沈殿させ、またタンパク質群を含む上清を使用できるようにした。
上清を分析して、それに含まれる総タンパク質群を定量した。
この目的で、ローリー法を使用して、抽出液中に存在するタンパク質総量を測定した。事実上、１mlのローリー試薬を、適当に希釈した２００μlの抽出液に添加する。
貯蔵溶液：
ローリーＡ：(０.１Ｍ ＮａＯＨ中Ｎａ２ＣＯ３(オートクレーブ))、
ローリーＢ：Ｈ２Ｏ中１％ＣｕＳＯ４(濾過により滅菌)、
ローリーＣ：Ｈ２Ｏ中２％Ｎａ−Ｋタートレート四水和物(濾過により滅菌)。
ローリー試薬(５０ml−５０サンプルあたり)：ローリーＡ ４９ml＋ローリーＢ ０.５ml＋ローリーＣ ０.５ml。
２００μlの適当に希釈したサンプル＋１mlのローリー試薬を室温で合わせる。１０分間、室温でインキュベートし、水に１：１希釈した１００μlのフォリン・シオカルト試薬を添加する。３０分間インキュベーション後、吸光度を５００nmで測定する。得られたデータをＢＳＡにより得られた回帰線に内挿する。次いで、抽出液の総タンパク質を決定し、mg／mlで表す。
ＢＳＨの特異的活性を滴定し(ＢＳＨ単位／総タンパク質mg)、ＢＳＨ酵素活性を有する細胞抽出液に存在するタンパク質群の比率を決定する。
この目的で、２０μlのタウロデオキシコール酸(ＴＤＣＡ)−ＴＣＤＡサンプル−またはグリココール酸(ＧＣＡ)−ＧＣＡサンプル−を２０μlの上記抽出液に、２００mM濃度で添加する。３６０μlの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６)を添加する。実験的ブランクは２０μlの抽出液および３８０μlの０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ６) − ブランクサンプル − である。
サンプル(ＴＤＣＡサンプル、ＧＣＡサンプルおよびブランクサンプル)を３７℃でインキュベートする。これを、各菌株から得た抽出液について繰り返す。
１０分間および３０分間インキュベーション後、１００μlの上記サンプルを回収し、１００μlのＴＣＡ(１５％トリクロロ酢酸)を添加して、タンパク質群を沈殿させる。その後５分間、１３０００rpmで遠心分離して、アミノ酸類グリシンおよびタウリンを含む酸性混合物および上清を回収する。
１０分および３０分に回収した５０μlの酸性混合物(得られた各酸性混合物、すなわちブランクサンプル、ＴＤＣＡサンプルおよびＧＣＡサンプルについて)をそのままおよび１：５希釈して分析する。詳細には、そのままのサンプルを、５０μlの酸性混合物および９５０μlのニンヒドリン混合物を使用して評価し、一方１：５希釈は、１０μlの酸性混合物を４０μlの脱塩水に添加し、９５０μlのニンヒドリン混合物を添加することにより評価した。ニンヒドリン混合物を次のとおり調製した：２mlの１％ニンヒドリンの０.５Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ５.５)；４.８mlのグリセロールおよび０.８mlの０.５Ｍクエン酸緩衝液(ｐＨ５.５)。サンプルを１４分間沸騰させ、水中で３分間冷却した。各サンプルの吸光度を５７０nmで読んだ。
タウリンおよびグリシンの定量は、タウリンまたはグリシンの標準濃度の特異的検量線が必要である。
１mlの抽出液あたりのＢＳＨ酵素活性単位の決定：
− Ｕ／ml＝１分間に遊離されるタウリンまたはグリシンのμモル／ml＝[[未知サンプルのＡｂｓ５７０−ブランクのＡｂｓ５７０]／１０分間]・１／[(１.２５×１０００)・(希釈係数１または５)]
ＢＳＨ単位(Ｕ)／mlの抽出液を、ローリー法を使用して決定した総タンパク質濃度に基づき、ＢＳＨ単位(Ｕ)／総タンパク質群mgに変換する。
全菌株で行ったこのスクリーニングの最後に(ＢＳＨの特異的活性決定により(ローリーおよびニンヒドリン))、全細胞でのＧＣＡ生体内分解の測定から成るさらなる分析を、それが“細胞外活性”を表すために行った。
事実上、一夜、ＭＲＳ＋０.０５％システイン重量／体積のブロス培養を行い、細胞濃度を標準化するために６００nmでのＯＤを測定する。
ＭＲＳ＋０.０５％システインを含むブランクを調製する。２０μlの２００mMグリココール酸(ＧＣＡ)溶液を１mlの各サンプルに添加し、３７℃で２０分間インキュベートする。続いて、１００μlを回収し、１００μlの１５％トリクロロ酢酸を添加して反応を中断させる。次いで、サンプルを１２０００rpmで５分間遠心分離して、全細胞およびタンパク質群を分離させ、脱塩水で２５倍希釈し、ブランクサンプルと比較した変換％を計算するためにＨＰＬＣ−ＭＳに注入する。
ＨＰＬＣ操作条件：
カラム：Zorbax Eclipse、
流速：０.２ml／分、
注入：１μl、
Λ＝２００nm、
溶媒：Ａ＝ｄｄ Ｈ２Ｏ；Ｂ＝ＡＣＮ、
勾配：Ｂ％Ｔ(分)；１０％、５分間；１００％、３０分間；１００％、５０分間；１０％、５５分間。
保持時間：ＧＣＡ(ＭＷ＝４６４)：３３.０４分間；ＣＡ(ＭＷ＝４０７)：３５.４１分間
ＭＳ(質量分析)操作条件：
極性：負、
捕捉時間：３００、
キャピラリー電流：３５００Ｖ、
ネブライザー：３０psi、
乾燥ガス：８.０ｌ／分、
乾燥温度：３２５℃、
Ｔ(分)：０−３０、３０−４０、４０−５５。
計算は細胞外ＢＳＨの存在を決定するために、変換％、すなわちどの程度ＣＡおよびＧＣＡが存在するかである。
それ故に、３２種の初期菌株を、細胞内ＢＳＨ(ローリー法およびニンヒドリンアッセイ)およびＧＣＡのＣＡへの生物変換−細胞外ＢＳＨ(ＨＰＬＣクロマトグラフィー＋ＭＳ)を考慮してスクリーニングした(表２参照)。
菌株を続いて吸着によりコレステロールを減少させるその能力を決定するために試験した。
コレステロール吸着能を、菌株をＭＲＳ培地＋システインで培養し、それに１００mg／ｌのコレステロールを添加することにより評価した。培養物を３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーション開始２４時間および４８時間後に、サンプルを採り、上清に残っているコレステロールをＨＰＬＣにより分析した。細胞に吸着されたコレステロールを計算し、非接種対照(ＭＲＳ培地＋システイン＋１００mg／ｌのコレステロール)と比較した。吸着されたコレステロールの％はまた培養物の光学密度(吸着されたコレステロール％／ＯＤ)に関連しても、この比がコレステロールをその膜に吸着させる細胞の能力を表すために考慮した。未知サンプルのコレステロール濃度を、既知コレステロール濃度の検量線(０.００mg／ｌ〜１００mg／ｌ)の手段により決定した。
ＨＰＬＣ方法
カラム：Zorbax Eclipse XBD-C18 高速分離ＨＴ ４.６×５０mm １.８μm、
移動相：ＡＣＮ、
ＤＡＤフロー：２００nm、
Ｒｔコレステロール：４.０分
培養条件
培地
グルコース：２０ｇ／ｌ、
バクトプロテオースペプトン３番、１０ｇ／ｌ、
バクト牛肉エキス：１０ｇ／ｌ、
バクト酵母エキス：５ｇ／ｌ、
酢酸ナトリウム５ｇ／ｌ、
Ｋ２ＨＰＯ３：２ｇ／ｌ、
クエン酸アンモニウム：２ｇ／ｌ、
ＭｇＳＯ４：０.１ｇ／ｌ、
ＭｎＳＯ４：０.０５ｇ／ｌ、
システイン：０.５ｇ／ｌ、
Ｔｗｅｅｎ ８０−コレステロール混合物
１１０℃で３０分間オートクレーブ。
増殖条件
一夜培養物から１０％接種、
Ｔ＝３７℃
ガス中嫌気条件、
初期コレステロール０.０８ｇ／ｌ
時間＝１８時間
コレステロール吸着値を表３に示す。
菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688および菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731は高コレステロール吸着能を示す。これらの２種の菌株は基準ラクトバチルス・ロイテリNCIMB701359と比較して、大量吸着する。
好ましい態様において、本発明の組成物は、高コレステロール吸着能を示すビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688およびビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731を含む、あるいはこれらから成る群から選択される少なくとも１種の高コレステロール吸着能を有する菌株を、ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733、ビフィドバクテリウム・ブレーベMB113 DSM23732、ビフィドバクテリウム・インファンティスBI02(MB287)DSM24687およびビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)DSM24690を含む、あるいはこれらから成る群から選択される細胞内および／または細胞外ＢＳＨ活性を有する少なくとも１種の菌株と共に含む。該組成物は、さらに上記のとおりステロール類および／またはスタノール類および／またはグルコマンナンおよび／またはコンニャクガムおよび／またはプレバイオティク繊維を含んでよい。
好ましい態様において、本発明の組成物は、高コレステロール吸着能を示すビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688およびビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731を含む、あるいはこれらから成る群から選択される高コレステロール吸着能を有する少なくとも１種の菌株を、ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733(ＢＳＨの細胞内および細胞外活性)およびビフィドバクテリウム・ブレーベMB113 DSM23732(ＢＳＨの高細胞内活性)を含む、あるいはこれらから成る群から選択されるＢＳＨ細胞内および／または細胞外活性を有する少なくとも１種の菌株と共に含む。有利に、該組成物は、菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731をビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733と共に含む。該組成物は、さらに上記のとおりステロール類および／またはスタノール類および／またはグルコマンナンおよび／またはコンニャクガムおよび／またはプレバイオティク繊維を含んでよい。
好ましい態様において、本組成物は、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731をビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733と共に含むか、またはこれらから成る。該組成物は、さらに上記のとおりステロール類および／またはスタノール類および／またはグルコマンナンおよび／またはコンニャクガムおよび／またはプレバイオティク繊維を含んでよい。
本発明が関係する上記組成物は、血中コレステロール、特にＬＤＬコレステロールのレベル低下のために有効に適用される。
本発明が関係する上記組成物は、２００mg／dlを超えるコレステロールレベルの高血中コレステロールレベルと関連する障害または病状の予防的または治癒的処置におよび高コレステロール血症の処置に有効に適用される。
臨床試験
臨床効果試験を、フラクトオリゴ糖類(ＦＯＳ)および二酸化ケイ素を含むプラセボ錠剤(総粉末／カプセル＝２８０.６mg)およびビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733、ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731およびビフィドバクテリウム・ロングムBL04 DSM 23233および二酸化ケイ素を含む錠剤(総粉末／カプセル＝２８０.６mg)を使用して行った。
実質的に、コレステロール低下活性を有する２種の菌株およびリノール酸(ＬＡ)を共役リノール酸(ＣＬＡ)に最もよく変換する菌株を合わせた。
治験のタイプ：プラセボに対する二重盲検無作為クロスオーバー。クロスオーバーを、７５日後に行うことが計画された(１５日間２カプセル／日＋６０日間１カプセル／日)。治験の総期間は１５０日間であった。該期間終了時の保証された負荷量：１０億／菌株／カプセル。各処置について本治験で提供された投与量(活性またはプラセボ)は次のとおりである。最初の１５日間２カプセル／日、その後６０日間１カプセル／日；クロスオーバー後、再び最初の１５日間２カプセル／日、続いて６０日間１カプセル／日。本臨床試験は、血中コレステロールレベルを２５％も低下させる、試験した細菌組成物の効果を確認した。
菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731、ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733およびビフィドバクテリウム・ロングムBL04 DSM 23233についての酸性化曲線の決定(表４、５、６および図１、２、３)。
菌株MB109、MB2409およびBL04を、実験前にＴＰＹ＋１％Ｃｙｓ−ＨＣｌで二次培養し、３７℃で嫌気生活下にインキュベートすることにより再活性化した。実験前に再活性化工程を３回、一夜インキュベーションと共に繰り返した。３回目の再活性化工程終了時、細胞をペレット化し、滅菌水で洗浄し、再懸濁して、繊維添加培地に接種した。使用する培地は、次のものをそれぞれ添加された無糖ＭＲＳ(炭素源)である。
− グルコース(１２１℃、１５分間の熱処理により滅菌された溶液)、対照培地。
− ＦＯＳ(濾過滅菌した溶液、０.２０μlフィルター)。
− ＧＯＳ−Ｇｌｕ − グルコース残基を有するガラクトオリゴ糖類(濾過滅菌した溶液、０.２０μlフィルター)。
− ＧＯＳ−Ｇａｌ − ガラクトース残基を有するガラクトオリゴ糖類(濾過滅菌した溶液、０.２０μlフィルター)。
− ＸＯＳ(濾過滅菌した溶液、０.２０μlフィルター)。
− Larex −カラマツ繊維またはアラビノガラクタン(１２１℃、１５分間の熱処理により滅菌した溶液)。
− イヌリン(１２１℃、１５分間の熱処理により滅菌した溶液)。
全培地について炭素源の最終濃度は２０ｇ／ｌでった。このように構成された培地に４％の菌株MB109、MB2409およびBL04(１％Ｃｙｓ−ＨＣｌ添加)を接種し、３７℃で好気生活下にインキュベートした。０時および３時間、６時間、８時間および１０時間に、グラフに示す酸性化曲線を構築するためにｐＨ値を測定した。
（原文に記載なし）

Claims (12)

  1. 高コレステロール血症の予防的または治癒的処置に使用するための、
    − コレステロールをその細胞壁表面に吸着できるビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも１種の菌株、および
    − 細胞内および／または細胞外レベルで胆汁酸塩類を加水分解できる
    ビフィドバクテリウム・ラクティス種、ビフィドバクテリウム・ブレーベ種またはビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する少なくとも１種の菌株
    から成る細菌組成物を含む、食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  2. 血中ＬＤＬコレステロールレベルを低下させるための、請求項１に従い使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  3. 該ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688および菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731から成る群から選択される、請求項１または２により使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  4. 該ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733および菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)DSM24690から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかにより使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  5. 該ビフィドバクテリウム・ブレーベ種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・ブレーベ(MB113)DSM23732である、請求項１〜４のいずれかにより使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  6. 該ビフィドバクテリウム・インファンティス種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・インファンティスBI02(MB287)DSM24687である、請求項１〜５のいずれかにより使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  7. リノール酸(ＬＡ)から共役リノール酸(ＣＬＡ)を産生できるビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株がさらに存在する、請求項１〜６のいずれかにより使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  8. 該ビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株がビフィドバクテリウム・ロングムBL04 DSM 23233である、請求項７により使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  9. 高コレステロール血症の予防的または治癒的処置に使用するための、該細菌組成物がビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する少なくとも１種の菌株、ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する少なくとも１種の菌株およびビフィドバクテリウム・ロングムに属する少なくとも１種の菌株から成る、請求項１〜８のいずれかにより使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  10. − 該ビフィドバクテリウム・ビフィダム種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムBB06(MB107)DSM24688および菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731から成る群から選択され；好ましくは菌株ビフィドバクテリウム・ビフィダムMB109 DSM23731であり、
    − 該ビフィドバクテリウム・ラクティス種に属する菌株が菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733および菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスBS07(MB243)DSM24690から成る群から選択され；好ましくは菌株ビフィドバクテリウム・ラクティスMB2409 DSM23733であり、そして
    − 該ビフィドバクテリウム・ロングム種に属する菌株がビフィドバクテリウム・ロングムBL04 DSM 23233である、
    請求項９により使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  11. さらにステロール類またはフィトステロール類、スタノール類またはフィトスタノール類、グルコマンナン、コンニャクガムおよび／またはフラクトオリゴ糖類−ＦＯＳ、ガラクトオリゴ糖類−ＧＯＳ、キシロオリゴ糖類−ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維またはアラビノガラクタンから成る群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維および／または発酵赤米および／または燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および／または凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルから成る群から選択される少なくとも１種の植物物質が存在する、請求項１〜１０のいずれかに従い使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
  12. さらに
    (ｉ) ステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類を含む群から選択される少なくとも１種の植物物質がグルコマンナン、コンニャクガム、発酵赤米、燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む群から選択される少なくとも１種の植物物質と共に存在する；
    (ii) ステロール類またはフィトステロール類および／またはスタノール類またはフィトスタノール類を含む群から選択される少なくとも１種の植物物質がグルコマンナン、コンニャクガム、発酵赤米、燕麦、燕麦糠、大麦、大麦糠由来のベータグルカン類および凍結乾燥形態のキダチアロエ・ゲルを含む群から選択される少なくとも１種の植物物質と共にＦＯＳ、ＧＯＳ、ＸＯＳ、イヌリン、カラマツ繊維またはアラビノガラクタンを含む群から選択される少なくとも１種のプレバイオティク繊維と共に存在する、
    請求項１１に従い使用するための食品組成物またはサプリメント製品またはメディカル・デバイスまたは医薬組成物。
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JP2018503367A (ja) * 2014-12-10 2018-02-08 バイオサーチ、ソシエダッド、アノニマＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｓ．Ａ． コレステロール吸収能を有するプロバイオティック株、その方法および使用

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