JP2013174616A - 抗体に基づくアレイを用いた乳癌療法のための薬物選択 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程を含み、切断受容体は、p95ErbB2であり、前記全長受容体は、ErbB2(HER−2)である切断受容体の存在を検出するための方法であって、シグナル伝達経路の成分の活性化状態に関する情報は、癌の診断、予後診断、および癌治療の設計において使用できる。
【選択図】なし
Description
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記抗癌剤が、前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療のために適切であることを指示する工程と、を含む。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性であることを指示する工程と、を含む。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性が高いことを指示する工程と、を含む。
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を前記対応する切断受容体に対して特異的である検出抗体とインキュベートする工程と;
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を、前記対応する切断受容体に対して特異的である複数の活性化状態非依存性抗体および複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーへチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。
上述したように、細胞増殖に関係するシグナル伝達経路の活性化および細胞死に関係する経路の非活性化は、多数の異なるタイプの癌を特性付ける分子的特徴の非限定的な例である。多数の場合において、特定のシグナル伝達経路の活性、およびそれらの成分は、所定タイプの癌のための分子シグニチャーとして機能することができる。そのような活性化された成分は、治療介入のために有用な標的をさらに提供することができる。したがって、治療前、治療中、および治療後に癌細胞内での特定シグナル伝達系の活性レベルに関する知識は、採用するべき適切な治療経過を選択するために使用できる高度に重要な情報を医師に提供する。さらに、癌細胞内で治療が進行するにつれて活性になるシグナル伝達経路の持続的監視は、例えば、同一もしくはまた別のシグナル伝達経路のいずれかを活性化するまた別の異常を通して癌細胞が治療に耐性になった場合は、医師に特定の治療コースを持続するか、または別の治療ラインへ切り替えるかを促すように、医師に治療の有効性に関する追加の情報を提供することができる。
本明細書で使用するように、以下の用語は、他に特に規定しない限り、それらに与えられた意味を有する。
1つの実施形態では、本発明は、特異的多重高スループットアッセイにおいて固形腫瘍の腫瘍組織に由来する腫瘍細胞または循環細胞中での複数の無秩序のシグナル伝達物質の発現および活性化状態を検出するための方法を提供する。本発明は、1つ以上の無秩序なシグナル伝達経路をダウンレギュレートまたは活動停止させるために適切な療法を選択するための方法および組成物もさらに提供する。そこで、本発明の実施形態は、所定の患者の腫瘍において活性化されたシグナル伝達タンパク質の収集によって提供される特定分子シグニチャーに基づいて個別の療法の設計を促進するために使用できる。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;および
(d)前記抗癌剤が、前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記抗癌剤が前記乳房腫瘍の治療のために適切であることを指示する工程と、を含む。
内の固体支持体上に固定される。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる)ために前記細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる)ために前記細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーへチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性であることを指示する工程と、を含む。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる)ために、前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる)ために細胞抽出物を前記複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために前記複数の捕捉分析物を、複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法を提供する。
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較する工程と;
(e)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態が前記対照活性化プロファイルと比較して実質的に減少している場合は、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性が高いことを指示する工程と、を含む。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉分析物の複合体に変換させる)ために前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を、前記捕捉分析物および前記活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために、前記複数の捕捉分析物を対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(i)複数の捕捉分析物を形成する(例えば、細胞抽出物中に存在する分析物を、前記分析物および捕捉抗体を含む捕捉抗体の複合体に変換させる)ために前記細胞抽出物を複数の希釈系列の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成する(例えば、捕捉分析物の複合体を捕捉分析物および検出抗体を含む検出可能な捕捉分析物の複合体に変換させる)ために前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および対応する分析物に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する(例えば、細胞抽出物を特異的全長受容体または全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換させる)ために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成する(例えば、全長受容体欠失細胞抽出物中に存在する切断受容体を切断受容体および捕捉抗体の複合体へ変換させる)ために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する(例えば、捕捉された切断受容体の複合体を、捕捉された切断受容体および活性化状態依存性抗体を含む検出可能な捕捉された切断受容体の複合体に変換させる)ために、前記複数の捕捉された切断受容体を対応する切断受容体に対して特異的な検出抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成する(例えば、細胞抽出物を特異的全長受容体または全長受容体のファミリーを含まない細胞抽出物に変換させる)ために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、前記複数の捕捉抗体は切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成する(例えば、全長受容体欠失細胞抽出物中に存在する切断受容体を切断受容体および捕捉抗体の複合体へ変換させる)ために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成する(例えば、前記捕捉された切断受容体の複合体を、前記捕捉された切断受容体および検出抗体を含む検出可能な捕捉された切断受容体を含む複合体に変換させる)ために、前記複数の捕捉された切断受容体を、複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する切断受容体に対して特異的な複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする(例えば、接触させる)工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体を前記シグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする(例えば、接触させる)工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。
乳癌は、肺癌、胃癌、肝臓癌、および大腸癌に続く、世界中の癌死亡の5番目に多い原因である。2005年には、乳癌のために世界中で502,000人が死亡した。特に世界中の女性については、乳癌は癌死亡の最大の原因である。
乳癌は、各々が下記の基準に基づく4種の分類スキームを用いて説明することができる:
1.病理学。病理学者は、その組織学的外観および他の基準に基づいて各腫瘍を分類することができる。乳癌の最も一般的な病理学的タイプは、浸潤性乳管癌および浸潤性小葉癌である。
2.腫瘍の悪性度。組織学的悪性度は、病理学者が顕微鏡下で決定することができる。高分化型(低悪性度)腫瘍は正常組織に似ている。低分化型(高悪性度)腫瘍は組織化されていない細胞から構成され、正常組織のようには見えない。中分化型(中悪性度)腫瘍は、その中間のどこかにある。
3.タンパク質および遺伝子発現の状態。乳癌は、例えば、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびHer2/Neu/ErbB2などのシグナル伝達分子の発現および/または活性化について試験することができる。本明細書に記載したように、所定の腫瘍の発現プロファイルはその予後診断の予測に役立ち、癌専門医が最も適切な治療を選択する際に支援する。
4.腫瘍の病期。乳癌は、TNM分類システムにしたがって病期分類することができる:
a.腫瘍。浸潤性癌の存在もしくは非存在、浸潤性癌の寸法、および乳房の外側(例えば、乳房の皮膚または下部の筋肉もしくは胸郭)での浸潤の存在もしくは非存在に依存する5つの値(Tis、T1、T2、T3、またはT4)。
b.リンパ節。リンパ節内の転移性沈着物の数、サイズ、および所在位置に依存する4つの値(N0、N1、N2、またはN3)。
c.転移。リンパ節以外の転移(例えば、骨、脳、肺などへのいわゆる遠隔転移)の存在もしくは非存在に依存する2つの値(M0またはM1)。
病理学に関して、WHO(世界保健機関)の乳房腫瘍の分類は、以下の組織学的タイプを規定している:
1.例えば、浸潤性乳管癌(例えば、基底細胞様癌、混合型癌、多形細胞癌、破骨巨細胞を備える癌、絨毛膜癌の特徴を備える癌、黒色性の特徴を備える癌)、浸潤性小葉癌、管状腺癌、浸潤性篩状癌、髄様癌、粘液性癌、および豊富なムチンを備えるその他の腫瘍(例えば、粘液性癌、嚢胞腺癌および円柱細胞粘液性癌、印環細胞癌)、神経内分泌腫瘍(例えば、固形神経内分泌癌(乳房のカルチノイド)、非定型カルチノイド腫瘍、小細胞/燕麦細胞癌、大細胞神経内分泌癌)、浸潤性乳頭状癌、浸潤性微小乳頭状癌、アポクリン腺癌、化生性癌(例えば、混合上皮/間葉性化生性癌または例えば扁平上皮癌、紡錘細胞化生を伴う腺癌、腺扁平上皮癌、および粘液性類表皮癌などの純粋上皮化生性癌)、脂質の多い癌、分泌性乳癌、膨大細胞癌、腺様嚢胞癌、膵腺房細胞癌、グリコーゲン富裕明細胞癌、皮脂腺癌、炎症性乳癌、および両側乳癌などの浸潤性乳癌;
2.例えば小葉腫瘍(例えば、上皮内小葉癌)、乳管内増殖性病変(例えば、通常の乳管過形成、扁平上皮過形成、非定型乳管過形成、非浸潤性乳管癌)、微小癌、および管内乳頭腫瘍(例えば、中枢性乳頭腫、末梢性乳頭腫、非定型乳頭腫、管内乳頭癌、嚢胞内乳頭癌、良性上皮性病変)などの前駆病変;
3.例えば、変形(例えば、硬化性腺症、アポクリン腺疾患、閉塞性腺症、微小乳腺腺症、腺筋上皮腺腫)を含む腺症、放射状瘢痕/複合硬化性病変、および腺腫(例えば、管状腺腫、乳汁分泌性腺腫、アポクリン腺腫、多形腺腫、乳管腺腫)などの良性上皮性病変;
4.例えば、筋上皮症、腺筋上皮腺症、腺筋上皮腫、および悪性筋上皮腫などの筋上皮病変;
5.例えば肉腫、血管腫、血管腫症、血管外皮細胞腫、偽血管腫性間質過形成、筋繊維芽細胞腫、線維腫症(進行性)、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、脂肪腫(例えば、血管脂肪腫)、顆粒細胞腫、神経線維腫、神経鞘腫、血管肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋腫、および平滑筋肉腫などの間葉腫瘍;
6.例えば線維腺腫、葉状腫瘍(例えば、良性、境界型、悪性)、低悪性度乳管周囲間質性肉腫、および乳腺過誤腫などの線維上皮腫瘍;
7.例えば、乳頭腺腫、乳頭の汗管腺腫、および乳頭のページェット(Paget)病などの乳頭の腫瘍;
8.悪性リンパ腫;
9.転移性腫瘍;および
10.例えば、女性化乳房および上皮内癌もしくは浸潤性癌などの男性乳房の腫瘍。
乳癌では、重要なシグナル伝達成分における多数の変化が証明されてきた。これらには:活性化を生じさせるEGFR突然変異;例えばcMetなどの他の受容体チロシンキナーゼの活性化;HER−2およびHER−3の活性化もしくはHER−2の増幅を伴うEGFR活性化;PI3K突然変異を伴うEGFR活性化;PTEN欠失を伴うEGFR活性化;およびRas突然変異を伴うEGFR活性化が含まれる。シグナル伝達経路の異なる成分における様々な変化は、様々な形態の化学療法の標的とされてきた。
タモキシフェンに対する新規(初期療法に非応答;一次耐性)および獲得耐性(療法に対する初期応答を示した後の疾患再発もしくは進行;二次耐性)は、重要な問題である。結果として、腫瘍生物学および耐性のメカニズムに関する理解は、有意な臨床上の意義を提供することができる。
乳房腫瘍の3分の2以上は、増殖に関してエストロゲン依存性である。転移性乳癌を治療するためには、多数のエストロゲン遮断剤を使用できる。これらの作用物質への治療応答は予測できないが、エストロゲンもしくはプロゲステロンに対する受容体を備える転移性乳癌を備える患者の約3分の1は、ホルモン療法から利益が得られない。転移性乳癌を備えるほぼ全患者は、ホルモン受容体が未だ存在するという事実にもかかわらず、最終的にはホルモン療法に対して耐性になる。
所定の態様では、例えば固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞の細胞抽出物中の複数のシグナル伝達分子の活性化状態は、固体支持体上に固定された希釈系列の捕捉抗体を含む抗体に基づくアレイを用いて検出される。これらのアレイは、典型的には、異なるアドレス可能な場所における固体支持体の表面に結合しているある範囲の捕捉抗体濃度で複数の異なる捕捉抗体を含む。
一部の実施形態では、例えば固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞の細胞抽出物中の当該の特定分析物(例えば、シグナル伝達分子)の活性化状態を検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット2抗体アッセイである。非限定的例として、本アッセイにおいて使用される2つの抗体は:(1)分析物に対して特異的な捕捉抗体;および(2)前記分析物の活性化形に対して特異的な検出抗体(すなわち、活性化状態依存性抗体)を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、前記分析物のリン酸化、ユビキチン化、および/または複合体形成状態を検出することができる。または、検出抗体は、細胞抽出物中の前記分析物の総量を検出する、活性化状態非依存性抗体を含む。活性化状態非依存性抗体は、一般に、分析物の活性化および非活性化形の両方を検出することができる。
(i)複数の捕捉分析物を形成するために細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
(a)細胞抽出物を細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程であって、前記ECD結合領域は全長受容体に対して特異的である工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は前記切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を前記対応する切断受容体に対して特異的である検出抗体とインキュベートする工程と;
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、例えば固形腫瘍の循環細胞などの腫瘍細胞の細胞抽出物中の当該の特定分析物(例えば、シグナル伝達分子)の活性化状態を検出するためのアッセイは、優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット近接(すなわち、3抗体)アッセイである。非限定的例として、本近接アッセイにおいて使用される3つの抗体は:(1)分析物に対して特異的な捕捉抗体と;(2)分析物の活性化形に対して特異的な検出抗体(すなわち、活性化状態依存性抗体);および(3)前記分析物の総量を検出する検出抗体(すなわち、活性化状態非依存性抗体)を含むことができる。活性化状態依存性抗体は、例えば、分析物のリン酸化、ユビキチン化、および/または複合体形成状態を検出することができる。活性化状態依存性抗体は、一般に、分析物の活性化および非活性化形の両方を検出することができる。
(i)複数の捕捉分析物を形成するために細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、複数の活性化状態非依存性抗体および対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む。
本発明による希少循環細胞などの腫瘍細胞中のシグナル伝達分子の活性化状態を分析するために未だ市販で入手可能にはなっていない抗体の生成および選択は、幾つかの方法によって実施できる。例えば、1つの方法は、当分野において公知のタンパク質発現および精製方法を使用して当該のポリペプチド(すなわち、抗原)を発現および/または精製する方法であるが、また別の方法は当分野において公知の固相ペプチド合成法を用いて当該のポリペプチドを合成する方法である。例えば、Guide to Protein Purification,Murray P.Deutcher,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.182(1990);Solid Phase Peptide Synthesis,Greg B.Fields,ed.,Meth.Enzymol.,Vol.289(1997);Kisoら、Chem.Pharm.Bull.,38:1192−99(1990);Mostafaviら、Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids,1:255−60,(1995);およびFujiwaraら、Chem.Pharm.Bull.,44:1326−31(1996)を参照されたい。精製もしくは合成されたポリペプチドは、次にポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するために、例えば、マウスまたはウサギに注射することができる。当業者であれば、例えば、Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow and Lane,Eds.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)に記載されているように、抗体を産生するためには多数の方法を利用できることを認識するであろう。当業者であれば、結合フラグメントまたは抗体を模倣する(例えば、抗体の機能的結合領域を保持する)Fabフラグメントもまたさらに様々な方法によって遺伝情報から調製できることも理解するであろう。例えば、Antibody Engineering:A Practical Approach,Borrebaeck,Ed.,Oxford University Press,Oxford(1995);およびHuseら、J.Immunol.,149:3914−3920(1992)を参照されたい。
ポリクローナル抗体は、好ましくは当該のポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射によって動物において立てられる。当該のポリペプチドを、二官能剤もしくは誘導体化剤を用いて、例えばアオガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤などの、免疫対象の種内で免疫原性であるタンパク質担体へ結合させるのが有利な可能性がある。二官能剤もしくは誘導体化剤の非限定的例には、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を通しての結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を通しての結合)、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、SOCl2、およびR1N=C=NR(式中、RおよびR1は異なるアルキル基である)が含まれる。
モノクローナル抗体は、一般には、実質的に均質な抗体の集団から入手される、すなわち、前記集団を含む個別抗体は小量で存在する可能性がある天然型変異を除いて同一である。そこで、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の性質が離散的抗体の混合物ではないことを示している。例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら、Nature,256:495(1975)によって記載されたハイブリドーマ法、または当分野において公知のあらゆる組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号明細書を参照されたい)を用いて作成することができる。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当分野において公知である。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである起源からその中に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから採取される、「インポート」残基と呼ばれることが多い。ヒト化は、本質的には非ヒト抗体の超可変性領域配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって実施できる。例えば、Jonesら、Nature,321:522−525(1986);Riechmannら、Nature,332:323−327(1988);およびVerhoeyenら、Science,239:1534−1536(1988)を参照されたい。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体(例えば、米国特許第4,816,567号明細書を参照されたい)であるが、このとき決して実質的に完全ではないヒト可変領域は、非ヒト種から対応する配列によって置換されている。実際に、ヒト化抗体は、典型的には一部の超可変領域残基およびおそらくは一部のフレームワーク領域(FR)残基は、齧歯類抗体の類似部位由来の残基と置換されているヒト抗体である。
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を生成することができる。一部の実施形態では、免疫すると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で全レパートリーのヒト抗体を生成できるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を生成することができる。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は内因性抗体産生の完全阻害を生じさせると記載されている。そのような生殖細胞系変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原惹起投与後にはヒト抗体の産生を生じさせる。例えば、Jakobovitsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovitsら、Nature,362:255−258(1993);Bruggermannら、Year in Immun.,7:33(1993);ならびに米国特許第5,591,669号明細書、第5,589,369号明細書、および第5,545,807号明細書を参照されたい。
抗体フラグメントを生成するために、様々な技術が開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、完全抗体のタンパク質分解によって引き出された(例えば、Morimotoら、J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107−117(1992);およびBrennanら、Science,229:81(1985)を参照されたい)。しかしこれらのフラグメントは、現在では組換え宿主細胞を用いて直接的に生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、上記で考察した抗体ファージライブラリーから単離できる。または、Fab’−SHフラグメントを大腸菌細胞から直接的に回収し、化学的に結合させてF(ab’)2フラグメントを形成することができる(例えば、Carterら、BioTechnology,10:163−167(1992)を参照されたい)。他のアプローチによると、F(ab’)2フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体フラグメントを生成するための他の技術は、当業者には明白であろう。他の実施形態では、最適な抗体は、一本鎖Fvフラグメント(scFv)である。例えば、国際公開第93/16185号パンフレット;ならびに米国特許第5,571,894号明細書および第5,587,458号明細書を参照されたい。抗体フラグメントは、さらに例えば米国特許第5,641,870号明細書に記載されたように線状抗体であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは、単一特異的または二重特異的であってもよい。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。典型的な二重特異性抗体は、当該の同一ポリペプチドの2つの異なるエピトープに結合することができる。その他の二重特異性抗体は、当該のポリペプチドのための結合部位を1つ以上の追加の抗原のための結合部位と結合することができる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。
組み換え技術を使用すると、抗体は単離された宿主細胞の内側で、宿主細胞のペリプラスム間隙内において生成できる、または宿主細胞から培地中へ直接分泌させることができる。抗体が細胞内で生成されると、微粒子破片は最初に、例えば遠心分離または限外濾過によって除去される。Carterら、BioTech.,10:163−167(1992)は、大腸菌のペリプラスム間隙内に分泌される抗体を単離するための方法について記載している。手短には、細胞ペーストは酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)の存在下で約30分間にわたり解凍させられる。細胞破片は、遠心分離によって取り除くことができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は一般に、例えば、Amicon社またはMillipore Pellicon社製限外濾過装置である市販で入手できるタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮させられる。例えばPMSFなどのプロテアーゼ阻害剤は、タンパク質分解を阻害するために上記の工程のいずれかに含めることができ、偶発的汚染物質の増殖を防止するためには抗生物質を含めることができる。
本発明の方法によると、本明細書に記載した抗癌剤は、当分野において公知の任意の便宜的手段によって被験者に投与される。本発明の方法は、被験者における腫瘍(例えば、乳房腫瘍)を治療するのに適切な抗癌剤または抗癌剤の組み合わせを選択するために使用できる。本発明の方法は、さらにまた抗癌剤または抗癌剤の組み合わせを用いた治療に対する被験者における腫瘍(例えば、乳房腫瘍)の応答を同定するためにも使用できる。さらに、本発明の方法は、抗癌剤または抗癌剤の組み合わせを用いた治療に対する腫瘍(例えば、乳房腫瘍)を有する被験者の応答を予測するためにも使用できる。当業者であれば、本明細書に記載した抗癌剤を単独で、または従来型化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、および/または手術との併用治療アプローチの一部として投与できることを理解するであろう。
以下の実施例は、本発明を限定するためではなく例示するために提供する。
固形腫瘍の循環細胞は固形腫瘍から転移または微小転移したのいずれかである細胞を含み、循環腫瘍細胞(CTC)、癌幹細胞、および/または腫瘍へ移動中である細胞(例えば、循環内皮前駆細胞(CEPC)、循環内皮細胞(CEC)、循環前血管新生骨髄性細胞、循環樹状細胞など)が含まれる。循環細胞を含有する患者サンプルは、任意の接近可能な生体液(例えば、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、尿、唾液、細針吸引液など)から入手できる。循環細胞は、例えば、免疫磁気分離法(例えば、Racilaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589−4594(1998);Bilkenrothら、Int.J.Cancer,92:577−582(2001)を参照されたい)、Immunicon社(ペンシルバニア州ハンティントン・バレー)によるCellTracks(登録商標)システム、マイクロ流体分離法(例えば、Mohamedら、IEEE Trans.Nanobiosci.,3:251−256(2004);Linら、Abstract No.5147,97th AACR Annual Meeting,Washington,D.C.(2006))、FACS(例えば、Mancusoら、Blood,97:3658−3661(2001))、密度勾配遠心分離法(例えば、Bakerら、Clin.Cancer Res.,13:4865−4871(2003))、および枯渇法(例えば、Meyeら、Int.J.Oncol.,21:521−530(2002)を参照されたい)を含む1つ以上の分離方法を使用して患者サンプルから単離することができる。
CTCの免疫磁気的分離−活性化アッセイを後に実施する手動単離:
1)事前に抗EpCAMモノクローナル抗体(Kordia Life Sciences社、オランダ国ライデン)へ結合されている磁気ビーズ(Dynal M450;Dynal AS社、ノルウェー国オスロ)を使用する。または、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の混合物を使用することもできる。
2)使用直前に、プレコートされたDynabeadsを0.01%のBSAを含む等量のPBS中で1回洗浄する。
3)25μLのプレコートされたDynabeadsを1mLのサンプルに加える。
4)この混合物を穏やかに傾斜および回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)この試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%でBSAを含むPBS中に再懸濁させることで3回洗浄し、その後に磁気分離することによってビーズ結合細胞を洗浄する。
7)このサンプルを100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト被験者由来の末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に取り出す。穿刺した静脈から遊離される上皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)使用前に、0.9% NaClを用いて、1mLの全血を1:3に希釈する。
1)細胞系コントロールは、ヒト癌細胞系をHL−60細胞内にスパイクすることによって作成する。
2)細胞系コントロールは、ヒト癌細胞系を健常ドナー由来の全血内にスパイクすることによって作成する。
非限定的な例として、生育可能なCECおよびCEPCは、Beerepootら、Ann.Oncology,15:139−145(2004)に記載された免疫磁気分離/濃縮法を使用すると単離できる。手短には、末梢血を抗CD146モノクローナル抗体(Kordia Life Sciences社)に事前に結合されている磁気ビーズ(Dynal M450 IgG1)とともにインキュベートする。この抗体は、末梢血中で造血細胞もしくは上皮細胞以外の全系統の内皮細胞を認識する(Georgeら、J.Immunol.Meth.,139:65−75(1991))。造血細胞および上皮細胞の陰性選択は、適切な抗体(例えば、白血球を枯渇させるためにはDynal−CD45ビーズ、単球を枯渇させるためにはDynal−CD14ビーズ、上皮細胞を枯渇させるためにはDynal−EpCAM(Invitrogen社、カリフォルニア州カールズバッド))に結合した磁気ビーズを用いた陽性選択の前に使用できる。この実施例では、陽性選択だけを使用する。
1)事前に抗CD146モノクローナル抗体(Kordia Life Sciences社)へ結合されている磁気ビーズ(Dynal M450)を使用する。
2)使用直前に、プレコートされたDynabeadsを0.01%のBSAを含む等量のPBS中で1回洗浄する。
3)25μLのプレコートされたDynabeadsを1mLのサンプルに加える。
4)この混合物を穏やかに傾斜および回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)この試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%でBSAを含むPBS中に再懸濁させることでビーズ結合細胞を3回洗浄し、その後に磁気分離にかける。
7)このサンプルを100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト被験者由来の末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に取り出す。
2)穿刺した静脈から遊離される内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
3)使用前に、0.9% NaClを用いて、1mLの全血を1:3に希釈する。
1)細胞系コントロールは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をHL−60細胞内にスパイクすることによって作成する。
2)細胞系コントロールは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を健常者から提供された全血内にスパイクすることによって作成する。
CEPCは、様々な血管新生成長因子に応答して成熟内皮細胞に分化する能力を有する骨髄由来前駆細胞の循環サブタイプである。CEPCは、表面マーカーCD34を認識する抗体を用いた選択によって単離することができる。CD133は、CEPCから未成熟内皮前駆細胞(EPC)または原子造血幹細胞(HSC)を分化させる表面マーカーである。様々な起源からのCEPCの様々な単離方法は、接着培養または磁気マイクロビーズを用いて記載されている。本実施例では、Asaharaら、Science,275:964−967(1997)に記載されたプロトコールから修正されたプロトコールが使用される。
1)磁気ビーズ(Dynal M450 CD34)を使用する。これらのビーズは、CD34表面抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を用いてコーティングする。
2)使用直前に、プレコートされたDynabeadsを0.01%のBSAを含む等量のPBS中で洗浄する。
3)25μLのプレコートされたDynabeadsを1mLのサンプルに加える。
4)この混合物を穏やかに傾斜および回転させながら、2〜8℃で20分間インキュベートする。
5)この試験管を磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に2分間配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%でBSAを含むPBS中に再懸濁させることでビーズ結合細胞を3回洗浄し、その後に磁気分離にかける。
7)このサンプルを100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)ヒト被験者由来の末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に取り出す。穿刺した静脈から遊離される内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)平衡食塩液を用いて、10mLの全血を1:1に希釈する。
3)4mLの希釈血は10mLの試験管中の3mLのFicoll−Paque上へ層状に重ねる。
4)試験管は18〜20℃で30〜40分間にわたり400×gで回転させる。
5)無菌パスツールピペットを用いて血漿および血小板を含有する上層を取り出し、界面で平静である単核球の層を残す。
6)単核球は、無菌ピペットを用いて無菌遠心分離管に移す。
7)6mLの平衡食塩液を加え、細胞を穏やかに再懸濁させる。
8)この混合物は、18〜20℃で10分間にわたり60〜100×gで遠心させる。
9)上清を取り除き、各試験管からの単核球を1mLのPBS中に再懸濁させる。
Veridex,LLC(ニュージャージー州ウォーレン)は、CellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)System、CellSearch(商品名)上皮細胞キット、およびCellTracks(登録商標)アナライザーから構成されるCellSearchシステムを市販している。CellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)システムは、半自動サンプル調製システムである(Kaganら、J.Clin.Ligand Assay,25:104−110(2002))。CellSearch(商品名)上皮細胞キットは:上皮細胞に対して特異的な抗EpCAM抗体がコーティングされた強磁性流体;サイトケラチン8、18、および19へのフィコエリトリン結合された抗体;アロフィコシアニンに結合された抗CD45抗体;DAPI色素;ならびに細胞を洗浄する、透過させる、および再懸濁化させるための緩衝液から構成される。この実施例で使用するプロトコールは、同様にAllardら、Clin.Cancer Res.,10:6897−6904(2004)に記載されている。全VeridexシステムはCTC計数のために使用できる、またはCellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)システムを用いた単離後にサンプルを手動で取り除くことによって、分析前に経路活性化のための単離方法を提供することができる。CTCの数は、アルゴリズム開発のために情報を提供できる。
1)7.5mLの血液を6mLのバッファと混合し、10分間にわたり800×gで遠心し、次にCellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)システム上に配置する。
2)機器が上清を吸引した後、この機器は強磁性流体を加える。
3)この機器はインキュベーション、およびその後の磁気分離工程を実施する。
4)未結合細胞および残留する血漿が吸引される。
5)蛍光染色のために透過緩衝液を結び付けて染色試薬を加える。
6)本システムによるインキュベーション後、細胞を再び磁気的に分離し、MagNest(登録商標)細胞提示デバイスに再懸濁させる。
7)MagNest(登録商標)細胞提示デバイスは、4色半自動蛍光顕微鏡であるCellTracks(登録商標)アナライザー上に配置する。
8)Veridex規定基準を満たす画像が捕捉され、最終手動選択のためにウエブベースのブラウザによって示される。
9)細胞計数の結果は、血液7.5mL当たりの細胞数として表示される。
1)7.5mLの血液を6mLのバッファと混合し、10分間にわたり800×gで遠心し、次にCellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)システム上に配置する。
2)機器が上清を吸引した後、この機器は強磁性流体を加える。
3)この機器はインキュベーション、およびその後の磁気分離工程を実施する。
4)未結合細胞および残留する血漿が吸引される。
5)このサンプルを100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)Veridexは、抗CD146抗体を用いた捕捉を利用するCellSearch(商品名)内皮細胞キットを供給する。CellSearch(商品名)内皮細胞キッ
トは、血液サンプル調製のためにはCellTracks(登録商標)AutoPrep(登録商標)システムと、および全血由来のCECおよびCEPCを計数して特性付けるためにはCellTracks(登録商標)アナライザーと結び付けて使用される。プロトコールは、CellSearch(商品名)上皮細胞キットについてのプロトコールと同一である。
1)計数:ヒト被験者由来の末梢血は、製造業者の取扱説明書にしたがってCellSave(登録商標)保存用試験管内に採血する。穿刺した静脈から遊離される上皮または内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
2)経路分析:ヒト被験者由来の末梢血を、1mg/mLのEDTAを含有するシリコン被覆試験管内に取り出す。穿刺した静脈から遊離される上皮または内皮細胞による汚染を回避するために、最初の3〜5mLは廃棄する。
腫瘍が固有の自己再生および生存メカニズムを備える小集団の推定癌幹細胞を含有するという証拠が確立されつつある(例えば、Sells,Crit.Rev.Oncol.Hematol.,51:1−28(2004);Reyaら、Nature,414:105−111(2001);Dontuら、Trends Endocrinol.Metal.,15:193−197(2004);およびDick,Nature,423:231−233(2003)を参照されたい)。癌幹細胞(CSC)は、長時間にわたって、分化細胞を標的とする化学療法薬に耐性にさせる静穏状態で存在することができる。この癌開始集団は、選択的除去のための標的療法を受ける自己再生および生存経路の活性化について特徴付けることができる。CSCの単離方法は、接着培養または磁気マイクロビーズを用いて記載されている。本実施例では、Coteら、Clin.Can.Res.,12:5615(2006)に記載されたプロトコールから修正されたプロトコールを使用する。
1)磁気ビーズ(Dynal AS;ノルウェー国オスロ)を使用する。これらのビーズは、CD34またはCD133表面抗原のいずれかに対して特異的なモノクローナル抗体を用いてコーティングする。
2)使用直前に、プレコートされたDynabeadsを0.01%のBSAを含む等量のPBS中で1回洗浄する。
3)1〜107のプレコートされたDynabeadsを3mLのサンプルに加える。
4)この混合物を穏やかに傾斜および回転させながら、2〜8℃で60分間インキュベートする。
5)この混合物を1mL部分に分割し、各試験管を少なくとも6分間にわたり磁気分離装置(MPL−1マグネット)内に配置する。
6)上清を廃棄し、0.01%でBSAを含むPBS中に再懸濁させることでビーズ結合細胞を3回洗浄し、その後に磁気分離にかける。
7)このサンプルを100μLの刺激緩衝液中に再懸濁させる。
1)骨髄標本は、初期乳癌患者からインフォームドコンセントを得た後に入手する。
2)骨髄吸引液を処理する工程は、Bauerら、Clin.Can.Res.,6:3552−3559(2000))に記載されたように実施する。任意の播種性腫瘍細胞を含有する単核球分画は、35分間にわたり4,000×gでBeckman社製GS−6遠心分離装置を用いてFicoll−Hypaque密度勾配遠心分離によって濃縮し、PBSを用いて2回洗浄する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)によって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ(microfuge)内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
VEGFは、CEPC(Larriveeら、J.Biol.Chem.,278:22006−22013(2003))および血管壁から剥がれ落ちていた成熟CEC(Soloveyら、Blood,93:3824−3830(1999))の両方において抗アポトーシス経路を活性化することによって生存を促進すると考えられている。VEGFは、CEPCまたは成熟CECの増殖を刺激することもできるが、成熟CECはCEPCに比較して限定された増殖能力しか有していないと思われる(Linら、J.Clin.Invest.,105:71−77(2000))。これらの理由から、CECおよび/またはCEPCは、溶解前にVEGFファミリー成長因子とのインキュベーションによって活性化される。
1)各々が100nMにある成長因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF、および/またはAngを細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のAvastin(登録商標)、Nexavar(登録商標)、Sutent(登録商標)、および/またはラパマイシンとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子VEGF、FGF、PDGF、PIGF、および/またはAngを各々100nMで加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のAvastin(登録商標)、Nexavar(登録商標)、Sutent(登録商標)、および/またはラパマイシンとインキュベートする。
2)細胞は、次にVEGF、FGF、PDGF、PIGF、および/またはAngを各々100nMで加えることによって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
刺激された細胞:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
この実施例は、腫瘍組織または生検標本から細胞を単離する、刺激する、および溶解させるための方法を例示する。この実施例は、組織、生検標本、または全血から単離した腫瘍細胞の一次培養を開始する、刺激する、および溶解させるための方法も例示する。化学療法薬をスクリーニングするための生物学的標本から腫瘍細胞を単離および培養するための追加の方法は、例えば、米国特許第第5,728,541号明細書;第6,416,967号明細書;第6,887,680号明細書;第6,900,027号明細書;第6,933,129号明細書;第7,112,415号明細書ならびに米国特許出願公開第20040023375号明細書および第20050202411号明細書に記載されている。この実施例によって調製される細胞抽出物は、本明細書に記載した単一検出または近接アッセイにおいて使用できる。
細胞の単離および培養:
1)約5〜100mgの非壊死性、非汚染腫瘍組織を外科的に採取し、無菌細胞培養培地(例えば、10% FBSおよび抗生物質を含むRMPI−1640)を含有する100mLボトル内に配置する。
2)サンプルは、抽出後72時間以内に室温で保管または輸送することができる。
3)サンプルは、細胞培養培地中で3回すすぎ洗う。
4)組織は外科用メスを用いて小片に細分化し、次に微細なワイヤーメッシュを通過させることによって細胞懸濁液内へ分解させる。
5)または、細分化した組織は、抗生物質を含有する血清無含有細胞培養培地中に希釈した0.25%コラゲナーゼIIおよび0.001% DNaseを含有するカクテルで処理する。インキュベーションは、緩徐に攪拌しながら15〜20分間行う。細胞培養培地を用いて3回洗浄することによって、処理後に酵素を取り除く。
6)細胞濃度を106/mLへ調整し、細胞を6ウエルプレート内へ播種し、一晩沈降させる。翌日、細胞をトリプシン処理し、リガンドを用いた刺激および/または標的薬を用いた阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)によって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、上記の表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
細胞の単離および培養:
1)コア生検標本を外科的に抽出し(真空支援生検のための1〜2片の生検標本とともに、14ゲージ針については2つのコア、16ゲージ針については3つのコア、および18ゲージ心については4つのコア)、腫瘍標本のための細胞培養培地を含有する10mL無菌バイアル内に配置する。
2)サンプルは、抽出後72時間以内に室温で保管または輸送することができる。
3)コア生検標本由来の細胞物質は、微細なワイヤーメッシュを通過させることによって細胞懸濁液内へ分解させる。
4)または、生検標本は、抗生物質を含有する細胞培養培地中に希釈した0.25%コラゲナーゼIIおよび0.001% DNaseを含有するカクテルで処理する。インキュベーションは、緩徐に攪拌しながら15〜20分間行う。細胞培養培地を用いて3回洗浄することによって、処理後に酵素を取り除く。
5)細胞濃度を106/mLへ調整し、細胞を6ウエルプレート内へ播種し、一晩沈降させる。翌日、細胞をトリプシン処理し、リガンドを用いた刺激および/または標的薬を用いた阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種する。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)によって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、上記の表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
細胞の培養:
1)上述したように組織、生検標本、または全血から単離した腫瘍細胞は、単離した腫瘍細胞の数に依存して、小さな無菌フラスコ(例えば、T−25)、ペトリ皿(例えば、10mm)、またはプレート(例えば、24ウエルプレート)内で培養する。
2)インキュベーションは、5% CO2が補給された加湿37℃インキュベーション内の細胞培養培地(例えば、2%FBSおよび抗生物質を含むRMPI−1640)中で実施する。自然に、細胞は容器底部上で単層を形成し、分化し始める。細胞がコンフルエンスに近付くと、細胞はトリプシン処理され、リガンドを用いた刺激および/または標的薬を用いた阻害のためにマイクロタイタープレート内に再播種される。
細胞の刺激:
1)成長因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を細胞に加え、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)を加えることによって刺激し、37℃で5分間にわたりインキュベートする。
1)サンプルは、37℃で30分間にわたり治療有効濃度のHerceptin(登録商標)、ラパチニブ、Tarceva(登録商標)、および/またはラパマイシンアナログとインキュベートする。
2)細胞は、次に因子TGF−α(100nM)、Hrg(100nM)、および/またはIGF(100nM)によって刺激し、37℃で120分間にわたりインキュベートする。
1)新鮮溶解緩衝液は、上記の表3に記載した試薬を混合することによって新しく調製する。
2)最終洗浄後、細胞は氷上で100μLの冷却緩衝液中に再懸濁させる。
3)インキュベーションは、氷上で30分間にわたり実施する。
4)この混合物は、溶解液からビーズを分離するために、10分間にわたり最高速度でマイクロフュージ内で回転させる。
5)溶解液は、アッセイのために新しい試験管に移すか、または−80℃で保管する。
この実施例では、希少循環細胞中でのシグナル伝達分子の活性化状態を分析するのに適切な優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット単一検出マイクロアレイELISAについて例示する。
1)捕捉抗体は、2倍の連続希釈液を用いて16パッドのFASTスライド((Whatman社;ニュージャージー州フローラムパーク)上にプリントした。
2)一晩乾燥させた後、スライドはWhatman社製遮断緩衝液を用いて遮断した。
3)80μLの細胞溶解物は、10倍の連続希釈液を含む各パッド上に加えた。スライドは、室温で2時間にわたりインキュベートした。
4)TBS−Tweenを用いた6回の洗浄後、80μLのビオチン標識検出抗体(例えば、p−EGFRを認識するモノクローナル抗体または活性化状態とは無関係にEGFRを認識するモノクローナル抗体)を室温で2時間にわたりインキュベートした。
5)6回の洗浄後、ストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ(SA−HRP)を加え、1時間にわたりインキュベートしてSA−HRPをビオチン標識検出抗体に結合させた。
6)シグナル増幅のために、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを加え、15分間にわたり反応させた。スライドはTBS−Tweenを用いて6回、20% DMSO/TBS−Tweenを用いて2回、およびTBSを用いて1回洗浄した。
7)80μLのSA−Alexa 555を加え、30分間インキュベートした。このスライドを次に2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー上でスキャンした(Perkin−Elmer社、マサチューセッツ州ウォルサム)。
この実施例では、希少循環細胞中でのシグナル伝達分子の活性化状態を分析するのに適切な優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット近接二重検出マイクロアレイELISAについて例示する。
1)捕捉抗体は、1mg/mL〜0.004mg/mLの範囲内の連続希釈液を含む16パッドのFASTスライド(Whatman社)上でプリントした。
2)一晩乾燥させた後、スライドはWhatman社製遮断緩衝液を用いて遮断した。
3)80μLのA431細胞溶解物は、10倍の連続希釈液を含む各パッド上に加えた。スライドは、室温で2時間にわたりインキュベートした。
4)TBS−Tweenを用いた6回の洗浄後、TBS−Tween/2% BSA/1% FBS中に希釈した近接アッセイのための80μLの検出抗体をスライドに加えた。使用した検出抗体は:(1)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接結合した抗EGFRモノクローナル抗体;および(2)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に直接結合したリン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体であった。インキュベーションは、室温で2時間にわたった。
5)または、検出抗体は、リン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体のビオチン−コンジュゲートを利用した。これらの場合には、6回の洗浄後に、1時間にわたるストレプトアビジン−HRPを用いた追加の連続工程を含めた。
6)または、検出抗体は、抗EGFR抗体のオリゴヌクレオチド媒介性グルコースオキシダーゼ(GO)コンジュゲートを利用した。リン酸化EGFR抗体に直接結合した、またはHRPのビオチン−ストレプトアビジン(SA)結合コンジュゲートのいずれかを使用した。
7)シグナル増幅のために、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを加え、15分間にわたり反応させた。スライドはTBS−Tweenを用いて6回、20% DMSO/TBS−Tweenを用いて2回、およびTBSを用いて1回洗浄した。
8)80μLのAS−Alexa 555を加え、30分間にわたりインキュベートした。次にこのスライドを2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー(Perkin−Elmer社)上でスキャンした。
本発明の方法および組成物は、癌治療のための薬物選択のために適用できる。典型的なプロトコールは、その後に特定薬物治療レジメンの有効性を決定するために比較される、対照活性化プロファイルおよび試験活性化プロファイルの生成を必要としている(図4を参照されたい)。
対照活性化プロファイルを引き出すために、血液サンプルは、抗癌剤治療の前に特定タイプの癌(例えば、乳房腫瘍)を有する患者から入手する。癌性腫瘍由来の希少循環細胞は、例えば、本明細書により詳細に記載したような免疫磁気分離法を使用して、血液サンプルから単離する。単離した循環細胞は、1つ以上の成長因子を用いてインビトロで刺激することができる。刺激した細胞は、次に細胞抽出物を生成するために溶解させられる。細胞抽出物は、その活性化状態が患者の癌のタイプにおいて変化させられる可能性があるシグナル伝達分子に対して特異的な希釈系列の1パネルの捕捉抗体を含有するアドレス可能なアレイに適用する。単一検出または近接アッセイは、当該の各シグナル伝達分子の活性化状態を決定するために、適切な検出抗体(例えば、活性化状態非依存性抗体および/または活性化状態依存性抗体)を用いて実施する。表2に示した「経路選択」表は、患者の癌のタイプに基づいてどの活性化状態を検出すべきかを選択するために特に有用である。例えば、1人の患者は、表2の「経路1」に記載したEGFR経路の活性化状態を提示する癌のタイプを有する可能性がある。または、他の患者は、表2の「経路2」に記載したEGFR経路の活性化状態を提示するまた別の癌のタイプを有する可能性がある。そこで対照活性化プロファイルは、あらゆる抗癌剤の非存在下で患者の癌におけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供するように生成される。
試験活性化プロファイルを入手するために、第2血液サンプルは、抗癌剤の投与前または抗癌剤の投与後のいずれかに(例えば、癌治療の全経過を通していずれかの時点に)特定タイプの癌(例えば、乳房腫瘍)を有する患者から入手する。癌性腫瘍に由来する希少循環細胞は、血液サンプルから単離する。単離した細胞が抗癌剤を用いた治療を受けていない被験者から入手される場合は、単離した細胞は上述した対照活性化プロファイルから決定された1つ以上の活性化シグナル伝達分子を標的とする抗癌剤とインキュベートする。「薬物選択」表(表1)は、特異的活性化標的シグナル伝達分子を阻害する、承認されている、または臨床試験下の適切な抗癌剤を選択するために特に有用である。例えば、EGFRが活性化されていることが対照活性化プロファイルから決定された場合は、その後に細胞を表1の欄「A」または「B」に列挙した薬物の1つ以上とインキュベートすることができる。単離した細胞は、次に1つ以上の成長因子を用いてインビトロで刺激することができる。単離した細胞は、次に細胞抽出物を生成するために溶解させられる。細胞抽出物はアドレス可能なアレイに適用され、当該の各シグナル伝達分子の活性化状態を決定するために近接アッセイが実施される。そこで患者のための試験活性化プロファイルは、特定抗癌剤の存在下での患者の癌におけるシグナル伝達分子の活性化状態を提供するように生成される。
抗癌剤は、試験活性化プロファイルを対照活性化プロファイルと比較することによって、患者の癌を治療するのに適切であるか不適切であるかが決定される。例えば、薬物治療が、大多数もしくは全部のシグナル伝達分子が薬物の非存在下におけるより実質的に低く活性化される場合、例えば薬物を用いない場合の強度の活性化から薬物を用いた場合の弱度の、もしくは極弱度の活性化への変化を引き起こす場合は、その治療は患者の癌にとって適切であると決定される。そのような場合には、治療は薬物療法を受けていなかった患者において適切な抗癌剤を用いて開始される、または既に薬物を摂取している患者において適切な抗癌剤による治療が継続される。しかし、薬物治療が患者の癌の治療のために不適切と見なされる場合は、異なる薬物が選択されて新規な試験活性化プロファイルを生成するために使用され、その薬物が対照活性化プロファイルと比較される。そのような場合には、治療は薬物療法を受けていなかった患者において適切な抗癌剤を用いて開始される、またはその後の治療は現在不適切な薬物を摂取している患者では適切な抗癌剤へ変更される。
図5は、本発明の典型的なアドレス可能な受容体チロシンキナーゼアレイを例示している。上記で考察したように、受容体チロシンキナーゼは、細胞増殖に関係する多数のシグナル伝達経路の重要な成分である。例えば、受容体チロシンキナーゼのErbBファミリーは4つのファミリーメンバーを有し、細胞増殖、分化、および生存のような基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。この受容体チロシンキナーゼのファミリーは、多数の様々な癌において過剰発現すると報告されており、より不良な臨床転帰と関連付けられている。成長因子が結合すると、ErbB1/EGFR、ErbB3/HER−3、およびErbB4/HER−4はホモおよびヘテロ二量体化して、様々な異なるシグナル伝達経路を活性化する。ErbB2/HER−2は、成長因子には結合せず、全3つのファミリーメンバーにとって好ましいヘテロ二量体化パートナーである。ErbB2は、過剰発現するとホモ二量体化することもでき、シグナル伝達経路を活性化することができる。ErbBファミリーのホモまたはヘテロ二量体化は、トランスリン酸化を生じさせる。自己もしくはトランス−リン酸化は、受容体チロシンキナーゼの阻害性立体配座を軽減し、完全キナーゼ活性化を可能にし、同時に例えばSrc、Shc、SHP−1、SHEP−1、およびPI3Kなどの多数のSH2含有シグナル伝達分子のための結合部位を作り出す。Shc、Grb2、もしくはPI3Kのようなアダプタータンパク質もしくはシグナル伝達タンパク質は、リン酸化受容体に動員される。アダプタータンパク質のリン酸化は、MAPKおよびAkt経路の活性化を生じさせる。MAPK経路の活性化は、ErkおよびRskのリン酸化状態を決定することによって評価することができ、他方PI3K経路の活性化は、Aktおよびp70S6Kのリン酸化状態を決定することによって評価することができる。
図6および7は、血管新生に関係するシグナル伝達成分の活性化状態を決定するためのアドレス可能なアレイの構造を示している。本明細書に記載したように、腫瘍血管新生は、多数の固形腫瘍の増殖のために極めて重要である。整列させた特に重要なシグナル伝達分子には、主として内皮細胞上で発現する受容体チロシンキナーゼのVEGFR、FGFR、およびTIEファミリーのメンバーが含まれる。PDGFRは、典型的には周皮細胞上で発現する。これらの受容体の発現および活性化状態は、個々の腫瘍標本における血管新生の優勢なメカニズムを決定する際に極めて重要である。VEGFおよびPIGFのような成長因子は、VEGFR−1およびVEGFR−2に結合し、ホモおよびヘテロ二量体化を開始する。二量体化の後にはこれらの受容体のリン酸化が続き、これには次にMAPKおよびPI3K/Aktシグナル伝達経路の活性化が続く。FGFR、TIE、およびPDGFR受容体もまた同様の方法で活性化される。自己もしくはトランスリン酸化は、受容体チロシンキナーゼの阻害性立体配座を軽減し、完全キナーゼ活性化を可能にし、同時に例えばSrc、Shc SHP−1、V−カドヘリン、SHEP−1、およびPI3Kなどの多数のSH2含有シグナル伝達分子のための結合部位を作り出す。Shc、Grb2、もしくはPI3Kのようなアダプタータンパク質もしくはシグナル伝達タンパク質は、リン酸化受容体に動員される。アダプタータンパク質のリン酸化は、MAPKおよびAkt経路の活性化を生じさせる。MAPK経路の活性化は、ErkおよびRskのリン酸化状態を決定することによって評価することができ、他方PI3K経路の活性化は、Aktおよびp70S6Kのリン酸化状態を決定することによって評価することができる。
癌治療の主要な挑戦課題は、所定の患者についての有効性を最大化して毒性を最小限に抑える治療レジメンの選択である。関連する課題は、正確な診断的、予後診断的、および予測的情報を提供する試みにある。
1.ER+/PR+/ErbB2−
2.ER+/ErbB2+
3.ER−/ErbB2+
4.ER−/PR−/ErbB2−
米合衆国では、毎年約200,000例の乳癌症例が存在する。185kDa膜受容体チロシンキナーゼであるHER−2/ErbB2は乳癌の18%〜20%において見いだされており、増加した比率の再発および死亡と関連付けられてきた。ErbB2は現在、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))などの療法から利点が得られる確立された予測マーカーである。
n(登録商標)への耐性が発生する。Herceptin(登録商標)への新規耐性およ
び獲得耐性のどちらも観察されている。
・変化した標的発現(ErbB2状態における変化)
・代替経路(IGF−1R)によるシグナル伝達
・他の受容体(ErbB1またはErbB3)を用いた優先的二量体化
・準最適薬物送達(ErbB2乳癌を備える女性間でのCNS転移性疾患は特に一般的であると思われる。ErbB2+転移性乳癌を備える患者におけるCNS転移性疾患の発生率は、ErbB2+転移性疾患を備える患者の3分の1と高い可能性がある)。
・PTENの変化
・PI3Kの突然変異
・P95ErbB2の発現またはErbB2の切断
・cMETの過剰発現または増幅である。
・5−FU/capcitibine:チミジレートシンテターゼ(TS)の発現
・ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(DPD)の発現
・TS発現におけるHDACの減少
・タキサン類:ErbB2
・アントラサイクリン類:TOPO2の過剰発現
・ErbB2陽性:(5−FUまたはタキサン類またはアントラサイクリン類)
乳癌を備える女性の約15〜20%は、三重陰性タイプの癌を有する。「三重受容体陰性乳癌」を備える患者は、進行性の臨床経過および治療選択肢の不足とともに、ホルモン受容体ER、PR、およびHER−2/ErbB2の完全な非存在を有する。唯一の治療選択肢は化学療法であり、これに関連して細胞増殖抑制剤の選択は限定される。三重陰性乳癌のための標準療法は、典型的には、化学療法、手術、および/または放射線療法の併用である。標準療法を用いて治療した場合、三重陰性乳癌を備える女性は、非三重陰性乳癌を備える女性に比較して不良な長期転帰を有する。三重陰性乳癌細胞は、通常は細胞表面上で発現したErbB1を有する。ErbB1陽性乳癌を備える女性は、腫瘍がErbB1を発現しない女性に比較して不良な長期転帰を有する。したがって当分野には、三重陰性乳癌患者のための治療選択肢をプロファイリングする、選択する、および予測する方法に対する必要がある。
療法を受けた5例の乳癌患者を、本明細書に記載した近接アッセイを使用して、循環腫瘍細胞(CTC)数、染色によるCTS上のEGFR発現、ならびにEGFRおよびHER−2(ErbB2)リン酸化について試験した。患者の人口統計学データ、癌病歴、および現在の投薬については、各々表36、37、および38に示した。エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびHER−2についての原発性腫瘍に関する試験結果は、表39に提供した。表40および41は、各サンプル中で検出されたCTCの数ならびにEGFRおよびHER−2についての相対リン酸化レベルを示している。相対リン酸化レベルは、4つの緩衝液コントロールの平均値を使用して計算した。リン酸化情報は、図10および11にもプロットした。図12は、EGFR、サイトケラチン(CK)についてのCTC染色、およびDAPIを用いたサイトケラチンの画像を示している。細胞系コントロールは、HER−2およびEGFR発現各々について陽性であるSKBr3およびA431であった。6人の正常個人由来の全血は、コントロールと同一プロトコールを用いて処理した。正常サンプルはいずれも、バックグラウンドを超えるEGFRまたはHER−2リン酸化を示さなかった。
ErbB2としても公知であるHER−2は、上皮成長因子受容体もしくはHERファミリーの4つのメンバー(HER−1、HER−2、HER−3、およびHER−4)のうちの1つである。全HER受容体は類似の構造:細胞外リガンド結合ドメイン;短い疎水性膜貫通領域;および細胞質チロシンキナーゼドメインを共有する。リガンド結合もしくは受容体過剰発現によって誘導されるHER受容体のヘテロもしくはホモ二量体化は、受容体キナーゼの活性化および数個のチロシン残基のその後のリン酸化を導く。順に、受容体のカルボキシル末端内に位置するこれらのリン酸化チロシン残基は、メディエータ分子を動員し、シグナル伝達経路を活性化して、細胞の増殖、分化、および生存の修飾をもたらす。ErbB2は、ヒト乳癌の約15%〜25%において過剰発現/増幅し、その過剰発現/増幅には進行性表現型が結び付いている。
図13は、全長ErbB2は、ポリスチレンビーズもしくはポリマーデキストランに付着させたErbB2の細胞外ドメインに結合する抗体を用いて臨床サンプルから取り除けることを示している。このアッセイは、迅速な液相結合動態、ビーズに結合した受容体抗体による全長タンパク質の選択的抽出、およびビーズ結合タンパク質の平面アレイへ結合する不能力を利用する。または、磁気帯電したビーズを使用すると全長ErbB2後部を保持することができ、切断p95ErbB2だけがマイクロアレイに適用されるであろう。
この実施例は、希少循環細胞中でのp95ErbB2などの切断受容体を検出するのに適切な優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット近接二重検出マイクロアレイELISAについて例示する:
1)捕捉抗体は、1mg/mL〜0.004mg/mLの範囲内の連続希釈液を含む16パッドのFASTスライド(Whatman社)上でプリントする。
2)一晩乾燥押させた後、スライドはWhatman社製遮断緩衝液を用いて遮断する。
3)抗ErbB2(細胞外)抗体コーティングビーズを含む、または含まない80μLのBT474細胞溶解物は、10倍の連続希釈液を含む各パッド上に加える。スライドは、室温で2時間にわたりインキュベートする。
4)TBS−Tweenを用いた6回の洗浄後、TBS−Tween/2% BSA/1% FBS中に希釈した近接アッセイのための80μLの検出抗体をスライドに加える。使用した検出抗体は:(1)グルコースオキシダーゼ(GO)に直接結合したErbB2の細胞内ドメインに特異的である抗ErbB2抗体;および(2)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)に直接結合しているリン酸化EGFRを認識するモノクローナル抗体である。インキュベーションは、室温で2時間にわたる。
5)シグナル増幅のために、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを加え、50mMのグルコースと一緒に15分間にわたり反応させる。スライドはTBS−Tweenを用いて6回、20% DMSO/TBS−Tweenを用いて2回、およびTBSを用いて1回洗浄する。80μLのAS−Alexa 555を加え、30分間にわたりインキュベートする。次にこのスライドを2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー(Perkin−Elmer社)上でスキャンする。
6)非限定的な例として、スライド1は全ErbB2活性化について報告できるが、スライド2は切断ErbB2活性化について報告できる。サンプル中の活性化または全切断ErbB2の量に基づくと、適切な療法を選択できる。
この実施例は、希少循環細胞中でのp95ErbB2などの切断受容体を検出するのに適切な優れたダイナミックレンジを有する多重高スループット近接単一検出マイクロアレイELISAについて例示する:
1)捕捉抗体は、1mg/mL〜0.004mg/mLの範囲内の連続希釈液を含む16パッドのFASTスライド(Whatman社)上でプリントする。
2)一晩乾燥押させた後、スライドはWhatman社製遮断緩衝液を用いて遮断する。
3)抗ErbB2(細胞外)抗体コーティングビーズを含む、または含まない80μLのBT474細胞溶解物は、10倍の連続希釈液を含む各パッド上に加える。スライドは、室温で2時間にわたりインキュベートする。
4)TBS−Tweenを用いた6回の洗浄後、TBS−Tween/2% BSA/1% FBS中に希釈したアッセイのための80μLの検出抗体をスライドに加える。使用した検出抗体は、HRPに直接結合したErbB2の細胞内ドメインに対して特異的な抗ErbB2抗体である。インキュベーションは、室温で2時間にわたる。
5)シグナル増幅のために、5μg/mLの80μLのビオチン−チラミドを加え、1mMの過酸化水素と一緒に15分間にわたり反応させる。スライドはTBS−Tweenを用いて6回、20% DMSO/TBS−Tweenを用いて2回、およびTBSを用いて1回洗浄する。
6)80μLのAS−Alexa 555を加え、30分間にわたりインキュベートする。次にこのスライドを2回洗浄し、5分間乾燥させ、マイクロアレイスキャナー(Perkin−Elmer社)上でスキャンする。
7)非限定的な例として、スライド1は全ErbB2活性化について報告できるが、スライド2は切断ErbB2活性化について報告できる。サンプル中の活性化または全切断ErbB2の量に基づくと、適切な療法を選択できる。
1)単細胞から切断受容体を検出する能力を提供する高感受性。
2)より高い特異性。
3)単一タンパク質の代わりに多重マイクロアレイを使用して全経路上で報告する能力。
4)拡張可能性。
例えばリンパ節陰性疾患を備える様々な女性集団における乳癌の予後および/または再発の可能性を予測する遺伝子発現マーカーのパネルが開発されている。これらの遺伝子パネルは、再発を経験する可能性が低い、したがって、アジュバント化学療法からの利益が得られる可能性が低い女性を同定するために有用な場合がある。これらの発現パネルを使用すると、疾患のない、そして全生存期間転帰へ不都合な影響を及ぼさずに、アジュバント化学療法を安全に回避できる女性を同定することができる。適切なシステムには、Genomic Health社からの21遺伝子パネルであるOncotype DX(商品名);Agendia社(オランダ国アムステルダム)からの70遺伝子パネルであるMammaPrint(登録商標);およびVeridex社(ニュージャージー州ウォーレン)からの76遺伝子パネルが含まれるがそれらに限定されない。これらのパネルは、上述の実施例に記載した方法を使用して選択された適切な標的療法とともに化学療法を含める必要を決定するために経路活性化の分析と結び付けて使用することができる。
1)生検パンチを用いて、最小厚さ3mmおよび最大厚さ5mmを備える腫瘍サンプルを収集する。生検標本は、RNARetain(商品名)保存料を含有するサンプル試験管内に直接入れる。この試験管は、MammaPrint(登録商標)アッセイを用いて試験するためにAgendia社へ直ちに送付する。
2)Agendia社からの試験報告書は、患者を「良好」シグニチャー/低リスク群または「不良」シグニチャー/高リスク群に指定する。患者が低リスク群に含まれる場合は、患者は疾患のない、そして全生存期間へ不都合な影響を及ぼさずに、アジュバント化学療法を安全に回避することができる。
3)MammaPrint(登録商標)アッセイは、ER陽性またはER陰性のいずれかである患者に適用できる。ERおよびErbB2状態が決定されると、患者は実施例8に記載した乳癌のサブクラスの1つに指定される。4つの主要サブクラスは、次の通りである:
1.ER+/PR+/ErbB2−
2.ER+/ErbB2+
3.ER−/ErbB2+
4.ER−/PR−/ErbB2
4)腫瘍細胞(例えば、CTC)は、実施例1に記載したように血液から単離し、分析のために調製する。または、生検標本の一部分を使用して実施例2に記載した腫瘍細胞抽出物を調製することができる。細胞標本は、実施例3または実施例4に記載したようにアッセイされる。活性化プロファイルは、実施例8(表4から表22)、実施例9(表23から表31)、および実施例10(表32から表35)に記載された方法と類似方法で評価する。適切な標的療法または標的療法の組み合わせを選択する。患者が低リスク群に含まれる場合は、化学療法は加えられない。患者が高リスク群に含まれる場合は、臨床情報に基づいて医師が選択した化学療法が標的療法に加えられる。
全転移性腫瘍の約3%〜5%は、原発不明癌(CUP)のカテゴリーに分類される。起源組織の正確な診断は、現行療法が多分に解剖学的部位に基づいているので、治療法の決定において重要である。遺伝子発現パネルは、最初に乳癌を備えると診断された女性に与えられる療法と一致する療法から利益が得られるであろう転移性癌を備える女性を同定する際に有用な場合がある。適切なシステムには、microRNAの発現パターンの分析を通して癌および起源組織を分類するRosetta Genomics CUPアッセイ(例えば、国際公開第08/117278号パンフレットを参照されたい);39の腫瘍タイプについて原発起源部位を同定するために92種の遺伝子を測定するRT−PCRに基づく発現アッセイであるAviara DX(カリフォルニア州カールズバッド)CancerTYPE ID(商品名)アッセイ;およびマイクロアレイ上で1,600種を超える遺伝子の発現を測定して15の公知の組織タイプと腫瘍の遺伝子発現「シグニチャー」を比較する、Pathwork(商品名)起源組織検査(カリフォルニア州サニーベール)が含まれるがそれらに限定されない。患者の原発性癌の組織が乳房であると同定されると、経路活性化プロファイルを使用して治療スケジュールに含めるために適切な標的療法を選択することができる。
1)転移性腫瘍から外科的または細針生検のいずれかによって切除された厚さ7μmの組織切片を載せた2枚以上のガラススライドを患者から入手する。これらの細胞は、ホルマリン中で固定して、パラフィン(FFPE)内に包埋する。追加の1枚の同一腫瘍のH&E染色スライドをH&Eで染色する。
2)病理学者は、H&Eスライドを精査し、CancerTYPE ID(商品名)アッセイのために収集すべき領域を指示する。これらのスライドは、分析のためにAviara DX社へ送付する。
3)Aviara DX社からの試験報告書は、k−最近傍分析から決定された上位5つの最も可能性が高い部位を指示し、予測が引き出される。患者のための予測が原発不明腫瘍として乳腺を示す場合、患者の腫瘍細胞は経路活性化について評価することができる。
4)腫瘍細胞(例えば、CTC)は、実施例1に記載したように血液から単離し、分析のために調製する。または、細針生検標本を使用して実施例2に記載した腫瘍細胞抽出物を調製することができる。細胞標本は、実施例3または実施例4に記載したようにアッセイされる。活性化プロファイルは、実施例8(表4から表22)、実施例9(表23から表31)、および実施例10(表32から表35)に記載された方法と類似方法で評価する。適切な標的療法または標的療法の組み合わせを選択する。
背景:
2008年には、合衆国内の女性において推定182,460例の浸潤性乳癌の新規症例が同定されるであろう。乳癌を備える女性の約20%は、診断時点にHER−2の過剰発現を有する。HER−2過剰発現(HER−2陽性)乳癌は、癌のより進行性形態と結び付いているので、このためより不良な生存率およびより高い再発率を生じさせる。HER−2陽性患者は、モノクローナル抗体薬であるトラスツズマブ(Herceptin(登録商標))を用いて治療されることが多い。しかしHerceptin(登録商標)は、高価で潜在的に心臓毒性治療法である;このため臨床転帰を最適化するためには、候補患者の正確な同定が絶対に必要である。Herceptin(登録商標)はHER−2を遮断することによって機能するので、このため腫瘍細胞増殖を減少させる。ラパチニブ(Tykerb(登録商標))は、Herceptin(登録商標)両方が失敗した患者のために使用されることが多い低分子キナーゼ阻害剤である。
HER−2の状態は、典型的には下記の一方または両方によって評価される:(1)免疫組織化学的アッセイ(IHC)を用いた受容体タンパク質検査;または(2)蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)試験法を用いた遺伝子増幅。しかし現行の検査法には精度が欠如していること、検査室間で高度に変動する可能性があること、さらに検査室へ受領される前の標本取り扱いにおける相違によって変動する可能性があることが広く認識されている。実際に、入手可能な証拠は、現行のHER−2検査の約20%は不正確な可能性があることを示唆している(ASCO/CAP Guidelines for HER−2 Testing in Breast Cancer,J.Clin.Oncology(2007))。
この実施例に記載する新規な乳癌検査セットは、本明細書に記載した多重高スループット近接(すなわち、3抗体)アッセイを利用する。そのような診断検査は、乳癌を備える患者から採取した循環腫瘍細胞(CTC)または細針吸引液(FNA)中のHER−2の発現および活性化を決定することに特に有用であり、乳癌患者のための療法選択に役立つであろう。
1.血液サンプルを収集する:
a.血液を2本の7.5mL試験管に採血する。
b.他の血液成分から循環腫瘍細胞(CTC)を分離するために上皮細胞に特異的な結合タンパク質を備えるVeridex上皮細胞接着分子(EpCAM)磁気ビーズを使用する。
c.サンプルを洗浄する。
2.1つのサンプルを活性化し(生きている細胞だけが活性化される)、それらの細胞を溶解させる。
3.他のサンプルの細胞を溶解させる。
4.(これは各検査間で変動性の工程である)全活性化タンパク質およびサイトケラチンを定量するために活性化サンプル中の2つのタンパク質(例えば、シグナル伝達タンパク質)およびサイトケラチンを検出するために近接マイクロアレイアッセイを使用する:
a.2つのタンパク質およびサイトケラチン(CK)に特異的である3つのモノクローナル抗体をマイクロアレイに固相化する。
b.分析物をそれらに対して特異的なモノクローナル抗体に結合させるために、サンプルをマイクロアレイチップの上方に注入する。
c.6つの追加のモノクローナル抗体の混合物をマイクロアレイチップ上に注入する(分析物1つ当たり2つのモノクローナル抗体)。蛍光を分析物の部位で発生させるために、全3種の特異的モノクローナル抗体(1つの固相化された抗体および2つの注入された抗体)がその分析物に結合しなければならない。
5.全タンパク質を定量するために不活性化サンプル中の2つのタンパク質のタンパク質マイクロアレイ分析。
6.各活性化タンパク質の結果は、不活性化サンプルを用いて較正される。これは、3つの分析物各々について「+」または「−」の結果を備える定量的タンパク質結果を生じさせるであろう。
この実施例では、遊離スルフヒドリル基をデキストラン分子に組み込むためのプロトコールを記載する。実施例17に例示したように、スルフヒドリル修飾デキストラン分子は、本明細書に記載した単一検出および近接アッセイにおいて使用するための抗体およびグルコースオキシダーゼ(GO)を備えるコンジュゲートを調製するために使用できる。一部の実施形態では、スルフヒドリル活性化500kDaデキストラン分子は、抗体:GO:デキストランの比率が2:12:1であるように抗体およびGOへ結合させることができる。スルフヒドリル活性化500kDaデキストラン分子の抗体およびGOへの結合は、有利にはアッセイの感受性を約10倍増強する。他の実施形態では、スルフヒドリル活性化70kDaデキストラン分子は、抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)へ結合させることができる。
1.デキストラン=グルコースポリマー
2.塩酸=HCl
3.N−(3−ジメチルアミノプロピル)N’−エチルカルボジイミド塩酸塩=EDC
4.リン酸緩衝食塩液=PBS
5.水酸化ナトリウム=NaOH
6.2−モルホリノエタンスルホン酸=MES
7.エチレンジアミン四酢酸=EDTA
1.水浴(Fisher社、Isotemp 210)
2.ELISAプレートリーダー(Molecular Devices社、SpectraMAX1900)
3.ELISAプレート洗浄装置(Nunc社、Nunc−Immuno Wash 8)
4.ボルテックス・ミキサー(Fisher社、Vortex Mixer)
5.凍結乾燥機(Virtis社、Freezemobile 12)
6.遠心分離器(Beckman社、GS−6R)
7.マグネチック・スターラー(Corning社、PC−410D)
8.NANOpure水を生成するための装置(Barnstead社、NANOpure Dlamond)
9.透析カセット(Pierce社、66380)
1.500kDaデキストラン(Fisher社、BP1580−100)
2.ブロモ酢酸(Sigma社、259357)
3.水酸化ナトリウム(Fisher社、S318−500)
4.イソプロパノール(Fisherr社、A451−4)
5.12N塩酸(Fisher社、A144−500)
6.システアミン(Sigma社、M9768)
7.N−(3−ジメチルアミノプロピル)N’−エチルカルボジイミド塩酸塩(Pie
rce社、22980)
8.リン酸緩衝食塩液(Cellgro社、21−040−CV)
9.0.5Mエチレンジアミン四酢酸溶液(GIBCO、15575−038)
10.2−モルホリノエタンスルホン酸(Fluka社、69892)
11.10×リン酸緩衝食塩液(Fisher社、BP399−500)
1.2.9M NaOH:5.8gの水酸化ナトリウムを50mLのNanopure水へ溶解させる。
2.50mM MES緩衝液:5.33gの2−モルホリノエタンスルホン酸を500mLのNANOpure水中に溶解させ、12N HClを使用してpHを4.5へ調整する。
3.透析緩衝液:10mLの0.5M EDTA溶液および100mLの10×PBSを890mLのNanopure水へ加えて、PBS中で最終濃度5mMのEDTAを作成する。
カルボキシル基のデキストランへの組み込み:
1.50mLのポリプロピレン製スクリューキャップ付き試験管内の8.5mLの2.9M NaOH中に溶解させた1gの500kDaデキストラン(2μmol)に850mgのブロモ酢酸を加える。ボルテックス・ミキサーにかけて完全に混合した後、試験管を50℃の水浴中で一晩インキュベートする。
2.インキュベーション後、カルボキシル化デキストランを沈降させるためにイソプロパノールを70(容量/容量)%の最終濃度へ反応混合液を加える。ボルテックス・ミキサーを用いて混合した後、この溶液を15分間にわたり室温のBeckman社製遠心分離装置において3,000rpmで回転させ、上清を廃棄する。
3.沈降物を10mLのNanopure水中に再溶解させ、イソプロパノールを用いても沈降物が得られなくなるまで、イソプロパノールを用いた沈降を2〜3回以上繰り返す。次に沈降物を再生成するためにボルテックス・ミキサーにかけながら12N HClを用いて透明の70%イソプロパノール溶液のpHを4へ調整し、この混合物を再びBeckman社製遠心分離装置において3,000rpmで回転させてカルボキシル化デキストランを沈降させ、上清を廃棄する。
4.残留ブロモ酢酸を取り除くために、沈降物を10mLのNanopure水中に再溶解させ、HClを用いてこの溶液のpHを4へ調整する。次にカルボキシル化デキストランを沈降させるために、イソプロパノールを70容量%へ加える。ボルテックス・ミキサー内で混合した後、この溶液を15分間にわたりBeckman社製遠心分離装置において3,000rpmで回転させ、上清を廃棄する。この洗浄プロセスは、全3回繰り返した。
5.最終洗浄後、沈降物を再び10mLのNanopure水中に溶解させ、HClを取り除くために凍結乾燥機内で乾燥するまで凍結乾燥させる。
6.凍結乾燥したカルボキシル化デキストランを−70℃で保存する。
カルボキシル化デキストラン上のカルボキシル基のスルフヒドリル基への変換:
1.2mLの褐色ガラス管中の、0.5mLの50mM MES緩衝液(pH4.5)中に10mgの凍結乾燥したカルボキシル化デキストランを溶解させる。
2.このカルボキシル化デキストラン溶液に1.42mgのEDCを加え、この混合液を40℃で30分間攪拌する。
3.次に10mgのシステアミンをこの混合液に加え、生じた溶液をさらに1時間、4℃で攪拌する。
4.攪拌した後、10,000の分子量カットオフを備える0.5〜3.0mLの透析カセットへ移し、500mLのPBS(pH7.4)に対して4℃で一晩透析する。
5.透析緩衝液を次に5mMのEDTA/PBSへ変更し、さらに2時間にわたり透析する。透析プロセスをもう1回繰り返す。
6.各500kDaデキストラン分子内に組み込まれたスルフヒドリル基の総数は、Ellmanのアッセイによって決定する。
7.50μLのアリコートのスルフヒドリルを組み込んだデキストラン溶液を1mLのエッペンドルフ試験管内で調製し、アリコートを凍結乾燥する。凍結乾燥アリコートは、保存のために−70℃で保持する。
この実施例では、細胞外ドメイン指向性HER−2抗体およびグルコースオキシダーゼ(GO)をスルフヒドリル活性化500kDaデキストラン分子へ結合するための方法を記載する。HER−2抗体−GO−デキストランコンジュゲートは、本明細書に記載した単一検出および近接アッセイにおいて使用できる。
1.スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシル−(6−アミドカプロエート)=LC−SMC
2.ジメチルスルホキシド=DMSO
3.水酸化ナトリウム=NaOH
4.濃塩酸=HCl
5.リン酸緩衝食塩液=PBS
6.エチレンジアミン四酢酸=EDTA
7.2−(エチル水銀メルカプト)安息香酸ナトリウム塩=チメロサール
8.HPLC=高速液体クロマトグラフィ
1.HPLCシステム(Agilent Technologies社;Series 1100)
2.サイズ排除クロマトグラフィカラム(Phenomenex社;BioSep−SEC−S3000)
3.分光光度計(Hitachi社;U−200)
4.遠心分離器(Beckman社、GS−6R)
5.マグネチック・スターラー(Corning社、PC−410D)
6.ELISAプレートリーダー(Molecular Devices社、SpectraMAX190)
7.ボルテックス・ミキサー(Fisher Scientific社;02−215−365.)
8.脱塩カラム(Pierce社、43230)
9.Centricon YM−10装置(Millipore社、4205)
10.1mLピペット(Rainin社、L−1000)
11.200μLピペット(Rainin社、L−200)
12.20μLピペット(Rainin社、L−20)
13.2μLピペット(Rainin社、L−2)
14.マルチチャンネルピペット(Rainin社、L8−200)
1.PBS中で1mg/mLのマウス抗ヒトHER−2モノクローナル抗体(Lab Vision社;MS−301−PABX)
2.透析されたグルコースオキシダーゼ(Prometheus社)
3.スルフヒドリル活性化デキストラン(Prometheus社)
4.LC−SMCC=スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシル−(6−アミドカプロエート)(Fisher社;22362)
5.DMSO=ジメチルスルホキシド(Sigma社;D2650)
6.ウシ血清アルブミン(Sigma社;A3294)
7.水酸化ナトリウム(Fisher社、S318)
8.濃塩酸(Fisher社、A144−500)
9.PBS=リン酸緩衝食塩液(Cellgro社、21−040−CV)
10.0.5Mエチレンジアミン四酢酸溶液(Invitrogen社、1758)
11.チメロサール(Sigma社、T8784)
1.脱気5mM EDTA/PBS緩衝液(pH7.2):2mLの0.5M EDTA溶液を200mLのPBSへ加え、次にアルゴンガスを5分間にわたり生じた溶液中へ気泡させて溶液中の他の全部の気体を取り除く。
2.10% BSA/PBS溶液:100mgのBSAを10mLのPBS中に溶解させ、この溶液を0.2μmフィルターに通して濾過する。この溶液を−20℃の冷凍庫内に保管する。
3.10%チメロサール/PBS溶液:100mgのチメロサールを10mLのPBS中に溶解させ、この溶液を0.2μmフィルターに通して濾過する。この溶液を−20℃の冷凍庫内に保管する。
4.0.1MのPB(リン酸緩衝液)(pH6.8)
活性化反応において即時使用するためのLC−SMCC溶液の調製:
1.−20℃の冷凍庫からLC−SMCCのボトルを取り出し、それを室温に加温させる。
2.1.5mLエッペンドルフ試験管内に1〜2mgのLC−SMCCおよび適正量のDMSOを計量して4.5mg/mL(10mM LC−SMCC)溶液を作成する。残ったLC−SMCCを冷凍庫内に戻して保管する。
HER−2抗体のLC−SMCC活性化:
1.2.3μLの10mM LC−SMCC溶液を、500μgの抗体を含有する0.5mLのHER−2抗体溶液に加え、反応を開始させるために直ちにボルテックスにかける。ボルテックス・ミキサーにかけた後、この混合液を室温で保持して30分間にわたり反応を継続させる。
2.次に、50mLの脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液で洗浄することによって、脱塩カラムを前平衡させる。
3.LC−SMCCを用いたHER−2抗体の活性化後、活性化混合液を脱塩カラム上に装填し、カラムを室温で脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液で溶出させる。溶出した溶液を0.5mL分画で収集し、分光光度計を用いて280nmの紫外線吸光度により監視する。
4.紫外線吸光度に基づいて活性化抗体を含有する分画をプールし、次の反応のために氷上に保存する。
グルコースオキシダーゼのLC−SMCC活性化:
1.4mgの酵素を含有する0.16mLの透析したグルコースオキシダーゼを取り出し、脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液を用いてその容量を0.5mLへ調整する。
2.12.4μLの10mM LC−SMCC溶液を0.5mLのグルコースオキシダーゼ溶液に加え、反応を開始させるために直ちにボルテックスにかける。ボルテックス・ミキサーにかけた後、この混合液を室温で保持して30分間にわたり反応を継続させる。
3.次に、50mLの脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液で洗浄することによって、脱塩カラムを前平衡させる。
4.LC−SMCCを用いたグルコースオキシダーゼの活性化後、活性化混合液を脱塩カラム上に装填し、カラムを室温で脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液で溶出させる。溶出した溶液を0.5mL分画で収集し、分光光度計を用いて280nmの紫外線吸光度によって監視する。
5.紫外線吸光度に基づいて活性化グルコースオキシダーゼを含有する分画をプールし、次の反応のために氷上に保存する。
活性化HER−2抗体および活性化グルコースオキシダーゼのスルフヒドリル活性化デキストランへの結合:
1.凍結乾燥したスルフヒドリル活性化デキストランの1mgアリコートに50μLのNanopure水を加え、20mg/mLのスルフヒドリル活性化デキストランの溶液を作成する。
2.プールした活性化抗体溶液に3mgのグルコースオキシダーゼに対応するある容量の結合活性化グルコースオキシダーゼ溶液を加え、これに34.3μLのスルフヒドリル修飾デキストラン溶液を加えると2:12:1のような抗体:グルコースオキシダーゼ:デキストランの適切なモル比が得られる。ボルテックス・ミキサーにかけた後、この混合液を4℃で一晩保管する。
3.修飾デキストラン上に残っている過剰なスルフヒドリル基は、脱気した0.5mM EDTA/PBS緩衝液中の56.4μLの1mg/mLのN−エチルマレイミドを加えることによって遮断し、遮断反応を4℃で3時間継続した。
HER−2抗体−グルコースオキシダーゼ−デキストランコンジュゲートの精製:
1.遮断反応後、HER−2抗体−グルコースオキシダーゼ−デキストランコンジュゲート溶液は、10,000分子量カットオフYM−10膜を装備したCentricon装置内で約300μLへ濃縮する。
2.この濃縮液は1.5mLのエッペンドルフ試験管内へ移し、この試験管を16,000gで3分間回転させて小量の沈降物を取り除く。
3.上清をHPLCサンプルバイアルへ移し、溶液の量は、HPLCによる精製のために脱気した5mM EDTA/PBS緩衝液を用いて320μLへ調整した。
4.100μLのコンジュゲート溶液をAgilent HPLCシステム内のBioSep−SE−S300サイズ排除カラム上に注入し、40分間にわたり0.5mL/分の流量で0.1M PB(pH6.8)を備える溶出によって結合されたタンパク質を分離し、溶出した溶液は280nmの紫外線吸光度によって監視する。
5.溶出分画からの最初の紫外線吸光ピークをプールし、氷上に保存する。
6.残っている200μLのコンジュゲート溶液をさらに同様に精製し、3回のHPLCランからの第1紫外線吸光ピークの全部をまとめてプールする。プールしたコンジュゲート溶液は10%BSA/PBS溶液を用いて0.1% BSAへ、そして−70℃で長期保存するためには10%チメロサール/PBSを用いて0.02%チメロサールへ調整する。
7.HER−2抗体−グルコースオキシダーゼ−デキストランコンジュゲート中に存在するグルコースオキシダーゼ酵素活性は、グルコースオキシダーゼ機能的アッセイによって決定する。
8.HER−2抗体−グルコースオキシダーゼ−デキストランコンジュゲート中に存在する抗体活性は、競合的ELISAアッセイによって決定する。
概要:
腫瘍組織の連続サンプリング上のキナーゼおよび他のシグナル伝達経路分子についての発現/活性化プロファイリングは、時間および療法の関数としての腫瘍細胞内で発生する変化に関する重要な情報を提供する。腫瘍進行についてのこの時間的プロファイリングは、臨床医が各患者において迅速に発達する癌シグニチャーを監視することを可能にする。この実施例は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)のErbBファミリーの発現レベルおよびリン酸化度を検出するための新規で強固なアッセイを例示しており、単細胞レベル感受性を備えるそのような療法誘導診断システムを使用することの利点を証明する。本アッセイは一般に、例えば細針吸引液(FNA)および血液などのサンプルに依存しており、そのようなサンプルから得られた限定された量の癌細胞を調べる(interrogate)ための高い感受性および特異性を達成する。
癌の発病および進行は、シグナル伝達経路の受容体およびその他の成分の異常調節された発現および活性化と結び付けることができる。HER−1およびHER−2の異常な活性化は、様々なタイプの癌の進行と結び付けられてきた。HER−1およびHER−2リン酸化パターンをプロファイリングするための方法は、全疾患病因への貴重な洞察を提供することができるので、このため重要な疾患誘発分子を同定することによってより優れた療法選択を導く。本明細書に記載したアッセイは、(2)三重抗体−酵素チャネリングシグナル増幅プロセスと結合した、(1)多重タンパク質マイクロアレイプラットフォームに基づいている。このマイクロアレイプラットフォームは、多重マーカーに適用するために必要とされる拡張性ならびに商業的開発のために必要とされるスケーラビリティを提供する。本明細書に記載したアッセイの固有かつ新規な設計は、特異性を保持しながら超高感受性を付与する三重抗体−酵素アプローチによって提供される。このアッセイがリン酸化される、このために活性化される標的を検出および定量するために使用される実施形態では、本アッセイは下記の通りに実施できる:
1.選択された標的は、マイクロアレイ表面上で連続希釈でプリントされた標的特異的抗体によって捕捉される。図19は、結合した各標的タンパク質毎のその後のチャネリング事象のためには酵素と連結した2つの追加の検出抗体の共局在化に依存する、本発明のアッセイの1つの実施形態を例示している。
2.図19に示した実施形態では、捕捉抗体による初期標的結合および捕捉された標的分子上で代替エピトープを認識するグルコースオキシダーゼ(GO)結合抗体の二次結合によって形成される免疫複合体は、グルコースなどのGO基質の存在下においてH2O2を生成する。GOは、105/分の代謝回転数(TON)を備える公知の最速酵素の1つである。
3.図19に示した実施形態では、H2O2の標的特異的局所流入は、次に捕捉された標的上のリン酸化部位へ結合する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、104/分のTONを備える)へ結合したリン−ペプチド特異的抗体によって利用され、それにより標的特異的シグナルが増幅させられる。リン酸化標的を検出するための特異性は、3種のタイプの抗体の同時結合のための要件を前提にすると、協調的免疫検出および増幅プロセスを通して大きく増加させられる。
組織培養:SKBR3、MDA−MB−468、T47D、およびBT474細胞系は、ATCCから入手した。細胞は、5% CO2中の37℃にある100mm組織培養皿内の下記の増殖培地中で増殖させた:SKBR3−10% FBSを含むマッコイ(MacCoy)5A培地;MDA−MB−468−DMEM、10% FBS;BT474−DMEM、10% FBS;T47D−RPMI 1640、10% FBS、0.2U/mLのウシインスリン。細胞は、緩徐な分離プロセス(トリプシン処理+その後の不活性化)を用いて70〜80%のコンフルエンシーで採取し、引き続いて計数し、1×PBSで洗浄した。細胞の刺激は、100μMのEGFもしくは20μMのヘレグリンβまたはその両方を用いて血清無含有増殖培地中で5分間にわたり実施した。その後、刺激し
細胞は1×PBSで洗浄し、次に溶解させ、氷上で30分間にわたり保持した。
感受性:単細胞の感受性レベルでのHER−1およびHER−2の活性化および発現は、複数の細胞系(MDA−MB−468、A431、BT−474、およびSKBr−3細胞系)において検出された。これらの細胞系は1細胞に付きそれらの細胞膜上で約1×106の全RTKを発現するが、全RTKのサブセットだけがリン酸化され、そのようなリン酸化は経路活性化のために必要とされる。SKBR−3細胞は、その増幅に起因して特発性HER−2活性化を有し、このためにそれらは参照陽性コントロールを提供する。MDA−MB−468細胞はHER−1リン酸化を誘導するためにはEGF(TGF−α)を用いて刺激する必要があり、刺激前後のそれらのシグニチャーは、陰性および陽性コントロールとして使用できる。MDA−MB−468は刺激前には境界的HER−1活性化を有するが、両方の細胞系はそれらの活性化されたRTKの約2〜5%でピークに達する(細胞1個当たり約0.5〜1×105回のリン酸化事象)。図20は、本明細書に記載したアッセイフォーマットが単細胞感受性を備える105回未満の活性化事象の検出を可能にする。
本実施例では、希少循環腫瘍細胞(CTC)を用いたその使用を可能にする感受性を備えるErbBファミリー受容体メンバーのリン酸化状態を特異的に検出することが可能である新規なアッセイを例示する。CTC中のHER−1およびHER−2活性化を同定することによって、このアッセイプラットフォームは、標的療法薬の初期選択のためだけではなく、療法の進行についてのその後の監視のためにもガイダンスを提供することができる。CTCの連続サンプリング上のキナーゼおよび他のシグナル伝達経路分子についての発現/活性化プロファイリングは、時間および療法の関数としての腫瘍細胞内で発生する変化に関する重要な情報を提供するであろう。この療法誘導診断アプローチは、図18に示すように、疾患管理の様々な段階で差し込むことができる。本明細書に記載したアッセイフォーマットによって提供される腫瘍進行についてのこの時間的プロファイリングは、臨床医が各患者において迅速に発達する癌シグニチャーを監視することを可能にするであろう。その圧倒的な感受性および特異性のために、本実施例に記載したアッセイフォーマットは、希少CTC中に存在するErbBファミリー受容体メンバー内でのリン酸化事象を検出するために適用できる。したがってこの方法は、標的療法薬の初期選択のためだけではなく、療法の進行についてのその後の監視のためにもガイダンスを提供することができる。
本出願は、単細胞レベル感受性でErbBファミリー受容体チロシンキナーゼ(RTK)におけるリン酸化事象を特異的に検出することのできる技術を提示する。所定の態様では、この多重タンパク質マイクロアレイプラットフォームは、固有の「三重抗体−酵素チャネリング」免疫複合体の形成を利用する。1つの実施形態では、この複合体は、標的タンパク質が捕捉抗体に結合されると、対応するチャネリング酵素と結合した2つの検出抗体の共局在を必要とする。近接している2つの検出酵素であるグルコースオキシダーゼ(GO、抗RTK抗体に結合している)および西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP、RTK内の抗リン酸化部位に結合している)間のチャネリング事象は、超高感受性を備えるRTKのプロファイリングを可能にした。この原理は、限定数の標的細胞:患者の全血(循環腫瘍細胞、CTC)および細針吸引液(FNA)サンプル中で見いだされる癌細胞を備える2つの乳癌モデル系に適用された。
背景:HER1およびHER2の異常な活性化は様々なタイプの癌進行と結び付けられており、原発腫瘍と循環腫瘍細胞(CTC)との間の発現状態における変化は有意な頻度で発生すると報告されてきた。連続的に収集されたCTCにおけるHER1およびHER2リン酸化を検出するための方法は、全疾患プロファイル変化に関する貴重な洞察を提供することができ、このためより良好な療法選択/調整を導くことができる。
背景:原発部位と転移病巣間の腫瘍受容体の発現状態における変化は、有意な頻度(約15〜20%)で発生することが公知である。結果として、転移性腫瘍上の受容体チロシンキナーゼ(RTK)活性化パターンをプロファイリングする方法は、変化する疾患病因に関する貴重な洞察を提供することができる。
Claims (168)
- 乳房腫瘍を治療するのに適切な抗癌剤を選択するための方法であって:
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記抗癌剤が、前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍の治療のために適切であるか、または不適切であるかを決定する工程と、を含む方法。 - 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項2に記載の方法。
- 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項2に記載の方法。
- 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項5に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項9に記載の方法。
- 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項9に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロ(in vitro)で刺激される、請求項1に記載の方法。
- 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体は、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))、アレムツズマブ(Campath(登録商標))、ベバシズマブ(Avastin(登録商標))、セツキシマブ(Erbitux(登録商標))、ゲムツズマブ(Mylotarg(登録商標))、パニツムマブ(Vectibix(商品名))、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))、トシツモマブ(BEXXAR(登録商標))、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ゲフィチニブ(Iressa(登録商標))、スニチニブ(Sutent(登録商標))、エルロチニブ(Tarceva(登録商標))、ラパチニブ(Tykerb(登録商標))、カネルチニブ(CI1033)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、ソラフェニブ(BAY43−9006)、イマチニブメシレート(Gleevec(登録商標))、レフルノミド(SU101)、バンデタニブ(ZACTIMA(商品名);ZD6474)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記化学療法薬は、ペメトレキセド(ALIMTA(登録商標))、ゲムシタビン(Gemzar(登録商標))、シロリムス(ラパマイシン)、ラパマイシンアナログ、白金化合物、カルボプラチン、シスプラチン、サトラプラチン、パクリタキセル(Taxol(登録商標))、ドセタキセル(Taxotere(登録商標))、テムシロリムス(CCI−779)、エベロリムス(RAD001)、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記ホルモン療法薬は、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体調節剤、ステロイド、フィナステリド、ゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト、それらの薬学的に許容される塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記放射線療法薬は、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、および212Bi、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記1つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記複数のシグナル伝達分子は、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分、核ホルモン受容体、核受容体コアクチベーター、核受容体リプレッサー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記複数のシグナル伝達分子は、EGFR(ErbB1)、HER−2(ErbB2)、p95ErbB2、HER−3(ErbB3)、HER−4(ErbB4)、Raf、SRC、Mek、NFkB−IkB、mTor、PI3K、VEGF、VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3、Eph−a、Eph−b、Eph−c、Eph−d、cMet、FGFR、cKit、Flt−3、Tie−1、Tie−2、Flt−3、cFMS、PDGFRA、PDGFRB、Abl、FTL3、RET、Kit、HGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、IGF−1R、ER、PR、NCOR、AIB1、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記複数のシグナル伝達分子は、ErbB1、ErbB2、p95ErbB2、ErbB3、ErbB4、VEGFR−1、VEGFR−2、VEGFR−3、ER、PR、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項1に記載の方法。
- 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記活性化状態依存性抗体は、結合対の第1メンバーを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記結合対の第1メンバーは、ビオチンである、請求項27に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、前記結合対の第2メンバーを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記結合対の第2メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項29に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項29に記載の方法。
- 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項31に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第2メンバーは、チラミド試薬である、請求項31に記載の方法。
- 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項33に記載の方法。
- 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項34に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項35に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項35に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項37に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項37に記載の方法。
- 前記発色試薬は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項39に記載の方法。
- 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて直接的に標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて、活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第1メンバーを用いて直接的に標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第1メンバーを用いて、前記活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第1メンバーと前記シグナル増幅対の第1メンバーに結合された前記結合対の第2メンバーとの間の結合によって標識される、請求項41に記載の方法。
- 前記結合対の第1メンバーは、ビオチンである、請求項45に記載の方法。
- 前記結合対の第2メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項45に記載の方法。
- 前記促進成分は、グルコースオキシダーゼである、請求項41に記載の方法。
- 前記グルコースオキシダーゼおよび前記活性化状態非依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子へ結合される、請求項48に記載の方法。
- 前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、500kDaの分子量を有する、請求項49に記載の方法。
- 前記酸化剤は、過酸化水素(H2O2)である、請求項48に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項51に記載の方法。
- 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項52に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第2メンバーは、チラミド試薬である、請求項52に記載の方法。
- 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項54に記載の方法。
- 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項55に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項56に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項56に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項58に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項58に記載の方法。
- 前記発色試薬は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項60に記載の方法。
- 抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍の応答を同定するための方法であって:
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記乳房腫瘍が前記抗癌剤を用いた治療に応答性または非応答性であると同定する工程と、を含む方法。 - 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項62に記載の方法。
- 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項63に記載の方法。
- 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項63に記載の方法。
- 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項66に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項67に記載の方法。
- 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項62に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項70に記載の方法。
- 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項70に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項62に記載の方法。
- 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記1つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項62に記載の方法。
- 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項62に記載の方法。
- 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項62に記載の方法。 - 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項62に記載の方法。 - 抗癌剤を用いた治療への乳房腫瘍を有する被験者の応答を予測するための方法であって:
(a)抗癌剤の投与後、または抗癌剤とのインキュベーション前に乳房腫瘍の細胞を単離する工程と;
(b)細胞抽出物を生成するために前記単離した細胞を溶解させる工程と;
(c)前記細胞抽出物中の1つ以上の分析物の活性化状態を、前記1つ以上の分析物に対して特異的である複数の希釈系列の捕捉抗体を含むアッセイを用いて検出する工程であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に固定される工程と;
(d)前記1つ以上の分析物について検出された活性化状態を前記抗癌剤の非存在下で作成された対照活性化プロファイルと比較することによって、前記被験者が前記抗癌剤を用いた治療に応答する可能性を予測する工程と、を含む方法。 - 前記乳房腫瘍は、乳管癌または小葉癌を有する被験者に由来する、請求項81に記載の方法。
- 前記乳管癌は、浸潤性乳管癌または非浸潤性乳管癌である、請求項82に記載の方法。
- 前記小葉癌は、浸潤性小葉癌または上皮内小葉癌である、請求項82に記載の方法。
- 前記細胞は、前記乳房腫瘍の循環細胞を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項85に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項86に記載の方法。
- 前記循環細胞は、循環腫瘍細胞、循環内皮細胞、循環内皮前駆細胞、癌幹細胞、播種性腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項85に記載の方法。
- 前記細胞は、腫瘍組織から単離される、請求項81に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項89に記載の方法。
- 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項89に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項81に記載の方法。
- 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記1つ以上の分析物は、複数のシグナル伝達分子を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記固体支持体は、ガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項81に記載の方法。
- 前記捕捉抗体は、アドレス可能なアレイ内の固体支持体上に固定される、請求項81に記載の方法。
- 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を前記対応する分析物に対して特異的な活性化状態依存性抗体とインキュベートする工程と;
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項81に記載の方法。 - 前記アッセイは、工程(c)において:
(i)複数の捕捉分析物を形成するために前記細胞抽出物を捕捉抗体の複数の希釈系列とインキュベートする工程と;
(ii)複数の検出可能な捕捉分析物を形成するために、前記複数の捕捉分析物を、前記複数の活性化状態非依存性抗体および前記対応する分析物に対して特異的である複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、
前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(iii)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉分析物をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(iv)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む、請求項81に記載の方法。 - 固体支持体上に固定された複数の希釈系列の捕捉抗体を含む優れたダイナミックレンジを有するアレイであって、各希釈系列中の捕捉抗体は細胞抽出物中のシグナル伝達経路の成分に対応する1つ以上の分析物に対して特異的である、アレイ。
- 前記シグナル伝達経路は、細胞増殖に関係している、請求項100に記載のアレイ。
- 前記捕捉抗体は、IGF1R、cMET、ErbB1、ErbB2、p95ErbB2、ErbB3、ErbB4、Shc、PI3K、Erk、Rsk、Akt、p70S6K、ER、PR、NCOR、およびAIB1と反応性である抗体からなる群より選択される1つ以上のメンバーを含む、請求項101に記載のアレイ。
- 前記シグナル伝達経路は、腫瘍血管新生に関係している、請求項100に記載のアレイ。
- 前記捕捉抗体は、Shc、PI3K、Erk、Rsk、Akt、p70S6K、VEGFR−1、VEGFR−2、Tie2、V−カドヘリン−R2複合体、PDGFRA、およびPDGFRBと反応性である抗体からなる群より選択される1つ以上のメンバーを含む、請求項103に記載のアレイ。
- 切断受容体の存在を検出するための方法であって:
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は前記切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を前記対応する切断受容体に対して特異的である検出抗体とインキュベートする工程と;
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第1および第2メンバーとインキュベートする工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法。 - 前記切断受容体は、p95ErbB2である、請求項105に記載の方法。
- 前記全長受容体は、ErbB2(HER−2)である、請求項105に記載の方法。
- 細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な前記複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、前記ストレプトアビジンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している、請求項105に記載の方法。
- 前記抗体は、前記全長受容体の前記ECD結合領域に対して特異的である、請求項108に記載の方法。
- 前記細胞抽出物は、乳房腫瘍の循環細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項105に記載の方法。
- 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項110に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項111に記載の方法。
- 前記細胞抽出物は、腫瘍組織から単離した細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項105に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項113に記載の方法。
- 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項113に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項111または113に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、成長因子刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、請求項116に記載の方法。
- 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項117に記載の方法。
- 前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体の活性化状態が調べられる(interrogated)、請求項105に記載の方法。
- 前記活性化状態は、リン酸化状態、ユビキチン化状態、複合体形成状態、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項119に記載の方法。
- 前記検出抗体は、結合対の第1メンバーを含む、請求項105に記載の方法。
- 前記結合対の第1メンバーは、ビオチンである、請求項121に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、前記結合対の第2メンバーを含む、請求項105に記載の方法。
- 前記結合対の第2メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項123に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項124に記載の方法。
- 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項125に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第2メンバーは、チラミド試薬である、請求項125に記載の方法。
- 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項127に記載の方法。
- 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項128に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項129に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項129に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項131に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項131に記載の方法。
- 前記発色試薬は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項133に記載の方法。
- 切断受容体の存在を検出するための方法であって:
(a)細胞抽出物を全長受容体の細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な複数のビーズとインキュベートする工程と;
(b)前記複数のビーズを前記細胞抽出物から取り除き、それによって前記全長受容体を含まない細胞抽出物を形成するために前記全長受容体を取り除く工程と;
(c)前記全長受容体を含まない前記細胞抽出物を複数の捕捉抗体とインキュベートする工程であって、前記複数の捕捉抗体は前記切断受容体の細胞内ドメイン(ICD)結合領域に対して特異的であり、前記複数の捕捉抗体は複数の捕捉された切断受容体を形成するために固体支持体上に固定される工程と;
(d)複数の検出可能な捕捉された切断受容体を形成するために、前記複数の捕捉された切断受容体を、前記対応する切断受容体に対して特異的である複数の活性化状態非依存性抗体および複数の活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートする工程であって、前記活性化状態非依存性抗体は促進成分で標識され、前記活性化状態依存性抗体はシグナル増幅対の第1メンバーで標識され、前記促進成分は前記シグナル増幅対の第1メンバーにチャネリングして反応する酸化剤を生成する工程と、
(e)増幅シグナルを生成するために、前記複数の検出可能な捕捉された切断受容体をシグナル増幅対の第2メンバーとインキュベートする工程と;
(f)前記シグナル増幅対の第1および第2メンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する工程と、を含む方法。 - 前記切断受容体は、p95ErbB2である、請求項135に記載の方法。
- 前記全長受容体は、ErbB2(HER−2)である、請求項135に記載の方法。
- 細胞外ドメイン(ECD)結合領域に対して特異的な前記複数のビーズはストレプトアビジン−ビオチン対を含み、前記ストレプトアビジンはビーズに付着しており、ビオチンは抗体に付着している、請求項135に記載の方法。
- 前記抗体は、前記全長受容体の前記ECD結合領域に対して特異的である、請求項138に記載の方法。
- 前記細胞抽出物は、乳房腫瘍の循環細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項135に記載の方法。
- 前記循環細胞は、免疫磁気分離法によってサンプルから単離される、請求項140に記載の方法。
- 前記サンプルは、全血、血清、血漿、管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ液、骨髄吸引液、尿、唾液、細針吸引液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項141に記載の方法。
- 前記細胞抽出物は、腫瘍組織から単離した細胞を溶解させる工程によって生成される、請求項135に記載の方法。
- 前記腫瘍組織は、原発性腫瘍組織または転移性腫瘍組織である、請求項143に記載の方法。
- 前記細胞は、細針吸引液サンプルとして腫瘍組織から単離される、請求項143に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、増殖因子を用いてインビトロで刺激される、請求項141または143に記載の方法。
- 前記単離した細胞は、成長因子刺激の前に抗癌剤とインキュベートされる、請求項146に記載の方法。
- 前記抗癌剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、化学療法薬、ホルモン療法薬、放射線療法薬、ワクチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項147に記載の方法。
- 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて直接的に標識される、請求項135に記載の方法。
- 前記活性化状態非依存性抗体は、前記促進成分を用いて、活性化状態非依存性抗体に結合されたオリゴヌクレオチドと前記促進成分に結合された相補的オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって標識される、請求項135に記載の方法。
- 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第1メンバーを用いて直接的に標識される、請求項135に記載の方法。
- 前記活性化状態依存性抗体は、前記シグナル増幅対の第1メンバーを用いて、前記活性化状態依存性抗体に結合された結合対の第1メンバーと前記シグナル増幅対の第1メンバーに結合された前記結合対の第2メンバーとの間の結合によって標識される、請求項135に記載の方法。
- 前記結合対の第1メンバーは、ビオチンである、請求項152に記載の方法。
- 前記結合対の第2メンバーは、ストレプトアビジンである、請求項152に記載の方法。
- 前記促進成分は、グルコースオキシダーゼである、請求項135に記載の方法。
- 前記グルコースオキシダーゼおよび前記活性化状態非依存性抗体は、スルフヒドリル活性化デキストラン分子へ結合される、請求項155に記載の方法。
- 前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子は、500kDaの分子量を有する、請求項156に記載の方法。
- 前記酸化剤は、過酸化水素(H2O2)である、請求項155に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第1メンバーは、ペルオキシダーゼである、請求項158に記載の方法。
- 前記ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)である、請求項159に記載の方法。
- 前記シグナル増幅対の第2メンバーは、チラミド試薬である、請求項159に記載の方法。
- 前記チラミド試薬は、ビオチン−チラミドである、請求項161に記載の方法。
- 前記増幅シグナルは、活性化チラミドを生成するために前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項162に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、直接検出される、請求項163に記載の方法。
- 前記活性化チラミドは、シグナル検出試薬の添加に基づいて検出される、請求項163に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識フルオロフォアである、請求項165に記載の方法。
- 前記シグナル検出試薬は、ストレプトアビジン標識ペルオキシダーゼおよび発色試薬の組み合わせである、請求項165に記載の方法。
- 前記発色試薬は、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)である、請求項167に記載の方法。
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