JP2002530629A - 癌診断インジケータとしてのｎ末端切断型ｈｅｒ−２／ｎｅｕ蛋白質 - Google Patents

癌診断インジケータとしてのｎ末端切断型ｈｅｒ−２／ｎｅｕ蛋白質

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JP2002530629A JP2000582590A JP2000582590A JP2002530629A JP 2002530629 A JP2002530629 A JP 2002530629A JP 2000582590 A JP2000582590 A JP 2000582590A JP 2000582590 A JP2000582590 A JP 2000582590A JP 2002530629 A JP2002530629 A JP 2002530629A
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Abstract

(57)【要約】 Ｎ末端切断型ＨＥＲ・２／ｎｅｕ産物を初めて特定したことを開示する。本産物はインビトロキナーゼ活性を有する９５ｋＤａのポリペプチドである（ウエスタンブロッティングにより決定）。更に、ドメイン特異抗体を利用した免疫沈降は、細胞内断片に由来する本特異ポリペプチドを、ＥＣＤ測定時に経験する強い希釈効果を生じることなく腺癌の診断及び予後インジケータとしての利用を可能にした。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の技術的分野 本発明は乳癌の診断及び予後（prognostic）インジケータとして有用なＮ末端
欠如型HER-2/neuポリペプチドである-95HER-2を提供する。本発明は更に、各種
腺癌、特に乳癌及び卵巣癌の診断及び予後（prognostic）に関する免疫学的アッ
セイに好適なエピトープでもある12-15アミノ酸からなる“細胞外スタブ”も提
供する。 本発明は、国立ガンセンターよりCA-71447として、及び国防省（DOD）乳癌研
究プログラムからDMD17-6204として成された米国政府奨学金により実施された。
米国政府は本発明に一定の権利を有するだろう。
【０００２】 発明の背景 HER-2/neu(erbB-2)遺伝子は上皮増殖因子受容体ファミリーのメンバーである
受容体様チロシンキナーゼ（RTK）をコードしている（Coussensら、Science230:
1132-1139、1985）。HER-2/neuの過剰発現は、肺非小細胞（Kernら、Cancer Res
. 50:5184-5191,1990）、結腸（Cohenら、Oncogene, 4:81-88, 1989）、前立腺
（Araiら、Prostate 30:195-201,1997）,卵巣、及び乳房（Slamonら、Science 2
44:707-712, 1989）を含む多くの部位に生じる腫瘍に観察されている。
【０００３】 Her-2/neuの関与が研究されいるヒト乳癌では、過剰発現は症例の15-30%に起
こっており（SingletonとStrickler、Pathol.Annual 27 Pt1: 165-198, 1992）
、そしてリンパ節陽性疾患を持つ患者に於いて有意に生存率が低いことや再発ま
で時間が短いことを推測している（Slamonら、Science 244: 707-712, 1989; Si
ngletonとStrickler、Pathol. Annual 27 Pt1: 165-198, 1992; Salmonら、Scie
nce 235:177-182;及びSlamonら、Science 235: 177-182, 1987）。
【０００４】 リンパ節陰性患者に於けるHER-2/neuのもつ意義については定まっておらず、
予後インジケータとしての臨床応用は限定される（Slamonら、Science 235:177-
182, 1987; 及びHynesら, Biochem. Biophys, Acta 1198:165-184, 1994）。HER
-2/neuを標的とする治療薬を得ようと様々な試みが行われているが、その多くは
受容体機能をダウンレギュレーションする膜貫通蛋白質の細胞外ドメイン（ECD
）に対する特異抗体、あるいはHER-2/neuを発現する腫瘍細胞を特異的に殺滅す
ることを目的とした標的組換え体毒素に基づくものである‘Hynesら、Biochem.
Biophys. Acta 1198:165-184,1994; Pressら、Progress in Clinical & Biologi
cal Research 354:209-221,1990;及びDougallら、Oncogene 9:2109-2123, 1994
）。
【０００５】 培養乳癌細胞からは制御された蛋白質分解により、HER-2/neuの全長膜貫通産
物であるp185に加え、細胞外ドメイン（ECD）に対応する切断産物が放出され（L
inとClinton, Oncogene 6:639-643, 1991; Zabreckyら、J. Biol. Chem. 266:17
16-1720, 1991;及びPupaら、Oncogene 8:2917-2923, 1993）、同時に別の形の転
写物も産生される（Scottら、Mol. Cell. BIol.13:2247-1157、1993）。
HER-2/neuECDは乳癌（Leitzelら、J. Clin. Oncol. 10:1436-1443, 1992）、卵
巣癌（Madenら、Anticancer Res. 17:757-760,1997）及び前立腺癌（Myersら、I
nt. J. Cancer 69:398-402, 1996）患者の血清中で上昇している。
【０００６】 乳癌に関する多くの研究は、乳癌初期段階の患者では6%以下、転移性の局所進
行癌患者では約25%、そして再発性転移性癌の患者では50%以上が高値血清ECDを
持つと推定している（Brandt-Raufら、Mutation Res.333:203-208, 1995）。血
清中でのECDの上昇は腫瘍組織中のHER-2/neuの過剰発現に伴うものであり、腫瘍
の負荷に相関することが示されている（Molinaら、Br. J.of Cancer 4:1126-113
1, 1996、及びBrodowiczら、Oncology 54;475-481,1997）。血清ECDは転移性疾
患のマーカーであり、再発（Molinaら、Br.J.of Cancer 4:1126-1131, 1996）、
生存期間短縮（Brodowiczら、Oncology 54:475-481,1997;Kandlら、Br.J.Cancer
70:739-742, 1994; Fehrnら、Oncology 55:33038, 1998及びMansourら、Antica
ncer Res.17:3101-3105,1997）及び進行ステージ患者に於ける抗エストロゲン治
療に対する反応性（Leitzelら、J. Clin.Onclo.13:1129-1135, 1995;及びYamauc
hiら、J.Clin. Onclol. 15:2518-2525, 1997）を予測するだろう。
【０００７】 血清ECDは更にECDを標的とする抗HER-2/neu抗体の活性を中和し（Baselgaら、
J.Clin. Onclo.14:737-744, 1996; 及びBrodowiczら、Int. J.Cancer. 73;875-8
79, 1997）、恐らくHER-2に富む腫瘍を免疫コントロールから回避させているだ
ろう。
【０００８】 エクトドメインを分割することで細胞性断片が作られることは、コロニー刺激
因子受容体（CSF-1R）（Downingら、Mol.Cell.Biol.9:2890-2896, 1989）、TrkA
ニューロトロピン受容体(Cabreraら、J. Cell. Biol. 132:427-436, 1996)、Axl
受容体(O’Bryanら、J. Biol. Chem. 270:551-557, 1995)及びHER-4（Vecchiら
、 J. Biol, Chem. 271;18989-18995, 1996）について報告されている。しかし
、HER-2/neu分割による切断型細胞産物は特定されていない。
【０００９】 切断型CSF-1Rはインビトロにてキナーゼ活性を持つこと（Downingら、Mol. Ce
ll. Biol. 9:2890-2896, 1989）、そしてフォルボールエステル腫瘍プロモータ
ーにより誘導された細胞質性HER-4が、殆ど又は全くキナーゼ活性を持っていな
いが（Vecchiら、J.Biol.Chem. 271:18989-18995, 1996）、その一方でプロテオ
ゾーム阻害剤で処理された細胞内にある切断型HER-4は活性型キナーゼであるこ
とが分かっている（Vecchiら、J.Cell. Biol 139:995-1003, 1997）。
【００１０】 従って、当該分野では切断型HER-2/neuポリペプチドを特定すること、及びも
しそれが一般的な酵素活性を有しているのか、あるいは特別なキナーゼ活性を持
っているのかを決定することが求められている。更に、この様な切断型ポリペプ
チドは、より希釈された形状にある分断されたECDをアッセイするよりもポリペ
プチドをアッセイする方が容易であることから、腫瘍診断、スクリーニング及び
予後のマーカーとして有用であると考えられている。
【００１１】 完全長膜貫通型ECDのECDはしばしばそのシグナル伝達活性に負の制御的拘束を
示す。遺伝子工学的にHER-2ECDの領域を欠失させると、発癌活性が増強されるこ
とが分かっている（DiFioreら、Science 237:178-182, 1987; Hudziakら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:7159-7163, 1987; Segattoら、Mol. Cell. Biol.8:5
570-5574, 1988;及びBargmannとWeinberg、EMBO J. 7:2043-2052, 1988）。この
ことは上皮増殖因子(EGF)受容体からECDを遺伝子工学的に除去することで、ある
いは正常型の細胞型には存在しているECD領域を欠く、ウイルスコードのv-erbB
、v-kit及びv-rosの発癌能より例示されている（RodringuesとPark, Curr. Opin
. Genet.Dev.4:15-24, 1994）。
【００１２】 N末端切断を伴う自然発生突然変異型EGF受容体が、複数のヒト癌で同定されて
おり（Moscatelloら、Cancer Res. 55:5536-5539, 1995）、そして細胞培養体及
び動物モデルに於いて構成的シグナル伝達活性と増強された発癌性の形質転換活
性を持っている（Moscatelloら、Oncogene 13:85-96, 1996;及びHuanら、J.Biol
. Chem.272:2927-2935, 1997）。
【００１３】 従って、当分野ではHER-2/neu受容体をよりよく研究し、乳癌に関するより高
感度の診断的及び予後的インジケータとして利用することができる、本蛋白質の
より良い領域があるか決定することが求められている。更に、局部リンパ節の様
な周辺組織を物理的に調べ、続いて困難な組織学的技術により組織を切片化する
のではない乳癌の様な各種腺腫のステージ及び予後のモニターに利用できる手段
も無い。従って、当分野では腺腫のステージを決定し、そして予後因子を更に決
定することで適当な治療方針を導く改良された手段の提供が求められている。本
発明は当分野に於ける前記需要に応えることを目的とし行われた。
【００１４】 発明の要約 本発明はN末端切断型HER-2/neu産物を初めて同定したことに基づく。本産物は
約95kDaの分子量を有し、さらにインビトロキナーゼ活性を有するポリペプチド
である。更に、ドメイン特異的抗体を利用した免疫沈降により、血液／血清中の
ECDを測定する際に経験する大きな希釈効果を持たない各種癌の診断及び予後イ
ンジケータとしての利用に好適である本特異的ポリペプチドを、細胞内断片から
分離することができる。95kDaポリペプチドが診断及び予後上価値を持っている
癌としては、例えばHER-2を過剰発現する癌であり、乳癌、胃ガン、非小細胞肺
癌及び前立腺癌がある。
【００１５】 本発明は、以下を含むHER-2を過剰発現している転移段階にある癌の診断的及
び予後的スクリーニング方法を提供する： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）細胞を溶解して細胞内容物を露出し、溶解物を形成させること；そして （ｃ）95HER-2ポリペプチドの存在について溶解物を測定すること。 好ましくは、溶解段階に続いて溶解物の不溶性物質から可溶性物質を分離する
追加段階を行い、密な繊維性物質を取り除く。好ましくは、測定段階はウエスタ
ンブロッティング、免疫化学、ELISA、及びその組合せより成るグループから選
択されるアッセイ方法を利用する。好ましくはHER-2を過剰発現する癌は、乳癌
、胃癌、前立腺癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌より成るグループから選択される。
【００１６】 本発明は、以下を含む、HER-2を過剰発現する転移段階の癌を診断的及び予後
的にスクリーニングするための方法を提供する： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）スタブ域が配列番号１のポリペプチド配列、又はその断片であるHER-2
のスタブ領域に結合する抗体を提供すること；そして （ｃ）露出した細胞外スタブ域を持つ細胞の割合を決定すること。
【００１７】 好ましくは、露出した細胞外スタブを持つ細胞の割合を決定する方法は、ウエ
スタンブロッティング、免疫化学、赤血球凝集法、ELISA、アフィニティークロ
マトグラフィー、及びその組合せより成るグループから選択されるアッセイ方法
を利用する。好ましくはHER-2を過剰発現する癌は、乳癌、胃癌、前立腺癌、非
小細胞肺癌及び卵巣癌より成るグループから選択される。
【００１８】 以下を含み、治療薬がHER-2結合リガンドである、HER-2を過剰発現している癌
の治療薬を利用した治療の治療有効性を推測する方法： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）スタブ域が配列番号１のポリペプチド配列、又はその断片であるHER-2
のスタブ領域に結合する抗体を提供すること；そして （ｃ）抗体への腫瘍細胞の結合の割合が高いことは癌が治療薬に対し耐性であ
ると思われることを示す、露出した細胞外スタブ域を持つ細胞の割合を決定する
こと。
【００１９】 好ましくは、露出した細胞外スタブを持つ細胞の割合を決定する方法は、ウエ
スタンブロッティング、免疫化学、赤血球凝集法、ELISA、アフィニティークロ
マトグラフィー、及びその組合せより成るグループから選択されるアッセイ方法
を利用する。好ましくはHER-2を過剰発現する癌は、乳癌、胃癌、前立腺癌、非
小細胞肺癌及び卵巣癌より成るグループから選択される。 好ましくは、治療薬がHER-2結合の細胞外ドメイン（Herceptin）に結合するヒ
ト化モノクローナル抗体である。 ヒドロキシメート化合物の有効量を投与することを含む、HER-2/neu陽性癌を
治療する方法。好ましくは、ヒドロキシメート化合物はTAPIである。
【００２０】 本発明は以下を含む乳癌予後に於ける結節の状態を決定する方法を提供する：
（ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）細胞内p95HER-2及びp185HER-2の両方を測定するために組織サンプルを分
割すること； （ｃ）細胞を溶解し細胞内含有物を露出し、p95HER-2アッセイ用に溶解物を形成
させること； （ｄ）p185HER-2について組織サンプルを測定すること；そして （ｅ）95HER-2ポリペプチドの存在について溶解物を測定することであり、その
中でp95HER-2陽性であり、且つp185HER-2に富む組織サンプルはリンパ節転移又
はその他転移を予測する。
【００２１】 好ましくは溶解段階に続いて、溶解物の不溶性物質から可溶性物質を分離する
追加段階が行われ密な繊維性物質が除かれる。好ましくは、測定段階はウエスタ
ンブロッティング、免疫化学、ELISA、及びその組合せより成るグループから選
択されるアッセイ方法を利用する。
【００２２】 発明の詳細な説明 本発明はN末端切断型HER-2/neu蛋白質（p95HER-2又は単にp95）を初めて同定
し特性決定したこと、そしてそれに続いてECD分割を検証し、関連付けし、そし
て乳癌病理因子と関連つけたことに基づく。
【００２３】 本発明は、C末端に対する抗ペプチド抗体を利用したウエスタンブロッティン
グ及び免疫沈降によっては検出されるが、p185HER-2/neuのN末端に対するモノク
ローナル抗体とは反応しない約95kDaのN末端切断型HER-2/neu産物を特定してい
る。p95HER-2については、抗neu(c)で免疫沈降する前にp185HER-2を細胞抽出物
から除いた時に、自己リン酸化することからキナーゼ活性があることが証明され
ている（図１）。
【００２４】 複数のコントロール及び抽出操作を行い、p95がインビトロでの分解によって
生じた人為的産物である可能性は排除されている。プロテアーゼ阻害剤と共に細
胞を抽出すると、２種類の主要細胞室性HER-2/neu蛋白質であるp95HER-2と-185H
ER-2だけが認められ、より小型の産物は示されなかった。p95HER-2の量は、煮沸
10%SDS-含有緩衝液中での細胞の直接抽出を含む、プロテアーゼ活性を除く作業
によっても影響を受けなかった。
【００２５】 N末端切断型受容体チロシンキナーゼ生成に関する従来報告されているメカニ
ズムの一つは、それらECDの蛋白質分解による放出である（Downingら、Mol. Cel
l. Biol. 9:2890-2896, 1989; Cabreraら、J. Cell. Biol. 132:427-436, 1996
; O’Bryanら、J. Biol. Chem. 270:551-557, 1995;及びVecchiら、J. BIol. Ch
em. 271: 18989-18995, 1996）。培養細胞中でのp95HER-2産生は細胞内蛋白質処
理により生じる。HER-2/neu cDNAをトランスフェクトされた17-3-1細胞中にp95H
ER-2が存在することは、p95HR-2が別の形の転写体産物ではなく、蛋白質分解産
物であることを示している。
【００２６】 更に、p95HER-2及び培養細胞から放出された可溶性HER-2 ECDとは相関した。
まず、p95HER-2及びECD量は共にBT474細胞に比べSKOV3細胞内で低くかった（図
４）。第２に、TPA 及びクロロキンで長時間（24時間）処理されることで95HER
-2及びECDが共に増加することから（図４）、切断型HER-2産物が一般の経路を通
じ産生されることが示された。
【００２７】 この刺激に関するメカニズムは直接検証されていないが、細胞がTPAに長期間
曝されることがRTKs（受容体チロシンキナーゼ）の内部移行を促進することが分
かっている（Seedorfら、J. Biol. Chem. 270:18953-18960, 1995）。更に細胞
内エンドゾーム及びリソゾーム内のpHを変化させる作用物質であるクロロキンは
蛋白質分解を完全に阻害するか、PTKの移動を変化させる（Marsahll, J. Biol.
Chem 260:4136-4144, 1985）。
【００２８】 最終的には生細胞のp95HER-2及びECDレベルは共にヒドロキシメート化合物で
あるTAP1により阻害される。阻害はTAPI濃度が10μM以下のときに最大であった
（図5）。TAPIによる強い阻害は、BT474細胞中のECD及びp95HER-2の大部分が金
属プロテアーゼにより生起されていること（McGeehanら、 Nature 370:561, 199
4;及びMohlerら、Nature 370:218-220, 1994）そしてプロテアーゼ阻害剤のこの
分類は乳癌患者に於ける分割の制御に有効であることを示している。
【００２９】 p95HER-2及び分割は様々な条件の下に変化するが、細胞性のp185HER-2レベル
の変化は認められなかった。TPAで誘導されたとき分割されるだけの複数の膜貫
通型蛋白質と異なり、p185HER-2の蛋白質分解性の分割は基礎レベルに於いて2時
間で約20％だけが可溶性ECDに変換するという（Pupaら、Oncogene, 8:2917-2923
, 1993）低レベルで継続的に起こっており（LinとClinton, Oncogene 6:639-643
, 1991;及びZabreckyら、J. Biol. Chem. 266.1716-1720, 1991）。
【００３０】 ここに記載の約95kDaの切断型細胞蛋白質は、〜105-110kDaECDの細胞質残存体
について期待される75-80kDaに比べ若干長い。ECDは糖化され、ゲル移動に於い
て複数のバンド生ずる。P95HER-2又はECDは、ECD分割に関し切断位置は知られて
いないことから、ゲル内を変則的に移動するのだろう。ECD及びp95HER-2は培養
体中では、金属プロテアーゼ阻害剤に対し感受性である蛋白質分解活性により協
調的に産生される。
【００３１】 同じ大きさ、95kDaのHER-2/neu産物がトランスフェクトされた3T3細胞、培養
乳癌細胞、乳癌組織、そして卵巣癌組織中にあることは、様々な細胞で同様の蛋
白質分解工程が起こっていることを示している。しかし、p95HER-2はp185HER-2
を含むいずれの細胞及び腫瘍組織中にも検出されなかった。２種類の非腫瘍性乳
房上皮細胞株ではp95HER-2は検出されなかった（図2）。
【００３２】 更にp185HER-2を過剰発現しているSKOV3卵巣癌細胞のp95HER-2含有量は非常に
低かった（図4）。これら観察結果は、p95HER-2の産生が制御されていることを
示している。様々なレベルの切断型HER-2/neu産物を持つ細胞では、有効なプロ
テアーゼ活性の大きさが異なっているか、又は蛋白質基質が蛋白質分解に対する
感受性に影響するような立体構造上の変化を起こしているのだろう。
【００３３】 P95HER-2/neuはキナーゼ酵素活性を有している。それはトリシンリン酸化を受
けており、またそのN末端から切断される。HER-2/neuによる癌化シグナル伝達は
、そのキナーゼ活性のレベルに依存している（DiFioreら、Science 237:178-182
, 1987; Hudziakら、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84;7159-7163;及びSegattoら
、Mol. Cell. Biol. 8:5570-5574, 1988）。p95HER-2は一部乳癌サンプルでは10
0%p185HER-2であることから、それはキナーゼシグナル伝達の大きさに影響を及
ぼした。
【００３４】 更に、p95HER-2の様なN末端が切断されたキナーゼドメインは、HER-2/neu産物
から遺伝子工学的にECDを欠失された場合の結果からの類推より構成的なシグナ
ルを発することが期待される（Vecchiら、J. Cell Biol. 139: 995-1003, 1997;
DiFireら、Science 237: 178-182, 1987; Hudziakら、Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 84:7159-7163, 1987; Segattoら、Mol. Cell. Biol. 8: 5570-5574, 1988;
及びBargmannとWeinberg, EMBO J. 7:2043-2052, 1988）。これらデータ（ここ
に提供された）をまとめるとp95HER-2は一部患者に於いてキナーゼシグナルを上
昇させ、それに伴って腫瘍の増殖がより攻撃的になることを示している。
【００３５】 癌組織はウエスタンブロッティングにより分析され、p95HER-2及びｐ185HER-2
/neu発現についてスコア化された。乳癌及び卵巣癌組織は共にp185HER-2/neuに
加えp94HER-2も発現していることが見いだされている。調べた161例の乳癌組織
中22.4%がp95HER-2を発現し、21.7%がp185HER-2を過剰発現し、14.3%が05HER-2
陽性であり且つp185HER-2を過剰発現していた。全腫瘍をまとめると、p95HER-2
を発現している割合は結節陰性例（63例中９例）よりも結節陽性患者（78例中23
例）で高かった（P=0.032）。
【００３６】 p185HER-2を過剰発現しているグループでは、p95HER-2を含む例には血清陽性
患者が多く（21例中15例）、一方p95陰性である例には結節陰性患者が多い（11
例中８例）（P=0.017）。本研究ではp95HER-2あるいはp185HER-2に富む患者は、
腫瘍サイズについてもホルモン状態についても相関性を示さなかった。これらデ
ータは、HER-2/neu発癌遺伝子を発現している乳癌患者はHER-2/neu蛋白質産物に
関し不均一であることを示している。更に、p95HER-2/neuは、結節陰性患者から
リンパ節転移を有する腫瘍例を区別すると考えられた。
【００３７】 以下実施例では、161例の乳癌組織はホモジェナイズされ、分画化された後、p
185HER-2をその切断型細胞質性蛋白質、p95HER-2と区別する技術であるウエスタ
ンブロッティングで分析した。Tandonら（Tandonら、 J. Clin. Oncol. 7:1120-
1128, 1989）により実施された研究でも乳癌組織抽出物に対しウエスタン分析法
が用いられているが、Tandonらは完全長産物であるp185HER-2のみを評価してい
るに過ぎない。今回のデータはTandonらが報告した結果に一致した。実施例中の
これらデータはp185HER-2が乳癌でより多く発現しており、その亜集団は21.7％
であり、Tandonらの高値陽性とされた16%より多い。
【００３８】 以下の実施例中の出０他は、HER-2/neuを発現している乳癌は、蛋白質産物に
関しては不均一であることを示している。異なる産物、p95HER-2及びp185HER-2
は結節状態と異なる関連性を示す。p185HER-2を過剰発現しているグループは結
節状態と関連していないが（表１）、p185に富みp95HER-2を含むグループは有意
にリンパ節転移と関連していた（表２）。
【００３９】 このことは、p185HER-2蛋白質過剰発現又はHER-2/neu遺伝子増幅のアッセイに
基づくリンパ節転移との関連性を示そうとした複数の従来研究の結果が一致しな
いことの説明に役立つだろう（例えば、SingletonとStrickler, Pathol. Annual
27 Pt1:165-198, 1992を参照せよ）。理論と結びつけることなく、これらデー
タの生物学的解釈はp95HER-2キナーゼからのECD制御域の消失は、原発性乳癌に
於けるp185HER-2シグナルの増幅と併せて、リンパ節等への転移を促進するとい
うものである。
【００４０】 これらデータではP95HER-2陽性、又はp185HER-2高陽性サンプルは腫瘍サイズ
又はホルモン受容体の状態を含むその他予後マーカーとは相関しなかった。腫瘍
サイズとの間に一定の相関性は認められなかったが、他の研究ではHER-2/neuの
過剰発現がER及びPR陰性と関連性があると報告している（SingletonとStrickler
, Pathol. Annual 27 Pt1:165-198,; Tandonら、J. Clin. Oncol. 7: 1120-1128
, 1989;及びCarlomagnoら、J. Clin. Oncol. 14: 2702-2708, 1996）。
【００４１】 更に、ここに報告されたデータとは異なり、HER-2過剰発現とホルモン受容体
の状態との間の関連性が、高リスク患者の亜集団もしくはホルモン受容体レベル
により階層化されたグループで検証されている（Tandonら、J. Clin. Oncol. 7:
1120-1128, 1989;及びCarlomagnoら；及びJ. Clin. Oncol. 14:2702-2708, 1996
）。
【００４２】 結論として、腫瘍組織中でのHER-2/neu過剰発現は強力な結節陽性患者に於い
てのみ予後マーカーである（Slamonら、Science 244:707-712, 1989; Singleton
とStrickler, Pathol. Annual 27 Pt 1:165-198, 1992; Slamonら、Science 235
:177-182, 1987; Pressら、Progress Clincal & Biological Research 354, 209
-221, 1990; Hynesら、Biochem. Biophys. Acta 1198:165-184, 1994;及びTando
nら、J. Clin. Oncol. 7:1120-1128, 1989）。ここに示したデータは、p95HER-2
が主にリンパ結節の関与を示すHER-2/neu陽性患者に認められることを示してい
る。p95HER-2がより強く発現していることは、結節陽性患者に於いてHER-2/neu
の持つ予後上の意味が大きいことを説明する重要な因子である。
【００４３】 ECD及びp95HER-2は、GT474乳癌細胞に比べるSKOV3卵巣癌細胞では約20倍低レ
ベルである。いずれも細胞をフォルボールエステル腫瘍プロモーター（TPA）及
びライソゾーム栄養性作用物質であるクロロキンで処理することで刺激される。
金属プロテアーゼのヒドロキシメート阻害剤、TAPIは、95HER-2もECD（HER-2/ne
u細胞外ドメイン）も共にBT474細胞に於いて用量依存的に阻害を示し、そして10
μM以下にて最大阻害を示した。 ECDの蛋白質分解性の放出によりキナーゼ活性を持つN末端切断型、膜結合断片
を作ると考えられる。
【００４４】 P95HER-2 P95HER-2は185HER-2のC末端ポリペプチド断片であり、その全配列はCoussens
ら、Science 230:1132-1139, 1985により初めて公開された。P185HER-2は1255位
置のVal残基で終止する1255アミノ酸ポリペプチドである。p95HER-2のN末端は位
置639のAsp付近から位置645のGlu残基付近に始まる。最も位置643のProがN末端
残基であると思われる。
【００４５】 ヒドロキシメート化合物 本発明は更に、HER-2を過剰発現する化合物を、次式Ｉ記載のヒドロキシメー
ト化合物を投与することで治療するための方法を提供する：
【００４６】
【化１】 前記Ｘはヒドロキサム酸、チオール、ホスフォリル又はカルボキシルであり；
ｍは０．１、又は２であり；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は独立に水素、アルキレン（シク
ロルキル）、ＯＲ4、ＳＲ4、Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）、ハロゲン、置換型又は非置換型
Ｃ1ないしＣ6アルキル、Ｃ1ないしＣ6アルキレンアリール、アリール、天然型α
アミノ酸の保護型又は非保護型側鎖；又は式中のＲ6が置換型又は非置換型Ｃ1な
いしＣ8アルキルであり、Ｒ7がＯＲ4、ＳＲ4、Ｎ（Ｒ4）（Ｒ5）またはハロゲン
であって、前記Ｒ4及びＲ5が独立に水素もしくは置換型あるいは非置換型Ｃ1な
いしＣ8アルキルであり；かつ前記ｎは０、１又は２であるグループＲ6Ｒ7であ
り、ｎが１の時が第１規定であり、且つＡは保護型又は非保護型αアミノ段ラジ
カルであり；ｎが２のとき第２規定であり、且つＡは同一又は異なる保護型又は
非保護型αアミノ酸ラジカルであり；Ｂは非保護型又は置換型Ｃ2ないしＣ8アル
キレンである。式１の化合物を合成する方法は、米国特許第5,629,285号に開示
されており、その開示はここに参照され取り込まれている。医薬品製剤も米国特
許第5,629,285号に開示されている。
【００４７】 実施例１ 本実施例は、キナーゼ活性を持つN末端切断型HER-2/neu蛋白質の同定を例示し
ている。3T3細胞をHER-2/neucDNAにてトランスフェクションし（17-3-1細胞）（
Applied BioTechnology Inc. Cambridge, MA）そしてp185HER-2/neuの蛋白質分
解処理により可溶性ECDを放出させた（Zabreckyら、J. Biol. Chem.266:1716-17
20, 1991）。切断型細胞質産物を検出するために、17-3-1細胞抽出物をゲル及び
HER-2/neu産物のC末端免疫に対する抗体（抗neu(C)を利用したブロットにて解析
した。
【００４８】 17-3-1細胞は0.4mg/mlのゲンタマイシン（G418GIBCO-BRL）を含む5%の胎児ウ
シ血清が添加されたDulbeccoの改良Eagles培地（DMEM）中で培養された。簡単に
述べると、anti-neu(C)は既報のものである（Linら、Mol. Cell. Endocrin. 69:
111-119, 1990）。HER-2.neuの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は既
報の如くに調製され（McKenizeら、Oncogene 4:543-548, 1989）そしてAppliedB
ioTechnology社より供給された。
【００４９】 簡単に述べると、新たに1%のNonidetP-40を含むTEG緩衝液（50mM Tris, 1.5,M
EDTA, 0.5mM ジチオスレイトール、10%グリセロール、pH7.5に1%アプロチニン
、2mMのPMSF及び2mMのバナジウム）に調製された細胞溶解物を、既報（Linら、M
ol. Cell. Endocrin. 69:111-119, 1990）に従い抗体と２時間、４℃にて振盪し
ながら抗体と反応させ免疫沈降させた。
【００５０】 プロテインGセファロース（Pharmacia）に結合した免疫複合体を２回TEDG緩衝
液で洗浄し、10分間氷上にて10mMHEPES、pH8.0、2mMジチオスレイトール、25μM
バナジウム、0.5%NonidetP-40、10mMMnCl2、１μMのATP、及び15μCiの（γ-32P
）ATP（New England Nuclear）を含むキナーゼ反応混合液中にインキュベーショ
ンした。免疫複合体は３回緩衝液で洗浄され、蛋白質は２分間SDS-PAGEサンプル
緩衝液中で煮沸され、放出させられた。
【００５１】 ２種類の主要産物が細胞抽出物中に検出された；完全長p185HER-2/neuと約95k
Daの切断型蛋白質である（図１、レーン１）。抽出物は免疫沈降され、95kDa蛋
白質、及び185HER-2/neuは免疫複合体中に（γ-32P）ATPにてリン酸化された（
図１、レーン２）。p185HER-2/neuのN末端域に特異的なモノクローナル抗体（抗
-neu(N)）はp95HER-2を免疫沈降しないことから、N末端が失われていることが示
された（図１、レーン３）。従ってp95HER-2はp185HER-2の断面であり、N末端断
片ではない。
【００５２】 実施例２ 本実施例は、p95HER-2が自己リン酸化活性を有しており、そして完全長受容体
キナーゼの基質ではないことを例示する。p185HER-2をまず細胞溶解体から抗-ne
u(N)抗体を利用し除き、次にp95HER-2を抗-neu(C)抗体により実施例１記載の如
くに免疫沈降した。p95HER-2は,P185HER-2レベルが大きく欠失した時リン酸化さ
れた（図１、レーン４）。これらデータは、p95HER-2がキナーゼ酵素活性を持つ
ことを示している。
【００５３】 更に、p95HER-2キナーゼ活性はヒト乳癌細胞内に存在するが、非癌性の上皮細
胞内には存在しない。可溶性ECDを放出することが知られている（LinとClinton,
Oncogene 6:639-643, 1991）ヒト癌細胞株BT474は２カ所の自己リン酸化HER-2/
neu産物、p185HER-2及びp95HER-2も含んでいる。ヒト乳癌細胞株PT474は１０％F
BS及び10μg/mlインスリンを添加されたRPMI培地中に培養された。いずれも非癌
性乳房上皮細胞株HBL-100に比べ高いレベルにあった（図２）。
【００５４】 p95は低レベルのp185HER-2を発現していることから、少数のHBL-100細胞中のp
95が検出されていない可能性もあった（Krausら、EMBO J 6:605-610, 1987）。H
ER-2/neu発現のレベルの違いを補正するために、ヒト乳腺上皮細胞（HMEC）であ
るhBL-100及び３種類の乳癌細胞株からの抽出量を補正し、蛋白質を（γ-32P）A
TPにてリン酸化した。P95HER-2は低(MDA-MB-453)及び高（BT474及びSKBR3）HER-
2/neu発現乳癌細胞では検出されたが、HLB-100及びHMEC細胞では乳房上皮細胞中
では若干小さい蛋白として移動するHER-2/neu受容体から強いシグナルがあるに
も関わらず検出されなかった（図２）。
【００５５】 実施例３ 本実施例はp95HER-2がキナーゼ酵素活性を持つチロシンリン酸化ポリペプチド
であり、そしてBT474細胞の膜分画に局在していることを例示する。チロシンキ
ナーゼ受容体のリン酸化は一般にはシグナル伝達の活性化を示している(Hynesら
、Biochem. Biophys. Acta 1198:165-184, 1994;及びDougallら、Oncogene9:210
9-2123, 1994）。p95HER-2のチロシンリン酸化及びその細胞内局在を、BT474細
胞抽出物を可溶性分画と粒子分画に分画化して検証した。
【００５６】 各分画は抗-neu(C)で免疫沈降され、続いてリン酸化チロシンに対するモノク
ローナル抗体を利用したウエスタンブロッティング分析にかけられた。簡単に述
べると、SDS-PAGE後細胞溶解物又は濃縮したコンディション培地からの蛋白質を
ニトロセルロース（Trans-Blot、Bio-Rad）上に、半乾燥式トランスファー装置
を利用し（Bio-Rad）、25mM Tris pH8.3, 192mM グリシン、50mMNaCl、20%メタ
ノールで平衡化した0.75mm厚ミニゲル（Mini-PROTEANII電気泳動セル、BioRad）
当たり15ボルト、20分間にてエレクトロブロットした。
【００５７】 結合部位は膜を5%非脂肪性ドライミルクでインキュベーションしてブロックし
た。一次抗体とインキュベーションした後、ブロットを15分間２回洗浄し、そし
て0.05%のTweenを含むTrisで緩衝化した生理食塩水（TBS）で４回、５分間洗浄
し、続いてTBS-Tweenで希釈された西洋ワサビパーオキシダーゼ(HPR)標識された
ヤギ抗ウサギ又はヤギ抗マウス抗体（Bio-Rad）と40分間インキュベーションし
た。二次抗体とインキュベーションした後、ブロットを上記同様にTBS-Tweenで
洗浄し、化学発光試薬（Pierce）で発光させた。
【００５８】 図３は、粒子分画中にp185HGER-2と共に分画化されたチロシンリン酸化p95HER
-2を例示している。粒子分画は原形質膜を含む。P95HER-2は更にまず抗リン酸化
チロシン抗体で免疫沈降し、続いて抗-neu(C)抗体を利用したウエスタンブロッ
トをプロービングすることでもチロシンリン酸化されていることが示された（例
示なし）。
【００５９】 実施例４ 本実施例はp95HER-2ポリペプチドの細胞内レベルが各種細胞から放出される可
溶性ECDのレベルに対応することを示している。可溶性ECDとp95HER-2との関連性
を検証するために、様々な条件の下に各種細胞におけるそれらのレベルを比較し
た。ECD及び細胞性p95HER-2/neuの基礎レベルはまずHER-2/neuを過剰発現してい
る２細胞株、BT474及び卵巣癌細胞株SKOV-3にて検証された。両細胞株は低レベ
ルのECDを生ずることが報告されている（Pupaら、Oncogene 8:2917-2923,1993）
。
【００６０】 p185HER-2及び細胞蛋白質に対するp95HER-2量は、BT474細胞で大きく増加して
いた。従って、BT474細胞からの細胞外培地中にある、抗-neu(N)抗体で検出され
るECDは、SKOV3細胞に比べ10倍増加していた（図４）。 複数の細胞膜蛋白質の分割はフォルボールエステル腫瘍プロモーターにより迅
速且つ一過性に誘導される（EhlersとRiordan, Biochem. J. 321:265-279, 1997
）。腫瘍プロモーターによる短時間処理は、HER-2の分割を誘導しなかった（Vec
chiら、J. Biol. Chem. 271:18989-18995, 1996）のに対し、クロロキノンと相
乗的に慢性投与されたフォルボールエステルTPAは可溶性HER-2の放出を促進した
。
【００６１】 p95HER-2及びECDが協調して制御されているか決定するために、TPA (500nM)
及びクロロキン（50μM）又はコントロール賦形剤がBT474及びSKOV3細胞の培養
培地に加えられた。SKOV3細胞は10%FBS及び抗生物質である0.05%のゲンタマイシ
ンが添加されたDMEM中で増殖させられた。24時間時の細胞外培地中のECDレベル
と細胞抽出物中のp95HER-2レベルについて分析した。
【００６２】 可溶性ECDは刺激されたBT474細胞及びSKOV3細胞のコンディショニング培地で
は数倍増加したが、一方p95HER-2はBT474細胞で約３倍ダウンレギュレーション
されていた（図４）。イムノブロットを過剰露出させると、SKOV3細胞抽出物中
のp95HER-2もまたTPA及びクロロキンにより約３倍刺激されていることが示され
た（図中データ未提示）。
【００６３】 実施例５ 本実施例は、金属プロテアーゼがPT474のp95HER-2及びECDのレベルを抑制する
ことを例示している。各種膜貫通蛋白質の分割は、強力な金属プロテアーゼ阻害
剤であるヒドロキサム酸をベースとした化合物により阻害される（McGreehanら
、Nature 370:561,1996）。従って、各種濃度のヒドロキサム酸、TAPI（Mohler
ら、Nature 370:218-220, 1994）のHER-2/neuECDの分割、及びp95の細胞レベル
に及ぼす作用について調べた。
【００６４】 TAPI（０ないし40μM）を培養したBT474細胞に24時間加え、濃縮したコンディ
ショニング培地中のECDを抗neu(N)を用いたイムノブロティングにより分析し、
そしてp95HER-2及びp185HER-2ポリペプチドを抗neu(C)モノクローナル抗体を利
用し細胞抽出物中に検証した。図５の結果は、ECD産生が部分的に1μMのTAPI濃
度で阻害され、10μMTAPI濃度で最大に阻害されることを示している。ECDの約10
％の残存量は、40μMのTAPIによる阻害に対しても耐性であった。細胞質中の切
断型p95HER-2のレベルもTAPIによって阻害されたが、1μM濃度ではその作用は殆
どあるいは全く無く、10μM濃度で最大阻害を示した（図５）。これらデータは
別の細胞株でも再現した。
【００６５】 ３回行った独立実験では、１μMのTAPIがECD及びp95HER-2レベルを50％以下に
阻害したが、いずれの例でも最大阻害は10μMのTAPI濃度により達成された。TAP
Iで処理された細胞、又は分割をTPAとクロロキンで刺激した場合にはp185HER-2/
neuレベルに変化は認められなかった（図４）。理論に結びつけるまでもなく、
これらの結果はp185HER-2の蛋白質分解工程が構成的であること、そして２時間
の間には約20％だけが可溶性HER-2/neuに変換されることによるものである（Pup
aら、Oncogene 8: 2917-2923, 1993）。 TAPIも細胞株内でp95HER-2を増加させた。しかし、その作用のメカニズムは異な
ると考えられる。
【００６６】 実施例６ 本実施例は、乳癌組織中でのp185HER-2及びp95HER-2の検出を例示している。
腫瘍組織はホモジェナイズ、分画化され、HER-2/neu蛋白質についてウエスタン
分析された。簡単に述べると、新鮮状態で凍結され、-70℃にて保存されていた
腫瘍組織0.1gmをドライアイス上でミンチし、TEDG緩衝液中に懸濁した。組織は
ブリンクマンポリトロンを用いて5-10秒間ホモジェナイズし、冷却プローブで2-
3回バーストさせた。
【００６７】 ホモジェナイズ体を1500×g、10分間、４℃で遠心分離した。脂質層を木製ス
ティックで取り除き、上清を20分間、40,000×g、4℃で遠心分離した。脂質層を
木製スティックで集め、上清をデカントし、膜を含む沈査を0.1%SDSを含むTEDG
緩衝液で20分間、間欠的に振盪して溶解し、15,000g×gで15分間遠心分離し、清
浄化した。上清の蛋白質濃度はBio-Rad社製アッセイ試薬を使い決定され、一部
は-80℃にて保存された。
【００６８】 乳癌組織チュのp95HER-2及びp185HER-2は以下の方法に従い分析された。各腫
瘍サンプルから調製された膜分画の蛋白質約20μgを、10％ゲルによるSDS-PAGE
中、変性及び還元条件下に変性された。各ゲルは17-3-1細胞の抽出物の蛋白質３
μgも含んでおり、p185及びp95の移動度を示すことから試験全体の標準として利
用された。蛋白質は上記同様にしてメンブレン上にエレクトロトランスファーさ
れ、４度のTBS-Tweenで1:10,000に希釈された抗neu(C)と一晩振盪しながらイン
キュベーションされ、続いて1:10,000に希釈されたヤギ抗ウサギHRP標識抗体（B
io-Rad）と40分間室温にてインキュベーションされた。
【００６９】 ブロットを発色させるために、メンブレンは化学発光試薬（Pierce）と５分間
インキュベーションされ、続いてKodak X-OMAT ARフィルムに１，５、20及び120
分間露光した。p185HER-2/neuを過剰発現しているサンプルを特定するため、HER
-2/neuに富む（400単位以上）のHER-2免疫アッセイ値を持つと考えられる検体を
低HER-2/neu値を持つサンプルと比べ、ウエスタンブロット分析によりコントロ
ールの17-3-1細胞に対するそれらのp185HER-2シグナルについて特性を調べた。
サンプルはフィルムに対するメンブレンの1分間露光により検出できるp185HER-2
シグナルを持つ高陽性に等級付けされ、フィルムのレーザーデンシトメーターに
よれば３μgの17-3-1に認められるp185HER-2レベル以上であった。
【００７０】 抽出サンプルについてHER-2/neu組織抽出物ELISAアッセイを行った。簡単に述
べると、上記に従い乳癌組織より調製された富メンブレン分画の一部をTriton D
iagostics社製c-erbB-2組織抽出EIAキット（Chiba Corning）をメーカー指示書
通りに使いアッセイした。このアッセイは２種類のHER-2/neuECDに対するモノク
ローナル抗体を利用する。検体のHER-2/neu単位/mg蛋白質は、免疫アッセイより
得た吸収値に対するキャリブレーション標準物質のHER-2/neu濃度をプロットし
て作製されたキャリブレーション曲線から計算された。
【００７１】 各患者より得た組織の臨床情報には、年齢、結節状態、原発性癌の大きさ、患
者の年齢、診断時の病気の段階、エストロゲン受容体(ER)レベル及びプロゲステ
ロン受容体（PR）受容体レベルに関する情報を含んだ。検体が細胞質ゾル他派櫛
津mg当たり少なくとも10fmolの特異的結合部位を含む場合、検体はER陽性及びPR
陽性と考えられた。検体の段階には、段階０の１検体、段階１の32検体、段階II
の56検体、段階IIIの45検体及び段階IVの13検体が含まれた。15検体が段階不明
であった。患者の平均年齢は60際であった。８例の卵巣癌には、等級IIIの３検
体と等級IVの５検体が含まれた。
【００７２】 本法を利用した場合、サンプルの21.7%がp185HER-2を過剰発現した。この比率
は多くの臨床試験に於けるHER-2/neu過剰発現している乳癌例の15-30％と同等で
あった。p95HER-2が検出可能なサンプルでは、そのレベルはp185の10%ないし100
%の範囲であった。本研究では、フィルムに対しメンブレンを２時間露光した場
合、p185HERに対し10％以上多くp95HER-2が検出された場合に検体を陽性と判定
された。一次抗体の高neu(C)の力価が高いため、イムノブロットを２時間フィル
ムに露光した場合でも殆どバックグランドは認められなかった。
【００７３】 幾つかの腫瘍組織から得た富メンブレンではあるが可溶性ではない分画（デー
タ未提示）は、完全長の産物、p185HER-2及びコントロール17-3-1細胞由来のHER
-2/neu蛋白質と共移動する切断型p95HER-2/neu蛋白質を含んだ（図６）。更に８
卵巣癌組織中２例について、p185HER-2と共にp95HER-2が検出された（データ未
提示）。複数の乳癌組織の初回分析からは、p95HER-2とp185HE R-2が異なる発
現パターンを持つことが示された。あるグループはp185HER-2又はp95HER-2が検
出されなかった（図６の#39及び#69参照）。
【００７４】 第２分類はp185HER-2とp95HER-2ポリペプチドの両方を発現している（#60、53
、04及び22）。別のグループはp185HER-2を比較的僅かなp95HER-2ポリペプチド
と共に、あるいはp95HER-2ポリペプチドなしに含んでいた（#40、58、38、57、1
7及び75）。他の研究者による従来研究にて観察されている様に、幾つかのサン
プルはp185HER-2に富んでいた（#04、22、57、17及び75）。p185HER-2について
強陽性とされたサンプルは、免疫アッセイ値により当初400単位以上であること
が特定された。ウエスタン分析の結果は、腫瘍がHER-2/neu蛋白質産物に関し不
均一であること、そしてそれらがp95HER-2の有無により亜分類されることを示し
た。
【００７５】 161例の乳癌サンプルのウエスタンブロット分析は、22.4%がp95HER-2陽性であ
ることを示した。p185HER-2陽性サンプルは更に免疫アッセイにより特定されたH
ER-2/neu過剰発現サンプルとの比較とコントロールの17-3-1抽出物との比較から
“強陽性”又はHER-2富検体に亜分類された。“強陽性”p185HER-2腫瘍サンプル
は全体の21.7%であった。
【００７６】 p95HER-2を発現する全ての腫瘍サンプルは同時にp185HER-2についても陽性で
あったが、p185陽性腫瘍サンプルの65%は検出可能なレベルのp95HER-2ポリペプ
チドを含まなかった。p95HER-2陽性腫瘍サンプルの家3.9%はp184HER-2について
も強陽性であり、36%についてはp185HER-2のレベルは低かった。従って細胞内p9
5HER-2ポリペプチドの検出は有効な予後インジケーターと考えられた。
【００７７】 実施例８ 本実施例は、p95HER-2陽性腫瘍サンプル、p185HER-2強陽性腫瘍サンプル及び
その他の乳癌又は卵巣癌の予後因子間の関連性を例示している。78の結節陽性乳
癌患者の内のかなりの割合が、結節陰性患者に比べp95HER-2ポリペプチドを細胞
内腫瘍サンプル中に発現していた（P=0.032）。更に、富p185HER-2サンプルは結
節状態と有意な関連性を持っていなかった（表１）。p95HER-2陽性又は富p185HE
R-2サンプルはいずれも、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体陰性又
は3cm以上の腫瘍サイズを含むその他既知の予後不良推測因子との間に有意な相
関性を示さなかった（McGuireら、E.Engl.J.Med.326: 1756-1761, 1992）（表
１）。
【００７８】
【表１】
【００７９】 実施例９ 本実施例はp185HER-2強陽性グループでのp95HER-2の影響を例示する。本実験
は、なぜ同様の割合の結節陽性及び結節陰性の患者が富p185HER-2である（24.4%
耐22.2%）のに、p95HER-2については富p185HER-2サンプルの65.7%がp95HER-2を
含み、結節陽性患者に関連しているのかという疑問から発している。実験では、
p185HER-2/neuを過剰発現している検体中のp95HER-2の有無がリンパ節状態との
関連性に影響するかについて検討した（表２）。p95HER-2を含むp185HER-2強陽
性（n=21）はリンパ節転移と有意に強く相関したのに対し、p95HER-2陰性のp185
HER-2強陽性例（n=11）はリンパ節陰性患者に関連した（P=.07）
【００８０】
【表２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はキナーゼ酵素活性を有するN末端切断型HER-2/neu産物を示す。17-3-1細
胞の蛋白質やく25μgを1:10,000に希釈された抗-neu（ｃ）抗体を利用しウエス
タンブロッティングにかけた（レーン１）。レーン2-4は、400μgの蛋白質は抗-
neu（Ｃ）（レーン2,4）で免疫沈降させられるか、あるいは細胞外ドメインに対
するモノクローナル抗体、抗-neu(N)（レーン３）免疫沈降させらあれ、もしく
は抗-neu(N)で２回抽出してp185HER-2/neuを除いた後に抗-neu(c)で免疫沈降さ
せられた。免疫複合体は(32P)ATPにてリン酸化され、SDS-PAGE及びオートラジオ
グラフィーにて分析し、キナーゼ活性を証明した。
【図２】 図２はヒト乳癌細胞株がp95HER-2/neuを含むことを示す。BT474、HBL-100、MD
A-MB-453、SKBR3、HMEC及び17-3-1細胞からの細胞溶解物の提示量を抗-neu(c)で
免疫沈降し、上記図１記載と同一方法によりリン酸化した。
【図３】 図３は、BT474乳癌細胞の粒子分画無いにp95のチロシンリン酸化が局在するこ
とを示す実験結果を提供する。粒子(P)及び可溶性(S)分画は、107細胞を3mlのホ
モジェナイズ緩衝液（10mM Tris pH7.4, 10mM NaCl, 2mM MgCl2に2mMのバナジウ
ムとプロテアーゼ阻害剤を加えた）中、氷中10分間インキュベーションし、続い
てダンス型ホモジェナイザーにてホモジェナイズし、更に100,000gの遠心分離を
１時間行い調製された。沈査を3mlのホモジェナイズ緩衝液に再懸濁された。粒
子分画から得た約200μgの蛋白質と等量の可溶性分画を抗-neu(c)で免疫沈降し
、抗フォスフォチロシンモノクローナル抗体（Sigma）を利用したウエスタンブ
ロッティングにかけた。これらのデータは、p95HER-2が原形質膜（185HER-2と共
に）に局在していること、そしてp95HER-2がインビボにてリン酸化され、これが
シグナル伝達活性のインジケータであることを示している。
【図４】 図４は、SKOV3及びBT474細胞内でのp95及びECDの発現を示す。細胞は24時間無
血清培地中にコントロールの賦形剤、又は500nMのフォルボールエステルTPA及び
50μMのクロロキンで処理された。上パネル（図4A）では、5mlのコンディショニ
ング培地が100倍濃縮され、非還元状態下に変性させられ、細胞抽出蛋白質に対
し標準化されたその一部が抗-neu(N)モノクローナル抗体1μg/mlを利用したウエ
スタンブロッティングにより分析された。下パネル（図4B）では、細胞蛋白質20
μgが抗-neu(c)抗体を利用するウエスタンブロッティングにより分析された。図
４に示すデータは、３回行った二重測定実験の例示である。
【図５】 図５は、P95HER-2及びECDがヒドロキサム酸、TAPIにより阻害されることを示
す。無血清培地中のBT474細胞を24時間コントロールの賦形剤、又は１，10、20
及び40μMのTAPI（Immunex、Seattle、WAより供与）で処理された。上パネル（
図5A）では、濃縮され、非還元状態下に変性させられ、細胞抽出蛋白質に対し標
準化されたものが抗-neu(N)モノクローナル抗体を利用したウエスタンブロッテ
ィングによって分析された。同様にな結果は欠く培地より得たコンディショニン
グ培地由来蛋白質５μgを分析した時にも得られた。下パネル（図5B）では、細
胞蛋白質20μgが抗-neu(c)抗体を利用するウエスタンブロッティングにより分析
された。
【図６】 図６は12乳癌細胞組織のウエスタンブロッティング分析を示す。12例の患者よ
りヒト腺内乳癌細胞は分画化され、蛋白質20μgが図１、レーン１に示す様な抗-
neu(c)抗体を利用したウエスタンブロッティングにかけられた。 コントロール
のレーンはトランスフェクションされた3T3細胞及び17-3-1細胞の蛋白質３μgを
含んだ。下パネルでは、トップバンドであるp185の位置、及び低位置バンドであ
るp95HER-2がコントロールである17-3-1サンプル中に印されている（図6B）。 上パネルは膜に20分間露光したフィルムの写真であり、下パネルは５分間の露
光写真である。HER-2/neu免疫アッセイ値は#60、39、69については＜100単位；#
40については389単位；#58については258単位；#38については302単位；#53につ
いては200単位；#04については2000単位；#22については10,000単位；#57につい
ては1,000単位；#17については550単位；#75については674単位であった。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月３０日（２００１．５．３０）
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 33/574 Ａ 33/574 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＮＡＺ // Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 CB01 DA36 DA78 FB02 FB03 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ27 QQ79 QQ91 QR48 QR51 QS33 4C084 AA02 BA01 BA07 BA14 BA15 BA16 BA31 CA59 DA27 ZB262 4C085 AA14 BB11 DD63

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下を含むHER-2を過剰発現する転移段階にある癌の診断的
    及び予後的にスクリーニングする方法： （ａ）細胞を含む疑わしい組織サンプルを提供すること； （ｂ）細胞を溶解して細胞内容物を露出し、溶解物を形成させること；そして （ｃ）95HER-2ポリペプチドの存在について溶解物を測定すること。
  2. 【請求項２】 以下を含む、HER-2を過剰発現する転移段階の癌を診断的及
    び予後的にスクリーニングするための方法： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）スタブ域が配列番号１のポリペプチド配列であるHER-2のスタブ領域に
    結合する抗体を提供すること；そして （ｃ）露出した細胞外スタブ域を持つ細胞の割合を決定すること。
  3. 【請求項３】 以下を含む、治療薬がHER-2結合リガンドである、治療薬を
    利用したHER-2を過剰発現している癌の治療の治療有効性を推測する方法： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）スタブ域が配列番号１のポリペプチド配列、又はその断片であるHER-2
    のスタブ領域に結合する抗体を提供すること；そして （ｃ）抗体への腫瘍細胞の結合の割合が高いことは癌が治療薬に対し耐性であ
    ると思われることを示す、露出した細胞外スタブ域を持つ細胞の割合を決定する
    こと。
  4. 【請求項４】 以下を含む乳癌予後に於ける結節の状態を決定する方法を提
    供する： （ａ）細胞を含む問題の組織サンプルを提供すること； （ｂ）細胞内p95HER-2、及びp185HER-2の両方を測定するために組織サンプルを
    分割すること； （ｃ）細胞を溶解し細胞内含有物を露出し、p95HER-2アッセイ用に溶解物を形成
    させること； （ｄ）p185HER-2について組織サンプルを測定すること；そして （ｅ）95HER-2ポリペプチドの存在について溶解物を測定することであり、その
    中でp95HER-2陽性であり、且つp185HER-2に富む組織サンプルはリンパ節転移又
    はその他転移を予測する。
  5. 【請求項５】 溶解段階に続いて、溶解物の不溶性物質から可溶性物質を分
    離する追加段階が実施され、高密度繊維性物質が取り除かれる請求項１又は４の
    方法。
  6. 【請求項６】 測定段階がウエスタンブロッティング、免疫化学、ELISA及
    びその組合せから成るグループから選択されるアッセイ方法を利用する、請求項
    １−４の方法。
  7. 【請求項７】 HER-2を過剰発現する癌が乳癌、胃癌、子宮頚部癌、非小細
    胞肺癌及び前立腺癌より成るグループから選択される、請求項１−４の方法。
  8. 【請求項８】 治療薬がHER-2の細胞外ドメインに結合するヒト化モノクロ
    ーナル抗体である、請求項３の方法。
  9. 【請求項９】 ヒドロキサメート化合物の有効量を投与することを含む、HE
    R-2/neu陽性癌を治療する方法。
  10. 【請求項１０】 ヒドロキサメート化合物がTAPIである請求項９の方法。
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