KR20160009070A - 대장암 환자의 생존율 예측 및 개선 방법 - Google Patents

대장암 환자의 생존율 예측 및 개선 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측하고, 그로써 상기 대상이 양호한 예후 또는 불량한 예후를 가질지 여부를 결정하는 검정 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CRC 를 갖는 대상에서 항암 치료제에 대한 치료적 효능 및/또는 반응을 예측하고, 그로써 대상이 반응성을 가질 것으로 예상되는 치료적 계획을 선택하는 검정 및 방법을 제공한다.

Description

대장암 환자의 생존율 예측 및 개선 방법 {METHODS FOR PREDICTING AND IMPROVING THE SURVIVAL OF COLORECTAL CANCER PATIENTS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013 년 5 월 21 일에 출원한 미국 가출원 번호 61/825,998 에 대해 우선권을 주장하며, 상기의 공개물은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참조로 포함된다.
세포에서 신호 전달 과정은 몇 가지 예로, 세포 분화 및 사멸, 물질대사, 면역 세포 활성화, 신경전달 및 감각 인식을 비제한적으로 포함하는 다양한 생물학적 기능을 책임진다. 따라서, 세포에서 정상 신호 전달에서의 교란은 당뇨병, 심장 질환, 자가면역 및 암과 같은 수많은 질환을 초래할 수 있다.
한 가지 널리 분석된 신호 전달 경로는 MAP 키나아제 경로이며, 이는 세포에서의 세포 증식을 촉진하기 위해 표피 성장 인자 (EGF) 로부터의 신호를 전달하는 역할을 한다. EGF 는 막관통 수용체-연결 티로신 키나아제, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) (EGF 의 결합에 의해 활성화됨) 에 결합한다. EGF 의 EGFR 에 대한 결합은 수용체의 세포질 도메인의 티로신 키나아제 활성을 활성화시킨다. 이러한 키나아제 활성화의 한 결과물은 티로신 잔기 상의 EGFR 의 자기인산화이다. 활성화된 EGFR 상의 인산화 티로신 잔기는 GRB2 와 같은 어댑터 단백질을 함유하는 SH2 도메인의 결합에 대한 도킹 부위를 제공한다. 어댑터로서의 이의 기능에 있어서, GRB2 는 GRB2 상의 SH3 도메인을 통한, 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자, SOS 에 추가로 결합한다. EGFR-GRB2-SOS 의 복합체 형성은 Ras 로부터의 GDP 제거를 촉진하는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자에 대한 SOS 활성화를 초래한다. GDP 제거시, Ras 는 GTP 에 결합하며 활성화된다.
활성화 후, Ras 가 결합하며 RAF 키나아제, 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나아제의 단백질 키나아제 활성을 활성화시킨다. 세포 증식을 초래하는 단백질 키나아제 캐스케이드의 활성화가 뒤따른다. 개략적으로, RAF 키나아제는 MEK, 또 다른 세린/트레오닌 키나아제를 인산화시키고 활성화시킨다. 활성화된 MEK 는 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 를 인산화시키고 활성화시킨다. MAPK 에 의한 추가 인산화에 대한 표적 중에서, 40S 리보솜 단백질 S6 키나아제 (RSK) 가 있다. MAPK 에 의한 RSK 의 인산화는 RSK 의 활성화를 초래하여, 이는 리보솜 단백질 S6 을 인산화시킨다. MAPK 의 또 다른 공지된 표적은 세포 증식에 중요한 유전자인 원암유전자, c-Myc 이며, 이는 다양한 암에서 돌연변이화된다. MAPK 는 또한 또 다른 단백질 키나아제, MNK 를 인산화시키고 활성화시켜, 이는 전사 인자, CREB 를 인산화시킨다. 간접적으로 MAPK 는 또한, 세포 증식에 포함되는 또 다른 전사 인자를 인코딩하는 Fos 유전자의 전사를 조절한다. 이러한 전사 인자의 수준 및 활성을 변형시킴으로써, MAPK 는 EGF 로부터의 본래 세포외 신호를 세포 주기 진행에 중요한 유전자의 변형된 전사로 전달한다.
신호 전달 경로가 세포 성장에서 역할하는 중심적 역할을 가지므로, 많은 암이 세포 증식 경로의 이상 활성화를 초래하는 신호 전달 성분에서의 돌연변이 및 기타 변형의 결과로서 발생한다는 것은 놀라운 일이 아니다. 예를 들어, EGFR 의 과발현 또는 과활성은 수많은 암, 예컨대 다형성교모세포종, 결장암 및 폐암과 연관된다. 이는 EGFR 에 대해 유도된 항암 치료제, 예컨대 폐암에 대한 게피티닙 및 에를로티닙, 및 결장암에 대한 세툭시맙의 개발을 유발한다.
세툭시맙은 EGFR 의 세포외 리간드 결합 도메인에 결합하여, 이에 따라 EGFR 티로신 키나아제를 활성화시키는 리간드의 결합을 막는 단일클론 항체 저해제의 예이다. 반대로, 게피티닙 및 에를로티닙은 세포내-위치한 EGFR 티로신 키나아제를 저해하는 소분자이다. 키나아제 활성의 부재 하, EGFR 은 다운스트림 어댑터 단백질, 예컨대 GRB2 의 결합에 대한 전제 조건인, 티로신 잔기에서의 자기인산화를 거칠 수 없다. 성장을 위해 이러한 경로에 의존하는 세포에서의 신호화 캐스케이드를 중단시킴으로써, 종양 증식 및 이동이 감소한다.
추가적으로, 약 70% 의 인간 흑색종 및 작은 일부의 다른 종양이 MAPK 경로의 지속되는 활성화를 초래하는 Raf 유전자에서의 점 돌연변이 (V599E) 를 갖는다는 것이 다른 연구에서 나타난 바 있다 (예를 들어, Davies et al., Nature, 417:949-954 (2002) 참조). 이러한 결과는 특정 신호 전달 경로에서의 돌연변이가 특정 유형의 종양의 특징일 수 있으며 이러한 특이적이고 변형된 신호 전달 경로가 화학요법 개입에 대한 유망한 표적일 수 있다는 것을 제안한다.
상이한 암 치료, 특히 암 화학요법이 각각 세포 증식 또는 사멸에 관여하는 세포 신호 전달 경로를 차단하거나 활성화시킴으로써 직접 또는 간접적으로 기능할 수 있다는 것을 고려하면, 특정 형태의 암, 예를 들어 대장암에서 주어진 신호 전달 경로의 발현 및/또는 활성화는 각종 암 치료의 효능에 대한 양호한 표시자로서 역할할 수 있다. 따라서, 다른 필요성을 충족시키는 것에 추가로, 본 발명은 대장암을 갖는 개별 환자에 대한 가능성 있는 항암 치료요법의 효과를 평가하는 방법을 제공한다. 그로써, 본 발명은 의사가 모든 환자에 대한 올바른 용량 및 올바른 시간으로의 대장암 치료에 적합한 암 치료요법을 선택하는 것을 돕는 방법을 제공한다.
본 발명은 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측함으로써 상기 대상이 예를 들어 종양 수술 후에 양호한 예후 (예를 들어 무병생존율) 또는 불량한 예후 (예를 들어 질환 재발) 를 가질지 여부를 결정하는 검정 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CRC 를 갖는 대상에서 항-HER 치료요법, 항-PI3K 치료요법, 항-cMET 치료요법, 또는 이의 조합과 같은 항암 치료법에 대한 치료 효능 및/또는 반응을 예측함으로써 대상이 반응성을 가질 것으로 예상되는 치료 계획을 선택하는 검정 및 방법을 제공한다. 본 발명은 CRC 종양에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 맞춘 특정 치료 계획을 부여함으로써 CRC 을 갖는 대상을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 CRC 를 갖는 대상으로부터 수득한 암 세포에서의 신호 전달 분석물의 특정 조합의 활성화 상태 또는 수준의 검출을 필요로 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 CRC 종양에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 특이적으로 맞춘 치료요법으로부터 이득을 얻을 수 있는 대상을 확인함으로써 CRC 를 갖는 대상의 생존율 또는 예후를 예측하고 종양 수술 전 및 종양 수술 후 모두의 치료 결정을 유도하는데 특히 유용하다.
일부 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 예를 들어 종양 수술 후 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 (예를 들어 pPI3K/pHER3 인덱스) 을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
(b) (제 1) 참조 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스 (예를 들어 PI3K/HER 참조 컷-오프 비) 를 기반으로 대상의 생존율을 예측함.
일부 구현예에서, HER 수용체는 HER1, HER2, HER3 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 PI3K/HER1 인덱스, PI3K/HER2 인덱스, PI3K/HER3 인덱스, 또는 이의 조합을 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 PI3K/HER3 인덱스를 단독으로 또는 PI3K/HER1 인덱스 및/또는 PI3K/HER2 인덱스와의 조합으로 결정하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 미만인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 긴 기간 또는 시간으로 생존하는 양호한 예후 (예를 들어 높은 무병생존율 (disease-free survival) 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G13D 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 의 값을 포함한다 (예를 들어, 약 20% 또는 2/10). 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 미만인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 짧은 기간 또는 시간으로 생존하는 불량한 예후 (예를 들어 낮은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G12 돌연변이를 갖는다. KRAS 발암유전자에서 G12 돌연변이의 비제한적 예는 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이를 포함한다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 초과인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 짧은 기간 또는 시간으로 생존하는 불량한 예후 (예를 들어 낮은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G13D 또는 G12 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는다. KRAS 발암유전자에서 G12 돌연변이의 비제한적 예는 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이를 포함한다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
다른 구현예에서, 방법은 PI3K 의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준이 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준에 대하여 낮은 경우 (예를 들어 pPI3K 수준이 pHER3 발현의 약 15% 내지 약 30% 임), 질환 재발 없이 더 긴 기간 또는 시간으로 생존하는 양호한 예후 (예를 들어 높은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것을 예측하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 방법은 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 HER1 및 cMET 의 수준 (예를 들어 HER1 및 cMET 의 발현 또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준) 을 기반으로 HER1/cMET 인덱스를 결정하고, 또한 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 에 대한 HER1/cMET 인덱스를 기반으로 대상의 생존율을 예측하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 미만 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 미만) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 초과인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 긴 기간 또는 시간으로 생존하는 양호한 예후 (예를 들어 높은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 다른 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 미만 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 미만) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 미만인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 짧은 기간 또는 시간으로 생존하는 불량한 예후 (예를 들어 낮은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 추가 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 초과 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 초과) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 미만인 경우, 대상은 질환 재발 없이 더 짧은 기간 또는 시간으로 생존하는 불량한 예후 (예를 들어 낮은 무병생존율 또는 DFS) 를 갖는 것으로 예측된다. 특정한 경우, (제 1) PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, (제 1) PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다. 다른 특정한 경우, (제 2) HER1/cMET 참조 인덱스 컷-오프는 약 2 의 값을 포함한다. 다른 경우, (제 2) HER1/cMET 참조 인덱스 컷-오프는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 값을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 예를 들어 종양 수술 후 대상에서의 대장암 (CRC) 치료를 위한 치료요법을 선택하는 방법을 제공한다:
(a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 (예를 들어 pPI3K/pHER3 인덱스) 을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
(b) (제 1) 참조 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스 (예를 들어 PI3K/HER 참조 컷-오프 비) 를 기반으로 대상에서의 CRC 를 치료하기 위한 적합한 치료요법 (예를 들어 항-EGFR 치료요법, 항-PI3K 치료요법, 항-HER2 치료요법, 항-HER3 치료요법, 항-cMET 치료요법 및/또는 PI3K 활성화를 유도하는 분자를 저해하는 표적제로의 치료요법) 을 선택함.
일부 구현예에서, HER 수용체는 HER1, HER2, HER3 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 PI3K/HER1 인덱스, PI3K/HER2 인덱스, PI3K/HER3 인덱스 또는 이의 조합을 결정하는 것을 포함한다. 일부 경우, 상기 방법은 PI3K/HER3 인덱스를 단독으로 또는 PI3K/HER1 인덱스 및/또는 PI3K/HER2 인덱스와 조합으로 결정하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 미만인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G13D 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 미만인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 반응성이 없는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G12 돌연변이를 갖는다. KRAS 발암유전자에서의 G12 돌연변이의 비제한적 예는 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이를 포함한다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 결정한 PI3K/HER 인덱스가 참조 인덱스 컷-오프 초과인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없는 것으로 예측된다. 일부 경우, 대상은 KRAS 발암유전자에서 G13D 또는 G12 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는다. KRAS 발암유전자에서의 G12 돌연변이의 비제한적 예는 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이를 포함한다. 특정한 경우, 참조 인덱스 컷-오프 값은 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 PI3K 의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준이 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준에 대하여 낮은 경우 (예를 들어 pPI3K 수준이 pHER3 발현의 약 15% 내지 약 30% 임), 대상이 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있을 가능성이 있다는 것을 예측하는 것을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 HER1 및 cMET 의 수준 (예를 들어 HER1 및 cMET 의 발현 또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준) 을 기반으로 HER1/cMET 인덱스를 결정하고, 또한 제 2 참조 인덱스 컷-오프에 대한 HER1/cMET 인덱스 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 를 기반으로 CRC 의 치료를 위한 치료요법을 선택하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 미만 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 미만) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 초과인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있는 것으로 예측된다. 다른 구현예에서, 결정한 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 미만 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 미만) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 미만인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없는 것으로 예측된다. 추가 구현예에서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 제 1 참조 인덱스 컷-오프 초과 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 초과) 이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 제 2 참조 인덱스 컷-오프 (예를 들어 HER1/cMET 참조 컷-오프 비) 미만인 경우, 대상은 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없는 것으로 예측된다. 특정한 경우, (제 1) PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.2 (예를 들어 약 20% 또는 2/10) 의 값을 포함한다. 다른 경우, (제 1) PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프는 약 0.1 (예를 들어 약 10% 또는 1/10), 약 0.3 (예를 들어 약 30% 또는 3/10), 약 0.4 (예를 들어 약 40% 또는 4/10), 또는 약 0.5 (예를 들어 약 50% 또는 5/10) 의 값을 포함한다. 다른 특정한 경우, (제 2) HER1/cMET 참조 인덱스 컷-오프는 약 2 의 값을 포함한다. 다른 경우, (제 2) HER1/cMET 참조 인덱스 컷-오프는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상의 값을 포함한다.
특정 구현예에서, 항-EGFR 치료요법에 대한 최적의 후보물은 pPI3K/pHER 인덱스가 낮지만 (예를 들어 PI3K/HER 참조 인덱스 컷-오프 미만) HER1/cMET 인덱스가 높은 (예를 들어 HER1/cMET 참조 인덱스 컷-오프 초과), CRC 를 갖는 대상이다.
추가 구현예에서, 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-pPI3K 치료요법은 pHER (예를 들어 pHER3) 의 약 15% 내지 약 30% 초과의 pPI3K 신호화를 갖는 공격적 CRC 종양에 보다 적합하다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다. 다른 구현예에서, 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-cMET 치료요법은, 항-PI3K 치료요법의 존재 하 또는 부재 하에, pHER (예를 들어 pHER3) 의 약 15% 내지 약 30% 초과의 pPI3K 를 갖는 공격적 CRC 종양의 치료에 보다 적합하다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다.
일부 경우, 항-EGFR 치료요법은 단일클론 항체 예컨대 세툭시맙, 파니투무맙, 마투주맙 및 니모투주맙; 티로신 키나아제 저해제 예컨대 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 게피티닙 (Iressa®), 카네르티닙 (CI 1033) 및 BIBW-2992; 및 이의 조합을 포함한다.
다른 경우, 항-PI3K 치료요법은 PX-866, 보르트만닌, LY 294002, 퀘르세틴, 테트로도톡신 시트레이트, 티오페르아미드 말레에이트, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ235 (NVP-BEZ235), TGX-115, ZSTK474, (-)-데구엘린, NU 7026, 미리세틴, 탄두티닙, GDC-0941 비스메실레이트, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, 페리포신, 트리시리빈, XL-147, PIK75, TGX-221, NU 7441, PI 828, XL-765 및 WHI-P 154 뿐 아니라 이의 조합을 포함한다.
다른 경우, 항-HER2 치료요법은 단일클론 항체 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®) 및 퍼투주맙 (2C4); 소분자 티로신 키나아제 저해제 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 에를로티닙 (Tarceva®), 펠리티닙, CP-654577, CP-724714, 카네르티닙 (CI 1033), HKI-272, 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 및 JNJ-26483327; 및 이의 조합을 포함한다.
다른 경우, 항-HER3 치료요법은 단일클론 항체 예컨대 MM-121, U3-1287 (AMG 888), MEHD7945A 및 퍼투주맙 (2C4); 이중특이적 항체 예컨대 MM-111; 소분자 저해제 예컨대 MP-470 (아무바티닙), AZD8931 및 카네르티닙 (CI 1033); 및 이의 조합을 포함한다.
다른 경우, 항-cMET 치료요법은 중화 항체, 예컨대 MAG102 (Amgen) 및 MetMab (Roche), 뿐 아니라 티로신 키나아제 저해제 (TKI), 예컨대 ARQ197, XL184, PF-02341066, GSK1363089/XL880, MP470, MGCD265, SGX523, PF04217903 JNJ38877605, INCB28060, AMG-458, E7050, MK-2461 및 BMS-777607, 및 이의 조합을 포함한다.
PI3K 및 그의 표적화제를 활성화하는 분자의 비제한적 예는 하기의 신호 전달 분자 및 이의 저해제를 포함한다:
Figure pct00001
특정한 경우, PI3K 활성화를 유도하는 분자는 K-Ras, H-Ras, 기타 Ras 패밀리 소 (small) GTPase, Rho 패밀리 소 GTPase (예를 들어 Rac, Cdc42, RhoG) 및 이의 조합을 포함한다. 다른 경우, PI3K 활성화를 유도하는 분자를 저해하는 표적화제는 ML141 (Cdc42/Rac1 저해제), AZA1 (Cdc42/Rac1 저해제), ZCL278 (Cdc42 저해제), NSC23766 (Rac 저해제), EHop-016/CAS 1380432-32-5 (Rac 저해제), CAS 1090893-12-1 (Rac 저해제), CAS 1177865-17-6 (Rac 저해제), EHT 1864 (Rac 저해제), W56 (Rac1 저해제), 살리라십 (Ras 저해제) 및 이의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 신호 전달 분자 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 추가적 분석물의 (총) 발현 및/또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
신호 전달 분자의 총 발현 및 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태는 임의의 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 암 세포의 세포 추출물과 같은 샘플에서의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태는 본원에 기재된 바와 같은 면역검정 예컨대 단일 검출 검정 또는 근접성 (proximity) 이중 검출 검정 (예를 들어 공동 효소 증강 반응성 면역검정 (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive Immunoassay (CEERTM)) 으로 검출된다.
CEERTM 기법은 본원 및 각각 그 전체가 모든 목적으로 본원에 참조로 포함되는 하기의 특허 문헌에서 기재된다: PCT 특허 공개 번호 WO 2008/036802, WO 2009/012140, WO 2009/108637, WO 2010/132723, WO 2011/008990 및 WO 2011/050069; 및 PCT 출원 번호 PCT/US2011/066624.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1 은 실시예 1 에서 기재된 연구에 대한 CRC 코호트 연구 개요를 나타낸다.
도 2 는 연구에 등록한 CRC 환자의 특징을 나타낸다.
도 3 은 CEER 을 사용하는 CRC 임상 샘플의 신호화 경로 프로파일링을 나타낸다.
도 4 는 CRC 무병생존율 (DFS) 에서의 다양성 및 이종성을 나타낸다.
도 5 는 CRC 생존율에서의 다양성이 신호화 경로 시그너쳐 (signature) 에서의 다양성과 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
도 6 은 pPI3K/pHER3 인덱스 감소와 DFS 에 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
도 7 은 pPI3K/pHER3 인덱스에 의해 구별된 CRC 종양의 조성을 나타낸다.
도 8 은 pPI3K/pHER3 인덱스에 의해 구별된 CRC 종양이 높은 생존율 및 낮은 생존율을 갖는 KRAS 야생형 종양 내에서 2 개 이상의 하위집단을 커버하지 못한다는 것을 나타낸다.
도 9 는 KRAS 돌연변이 상태를 기반으로 한 DFS 구별에 있어서의 상당한 차이가 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 종양에서만 관찰되었다는 것을 나타낸다.
도 10 은 높은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 종양이, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 조기에 재발된다는 것을 나타낸다.
도 11 은 먼 거리의 기관까지 전이됨에 따라, CRC 종양이 높은 pPI3K/pHER3 인덱스를 획득한다는 것을 나타낸다.
도 12 는 도 6-11 에서 나타낸 실험 데이터의 그림 요약을 나타낸다.
도 13 은 MET 신호화가 공격적 (높은 pPI3K/pHER3 인덱스) KRAS 야생형 및 KRAS G13D 돌연변이체 CRC 에서 더 높다는 것을 나타낸다.
도 14 는 MET 신호화가 (A) 공격적 (높은 pPI3K/pHER3 인덱스) CRC 및 (B) 전이성 CRC 에서의 HER1 신호화보다 더 높다는 것을 나타낸다.
도 15 는 KRAS-WT CRC 종양이 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 종양에서 KRAS G12mut 종양보다 상당히 더 높은 HER1/cMET 인덱스 비를 입증한다는 것을 나타낸다.
도 16 은 적절한 HER1/cMET 비의 컷-오프가 낮은 PI3K 집단 내에서 보다 공격적인 KRAS G12mut 종양을 가려낸다는 것을 나타낸다.
도 17 은 상대적 경로 시그너쳐 + KRAS 돌연변이 상태를 포함하는 본 발명의 상대적/통합적 경로 인덱스의 그림 요약을 제공한다.
도 18 은 pPI3K/pHER1, pPI3K/pHER2 및 pPI3K/pHER3 비가 모두 CRC 에서 재발 (예를 들어 마커 수치가 높을수록 재발이 빠름) 및 무병생존율 (DFS) 과 음성적이고 유의하게 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
도 19 는 pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 가 더 높은 pPI3K/pHER3 발현 (예를 들어 참조 pPI3K/pHER3 인덱스 컷-오프 초과) 을 갖는 CRC 샘플에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 나타낸다.
I. 개요
본 발명은 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측하고, 그로써 예를 들어 종양 수술 후, 상기 대상이 양호한 예후 (예를 들어 무병생존율) 또는 불량한 예후 (예를 들어 질환 재발) 를 가지는지 여부를 결정하는 검정 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 CRC 를 갖는 대상에서 항-HER 치료요법, 항-PI3K 치료요법, 항-cMET 치료요법 또는 이의 조합과 같은 항암 치료법에 대한 치료 효능 및/또는 반응을 예측하고, 그로써 대상이 반응성을 보일 것으로 예상되는 치료 계획을 선택하는 검정 및 방법을 제공한다. 본 발명은 CRC 종양에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 맞춘 특정 치료 계획을 부여함으로써 CRC 를 갖는 대상을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 CRC 를 갖는 대상으로부터 수득한 암 세포에서의 신호 전달 분석물의 특정 조합의 활성화 상태 또는 수준의 검출을 필요로 한다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 CRC 종양에서 활성화되는 신호 전달 바이오마커에 특이적으로 맞춘 치료요법으로부터 이득을 얻을 수 있는 대상을 확인함으로써 CRC 를 갖는 대상의 생존율 또는 예후를 예측하고 종양 수술 전 및 종양 수술 후 모두의 치료 결정을 유도하는데 특히 유용하다.
실시예 1 은 그의 KRAS 상태에 관계없이 대장암 (CRC) 종양에서의 포스포-PI3K (pPI3K) 대 포스포-HER3 (pHER3) 의 비를 입증하며, 종양 예후 및 항-EGFR 치료요법 결과를 예측한다. 본원에 기재한 바와 같이, 항-EGFR 치료요법에 대한 최적의 후보물은, pPI3K/pHER3 비는 낮으나 HER1/cMET 비가 높은 CRC 일 수 있다.
실시예 1에서 기재한 바와 같이, pPI3K/pHER3 인덱스가 컷-오프 비를 초과하는 경우 (예를 들어 pPI3K/pHER3 > 20%), pPI3K 신호화는 HER 신호화 초과이며 CRC 는 PI3K-유도된 것으로서 분류된다. 예후의 측면에서, 컷-오프 비를 초과하는 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 낮은 DFS 를 갖는 것으로 예측된다. CRC 치료요법 선택의 측면에서, 컷-오프 비 초과의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없는 것으로 예상되며 항-PI3K 치료요법에 대해 반응성이 있을 가능성이 높다. pPI3K/pHER3 인덱스가 컷-오프 비 미만인 경우 (예를 들어 pPI3K/pHER3 < 20%), HER 신호화는 더 높으며 CRC 는 HER-유도된 것으로서 분류된다. 예후의 측면에서, 컷-오프 비 미만의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는 KRAS 상태가 WT 또는 G13D 인 경우 높은 DFS 를 갖지만, KRAS 상태가 KRAS G12mut 인 경우 낮은 DFS 를 갖는 것으로 예측된다. CRC 치료요법 선택의 측면에서, 컷-오프 비 미만의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 일부 환자는 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있는 것으로 예상된다.
실시예 1 에서 추가로 기재한 바와 같이, cMET 신호화보다 더 높은 HER 신호화를 갖는 (예를 들어 HER1 > cMET; 높은 HER1/cMET 인덱스 또는 낮은 cMET 신호화) HER-유도 CRC 종양에서, 야생형 또는 G13D KRAS 상태를 갖는 CRC 환자는 예후가 양호하며 (예를 들어 높은 DFS) 항-EGFR 치료요법에 보다 더 반응할 가능성이 있다. 그러나, 낮은 HER1 신호화를 갖는 (예를 들어 HER1 < cMET; 낮은 HER1/cMET 인덱스 또는 높은 cMET 신호화) HER-유도 CRC 종양에서, G12 KRAS 돌연변이를 갖는 CRC 환자는 예후가 불량하다 (예를 들어 낮은 DFS).
따라서, 실시예 1 은 CEER-기반 신호화 경로 프로파일이 KRAS 돌연변이-기반 구별을 넘어서는 CRC 의 신규한 분자적 하위집합을 밝혀냈다는 것을 나타낸다. 이러한 분자적 구별은 CRC 에 대한 신규한 치료적 선택 전략을 유도할 수 있다. 특히, CRC 종양에서 pPI3K 대 pHER3 발현 비 (pPI3K/pHER3 인덱스) 로, 그의 KRAS 상태에 관계없이, 종양 예후 및 항-EGFR 치료요법 결과를 예측한다는 것이 발견되었다. 항-EGFR 치료요법에 대한 최적의 후보물은, pPI3K/pHER3 비는 낮으나 HER1/cMET 비가 높은 CRC 로서 확인되었다. 낮은 pPI3K 신호화 (예를 들어 pHER3 발현의 약 15-30%) 를 갖는 CRC 종양의 2 차적 선택은, 그의 KRAS 상태에 관계없이 최적 예후의 항-EGFR 치료요법 결과를 가질 수 있는 CRC 종양을 추가로 예측할 수 있다. 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-pPI3K 치료요법은 pHER3 의 약 15-30% 초과의 pPI3K 신호화를 갖는 공격적 CRC 종양에 보다 적합하다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다. 이러한 연구는 또한 증가된 pPI3K 신호화가 일부 CRC 에서 증가된 cMET 신호화로 인한 것일 수 있다는 것을 발견하였다. 항-PI3K 치료요법의 존재 하 또는 부재 하에, 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-cMET 치료요법은, pHER3 의 약 15-30% 초과의 pPI3K 를 갖는 공격적 CRC 종양의 치료에 유용할 수 있다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다.
더욱이, 실시예 1 은 pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 비가 또한 CRC 에서 재발 (예를 들어 마커 수치가 높을수록 재발이 빠름) 및 무병생존율 (DFS) 과 음성적이고 유의하게 상관관계가 있다는 것을 입증한다. 특히, 실시예 1 은 pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 비가 더 높은 pPI3K/pHER3 비 (예를 들어 참조 pPI3K/pHER3 인덱스 컷-오프 초과) 를 갖는 CRC 샘플에서 더 높다는 것을 추가로 입증한다.
따라서, 본 발명은 또한 대장암에 관련된 하나 이상의 탈조절된 신호 전달 경로를 하향조절하기 위한 적절한 치료요법을 선택하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 해당 환자의 대장 종양에서 단독으로 또는 체세포 돌연변이 분석과 조합으로, 총 및/또는 활성화된 신호 전달 단백질의 집합물에 의해 제공된 특정 분자 시그너쳐를 기반으로 개인맞춤화된 치료요법의 설계를 촉진시키는데 사용될 수 있다.
II. 정의
용어 "암" 은 이상 세포의 조절되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는, 악성, 양성, 연조직 또는 고형 중 어느 것으로 특징지어지든, 모든 알려진 암 및 신생물 상태, 및 전이 전 및 후의 암을 포함하는 모든 시기 및 등급의 암을 포함한다. 상이한 유형의 암의 예는비제한적으로, 소화 및 위장관 암 예컨대 대장암, 위장암 (gastric cancer) (예를 들어 위암 (stomach cancer)), 위장관 기질 종양 (GIST), 위장관 카르시노이드 종양, 결장암, 직장암, 항문암, 담도암, 소장암, 및 식도암; 유방암; 폐암 (예를 들어 비-소세포 폐암 (NSCLC)); 담낭암; 간암; 췌장암; 맹장암; 전립선암, 난소암; 신장암 (예, 신세포 암종); 중추신경계의 암; 피부암; 림프종; 신경교종; 융모막암종; 두경부암; 골육종; 및 혈액암을 포함한다. 본원에서 사용되는, "종양" 은 하나 이상의 암 세포를 포함한다.
용어 "분석물" 은 그것의 존재, 양 (발현 수준), 활성화 상태 및/또는 정체가 결정되는 임의의 관심 분자, 통상 거대분자 예컨대 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "신호 전달 분자" 또는 "신호 전달인자" 는 세포외 신호 또는 자극을, 통상 세포 내부의 일련의 순차적 생화학 반응을 포함하는 반응으로 변환시키는 과정을 수행하는 단백질 및 기타 분자를 포함한다. 신호 전달 분자의 예는 비제한적으로, 수용체 티로신 키나아제 예컨대 EGFR (예를 들어 EGFR/HER1/ErbB1, HER2/Neu/ErbB2, HER3/ErbB3, HER4/ErbB4), VEGFR1/FLT1, VEGFR2/FLK1/KDR, VEGFR3/FLT4, FLT3/FLK2, PDGFR (예를 들어 PDGFRA, PDGFRB), c-KIT/SCFR, INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (인슐린 수용체 관련 수용체), CSF-1R, FGFR 1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, c-MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYRO3, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-카드헤린, LTK (백혈구 티로신 키나아제), ALK (역형성 림프종 키나아제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, 및 RTK 106; 수용체 티로신 키나아제의 절두 (truncated) 형태 예컨대 아미노-말단 세포외 도메인이 결여된 절두형 HER2 수용체 (예를 들어 p95ErbB2 (p95m), p110, p95c, p95n 등), 아미노-말단 세포외 도메인이 결여된 절두형 cMET 수용체, 및 아미도-말단 세포외 도메인이 결여된 절두형 HER3 수용체; 수용체 티로신 키나아제 이량체 (예를 들어 p95HER2/HER3; p95HER2/HER2; HER1, HER2, HER3 또는 HER4 를 갖는 절두형 HER3 수용체; HER2/HER2; HER3/HER3; HER2/HER3; HER1/HER2; HER1/HER3; HER2/HER4; HER3/HER4; 등); 비-수용체 티로신 키나아제 예컨대 BCR-ABL, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack 및 LIMK; 티로신 키나아제 신호화 캐스케이드 성분 예컨대 AKT (예를 들어 AKT1, AKT2, AKT3), MEK (MAP2K1), ERK2 (MAPK1), ERK1 (MAPK3), PI3K (예를 들어 PIK3CA (p110), PIK3R1 (p85)), PDK1, PDK2, 포스파타아제 및 텐신 동족체 (PTEN), SGK3, 4E-BP1, P70S6K (예를 들어 p70 S6 키나아제 스플라이스 변이체 알파 I), 단백질 티로신 포스파타아제 (예를 들어 PTP1B, PTPN13, BDP1 등), RAF, PLA2, MEKK, JNKK, JNK, p38, Shc (p66), Ras (예를 들어 K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Rac1, Cdc42, PLC, PKC, p53, 사이클린 D1, STAT1, STAT3, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 (PIP2), 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 (PIP3), mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, GSK-3β, RSK 1-3, JNK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, 및 팩실린; 핵 호르몬 수용체 예컨대 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄로코르티코이드 수용체, 비타민 A 수용체, 비타민 D 수용체, 레티노이드 수용체, 갑상선 호르몬 수용체, 및 고아 수용체; 핵 수용체보조활성화제 및 억제제 예컨대 유방암-1 에서 증폭된 것 (AIB1) 및 핵 수용체 보조억제제 1 (NCOR) 각각; 및 이의 조합을 포함한다.
용어 "활성화 상태" 는 특정 신호 전달 분자가 활성화되는지 여부를 나타낸다. 유사하게, 용어 "활성화 수준" 은 특정 신호 전달 분자가 활성화되는 정도를 나타낸다. 활성화 상태는 통상 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체화 상태에 해당한다. 활성화 상태 (괄호 안에 열거됨) 의 비제한적 예는 하기를 포함한다: HER1/EGFR (EGFRvIII, 인산화된 (p-) EGFR, EGFR:Shc, 유비퀴틴화 (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p-ErbB2, p95HER2 (절두형 ErbB2), p-p95HER2, ErbB2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, 절두형 ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-MET (p-c-MET, 절두형 c-MET, c-Met:HGF 복합체); AKT1 (p-AKT1); AKT2 (p-AKT2); AKT3 (p-AKT3); PTEN (p-PTEN); P70S6K (p-P70S6K); MEK (p-MEK); ERK1 (p-ERK1); ERK2 (p-ERK2); PDK1 (p-PDK1); PDK2 (p-PDK2); SGK3 (p-SGK3); 4E-BP1 (p-4E-BP1); PIK3R1 (p-PIK3R1); c-KIT (p-c-KIT); ER (p-ER); IGF-1R (p-IGF-1R, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); FLT3 (p-FLT3); HGFR1 (p-HGFR1); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRA (p-PDGFRA); PDGFRB (p-PDGFRB); VEGFR1 (p-VEGFR1, VEGFR1:PLCγ, VEGFR1:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCγ, VEGFR2:Src, VEGFR2:헤파린 술페이트, VEGFR2:VE-카드헤린); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); TIEl (p-TIEl); TIE2 (p-TIE2); EPHA (p-EPHA); EPHB (p-EPHB); GSK-3β (p-GSK-3β; NFKB (p-NFKB), IKB (p-IKB, p-P65:IKB); BAD (p-BAD, BAD:14-3-3); mTOR (p-mTOR); Rsk-1 (p-Rsk-1); Jnk (p-Jnk); P38 (p-P38); STAT1 (p-STAT1); STAT3 (p-STAT3); FAK (p-FAK); RB (p-RB); Ki67; p53 (p-p53); CREB (p-CREB); c-Jun (p-c-Jun); c-Src (p-c-Src); 팩실린 (p-팩실린); GRB2 (p-GRB2), Shc (p-Shc), Ras (p-Ras), GAB1 (p-GAB1), SHP2 (p-SHP2), GRB2 (p-GRB2), CRKL (p-CRKL), PLCγ (p-PLCγ), PKC (예를 들어 p-PKCα, p-PKCβ, p-PKCδ), 아듀신 (p-아듀신), RB1 (p-RB1) 및 PYK2 (p-PYK2).
용어 "발암유전자" 는 암을 일으킬 가능성이 있는 유전자를 포함한다. 발암유전자의 비제한적 예는 성장 인자 또는 미토겐 예컨대 c-Sis; 수용체 티로신 키나아제 예컨대 EGFR, HER2, PDGFR 및 VEGFR; 세포질 티로신 키나아제 예컨대 Abl 및 티로신 키나아제의 Src-패밀리, Syk-ZAP-70 패밀리 및 BTK 패밀리에서의 키나아제; 세포질 세린/트레오닌 키나아제 및 이의 조절 서브유닛 예컨대 PIK3CA, PIK3R1 및 RAF (예를 들어 RAF-1, A-RAF, B-RAF); 조절 GTPase 예컨대 RAS (예를 들어 KRAS); 전사 인자 예컨대 MYC; 및 이의 조합을 포함한다.
용어 "KRAS 돌연변이" 는 KRAS (또한 KRAS2 또는 RASK2 로서 지칭될 수 있음) 유전자에서의 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. KRAS 돌연변이의 예는 비제한적으로 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R, G12C, G13D, 및 이의 조합을 포함한다.
용어 "BRAF 돌연변이" 는 BRAF (또한 세린/트레오닌-단백질 키나아제 B-Raf 또는 B-Raf 로서 지칭될 수 있음) 유전자에서의 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. BRAF 돌연변이의 예는 비제한적으로 V600E, R461I, I462S, G463E, G463V, G465A, G465E, G465V, G468A, G468E, N580S, E585K, D593V, F594L, G595R, L596V, T598I, V599D, V599E, V599K, V599R, K600E, A727V, 및 이의 조합을 포함한다.
용어 "PIK3CA 돌연변이" 는 PIK3CA (또한 PI3K 또는 p110-알파로서 지칭될 수 있음) 유전자에서의 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. PIK3CA 돌연변이의 예는 비제한적으로 E545A, E545G, E545K, Q546E, Q546K, H1047R, H1047L, 3204insA, 및 이의 조합을 포함한다.
용어 "EGFR 돌연변이" 는 EGFR (또한 HER1 또는 ErbB1 로서 지칭될 수 있음) 유전자에서의 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. EGFR 돌연변이의 예는 비제한적으로 엑손 19 에서의 결실 예컨대 L858R, G719S, G719S, G719C, L861Q 및 S768I, 뿐 아니라 엑손 20 에서의 삽입 예컨대 T790M, 및 이의 조합을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "희석물 시리즈" 는 일련의 감소하는 농도의 특정 샘플 (예를 들어 세포 용해물) 또는 시약 (예를 들어 항체) 을 포함하는 것으로 의도된다. 희석물 시리즈는 전형적으로 측정된 양의 출발 농도의 샘플 또는 시약을 희석제 (예를 들어 희석 완충제) 와 혼합하여 더 낮은 농도의 샘플 또는 시약을 제조하고, 이 과정을 원하는 수의 연속 희석물을 수득하기에 충분한 횟수로 반복하는 과정에 의해 생성된다. 샘플 또는 시약은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, 또는 1000-배로 연속 희석되어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 개의 감소하는 농도의 샘플 또는 시약을 포함하는 희석물 시리즈를 생성할 수 있다. 예를 들어, 1 ㎎/㎖ 출발 농도에서 포획 항체 시약의 2-배 연속 희석물을 포함하는 희석물 시리즈는 일정량의 출발 농도의 포획 항체를 동일양의 희석 완충제와 혼합하여 0.5 ㎎/㎖ 농도의 포획 항체를 생성하고, 이 과정을 반복하여 0.25 ㎎/㎖, 0.125 ㎎/㎖, 0.0625 ㎎/㎖, 0.0325 ㎎/㎖ 등의 포획 항체 농축물을 수득함으로써 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "우수한 동적 범위" 는 1 개 만큼 적은 세포 중 또는 천 개 만큼 많은 세포 중 특정 분석물을 검출하는 검정 능력을 나타낸다. 예를 들어, 본원에 기재된 면역검정은 포획 항체 농축물의 희석물 시리즈를 사용하여 약 1-10,000 개의 세포 (예를 들어 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 또는 10,000 개의 세포) 중 관심의 특정 신호 전달 분자를 검출하기 때문에 우수한 동적 범위를 보유한다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플" 은 환자로부터 수득한 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 샘플은 비제한적으로, 전혈, 혈장, 혈청, 적혈구, 백혈구 (예를 들어 말초 혈액 단핵구), 유관액, 복수, 늑막 유출물 (pleural efflux), 수유관액 (nipple aspirate), 림프액 (예를 들어 림프절의 파종성 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변 (즉, 배설물), 가래, 기관지 세척액, 눈물, 미세 바늘 흡인물 (예를 들어 무작위 유선 미세 바늘 흡인에 의해 수확된), 임의의 기타 체액, 조직 샘플 (예를 들어 종양 조직) 예컨대 종양 생검 (예를 들어 천자 생검) 또는 림프절 (예를 들어 감시 (sentinel) 림프절 생검), 조직 샘플 (예를 들어 종양 조직) 예컨대 종양의 수술적 절제, 및 이의 세포 추출물을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 전혈 또는 이의 일부 성분 예컨대 혈장, 혈청 또는 세포 펠렛이다. 다른 구현예에서, 샘플은 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 전혈 또는 이의 세포 분획물로부터 고형 종양의 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현예에서, 샘플은 예를 들어 대장암과 같은 고형 종양으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매 (FFPE) 종양 조직 샘플이다. 특정 구현예에서, 샘플은 대장암을 갖는 대상으로부터 수득한 동결 조직으로부터 제조된 종양 용해물 또는 추출물이다.
용어 "대상" 또는 "환자" 또는 "개인" 은 통상 인간을 포함할 뿐 아니라 다른 동물, 예를 들어 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 돼지 등을 포함할 수 있다.
"어레이" 또는 "마이크로어레이" 는 고체 지지체 예컨대 유리 (예를 들어 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드 (예를 들어 자기 비드, 폴리스티렌 비드 등), 종이, 막 (예를 들어 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질에 고정되거나 구속된 포획 항체의 희석물 시리즈 및/또는 별도의 세트를 포함한다. 포획 항체는 일반적으로 공유적 또는 비공유적 상호작용 (예를 들어 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합) 을 통해 고체 지지체에 고정되거나 구속된다. 특정 경우에, 포획 항체는 고체 지지체에 결합된 포획제와 상호작용하는 포획 태그를 포함한다. 본원에 기재된 검정에 사용되는 어레이는 전형적으로 상이한 알려진/접근가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 복수의 상이한 포획 항체 및/또는 포획 항체 농축물을 포함한다.
용어 "포획 항체" 는 샘플 예컨대 세포 추출물 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 고정된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 포획 항체는 어레이 내의 고체 지지체 상에 제지된다. 고체 지지체 상에 임의의 다양한 신호 전달 분자를 고정시키기에 적합한 포획 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO) 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 이용가능하다.
본원에서 사용되는 용어 "검출 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 검출가능한 표지를 포함하는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 항체를 포함하며, 상기 항체는 검출가능한 표지를 포함하는 또 다른 종에 의해 결합될 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 비제한적으로 비오틴/스트렙타비딘 표지, 핵산 (예를 들어 올리고뉴클레오티드) 표지, 화학 반응성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 방사선 표지, 및 이들의 조합을 포함한다. 임의의 다양한 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 총량을 검출하기에 적합한 검출 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO) 및 BD Biosciences (San Jose, CA) 로부터 이용가능하다. 비제한적인 예로서, 신호 전달 분자 예컨대 EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, AKT, MAPK, PTEN, Raf 및 MEK 의 다양한 인산화된 형태에 대한 포스포 (phospho)-특이적 항체가 Santa Cruz Biotechnology 로부터 이용가능하다.
용어 "활성화 상태-의존적 항체" 는 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물의 특정 활성화 상태에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 검출 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 분석물 예컨대 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태를 검출한다. 일부 구현예에서, 수용체 티로신 키나아제의 EGFR 패밀리의 일원의 인산화 및/또는 EGFR 패밀리 일원 사이의 이종이량체성 복합체의 형성이 활성화 상태-의존적 항체를 사용하여 검출된다. 특정 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 하나 이상의 하기 신호 전달 분자 내의 하나 이상의 인산화 자리를 검출하는데 유용하다 (인산화 자리는 인간 단백질 서열 내의 아미노산의 위치에 상응한다): EGFR/HER1/ErbB1 (예를 들어 티로신 (Y) 1068); ErbB2/HER2 (예를 들어 Y1248); ErbB3/HER3 (예를 들어 Y1289); ErbB4/HER4 (예를 들어 Y1284); c-Met (예를 들어 Y1003, Y1230, Y1234, Y1235, 및/또는 Y1349); SGK3 (예를 들어 트레오닌 (T) 256 및/또는 세린 (S) 422); 4E-BP1 (예를 들어 T70); ERK1 (예를 들어 T185, Y187, T202, 및/또는 Y204); ERK2 (예를 들어 T185, Y187, T202, 및/또는 Y204); MEK (예를 들어 S217 및/또는 S221); PIK3R1 (예를 들어 Y688); PDK1 (예를 들어 S241); P70S6K (예를 들어 T229, T389, 및/또는 S421); PTEN (예를 들어 S380); AKT1 (예를 들어 S473 및/또는 T308); AKT2 (예를 들어 S474 및/또는 T309); AKT3 (예를 들어 S472 및/또는 T305); GSK-3β (예를 들어 S9); NFKB (예를 들어 S536); IKB (예를 들어 S32); BAD (예를 들어 S112 및/또는 S136); mTOR (예를 들어 S2448); Rsk-1 (예를 들어 T357 및/또는 S363); Jnk (예를 들어 T183 및/또는 Y185); P38 (예를 들어 T180 및/또는 Y182); STAT3 (예를 들어 Y705 및/또는 S727); FAK (예를 들어 Y397, Y576, S722, Y861, 및/또는 S910); RB (예를 들어 S249, T252, S612, 및/또는 S780); RB1 (예를 들어 S780); 아듀신(예를 들어 S662 및/또는 S724); PYK2 (예를 들어 Y402 및/또는 Y881); PKCα (예를 들어 S657); PKCα/β (예를 들어 T368 및/또는 T641); PKCδ (예를 들어 T505); p53 (예를 들어 S392 및/또는 S20); CREB (예를 들어 S133); c-Jun (예를 들어 S63); c-Src (예를 들어 Y416); 및 팩실린 (예를 들어 Y31 및/또는 Y118).
용어 "활성화 상태-비의존적 항체" 는 활성화 상태와 무관하게 샘플 내의 하나 이상의 관심의 분석물에 특이적인 (즉, 그에 결합하거나, 그에 의해 결합되거나, 그와 함께 복합체를 형성하는) 검출 항체를 포함한다. 예를 들어, 활성화 상태-비의존적 항체는 하나 이상의 분석물 예컨대 하나 이상의 신호 전달 분자의 인산화된 형태 및 인산화되지 않은 형태 둘 모두를 검출할 수 있다.
용어 "인큐베이션" 은 "접촉" 및 "노출" 과 유의어로 사용되고, 다르게 명시되지 않으면 임의의 특정 시간 또는 온도 요건을 포함하지 않는다.
"수용체 티로신 키나아제" 또는 "RTK" 는 막관통 도메인 및 티로신 키나아제 모티프에 의해 특징지어지는 56 개의 단백질의 패밀리를 포함한다. RTK 는 세포 신호전달에서 기능하고, 성장, 분화, 부착, 이동 및 세포자멸사를 조절하는 신호를 전달한다. 수용체 티로신 키나아제의 돌연변이성 활성화 및/또는 과발현은 세포를 형질전환시키고, 종종 암의 발달에서 중요한 역할을 수행한다. RTK 는 다양한 분자 표적화제 예컨대 트라스투주맙, 세툭시맙, 게피티닙, 에를로티닙, 수니티닙, 이마티닙, 닐로티닙 등의 표적이 된다. 하나의 잘 분석된 신호 전달 경로는 MAP 키나아제 경로이고, 이는 세포 내에서 세포 증식을 촉진하는 표피 성장 인자 (EGF) 로부터의 신호를 전달하는 역할을 한다.
용어 "유전자" 및 이의 변형물은 폴리펩티드 사슬 생성에 관여한 DNA 조각을 포함하며; 이는 코딩 부위 이전 및 이후의 부위, 예컨대 프로모터 및 3'-미번역 부위를 각각 포함할 뿐 아니라, 개별적인 코딩 단편 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 을 포함한다.
용어 "유전자형" 및 이의 변형물은, 예를 들어 2배체 유기체가 하나 이상의 관심 변형 대립형질에 대해 이형접합성인지 또는 동형접합성인지 여부를 포함하는 유기체의 유전적 구성을 나타낸다.
용어 "다형성" 및 이의 변형물은 집단 내 둘 이상의 유전적으로 결정된 대안적 서열 또는 대립형질의 발생을 나타낸다. "다형성 부위" 는 발산 (divergence) 이 일어나는 유전자좌 (locus) 를 나타낸다. 바람직한 다형성 부위는 2 개 이상의 대립형질을 가지며, 각각 집단 내에서 특정 빈도로 발생한다. 다형성 유전자좌는 1 염기쌍만큼 작을 수 있다 (예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 SNP). 다형성 마커는 제한 단편 길이 다형성, 연쇄염기서열 반복 (variable number of tandem repeat, VNTR), 초가변부, 미소부수체, 디뉴클레오티드 반복물, 트리뉴클레오티드 반복물, 테트라뉴클레오티드 반복물, 단순 서열 반복물 및 삽입 요소 예컨대 Alu 를 포함한다. 제 1 확인 대립형질은 참조 대립형질로서 자의적으로 지정되고, 다른 대립형질은 대안적 대립형질, "변이 대립형질 (variant allele)" 또는 "변이 (variance)" 로서 지정된다. 선택된 집단에서 가장 빈번하게 발생하는 대립형질은 때때로 "야생형" 대립형질로서 지칭될 수 있다. 2배체 유기체는 변이 대립형질에 대해 동형접합성이거나 이형접합성일 수 있다. 변이 대립형질은 변이 대립형질을 수반하는 개인에서 관찰가능한 물리적 또는 생화학적 특징 ("표현형") 을 생성시킬 수 있거나 생성시키지 않을 수 있다. 예를 들어, 변이 대립형질은 관심 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 효소 활성을 변화시킬 수 있거나, 대안적으로 변이 대립형질은 인코딩된 단백질의 효소 활성이 영향을 주지 않을 수 있다.
용어 "단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)" 및 이의 변형물은 폴리뉴클레오티드 내, 예컨대 대립형질 내 단일 뉴클레오티드의 변화를 나타낸다. 이는 다른 것에 의한 하나의 뉴클레오티드의 대체 뿐 아니라 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 가장 통상적으로, 삼중- 및 사중대립형질 마커가 또한 존재할 수 있으나 , SNP 는 이중대립형질 마커이다. 비제한적 예로서, SNP A＼C 를 포함하는 핵산 분자는 다형성 위치에서 C 또는 A 를 포함할 수 있다. SNP 의 조합을 위해, 용어 "단상형 (haplotype)" 이 사용된다 (예를 들어 서로 연결되는 단일 DNA 가닥에서의 SNP 의 유전자형). 일부 구현예에서, 용어 "단상형" 은 SNP 대립형질의 조합, 예를 들어 단일 DNA 분자 상에 함께 발견되는 SNP 의 대립형질을 기재하는데 사용될 수 있다. 추가 구현예에서, 단상형에서의 SNP 는 서로 연관 불균형 (linkage disequilibrium) 일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "무병생존율 (disease-free survival)" 및 "DFS" 는 특정 질환 (예를 들어 암) 에 대한 치료 후 환자가 질환의 징후 없이 (예를 들어 알려진 재발 없이) 생존하는 기간을 포함한다. 특정 구현예에서, 무질환 생존기간은, 통상 1 또는 5 년의 단위로 측정되는, 특정 치료요법의 효능을 평가하는데 사용되는 임상 매개변수이다.
용어 "무진행 생존율 (progression-free survival)" 은 특정 질환 (예를 들어 암) 에 대한 치료 후 또는 치료 동안 환자가 질환의 부가적 증상 없이 질환을 갖고 살아가는 기간을 포함한다.
용어 "전체 생존률 (overall survival)" 은 질환, 예컨대 암으로 진단되거나 그에 대해 치료된 후 한정된 시간 동안 살아 있는 환자를 기재하는 임상적 종점을 포함한다.
III. 구현예의 설명
본 발명은 대장암으로부터의 종양 세포에서의 신호 전달 경로 성분의 상태 (예를 들어 발현 및/또는 활성화 수준) 를 검출하는 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 대장암으로부터의 종양 세포에서의 하나 이상의 체세포 돌연변이 (예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)) 의 존재 (또는 부재) 를 검출 (예를 들어 유전자형 분석) 하는 것을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 또한 하나 이상의 탈조절된 신호 전달 경로를 하향조절하거나 정지 (shut down) 시키기 위해 적절한 치료요법을 선택하는 방법 및 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는 해당 환자의 종양 (예를 들어 대장암) 에서의 총 및 활성화된 신호 전달 단백질 및/또는 체세포 돌연변이의 수집물에 의해 제공된 특정 분자 시그너쳐를 기반으로 개인맞춤화된 치료요법의 설계를 촉진시키는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 대장암이 항암 약물에 순조롭게 반응할 가능성이 있거나 이와 반응할 수 있는지 여부를 측정하거나 예측할 수 있게 하는 분자 마커 (바이오마커) 를 제공한다. 특정 구현예에서, HER1, HER2, HER3, cMET, cKIT, IGF-1R, PI3K, AKT, ERK 및/또는 SHC 중 적어도 하나 이상의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 것은 적합한 항암 약물을 선택하고/하거나 대장암 세포 (예를 들어 대장 종양으로부터 단리된 암 세포) 와 같은 세포에서의 이에 대한 반응을 확인하거나 예측하는데 특히 유용하다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 KRAS, BRAF 및/또는 PIK3CA 와 같은 유전자에서 (예를 들어 이들 유전자 중 하나 이상에서의 SNP 와 같은 1, 2, 3, 4, 5 개 이상의 다형성 부위에서) 하나 이상의 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 의 존재 또는 부재에 대한 유전자형 분석을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 발현 수준 및/또는 활성화 수준의 측정과 함께 변이 대립형질의 존재 또는 부재의 측정은, 적합한 항암 약물의 선택 및/또는 대장암 세포 (예를 들어 대장 종양으로부터 단리된 암 세포) 와 같은 세포에서의 이에 대한 반응의 확인 또는 예측을 추가로 돕거나 개선시킨다.
일부 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 예를 들어 종양 수술 후 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측하는 방법을 제공한다:
(a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 (예를 들어 pPI3K/pHER3 인덱스) 을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
(b) (제 1) 참조 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스 (예를 들어 PI3K/HER 참조 컷-오프 비) 를 기반으로 대상의 생존율을 예측함.
다른 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 예를 들어 종양 수술 후 대상에서의 대장암 (CRC) 치료를 위한 치료요법을 선택하는 방법을 제공한다:
(a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 (예를 들어 pPI3K/pHER3 인덱스) 을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
(b) (제 1) 참조 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스 (예를 들어 PI3K/HER 참조 컷-오프 비) 를 기반으로 대상에서의 CRC 를 치료하기 위한 적합한 치료요법 (예를 들어 항-EGFR 치료요법, 항-PI3K 치료요법, 항-HER2 치료요법, 항-HER3 치료요법, 항-cMET 치료요법 및/또는 PI3K 활성화를 유도하는 분자를 저해하는 표적제로의 치료요법) 을 선택함.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 신호 전달 분자 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 추가적인 분석물의 (총) 발현 및/또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태를 측정하는 것을 추가로 포함한다.
제자리 (in situ) 활성화 상태를 보존하기 위해, 신호 전달 단백질은 통상 세포가 단리된 직후, 바람직하게는 96, 72, 48, 24, 6 또는 1 시간 내, 보다 바람직하게는 30, 15 또는 5 분 내에 추출된다. 단리된 세포는 또한 신호 전달인자 활성화를 소생시키거나 자극하기 위해 통상 약 1-30 분 동안 나노몰 내지 마이크로몰 농도에서 성장 인자와 함께 인큐베이션될 수 있다 (예를 들어 Irish et al., Cell, 118:217-228 (2004) 참조). 자극성 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF), 헤레굴린 (HRG), TGF-α, PIGF, 안지오포이에틴 (Ang), NRG1, PGF, TNF-α, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, 사이토카인 등을 포함한다. 개별 환자에 대한 가능성 있는 항암 치료요법을 평가하기 위해, 단리된 세포를 성장 인자 자극 전, 동안 및/또는 이후에 다양한 용량의 하나 이상의 항암 약물과 함께 인큐베이션할 수 있다. 성장 인자 자극은 수 분 또는 수 시간 (예를 들어 약 1-5 분 내지 약 1-6 시간) 동안 수행될 수 있다. 단리, 항암 약물로의 처리 및/또는 성장 인자 자극 후, 세포를 용해하여 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 신호 전달 단백질을 추출하였다. 바람직하게는, 세포 용해를 성장 인자 자극 후 약 1-360 분 사이에서, 보다 바람직하게는 두 상이한 시간 간격에서 개시한다: (1) 성장 인자 자극 후 약 1-5 분에서; 및 (2) 성장 인자 자극 후 약 30-180 분 사이에서. 대안적으로, 용해물은 사용시까지 -80℃ 에서 보관될 수 있다.
일부 구현예에서, 항암 약물은 암 세포에서의 하나 이상의 활성화된 신호 전달 경로 성분의 기능을 간섭하는 작용제를 포함한다. 이러한 작용제의 비제한적 예는 하기 표 1 에서 열거한 것들을 포함한다.
표 1
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Figure pct00004
특정 구현예에서, 항암 약물은 항-신호화제 (즉, 세포분열억제 약물) 예컨대 단일클론 항체 또는 티로신 키나아제 저해제; 항-증식제; 화학요법제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 암 세포와 같은 이상 세포의 비제어된 성장을 감소시키거나 없애는 능력을 갖는 임의의 기타 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 세포는 하나 이상의 항-신호화제, 항-증식제 및/또는 호르몬 치료제와 하나 이상의 화학요법제의 조합으로 처리된다.
본 발명에서 사용하기 적합한 항-신호화제의 예는 비제한적으로, 단일클론 항체 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®), 퍼투주맙 (2C4), 알렘투주맙 (Campath®), 베바시주맙 (Avastin®), 세툭시맙 (Erbitux®), 겜투주맙 (Mylotarg®), 파니투무맙 (VectibixTM), 리툭시맙 (Rituxan®) 및 토시투모맙 (BEXXAR®); 티로신 키나아제 저해제 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 수니티닙 (Sutent®), 에를로티닙 (Tarceva®), 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), 카네르티닙 (CI 1033), 세막시닙 (SU5416), 바탈라닙 (PTK787/ZK222584), 소라페닙 (BAY 43-9006; Nexavar®), 이마티닙 메실레이트 (Gleevec®), 레플루노미드 (SU101), 반데타닙 (ZACTIMATM; ZD6474), 펠리티닙, CP-654577, CP-724714, HKI-272, PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 및 JNJ-26483327; 및 이의 조합을 포함한다.
예시적인 항-증식제는 mTOR 저해제 예컨대 시롤리무스 (라파마이신), 템시롤리무스 (CCI-779), 에버롤리무스 (RAD001), BEZ235 및 XL765; AKT 저해제 예컨대 1L6-히드록시메틸-치로-이노시톨-2-(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실-sn-글리세로카르보네이트, 9-메톡시-2-메틸엘리프티시늄 아세테이트, 1,3-디히드로-1-(1-((4-(6-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐)메틸)-4-피페리디닐)-2H-벤즈이미다졸-2-온, 10-(4'-(N-디에틸아미노)부틸)-2-클로로페녹사진, 3-포르밀크로몬 티오세미카르바존 (Cu(II)Cl2 복합체), API-2, 원암유전자 TCL1 의 아미노산 10-24 에서 유래한 15-량체 펩티드 (Hiromura et al., J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004)), KP372-1, 및 Kozikowski et al., J. Am. Chem. Soc., 125:1144-1145 (2003) 및 Kau et al., Cancer Cell, 4:463-476 (2003) 에 기재된 화합물; PI3K 저해제 예컨대 PX-866, 보르트만닌, LY 294002, 퀘르세틴, 테트로도톡신 시트레이트, 티오페르아미드 말레에이트, GDC-0941 (957054-30-7), IC87114, PI-103, PIK93, BEZ235 (NVP-BEZ235), TGX-115, ZSTK474, (-)-데구엘린, NU 7026, 미리세틴, 탄두티닙, GDC-0941 비스메실레이트, GSK690693, KU-55933, MK-2206, OSU-03012, 페리포신, 트리시리빈, XL-147, PIK75, TGX-221, NU 7441, PI 828, XL-765 및 WHI-P 154; MEK 저해제 예컨대 PD98059, ARRY-162, RDEA119, U0126, GDC-0973, PD184161, AZD6244, AZD8330, PD0325901 및 ARRY-142886; 및 이의 조합을 포함한다.
pan-HER 저해제의 비제한적 예는 PF-00299804, 네라티닙 (HKI-272), AC480 (BMS-599626), BMS-690154, PF-02341066, HM781-36B, CI-1033, BIBW-2992 및 이의 조합을 포함한다.
화학요법제의 비제한적 예는 백금-기재 약물 (예를 들어 옥살리플라틴, 시스플라틴, 카르보플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴 등), 알킬화제 (예를 들어 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 메클로르에타민, 우라무스틴, 티오테파, 니트로소우레아 등), 항-대사물질 (예를 들어 5-플루오로우라실, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 류코보린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈 (Gemzar®), 페메트렉세드 (ALIMTA®, 랄티트렉세드 등), 식물 알칼로이드 (예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®) 등), 토포이소머라아제 저해제 (예를 들어 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드 (VP16), 에토포시드 포스페이트, 테니포시드 등), 항종양 항생제 (예를 들어 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신 등), 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 유도체 및 이의 조합을 포함한다.
호르몬 치료제의 예는 비제한적으로, 아로마타아제 저해제 (예를 들어 아미노글루테티미드, 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 보로졸, 엑세메스탄 (Aromasin®), 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO), 1,4,6-안드로스타트리엔-3,17-디온 (ATD), 포르메스탄 (Lentaron®) 등), 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (예를 들어 바제독시펜, 클로미펜, 풀베스트란트, 라소폭시펜, 랄록시펜, 타목시펜, 토레미펜 등), 스테로이드 (예를 들어 덱사메타손), 피나스테리드 및 고나도트로핀-배출 호르몬 아고니스트 (GnRH) 예컨대 고세렐린, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 입체이성질체, 이의 유도체, 이의 유사체 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명에서 유용한 암 백신의 비제한적 예는 ANYARA (Active Biotech), DCVax-LB (Northwest Biotherapeutics), EP-2101 (IDM Pharma), GV1001 (Pharmexa), IO-2055 (Idera Pharmaceuticals), INGN 225 (Introgen Therapeutics) 및 Stimuvax (Biomira/Merck) 를 포함한다.
방사선치료의 예는 비제한적으로, 방사성 핵종 예컨대 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At 및 212Bi (종양 항원에 대해 유도된 항체에 임의로 접합됨) 를 포함한다.
HER2 저해제의 비제한적 예는 단일클론 항체 예컨대 트라스투주맙 (Herceptin®) 및 퍼투주맙 (2C4); 소분자 티로신 키나아제 저해제 예컨대 게피티닙 (Iressa®), 에를로티닙 (Tarceva®), 펠리티닙, CP-654577, CP-724714, 카네르티닙 (CI 1033), HKI-272, 라파티닙 (GW-572016; Tykerb®), PKI-166, AEE788, BMS-599626, HKI-357, BIBW 2992, ARRY-334543, JNJ-26483327 및 JNJ-26483327; 및 이의 조합을 포함한다.
c-Met 저해제의 비제한적 예는 단일클론 항체 예컨대 AMG102 및 MetMAb; c-Met 의 소분자 저해제 예컨대 ARQ197, JNJ-38877605, PF-04217903, SGX523, GSK 1363089/XL880, XL184, MGCD265 및 MK-2461; 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명을 사용하여 규문될 수 있는 신호 전달 분자 및 경로의 비제한적 예는 하기 표 2 에서 나타낸 것들을 포함한다.
표 2
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세포 추출물에서의 발현 (예를 들어 총량) 수준 및/또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준에 대해 규문될 수 있는 신호 전달 분자와 같은 분석물의 비제한적 예는 수용체 티로신 키나아제, 비-수용체 티로신 키나아제, 티로신 키나아제 신호화 캐스케이드 성분, 핵 호르몬 수용체, 핵 수용체 보조활성화제, 핵 수용체 억제제 및 이의 조합을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포 추출물에서 하기 분석물 중 적어도 하나 이상의 발현 수준 (예를 들어 총량) 및/또는 활성화 수준 (예를 들어 인산화 또는 복합체 형성 수준) 을 측정하는 것을 포함한다: (1) HER1/EGFR/ErbB1; (2) HER2/ErbB2; (3) p95HER2 (절두형 HER2); (4) HER3/ErbB3; (5) c-Met; (6) IGF1R; (7) cKit; (8) PI3K (예를 들어 PIK3CA 및/또는 PIK3R1); (9) Shc; (10) Akt; (11) p70S6K; (12) VEGFR (예를 들어 VEGFR1, VEGFR2, 및/또는 VEGFR3) 및/또는 PDGFR (예를 들어 PDGFRA 및/또는 PDGFRB); 및 (13) Erk (예를 들어 Erk1 (MAPK3) 및/또는 Erk2 (MAPK1)).
한 특정 구현예에서, 본 발명은 하기의 분석물 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 발현 수준 (예를 들어 총량) 및/또는 활성화 수준 (예를 들어 인산화 또는 복합체 형성 수준) 을 측정하는 것을 포함한다: HER1, HER2, HER3, cMET, cKIT, IGF-1R, PI3K (예를 들어 PIK3CA 및/또는 PIK3R1), AKT, ERK (예를 들어 ERK1 (MAPK3) 및/또는 ERK2 (MAPK1)) 및 SHC.
일부 구현예에서, 활성화 수준은 HER1, HER2, HER3, cMET, cKIT, IGF-1R, AKT, ERK 및/또는 SHC 의 인산화 수준에 상응한다. 특정한 다른 구현예에서, 활성화 수준은 PI3K 복합체의 수준에 상응한다. PI3K 복합체의 예는 비제한적으로, 이량체화된 수용체 티로신 키나아제 쌍을 포함하는 하나 이상의 복합체, PI3K p85 서브유닛 (예를 들어 PIK3R1) 및 PI3K p110 서브유닛 (예를 들어 α 또는 β 서브유닛 예컨대 PIK3CA 또는 PIK3CB) 을 포함한다; 예를 들어, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는, 2011 년 9 월 2 일에 출원한 미국 가출원 번호 61/530,621 참조.
특정 구현예에서, 본 발명은 세포 추출물에서 하나 이상 (예를 들어 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 이상) 의 추가적인 분석물의 발현 수준 (예를 들어 총량) 및/또는 활성화 수준 (예를 들어 인산화 또는 복합체 형성 수준) 을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상 (예를 들어 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 이상) 의 추가적인 분석물은 수용체 티로신 키나아제, 비-수용체 티로신 키나아제, 티로신 키나아제 신호화 캐스케이드 성분, 핵 호르몬 수용체, 핵 수용체 보조활성화제, 핵 수용체 억제제 및 이의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 신호 전달 분자를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 세포 추출물에서의 하기 추가적 분석물 중 하나 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 개 이상의 임의의 조합의 발현 수준 (예를 들어 총량) 및/또는 활성화 수준 (예를 들어 인산화 또는 복합체 형성 수준) 을 측정하는 것을 추가로 포함한다: HER4, MEK, PTEN, SGK3, 4E-BP1, PDK1, PDK2, GSK-3β, Raf, SRC, NFkB-IkB, mTOR, EPH-A, EPH-B, EPH-C, EPH-D, FLT-3, TIE-1, TIE-2, c-FMS, Abl, FTL 3, RET, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, ER, PR, NCOR, AIB1, RON, PIP2, PIP3, p27, 단백질 티로신 포스파타아제 (예를 들어 PTP1B, PTPN13, BDP1 등), 수용체 이량체 및 이의 조합.
신호 전달 분자와 같은 분석물의 총 발현 및 활성화 (예를 들어 인산화) 수준은 임의의 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 암세포의 세포 추출물과 같은 샘플 중 신호 전달 분자와 같은 분석물의 발현 및/또는 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태는 본원에 기재된 바와 같은 단일 검출 검정 또는 근접성 이중 검출 검정 (예를 들어 CEERTM) 과 같은 면역검정으로 검출된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 발현 (예를 들어 총) 수준을 측정하는 것은 하기를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 포획 항체 (예를 들어 하나 이상의 분석물에 대해 특이적인 포획 항체) 의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 포획 분석물을 형성시킴, 이때 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에서 제지됨 (예를 들어 세포 추출물에 존재하는 분석물을 분석물 및 포획 항체를 포함하는 포획된 분석물의 복합체로 변형시킴);
(ii) 다수의 포획된 분석물을 상응하는 분석물에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체 (예를 들어 하나 이상의 분석물에 대해 특이적인 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체) 를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여, 다수의 검출가능한 포획된 분석물을 형성시킴 (예를 들어 포획된 분석물의 복합체를 포획된 분석물 및 검출 항체를 포함하는 검출가능한 포획된 분석물의 복합체로 변형시킴),
이때, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분 (moiety) 으로 표지되고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 상기 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(iii) 다수의 검출가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출함.
특정한 다른 구현예에서, 절두형 수용체 (예를 들어 p95HER2) 인 하나 이상의 분석물의 발현 (예를 들어 총) 수준을 검출하는 것은 하기를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 함;
(ii) 세포 추출물로부터 다수의 비드를 제거하여, 그로써 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 를 제거하여 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 가 없는 세포 추출물을 형성시킴 (예를 들어 세포 추출물을 특정 전체 길이 수용체 또는 전체 길이 수용체 부류가 없는 세포 추출물로 변형시킴);
(iii) 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 가 없는 세포 추출물을 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 포획 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 포획된 절두형 수용체를 형성시킴, 이때 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에서 제지됨 (예를 들어 전체 길이 수용체-고갈 세포 추출물에 존재하는 절두형 수용체를 절두형 수용체 및 포획 항체의 복합체로 변형시킴);
(iv) 다수의 포획된 절두형 수용체를 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 ICD 결합 부위에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 형성시킴 (예를 들어 포획된 절두형 수용체의 복합체를 포획된 절두형 수용체 및 검출 항체를 포함하는 검출가능한 포획된 절두형 수용체의 복합체로 변형시킴),
이때, 상기 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 상기 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(v) 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출함.
제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 직접 표지될 수 있거나 촉진 부분으로 간접적으로, 예를 들어 제 1 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드와 촉진 부분에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화를 통해 표지될 수 있다. 유사하게, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지될 수 있거나 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접적으로, 예를 들어 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원과 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해 표지될 수 있다. 특정한 경우, 결합 쌍의 제 1 일원은 비오틴이고 결합 쌍의 제 2 일원은 아비딘 예컨대 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이다.
일부 구현예에서, 촉진 부분은 예를 들어 글루코오스 옥시다아제일 수 있다. 특정한 경우, 예를 들어 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 16-17 에서 기재된 바와 같이 글루코오스 옥시다아제 및 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자는 통상 분자량이 약 500kDa (예를 들어 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 또는 750kDa) 이다. 다른 구현예에서, 산화제는 예를 들어 과산화수소 (H2O2) 일 수 있다. 다른 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 예를 들어 퍼옥시다아제 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 일 수 있다. 추가 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은 예를 들어 티라미드 시약 (예를 들어 비오틴-티라미드) 일 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 신호는 비오틴-티라미드의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어, 활성화된 티라미드를 생성시킨다 (예를 들어 비오틴-티라미드를 활성화된 티라미드로 변형시킴). 활성화된 티라미드는 예를 들어 신호 검출 시약 첨가시, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 신호 검출 시약의 비제한적 예는 스트렙타비딘-표지된 형광발색단, 및 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다아제 및 발색 시약 예컨대 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 의 조합을 포함한다.
특정한 경우, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자는 통상 분자량이 약 70kDa (예를 들어 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100kDa) 이다.
절두형 수용체는 통상 전체 길이 수용체의 단편이며 전체 길이 수용체와 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위를 공유한다. 특정 구현예에서, 전체 길이 수용체는 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위를 포함한다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않고, 절두형 수용체는 전체 길이 수용체의 ECD 의 단백질 분해 처리를 통하거나 막관통 도메인의 이전, 이내 또는 이후에 위치하는 메티오닌 잔기로부터의 대안적 번역 개시에 의해 발생하여, 예를 들어 단축된 ECD 를 갖는 절두형 수용체 또는 막-연관 또는 시토졸 ICD 단편을 포함하는 절두형 수용체를 생성시킬 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 절두형 수용체는 p95HER2 이며 상응하는 전체 길이 수용체는 HER2 이다. 그러나, 당업자는 절두형 단백질을 검출하기 위한 본원에 기재된 방법을, EGFR VIII 돌연변이체 (교모세포종, 대장암 등에 연관됨), 기타 절두형 수용체 티로신 키나아제, 카스파아제 등을 비제한적으로 포함하는 수많은 상이한 단백질에 적용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 12 는, 우수한 동적 범위를 갖는 다중사용 (multiplex), 고산출량, 근접성 이중 검출 마이크로어레이 ELISA 를 사용하여 세포에서 절두형 수용체 예컨대 p95HER2 를 검출하기 위한 본 발명의 검정 방법의 예시적인 구현예를 제공한다.
일부 구현예에서, ECD 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하는데, 스트렙타비딘이 비드에 부착되고 비오틴이 항체에 부착된다. 특정한 경우, 항체는 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 ECD 결합 부위에 대해 특이적이다.
일부 구현예에서, 포획 항체의 각각의 희석물 시리즈는 하향 포획 항체 농도의 시리즈를 포함한다. 특정한 경우, 포획 항체는 적어도 2-배 (예를 들어 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 또는 1000-배) 로 연속 희석되어, 어레이에 스포팅되는 정해진 수 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 이상) 의 하향 포획 항체 농도를 포함하는 희석물 시리즈가 생성된다. 바람직하게는, 각 포획 항체 희석물의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개 복제물이 어레이에 스포팅된다.
다른 구현예에서, 고체 지지체는 유리 (예를 들어 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막 (예를 들어 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 니트로셀룰로오스 중합체로 코팅된 유리 슬라이드 예컨대 Whatman Inc. (Florham Park, NJ) 에서 시판되는 FAST® 슬라이드 상에서 제지된다 (예를 들어 공유 또는 비공유 상호작용을 통해). 본 발명에서 사용하기에 적합한 항체 어레이를 구축하기 위한 예시적 방법이 예를 들어 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 에 기재되어 있다.
추가 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 측정하는 것은 검출할 각각의 분석물의 인산화된 형태에 대해 특이적인 항체로 세포 추출물 중 하나 이상의 분석물의 인산화 수준을 검출하는 것을 포함한다.
인산화 수준 및/또는 상태는 임의의 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 인산화된 단백질이 단백질의 인산화된 형태를 특이적으로 인지하는 항체를 사용하는 면역검정을 통해 검출될 수 있다는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, Lin et al., Br. J. Cancer, 93:1372-1381 (2005) 참조). 면역검정은 일반적으로 면역블로팅 (예를 들어 웨스턴 블로팅), RIA 및 ELISA 를 포함한다. 면역검정의 보다 특이적인 유형은 항원 포획/항원 경쟁, 항체 포획/항원 경쟁, 2-항체 샌드위치, 항체 포획/항체 과다 및 항체 포획/항원 과다를 포함한다. 항체를 생성하는 방법은 본원 및 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA] 에 기재되어 있다. 포스포-특이적 항체는 새로이 (de novo) 생성될 수 있거나 시판 또는 비-시판 공급원으로부터 수득될 수 있다. 인산화 수준 및/또는 상태는 또한 [γ-32P]ATP 또는 [γ-33P]ATP 의 형태로 방사성 포스페이트를 사용하여 대사적 표지 세포에 의해 측정될 수 있다. 인산화된 단백질은 방사성이 되며 따라서 소결 계수, 라디오그래피 등을 통해 추적가능하고 정량가능하다 (예를 들어 Wang et al., J. Biol. Chem., 253:7605-7608 (1978) 참조). 예를 들어, 대사적으로 표지된 단백질은 세포로부터 추출되고, 겔 전기영동에 의해 분리되고, 막에 옮겨지고, 특정 분석물에 대해 특이적인 항체로 탐침되고, 오토라디오그래피 처리되어 32P 또는 33P 를 검출할 수 있다. 대안적으로, 겔은 막 이동 및 항체 탐침 전에 오토라디오그래피 처리될 수 있다.
특정 구현예에서, 샘플에서의 하나 이상의 분석물 각각의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준 및/또는 상태는 본원에 기재된 바와 같은 면역검정 예컨대 단일검출 검정 또는 근접성 이중 검출 검정 (예를 들어 공동 효소 증강 반응성 면역검정 (CEER)) 으로 검출된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준을 측정하는 것은 하기를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 포획 항체 (예를 들어 하나 이상의 분석물에 대해 특이적인 포획 항체) 의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 포획 분석물을 형성시킴, 이때 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에서 제지됨 (예를 들어 세포 추출물에 존재하는 분석물을 분석물 및 포획 항체를 포함하는 포획된 분석물의 복합체로 변형시킴);
(ii) 다수의 포획된 분석물을 상응하는 분석물에 대해 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체 (예를 들어 하나 이상의 분석물에 대해 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체) 및 상응하는 분석물에 대해 특이적인 활성화 상태-의존적 항체 (예를 들어 하나 이상의 분석물에 대해 특이적인 활성화 상태-의존적 항체) 를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여, 다수의 검출가능한 포획된 분석물을 형성시킴 (예를 들어 포획된 분석물의 복합체를 포획된 분석물 및 검출 항체를 포함하는 검출가능한 포획된 분석물의 복합체로 변형시킴),
이때, 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 상기 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(iii) 다수의 검출가능한 포획된 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출함.
특정한 다른 구현예에서, 절두형 수용체 (예를 들어 p95HER2) 인 하나 이상의 분석물의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준을 측정하는 것은 하기를 포함한다:
(i) 세포로부터 생성된 세포 추출물을 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 함;
(ii) 세포 추출물로부터 다수의 비드를 제거하여, 그로써 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 를 제거하여 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 가 없는 세포 추출물을 형성시킴 (예를 들어 세포 추출물을 특정 전체 길이 수용체 또는 전체 길이 수용체 부류가 없는 세포 추출물로 변형시킴);
(iii) 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 가 없는 세포 추출물을 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 포획 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 포획된 절두형 수용체를 형성시킴, 이때 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에서 제지됨 (예를 들어 전체 길이 수용체-고갈 세포 추출물에 존재하는 절두형 수용체를 절두형 수용체 및 포획 항체의 복합체로 변형시킴);
(iv) 다수의 포획된 절두형 수용체를 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 ICD 결합 부위에 대해 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체 및 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 형성시킴 (예를 들어 포획된 절두형 수용체의 복합체를 포획된 절두형 수용체 및 검출 항체를 포함하는 검출가능한 포획된 절두형 수용체의 복합체로 변형시킴),
이때, 상기 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 상기 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(v) 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들어 접촉) 하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭된 신호를 검출함.
활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 직접 표지될 수 있거나 촉진 부분으로 간접적으로, 예를 들어 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드와 촉진 부분에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 사이의 하이브리드화를 통해 표지될 수 있다. 유사하게, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지될 수 있거나 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접적으로, 예를 들어 활성화 상태-의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원과 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해 표지될 수 있다. 특정한 경우, 결합 쌍의 제 1 일원은 비오틴이고 결합 쌍의 제 2 일원은 아비딘 예컨대 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘이다.
일부 구현예에서, 촉진 부분은 예를 들어 글루코오스 옥시다아제일 수 있다. 특정한 경우, 예를 들어 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 16-17 에서 기재된 바와 같이 글루코오스 옥시다아제 및 활성화 상태-비의존적 항체는 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자는 통상 분자량이 약 500kDa (예를 들어 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 또는 750kDa) 이다. 다른 구현예에서, 산화제는 예를 들어 과산화수소 (H2O2) 일 수 있다. 다른 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 예를 들어 퍼옥시다아제 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 일 수 있다. 추가 구현예에서, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은 예를 들어 티라미드 시약 (예를 들어 비오틴-티라미드) 일 수 있다. 바람직하게는, 증폭된 신호는 비오틴-티라미드의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어, 활성화된 티라미드를 생성시킨다 (예를 들어 비오틴-티라미드를 활성화된 티라미드로 변형시킴). 활성화된 티라미드는 예를 들어 신호 검출 시약 첨가시, 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 신호 검출 시약의 비제한적 예는 스트렙타비딘-표지된 형광발색단, 및 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다아제 및 발색 시약 예컨대 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 의 조합을 포함한다.
특정한 경우, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 및 활성화 상태-의존적 항체는 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자에 접합될 수 있다. 술프히드릴-활성화 덱스트란 분자는 통상 분자량이 약 70kDa (예를 들어 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100kDa) 이다.
절두형 수용체는 통상 전체 길이 수용체의 단편이며 전체 길이 수용체와 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위를 공유한다. 특정 구현예에서, 전체 길이 수용체는 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위, 막관통 도메인 및 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위를 포함한다. 어떠한 특정 이론에도 얽매이지 않고, 절두형 수용체는 전체 길이 수용체의 ECD 의 단백질 분해 처리를 통하거나 막관통 도메인의 이전, 이내 또는 이후에 위치하는 메티오닌 잔기로부터의 대안적 번역 개시에 의해 발생하여, 예를 들어 단축된 ECD 를 갖는 절두형 수용체 또는 막-연관 또는 시토졸 ICD 단편을 포함하는 절두형 수용체를 생성시킬 수 있다.
특정 바람직한 구현예에서, 절두형 수용체는 p95HER2 이며 상응하는 전체 길이 수용체는 HER2 이다. 그러나, 당업자는 절두형 단백질을 검출하기 위한 본원에 기재된 방법을, EGFR VIII 돌연변이체 (교모세포종, 대장암 등에 연관됨), 기타 절두형 수용체 티로신 키나아제, 카스파아제 등을 비제한적으로 포함하는 수많은 상이한 단백질에 적용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 12 는, 우수한 동적 범위를 갖는 다중사용, 고산출량, 근접성 이중 검출 마이크로어레이 ELISA 를 사용하여 세포에서 절두형 수용체 예컨대 p95HER2 를 검출하기 위한 본 발명의 검정 방법의 예시적인 구현예를 제공한다.
일부 구현예에서, ECD 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하는데, 스트렙타비딘이 비드에 부착되고 비오틴이 항체에 부착된다. 특정한 경우, 항체는 전체 길이 수용체 (예를 들어 전체 길이 HER2) 의 ECD 결합 부위에 대해 특이적이다.
일부 구현예에서, 포획 항체의 각각의 희석물 시리즈는 하향 포획 항체 농도의 시리즈를 포함한다. 특정한 경우, 포획 항체는 적어도 2-배 (예를 들어 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500 또는 1000-배) 로 연속 희석되어,어레이에 스포팅되는 정해진 수 (예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 이상) 의 하향 포획 항체 농도를 포함하는 희석물 시리즈가 생성된다. 바람직하게는, 각 포획 항체 희석물의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6 개 복제물이 어레이에 스포팅된다.
다른 구현예에서, 고체 지지체는 유리 (예를 들어 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막 (예를 들어 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 기타 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 니트로셀룰로오스 중합체로 코팅된 유리 슬라이드 예컨대 Whatman Inc. (Florham Park, NJ) 에서 시판되는 FAST® 슬라이드 상에서 제지된다 (예를 들어 공유 또는 비공유 상호작용을 통해). 본 발명에서 사용하기에 적합한 항체 어레이를 구축하기 위한 예시적 방법이 예를 들어 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 에 기재되어 있다.
IV . 단일 검출 검정
일부 구현예에서, 세포의 세포 추출물에서 관심 대상인 하나 이상의 분석물의 발현 및/또는 활성화 수준을 검출하기 위한 검정은 우수한 동적 범위를 갖는 다중사용, 고산출량 2-항체 검정이다. 비제한적인 예로서, 검정에서 사용한 2 개 항체는 하기를 포함할 수 있다: (1) 관심의 특정 분석물에 대해 특이적인 포획 항체; 및 (2) 분석물의 활성화된 형태에 대해 특이적인 검출 항체 (즉, 활성화 상태-의존적 항체). 활성화 상태-의존적 항체는 예를 들어 분석물의 인산화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태를 검출할 수 있다. 대안적으로, 검출 항체는 세포 추출물 내 분석물의 총량을 검출하는 활성화 상태-비의존적 항체를 포함한다. 활성화 상태-비의존적 항체는 일반적으로 활성화 및 비활성화 형태 모두의 분석물을 검출할 수 있다.
한 특정 구현예에서, 관심의 분석물의 발현 또는 활성화 수준을 검출하기 위한 2-항체 검정은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획 분석물을 형성시킴;
(ii) 다수의 포획 분석물을 상응하는 분석물에 대해 특이적인 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획 분석물을 형성시킴, 이때 검출 항체는 분석물의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-의존적 항체 또는 분석물의 발현 수준 (예를 들어 총량) 을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체를 포함함;
(iii) 다수의 검출가능한 포획 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원과 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
본원에 기재된 2-항체 검정은 통상 상이한 위치부여가능 장소에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 포획 항체 농도 범위에서 다수의 상이한 포획 항체를 포함하는 항체-기반 어레이이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 고체 지지체의 예는 상기 기재되어 있다.
포획 항체 및 검출 항체는 바람직하게는 분석물 결합에 대하여 이들 사이의 경쟁이 최소화되도록 선택된다 (즉, 포획 및 검출 항체 모두는 그의 상응하는 신호 전달 분자에 동시에 결합할 수 있음).
한 구현예에서, 검출 항체는 결합 쌍의 제 1 일원 (예를 들어 비오틴) 을 포함하며 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 결합 쌍의 제 2 일원 (예를 들어 스트렙타비딘) 을 포함한다. 결합 쌍 일원은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 검출 항체 또는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 특정한 경우, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 퍼옥시다아제 (예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 카탈라아제, 클로로퍼옥시다아제, 시토크롬 c 퍼옥시다아제, 호산구 퍼옥시다아제, 글루타티온 퍼옥시다아제, 락토퍼옥시다아제, 미엘로퍼옥시다아제, 갑상선 퍼옥시다아제, 데이오디나아제 등) 이고, 신호 증폭 쌍의 제 2 일원은 티라미드 시약 (예를 들어 비오틴-티라미드) 이다. 이러한 경우, 증폭된 신호는 티라미드 시약의 퍼옥시다아제 산화에 의해 생성되어, 과산화수소 (H2O2) 의 존재 하 활성화된 티라미드를 생성시킨다.
활성화된 티라미드는 직접 검출되거나 신호-검출 시약 예컨대 스트렙타비딘-표지 형광발색단 또는 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물 첨가시 검출된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 형광발색단의 예는 비제한적으로, Alexa Fluor® 염료 (예를 들어 Alexa Fluor® 555), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon GreenTM; 로다민, 텍사스 레드 (Texas red), 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDyeTM 플루오로 (예를 들어 Cy2, Cy3, Cy5) 등을 포함한다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 형광발색단 또는 퍼옥시다아제에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN) 및/또는 포르피리노겐을 포함한다.
본원에 기재된 2-항체 검정을 수행하기 위한 예시적 프로토콜은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 3 에 제공된다.
2-항체 접근법의 또 다른 구현예에서, 본 발명은 절두형 수용체의 발현 또는 활성화 수준을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드와 함께 인큐베이션함;
(ii) 다수의 비드를 세포 추출물로부터 제거하고, 그로써 전체 길이 수용체를 제거하여 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 형성시킴;
(iii) 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위에 대해 특이적인 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획된 절두형 수용체를 형성시킴;
(iv) 다수의 포획된 절두형 수용체를 전체 길이 수용체의 ICD 결합 부위에 대해 특이적인 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 형성시킴, 이때 검출 항체는 절두형 수용체의 활성화 (예를 들어 인산화) 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-의존적 항체 또는 절두형 수용체의 발현 수준 (예를 들어 총량) 을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체를 포함함;
(v) 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원과 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
특정 구현예에서, 절두형 수용체는 p95HER2 이고 전체 길이 수용체는 HER2 이다. 특정한 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하는데, 비오틴이 비드에 부착되며 비오틴이 항체에 부착된다 (예를 들어 항체는 전체 길이 수용체의 ECD 결합 부위에 대해 특이적임).
모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 개시물인 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 도 14A 는, 관심 대상인 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 에 유도된 항체로 코팅된 비드가 전체 길이 수용체 (예를 들어 HER2) 에 결합하나 절두형 수용체 (예를 들어 p95HER2) 에는 결합하지 않아, 검정으로부터 임의의 전체 길이 수용체가 제거된다는 것을 나타낸다. PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 도 14B 는, 포획 항체에 결합되고 나면, 절두형 수용체 (예를 들어 p95HER2) 가 전체 길이 수용체 (예를 들어 HER2) 의 세포내 도메인 (ICD) 에 대해 특이적인 검출 항체에 의해 검출될 수 있다는 것을 나타낸다. 검출 항체는 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 에 직접적으로 접합될 수 있다. 티라미드 신호 증폭 (TSA) 이 이후 수행되어, 검출될 신호가 생성될 수 있다. 절두형 수용체 (예를 들어 p95HER2) 의 발현 수준 또는 활성화 상태가, 예를 들어 이의 총 농도 또는 이의 인산화 상태, 유비퀴틴화 상태 및/또는 복합체화 상태가 측정되도록 규문될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 상기 기재한 2-항체 검정을 수행하기 위한 키트를 제공한다: (a) 고체 지지체 상에 제지된 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈; 및 (b) 하나 또는 다수의 검출 항체 (예를 들어 활성화 상태-비의존적 항체 및/또는 활성화 상태-의존적 항체). 일부 경우, 키트는 종양 세포와 같은 세포의 하나 또는 다수의 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 상태를 검출하기 위해 키트를 사용하는 방법에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원, 티라미드 신호 증폭 시약, 세척 완충액 등과 같은 본 발명의 특정 방법을 수행하는 것에 대한 상기 기재한 임의 추가적인 시약을 포함할 수 있다.
V. 근접성 이중 검출 검정
일부 구현예에서, 종양 세포와 같은 세포의 세포 추출물의 하나 이상의 관심 분석물의 발현 및/또는 활성화 수준을 검출하기 위한 검정은 우수한 동적 범위를 갖는 다중사용, 고산출량 근접성 (즉, 3-항체) 검정이다. 비제한적 예로서, 근접성 검정에서 사용한 3 개의 항체는 하기를 포함할 수 있다: (1) 관심의 특정 분석물에 대해 특이적인 포획 항체; (2) 분석물의 활성화된 형태에 대해 특이적인 검출 항체 (즉, 활성화 상태-의존적 항체); 및 (3) 분석물의 총량을 검출하는 검출 항체 (즉, 활성화 상태-비의존적 항체). 활성화 상태-의존적 항체는 예를 들어 분석물의 인산화, 유비퀴틴화 및/또는 복합체화 상태를 검출할 수 있는 한편, 활성화 상태-비의존적 항체는 분석물의 총량 (즉, 활성화된 형태 및 비활성화된 형태 모두) 을 검출할 수 있다.
한 특정 구현예에서, 관심 분석물의 활성화 수준 또는 상태를 검출하기 위한 근접성 검정은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획 분석물을 형성시킴;
(ii) 다수의 포획 분석물을 상응하는 분석물에 대해 특이적인, 하나 또는 다수의 활성화 상태-비의존적 항체 및 하나 또는 다수의 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획 분석물을 형성시킴,
이때 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(iii) 다수의 검출가능한 포획 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원와 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
또 다른 특정 구현예에서, 절두형 수용체인 관심 분석물의 활성화 수준 또는 상태를 검출하기 위한 근접성 검정은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드와 인큐베이션함;
(ii) 세포 추출물로부터 다수의 비드를 제거하고, 그로써 전체 길이 수용체를 제거하여 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 형성시킴;
(iii) 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획된 절두형 수용체를 형성시킴;
(iv) 다수의 포획된 절두형 수용체를 전체 길이 수용체의 ICD 결합 부위에 대해 특이적인, 하나 또는 다수의 활성화 상태-비의존적 항체 및 하나 또는 다수의 활성화 상태-의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 형성시킴,
이때 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 활성화 상태-의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(v) 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
특정 구현예에서, 절두형 수용체는 p95HER2 이며 전체 길이 수용체는 HER2 이다. 특정한 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하는데, 비오틴이 비드에 부착되고 비오틴이 항체에 부착된다 (예를 들어 상기 항체는 전체 길이 수용체의 ECD 결합 부위에 대해 특이적임).
대안적 구현예에서, 활성화 상태-의존적 항체는 촉진 부분으로 표지될 수 있으며 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지될 수 있다.
또 다른 비제한적 예로서, 근접성 검정에서 사용한 3 개 항체는 하기를 포함할 수 있다: (1) 특정한 관심 분석물에 대해 특이적인 포획 항체; (2) 분석물의 총량을 검출하는 제 1 검출 항체 (즉, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체); 및 (3) 분석물의 총량을 검출하는 제 2 검출 항체 (즉, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체). 바람직한 구현예에서, 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 분석물 상의 상이한 (예를 들어 별개의) 에피토프를 인지한다.
한 특정 구현예에서, 관심 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 근접성 검정은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획 분석물을 형성시킴;
(ii) 다수의 포획 분석물을 상응하는 분석물에 대해 특이적인, 하나 또는 다수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획 분석물을 형성시킴,
이때 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 증폭되며, 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(iii) 다수의 검출가능한 포획 분석물을 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(iv) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
또 다른 특정 구현예에서, 절두형 수용체의 관심 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 근접성 검정은 하기를 포함한다:
(i) 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드와 함께 인큐베이션함;
(ii) 세포 추출물로부터 다수의 비드를 제거하고, 그로써 전체 길이 수용체를 제거하여 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 형성시킴;
(iii) 전체 길이 수용체가 없는 세포 추출물을 전체 길이 수용체의 세포내 도메인 (ICD) 결합 부위에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 포획 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 포획된 절두형 수용체를 형성시킴;
(iv) 다수의 포획된 절두형 수용체를 전체 길이 수용체의 ICD 결합 부위에 대해 특이적인 하나 또는 다수의 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체를 포함하는 검출 항체와 함께 인큐베이션하여 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 형성시킴,
이때 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지되고, 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지되며, 촉진 부분은 산화제를 생성하여 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 보내지며 이와 반응함;
(v) 다수의 검출가능한 포획된 절두형 수용체를 신호 증폭 쌍의 제 2 일원과 함께 인큐베이션하여 증폭된 신호를 생성함; 및
(vi) 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원으로부터 생성된 증폭 신호를 검출함.
특정 구현예에서, 절두형 수용체는 p95HER2 이고 전체 길이 수용체는 HER2 이다. 특정한 다른 구현예에서, 세포외 도메인 (ECD) 결합 부위에 대해 특이적인 다수의 비드는 스트렙타비딘-비오틴 쌍을 포함하는데, 비오틴이 비드에 부착되고 비오틴이 항체에 부착된다 (예를 들어 상기 항체는 전체 길이 수용체의 ECD 결합 부위에 대해 특이적임).
대안적 구현예에서, 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 표지될 수 있으며 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 표지될 수 있다.
본원에서 기재된 근접성 검정은 통상 상이한 위치부여가능 장소에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 포획 항체 농도 범위에서 하나 또는 다수의 상이한 포획 항체를 포함하는 항체-기반 어레이이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 고체 지지체의 예는 상기에 기재되어 있다.
포획 항체, 활성화 상태-비의존적 항체 및 활성화 상태-의존적 항체는 바람직하게는 분석물 결합에 관하여 이들 사이의 경쟁이 최소화되도록 선택된다 (즉, 모든 항체는 그의 상응하는 신호 전달 분자에 동시에 결합할 수 있음).
일부 구현예에서, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체, 또는 대안적으로는, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 검출가능한 부분을 추가로 포함한다. 이러한 경우, 검출가능한 부분의 양은 세포 추출물 내 하나 이상의 분석물의 양에 대해 상관관계가 있다. 검출가능한 부분의 예는 비제한적으로, 형광 표지, 화학적 반응성 표지, 효소 표지, 방사성 표지 등을 포함한다. 바람직하게는, 검출가능한 부분은 형광발색단 예컨대 Alexa Fluor® 염료 (예를 들어 Alexa Fluor® 647), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon GreenTM; 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDyeTM 플루오르 (예를 들어 Cy2, Cy3, Cy5) 등이다. 검출가능한 부분은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존적 항체에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다.
특정한 경우, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체, 또는 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 촉진 부분으로 직접 표지된다. 촉진 부분은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진 부분은 산화제를 생성할 수 있으며 이것이 촉진 부분에 근접한 또 다른 분자에 보내지며 (즉, 이에 유도됨) 이와 반응하는 (즉, 이에 결합하고, 이에 의해 결합되어지거나, 이와 복합체를 형성함), 임의의 분자를 포함한다. 촉진 부분의 예는 제한없이, 효소 예컨대 글루코오스 옥시다아제 또는 전자 수용체로서 분자 산소 (O2) 를 포함하는 산화/환원 반응을 촉매화하는 임의의 다른 효소, 및 광감작제 예컨대 메틸렌 블루, 로즈 벵갈 (rose bengal), 포르피린, 스쿠아레이트 염료, 프탈로시아닌 등을 포함한다. 산화제의 비제한적인 예는 과산화수소 (H2O2), 일중항 산소, 및 산화/환원 반응에서 전자를 얻거나 산소 원자를 전달하는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 적합한 기질 (예를 들어 글루코오스, 광 등) 의 존재 하에, 촉진 부분 (예를 들어 글루코오스 옥시다아제, 광감작제 등) 은 산화제 (예를 들어 과산화수소 (H2O2), 일중항 산소 등) 를 생성시켜, 이것이 신호 증폭 쌍의 제 1 일원 (예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 보호기에 의해 보호된 합텐, 효소 저해제에 대한 티오에테르 결합에 의해 불활성화된 효소 등) 에 보내지며 이와 반응한다 (2 개 부분이 서로 근접하게 존재하는 경우).
특정한 다른 경우, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체, 또는 대안적으로, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 제 1 활성화 상태-비의존적 항체는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커와 촉진 부분에 접합된 상보적 올리고뉴클레오티드 링커 사이의 하이브리드화를 통해 촉진 부분으로 간접적으로 표지된다. 올리고뉴클레오티드 링커는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 촉진 부분 또는 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 촉진 부분에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 올리고뉴클레오티드 링커에 대해 100% 상보성을 갖는다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커 쌍은 예를 들어 엄격한 하이브리드화 조건 하에 하이브리드화시, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 미스매치 부위를 포함한다. 당업자는 상이한 분석물에 대해 특이적인 활성화 상태-비의존적 항체가 동일한 올리고뉴클레오티드 링커 또는 상이한 올리고뉴클레오티드 링커에 접합될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
촉진 부분 또는 활성화 상태-비의존적 항체에 접합되는 올리고뉴클레오티드 링커의 길이는 가변적일 수 있다. 일반적으로, 링커 서열은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 또는 100 개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 통상, 무작위 핵산 서열이 커플링을 위해 생성된다. 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드 링커의 라이브러리는 3 개의 별개의 인접 도메인; 스페이서 도메인; 시그너쳐 도메인; 및 접합 도메인을 갖는 것으로 설계될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 링커는 이들이 접합되는 촉진 부분 또는 활성화 상태-비의존적 항체의 기능을 파괴하지 않는 효율적인 커플링을 위해 설계된다.
올리고뉴클레오티드 링커 서열은 다양한 검정 조건 하에 임의의 2 차적 구조 형성을 방지하거나 최소화하도록 설계될 수 있다. 용융 온도는 통상, 전체 검정 절차에서 이의 참여가 가능하도록, 링커 내 각각의 조각에 대해 주의깊게 모니터링된다. 일반적으로, 링커 서열 조각의 용융 온도의 범위는 1-10℃ 이다. 용융 온도, 2 차 구조 및 헤어핀 구조 (규정된 이온 농도 하) 를 측정하기 위한 컴퓨터 알고리즘 (예를 들어 OLIGO 6.0) 을 사용하여 각각의 링커 내 3 개의 상이한 도메인 각각을 분석할 수 있다. 전체 조합된 서열은 또한 그의 구조적 특징화 및 그의 다른 접합된 올리고뉴클레오티드 링커 서열에 대한 비교가능성, 예를 들어 엄격한 하이브리드 조건 하에 상보적 올리고뉴클레오티드 링커에 대해 하이브리드될지 여부에 대하여 분석될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커의 스페이서 부위는 올리고뉴클레오티드 가교 부위로부터의 접합 도메인의 적절한 분리를 제공한다. 접합 도메인은 상보적 올리고뉴클레오티드 링커 서열로 표지된 분자를 핵산 하이브리드화를 통해 접합 도메인에 연결시키는 기능을 한다. 핵산-매개 하이브리드화는 항체-분석물 (즉, 항원) 복합체 형성 이전 또는 이후에 수행될 수 있어, 보다 유연한 검정 포맷을 제공한다. 많은 직접 항체 접합 방법과 달리, 상대적으로 작은 올리고뉴클레오티드를 항체 또는 다른 분자에 연결시키는 것은 그의 표적 분석물에 대한 항체의 특이적 친화성 또는 접합된 분자의 기능에 대해 최소의 영향을 갖는다.
일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커의 시그너쳐 서열 도메인은 복합적 다중사용 단백질 검정에서 사용될 수 있다. 다수의 항체가 상이한 시그너쳐 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 링커와 접합될 수 있다. 다중사용 면역검정에서, 적절한 프로브로 표지된 리포터 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여, 다중사용 검정 포맷으로 항체와 그의 항원 사이의 교차-반응성을 검출할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는 여러 상이한 방법을 사용하여 항체 또는 다른 분자에 접합될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 링커는 5' 또는 3' 말단 상의 티올기로 합성될 수 있다. 티올기는 환원제 (예를 들어 TCEP-HCl) 를 사용하여 탈보호될 수 있으며 생성된 링커는 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 생성된 탈보호 올리고뉴클레오티드 링커는 SMCC 와 같은 이종이관능성 교차 링커를 사용하여 항체의 1 차 아민 또는 다른 유형의 단백질에 접합될 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드 상의 5'-포스페이트기는 수용성 카르보디이미드 EDC 로 처리되어 포스페이트 에스테르를 형성한 뒤 아민-함유 분자에 커플링될 수 있다. 특정한 경우, 3'-리보오스 잔기 상의 디올은 알데히드기로 산화된 후, 환원적 아미노화를 사용하여 항체 또는 다른 유형의 단백질의 아민기에 접합될 수 있다. 특정한 다른 경우, 올리고뉴클레오티드 링커는 3' 또는 5' 말단 상에서 비오틴 개질과 함께 합성되고 스트렙타비딘-표지 분자에 접합될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는, Usman et al., J. Am. Chem. Soc., 109:7845 (1987); Scaringe et al., Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al., Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott et al., Methods Mol. Bio., 74:59 (1997) 에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 임의의 다양한 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 합성에서는 통상적인 핵산 보호기 및 커플링기, 예컨대 5'-말단에서의 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서의 포스포르아미디트를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 적합한 시약, 핵산 탈보호 방법, 및 핵산 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
특정한 경우, 하나 이상의 분석물의 활성화 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-의존적 항체, 또는 대안적으로는, 하나 이상의 분석물의 발현 수준을 검출하기 위한 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 직접 표지된다. 신호 증폭 쌍 일원은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 활성화 수준을 검출하기 위해 활성화 상태-의존적 항체에, 또는 발현 수준을 검출하기 위해 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 특정한 다른 경우, 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체는 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 접합된 결합 쌍의 제 1 일원과 신호 증폭 쌍의 제 1 일원에 접합된 결합 쌍의 제 2 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭 쌍의 제 1 일원으로 간접적으로 표지된다. 결합 쌍 일원 (예를 들어 비오틴/스트렙타비딘) 은 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 신호 증폭 쌍 일원 또는 활성화 상태-의존적 항체 또는 제 2 활성화 상태-비의존적 항체에 커플링될 수 있다. 신호 증폭 쌍 일원의 예는 비제한적으로, 퍼옥시다아제 예컨대 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP), 카탈라아제, 클로로퍼옥시다아제, 시토크롬 c 퍼옥시다아제, 호산구 퍼옥시다아제, 글루타티온 퍼옥시다아제, 락토퍼옥시다아제, 미엘로퍼옥시다아제, 갑상선 퍼옥시다아제, 데이오디나아제 등을 포함한다. 신호 증폭 쌍 일원의 다른 예는 보호기에 의해 보호된 합텐 및 효소 저해제에 대한 티오에테르 연결에 의해 불활성화된 효소를 포함한다.
근접 채널링의 한 예에서, 촉진 부분은 글루코오스 옥시다아제 (GO) 이고 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (HRP) 이다. GO 가 글루코오스와 같은 기질과 접촉되는 경우, 이는 산화제 (즉, 과산화수소 (H2O2)) 를 생성한다. HRP 가 GO 에 대한 근접 채널링 내에 있는 경우, GO 에 의해 생성된 H2O2 는 HRP 에 보내지며 이와 복합체화되어 HRP-H2O2 복합체가 형성되어, 이는 신호 증폭 쌍의 제 2 일원 (예를 들어 화학발광 기질 예컨대 루미놀 또는 이소루미놀 또는 형광원성 기질 예컨대 티라미드 (예를 들어 비오틴-티라미드), 호모바닐린산 또는 4-히드록시페닐 아세트산) 의 존재 하에, 증폭된 신호를 생성한다. 근접성 검정에서 GO 및 HRP 를 사용하는 방법은 예를 들어 [Langry et al., U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID-136797 (1999)] 에 기재되어 있다. 비오틴-티라미드가 신호 증폭 쌍의 제 2 일원으로서 사용되는 경우, HRP-H2O2 복합체는 티라미드를 산화하여, 친핵성 잔기 근처에 공유 결합하는 반응성 티라미드 라디칼을 생성한다. 활성화된 티라미드는 직접 검출되거나, 신호-검출 시약 예컨대 스트렙타비딘-표지 형광발색단 또는 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다아제 및 발색 시약의 조합물 첨가시 검출된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 형광발색단의 예는 비제한적으로, Alexa Fluor® 염료 (예를 들어 Alexa Fluor® 555), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon GreenTM, 로다민, 텍사스 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDyeTM 플루오르 (예를 들어 Cy2, Cy3, Cy5) 등을 포함한다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 형광발색단 또는 퍼옥시다아제에 직접 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발색 시약의 비제한적 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조테아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1-나프톨 (4CN) 및/또는 포르피리노겐을 포함한다.
근접 채널링의 또 다른 예에서, 촉진 부분은 광감작제이고 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 특이적 결합 파트너 (예를 들어 리간드, 항체 등) 에 대한 합텐의 결합을 방지하는 보호기로 보호되는 다수의 합텐으로 표지된 거대 분자이다. 예를 들어, 신호 증폭 쌍 일원은 보호된 비오틴, 쿠마린 및/또는 플루오레세인 분자로 표지된 덱스트란 분자일 수 있다. 적합한 보호기는 비제한적으로, 페녹시-, 아닐리노-, 올레핀-, 티오에테르- 및 셀레노에테르-보호기를 포함한다. 본 발명의 근접성 검정에서 사용하기에 적합한 추가적인 광감작제 및 보호된 합텐 분자는 미국 특허 번호 5,807,675 에 기재되어 있다. 광감작제가 빛으로 여기될 때, 이는 산화제 (즉, 일중항 산소) 를 생성한다. 합텐 분자가 광감작제에 대한 근접 채널링 내에 존재하는 경우, 광감작제에 의해 생성된 일중항 산소는 합텐의 보호기 상의 티오에테르에 보내지며 이와 반응하여, 카르보닐기 (케톤 또는 알데히드) 및 술핀산이 수득되어, 합텐으로부터 보호기가 방출된다. 비보호된 합텐은 신호 증폭 쌍의 제 2 일원 (예를 들어 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 결합 파트너) 에 특이적으로 결합하도록 이용가능하다. 예를 들어, 합텐이 비오틴인 경우, 특이적 결합 파트너는 효소-표지된 스트렙타비딘일 수 있다. 예시적 효소는 알칼리 포스페이트, β-갈락토시다아제, HRP 등을 포함한다. 결합하지 않은 시약을 제거하기 위해 세척한 후, 검출가능한 신호는 효소의 검출가능한 (예를 들어 형광, 화학발광, 발색 등) 기질을 첨가하여 생성될 수 있으며 당업계에 공지된 적합한 방법 및 기기 장치를 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 신호는 티라미드 신호 증폭을 사용하여 증폭될 수 있으며 활성화된 티라미드는 상기 기재한 바와 같이 직접 검출되거나 신호-검출 시약 첨가시 검출된다.
또 다른 근접 채널링의 예에서, 촉진 부분은 광감작제이고 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 효소-저해체 복합체이다. 효소 및 저해제 (예를 들어 포스폰산-표지 덱스트란) 는 절단가능 링커 (예를 들어 티오에테르) 에 의해 함께 연결된다. 광감작제가 빛으로 여기될 때, 이는 산화제 (즉, 일중항 산소) 를 생성한다. 효소-저해제 복합체가 광감작제에 근접한 채널링 내에 존재하는 경우, 광감작제에 의해 생성된 일중항 산소는 절단가능 링커에 보내지며 이와 반응하여, 효소로부터 저해제가 방출되고, 그로써 효소가 활성화된다. 효소 기질이 첨가되어 검출가능한 신호가 생성되거나, 대안적으로, 증폭 시약이 첨가되어 증폭된 신호가 생성된다.
근접 채널링의 추가 예에서, 촉진 부분은 HRP 이고, 신호 증폭 쌍의 제 1 일원은 상기 기재한 바와 같은 보호된 합텐 또는 효소-저해제 복합체이며, 보호기는 p-알콕시 페놀을 포함한다. 페닐렌디아민 및 H2O2 의 첨가는 반응성 페닐렌 디이민을 생성시켜, 이것이 보호된 합텐 또는 효소-저해제 복합체에 보내지며 p-알콕시 페놀 보호기와 반응하여, 노출된 합텐 또는 반응성 효소가 수득된다. 증폭된 신호가 생성되며 상기 기재한 바와 같이 검출된다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,532,138 및 5,445,944 참조).
본원에 기재된 근접성 검정을 수행하기 위한 예시적 프로토콜이, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2009/108637 의 실시예 4 에 제공된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 상기 기재한 근접성 검정을 수행하기 위한 키트를 제공한다: (a) 고체 지지체 상에 제지된 포획 항체의 하나 또는 다수의 희석물 시리즈; 및 (b) 하나 또는 다수의 검출 항체 (예를 들어 활성화 수준을 검출하기 위한 활성화 상태-비의존적 항체 및 활성화 상태-의존적 항체의 조합 및/또는 발현 수준을 검출하기 위한 제 1 및 제 2 활성화 상태-비의존적 항체의 조합). 일부 경우, 키트는 종양 세포와 같은 세포의 하나 또는 다수의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 상태를 검출하기 위해 키트를 사용하는 방법에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 또한 신호 증폭 쌍의 제 1 및 제 2 일원, 티라미드 신호 증폭 시약, 촉진 부분에 대한 기질, 세척 완충액 등과 같은 본 발명의 특정 방법을 수행하는 것에 대한 상기 기재한 임의 추가적인 시약을 포함할 수 있다.
VI. 유전자형 분석 방법
다양한 수단을 KRAS, BRAF, PIK3CA, 및/또는 EGFR 유전자와 같은 발암유전자에서의 다형성 부위에서 개인을 유전자형 분석하는데 사용하여, 샘플 (예를 들어 핵산 샘플) 이 특이적인 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형을 함유하는지 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어, 개인으로부터 핵산의 효소적 증폭을 편리하게 사용하여, 후속 분석을 위한 핵산을 수득할 수 있다. 하나 이상의 관심 발암유전자에서의 특이적인 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재는 또한 효소적 증폭 없이 개인의 핵산으로부터 직접 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 개인은 하나 이상의 관심 발암유전자에서의 1, 2, 3, 4, 5 이상의 다형성 부위 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 에서 유전자형 분석된다.
증폭되었는지 여부에 대한 개인으로부터의 핵산의 유전자형 분석은 임의의 다양한 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 유용한 기법에는 비제한적으로, 검정 예컨대 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 분석 검정, 서열 분석 검정, 전기영동 분석 검정, 제한 길이 다형성 분석 검정, 하이브리드화 분석 검정, 대립형질-특이적 하이브리드화, 올리고뉴클레오티드 라이게이션 대립형질-특이적 연장/라이게이션, 대립형질-특이적 증폭, 단일-염기 확장, 분자적 역위 프로브 (molecular inversion probe), 침습적 절단, 선택적 종결, 제한 길이 다형성, 서열분석, 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP), 단일 가닥 사슬 다형성, 미스매치-절단 및 변성 구배 겔 전기영동이 포함되며, 이들 모두는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용한 바와 같이, 용어 "핵산" 은 폴리뉴클레오티드 예컨대 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA 분자, 예를 들어 게놈 DNA, cDNA 및 mRNA 를 포함한다. 이러한 용어는 자연발생적 및 합성 기원 모두의 핵산 분자 뿐 아니라 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 선형, 원형 또는 분지형 구성의 분자, 또는 모두 선천적 핵산 분자인 분자를 포함한다. 이러한 핵산은 미정제, 정제될 수 있거나, 비드 또는 컬럼 매트릭스와 같은 합성 물질에 부착될 수 있다는 것이 이해된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 관심 발암유전자에서의 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 의 존재 또는 부재는 미국 가출원 번호 61/525,137 (2011 년 8 월 18 일 출원) 및 미국 가출원 번호 61/588,151 (2012 년 1 월 18 일 출원) 에서 기재된 바와 같은 유전자형 분석 검정을 사용하여 측정되며, 상기 개시물들은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
핵산을 포함하는 물질은 개인으로부터 일상적으로 수득된다. 이러한 물질은 그로부터 핵산이 만들어질 수 있는 임의의 생물학적 물질이다. 비제한적 예로서, 물질은 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 볼 채취물 (cheek swab), 가래, 또는 핵산을 함유하는 기타 체액 또는 조직일 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 방법은 비-침습적 방법으로 용이하게 수득될 수 있으며 게놈 DNA 를 만드는데 사용될 수 있는 전혈로 실행된다. 또 다른 구현예에서, 유전자형 분석은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 사용하는 개인의 핵산의 증폭을 포함한다. 핵산의 증폭을 위한 PCR 의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어 Mullis et al. (Eds.), The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, Boston, (1994) 참조). 또 다른 구현예에서, PCR 증폭은 DNA 마이너 그루브 결합제를 함유하는 하나 이상의 표지 또는 미표지 프라이머를 사용하여 수행된다.
본 발명의 방법에서 변이체 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 의 존재 또는 부재를 측정하기 위해, 임의의 각종 상이한 프라이머를 사용하여 PCR 에 의해 개인의 핵산을 증폭할 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, PCR 분석용 프라이머는 관심 유전자에서의 관심 다형성 부위(들) 측면에 위치하는 서열을 기반으로 설계될 수 있다. 비제한적 예로서, 프라이머 서열은 관심 유전자에서의 관심 다형성 부위의 업스트림 또는 다운스트림 서열의 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 프라이머는 일반적으로, 증폭 반응에서 안정적인 어닐링 단계가 가능하게 하는 높은 용융 온도를 얻기에 충분한 구아닌 및 시토신 함량을 갖도록 설계된다. Primer Select 와 같은 여러 컴퓨터 프로그램이 PCR 프라이머 설계에 이용가능하다.
Applied Biosystems사에서 이용가능한 Taqman® 대립형질 변별 검정은 다형성 부위에서 개인을 유전자형 분석하여 그로써 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하는데 유용할 수 있다. Taqman® 대립형질 변별 검정에서, 각각의 대립형질에 대해 특이적인 형광 염료-표지된 프로브가 구축된다. 상기 프로브는 상이한 형광 리포터 염료 예컨대 FAM 및 VICTM 을 함유함으로써 각각의 대립형질의 증폭이 구별된다. 또한, 각각의 프로브는 하나의 말단에서 소광제 염료를 갖는데, 이는 형광 공명 에너지 전달에 의해 형광을 소멸시킨다. PCR 동안, 각각의 프로브는 개인으로부터의 핵산에서의 상보적 서열에 특이적으로 어닐링된다. Taq 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성은 대립형질에 하이브리드화되는 프로브만 절단하는데 사용된다. 절단은 리포터 염료를 소광제 염료로부터 분리시켜, 리포터 염료에 의한 형광의 증가를 초래한다. 따라서, PCR 증폭에 의해 생성된 형광 신호는 어떤 대립형질이 샘플 내 존재하는지를 나타낸다. 프로브와 대립형질 사이의 미스매치는 프로브 하이브리드화 및 Taq 중합효소에 의한 절단 모두의 효율을 감소시켜, 약간의 형광 신호를 생성시키거나 형광 신호를 생성시키지 않는다. 예를 들어 [Kutyavin et al., Nuc. Acids Research 28:655-661 (2000)] 에서 기재된 바와 같이, 당업자는 대립형질 변별 검정에서의 개선된 특이성이 DNA 마이너 그루브 결합제 (MGB) 기를 DNA 프로브에 접합시킴으로써 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 마이너 그루브 결합제는 비제한적으로, 디히드로시클로피롤로인돌 트리펩티드 (DPI3) 와 같은 화합물을 포함한다.
서열 분석은 또한, 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본원에 기재된 방법에 따라 개인을 유전자형 분석하는데 유용할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 관심 변이 대립형질은 관심 유전자에서의 관심 다형성 부위에 측면으로 위치하는 서열을 기반으로 설계되는 적절한 프라이머를 사용하여 서열 분석에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자에서의 변이 대립형질은 당업계의 기술 중 하나에 의해 설계된 프라이머를 사용하여 서열 분석에 의해 검출될 수 있다. 추가적 또는 대안적 프라이머 서열은 관심 유전자에서의 관심 다형성 부위의 업스트림 또는 다운스트림의 약 40 내지 약 400 염기쌍의 서열에 상응하는 서열의 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 프라이머는 일반적으로, 서열분석 반응에서 안정적인 어닐링 단계가 가능하게 하는 높은 용융 온도를 얻기에 충분한 구아닌 및 시토신 함량을 갖도록 설계된다.
용어 "서열 분석" 은 그에 의해 핵산에서의 뉴클레오티드 순서가 결정되는 임의의 수동 또는 자동화된 과정을 포함한다. 예로서, 서열 분석은 DNA 샘플의 뉴클레오티드 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 용어 '서열 분석' 은 비제한적으로, 화학적 및 효소적 방법 예컨대 디데옥시 효소 방법, 예컨대 맥삼-길버트 (Maxam-Gilbert) 및 생어 (Sanger) 서열분석 뿐 아니라 이의 변형을 포함한다. 용어 '서열 분석' 은 비제한적으로, 모세관 어레이 DNA 서열분석을 추가로 포함하는데, 이는 모세관 전기영동 및 레이저-유도 형광 검출을 필요로 하며 MegaBACE 1000 또는 ABI 3700 과 같은 기기를 사용하여 수행될 수 있다. 추가적인 비제한적 예로서, 용어 '서열 분석' 은 열주기 서열분석 (Sears et al., Biotechniques 13:626-633 (1992) 참조); 고체상 서열분석 (Zimmerman et al., Methods Mol. Cell Biol. 3:39-42 (1992) 참조); 및 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간 (time-of-flight) 질량분석법과 같은 질량분석법을 사용하는 서열분석 (MALDI-TOF MS; Fu et al., Nature Biotech. 16:381-384 (1998) 참조) 을 포함한다. 용어 '서열 분석' 은 비제한적으로, 하이브리드화에 의한 서열분석 (SBH) 을 추가로 포함하는데, 이는 서열 조각을 확인하기 위해 모든 가능한 짧은 올리고뉴클레오티드의 어레이를 필요로 한다 (Chee et al., Science 274:610-614 (1996); Drmanac et al., Science 260:1649-1652 (1993); 및 Drmanac et al., Nature Biotech. 16:54-58 (1998) 참조). 당업자는 이러한 것들 및 추가적인 변형물이 본원에 정의한 바와 같은 용어 서열 분석에 의해 포함된다는 것을 이해한다.
전기영동 분석이 또한, 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본 발명에 따른 방법에 따라서 개인을 유전자형 분석하는데 유용할 수 있다. 증폭된 단편과 같은 하나 이상의 핵산과 관련하여 본원에서 사용하는 바와 같은 "전기영동 분석" 은 하전된 분자가 전기장의 영향 하에 고정 매질을 통해 이동하는 과정을 포함한다. 전기영동 이동은 주로, 그의 전하를 기반으로 핵산을 분리하는데, 이는 그의 크기에 비례한다 (작은 분자가 빠르게 이동함). 용어 '전기영동 분석' 은 비제한적으로, 평판 겔 전기영동, 예컨대 아가로오스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 모세관 전기영동을 사용하는 분석을 포함한다. 모세관 전기영동 분석은 일반적으로, 수 분의 분리 시간을 갖는 높은 (킬로볼트-수준) 분리 전압의 존재 하에 소-직경 (50-100 m) 석영 모세관 내부에서 일어난다. 모세관 전기영동 분석을 사용하여, 핵산은 UV 흡수 또는 형광 표지화에 의해 편리하게 검출되며, 단일-염기 해상도가 수백 염기쌍까지의 단편에 대해 수득될 수 있다. 이러한 전기영동 분석 방법 및 이의 변형물은 예를 들어 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology Chapter 2 (Supplement 45) John Wiley & Sons, Inc. New York (1999)] 에서 기재된 바와 같이, 당업계에 널리 공지되어 있다.
제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 분석은 또한, 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본 발명의 방법에 따라 개인을 유전자형 분석하는데 유용할 수 있다 (Jarcho et al. in Dracopoli et al., Current Protocols in Human Genetics pages 2.7.1-2.7.5, John Wiley & Sons, New York; Innis et al.,(Ed.), PCR Protocols, San Diego: Academic Press, Inc. (1990) 참조). 본원에서 사용되는 바와 같이, "제한 단편 길이 다형성 분석" 은 특이적인 염기 서열, 일반적으로 역보상성 염기순서 (palindrome) 또는 역위 반복물 (inverted repeat) 의 인지에 따라 핵산의 분해를 촉매화하는 엔도뉴클레아제인 제한 효소를 사용하여 다형성 대립형질을 구별하기 위한 임의의 방법을 포함한다. 당업자는 RFLP 분석의 사용이 변이 대립형질을 다형성 부위에서의 야생형 또는 다른 대립형질과 구분시킬 수 있는 효소에 좌우된다는 것을 이해한다.
추가로, 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화는 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본원에서 기재한 방법에서 개인을 유전자형 분석하는데 유용할 수 있다. 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화는 예를 들어 변이 대립형질을 포함하는 서열에 대해 완벽하게 상보적인 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브의 사용을 기반으로 한다. 적절한 조건 하에서, 변이 대립형질-특이적 프로브는 변이 대립형질을 포함하는 핵산에 하이브리드화하나, 프로브와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 갖는 하나 이상의 다른 대립형질에 하이브리드화하지 않는다. 필요시, 대안적 (예를 들어 야생형) 대립형질과 매치되는 제 2 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 또한 사용될 수 있다. 유사하게, 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 증폭 기법을 사용하여, 예를 들어 변이 대립형질을, 변이 대립형질의 뉴클레오티드 서열에 대해 완벽하게 상보적이지만 다른 대립형질과 비교하여 하나 이상의 미스매치를 갖는 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머 사용에 의해 선택적으로 증폭시킬 수 있다 (상기 Mullis et al.). 당업자는 변이 대립형질과 다른 대립형질 사이를 구별하는 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치가 종종 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화에서 사용되는 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 중앙에 위치한다는 것을 이해한다. 반대로, PCR 증폭에서 사용되는 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머는 일반적으로 프라이머의 3' 말단에서 변이체와 다른 대립형질을 구별시키는 하나 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다.
이형이중가닥 이동성 검정 (HMA) 은 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본 발명의 방법에서 유전자형 분석하는데 사용될 수 있는 또 다른 널리 공지된 검정이다. HMA 는, 미스매치를 포함하는 DNA 듀플렉스가 완벽하게 염기 쌍을 이룬 듀플렉스의 이동성에 비해 폴리아크릴아미드 겔에서 이동성이 감소하기 때문에, 변이 대립형질의 존재를 검출하는데 유용하다 (Delwart et al., Science, 262:1257-1261 (1993); White et al., Genomics, 12:301-306 (1992) 참조).
단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 기법은 또한 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본원에서 기재된 방법에서 유전자형 분석하는데 유용할 수 있다 (Hayashi, Methods Applic., 1:34-38 (1991) 참조). 이러한 기법은 미-변성 겔 전기영동시 변형된 전기영동 이동성을 생성시키는 단일-가닥 DNA 의 2 차 구조에서의 차이를 기반으로 변이 대립형질을 검출하는데 사용된다. 변이 대립형질은, 공지된 대립형질을 포함하는 상응 표준 단편과 시험 단편의 전기영동 패턴을 비교하여 검출된다.
변성 구배 겔 전기영동 (DGGE) 은 또한 관심 유전자에서의 특정한 변이 대립형질 (예를 들어 체세포 돌연변이) 또는 단상형의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 본 발명의 방법에서 유용할 수 있다. DGGE 에서, 이중-가닥 DNA 는 증가 농도의 변성제를 함유하는 겔에서 전기영동처리되고; 이중-가닥 단편은 보다 빠르게 용융되는 조각을 갖는 미스매치된 대립형질로 이루어져, 이러한 단편이 완벽하게 상보적인 서열과 비교하여 상이하게 이동하게 한다 (Sheffield et al., "Identifying DNA Polymorphisms by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis" in Innis et al., supra, 1990 참조).
개인의 유전자형 분석에 유용한 다른 분자적 방법이 당업계에 공지되어 있으며 본 발명의 방법에서 유용하다. 이러한 널리 공지된 유전자형 분석 접근법은 비제한적으로, 자동화 서열분석 및 RNase 미스매치 기법을 포함한다 (Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 82:7575-7579 (1985) 참조). 또한 당업자는, 다수의 변이 대립형질의 존재 또는 부재가 측정되는 경우, 개별적 변이 대립형질이 분자적 방법의 임의의 조합에 의해 검출될 수 있다는 것을 이해한다. 일반적으로, Birren et al. (Eds.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Volume 1 (Analyzing DNA) New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997) 을 참조한다. 또한, 당업자는 다수의 변이 대립형질이 개별적인 반응 또는 단일 반응에서 검출될 수 있다는 것을 이해한다 ("다중사용" 검정).
VII. 항체 생성
본 발명의 면역검정에 따라 종양 세포에서의 신호 전달 분자의 발현 및 활성화 수준을 분석하기 위해 벌써 시판되어 있지는 않은 항체의 생성 및 선택은 여러 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 한 가지 방식은 당업계에 공지된 단백질 발현 및 정제 방법을 사용하여 관심 폴리펩티드 (즉, 항원) 를 발현 및/또는 정제하는 것인 한편, 또 다른 방식은 당업계에 공지된 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 관심 폴리펩티드를 합성하는 것이다. 예를 들어, Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull., 38:1192-99 (1990); Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 1:255-60, (1995); 및 Fujiwara et al., Chem. Pharm. Bull., 44:1326-31 (1996) 을 참조한다. 정제 또는 합성된 폴리펩티드는 예를 들어 마우스 또는 토끼에 주입되어, 다클론 또는 단일클론 항체를 생성할 수 있다. 당업자는 예를 들어 [Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)] 에 기재된 바와 같이, 많은 절차가 항체 생성을 위해 이용가능하다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 또한, 항체를 모방하는 (예를 들어 항체의 기능적 결합 부위를 보유하는) 결합 단편 또는 Fab 단편이 또한 각종 절차에 의해 유전적 정보로부터 생성될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, [Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995)]; 및 [Huse et al., J. Immunol., 149:3914-3920 (1992)] 를 참조한다.
당업자는 항체 및 결합 단편 생성, 및 각종 관심 폴리펩티드에 대한 친화성 및 특이성에 대한 스크리닝 및 선택에 있어서 많은 접근법이 취해질 수 있으나 이러한 접근법이 본 발명의 범주를 변화시키지 않는다는 것을 인지할 것이다.
다클론 항체, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 이중특이적 항체, 이의 단편, 및 항체를 정제하는 방법의 보다 상세한 설명은, 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO 2010/132723 에서 발견된다.
VIII. 투여 방법
본 발명의 방법에 따라서, 본원에 기재된 항암 약물은 당업계에 공지된 임의의 편리한 수단에 의해 대상에게 투여된다. 본 발명의 방법은 대상에서의 종양, 예를 들어 대장 종양의 치료를 위해 적합한 항암 약물 또는 항암 약물의 조합을 선택하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한, 항암 약물 또는 항암 약물의 조합에 대한 대상에서의 종양, 예를 들어 대장 종양의 반응을 확인하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 항암 약물 또는 항암 약물의 조합으로의 치료에 대한, 종양, 예를 들어 대장 종양을 갖는 대상의 반응을 예측하는데 사용될 수 있다. 당업자는 본원에 기재된 항암 약물이 단독으로 또는 종래의 화학요법, 방사선치료법, 호르몬 치료요법, 면역요법 및/또는 수술과의 조합된 치료적 접근법의 일부로서 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
특정 구현예에서, 항암 약물은 항-신호화제 (즉, 세포분열억제 약물) 예컨대 단일클론 항체 또는 티로신 키나아제 저해제; 항-증식제; 화학요법제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 암 세포와 같은 이상 세포의 제어되지 않은 성장을 감소시키거나 없애는 능력을 갖는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상은 하나 이상의 화학요법제와의 조합으로 하나 이상의 항-신호화제, 항-증식제 및/또는 호르몬 치료제로 처리된다. 예시적인 단일클론 항체, 티로신 키나아제 저해제, 항-증식제, 화학요법제, 호르몬 치료제, 방사선치료제 및 백신이 상기에 기재된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항암 약물은 종래의 면역치료제 예컨대 비제한적으로, 면역자극제 (예를 들어 바실러스 칼메테-구에린 (Bacillus Calmette-Guerin) (BCG), 레바미솔 (levamisole), 인터류킨-2, 알파-인터페론 등), 면역독소 (예를 들어 항-CD33 단일클론 항체-칼리키아미신 (calicheamicin) 접합체, 항-CD22 단일클론 항체-슈도모나스 (pseudomonas) 엑소톡신 접합체 등), 및 방사면역치료 (예를 들어 111In, 90Y 또는 131I 등에 접합된 항-CD20 단일클론 항체) 와 동시-투여될 수 있다.
항암 약물은 필요에 따라 적합한 약학적 부형제와 함께 투여될 수 있고, 임의의 승인된 투여 방식을 통해 운반될 수 있다. 따라서 투여는, 예를 들어 경구, 협측 (buccal), 설하, 잇몸 (gingival), 입천장 (palatal), 정맥내, 국소, 피하, 경피 (transcutaneous), 경피 (transdermal), 근육내, 관절내, 비경구, 소동맥내, 진피내, 심실내, 두개내, 복막내, 방광내, 경막내, 병변내, 비강내, 직장, 질내, 또는 흡입 투여일 수 있다. "동시-투여" 는 항암 약물이 제 2 약물 (예를 들어 또 다른 항암 약물, 항암 약물 치료요법과 연관된 부작용을 감소시키는데 유용한 약물, 방사선치료제, 호르몬 치료제, 면역치료제 등) 의 투여와 동일한 시간에, 그 직전에, 또는 그 직후에 투여되는 것을 의미한다.
항암 약물의 치료적 유효량은 반복적으로, 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 회 이상 투여될 수 있거나, 그 용량은 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 고체, 반고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여 형태 예컨대 정제, 알약, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액, 에멀젼, 좌제, 체류 관장제 (retention enemas), 크림, 연고, 로션, 겔, 에어로졸, 포말 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는, 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투약 형태이다.
본원에서 사용되는 용어 "단위 투약 형태" 는 인간 대상 및 다른 포유동물에 대한 단일 투약량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 나타내며, 각각의 단위는 적합한 약학적 부형제 (예를 들어 앰플) 와 함께, 필요로 하는 개시, 내성 및/또는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정량의 항암 약물을 함유한다. 또한, 더욱 농축된 투약 형태가 제조될 수 있고, 그로부터 그 후 더욱 희석된 단위 투약 형태가 생성될 수 있다. 따라서 더욱 농축된 투약 형태는 실질적으로, 예를 들어 항암 약물의 양의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 배 이상을 함유할 것이다.
그러한 투약 형태를 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990) 참조). 투약 형태는 통상 종래의 약학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 다른 의약제, 담체, 아쥬반트, 희석제, 조직 투과 증강제, 가용화제 등을 부가적으로 포함할 수 있다. 적절한 부형제는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 특정한 투약 형태 및 투여 경로에 맞추어질 수 있다 (예를 들어 상기 Remington's Pharmaceutical Sciences 참조).
적합한 부형제의 예는 비제한적으로, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 트래거캔스, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 염수, 시럽, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 폴리아크릴산 예컨대 카르보폴, 예를 들어 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함한다. 투약 형태는 윤활제 예컨대 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일; 습윤제; 에멀젼화제; 현탁제; 보존제 예컨대 메틸-, 에틸-, 및 프로필-히드록시-벤조에이트 (즉, 파라벤); pH 조정제 예컨대 무기 및 유기산 및 염기; 감미제; 및 착향제를 부가적으로 포함할 수 있다. 투약 형태는 또한 생분해성 중합체 비드, 덱스트란 및 시클로덱스트린 포함 복합체를 포함할 수 있다.
경구 투여의 경우, 치료적 유효량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁액, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말 및 지속-방출 제형의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로오스, 글루코오스, 젤라틴, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 치료적 유효량은 알약, 정제 또는 캡슐의 형태를 취하고, 따라서 투약 형태는 항암 약물과 함께, 하기 중 임의의 것을 함유할 수 있다: 희석제 예컨대 락토오스, 수크로오스, 디칼슘 포스페이트 등; 붕해제 예컨대 전분 또는 이의 유도체; 윤활제 예컨대 마그네슘 스테아레이트 등; 및 결합제 예컨대 전분, 아카시아 검, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 이의 유도체. 항암 약물은 또한 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 담체 중에 배치된 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 투약 형태는 예를 들어 경구, 국소 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 현탁액을 형성하기 위해, 예를 들어 식염수 (예를 들어 0.9% w/v 염화나트륨), 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 중에 항암 약물 및 임의로는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 아쥬반트를 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 항암 약물은 또한 체류 관장제로 제형화될 수 있다.
국소 투여의 경우, 치료적 유효량은 에멀젼, 로션, 겔, 포말, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고 및 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 항암 약물은 네뷸라이저를 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 치료적 유효량은 멸균 주사가능 용액 및 멸균 포장된 분말 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사가능 용액은 약 4.5 내지 약 7.5 의 pH 에서 제형화된다.
치료적 유효량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 이러한 투약 형태는 투여 전 재구성을 위한 완충액, 예를 들어 바이카르보네이트를 포함할 수 있거나, 또는 완충액이, 예를 들어 물로 재구성하기 위한 동결건조된 투약 형태에 포함될 수 있다. 동결건조된 투약 형태는 적합한 혈관수축제, 예를 들어 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결건조된 투약 형태는, 재구성된 투약 형태가 즉시 대상에게 투여될 수 있도록, 임의로 재구성용 완충제와의 조합으로 포장된, 주사기 중에 제공될 수 있다.
대상은 또한 특정 치료 계획의 효능을 평가하기 위해 주기적 시간 간격으로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 전달 분자의 활성화 상태는 본원에 기재된 하나 이상의 항암 약물을 사용하는 처리의 치료 효과를 기반으로 변화할 수 있다. 대상은 개별화된 접근법에서 반응을 평가하고 특정 약물 또는 치료의 효과를 이해하기 위해 모니터링될 수 있다. 부가적으로, 처음에는 특정 항암 약물 또는 항암 약물의 조합에 반응하는 대상이 상기 약물 또는 약물 조합에 불응성으로 변할 수 있으며, 이는 상기 대상이 후천적 약물 저항성을 발달시켰음을 나타낸다. 상기 대상은 그의 현재 치료요법을 중단하고 본 발명의 방법에 따라 대안적 치료를 처방받을 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 방법은 다양한 집단에서의 대장암 예후 및/또는 재발 가능성을 예측하는 유전자 발현 마커의 패널과 함께 사용될 수 있다. 이러한 유전자 패널은 재발을 경험할 것으로 보이지 않으며 따라서 아쥬반트 화학요법으로부터 이득을 얻을 것을 보이지 않는 개인을 확인하는데 유용할 수 있다. 발현 패널은 무병 및 전체 생존율 결과에 부정적으로 영향을 미치지 않고 아쥬반트 화학요법을 안전하게 피할 수 있는 개인을 확인하는데 사용될 수 있다. 적합한 시스템은 비제한적으로, Genomic Health, Inc. 으로부터의 21-유전자 패널인 Oncotype DXTM; Agendia 로부터의 70-유전자 패널인 MammaPrint®; 및 Veridex 로부터의 76-유전자 패널을 포함한다.
또한 특정한 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 원발 불명암 (Cancers of unknown primary) (CUP)) 에 대한 본래의 종양을 확인하는 유전자 발현 마커의 패널과 함께 사용될 수 있다. 이러한 유전자 패널은 초기에 대장암으로 진단받은 환자에게 주어진 바와 일치하는 치료요법으로 이익을 얻을 수 있는 전이성 암을 갖는 환자를 확인하는데 있어서 유용할 수 있다. 적합한 시스템은 비제한적으로, Aviara CancerTYPE ID 검정, RT-PCR-기반 발현 검정 (39 가지 종양 유형에 대한 원발 기원 부위를 확인하기 위해 92 개 유전자를 측정함); 및 Origin Test 의 Pathwork® Tissue (마이크로어레이에서 1600 개 초과의 유전자 발현을 측정하고 15 개의 공지된 조직 유형에 대한 종양의 유전자 발현 "시그너쳐" 를 비교함) 를 포함한다.
IX. 실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 설명하기 위해 제공되나, 이를 제한하지는 않는다.
실시예 1. CEER 을 사용하는 대장암의 분자적 표현형 분석: 환자-집중적 치료 표적화에 대한 결과
이 실시예는 대장암 (CRC) 종양에서 그의 KRAS 상태에 관계없이 포스포-PI3K (pPI3K) 대 포스포-HER3 (pHER3) 의 비를 설명하고, 종양 예후 및 항-EGFR 치료요법 결과를 예측한다. 본원에서 기재한 바와 같이, 항-EGFR 치료요법에 대한 최적의 후보물은 pPI3K/pHER3 비는 낮으나 HER1/cMET 비가 높은 CRC 일 수 있다. 이 실시예는 또한 pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 비가 CRC 환자에서의 재발 및 무병생존율 (DFS) 과 음성적이고 유의하게 상관관계가 있다는 것을 설명한다. 본원에서 기재한 바와 같이, pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 비는 더 높은 pPI3K/pHER3 비 (예를 들어 참조 pPI3K/pHER3 인덱스 컷-오프 초과) 를 갖는 CRC 샘플에서 더 높다.
도 1 은 CRC 코호트 연구 개요를 나타낸다. 이 연구는 115 개의 원발성 CRC 종양 및 10 개의 원발/전이성 매치된 종양 샘플을 포함하였다. CEER/돌연변이 분석을 수집한 샘플에 대해 수행하였다. HER 일원 (예를 들어 HER1, HER2, HER3), cMET, IGF1R, PI3K, Shc, AKT 및 ERK 를 공동 효소 증강 반응성 (Collaborative Enzyme Enhanced Reactive (CEER)) 면역검정을 이용하여 그의 발현 및/또는 활성화 수준에 대해 분석하였다. CEER 은 표적 단백질을 둘러싼 3 배체 항체 복합체의 형성을 필요로 하는 고도로 민감하며 특이적인 근접성 검정이다. 샘플을 또한 KRAS, BRAF 및 PIK3CA 발암유전자 내 14 개 상이한 돌연변이에 대해 분자적으로 분석하였다. 도 2 는 이 연구에 등록한 CRC 환자의 특징을 설명한다.
그의 KRAS 돌연변이 상태를 기반으로 CRC 종양을 구별하는 것은 예후 및 치료적 결과를 예측하기 위한 현재 최적의 이용가능한 바이오마커이다. 그러나, 단순히 KRAS 돌연변이 상태를 기반으로 하는 CRC 환자 선택은 불완전하다. 따라서, CRC 에 대한 치료요법의 선택을 유도하고 예후를 예측하기 위한 보다 양호한 바이오마커에 대하여 충족되지 않은 필요성이 CRC 분야에 존재한다. 예를 들어, KRAS 야생형 (KRAS-WT) CRC 종양은 미상의 이유로, 혼합된 수술 후 예후를 갖는다. KRAS-WT CRC 종양은 세툭시맙 치료요법 후 이종의 반응을 가지며; BRAF 돌연변이는 일부 종양에서의 원인으로 나타나지만, 다수의 세툭시맙 미반응성 종양을 설명하지 못한다. 또한, KRAS G12 돌연변이체 (KRAS-G12mut) CRC 종양은 통상 미상의 이유로, 열악한 수술 후 예후를 갖는다. 특히, KRAS-G12mut CRC 종양은 통상 항-EGFR 치료요법에 반응하지 않는다. 현재, KRAS-G12mut CRC 종양을 치료하기 위한 표적화된 치료요법은 이용가능하지 않다.
도 3 은 CEER 을 사용하는 CRC 임상 샘플의 신호화 경로 프로파일을 나타낸다. 8 명의 상이한 환자로부터의 샘플예를 총 및 인산화된 (phos) HER1, HER2, HER3, cMET, IGF1R, cKIT, PI3K 및 Shc 의 발현에 대해 분석하였다. Pan-CK 및 인산화된 AKT 및 ERK 를 또한 분석하였다. 각 샘플의 KRAS 돌연변이 상태를 나타낸다.
도 4 는 CRC 무병생존율 (DFS) 에서의 다양성 및 이종성을 나타낸다. 도 5 는 CRC 생존율에 있어서의 다양성이 신호화 경로 시그너쳐에 있어서의 다양성과 상관관계가 있다는 것을 나타낸다. 특히, 도 5 는 CRC 에서의 무병생존율 차이가 CEER 기법을 통해 발견된 경로 시그너쳐와 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
도 6-12 는 pPI3K/pHER3 이 CRC 에 대한 예후 마커라는 것을 입증한다. 특히, 도 6-8 은 pPI3K/pHER3 인덱스 또는 비가 CRC 환자에서의 생존율 차이를 구별하는데 이용될 수 있다는 것을 나타낸다. pPI3K 수준은 pHER3 에 관련하여 증가하며, 질환 재발의 가능성이 증가한다. 도 6 은 pPI3K/pHER3 인덱스의 감소가 DFS 와 상관관계가 있다는 것을 입증한다. 1/10 (0.1), 2/10 (0.2), 3/10 (0.3) 및 4/10 (0.4) 의 예시적 컷-오프 비를 시험하였다. 2/10 (0.2) 의 컷-오프 비를 추가의 분석을 위해 사용한 경우, pHER3 에 의해 설명될 수 있는 것을 넘어서는 더 높은 pPI3K 를 갖는 CRC 환자의 불량한 예후가 관찰되었다. 특정 구현예에서, pPI3K/pHER3 비 <0.2 인 CRC 환자는 하나 이상의 항-HER 치료요법에 대한 후보물인 반면, pPI3K/pHER3 비 >0.2 인 CRC 환자는 하나 이상의 항-PI3K 치료요법에 대한 후보물이다. 도 7 은 pPI3K/pHER3 인덱스에 의해 구별되는 CRC 종양의 구성을 나타낸다. 특히, CRC 종양은 종양 병기 및 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 구별된다. 도 8 은 pPI3K/pHER3 인덱스에 의해 구별된 CRC 종양이 높은 생존율 및 낮은 생존율을 갖는 KRAS 야생형 종양 내에서 2 개 이상의 하위집단을 커버하지 못한다는 것을 나타낸다. 그러나, KRAS G12mut CRC 종양은 그의 pPI3K/pHER3 인덱스에 관계 없이 낮은 생존율을 갖는다. 즉, KRAS WT 종양은 그의 pPI3K/pHER3 인덱스 비를 기반으로 유의하게 구별되는 DFS 차이를 갖는 2 개의 하위집합으로 명백히 구별되는 반면, KRAS G12mut 종양은 그의 pPI3K/pHER3 비에 관계없이 항상 공격적이며 낮은 DFS 를 갖는다. 그로서, pPI3K/pHER3 발현은 CRC 에 대한 신규한 예후 인자이다.
도 9 는 KRAS 돌연변이 상태-기반 예후 결과가 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 에서만 이용가능하다는 것을 설명한다. 특히, KRAS 돌연변이 상태를 기반으로 한 DFS 구별에 있어서의 유의한 차이는 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 종양에서만 관찰되었다. 도 10 은 높은 pPI3K/pHER3 인덱스가 CRC 에서의 공격성과 상관관계가 있다는 추가적인 증거를 제공한다. 높은 pPI3K 신호화는 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 CRC 에서의 조기 재발과 상관관계가 있다. 즉, 도 10 은 높은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 종양이, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계 없이 조기에 재발한다는 것을 나타낸다. 도 11 은 낮은 pPI3K 신호화를 갖는 CRC 가 전이함에 따라 pPI3K/pHER3 비가 증가한다 (예를 들어 pPI3K/pHER3 컷-오프 비 초과) 는 것을 나타낸다. 특히, CRC 종양은 이들이 먼 거리의 기관까지 전이되기 때문에, 높은 pPI3K/pHER3 인덱스를 획득한다. 치료적 결과는, 표적화 치료요법이 그의 경로 프로파일을 기반으로 조정될 필요가 있다는 것이다 (예를 들어 항-HER 치료요법 이후 항-PI3K 치료요법).
도 12 는 도 6-11 에서 나타낸 실험적 데이터의 그림 요약을 제공한다. pPI3K/pHER3 인덱스가 컷-오프 비 초과인 경우 (예를 들어 pPI3K/pHER3 > 20%), pPI3K 신호화는 HER 신호화를 초과하며 CRC 는 PI3K-유도된 것으로서 분류된다. 예후 측면에서, 컷-오프 비 초과의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는 KRAS 돌연변이 상태에 관계 없이 낮은 DFS 를 갖는 것으로 예측된다. CRC 치료요법 선택 측면에서, 컷-오프 비 초과의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없을 것으로 예상되며 항-PI3K 치료요법에 대해 반응성이 있을 가능성이 높다. pPI3K/pHER3 인덱스가 컷-오프 비 미만인 경우 (예를 들어 pPI3K/pHER3 < 20%), HER 신호화는 더 높으며 CRC 는 HER-유도된 것으로서 분류된다. 예후 측면에서, 컷-오프 비 미만의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자는, KRAS 상태가 WT 또는 G13D 인 경우 높은 DFS 를 갖는 것으로 예측되나, KRAS 상태가 KRAS G12mut 인 경우 낮은 DFS 를 갖는 것으로 예측된다. CRC 치료요법 선택 측면에서, 컷-오프 비 미만의 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 환자 중 일부는 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있는 것으로 예상된다.
도 13-17 은 높은 HER1/cMET 인덱스 또는 낮은 cMET 신호화가 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스와 상관관계가 있으며 양호한 예후를 갖는 CRC 에 대한 마커를 나타낸다는 것을 입증한다. 특히, 도 13 은 MET 신호화가 공격적 (높은 pPI3K/pHER3 인덱스) KRAS 야생형 및 KRAS G13Dmut CRC 에서 더 높다는 것을 나타낸다. 도 14 는 MET 신호화가 (A) 공격적 (높은 pPI3K/pHER3 인덱스) CRC 및 (B) 전이성 CRC 에서의 HER1 신호화보다 더 높다는 것을 나타낸다. pHER1/pMET 비는 낮은 pPI3K 신호화를 갖는 CRC 가 전이됨에 따라 감소한다. 도 15 는 KRAS-WT CRC 종양이 낮은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 종양에서의 KRAS G12mut 종양보다 상당히 더 높은 HER1/cMET 인덱스 비를 입증한다는 것을 나타낸다. 이는 KRAS G12mut 종양에서보다 KRAS-WT 종양에서 더 높은 DFS 와 상관관계가 있다. 반대로, HER1/cMET 비는 높은 pPI3K/pHER3 인덱스를 갖는 CRC 종양 중에서는 유의하게 상이하지 않다. 이는 이러한 코호트에서의 낮은 생존율을 갖는 종양과 상관관계가 있다. 도 16 은 적절한 HER1/cMET 비 컷-오프가 낮은 PI3K 집단 내에서 보다 공격적인 KRAS G12mut 종양을 가려낸다는 것을 나타낸다.
도 17 은 상대적 경로 시그너쳐 + KRAS 돌연변이 상태를 포함하는 본 발명의 상대적/통합적 경로 인덱스의 그림 요약을 제공한다. cMET 신호화보다 더 높은 HER 신호화를 갖는 HER 유도된 CRC 종양에서 (예를 들어 HER1 > cMET; 높은 HER1/cMET 인덱스 또는 낮은 cMET 신호화), WT 또는 G13D KRAS 상태를 갖는 CRC 환자는 양호한 예후 (예를 들어 높은 DFS) 를 가지며 항-EGFR 치료요법에 반응할 가능성이 더 높다. 그러나, 낮은 HER1 신호화를 갖는 HER 유도된 CRC 종양에서 (예를 들어 HER1 < cMET; 낮은 HER1/cMET 인덱스 또는 높은 cMET 신호화), G12 KRAS 돌연변이를 갖는 CRC 환자는 불량한 예후 (예를 들어 낮은 DFS) 를 갖는다.
도 18 은 pPI3K/pHER1, pPI3K/pHER2 및 pPI3K/pHER3 비가 모두, CRC 에서 재발 (예를 들어 마커 수치가 높을수록, 재발이 빠름) 및 무병생존율 (DFS) 과 음성적이고 유의하게 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.
도 19 는 pPI3K/pHER1 및 pPI3K/pHER2 가 더 높은 pPI3K/pHER3 발현을 갖는 (예를 들어 참조 pPI3K/pHER3 인덱스 컷-오프 초과) CRC 샘플에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 나타낸다.
요약하면, 이 실시예는 CEER-기반 신호화 경로 프로파일이 KRAS 돌연변이-기반 구별을 넘어 CRC 의 신규한 분자 하위집합을 밝혀낸 것을 입증한다. 이러한 분자적 구별은 CRC 에 대한 신규한 치료적 선택을 유도할 수 있다. 특히, CRC 종양에서의 pPI3K 대 pHER3 발현의 비 (pPI3K/pHER3 인덱스) 로, 그의 KRAS 상태에 관계없이 종양 예후 및 항-EGFR 치료요법 결과를 예측한다는 것이 발견되었다. 항-EGFR 치료요법에 대한 최적의 후보물은 pPI3K/pHER3 비는 낮으나 HER1/cMET 비가 높은 CRC 로서 확인되었다. 낮은 pPI3K 신호화 (예를 들어 pHER3 발현의 약 15-30%) 를 갖는 CRC 종양의 2 차적 선택은 그의 KRAS 상태에 관계없이 최적 예후의 항-EGFR 치료요법 결과를 가질 수 있는 CRC 종양을 추가로 예측할 수 있다. 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-pPI3K 치료요법은 pHER3 의 약 15-30% 초과의 pPI3K 신호화를 갖는 공격적 CRC 종양에 보다 적합하다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계 없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다. 이러한 연구는 또한, pPI3K 신호화 증가가 일부 CRC 에서 cMET 신호화 증가로 인한 것일 수 있다는 것을 발견하였다. 항-EGFR 치료요법에 추가적이거나 이를 대신하는 항-MET 치료요법은, 항-PI3K 치료요법의 존재 하 또는 부재 하에, pHER 의 약 15-30% 초과의 pPI3K 를 갖는 공격적 CRC 종양의 치료에 유용할 수 있다. 이러한 종양은 비제한적으로, 높은 pPI3K 신호화를 갖는 KRAS-WT 종양, 다수의 KRAS-G12mut 종양, 그의 KRAS 돌연변이 상태에 관계없이 전이된 CRC 종양 등을 포함한다.
이 명세서에서 언급된 모든 출판물 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 출판물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 포함된다고 표시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다. 상술된 발명은 명확한 이해를 목적으로 설명 및 예를 이용하여 다소 상세히 기술되었지만, 본 발명의 교시에 비추어 첨부된 청구항의 취지 또는 범주에서 벗어나지 않으면서 특정 변화 및 수정이 그에 가해질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (26)

  1. 하기를 포함하는, 대장암 (CRC) 을 갖는 대상의 생존율을 예측하는 방법:
    (a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 수준을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
    (b) 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스를 기반으로 대상의 생존율을 예측함.
  2. 제 1 항에 있어서, HER 수용체가 HER1, HER2 및 HER3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프 미만인 경우 대상이 양호한 예후를 갖는 것으로 예측되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 양호한 예후가 높은 무병생존율 (DFS) 을 포함하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 대상이 KRAS 발암유전자에서 G13D 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프 초과인 경우 대상이 불량한 예후를 갖는 것으로 예측되는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 불량한 예후가 낮은 무병생존율 (DFS) 을 포함하는 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 대상이 KRAS 발암유전자에서 G13D 또는 G12 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, G12 돌연변이가 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프가 약 0.2 의 값을 포함하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K 및/또는 HER 수용체의 활성화 수준이 이의 인산화 수준에 상응하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K/HER1 인덱스, PI3K/HER2 인덱스, PI3K/HER3 인덱스 또는 이의 조합을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 추출물에서의 HER1 및 cMET 의 수준을 기반으로 HER1/cMET 인덱스를 결정하고; (i) 참조 HER1/cMET 인덱스 컷-오프에 대해 결정한 HER1/cMET 인덱스 및 (ii) 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프에 대해 결정한 PI3K/HER 인덱스를 기반으로 대상의 생존율을 예측하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 하기를 포함하는, 대상에서의 대장암 (CRC) 의 치료를 위한 치료요법을 선택하는 방법:
    (a) 단리된 암 세포로부터 생성된 세포 추출물에서의 PI3K 및 HER 수용체의 활성화 수준을 기반으로 PI3K/HER 인덱스를 결정하고;
    (b) 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프에 대한 PI3K/HER 인덱스를 기반으로 대상에서의 CRC 의 치료를 위해 적합한 치료요법을 선택함.
  15. 제 14 항에 있어서, HER 수용체가 HER1, HER2 및 HER3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 치료요법이 항-EGFR 치료요법, 항-PI3K 치료요법, 항-HER2 치료요법, 항-HER3 치료요법, 항-cMET 치료요법, PI3K 활성화를 유도하는 분자를 저해하는 표적화제를 사용하는 치료요법, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프 미만인 경우 대상이 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 있는 것으로 예측되는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 대상이 KRAS 발암유전자에서 G13D 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는 방법.
  19. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프 초과인 경우 대상이 항-EGFR 치료요법에 대해 반응성이 없는 것으로 예측되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 대상이 KRAS 발암유전자에서 G13D 또는 G12 돌연변이를 갖거나 야생형 KRAS 유전자형을 갖는 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, G12 돌연변이가 G12S, G12D, G12A, G12V, G12R 및 G12C 돌연변이로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프가 약 0.2 의 값을 포함하는 방법.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K 및/또는 HER 수용체의 활성화 수준이 이의 인산화 수준에 상응하는 방법.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, PI3K/HER1 인덱스, PI3K/HER2 인덱스, PI3K/HER3 인덱스 또는 이의 조합을 결정하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제 14 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 추출물에서의 HER1 및 cMET 의 수준을 기반으로 HER1/cMET 인덱스를 결정하고; (i) 참조 HER1/cMET 인덱스 컷-오프에 대해 결정한 HER1/cMET 인덱스 및 (ii) 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프에 대해 결정한 PI3K/HER 인덱스를 기반으로 CRC 의 치료를 위한 치료요법을 선택하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 항-EGFR 치료요법이, 결정된 PI3K/HER 인덱스가 참조 PI3K/HER 인덱스 컷-오프 미만이고 결정된 HER1/cMET 인덱스가 참조 HER1/cMET 인덱스 컷-오프 초과인 경우 CRC 의 치료를 위해 적합한 치료요법으로서 선택되는 방법.
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