JP2012147798A - Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化 - Google Patents

Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化 Download PDF

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Abstract

【課題】クラミジア感染、特に、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅによる感染に対する免疫化を提供すること。
【解決手段】Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの公開されたゲノムは
、１０００を超える推定コードタンパク質を開示するが、それ自体は、これらの
うちのタンパク質が、免疫化およびワクチン接種または診断のための抗原として
有用であり得ることを示すのではない。この困難性は、本発明によって取り組ま
れ、本発明は、ワクチンの産生および開発ならびに／または診断目的に適切な多
数のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのタンパク質配列を提供する。
【選択図】図１９０

Description

本明細書中に援用される全ての書類は、その全体が参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、クラミジア感染、特に、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅによる感染に対する免疫化の分野に存在する。
（背景技術）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、地域性の性感染症および種々の他の疾患症候群に寄
与する真核生物細胞の偏性細胞内寄生生物である。これらは、排他的な真正細菌
の分科を占め、他のいずれの既知の生物に対しても密接な関係を有さず、これら
は、単一のファミリー（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ）を含むこれら独自の目（
Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ）に分類され、次いで単一の属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ
）を含む。Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅは、これらの固有の生活環が特に特徴的であり
、この生活環において、細菌は、２つの形態学的に別々の形態：細胞外感染性形
態（基本小体、ＥＢ）と細胞内非感染性形態（網状体（Ｒｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ
ｂｏｄｉｅｓ）、ＲＢ）との間で交替する。この生活環は、ＲＢのＥＢへの再
編成で完了し、ＥＢは、引き続き、分裂した宿主細胞がさらなる細胞を感染する
準備をさせておく。
４つのクラミジア種（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ、Ｃ．ｐｅｃｏｒｕｍおよびＣ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）が現在知られている［例
えば、Ｒａｕｌｓｔｏｎ（１９９５）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５：６０
７−６１６；Ｅｖｅｒｅｔｔ（２０００）Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７５：
１０９−１２６］。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、各種由来の少なくとも２つの
単離体の全体のゲノム比較が示すように、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに密接に
関連している［Ｋａｌｍａｎら、（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
２１：３８５−３８９；Ｒｅａｄら、（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ ２８：１３９７−４０６；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、（１９９８）Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２８２：７５４−７５９］。患者の免疫血清を用いる表面反応に基
づいて、現在の見解は、世界的に唯一のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型が存
在するというものである。
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒト呼吸器疾患の一般的な原因である。これは
、１９６５年に台湾で子供の結膜から最初に単離され、そして１９８３年に主要
な呼吸器の病原体として樹立された。米国において、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
は、約１０％の地域感染型肺炎および５％の咽頭炎、気管支炎、および副鼻腔炎
の原因となる。
より最近では、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の範囲は、関節硬化症、冠状動
脈性心臓病、頸動脈狭窄、心臓梗塞、心血管疾患、大動脈瘤、跛行、および発作
を含むように広がっている。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの関節硬化症との関連は
、動脈系全体にわたる関節硬化症の病変における生物体の存在、および健康な動
脈組織における生物体の非存在と相関する。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅはまた、
冠状動脈および頸動脈のアテローム性プラークから単離された。この細菌はまた
、血清疫学的観察、症例報告、試料中の生物体の単離または直接的検出、および
抗クラミジア抗生物質に対する首尾良い応答の結果として、他の急性呼吸器疾患
および慢性呼吸器疾患（例えば、中耳炎、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症の肺
増悪）に関連している。慢性的な感染が、疾患の開始または進行において役割を
果たしているか否かを決定するために、ヒトにおける介入研究を開始し、そして
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の動物モデルを開発した。
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染の疫学のかなりの知見は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅ特異的微量免疫蛍光試験を使用する血清学的研究に由来する。感染は、遍
在性であり、そして実質上すべてのヒトが、生活のある時点で感染している（一
般的な再感染を有する）ことが推定されている。Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対
する抗体は、途上国および熱帯諸国を除いて、５歳未満の子供においてまれであ
る。抗体の普及は、５〜１４歳で迅速に増加し、２０歳で５０％に達し、そして
７０歳までに約８０％までゆっくりと増加し続ける。
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒト集団の非常に大部分の無症候性軽度感染に
おいて持続し得るという現在の仮説が、存在する。この状態が生じる際、Ｃ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在、および／または細菌に対する宿主反応の効果が、心
血管の病気の進行を引き起こし得るかまたは補助し得ると考えられる。
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが実際に心血管病の原因物質であるか否か、または
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが単に人為的に心血管病に関連しているか否かは、ま
だ明らかではない。しかし、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、ヒト単球による
ＬＤＬ酸化を誘導し得ることが示されている［Ｋａｋａｙｏｇｌｕら、（１９９
９）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：７８０−９０；Ｋａｌａｙｏｇｌｕら
、（１９９９）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１３８：Ｓ４８８−４９０］。ＬＤＬ酸
化産物が高度にアテローム生成的であるので、この観察は、可能性のある機構を
提供し、これにより、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、アテローム性の分解を引き
起こし得る。原因である影響が確認されると、ワクチン接種（予防的および治療
的）は、普遍的に推奨される。
ゲノム配列情報は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅについて公開されており［Ｋａ
ｌｍａｎら、（１９９９）前出；Ｒｅａｄら、（２０００）前出；Ｓｈｉｒａｉ
ら、（２０００）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８１（補遺３）：Ｓ５２４−Ｓ
５２７；ＷＯ９９／２７１０５；ＷＯ００／２７９９４］、そしてＧｅｎＢａｎ
ｋより入手可能である。しかし、配列決定の努力は、ワクチン接種に集中してお
らず、そしてゲノム配列の利用可能性は、それ自体、１０００を超える遺伝子が
、免疫化およびワクチン接種に有用な抗原をコードし得ることを示していない。
例えば、ＷＯ９９／２７１０５は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＣＭ１ゲノムに
おいて同定された１２９６のＯＲＦのあらゆるＯＲＦが、有用なワクチン抗原で
あることを示す。
従って、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ中に存在する多数のタンパク質の中からワ
クチンの産生および開発に有用な抗原を同定することが、本発明の目的である。
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの診断（例えば、免疫診断）に有用な抗原を同定する
ことは、さらなる目的である。
（発明の開示）
本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列
を含むタンパク質を提供する。
本発明はまた、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸
配列と少なくともｘ％配列同一性を共有する配列を含むタンパク質を提供する。
特定の配列に依存して、ｘは、好ましくは、５０％以上（例えば、６０％、７０
％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）である。これらは、変異体および対
立遺伝子改変体を含む。代表的には、２つのタンパク質間の５０％以上の同一性
は、機能的同等性の指標であると考えられる。タンパク質間の同一性は、好まし
くは、パラメーターのギャップオープンペナルティー＝１２およびギャップ伸長
ペナルティー＝１を用いるアフィンギャップ検索を使用して、ＭＰＳＲＣＨプロ
グラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）において実行されるように、Ｓｍ
ｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。
本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅアミノ酸配列
のフラグメントを含むタンパク質をさらに提供する。これらのフラグメントは、
配列から少なくともｎ連続するアミノ酸を含むはずであり、そして特定の配列に
依存して、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、
３０、４０、５０、７５、１００以上）である。好ましくは、これらのフラグメ
ントは、配列から１つ以上のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、
シグナルペプチドを省略する。
本発明のタンパク質は、もちろん、種々の手段（例えば、ネイティブな発現、
組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）によってそして種々の形態
（例えば、ネイティブ、融合物など）で調製され得る。これらは、好ましくは、
実質的に純粋な形態（すなわち、他のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたは宿主細胞
タンパク質を実質的に含まない）で調製される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける異種発現
は、好ましい調製用経路である。
さらなる局面に従って、本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらに、本発明は、実施例
において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅヌクレオチド配列と少なくともｘ
％配列同一性を共有する配列を含む核酸を提供する。特定の配列に依存して、ｘ
は、５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以
上）である。
さらに、本発明は、実施例において開示されるＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ核酸
に、好ましくは、「高ストリンジェンシー」条件下（例えば、０．１×ＳＳＣ、
０．５％ ＳＤＳ溶液中６５℃）でハイブリダイズし得る核酸を提供する。
これらの配列のフラグメントを含む核酸もまた提供される。これらは、Ｃ．ｐ
ｎｅｕｍｏｎｉａｅ配列から少なくともｎ連続するヌクレオチドを含むべきであ
り、そして特定の配列に依存して、ｎは、１０以上（例えば、１２、１４、１５
、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、２００、３００
以上）である。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のタンパク質およびタンパク質フラ
グメントをコードする核酸を提供する。
本発明が上記の配列に相補的な配列を含む核酸を提供すること（例えば、アン
チセンスまたはプローブ化目的のために）もまた、理解されるべきである。
本発明に従う核酸は、もちろん、多数の方法で（例えば、化学合成によって、
ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物体自体からなど）調
製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブな
ど）を取り得る。
さらに、用語「核酸」としては、ＤＮＡおよびＲＮＡ、そしてまたこれらのア
ナログ（例えば、改変された骨格を含むもの）、そしてまたペプチド核酸（ＰＮ
Ａ）などが挙げられる。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター
（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびそれで形質転換さ
れた宿主細胞を提供する。
さらなる局面に従って、本発明は、本発明に従うタンパク質および／または核
酸を含む免疫原性組成物を提供する。これらの組成物は、免疫化およびワクチン
接種の目的に適している。本発明のワクチンは、予防的または治療的であり得、
そして代表的に、（ａ）クラミジア付着、（ｂ）クラミジア侵入、および／また
は（ｃ）宿主細胞内での首尾良い複製を阻害し得る抗体を誘導し得る抗原を含む
。これらのワクチンは、好ましくは、宿主からのクラミジアクリアランスに必要
である任意の細胞媒介性Ｔ細胞応答を誘導する。
本発明はまた、医薬としての（例えば、ワクチンとしての）使用のための本発
明に従う核酸およびタンパク質を提供する。本発明はまた、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉａｅに起因する感染を処置または予防するための医薬（例えば、ワクチンまた
は免疫原性組成物）の製造における本発明に従う核酸またはタンパク質の使用を
提供する。
本発明はまた、患者を処置（例えば、免疫化）する方法を提供し、この方法は
、本発明に従う治療的に有効な量の核酸またはタンパク質を患者に投与する工程
を包含する。
さらなる局面に従って、本発明は、種々のプロセスを提供する。
本発明のタンパク質を産生するプロセスが提供され、このプロセスは、タンパ
ク質発現を誘導する条件下で、本発明に従う宿主細胞を培養する工程を包含する
。
本発明のタンパク質または核酸を生成するプロセスが提供され、ここで、この
タンパク質または核酸は、化学的手段を一部または全体的に使用して合成される
。
サンプル中のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを検出するためのプロセスが提供され
、ここで、このサンプルは、本発明のタンパク質に結合する抗体と接触される。
本発明を実行するために（例えば、免疫化について開示される配列を利用する
ために）使用され得る標準的な技術および手順の要約は、以下の通りである。こ
の要約は、本発明を制限するのではなく、必要とされないが、使用され得る実施
例を示す。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１） 以下：
Figure 2012147798
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
（項目２） 項目１に記載のタンパク質に５０％以上の配列同一性を有
する、タンパク質。
（項目３） 以下：
Figure 2012147798
からなる群より選択されるアミノ酸配列のフラグメントを含む、タンパク質。
（項目４） 項目１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードす
る、核酸分子。
（項目５） 項目４に記載の核酸分子であって、以下：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目６） 以下：
Figure 2012147798
からなる群より選択されるヌクレオチド配列のフラグメントを含む、核酸分子。
（項目７） 項目４〜６のいずれか１項に記載の核酸分子に相補的なヌ
クレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目８） 項目４〜７のいずれか１項に記載の核酸分子に５０％以上
の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
（項目９） 項目４〜８のいずれか１項に記載の分子に、高ストリンジ
ェンシーな条件下でハイブリダイズし得る、核酸分子。
（項目１０） 項目１〜９のいずれか１項に記載のタンパク質または核
酸分子を含む、組成物。
（項目１１） ワクチン組成物である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２） 医薬品としての使用のための、項目１０または項目１
１に記載の組成物。
（項目１３） Ｃｈａｌｍｙｄｉａ細菌、特にＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅに起因する感染を処置または予防するための医薬の製造におけ
る、項目１０に記載の組成物の使用。
図１は、実施例１に関するデータを示す。 図２は、実施例２に関するデータを示す。 図３は、実施例３に関するデータを示す。 図４は、実施例４に関するデータを示す。 図５は、実施例５に関するデータを示す。 図６は、実施例６に関するデータを示す。 図７は、実施例７に関するデータを示す。 図８は、実施例８に関するデータを示す。 図９は、実施例９に関するデータを示す。 図１０は、実施例１０に関するデータを示す。 図１１は、実施例１１に関するデータを示す。 図１２は、実施例１２に関するデータを示す。 図１３は、実施例１３に関するデータを示す。 図１４は、実施例１４に関するデータを示す。 図１５は、実施例１５に関するデータを示す。 図１６は、実施例１６に関するデータを示す。 図１７は、実施例１７に関するデータを示す。 図１８は、実施例１８に関するデータを示す。 図１９は、実施例１９に関するデータを示す。 図２０は、実施例２０に関するデータを示す。 図２１は、実施例２１に関するデータを示す。 図２２は、実施例２２に関するデータを示す。 図２３は、実施例２３に関するデータを示す。 図２４は、実施例２４に関するデータを示す。 図２５は、実施例２５に関するデータを示す。 図２６は、実施例２６に関するデータを示す。 図２７は、実施例２７に関するデータを示す。 図２８は、実施例２８に関するデータを示す。 図２９は、実施例２９に関するデータを示す。 図３０は、実施例３０に関するデータを示す。 図３１は、実施例３１に関するデータを示す。 図３２は、実施例３２に関するデータを示す。 図３３は、実施例３３に関するデータを示す。 図３４は、実施例３４に関するデータを示す。 図３５は、実施例３５に関するデータを示す。 図３６は、実施例３６に関するデータを示す。 図３７は、実施例３７に関するデータを示す。 図３８は、実施例３８に関するデータを示す。 図３９は、実施例３９に関するデータを示す。 図４０は、実施例４０に関するデータを示す。 図４１は、実施例４１に関するデータを示す。 図４２は、実施例４２に関するデータを示す。 図４３は、実施例４３に関するデータを示す。 図４４は、実施例４４に関するデータを示す。 図４５は、実施例４５に関するデータを示す。 図４６は、実施例４６に関するデータを示す。 図４７は、実施例４７に関するデータを示す。 図４８は、実施例４８に関するデータを示す。 図４９は、実施例４９に関するデータを示す。 図５０は、実施例５０に関するデータを示す。 図５１は、実施例５１に関するデータを示す。 図５２は、実施例５２に関するデータを示す。 図５３は、実施例５３に関するデータを示す。 図５４は、実施例５４に関するデータを示す。 図５５は、実施例５５に関するデータを示す。 図５６は、実施例５６に関するデータを示す。 図５７は、実施例５７に関するデータを示す。 図５８は、実施例５８に関するデータを示す。 図５９は、実施例５９に関するデータを示す。 図６０は、実施例６０に関するデータを示す。 図６１は、実施例６１に関するデータを示す。 図６２は、実施例６２に関するデータを示す。 図６３は、実施例６３に関するデータを示す。 図６４は、実施例６４に関するデータを示す。 図６５は、実施例６５に関するデータを示す。 図６６は、実施例６６に関するデータを示す。 図６７は、実施例６７に関するデータを示す。 図６８は、実施例６８に関するデータを示す。 図６９は、実施例６９に関するデータを示す。 図７０は、実施例７０に関するデータを示す。 図７１は、実施例７１に関するデータを示す。 図７２は、実施例７２に関するデータを示す。 図７３は、実施例７３に関するデータを示す。 図７４は、実施例７４に関するデータを示す。 図７５は、実施例７５に関するデータを示す。 図７６は、実施例７６に関するデータを示す。 図７７は、実施例７７に関するデータを示す。 図７８は、実施例７８に関するデータを示す。 図７９は、実施例７９に関するデータを示す。 図８０は、実施例８０に関するデータを示す。 図８１は、実施例８１に関するデータを示す。 図８２は、実施例８２に関するデータを示す。 図８３は、実施例８３に関するデータを示す。 図８４は、実施例８４に関するデータを示す。 図８５は、実施例８５に関するデータを示す。 図８６は、実施例８６に関するデータを示す。 図８７は、実施例８７に関するデータを示す。 図８８は、実施例８８に関するデータを示す。 図８９は、実施例８９に関するデータを示す。 図９０は、実施例９０に関するデータを示す。 図９１は、実施例９１に関するデータを示す。 図９２は、実施例９２に関するデータを示す。 図９３は、実施例９３に関するデータを示す。 図９４は、実施例９４に関するデータを示す。 図９５は、実施例９５に関するデータを示す。 図９６は、実施例９６に関するデータを示す。 図９７は、実施例９７に関するデータを示す。 図９８は、実施例９８に関するデータを示す。 図９９は、実施例９９に関するデータを示す。 図１００は、実施例１００に関するデータを示す。 図１０１は、実施例１０１に関するデータを示す。 図１０２は、実施例１０２に関するデータを示す。 図１０３は、実施例１０３に関するデータを示す。 図１０４は、実施例１０４に関するデータを示す。 図１０５は、実施例１０５に関するデータを示す。 図１０６は、実施例１０６に関するデータを示す。 図１０７は、実施例１０７に関するデータを示す。 図１０８は、実施例１０８に関するデータを示す。 図１０９は、実施例１０９に関するデータを示す。 図１１０は、実施例１１０に関するデータを示す。 図１１１は、実施例１１１に関するデータを示す。 図１１２は、実施例１１２に関するデータを示す。 図１１３は、実施例１１３に関するデータを示す。 図１１４は、実施例１１４に関するデータを示す。 図１１５は、実施例１１５に関するデータを示す。 図１１６は、実施例１１６に関するデータを示す。 図１１７は、実施例１１７に関するデータを示す。 図１１８は、実施例１１８に関するデータを示す。 図１１９は、実施例１１９に関するデータを示す。 図１２０は、実施例１２０に関するデータを示す。 図１２１は、実施例１２１に関するデータを示す。 図１２２は、実施例１２２に関するデータを示す。 図１２３は、実施例１２３に関するデータを示す。 図１２４は、実施例１２４に関するデータを示す。 図１２５は、実施例１２５に関するデータを示す。 図１２６は、実施例１２６に関するデータを示す。 図１２７は、実施例１２７に関するデータを示す。 図１２８は、実施例１２８に関するデータを示す。 図１２９は、実施例１２９に関するデータを示す。 図１３０は、実施例１３０に関するデータを示す。 図１３１は、実施例１３１に関するデータを示す。 図１３２は、実施例１３２に関するデータを示す。 図１３３は、実施例１３３に関するデータを示す。 図１３４は、実施例１３４に関するデータを示す。 図１３５は、実施例１３５に関するデータを示す。 図１３６は、実施例１３６に関するデータを示す。 図１３７は、実施例１３７に関するデータを示す。 図１３８は、実施例１３８に関するデータを示す。 図１３９は、実施例１３９に関するデータを示す。 図１４０は、実施例１４０に関するデータを示す。 図１４１は、実施例１４１に関するデータを示す。 図１４２は、実施例１４２に関するデータを示す。 図１４３は、実施例１４３に関するデータを示す。 図１４４は、実施例１４４に関するデータを示す。 図１４５は、実施例１４５に関するデータを示す。 図１４６は、実施例１４６に関するデータを示す。 図１４７は、実施例１４７に関するデータを示す。 図１４８は、実施例１４８に関するデータを示す。 図１４９は、実施例１４９に関するデータを示す。 図１５０は、実施例１５０に関するデータを示す。 図１５１は、実施例１５１に関するデータを示す。 図１５２は、実施例１５２に関するデータを示す。 図１５３は、実施例１５３に関するデータを示す。 図１５４は、実施例１５４に関するデータを示す。 図１５５は、実施例１５５に関するデータを示す。 図１５６は、実施例１５６に関するデータを示す。 図１５７は、実施例１５７に関するデータを示す。 図１５８は、実施例１５８に関するデータを示す。 図１５９は、実施例１５９に関するデータを示す。 図１６０は、実施例１６０に関するデータを示す。 図１６１は、実施例１６１に関するデータを示す。 図１６２は、実施例１６２に関するデータを示す。 図１６３は、実施例１６３に関するデータを示す。 図１６４は、実施例１６４に関するデータを示す。 図１６５は、実施例１６５に関するデータを示す。 図１６６は、実施例１６６に関するデータを示す。 図１６７は、実施例１６７に関するデータを示す。 図１６８は、実施例１６８に関するデータを示す。 図１６９は、実施例１６９に関するデータを示す。 図１７０は、実施例１７０に関するデータを示す。 図１７１は、実施例１７１に関するデータを示す。 図１７２は、実施例１７２に関するデータを示す。 図１７３は、実施例１７３に関するデータを示す。 図１７４は、実施例１７４に関するデータを示す。 図１７５は、実施例１７５に関するデータを示す。 図１７６は、実施例１７６に関するデータを示す。 図１７７は、実施例１７７に関するデータを示す。 図１７８は、実施例１７８に関するデータを示す。 図１７９は、実施例１７９に関するデータを示す。 図１８０は、実施例１８０に関するデータを示す。 図１８１は、実施例１８１に関するデータを示す。 図１８２は、実施例１８２に関するデータを示す。 図１８３は、実施例１８３に関するデータを示す。 図１８４は、実施例１８４に関するデータを示す。 図１８５は、実施例１８５に関するデータを示す。 図１８６は、実施例１８６に関するデータを示す。 図１８７は、実施例１８７に関するデータを示す。 図１８８は、実施例１８８に関するデータを示す。 図１８９は、実施例１８９に関するデータを示す。 図１９０は、基本小体中のタンパク質の代表的な２Ｄゲルを示す。 図１９１は、本発明の５個（６個）のタンパク質における配列の整列を示す。
（一般）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該分野の技術の範囲内である、分子
生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を使用する。この
ような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
第２版（１９８９）および第３版（２００１）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖ
ｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ｉｉ（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）；Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編 １９
８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈ
ａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．
Ｈｉｇｇｉｎｓ編 １９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ
．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編 １９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ
ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａ
ｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特に１５４および
１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編１９
８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａ
ｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ，編（１９８７），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｓｃｏｐｅｓ，（１９８
７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎ
ｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）
、およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃ
ｋｗｅｌｌ編 １９８６）。
ヌクレオチドおよびアミノ酸についての標準的な省略が、本明細書において使
用される。
（定義）
Ｘを含む組成物は、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少なくとも８５重量％がＸであると
き、Ｙを「実質的に含まない」。好ましくは、Ｘは、組成物中の全Ｘ＋Ｙの少な
くとも９０重量％を、さらに好ましくは少なくとも約９５重量％または９９重量
％さえを含む。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」お
よび「からなる」を意味する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸから
なり得るか、またはＸ＋ＹのようなＸに付加したものも含み得る。
用語「異種」とは、天然では共に見られない２つの生物学的成分をいう。この
成分は、宿主細胞、遺伝子、調節領域（例えば、プロモーター）であり得る。異
種成分は天然では共に見られないが、遺伝子に対して異種のプロモーターがその
遺伝子に作動可能に連結されるときのように、それらは共に機能し得る。別の例
は、クラミジア配列がマウス宿主細胞に対して異種であることである。さらなる
例は、天然においてみられない配置で単一タンパク質に組み立てられる同じタン
パク質または異なるタンパク質由来の２つのエピトープである。
「複製起点」とは、発現ベクターのような、ポリヌクレオチドの複製を開始ま
たは調節するポリヌクレオチド配列である。複製起点は、細胞内でのポリヌクレ
オチド複製の自律性ユニットとして振る舞い、それ自体の制御下で複製し得る。
複製起点は、ベクターが特定の宿主細胞において複製するために必要であり得る
。特定の複製起点を有せば、発現ベクターは、細胞内の適切なタンパク質の存在
下で高いコピー数で再生され得る。起点の例は、酵母において有効な自律性複製
配列；およびＣＯＳ−７細胞で有効であるウイルスＴ抗原である。
「変異体」配列は、天然の配列または開示された配列とは異なるが配列同一性
を有するＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列またはアミノ酸配列として規定される。特定の
配列に依存して、天然の配列または開示された配列と変異体配列との間の配列同
一性の程度は、好ましくは５０％より大きい（例えば、上記記載のＳｍｉｔｈ−
Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用して算出して６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％、９９％またはそれ以上）。本明細書中で使用される場合、本明細
書で核酸分子配列が提供される核酸分子、または領域の「対立遺伝子改変体」は
、別のもしくは２番目の単離体のゲノム中の同じ遺伝子座で本質的に生ずる領域
および、例えば、変異または組換えにより生ずる天然変化に起因して、類似する
が、しかし同一でない核酸配列を有する核酸分子、または領域である。コード領
域の対立遺伝子改変体は、代表的には、比較される遺伝子によってコードされる
タンパク質の活性と類似した活性を有するタンパク質をコードする。対立遺伝子
改変体はまた、遺伝子の５’または３’非翻訳領域（例えば、調節制御領域）で
の変化を含み得る（例えば、米国特許第５，７５３，２３５号）。
（発現系）
クラミジアヌクレオチド配列は、種々の異なる発現系；例えば、哺乳動物細胞
、バキュロウイルス、植物、細菌、および酵母と共に使用される発現系において
発現され得る。
（ｉ．哺乳動物系）
哺乳動物発現系は当該分野において公知である。哺乳動物プロモーターは、哺
乳動物ＲＮＡポリメラーゼを結合し、コード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲ
ＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーター
は、転写開始領域（これはコード配列の５’末端の近位に通常位置する）および
ＴＡＴＡボックス（転写開始部位の２５〜３０塩基対（ｂｐ）上流に通常位置す
る）を有する。ＴＡＴＡボックスは、その正しい部位においてＲＮＡポリメラー
ゼＩＩにＲＮＡ合成を開始させるよう指示すると考えられている。哺乳動物プロ
モーターはまた、ＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流以内に通常位置す
る上流プロモーターエレメントを含む。上流プロモーターエレメントは、転写が
開始され、そしていずれかの方向において作用し得る速度を決定する（Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎ
ｅｓ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ」 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版）。
哺乳動物ウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を
有する；従って、哺乳動物ウイルス遺伝子をコードする配列は、特に有用なプロ
モーター配列を提供する。例は、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイル
スＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）
、および単純疱疹ウイルスプロモーターを含む。さらに、マウスのメタロチオネ
イン遺伝子のような非ウイルス性遺伝子に由来する配列もまた、有用なプロモー
ター配列を提供する。発現は、構成性であるかまたは調節される（誘導可能）か
のいずれかであり得る、プロモーターに依存して、ホルモン応答性細胞において
グルココルチコイドで誘導され得る。
上記に記載されるプロモーターエレメントと組み合わされるエンハンサーエレ
メント（エンハンサー）の存在は、通常発現レベルを増大させる。エンハンサー
は、相同性プロモーターまたは異種プロモーターに連結されるとき、転写を１０
００倍まで刺激し得る調節ＤＮＡ配列であり、合成は、通常のＲＮＡ開始部位で
開始する。エンハンサーはまた、それらが、通常方向もしくは反対（ｆｌｉｐｐ
ｅｄ）方向のいずれかで転写開始部位より上流または下流に、もしくはプロモー
ターから１０００ヌクレオチドを超える距離に位置するとき、活性である（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７；Ａｌｂｅｒ
ｔｓら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅ
ｌｌ，第２版）。ウイルス由来のエンハンサーエレメントは、それらは通常、よ
り広い宿主範囲を有するため、特に有用であり得る。例は、ＳＶ４０初期遺伝子
エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）およ
びラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモ
ーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７９：６７７７）およ
びヒトサイトメガウイルスに由来するエンハンサー／プロモーター（Ｂｏｓｈａ
ｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）を包含する。さらに、いくつかの
エンハンサーは調節可能であり、そしてホルモンまたは金属イオンのような誘導
因子の存在下のみで活性になる（Ｓａｓｓｏｎｅ−ＣｏｒｓｉおよびＢｏｒｅｌ
ｌｉ（１９８６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．２：２１５；Ｍａｎｉａｔｉｓら
（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７）。
ＤＮＡ分子は、哺乳動物細胞において細胞内で発現され得る。プロモーター配
列は、組換えタンパク質のＮ末端における最初のアミノ酸が常にＡＴＧ開始コド
ンによりコードされるメチオニンである場合、ＤＮＡ分子と直接連結され得る。
所望される場合、Ｎ末端は、臭化シアンとのインビトロでのインキュベーション
によりタンパク質から切断され得る。
あるいは、外来タンパク質もまた、哺乳動物細胞において外来タンパク質の分
泌を提供するリーダー配列フラグメントで構成される融合タンパク質をコードす
るキメラＤＮＡ分子を作製することにより、細胞から成長培地へ分泌され得る。
好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて切断され得る、リー
ダーフラグメントおよび外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存
在する。リーダー配列フラグメントは通常、細胞からのタンパク質の分泌を指示
する疎水性アミノ酸で構成される単一のペプチドをコードする。アデノウイルス
３部分からなるリーダーは、哺乳動物細胞における外来タンパク質の分泌を提供
するリーダー配列の例である。
通常、哺乳類細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列
は、翻訳終止コドンの３’側に存在する調節領域であり、従って、プロモーター
エレメントと共に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特
異的転写後切断およびポリアデニル化により形成される（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌら
（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：３４９；ＰｒｏｕｄｆｏｏｔおよびＷｈｉｔｅｌ
ａｗ（１９８８）「Ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｅｎｄ ｐｒｏｃｅ
ｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡ．」Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖ
ｅｒ編）；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓ
ｃｉ．１４：１０５）。これらの配列は、ｍＲＮＡの転写を方向づけ、そのｍＲ
ＮＡは、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドに翻訳され得る。転写終結／ポ
リアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来のシグナルが挙げられる（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．」Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
）。
通常、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および転写終結配列を含む上
記の構成要素は、発現構築物内に共に導入される。エンハンサー、機能的なスプ
ライス供与部位および受容部位を有するイントロン、ならびにリーダー配列もま
た、所望される場合、発現構築物内に含まれ得る。発現構築物はしばしば、哺乳
類細胞または細菌のような宿主内で安定的に維持し得る染色体外エレメント（例
えば、プラスミド）のような、レプリコン内で維持される。哺乳類の複製系とし
ては、複製にトランス作用性の因子を必要とする、動物ウイルス由来の複製系が
挙げられる。例えば、ＳＶ４０（Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ ２３：
１７５）、あるいはポリオーマウイルスのようなパポバウイルスの複製系を含む
プラスミドは、適切なウイルスのＴ抗原の存在下で極めて高いコピー数で複製す
る。哺乳類レプリコンの別の例としては、ウシパピローマウイルスおよびエプス
タイン−バーウイルス由来のレプリコンが挙げられる。さらに、このレプリコン
は、二つの複製系を有し得、従って、例えば、発現用の哺乳類細胞内で、ならび
にクローニングおよび増幅用の原核生物の宿主内で、そのレプリコンを維持する
ことが可能である。このような哺乳類−細菌シャトルベクターの例としては、ｐ
ＭＴ２（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：９４
６）およびｐＨＥＢＯ（Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．６：１０７４）が挙げられる。
使用される形質転換の手順は、形質転換される宿主に依存する。異種のポリヌ
クレオチドの哺乳類細胞への導入方法は、当該分野で公知であり、その方法とし
ては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブ
レン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション
、リポソーム内でのポリヌクレオチドの封入、およびＤＮＡの核内への直接微量
注入が挙げられる。
発現用宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該分野で公知であり、そのよ
うな細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細
胞、乳仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞
癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）および多くの他の細胞株を含むが、これらに限
定しない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。
（ｉｉ バキュロウイルス系）
タンパク質をコードしているポリヌクレオチドはまた、適切な昆虫の発現ベク
ター内に挿入され得、そしてそのベクター内で、制御エレメントに作動可能に連
結される。ベクターの構築には、当該分野で公知の技術を使用する。一般に、そ
の発現系の構成要素として、以下のものが挙げられる：バキュロウイルスゲノム
のフラグメント、および発現させる異種遺伝子の挿入用の簡便な制限部位の両方
を有する転移ベクター（通常は細菌ベクター）；転移ベクター内のバキュロウイ
ルスに特異的なフラグメントに相同性のある配列を有する野生型バキュロウイル
ス（これは、バキュロウイルスゲノム内への異種遺伝子の相同組換えを可能にす
る）；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地。
転移ベクターにタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挿入した後、そのベクタ
ーおよび野生型ウイルスゲノムを、昆虫宿主細胞にトランスフェクトし、そこで
ベクターとウイルスゲノムを組換え可能にする。パッケージングされた組換えウ
イルスは発現され、そして組換えプラークが同定されそして精製される。バキュ
ロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキット形態（「ＭａｘＢａｃ」キット）で市販
される。これらの技術は、一般に当業者に公知であり、そしてＳｕｍｍｅｒｓな
らびにＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）（以下
、「Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ」）に十分に記載されている。
タンパク質をコードするＤＮＡ配列をバキュロウイルスゲノムに挿入するのに
先立って、プロモーター配列、リーダー配列（所望される場合は）、目的のコー
ド配列、および転写終結配列を含む上記の構成要素を、通常、中間転移構築物（
転移ベクター）に構築する。この構築物は、単一の遺伝子および作動可能に連結
された調節エレメント；操作可能に連結された調節エレメントのセットを各々が
所有する複数の遺伝子；あるいは同じ調節エレメントのセットにより調節される
複数の遺伝子を含み得る。中間転移構築物は、しばしば、細菌のような宿主内で
安定的に維持し得る染色体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプ
リコン内で維持される。レプリコンは、複製系を有しており、従って、それはク
ローニングおよび増幅に適切な宿主内で維持され得る。
現在、外来遺伝子のＡｃＮＰＶへの導入のために最も一般に使用される転移ベ
クターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知の多くの他のベクターもまた設計
され、これらのものとして、例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリンの開始コドン
をＡＴＧからＡＴＴに変化させ、そしてそのＡＴＴから３２塩基対下流に、Ｂａ
ｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１）が挙げられる。
そのプラスミドも通常、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒ
ら（１９８８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４２：１７７）、およ
び原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および大腸菌においての選抜
ならびに増殖のための複製起点を有する。
バキュロウイルス転移ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを有す
る。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに
結合し、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（５’か
ら３’）方向の転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通
常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域を有している。この
転写開始領域は通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始点を含む。バ
キュロウイルス転移ベクターは、またエンハンサーと呼ばれる第二のドメインを
有し得、存在する場合は、通常、構造遺伝子に対し遠位にある。発現は調節され
得るか、あるいは構成的であり得る。
ウイルスの感染周期の後期で大量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロ
モーター配列を提供する。例としては、ウイルス多面体タンパク質をコードする
遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら（１９８６）「Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，」：Ｔｈｅ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｗａ
ｌｔｅｒ Ｄｏｅｒｆｌｅｒ編）；ＥＰＯ公開番号１２７８３９および１５５４
７６；ならびにｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋら，（１９８８
），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５）由来の配列が挙げられる。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌昆虫タンパク質、あるいはバ
キュロウイルスポリへドリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１９９８）Ｇｅ
ｎｅ，７３：４０９）のような、分泌バキュロウイルスタンパク質の遺伝子から
由来し得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切
断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のシグナルは、昆虫細胞に認識さ
れると思われ、そして分泌および核蓄積に必要なシグナルはまた、無脊椎動物細
胞および脊椎動物細胞間で保存されると思われるので、ヒトインターフェロンα
（Ｍａｅｄａら，（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２）；ヒトガスト
リン放出ペプチド（Ｌｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら，（１９８８），Ｍｏ
ｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９）；ヒトＩＬ−２（Ｓｍｉｔｈら，
（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：８４０
４）；マウスＩＬ−３（Ｍｉｙａｊｉｍａら，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２
７３）；およびヒトグルコセレブロシダーゼ（Ｍａｒｔｉｎら，（１９８８）Ｄ
ＮＡ、７：９９）をコードする遺伝子由来のような、非昆虫起源のリーダーも、
昆虫での分泌を与えるために使用され得る。
組換えポリペプチドあるいは組換えポリタンパク質は、細胞内に発現され得、
あるいは適切な調節配列と共に発現される場合、分泌され得る。非融合の外来タ
ンパク質の優れた細胞内発現には通常、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻
訳開始シグナルを含む短いリーダー配列を理想的には有する異種遺伝子が必要で
ある。所望であれば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキ
ュベーションにより、成熟タンパク質から切断され得る。
あるいは、自然に分泌されない組換えポリタンパク質あるいは組換えタンパク
質は、昆虫において外来タンパク質の分泌を与えるリーダー配列フラグメントを
含む、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することにより、昆
虫細胞から分泌され得る。リーダー配列フラグメントは通常、タンパク質の小胞
体内への輸送を指示する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードして
いる。
タンパク質の前駆体である発現産物をコードするＤＮＡ配列および／または遺
伝子の挿入後、昆虫細胞宿主に、転移ベクターの異種ＤＮＡおよび野生型バキュ
ロウイルスのゲノムＤＮＡを同時形質転換（通常は、同時トランスフェクション
によって）する。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、通常バキュロウ
イルスゲノムの２〜５ｋｂの区域を含む。バキュロウイルスウイルスの望ましい
部位に異種ＤＮＡを導入する方法は、当該分野で公知である（Ｓｕｍｍｅｒｓお
よびＳｍｉｔｈ、上記；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；ならびにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍ
ｅｒｓ（１９８９）を参照のこと）。例えば、その挿入物は、相同二重交差組換
え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ）により、ポリへドリン遺伝子のような遺伝子内にあり得る；挿
入物はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に設計された制限酵素部位内にあり
得る。Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ４；９１。発現ベク
ター内のポリへドリン遺伝子の代わりにクローン化される場合のＤＮＡ配列は、
ポリへドリン特異的配列により５’および３’の両側で隣接され、そしてポリへ
ドリンプロモーターの下流に位置される。
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは続いて、感染性の組換えバ
キュロウイルス内にパッケージされる。相同組換えは、低い頻度で起こる（約１
％〜約５％の間）；それゆえ、同時トランスフェクション後に産生されたウイル
スの大半は、依然野生型ウイルスである。従って、方法には、組換えウイルスの
同定が必要となる。その発現系の利点は、組換えウイルスを区別させ得る可視的
スクリーニングである。天然のウイルスにより産生されるポリへドリンタンパク
質は、ウイルス感染後の後期で、その感染された細胞の核内で非常に高いレベル
で産生される。蓄積されたポリへドリンタンパク質は、閉塞体を形成し、またそ
れは包理された粒子を含む。これらの閉塞体は、最大１５μｍの大きさで、高度
に屈折し、明るく輝く外見を与え、容易に光学顕微鏡下で可視化される。組換え
ウイルスに感染された細胞は、閉塞体を欠く。組換えウイルスと野生型ウイルス
を区別するために、トランスフェクションの上清を、当業者に公知の技術により
昆虫細胞の単層にプラーク形成させた。すなわち、プラークを、光学顕微鏡下で
閉塞体の存在（野性型ウイルスを示す）または非存在（組換えウイルスを示す）
によりスクリーニングする。「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」２巻（Ａｕｓｕｂｅｌら編）１６．８（増補１０、１
９９０）；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、上記；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９
）。
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくらかの昆虫細胞への感染用に開
発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、特に以下に示すもののために開
発された：Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇ
ａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ＷＯ８９／０４６６９９；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら，（１
９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：１５３；Ｗｒｉｇｈｔ（１９８６）Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２１：７１８；Ｓｍｉｔｈら，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．３：２１５６；およびＦｒａｓｅｒら，（１９８９）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅ
ｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：２２５を一般に参照のこと）。
細胞および細胞培養培地は、バキュロウイルス／発現系における異種ポリペプ
チドの直接発現および融合発現の両方のために市販される；細胞培養技術は、一
般に当業者に公知である。例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（上記）を
参照のこと。
次いで、改変した昆虫細胞を、適切な栄養培地で増殖し、その改変した昆虫宿
主内で存在するプラスミドの安定的維持を可能にする。発現産物の遺伝子が、誘
導性の制御下にある場合、宿主は高密度で増殖され得、そして発現は誘導され得
る。あるいは、発現が構成的である場合、その産物は培地中に連続的に発現され
、そして栄養培地を連続的に循環し、目的産物を取り出し、そして枯渇した栄養
を補給する必要がある。その産物は、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、
アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）；電
気泳動；密度勾配遠心；溶媒抽出などのような技術により精製し得る。適切には
、その産物をさらに精製し、必要ならば、培地中に分泌された、または昆虫細胞
の溶解から生じた任意の昆虫タンパク質を実質的に除去し、宿主細片（例えば、
タンパク質、脂質および多糖類）を少なくとも実質的に含まない産物を供給する
。
タンパク質の発現を得るために、形質転換体に由来する組換え宿主細胞は、組
換えタンパク質をコードする配列の発現を可能にする条件下でインキュベートさ
れる。これらの条件は、選択された宿主細胞に依存して変動する。しかし、その
条件は、当該分野で公知の条件に基づいて、当業者に容易に確かめられる。
（ｉｉｉ 植物系）
当該分野で公知の多くの植物細胞培養および全植物遺伝子発現系が存在する。
例示的な植物細胞遺伝子発現系としては、米国特許第５，６９３，５０６号；米
国特許第５，６５９，１２２号；米国特許第５，６０８，１４３号のような特許
に記載されるものが挙げられる。植物細胞培養における遺伝子発現の別の例は、
Ｚｅｎｋ，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３８６１−３８６３（１９９
１）に記載された。植物タンパク質のシグナルペプチドの記載は、上記の参考文
献に加え、以下に示すものの中においても確認される；Ｖａｕｌｃｏｍｂｅら，
Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０９：３３−４０（１９８７）；Ｃｈａｎｄｌ
ｅｒら，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：４０７−４１
８（１９８４）；Ｒｏｇｅｒｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７３１−
３７３８（１９８５）；Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎら，Ｇｅｎｅ ５５：３５３−３５
６（１９８７）；Ｗｈｉｔｔｉｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ １５：２５１５−２５３５（１９８７）；Ｗｉｒｓｅｌら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３−１４（１９８９）；Ｙｕら，
Ｇｅｎｅ １２２：２４７−２５３（１９９２）。植物ホルモン（ジベレリン酸
およびジベレリン酸により誘導される分泌酵素）による植物遺伝子発現の調節の
記載は、Ｒ．Ｌ．ＪｏｎｅｓおよびＪ．ＭａｃＭｉｌｌｉｎ，Ｇｉｂｂｅｒｅｌ
ｌｉｎｓ：Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｌｃｏ
ｌｍ Ｂ．Ｗｉｌｋｉｎｓ編 １９８４ Ｐｉｔｍａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，２１−５２頁の中に確認され得る。他の代謝
調節性遺伝子が記載される参考文献は以下である；Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ Ｃ
ｅｌｌ，２：１０２７−１０３８（１９９０）；Ｍａａｓら，ＥＭＢＯ Ｊ．９
：３４４７−３４５２（１９９０）；ＢｅｎｋｅｌおよびＨｉｃｋｅｙ、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：１３３７−１３３９（１９８７）。
代表的に、当該分野で公知の技術を使用して、所望のポリヌクレオチド配列は
、植物内で操作するために設計された遺伝子調節エレメントを含む発現カセット
の中に挿入される。その発現カセットは、植物宿主内での発現に適切な発現カセ
ットの上流および下流にコンパニオン配列を有する望ましい発現ベクターの中に
挿入される。そのコンパニオン配列は、プラスミドまたはウイルス起源のもので
あり、そしてそのベクターが、細菌のような本来のクローニング宿主から、所望
の植物宿主へＤＮＡを移動させるために必要とされる特徴をベクターに提供する
。基本的な細菌／植物ベクター構築物は、好ましくは、広い宿主範囲の原核生物
の複製起点；原核生物の選択マーカー；および、アグロバクテリウムの形質転換
については、アグロバクテリウム媒介転位のためのＴ ＤＮＡ配列を植物染色体
に提供する。異種遺伝子が容易に検出に従順しない場合は、好ましくは、その構
築物はまた、植物細胞が形質転換されたかどうかを決定するために適した選択マ
ーカー遺伝子を有する。適切なマーカーの一般的な総説は、例えば、イネ科につ
いては、ＷｉｌｍｉｎｋおよびＤｏｎｓ，１９９３，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｒｅｐｔｒ，１１（２）：１６５−１８５に見られる。
植物ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために適した配列もまた、推
奨される。これらは、植物ゲノム内へ異種発現カセットのランダム挿入を可能に
する相同組換え用のためのトランスポゾン配列など、およびＴｉ配列を含み得る
。適切な原核生物選択マーカーとしては、アンピシリンまたはテトラサイクリン
のような抗生物質に対する耐性が挙げられる。別の機能をコードしている他のＤ
ＮＡ配列もまた、そのベクターの中に存在し得、当該分野で公知である。
本発明の核酸分子はまた、目的のタンパク質の発現用の発現カセットに含まれ
得る。２つ以上も可能であるが、通常はただ一つの発現カセットである。組換え
発現カセットは、異種タンパクのコード配列に加え、以下のエレメントを含む；
プロモーター領域、植物５’非翻訳配列、構造遺伝子がそれを備えているかどう
かに依存して、開始コドン、ならびに転写および翻訳終結配列。そのカセットの
５’および３’末端の独特な制限酵素部位は、既存のベクター内への容易な挿入
を可能にする。
異種のコード配列は、本発明に関係する任意のタンパク質のための配列であり
得る。目的のタンパクをコードする配列は、そのタンパク質の適切なプロセッシ
ングおよび輸送を可能にするシグナルペプチドをコードし、そして通常、本発明
の所望のタンパク質の膜への結合を生じ得る任意の配列を欠いている。翻訳開始
領域は、大部分は、発芽中に発現および輸送される遺伝子のためのものであるか
ら、輸送を規定するシグナルペプチドを使用することにより、それはまた、目的
のタンパク質の輸送を規定し得る。この方法で、目的のタンパク質は、それらが
発現される細胞から輸送され、そして効率的に回収され得る。代表的には、種子
における分泌は、種子の胚乳内へ、アリューロン層あるいは胚盤上皮層を通過す
る。タンパク質がそれが産生された細胞から分泌される必要がない場合、このこ
とは組換えタンパク質の分離および精製を容易にする。
所望の遺伝子産物の最終的な発現が、真核生物におけるものであるために、ク
ローン化した遺伝子の任意の部分が、イントロンのように、宿主のスプライセオ
ソーム（ｓｐｌｉｃｏｓｏｍｅ）機構より、プロセッシングされる配列を含むか
否かを決定することが望ましい。そのような場合、「イントロン」領域の部位特
異的変異誘発は、仮性イントロンコードとして遺伝的情報の一部を欠失すること
を防ぐために実施され得る。ＲｅｅｄおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｅｌｌ ４１
：９５−１０５（１９８５）。
ベクターは、組換えＤＮＡを機械的に転移するためにマイクロピペットを用い
て植物細胞内に直接的に微量注入され得る（Ｃｒｏｓｓｗａｙ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ，２０２：１７９−１８５、１９８５）。遺伝子物質はまた、ポリ
エチレングリコールを用いて植物細胞内に転移され得る（Ｋｒｅｎｓら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，２９６、７２−７４、１９８２）。核酸部分の導入の別の方法は、小さ
いビーズまたは微粒子のいずれかのマトリックスの内部に、あるいは表面に核酸
を有する小さな微粒子による高速バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）穿通法
である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２７，７０−７３，１９８７ならびに
ＫｎｕｄｓｅｎおよびＭｕｌｌｅｒ，１９９１，Ｐｌａｎｔａ，１８５：３３０
−３３６は、大麦胚乳の粒子の照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）によりトランス
ジェニック大麦を作製することを示している）。さらに別の導入方法は、他の物
体、いずれかのミニ細胞、細胞、リソソームあるいは他の易融な脂肪表面体との
プロトプラストの融合である（Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，１８５９−１８６３，１９８２）。
ベクターはまた、エレクトロポレーションにより植物細胞内に導入され得る（
Ｆｒｏｍｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２
４，１９８５）。この技術において、植物プロトプラストは、遺伝子構築物を含
むプラスミドの存在中でエレクトロポレート（電気穿孔）される。高い電界の強
さの電気インパルス（衝撃）により、生体膜を可逆的に通過できるようにし、プ
ラスミドの導入を可能にする。エレクトロポレートされた植物プロトプラストは
細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルス形成する。
プロトプラストが単離され得、そして培養されて完全な再生植物を与え得る全
ての植物は、本発明により形質転換され得、これによって移入した遺伝子を保持
する完全な植物が再生される。実際に、全ての植物は、さとうきび、甜菜、綿、
果実および他の樹木、マメ科植物および野菜の全ての主要な種を含むがそれらに
限定されない培養細胞あるいは組織から再生され得る。いくつかの適応した植物
としては、例えば、以下の属由来の種が挙げられる；Ｆｒａｇａｒｉａ，Ｌｏｔ
ｕｓ，Ｍｅｄｉｃａｇｏ，Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ，Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ，Ｔｒｉ
ｇｏｎｅｌｌａ，Ｖｉｇｎａ，Ｃｉｔｒｕｓ，Ｌｉｎｕｍ，Ｇｅｒａｎｉｕｍ，
Ｍａｎｉｈｏｔ，Ｄａｕｃｕｓ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｂｒａｓｓｉｃａ，
Ｒａｐｈａｎｕｓ，Ｓｉｎａｐｉｓ，Ａｔｒｏｐａ，Ｃａｐｓｉｃｕｍ，Ｄａｔ
ｕｒａ，Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ，Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
，Ｓｏｌａｎｕｍ，Ｐｅｔｕｎｉａ，Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ，Ｍａｊｏｒａｎａ，
Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ，Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ，Ｌａｃｔｕｃａ，Ｂｒｏｍｕｓ，
Ａｓｐａｒａｇｕｓ，Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ，Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ，Ｎ
ｅｍｅｓｉａ，Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ，Ｐａｎｉｃｕｍ，Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕ
ｍ，Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ，Ｓｅｎｅｃｉｏ，Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ，Ｃｕ
ｃｕｍｉｓ，Ｂｒｏｗａａｌｉａ，Ｇｌｙｃｉｎｅ，Ｌｏｌｉｕｍ，Ｚｅａ，Ｔ
ｒｉｔｉｃｕｍ，Ｓｏｒｇｈｕｍ，およびＤａｔｕｒａ。
再生のための手法は、植物の種によって変化するが、しかし一般に異種遺伝子
のコピーを含む形質転換されたプロトプラストの懸濁液が最初に提供される。カ
ルス組織は形成され、そしてシュート（苗条）がカルスから誘導され、続いて発
根される。あるいは、胚形成がプロトプラスト懸濁液から誘導され得る。これら
の胚は、天然の胚として発芽し、植物を形成する。培養培地は、一般に種々のア
ミノ酸、ならびにオーキシンおよびサイトカイニンのようなホルモンを含有する
。またグルタミン酸およびプロリンを培地に添加することは、特にコーン（穀草
）およびアルファルファのような種にとって有用である。シュートおよび根は通
常、同時に発生する。効果的な再生は培地、遺伝子型、および培養遍歴に依存す
る。これらの３つの変数が制御される場合は、再生は十分に再現性がありそして
繰り返し可能である。
いくつかの植物細胞培養系において、本発明の所望のタンパク質は排出され、
あるいはこのタンパク質は植物全体から抽出され得る。本発明の所望のタンパク
質は培地内に分泌される場合、これは回収され得る。あるいは、胚および胚のな
い不完全な種子または他の植物組織は、機械的に破壊され細胞間および組織間の
任意の分泌されたタンパク質を放出し得る。その混合物は緩衝液に懸濁され、可
溶タンパクを回収し得る。次いで、慣用的なタンパク質分離および精製方法は組
換えタンパク質を精製するために使用される。時間、温度、ｐＨ、酸素、および
容量のパラメーターは、慣用的な方法によって、異種タンパク質の発現および回
収を最適化するように調整される。
（ＩＶ．細菌系）
細菌の発現技術は、当該分野で公知である。細菌のプロモーターは、細菌のＲ
ＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流
方向（３’方向）へのｍＲＮＡへの転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である。
プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して存在する転写開始領域
を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写
開始部位を含む。細菌のプロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のド
メインを有し、ＲＮＡ合成が始まる近接のＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し
ている。オペレーターは、遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結
合し、そのため特定の遺伝子の転写を抑制し得るような、負の調節された（誘導
性の）転写を可能にする。構成的発現は、オペレーターのような負の調節エレメ
ントの非存在下で起こり得る。さらに、正の調節は、遺伝子アクチベーター（活
性化因子）タンパク質結合配列により達成され得、その配列が存在する場合は通
常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の（５’）側に近接している。遺伝子アクチベ
ータータンパク質の例としては、異化（カタボライト）活性化タンパク質（ＣＡ
Ｐ）があり、それはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）におけ
るｌａｃオペロンの転写の開始を助ける（Ｒａｉｂａｕｄら（１９８４）Ａｎｎ
ｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：１７３）。それゆえ、調節される発現は、正ま
たは負のいずれかであり得、従って転写を増強するかまたは低下し得るかのいず
れかである。
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する
。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら（１９９７
）Ｎａｔｕｒｅ １９８：１０５６）、およびマルトースのような糖代謝の酵素
由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（
ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４
０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９
：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ−Ａ−００３６７７６号およ
びＥＰ−Ａ−０１２１７７５）のような生合成酵素由来のプロモーター配列が挙
げられる。ｇ−ラクタマーゼ（ｇ−ｌａｏｔａｍａｓｅ）（ｂｌａ）プロモータ
ー系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｉｎ
ｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍ
ａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１２８）およびＴ５（米国特
許第４，６８９，４０６号）プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を提
供する。
さらに、天然に存在しない合成プロモーターもまた、細菌のプロモーターとし
て機能する。例えば、ある細菌（バクテリア）あるいはバクテリオファージプロ
モーターの転写活性化配列は、別のバクテリアあるいはバクテリオファージプロ
モーターのオペロン配列と結合し得、合成ハイブリッドプロモーターを形成する
。（米国特許第４，５５１，４３３号）。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｌａ
ｃリプレッサーにより調節されるｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃオペロン
配列の両方から構成される、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（
Ａｍａｎｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ ２５：１６７；ｄｅ Ｂｏｅｒら（１９８
３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２１）。さらに、ある細菌
のプロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始させ
る能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターを含み得る。非細菌起
源の天然に存在するプロモーターはまた、原核生物内でいくらかの遺伝子の高い
レベルでの発現を生じるために、適合性のあるＲＮＡポリメラーゼと結合され得
る。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結し
たプロモーター系の例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バ
クテリオファージプロモーターおよびＥ．ｃｏｌｉオペレーター領域から構成さ
れ得る（ＥＰＯ−Ａ−０２６７８５１）。
機能性のプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位もまた、原核
生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、リボソー
ム結合部位は、シャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、そして開始コドン（
ＡＴＧ）および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上流に位置する長さ３〜９ヌ
クレオチドの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５４：３
４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．ｃｏｌｉの１６Ｓ ｒＲＮＡの３’側との間
の塩基対形成によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられている
（Ｓｔｅｉｔｚら（１９７９）「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ
」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒら編）
）。弱いリボソーム結合部位を有する真核遺伝子および原核遺伝子の発現のため
には（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏ
ｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。
ＤＮＡ分子は、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、直接的にそのＤ
ＮＡ分子と連結され得、この場合、Ｎ末端の最初のアミノ酸は、常に、ＡＴＧ開
始コドンによりコードされるメチオニンである。所望される場合、Ｎ末端のメチ
オニンは、臭化シアンとのインビトロインキュベーション、あるいは細菌のメチ
オニンＮ末端ペプチダーゼとのインビボまたはインビトロインキュベーションの
いずれかによりタンパク質から切断され得る（ＥＰＯ−Ａ−０２１９２３７）。
融合タンパク質は、直接的発現に代わるものを提供する。通常、内在性の細菌
のタンパク質、あるいは他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ
配列は、異種のコード配列の５’末端と融合される。発現の際に、この構築物は
、２つのアミノ酸配列の融合を提供する。例えば、バクテリオファージλ細胞遺
伝子は、外来遺伝子の５’末端と連結し得、そして細菌において発現され得る。
生じた融合タンパク質は、好ましくは、外来遺伝子由来のバクテリオファージタ
ンパク質を切断するための切断酵素（第Ｘａ因子）用の部位を保持する（Ｎａｇ
ａｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０９：８１０）。融合タンパク質はまた、
ｌａｃＺ（Ｊｉａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ６０：１９７）、ｔｒｐＥ（Ａｌｌ
ｅｎら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：９３；Ｍａｋｏｆｆら（１
９８９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３５：１１）、およびＣｈｅｙ（
ＥＰ−Ａ−０３２４６４７）遺伝子由来の配列を用いて作製され得る。２つのア
ミノ酸配列の接合部でのＤＮＡ配列は、切断部位をコードしてもよいし、あるい
はコードしなくてもよい。別の例としては、ユビキチン融合タンパク質である。
そのような融合タンパク質は、好ましくは、外来タンパク質からユビキチンを切
断するための切断酵素（例えば、ユビキチン特異的切断プロテアーゼ）用の部位
を保持するユビキチン領域と共に作製され得る。この方法を通して、天然外来タ
ンパク質は分離され得る（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ７：６９８）。
あるいは、外来タンパク質はまた、細菌における外来タンパク質の分泌を提供
するシグナルペプチド配列フラグメントから構成される、融合タンパク質をコー
ドするキメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から分泌され得る(米国
特許４，３３６，３３６）。シグナル配列フラグメントは、通常、細胞からのタ
ンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドを
コードする。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）、または細胞の内
膜と外膜との間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかへ分泌され
る。好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、このシ
グナルペプチドフラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部
位がある。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ外膜タンパク質遺伝
子（ｏｍｐＡ）（Ｍａｓｕｉら（１９８３）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔａｌ Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｇｈｒａｙｅｂ
ら（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２４３７）およびＥ．ｃｏｌｉアルカリホス
ファターゼシグナル配列（ｐｈｏＡ）（Ｏｋａら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：７２１２）のような、分泌性細菌タンパク質に関
する遺伝子由来であり得る。さらなる例として、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株由来
のα−アミラーゼ遺伝子のシグナル配列は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来の異種タ
ンパク質を分泌するために使用され得る（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ.
Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０２４４０４
２）。
通常、細菌によって認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位
置する調節領域であり、そして従って、プロモーターとともに、コード配列に隣
接する。これらの配列は、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドへと翻
訳され得るｍＲＮＡの転写を指向する。転写終結配列は、しばしば、転写の終結
を補助するステムループ構造を形成し得る、約５０ヌクレオチドのＤＮＡ配列を
含む。例は、強力なプロモーターを有する遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒ
ｐ遺伝子および他の生合成遺伝子）由来の転写終結配列を含む。
通常、上記の成分（プロモーター、シグナル配列（もし所望ならば）、目的の
コード配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物となる
。発現構築物は、しばしば、宿主（例えば細菌）における安定な保持が可能であ
る染色体外エレメント（例えばプラスミド）のような、レプリコンに保持される
。このレプリコンは複製系を有し、従って、このことによって、発現またはクロ
ーニングおよび増幅のいずれかのために、レプリコンが原核生物宿主において保
持されることを可能になる。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドまた
は低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一般
に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有する。高
コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そしてより
好ましくは少なくとも約２０個のプラスミドを含む。高コピー数ベクターまたは
低コピー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターお
よび外来タンパク質の効果に依存する。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、細菌のゲノムへ組み込
まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、細
菌の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含む。組み込みは、ベクターにおけ
る相同なＤＮＡと細菌の染色体との間の組換えから生じるようである。例えば、
種々のＢａｃｉｌｌｕｓ株からのＤＮＡによって構築される組み込みベクターは
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ染色体に組み込まれる（ＥＰ−Ａ−０ １２７ ３２８）。
組み込みベクターはまた、バクテリオファージまたはトランスポゾン配列から構
成され得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含ん
で、形質転換された細菌株の選択を可能にし得る。選択マーカーは、細菌宿主に
おいて発現され得、そして細菌が薬物（例えば、アンピシリン、クロラムフェニ
コール、エリスロマイシン、カナマイシン（ネオマイシン）、およびテトラサイ
クリン）に耐性になるようにする遺伝子を含み得る（Ｄａｖｉｅｓら（１９７８
）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：４６９）。選択マーカーはま
た、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシンの生合成経路における生合成
遺伝子のような、生合成遺伝子を含み得る。
あるいは、上記の成分のいくつかは、形質転換ベクターにおいて組み立てられ
得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持され
るか、または組み込みベクターへと開発されるかのいずれかの選択マーカー（ｍ
ａｒｋｅｔ）から構成され得る。
発現ベクターまたは形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込み
ベクターのいずれも、多くの細菌への形質転換のために開発されてきた。例えば
、発現ベクターは、とりわけ、以下の細菌のために開発されてきた：Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｐａｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およ
びＥＰ−Ａ−０ ０６３ ９５３；ＷＯ ８４／０４５４１）、Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２
：１２８；Ａｍａｎｎら（１９８５）Ｇｅｎｅ ４０：１８３；Ｓｔｕｄｉｅｒ
ら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３；ＥＰ−Ａ−０ ０３６
７７６、ＥＰ−Ａ−０ １３６ ８２９およびＥＰ−Ａ−０ １３６ ９０７
）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８
８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）；Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｐｏｗｅｌｌら（１９８８）Ａｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（米国特許４，７４５，０５６）。
外来ＤＮＡを細菌宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そし
て通常、ＣａＣｌ２または他の薬剤（例えば、２価の陽イオンおよびＤＭＳＯ）
のいずれかで処理された細菌の形質転換を含む。ＤＮＡはまた、エレクトロポレ
ーションによって、細菌細胞へ導入され得る。形質転換の手順は、通常、形質転
換される細菌の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｍａｓｓｏｎ
ら（１９８９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．６０：２７３；Ｐａ
ｌｖａら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：
５５８２；ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ２５９およびＥＰ−Ａ−０６３ ９５３；Ｗ
Ｏ ８４／０４５４１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、（Ｍｉｌｌｅｒら（１９８８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５６；Ｗａｎｇら（１９９０）
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：９４９、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、（
Ｃｏｈｅｎら（１９７３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９：２１
１０；Ｄｏｗｅｒら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：
６１２７；Ｋｕｓｈｎｅｒ（１９７８）「ＣｏｌＥ１由来のプラスミドによるＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの形質転換のための改良された方法」Ｇｅｎｅ
ｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｈ．Ｗ．ＢｏｙｅｒおよびＳ．Ｎｉｃｏｓｉａ編）；Ｍａ
ｎｄｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３：１５９；Ｔａｋｅｔｏ（
１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ９４９：３１８；Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、（Ｃｈａｓｓｙら（１９８７）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．４４：１７３ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）；（Ｆｉｅｄ
ｌｅｒら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １７０：３８、Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ）；（Ａｕｇｕｓｔｉｎら（１９９０）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．６６：２０３、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、（Ｂａｒａｎ
ｙら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４４：６９８；Ｈａｒｌａｎｄｅ
ｒ（１９８７）「エレクトロポレーションによるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｌａｃｔｉｓの形質転換」Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ
．ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＲ．Ｃｕｒｔｉｓｓ ＩＩＩ編）；Ｐｅｒｒｙら（１
９８１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５；Ｐｏｗｅｌｌら（１９８
８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４：６５５；Ｓｏｍｋ
ｕｔｉら（１９８７）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ Ｅｖｒ．Ｃｏｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ １：４１２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。
（ｖ．酵母発現）
酵母発現系もまた、当業者に公知である。酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポ
リメラーゼに結合可能であり、そしてコード配列（例えば、構造遺伝子）からｍ
ＲＮＡへの下流の（３’側の）転写を開始し得る、任意のＤＮＡ配列である。プ
ロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する転写開始領域を有
する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位（「ＴＡＴＡボ
ックス」）および転写開始部位を含む。酵母プロモーターはまた、上流アクチベ
ーター配列（ＵＡＳ）と呼ばれる第２のドメインを有し得、これは、もし存在す
るならば、通常、構造遺伝子とは遠位である。このＵＡＳは、調節される（誘導
できる）発現を可能にする。構成的発現は、ＵＡＳの非存在下で生じる。調節さ
れる発現は、正または負のいずれかであり得、それによって転写を増加させるか
または減少させるかのいずれかであり得る。
酵母は、活性な代謝経路を有する発酵性微生物であり、従って、代謝経路にお
ける酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例とし
ては、以下が挙げられる：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ−Ａ−
０ ２８４ ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸
イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまた
はＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセ
リン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰＯ−Ａ−０ ３２
９ ２０３）。酵母ＰＨＯ５遺伝子はまた、酸性ホスファターゼをコードし、有
用なプロモーター配列を提供する（Ｍｙａｎｏｈａｒａら（１９８３）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：１）。
さらに、天然には生じない合成プロモーターもまた、酵母のプロモーターとし
て機能する。例えば、ある１つの酵母プロモーターのＵＡＳ配列は、別の酵母プ
ロモーターの転写活性化領域と連結され得、合成ハイブリッドプロモーターを生
成し得る。このようなハイブリッドプロモーターの例は、ＧＡＰ転写活性化領域
と連結されるＡＤＨ調節配列（米国特許第４，８７６，１９７号および同第４，
８８０，７３４号）を含む。ハイブリッドプロモーターの他の例は、ＡＤＨ２、
ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子のいずれかの調節配列からなり、
ＧＡＰまたはＰｙＫ（ＥＰ−Ａ−０ １６４ ５５６）のような解糖酵素遺伝子
の転写活性化領域に結合されているプロモーターを含む。さらに、酵母プロモー
ターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして転写を開始する能力を有する
、天然に生じる非酵母起源のプロモーターを含み得る。このようなプロモーター
の例としては、とりわけ、以下が挙げられる：（Ｃｏｈｅｎら（１９８０）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：１０７８；Ｈｅｎｉｋｏｆ
ｆら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２８３：８３５；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１
９８１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６
：１１９；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら（１９７９）「酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける細菌の抗生物質耐性遺伝子の発現」、Ｐｌ
ａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ
Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ（Ｋ．Ｎ．ＴｉｍｍｉｓおよびＡ
．Ｐｕｈｌｅｒ編）；Ｍｅｒｃｅｒａｕ−Ｐｕｉｇａｌｏｎら（１９８０）Ｇｅ
ｎｅ １１：１６３；Ｐａｎｔｈｉｅｒら（１９８０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．
２：１０９；）。
ＤＮＡ分子は、酵母において、細胞内で発現され得る。プロモーター配列は、
ＤＮＡ分子と直接連結され得、その場合、組換えタンパク質のＮ末端にある最初
のアミノ酸は常にＡＴＧ開始コドンによってコードされているメチオニンである
。もし所望ならば、Ｎ末端のメチオニンは、臭化シアンとのインビトロインキュ
ベーションによって、タンパク質から切断され得る。
融合タンパク質は、酵母発現系について、ならびに哺乳動物、バキュロウイル
ス、および細菌の発現系において、代替物を提供する。通常、内因性酵母タンパ
ク質、または他の安定なタンパク質のＮ末端部分をコードするＤＮＡ配列は、異
種コード配列の５’末端に融合される。発現において、この構築物は、２つのア
ミノ酸配列の融合物を提供する。例えば、酵母またはヒトのスーパーオキシドジ
スムターゼ（ＳＯＤ）遺伝子は、外来遺伝子の５’末端に連結され、そして酵母
において発現し得る。２つのアミノ酸配列の連結部にあるＤＮＡ配列は、切断部
位をコードしてもよいし、コードしなくてもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−０ １９
６ ０５６を参照のこと。別の例はユビキチン融合タンパク質である。このよう
な融合タンパク質は、外来タンパク質からユビキチンを切断するプロセシング酵
素（例えば、ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ）のための部位を好ま
しくは保持する、ユビキチン領域を伴って作製される。従って、この方法を通じ
て、ネイティブな融合タンパク質は、単離され得る（例えば、ＷＯ８８／０２４
０６６）。
あるいは、外来タンパク質はまた、酵母における外来タンパク質の分泌を提供
する、リーダー配列フラグメントから構成される融合タンパク質をコードする、
キメラＤＮＡ分子を作製することによって、細胞から増殖培地へ分泌され得る。
好ましくは、インビボまたはインビトロのいずれかで切断され得る、リーダーフ
ラグメントと外来遺伝子との間にコードされるプロセシング部位が存在する。リ
ーダー配列フラグメントは、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性ア
ミノ酸から構成されるシグナルペプチドを、通常コードする。
適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌性酵母タンパク質に関する遺
伝子由来であり得、その遺伝子は例えば、酵母インベルターゼ遺伝子（ＥＰ−Ａ
−０ ０１２ ８７３；ＪＰＯ．６２，０９６，０８６）およびＡ因子遺伝子（
米国特許第４，５８８，６８４号）である。あるいは、インターフェロンリーダ
ーのような、酵母における分泌もまた提供する、非酵母起源のリーダーが存在す
る（ＥＰ−Ａ−０ ０６０ ０５７）。
好ましいクラスの分泌リーダーは、酵母α因子遺伝子のフラグメントを使用す
るリーダーであり、これは「プレ」シグナル配列、および「プロ」領域の両方を
含む。用いられ得るこの型のα因子フラグメントは、完全長の、プレ−プロα因
子リーダー(約８３アミノ酸残基）および短縮されたα因子リーダー（通常約２
５〜約５０アミノ酸残基）を含む（米国特許第４，５４６，０８３号および同第
４，８７０，００８号；ＥＰ−Ａ−０ ３２４ ２７４）。分泌を提供するα因
子リーダーフラグメントを使用するさらなるリーダーは、第１の酵母のプレ配列
を有するが、第２の酵母α因子からのプロ領域を有しないで作製される、ハイブ
リッドα因子リーダーを含む（例えば、ＷＯ８９／０２４６３を参照のこと）。
通常、酵母に認識される転写終結配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する
調節領域であり、従って、プロモーターと共にコード配列に隣接する。これらの
配列は、そのＤＮＡにコードされるポリペプチドへと翻訳され得る、ｍＲＮＡの
転写を指向する。転写終結配列および他の酵母に認識される終結配列の例は、例
えば、解糖酵素をコードする転写終結配列である。
通常、上記の成分（プロモーター、リーダー（もし所望ならば）、目的のコー
ド配列、および転写終結配列を含む）は、組み立てられて発現構築物になる。発
現構築物は、宿主（例えば、酵母または細菌）において安定に保持され得る染色
体外エレメント（例えば、プラスミド）のような、レプリコンにおいてしばしば
保持される。このレプリコンは、２つの複製系を有し得、従って、このことが、
例えば、発現のために酵母において、ならびにクローニングおよび増幅のために
原核生物宿主において保持されることを可能にする。このような酵母−細菌シャ
トルベクターの例としては、以下が挙げられる：ＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ
ら（１９７９）Ｇｅｎｅ ８：１７〜２４）、ｐＣｌ／１（Ｂｒａｋｅら（１９
８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４６４２〜４６
４６）、およびＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１５８：１５７）。さらに、レプリコンは、高コピー数プラスミドま
たは低コピー数プラスミドのいずれかであり得る。高コピー数プラスミドは、一
般に約５〜約２００、そして通常約１０〜約１５０の範囲のコピー数を有し得る
。高コピー数プラスミドを含む宿主は、好ましくは少なくとも約１０個、そして
より好ましくは少なくとも約２０個を有する。高コピー数ベクターまたは低コピ
ー数ベクターのいずれかが選択され得、それは、宿主に対するベクターおよび外
来タンパク質の効果に依存する。例えば、Ｂｒａｋｅら、前出を参照のこと。
あるいは、発現構築物は、組み込みベクターを用いて、酵母のゲノムへ組み込
まれ得る。組み込みベクターは、通常、ベクターが組み込むのを可能にする、酵
母の染色体と相同な少なくとも１つの配列を含み、そして好ましくは、発現構築
物に隣接する２つの相同配列を含む。組み込みは、ベクターにおける相同なＤＮ
Ａと酵母の染色体との間の組換えから生じるようである（Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ
ら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２２８〜２４
５）。組み込みベクターは、そのベクター中に含有するために適切な相同配列を
選択することによって、酵母における特定の遺伝子座を指向され得る。Ｏｒｒ−
Ｗｅａｖｅｒら、前出を参照のこと。１つ以上の発現構築物が組み込まれ得、お
そらく産生される組換えタンパク質のレベルに影響を与え得る（Ｒｉｎｅら（１
９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：６７５０）。
ベクターに含まれる染色体配列は、ベクターにおける単一セグメント（ベクター
全体の組み込みを生じる）、または染色体における隣接セグメントに相同でかつ
ベクターにおける発現構築物に隣接する２つのセグメント（発現構築物のみの安
定した組み込みを生じ得る）のいずれかとして生じ得る。
通常、染色体外発現構築物および組み込み発現構築物は、選択マーカーを含み
得、形質転換された酵母株の選択を可能にする。選択マーカーは、酵母宿主にお
いて発現され得る生合成遺伝子を含み得、それは例えば、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、
ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７、ならびにＧ４１８耐性遺伝子であり、そ
れぞれ、酵母細胞がツニカマイシンおよびＧ４１８に耐性になるようにする。さ
らに、適切な選択マーカーはまた、金属のような毒性化合物の存在下において増
殖する能力を、酵母に提供し得る。例えば、ＣＵＰ１の存在は、酵母が、銅イオ
ンの存在下において増殖することを可能にする（Ｂｕｔｔら（１９８７）Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３５１）
あるいは、上記成分のうちのいくつかは、組み立てられて形質転換ベクターに
なり得る。形質転換ベクターは、通常、上記のように、レプリコンにおいて保持
されるか、または組み込みベクターに開発されるかのいずれかである、選択マー
カーから構成される。
発現ベクターおよび形質転換ベクターは、染色体外レプリコンまたは組み込み
ベクターのいずれかであり、多くの酵母への形質転換のために開発されてきた。
例えば、発現ベクターは、とりわけ、以下の酵母のために開発されてきた：Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅら（１
９８５）Ｊ.Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）。Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１
１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃ
ｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７；Ｖａｎ ｄ
ｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、
Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．
Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６
；米国特許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９；Ｉｔｏら（１
９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８１）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３００：７０６）、およびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ
（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０４７１；
Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。
外来ＤＮＡを酵母宿主へ導入する方法は、当該分野において周知であり、そし
て通常、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処置された無傷の酵母
細胞のいずれかの形質転換を含む。形質転換の手順は、通常、形質転換される酵
母の種によって変化する。例えば以下を参照のこと：（Ｋｕｒｔｚら（１９８６
）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２；Ｋｕｎｚｅら（１９８５）Ｊ．Ｂ
ａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；Ｃａｎｄｉｄａ）；（Ｇｌｅｅ
ｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９；Ｒ
ｏｇｇｅｎｋａｍｐら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０
２；Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）；（Ｄａｓら（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１５８：１１６５；Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１５４：１１６５；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）；（Ｃ
ｒｅｇｇら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６；Ｋｕｎｚ
ｅら（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１；米国特
許第４，８３７，１４８号および同第４，９２９，５５５号；Ｐｉｃｈｉａ）；
（Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：１９２９；Ｉｔｏら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１
６３ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）；（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ（１９８
１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
）；（Ｄａｖｉｄｏｗら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３９；Ｇａ
ｉｌｌａｒｄｉｎら（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９；Ｙａｒｒ
ｏｗｉａ）。
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、本発明のポリペプチド、抗体または核酸のいずれかを含み得
る。この薬学的組成物は、治療上有効な量の、本願発明のポリペプチド、抗体、
またはポリヌクレオチドのいずれかを含む。
本明細書において使用される用語「治療上有効な量」とは、所望の疾患または
状態を処置、改善、または予防するための治療薬剤の量、または、検出可能な治
療効果または予防効果を示すための治療薬剤の量をいう。この効果は、例えば、
キメラマーカーまたは抗原レベルによって検出され得る。治療効果はまた、体温
低下のような、身体の症状における減少を含む。被験体に関する正確な有効量は
、被験体の大きさおよび健康、状態の性質および程度、および投与のために選択
される治療または治療の組合せに依存する。従って、あらかじめ正確な有効量を
特定することは有用ではない。しかし、所定の情況のための有効量は、慣用的な
実験によって決定され得、そして臨床医の判断内である。
本発明の目的のために、有効な用量は、ＤＮＡ構築物が投与される個体におい
て、ＤＮＡ構築物の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．０５ｍｇ
／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
薬学的組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。用語「薬学的
に受容可能なキャリア」とは、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治
療薬剤のような、治療薬剤の投与のためのキャリアをいう。この用語は、この組
成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導せず、そして過度の毒性
を伴わずに投与され得る、任意の薬学的キャリアをいう。適切なキャリアは、タ
ンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリ
マー、および不活性ウイルス粒子のように、大きく、遅く代謝される巨大分子で
あり得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。
薬学的に受容可能な塩が、その中で使用され得る。例えば、塩酸塩、臭化水素
塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マ
ロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩である。薬学的に受容可能な賦形
剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）にて利用
可能である。
治療組成物における薬学的に受容可能なキャリアは、水、生理的食塩水、グリ
セロールおよびエタノールのような液体を含み得る。さらに、湿潤剤または乳化
剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が、このようなビヒクルに存在し得る。
代表的には、治療組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの、注射可能物質
として調製される；注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適切な固体
形態もまた、調製され得る。リポソームは、薬学的に受容可能なキャリアの定義
中に含まれる。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明の組成物は、その被験体へ直接投与され得る。処置
される被験体は、動物であり得；特に、ヒト被験体が処置され得る。
その組成物直接送達は、一般的に、皮下的に、腹腔内に、静脈内に、または筋
肉内のいずれかでの注入によって達成されるか、あるいは、組織の間質空間へ送
達される。この組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式には、経口投
与、および肺投与、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経
皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参
照のこと）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）
が含まれる。投薬処置は、単回用量スケジュール、または多数回用量スケジュー
ルであり得る。
（ワクチン）
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治
療（すなわち、感染後の疾患を処置するため）のいずれかであり得る。
このようなワクチンは、免疫抗原、免疫原、ポリペプチド、タンパク質または
核酸を、通常「薬学的に受容可能なキャリア」とともに含み、このキャリア自体
は、その組成物を受ける個体に有害である抗体の産生を誘発しない任意のキャリ
アを含む。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくり代謝される高分子（
例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー
性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソー
ム）、および不活性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当該分野で周
知である。さらに、これらのキャリアは免疫刺激薬剤（「アジュバント」）とし
て機能し得る。さらに、この抗原または免疫原は、細菌毒素（例えば、ジフテリ
ア、破傷風、コレラ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉなどの病原因子からの毒素）と結合体化
され得る。
この組成物の効力を増強するために好ましいアジュバントは、（１）アルミニ
ウム塩（「明礬」）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸
アルミニウムなど）、（２）水中油懸濁処方物（他の特定の免疫刺激薬剤（例え
ば、ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を伴うか伴
わない）を包含するが、それらに限定されず、例えば、以下：（ａ）５％スクア
レン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５（必要に応
じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含有するが、必要ではな
い）を含み、モデル１１０Ｙ微小流体化器（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅ
ｗｔｏｎ、ＭＡ）のような微小流体化器を用いてμ未満の粒子へと処方されたＭ
Ｆ５９ＴＭ（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ
ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ、編、Ｐｏｗｅ
ｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５の第１０節）；
（ｂ）μ未満のエマルジョンへと微小流体化されたか、またはボルテックスして
、より大きな粒子径エマルジョンを生成したかのいずれかである、１０％スクア
レン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、
およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）
２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ
）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）好まし
くはＭＰＬおよびＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１つ以上の細菌細
胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕ
ｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）サポニンアジュバント（例え
ば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗ
ｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）を使用し得るか、またはそれから粒子（例えば、ＩＳ
ＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を生成し得る；（４）完全フロイントアジュバント
（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイ
ン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ
−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、γ
インターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）など；および（６）その組成物の効力を強化するための免疫刺
激因子として作用する他の物質を包含するがそれらに限定されない。ミョウバン
およびＭＦ５９ＴＭが好ましい。
上記で言及したように、ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−
スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’
−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチ
ルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するがそれらに限定されない。
免疫原性組成物（例えば、免疫化抗原／免疫原／ポリペプチド／タンパク質／
核酸、薬学的に受容可能なキャリア、およびアジュバント）は、代表的に、希釈
剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含有する。さ
らに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、このよ
うなビヒクルにおいて存在し得る。
代表的に、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁物として、注射剤として調
製され；注射前に液体ビヒクルにおける溶液または懸濁物として適切な固体形態
もまた調製され得る。この調製物はまた、薬学的に受容可能なキャリアの下で、
上記に記載のように、アジュバント効果の強化のために乳化され得るかまたはリ
ポソーム中にカプセル化され得る。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原性または
免疫原性のポリペプチド、および任意の他の上記の成分を必要に応じて含む。「
免疫学的有効量」とは、その量の個体への投与が、単回用量であれ、一連の（用
量の）一部としてであれ、処置または予防に有効であることを意味する。この量
は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類学上の群（例
えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望
される保護の程度、そのワクチンの処方物、処置する医師の医療的状況の評価、
および他の関連する因子に依存して変動する。その量は、比較的広い範囲に入り
、この量が慣用的な試行を通して決定され得ることが予想される。
免疫学的組成物は、従来のように、非経口的（例えば、皮下、筋肉内または経
皮（ｔｒａｎｓｕｄｅｒｍａｌｌｙ）／経皮（ｔｒａｎｓｕｃｕｔａｎｅｏｕｓ
ｌｙ）のいずれかでの注射による）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）に投与さ
れる）。他の投与様式に適切なさらなる処方物は、経口処方物および肺処方物、
坐剤、および経皮適用を含む。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回
用量スケジュールであり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤とともに投与され得
る。
タンパク質ベースのワクチンの代替として、ＤＮＡワクチンを使用し得る（例
えば、ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＴｏｒｒｅｓ（１９９７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉ
ｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：２７１−２８３；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９
７）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：６１７−６４８；本明細書中後
半部を参照のこと）。
（遺伝子送達ビヒクル）
本発明の治療剤のコード配列を含む、哺乳動物における発現のためにその哺乳
動物へ送達される構築物の送達のための遺伝子治療ビヒクルは、局所または全身
的のいずれかで投与され得る。これらの構築物は、ウイルスベクターアプローチ
または非ウイルスベクターアプローチを、インビボまたはエキソビボの様式で利
用し得る。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは
外因性プロモーターを用いて誘導され得る。このコード配列のインビボでの発現
は、構成性または調節性のいずれかであり得る。
本発明は、意図された核酸配列を発現し得る遺伝子送達ビヒクルを含む。この
遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルスベクター、およびより好ましくは
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡ
Ｖ）ベクター、ヘルペスウイルスベクターまたはαウイルスベクターである。こ
のウイルスベクターはまた、アストロウイルスベクター、コロナウイルスベクタ
ー、オルトミクソウイルスベクター、パポバウイルスベクター、パラミクソウイ
ルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポックス
ウイルスベクター、またはトガウイルスベクターであり得る。一般的には、Ｊｏ
ｌｌｙ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１−６４
；Ｋｉｍｕｒａ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：８４
５−８５２；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ ６：１８５−１９３；およびＫａｐｌｉｔｔ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１４８−１５３を参照のこと。
レトロウイルスベクターは、当該分野で周知であり、そして本発明者らは、任
意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であることを
意図する。これには、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型のレトロウイルス、異種栄養性ウイ
ルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２およびＮＺＢ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌ
ｌ（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：１６０を参照のこと）多栄養性レトロウ
イルス（例えば、ＭＣＦおよびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．４５：２９１を参照のこと）、スプマウイルスおよびレンチウイルス
が含まれる。ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｏｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの部分は、異なるレトロウイルスに由来し
得る。例えば、レトロウイルスＬＴＲは、マウス肉腫ウイルスに由来し得、ｔＲ
ＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスに由来し得、パッケージングシグナルはマウ
ス白血病ウイルスに由来し得、そして第二の鎖合成の起源はトリ白血病ウイルス
に由来し得る。
これらの組換えレトロウイルスベクターを使用して、適切なパッケージング細
胞株へそれらを導入することによって形質導入適合性レトロウイルスベクター粒
子を生成し得る（米国特許第５，５９１，６２４号を参照のこと）。レトロウイ
ルスベクターは、レトロウイルス粒子へのキメラインテグラーゼ酵素の組込みに
よって宿主細胞ＤＮＡへの部位特異的組込みについて構築され得る（ＷＯ９６／
３７６２６号を参照のこと）。この組換えウイルスベクターは複製欠損組換えウ
イルスであることが好ましい。
上記に記載のレトロウイルスベクターを伴う使用について適切なパッケージン
グ細胞株は、当該分野で周知であり、容易に調製され（ＷＯ９５／３０７６３号
およびＷＯ９２／０５２６６号を参照のこと）、そしてこれを使用して、組換え
ベクター粒子の生産のためのプロデューサー細胞株（これは、ベクター細胞株ま
たは「ＶＣＬ」とも称される）を作製し得る。好ましくは、このパッケージング
細胞株は、ヒトの親細胞（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株か
ら作製され、これは、ヒト血清における不活化を除去する。
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築のために好ましいレトロウイルスは
、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細
胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルス、および
ラウス肉腫ウイルスを含む。特に好ましいマウス白血病ウイルスは、４０７０Ａ
および１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ（１９７６）Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．１９：１９−２５）、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、Ｆｒ
ｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−２４５）、Ｇｒａｆｆｉ、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ
番号ＶＲ−５９０）、Ｋｉｒｓｔｅｎ、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルスおよびＲａｕ
ｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス
（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）を含む。このようなレトロウイルスベクターは、
寄託機関または収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（
「ＡＴＣＣ」）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手し得るか、
または一般に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。
本発明において使用可能な例示的な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクター
は、特許出願ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０４１５７３１、ＥＰ０３４５２４２、
ＥＰ０３３４３０１、ＷＯ８９／０２４６８；ＷＯ８９／０５３４９、ＷＯ８９
／０９２７１．ＷＯ９０／０２８０６、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３
６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０
、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９１／０２８２５、ＷＯ
９５／０７９９４、米国特許第５，２１９，７４０号、同４，４０５，７１２号
、同４，８６１，７１９号、同４，９８０，２８９号、同４，７７７，１２７号
、同５，５９１，６２４号に記載されるものを含む。Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ ５３（１９９３）８３−８８；Ｔａｋａｍｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒ
ｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒ
ｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１
５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１；６
３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ １もまた参照のこと。
ヒトアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、そして
本発明において使用可能である。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ（１９９１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５２：４３１；ならびにＷＯ９３／０７２８３、ＷＯ９３／０６２
２３、およびＷＯ９３／０７２８２を参照のこと。本発明において使用可能な例
示的な公知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、上記に参照される文書およ
びＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ
９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、ＷＯ９５／００６５５、ＷＯ９５／
２７０７１、ＷＯ９５／２９９９３、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／０５３
２０、ＷＯ９４／０８０２６、ＷＯ９４／１１５０６、ＷＯ９３／０６２２３、
ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／１４１０２、ＷＯ９５／２４２９７、ＷＯ９
５／０２６９７、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２４２９９、ＷＯ９５／０
９２４１，ＷＯ９５／２５８０７、ＷＯ９５／０５８３５、ＷＯ９４／１８９２
２およびＷＯ９５／０９６５４において記載されるものを含む。あるいは、Ｃｕ
ｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４に記載
されるような殺傷したアデノウイルスに連結したＤＮＡの投与が使用され得る。
本発明の遺伝子送達ビヒクルはまた、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベ
クターを含む。本発明における使用のためのこのようなベクターの主要なおよび
好ましい例は、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＷＯ９３／０９２３９に開示されるＡＡ
Ｖ−２ベースのベクターである。最も好ましいＡＡＶベクターは、２つのＡＡＶ
逆方向末端反復を含む。ここで、ネイティブＤ配列は、ヌクレオチドの置換によ
って改変され、その結果、少なくとも５つのネイティブなヌクレオチドおよび１
８までのネイティブヌクレオチド、好ましくは少なくとも１０のネイティブヌク
レオチドから１８までのネイティブヌクレオチド、最も好ましくは１０のネイテ
ィブヌクレオチドが維持され、そしてＤ配列の残りのヌクレオチドが欠失または
ネイティブでないヌクレオチドで置換されている。ＡＡＶ逆方向末端反復のネイ
ティブなＤ配列は、各ＡＡＶ逆方向末端反復において（すなわち、各末端に１つ
の配列が存在する）２０の連続するヌクレオチドの配列であって、これは、ＨＰ
形成に関与しない。ネイティブでない置換ヌクレオチドは、同じ位置でのネイテ
ィブなＤ配列に見出されるヌクレオチド以外の任意のヌクレオチドであり得る。
他の使用可能な例示的なＡＡＶベクターは、、ｐＷＰ−１９、ｐＷＮ−１であり
、これらは両方ともＮａｈｒｅｉｎｉ（１９９３）Ｇｅｎｅ １２４：２５７−
２６２に開示される。このようなＡＡＶベクターの別の例は、ｐｓｕｂ２０１（
Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６を参照のこと）
である。別の例示的なＡＡＶベクターは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターで
ある。Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ ＩＴＲベクターの構築は、米国特許第５，４７８，７
４５号に開示される。なお他のベクターは、Ｃａｒｔｅｒ 米国特許第４，７９
７，３６８号およびＭｕｚｙｃｚｋａ 米国特許第５，１３９，９４１号、Ｃｈ
ａｒｔｅｊｅｅ 米国特許第５，４７４，９３５号ならびにＫｏｔｉｎ ＷＯ９
４／２８８１５７に開示されるものである。本発明において使用可能なＡＡＶベ
クターのなおさらなる例は、ＳＳＶ９ＡＦＡＢＴＫｎｅｏであり、これは、ＡＦ
Ｐエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含み、そして肝臓において優性
に発現を指向する。その構造および構築は、Ｓｕ（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４６３−４７０に開示される。さらなるＡＡＶ遺伝
子治療ベクターは、米国特許第５，３５４，６７８号、同５，１７３，４１４号
、同５，１３９，９４１号、および同５，２５２，４７９号に開示される。
本発明の遺伝子治療ベクターはまた、ヘルペスウイルスベクターを含む。主要
なおよび好ましい例は、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含む
単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号、お
よびＥＰ０１７６１７０（Ｒｏｉｚｍａｎ）に開示されるもの）である。さらな
る例示的な単純ヘルペスウイルスベクターは、ＷＯ９５／０４１３９（Ｗｉｓｔ
ａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）に開示されるＨＦＥＭ／ＩＣＰ６−ｌａｃＺ、Ｇｅ
ｌｌｅｒ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６６７−１６６９ならびにＷ
Ｏ９０／０９４４１およびＷＯ９２／０７９４５に記載されるｐＨＳＶｌａｃ、
Ｆｉｎｋ（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１−１９
に記載されるＨＳＶ Ｕｓ３：：ｐｇＣ−ｌａｃＺ、ならびにＥＰ０４５３２４
２（Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｅｄ）に記載されるＨＳＶ ７１３４、２ＲＨ １０
５およびＧＡＬ４、ならびにＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−９７７および
ＡＴＣＣ ＶＲ−２６０として寄託されたものを含む。
意図されるのはまた、本発明において使用され得るαウイルス遺伝子治療ベク
ターである。好ましいαウイルスベクターは、シンドビスウイルスベクターであ
る。トガウイルス、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ
ＶＲ−１２４７）、Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７０）
、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）
、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ
−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）および米国
特許第５，００９１，３０９号、同５，２１７，８７９号、およびＷＯ９２／１
０５７８に記載されるもの。より詳細には、米国特許出願第０８／４０５，６２
７号（１９９５年３月１５日出願）、ＷＯ９４／２１７９２号、ＷＯ９２／１０
５７８号、ＷＯ９５／０７９９４号、米国特許第５，０９１，３０９号、および
米国特許第５，２１７，８７９号に記載されるそれらのαウイルスベクターが使
用可能である。このようなαウイルスは、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａ
ｒｙｌａｎｄのような寄託機関または収集機関から入手し得るか、または一般的
に利用可能な技術を用いて公知の供給源から単離され得る。好ましくは、細胞傷
害性が減少したαウイルスベクターを使用する（米国特許仮出願０８／６７９６
４０号を参照のこと）。
ＤＮＡベクター系（例えば、真核細胞層状発現系）もまた、本発明の核酸の発
現について有用である。真核生物層状発現系の詳細な説明についてはＷＯ９５／
０７９９４を参照のこと。好ましくは、本発明の真核細胞層状発現系はαウイル
スベクターに由来し、そして最も好ましくはシンドビスウイルスベクターに由来
する。
本発明における使用に適切な他のウイルスベクターは、ポリオウイルス（例え
ば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８およびＥｖａｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３８５
およびＳａｂｉｎ（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ
１：１１５に記載されるもの；リノウイルス、例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１
１０およびＡｒｎｏｌｄ（１９９０）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌ４０１
に記載されるもの；ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスルウイルスま
たはワクシニアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−１１１およびＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−２０１０ならびにＦｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：３１７；Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９８９）Ａｎｎ ＮＹ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５６９：８６、Ｆｌｅｘｎｅｒ（１９９０）Ｖａｃｃｉｎ
ｅ ８：１７；米国特許第４，６０３，１１２号および同４，７６９，３３０号
ならびにＷＯ８９／０１９７３号に記載されるもの））；ＳＶ４０ウイルス（例
えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３０５およびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒ
ｅ ２７７：１０８およびＭａｄｚａｋ（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ
７３：１５３３に記載されるもの）；インフルエンザウイルス（例えば、ＡＴＣ
Ｃ ＶＲ−７９７および米国特許第５，１６６，０５７号およびＥｎａｍｉ（１
９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ．８７：３８０２−３８０５
；ＥｎａｍｉおよびＰａｌｅｓｅ（１９９１）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：２７１１
−２７１３およびＬｕｙｔｊｅｓ（１９８９）Ｃｅｌｌ ５９：１１０（ＭｃＭ
ｉｃｈａｅｌ（１９８３）ＮＥＪ Ｍｅｄ ３０９：１３ならびにＹａｐ（１９
７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７３：２３８およびＮａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：
１０８もまた参照のこと）に記載されるような逆遺伝子技術を使用して作製した
組換えインフルエンザウイルス）；ＥＰ−０３８６８８２およびＢｕｃｈｓｃｈ
ａｃｈｌｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１に記載されるような
ヒト免疫不全ウイルス；麻疹ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６７およびＶ
Ｒ−１２４７ならびにＥＰ−０４４０２１９に記載されるもの）；アウラウイル
ス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６８）；ベバルウイルス（例えば、ＡＴＣＣ
ＶＲ−６００およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４０）；カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）
ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２２）；チクングンヤウイルス（例えば
、ＡＴＣＣ ＶＲ−６４およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４１）；フォートモーガン
（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２４）；ゲ
タウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３６９およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４３
）；キジラガハ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−
９２７）；マヤロウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６６）；ムカンボウイル
ス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−５８０およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４４）；ヌヅ
ムウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７１）；ピクスナウイルス（例えば、
ＡＴＣＣ ＶＲ−３７２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２４５）；トナテ（Ｔｏｎａ
ｔｅ）ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２５）；トリニティウイルス（例
えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−４６９）；ユナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３
７４）；ワタロアウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９２６）；Ｙ−６２−３
３ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−３７５）；オニオニオンウイルス、東部
ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−６５およびＡＴＣＣ ＶＲ−
１２４２）；西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７０、ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−６２２およびＡＴＣＣ ＶＲ−１２５
２）；ならびにコロナウイルス（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−７４０）およびＨａ
ｍｒｅ（１９６６）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ １２１：１
９０に記載のものを含む。
本発明の組成物の細胞への送達は、上記に言及したウイルスベクターに限定さ
れない。他の送達方法および媒体が使用され得る（例えば、核酸発現ベクター、
殺傷したアデノウイルスに連結したかまたは連結してないポリカチオン性縮合Ｄ
ＮＡ単独（例えば、米国特許出願番号０８／３６６，７８７（１９９４年１２月
３０日出願）およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３
：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ（１９８
９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこと）
、真核生物細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許出願番号０８／２４０，０
３０（１９９４年５月９日出願）および米国特許出願番号０８／４０４，７９６
を参照のこと）、光重合化ヒドロゲル物質の沈着、手動の遺伝子送達粒子銃（米
国特許第５，１４９，６５５号に記載されるような）、米国特許第５，２０６，
１５２およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような電離放射線、核酸電荷中
和または細胞膜との融合）。さらなるアプローチは、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）
Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：２４１１−２４１８およびＷｏｆｆｅｎｄ
ｉｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：１５８１−１
５８５に記載される。
粒子媒介遺伝子送達が使用され得る（例えば、米国特許出願６０／０２３，８
６７号を参照のこと）。手短には、配列を、高レベル発現のための従来の制御配
列を含む従来のベクターに挿入し得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシ
アロオロソムコイド（ＷｕおよびＷｕ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６２：４４２９−４４３２に記載されるような）、Ｈｕｃｋｅｄ（１９９０）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４０：２５３−２６３に記載されるような
インスリン、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ３
：５３３−５３９に記載されるようなガラクトース、ラクトースまたはトランス
フェリン）に連結された合成遺伝子送達分子（例えば、重合ＤＮＡ結合カチオン
様ポリリジン、プロタミンおよびアルブミン）とともにインキュベートされ得る
。
裸のＤＮＡもまた使用され得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ９０／
１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載される。取り込み効率
は、生体分解性のラテックスビーズを用いて改良され得る。ＤＮＡコートラテッ
クスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に効率よく細胞へと輸
送される。この方法は、ビーズを処理して疎水性を高め、それによってエンドソ
ームの破壊および細胞質へのＤＮＡの放出を容易にすることによってさらに改良
され得る。
遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，
１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４
５、およびＥＰ５２４，９６８に記載される。米国特許出願６０／０２３，８６
７に記載されるように、非ウイルス性送達において、ポリペプチドをコードする
核酸配列は、高レベル発現のための従来の制御配列を含む従来のベクターへと挿
入され得、次いで細胞標的化リガンド（例えば、アシアロオロソムコイド、イン
スリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリン）に連結された、重
合性ＤＮＡ結合カチオン（例えば、ポリリジン、プロタミン、およびアルブミン
）のような合成遺伝子伝達分子とともにインキュベートされ得る。他の送達系は
、種々の組織特異的または普遍的作用性のプロモーターの制御下に遺伝子を含む
ＤＮＡをカプセル化するためのリポソームの使用を含む。さらに、使用に適切な
非ウイルス送達は、機械的送達系（例えば、Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎら（１９９４）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２４）：１１５８１−
１１５８５に記載されるアプローチを含む。さらに、コード配列およびそのよう
なものの発現産物は、光重合化ヒドロゲル物質の沈着を介して送達され得る。コ
ード配列の送達について使用され得る、遺伝子送達のための他の従来の方法は、
例えば、手動の遺伝子送達粒子銃（米国特許第５，１４９，６５５号に記載され
るような）；移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用（米国特許
第５，２０６，１５２号およびＷＯ９２／１１０３３に記載されるような）を含
む。
例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、米国特許第
５，４２２，１２０号および同４，７６２，９１５号；ＷＯ９５／１３７９６；
ＷＯ９４／２３６９７；およびＷＯ９１／１４４４５；ＥＰ−０５２４９６８；
およびＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３６−２４０頁（１９７５
）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｚｏｋａ（１９
８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ６００：１；Ｂａｙｅｒ（
１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ５５０：４６４；Ｒ
ｉｖｎａｙ（１９８７）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １４９：１１９；Ｗａｎｇ
（１９８７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：７８５１；Ｐｌａ
ｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １７６：４２０に記載されるもの
である。
ポリヌクレオチド組成物は、治療有効量（この用語は上記に定義されるとおり
である）の遺伝子治療ビヒクルを含み得る。本発明の目的のために、有効用量は
、投与される個体において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．
０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＤＮＡ構築物である。
（送達方法）
一旦処方されると、本発明のポリヌクレオチド組成物は、（１）被験体に直接
）；（２）エキソビボで被験体由来の細胞に送達されて；または（３）組換えタ
ンパク質の発現のためにインビトロで、投与され得る。処置される被験体は、哺
乳動物または鳥類であり得る。ヒト被験体もまた処置され得る。
この組成物の直接送達は、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内の注射によっ
て、または組織の間質空間への送達のいずれかによって一般的に達成される。こ
の組成物はまた、病巣へ投与され得る。他の投与様式は、経口投与または肺投与
、坐剤、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔ
ａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）、針、およ
び遺伝子銃またはハイポスプレーを含む。投薬治療は、単回用量スケジュールま
たは多数回用量スケジュールであり得る。
エキソビボ送達および被験体への形質転換細胞の再移植のための方法は、当該
分野で公知であり、そして例えばＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキ
ソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ
細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。
一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は
、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシ
ウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレ
ーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核
への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的組成物）
上記に記載の薬学的に受容可能なキャリアおよび塩に加えて、以下のさらなる
薬剤がポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物とともに使用
され得る。
（Ａ．ポリペプチド）
１つの例は、限定することなく以下を包含する：アシアロオロソムコイド（Ａ
ＳＯＲ）；トランスフェリン；アシアロ糖タンパク質；抗体；抗体フラグメント
；フェリチン；インターロイキン；インターフェロン；顆粒球マクロファージコ
ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マ
クロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子およびエリスロポエ
チン。ウイルス抗原（例えば、エンベロープタンパク質）もまた、使用され得る
。また、他の侵襲性生物由来のタンパク質（例えば、ＲＩＩとして知られるＰｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの環境スポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓ
ｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質由来の１７アミノ酸ペプチド）。
（Ｂ．ホルモン、ビタミンなど）
包含され得る他の群は、例えば、ホルモン、ステロイド、アンドロゲン、エス
トロゲン、甲状腺ホルモン、またはビタミン、葉酸である。
（Ｃ．ポリアルキレン、ポリサッカリドなど）
また、ポリアルキレングリコールが、所望のポリヌクレオチド／ポリペプチド
とともに含有され得る。好ましい実施態様において、ポリアルキレングリコール
は、ポリエチレングリコールである。さらに、モノサッカリド、ジサッカリド、
またはポリサッカリドが含有され得る。この局面の好ましい実施態様において、
このポリサッカリドは、デキストランまたはＤＥＡＥデキストランである。また
、キトサンおよびポリ（乳酸−コ−グリコリド）。
（Ｄ．脂質およびリポソーム）
所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドはまた、被験体またはそれに由来する
細胞への送達の前に、脂質中にカプセル化され得るか、またはリポソーム中にパ
ッケージングされ得る。
脂質カプセル化は、一般的に核酸に安定に結合し得るか、または核酸を捕捉も
しくは維持し得るリポソームを用いて達成される。縮合ポリヌクレオチドの脂質
調製物に対する比は、変動し得るが、一般的に約１：１（ｍｇＤＮＡ：マイクロ
モル脂質）であるか、またはより多くの脂質である。核酸の送達のためのキャリ
アとしてリポソーム使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ（１９
９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０９７：１−１７；Ｓｔ
ｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２−
５２７を参照のこと。
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に荷電した
）アニオン性（負に荷電した）および中性の調製物を包含する。カチオン性リポ
ソームは、機能的な形態で、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９８７）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１６）；
ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１；および精製した転写因子（Ｄｅｂｓ（１９
９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２）の細胞内送
達を媒介することが示されている。
カチオン性リポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジ
オレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭ
Ａ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹから
の商標リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）の下で入手可能である（Ｆｅｇ
ｎｅｒ前出もまた参照のこと）。他の市販されているリポソームは、トランスフ
ェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴ
ＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは
、当該分野で周知の技法を使用する容易に利用可能な物質から調製され得る。例
えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモ
ニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４１９４−４１９８；Ｗ
Ｏ９０／１１０９２を参照のこと。
同様に、アニオン性および中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌ
ａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から容易に入手可能である
か、または容易に入手可能な物質を使用してたやすく調製され得る。このような
物質には、とりわけ、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジル
エタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオ
イルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＯＰＥ）などが含まれる。これらの物質はまた、適切な比率
のＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの出発物質と混合され得る。これらの物質を使用
してリポソームを作製する方法は、当該分野で周知である。
このリポソームは、多重膜のベシクル（ＭＬＶ）、小さな単一膜ベシクル（Ｓ
ＵＶ）、または大きな単一膜のベシクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソー
ム−核酸複合体は当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。例えば、Ｓｔ
ｒａｕｂｉｎｇｅｒ（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：５１２−
５２７；Ｓｚｏｋａ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７５）
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ３９２：４８３；Ｗｉｌｓｏｎ（
１９７９）Ｃｅｌｌ １７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ（１９
７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４４３：６２９；Ｏｓｔｒ
ｏ（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７６
：８３６；Ｆｒａｌｅｙ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ（１９
７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１４５；Ｆｒａ
ｌｅｙ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１
；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ
−Ｒｉｄｄｅｒ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６を参照のこと。
（Ｅ．リポタンパク質）
さらに、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレオチド／ポリペプチドとと
もに含まれ得る。利用されるリポタンパク質の例は、キロミクロン、ＨＤＬ、Ｉ
ＤＬ、ＬＤＬ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の変異体、フラグメ
ント、または融合物もまた、使用され得る。また、天然に存在するリポタンパク
質の改変体（例えば、アセチル化されたＬＤＬ）が使用され得る。これらのリポ
タンパク質は、リポタンパク質レセプターを発現する細胞へ、ポリヌクレオチド
の送達を標的化し得る。好ましくは、リポタンパク質が、送達されるポリヌクレ
オチドとともに含まれる場合、他の標的化リガンドはその組成物中には含まれな
い。
天然に存在するリポタンパク質は、脂質部分およびタンパク質部分を含む。こ
のタンパク質部分は、アポタンパク質として知られる。現在では、アポタンパク
質Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥが単離および同定されている。少なくともこれらの
２つはいくつかのタンパク質を含み、ローマ数字、ＡＩ、ＡＩＩ、ＡＩＶ；ＣＩ
、ＣＩＩ、ＣＩＩＩによって命名されている。
１つのリポタンパク質は、１を超えるアポタンパク質を含み得る。例えば、天
然に存在するキロミクロンはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＥからなり、そして時間が経て
ばこれらのリポタンパク質はＡを欠失し、そしてＣおよびＥアポタンパク質を獲
得する。ＶＬＤＬは、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥアポタンパク質を含み、ＬＤＬはア
ポタンパク質Ｂを含み；そしてＨＤＬはアポタンパク質Ａ、Ｃ、およびＥを含む
。
これらのアポタンパク質のアミノ酸は公知であり、そして例えば、Ｂｒｅｓｌ
ｏｗ（１９８５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ５４：６９９；Ｌａｗ（
１９８６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１５１：１６２；Ｃｈｅｎ（１
９８６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１２９１８；Ｋａｎｅ（１９８０）
Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：２４６５；Ｕｔｅｒｍ
ａｎｎ（１９８４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６５：２３２に記載されている。
リポタンパク質は、トリグリセリド、コレステロール（遊離およびエステル）
、およびリン脂質を含む、種々の脂質を含む。この脂質の組成は、天然に存在す
るリポタンパク質において変化する。例えば、キロミクロンは主としてトリグリ
セリドを含む。天然に存在するリポタンパク質の脂質含有物のより詳細な記載は
、例えば、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８（１９８６）に見いだされ得る。
この脂質の組成は、レセプター結合活性についてアポタンパク質の立体構造にお
いて補助するために選択される。脂質組成はまた、ポリヌクレオチド結合分子と
の疎水性相互作用および会合を容易にするように選択され得る。
天然に存在するリポタンパク質は、例えば、血清から超遠心分離によって単離
され得る。そのような方法は、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（前出）；Ｐｉｔａ
ｓ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５３：５４５４−５４６０およびＭａｈ
ｅｙ（１９７９）Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ６４：７４３−７５０に記載さ
れる。リポタンパク質はまた、インビトロまたは所望の宿主細胞中のアポタンパ
ク質遺伝子の発現による組換え方法によって産生され得る。例えば、Ａｔｋｉｎ
ｓｏｎ（１９８６）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ １５：４０
３およびＲａｄｄｉｎｇ（１９５８）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔ
ａ ３０：４４３を参照のこと。リポタンパク質はまた、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｔｅｃｈｎｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃ
ｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡのような商業的な供給者から購入され得る。さらなるリ
ポタンパク質の記載は、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４４６
５に見い出され得る。
（Ｆ．ポリカチオン性薬剤）
ポリカチオン性薬剤は、送達される所望のポリヌクレオチド／ポリペプチドを
有する組成物中に、リポタンパク質を伴って、またはリポタンパク質を伴わずに
含まれ得る。
ポリカチオン性薬剤は、代表的には、生理的に適切なｐＨにおいて正味の正電
荷を示し、そして所望の位置への送達を容易にするための核酸の電荷を中和し得
る。これらの薬剤は、インビトロ、エキソビボ、およびインビボ適用のいずれも
を有する。ポリカチオン性薬剤は、生きている被験体に、筋肉内、皮下などのい
ずれかで核酸を送達するために使用され得る。
以下は、ポリカチオン性薬剤としての有用なポリペプチドの例である：ポリリ
ジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、およびプロタミン。他の例は、ヒスト
ン、プロタミン、ヒト血清アルブミン、ＤＮＡ結合タンパク質、非ヒストン染色
体タンパク質、ＤＮＡウイルス由来のコートタンパク質（例えば、Ｘ１７４）を
含む。転写因子もまた、ＤＮＡに結合するドメインを含み、従って核酸縮合薬剤
として有用であり得る。手短に言えば、転写因子（例えば、Ｃ／ＣＥＢＰ、ｃ−
ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＣＰＦ、Ｐｒｏｔ−１、
Ｓｐ−１、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−２、ＣＲＥＰ、およびＴＦＩＩＤ）は、ＤＮＡ
配列に結合する塩基性ドメインを含む。
有機ポリカチオン性薬剤は、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシン（
ｐｕｒｔｒｅｓｃｉｎｅ）を含む。
ポリカチオン性薬剤の大きさおよびその物理的特性は、上記の表から外挿され
て、他のポリカチオン性薬剤が構築され得るか、または合成ポリカチオン性薬剤
が産生され得る。
有用な合成ポリカチオン性薬剤は、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブ
レンを含む。ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴ
Ｍは、ポリヌクレオチド／ポリペプチドと組み合わせた場合にポリカチオン性複
合体を形成するモノマーである。
（核酸ハイブリダイゼーション）
「ハイブリダイゼーション」とは、水素結合による２つの核酸配列の互いの会
合をいう。代表的には、１つの配列は、固体支持体に固定され、そして他方は溶
液中で遊離している。次いで、２つの配列は水素結合に好ましい条件下で互いに
接触される。この結合に影響を与える因子は以下を含む：溶媒のタイプおよび容
量；反応温度；ハイブリダイゼーションの時間；撹拌；液体相の配列の固体支持
体への非特異的な付着をブロックする薬剤（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬またはＢ
ＬＯＴＴＯ）；配列の会合の速度を増大させる化合物（硫酸デキストランまたは
ポリエチレングリコール）の使用；およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件
のストリンジェンシー。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）第２巻、第９章、９．４７
〜９．５７頁。
「ストリンジェンシー」とは、異なる配列よりも非常に類似する配列の会合に
好ましいハイブリダイゼーション反応における条件をいう。例えば、研究中のハ
イブリッドの計算されたＴｍより約１２０〜２００℃低い温度および塩濃度の組
み合わせが選択されるべきである。温度および塩条件はしばしば、フィルターに
固定したゲノムＤＮＡのサンプルが目的の配列にハイブリダイズし、次いで異な
るストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備的な実験において経験的に決
定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、９．５０頁を参照のこと。
例えば、サザンブロットを行う場合、考慮する変数は、（１）ブロットされる
ＤＮＡの複雑さ、および（２）プローブおよび検出される配列の間の相同性であ
る。研究されるフラグメント全量は、プラスミドまたはファージ消化物について
は０．１〜１μｇ、高度に複雑な真核生物ゲノム中の単一コピーについては１０
−９〜１０−８ｇまで、１０倍変化し得る。より低い複雑さのポリヌクレオチド
については、実質的により短いブロッティング、ハイブリダイゼーション、およ
び曝露回数、より少量の出発ポリヌクレオチド、およびより低い非活性のプロー
ブが使用され得る。例えば、単一コピーの酵母遺伝子は、１μｇの酵母ＤＮＡで
開始し、２時間ブロットし、そして４〜８時間１０８ｃｐｍ／μｇを用いてハイ
ブリダイズして、わずか１時間の曝露時間を用いて検出され得る。単一コピーの
哺乳動物遺伝子について、保存性のアプローチは、１０μｇのＤＮＡで開始し、
一晩ブロットし、そして１０８ｃｐｍ／μｇより多いプローブを用いて１０％硫
酸デキストランの存在下で一晩ハイブリダイズし、約２４時間露光時間を生じる
。
いくつかの因子が、プローブと目的のフラグメントとの間のＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリッドの融解温度（Ｔｍ）、ならびに、結果として、ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄についての適切な条件に影響を与え得る。多くの場合において、そ
のプローブはフラグメントに対して１００％相同なわけではない。他の共通して
直面する変化には、長さ、ハイブリダイズする配列の全Ｇ＋Ｃ含量、ならびにイ
オン強度およびハイブリダイゼーション緩衝液のホルムアミド含量が含まれる。
これらのすべての因子の効果は、一つの式によって近似され得る：
Ｔｍ＝８１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４［（Ｇ＋Ｃ）％］−０．６
（ホルムアミド％）−６００／ｎ−１．５（ミスマッチ％）。
ここでＣｉは塩濃度（一価イオン）であり、およびｎは塩基対内のハイブリッド
の長さである（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１３８：２６７／２８４からわずかに改変した）。
ハイブリダイゼーション実験の設計において、核酸ハイブリダイゼーションに
影響を与えるいくつかの因子が簡便に変更され得る。ハイブリダイゼーションお
よび洗浄の温度ならびに洗浄時の塩濃度を調整するのが最も単純である。ハイブ
リダイゼーション温度（すなわち、ストリンジェンシー）が上昇するにつれて、
非相同的な鎖の間で起こるハイブリダイゼーションは起こりにくくなるようであ
り、結果として、バックグラウンドが減少する。放射標識したプローブが固定化
されたフラグメントと完全に相同ではない場合（遺伝子ファミリーおよび種間の
ハイブリダイゼーション実験における場合で頻繁であるように）、ハイブリダイ
ゼーション温度は低下されなければならず、そしてバックグラウンドが増大する
。洗浄の温度は、類似の様式で、ハイブリダイゼーションバンドの強度、および
バックグラウンドの程度に影響を与える。洗浄のストリンジェンシーはまた、塩
濃度の減少とともに増大する。
一般的に、５０％ホルミアミドの存在下で都合よいハイブリダイゼーション温
度は、標的フラグメントに９５％〜１００％相同であるプローブについて４２℃
、９０％〜９５％相同性では３７℃、８５％〜９０％相同性については３２℃で
ある。より低い相同性については、上記の式を用いて、適切にホルムアミド含量
が低くされ、そして温度が調整されるべきである。プローブと標的フラグメント
との間の相同性が未知である場合、最も単純なアプローチは、ともにストリンジ
ェントではないハイブリダイゼーション条件および洗浄条件で開始することであ
る。オートラジオグラフィー後に非特異的バンドまたは高いバックグラウンドが
観察される場合、フィルターは高ストリンジェンシーで洗浄され得、そして再び
露光され得る。露光のために必要な時間がこのアプローチを非実用的にする場合
、いくつかのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ストリンジェンシーが
並行して試験されるべきである。
（核酸プローブアッセイ）
本発明に従う核酸プローブを利用する、ＰＣＲ、分枝ＤＮＡプローブアッセイ
、またはブロッティング技術のような方法は、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在を
決定し得る。プローブは、検出されるに十分に安定な、二重鎖または二本鎖複合
体を形成し得る場合に、本発明の配列に「ハイブリダイズする」といわれる。
核酸プローブは、本発明のクラミジアの（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ）ヌクレオチ
ド配列（センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む）にハイブリダイズする。
多くの異なるヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードするが、ネイティブなク
ラミジアの配列は、細胞に存在する実際の配列であるので、好ましい。ｍＲＮＡ
は、コード配列を表し、従ってプローブはコード配列に相補的であるべきであり
、一本鎖ｃＤＮＡはｍＲＮＡに相補的であり、従ってｃＤＮＡプローブは非コー
ド配列に相補的であるべきである。
プローブ配列はクラミジアの配列（またはその相補物）に同一である必要はな
い。核酸プローブが標的ヌクレオチドと検出され得る二重鎖を形成し得る場合、
配列および長さの変動は、アッセイの感受性の増加をもたらし得る。また、核酸
プローブは、形成された二重鎖を安定化するためにさらなるヌクレオチドを含み
得る。さらなるクラミジアの配列もまた、形成された二重鎖を検出するための標
識としての一助となり得る。例えば、非相補的ヌクレオチド配列が、そのプロー
ブの５’末端に付着され得、ここでそのプローブ配列の残りはクラミジアの配列
に相補的である。あるいは、プローブ配列が、それとハイブリダイズし、そして
それによって検出され得る二重鎖を形成するためにクラミジアの配列との十分な
相補性を有する場合、非相補的塩基またはより長い配列は、プローブ中に分散さ
れ得る。
プローブの正確な長さおよび配列は、ハイブリダイゼーション条件（例えば、
温度、塩条件など）に依存する。例えば、診断的適用については、分析物の配列
の複雑さに依存して、核酸プローブは、代表的には、少なくとも１０〜２０ヌク
レオチド、好ましくは１５〜２５、そして最も好ましくは少なくとも３０ヌクレ
オチドを含むが、これよりも短くもあり得る。短いプライマーは、一般的には、
鋳型との安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。
プローブは、合成的手順（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法、
（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８１）１０３：３１８５））、またはＵ
ｒｄｅａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０
：７４６１）に従って、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して
、産生され得る。
プローブの化学的性質は、優先度に従って選択され得る。特定の適用について
は、ＤＮＡまたはＲＮＡが適切である。他の適用については、改変（例えば、ホ
スホロチオエートまたはメチルホスホネートのようなバックボーンの改変）が組
み込まれ得、インビボの半減期を増大させるために使用され得、ＲＮＡ親和性を
変化させ、ヌクレアーゼ耐性などを増大させるなどを行い（例えば、Ａｇｒａｗ
ａｌおよびＩｙｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
６：１２−１９；Ａｇｒａｗａｌ（１９９６）ＴＩＢＴＥＣＨ １４：３７６−
３８７）；ペプチド核酸のようなアナログもまた使用され得る（例えば、Ｃｏｒ
ｅｙ（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５ ２２４−２２９；Ｂｕｃｈａｒｄｔら（
１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：３８４−３８６を参照のこと）。
あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、少量の標的核酸を検出する別
の周知の手段である。そのアッセイは、Ｍｕｌｌｉｓら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．（１９８７）１５５：３３５−３５０）；米国特許第４，６８３，１９
５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。２つの「プライマー」
ヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、そして反応を開始するために使
用される。このプライマーは、増殖標的（またはその相補物）の配列にハイブリ
ダイズしない、二重鎖の安定性を補助するための、または、例えば、首尾よい制
限部位を組み込むための配列を含む。代表的には、このような配列は、所望のク
ラミジアの配列に隣接する。
熱安定性のポリメラーゼは、もともとの標的核酸を鋳型として使用して、プラ
イマーから標的核酸のコピーを作製する。標的核酸の閾値量がポリメラーゼによ
って産生された後、それらはより従来的な方法（例えば、サザンブロット）によ
って検出され得る。サザンブロット法を使用する場合、標識されたプローブは、
クラミジアの配列（またはその相補物）にハイブリダイズする。
また、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される
、従来的なブロッティング技術によって検出され得る。ｍＲＮＡ、またはｍＲＮ
Ａからポリメラーゼ酵素を使用して生成されたｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を使用
して精製および分離され得る。次いで、ゲル上のこの核酸は、ニトロセルロース
のような固体支持体にブロットされる。この固体支持体は、標識されたプローブ
に曝露され、次いですべてのハイブリダイズしていないプローブを洗浄して除去
する。次に、標識プローブを含む二重鎖を検出する。代表的には、そのプローブ
は、放射活性部分で標識される。
（実施例）
本実施例は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質がワクチン産生およびワク
チン開発または診断目的のための有用な抗原である見解を支持する証拠とともに
、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質を示す。本証拠は、以下の形態をとる。
・ＣＷＬ０２９株からの配列情報に基づくコンピューター予測（例えば、ｗｗ
ｗ．ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐから利用可能であるＰＳＯＲＴアルゴリ
ズムを用いる）。
・ＩＯＬ２０７株からクローン化されたタンパク質の組換え発現および精製に
基づくデータ。
・血清中の免疫反応性を実証するためのウエスタンブロット（代表的に、組換
えタンパク質に対するマウス抗血清を用いて染色した、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ ＦＢ／９６株のＥＢ抽出物のブロット）。
・免疫系に対する抗原の利用性を確認するためのＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細
菌または精製ＥＢのＦＡＣＳ分析（表ＩＩＩもまた参照のこと）。
・タンパク質が、ＦＢ／９６株由来の精製基本小体からのタンパク質の、２Ｄ
ゲル電気泳動マップからのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定されたか否かの指標
。これによって、タンパク質がインビボで発現されるか否かを確認する（表Ｖも
また参照のこと）。
種々の試験を使用して、本実施例において、同定したタンパク質のインビボ免
疫原性を評価し得る。例えば、このタンパク質を組換え発現させ、そして免疫ブ
ロットによって患者の血清をスクリーニングするために使用し得る。このタンパ
ク質と患者の血清との間のポジティブな反応は、この患者が問題のタンパク質に
対する免疫応答を以前に高めていたこと、すなわち、このタンパク質は、免疫原
であることを示す。本方法をまた使用して、免疫優性タンパク質を同定し得る。
組換えタンパク質もまた好都合に使用して、例えば、マウスにおいて抗体を調
製するために調製し得る。これらの抗体は、タンパク質が細胞表面上に位置する
ことの直接的な確認のために使用し得る。標識抗体（例えば、ＦＡＣＳのための
蛍光標識）を、インタクトな細菌とインキュベートし得、そして細菌表面上の標
識の存在によって、タンパク質の位置を確認する。
特に、以下の方法（Ａ）〜（Ｏ）を使用して、本発明のタンパク質を発現させ
、精製し、そして生化学的に特徴付けた。
（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のためのＣＰＮ ＯＲＦのクローニング）
Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃｐｎ）のＯＲＦを、３つの異
なる種類のタンパク質を潜在的に得るようにクローニングした：
ａ）Ｃ末端にヘキサ−ヒスチジンタグを有するタンパク質（ｃｐｎ−Ｈｉｓ）
ｂ）Ｎ末端にＧＳＴ融合パートナーを有するタンパク質（Ｇｓｔ−ｃｐｎ）
ｃ）Ｃ末端のヘキサ−ヒスチジンタグおよびＮ末端のＧＳＴの両方を有するタ
ンパク質（ＧＳＴ／Ｈｉｓ融合物；ＮＨ２−ＧＳＴ−ｃｐｎ−（Ｈｉｓ）６−Ｃ
ＯＯＨ）。
ａ）型タンパク質を、ｐＥＴ２１ｂ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にクローニングす
る際に得た。ｂ）型タンパク質およびｃ）型タンパク質を、改変ｐＧＥＸ−ＫＧ
ベクター［Ｇｕａｎ ＆ Ｄｉｘｏｎ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１９２．２６２］へのクローニングの際に得た。例えば、ｐＧＥＸ−ＫＧを改変
して、ｐＧＥＸ−ＮＮを得、次いで、ｐＧＥＸ−ＮＮを改変することによってｐ
ＧＥＸ−ＮＮＨを得た。Ｇｓｔ−ｃｐｎタンパク質およびＧｓｔ−ｃｐｎ―Ｈｉ
ｓタンパク質を、それぞれ、ｐＧＥＸ−ＮＮおよびｐＧＥＸ−ＮＮＨ中に得た。
１個のみの二重制限酵素での消化後に全ての３つのベクターにおいて単一増幅
産物をクローニングし、そして最終組換えタンパク質において外来アミノ酸の存
在を最小化することを目的として、ｐＧＥＸ−ＫＧベクターの改変バージョンを
作製した。
（（Ａ）ｐＧＥＸ−ＮＮ発現ベクターおよびｐＧＥＸ−ＮＮＨ発現ベクターの
構築）
２組の相補鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドを、ＤＮＡ合成機ＡＢＩ３９４
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ、Ｓｃ
ｏｔｌａｎｄ）からの試薬を用いて合成した。等モル量のオリゴ対（各オリゴ５
０ｎｇ）を、最終容量５０μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で１０分間アニーリングし、次いで、ゆっくりと
冷却するために室温に放置した。記載した手順を用いて、以下のＤＮＡリンカー
を得た。
Figure 2012147798
プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そし
て１００ｎｇを、２００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３：１のリンカー／プラスミドのモル比でリン
カーｇｅｘＮＮと１６℃で一晩連結させた。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５における連結
産物の形質転換後、ｐＧＥＸ−ＮＮプラスミド（正確なリンカーを有する）を含
むクローンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって選択した。
新規プラスミドｐＧＥＸ−ＮＮを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、
そしてｇｅｘＮＮＨと連結した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５における連結産物の形質
転換後、ｐＧＥＸ−ＮＮＨプラスミド（正確なリンカーを有する）を含むクロー
ンを、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定によって選択した。
（（Ｂ）染色体ＤＮＡ調製）
Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ １０Ｌ−２０７株の基本小体（ＥＢ）の染色体Ｄ
ＮＡを、１．５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．６％ ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅ Ｋ、ｐＨ８）を４５０μｌ ＥＢ懸濁液（４００．０００／μｌ
）に添加し、そして３７℃で一晩インキュベートすることによって調製した。フ
ェノール、フェノール−クロロホルム、およびクロロホルムを用いた連続抽出の
後、ＤＮＡを０．３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２容量の無水エタ
ノールを用いて沈澱させた。ＤＮＡペレットを、７０％ エタノールを用いて洗
浄した。蒸留水を用いた可溶化および２０μｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａを用いた
室温で１時間の処理後、ＤＮＡを再び、フェノール−クロロホルムで抽出し、ア
ルコール沈澱し、そして３００μｌ １ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
に懸濁した。ＤＮＡ濃度を、サンプルのＯＤ２６０を測定することによって評価
した。
（（Ｃ）オリゴヌクレオチド設計）
合成オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＣＷＬ０
２９株の配列を用いて各ＯＲＦのコード配列に基づいて設計した。推定リーダー
配列の直ぐ下流にある５’末端増幅プライマー配列を推定することによって、任
意の推定シグナルペプチドを排除した。ほとんどのＯＲＦに関して、プライマー
の５’テイル（表Ｉ）は、制限酵素認識部位を１つだけ含み（遺伝子自体の制限
パターンに依存して、ＮｄｅＩ、またはＮｈｅＩ、またはＳｐｅＩ）；３’プラ
イマーテイル（表Ｉ）は、ＸｈｏＩまたはＮｏｔＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限部
位を含んだ。
Figure 2012147798
制限酵素認識配列を含むことと同様に、プライマーは、増幅される配列にハイ
ブリダイズするヌクレオチドを含んだ。ハイブリダイズするヌクレオチドの数は
、記載されるように［（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら（１９８６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ
８３：３７４６−５０）］決定されたプライマーの融解温度に依存した。選択し
たオリゴの平均融解温度は、ハイブリダイゼーション領域単独については５０〜
５５℃であり、全オリゴについては６５〜７５℃であった。表ＩＩは、各増幅に
使用した順方向プライマーおよび逆方向プライマーを示す。
（（Ｄ）増幅）
標準的なＰＣＲプロトコールは、以下のようであった：１００μｌの最終容量
中、０．２μＭ 各プライマー、２００μＭ 各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液（Ｍｇ不含）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、および２ユニッ
トのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ、Ｇｉｂｃｏ−Ｂ
ＲＬ）の存在下、５０ｎｇ ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。各サ
ンプルに、二工程増幅を実施した：第１の５サイクルは、オリゴのうちの１つが
制限酵素テイルを排除するようなハイブリダイゼーション温度を用いて実行し、
続く２５サイクルは、プライマー全長のハイブリダイゼーション温度に従って実
行した。標準的なサイクルは、以下のようであった。
Figure 2012147798
伸長時間は、２０００ｂｐよりも短いＯＲＦについては１分間であり、２００
０ｂｐよりも長いＯＲＦについては２分４０秒間であった。増幅を、Ｇｅｎｅ
Ａｍｐ ＰＣＲシステム９６００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて実行し
た。
増幅結果の確認をするために、４μｌの各ＰＣＲ産物を、１〜１．５アガロー
スゲルに充填し、そして増幅フラグメントのサイズを、ＤＮＡ分子量標準と比較
した（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）。ＰＣＲ産物を、アガロ
ースゲルに充填し、そして電気泳動の後、正確なサイズのバンドを、ゲルから切
り出した。ＤＮＡを、製造業者らの指示書に従ってＧｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてアガロースゲルから精製した。ＤＮＡの最
終溶出容量は、５０μｌ ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８）であった。１μｌの各精製ＤＮＡを、アガロースゲルに充填し、収
量を評価した。
（（Ｅ）ＰＣＲフラグメントの消化）
１〜２μｇの精製ＰＣＲ産物を、最終容量１００μｌ中、適切な制限緩衝液を
用いて適切な制限酵素（各酵素６０ユニット）で、３７℃で一晩二重消化した。
制限酵素および消化緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製であ
った。消化ＤＮＡの精製（ＰＣＲ 精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）および３０μｌ
ＴＥを用いての溶出後、１μｌを、アガロースゲル電気泳動に供し、滴定した
分子量標準（ＤＮＡマーカーＩＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）と比較して収量を
評価した。
（（Ｆ）クローニングベクター（ｐＥＴ２１ｂ＋、ｐＧＥＸ−ＮＮ、およびｐ
ＧＥＸ−ＮＮＨ）の消化）
１０μｇのプラスミドを、適切な緩衝液の存在下、４００μｌの反応溶液中に
１００ユニットの各制限酵素を用いて、一晩３７℃でのインキュベーションによ
って二重消化した。１％アガロースゲルでの電気泳動後、消化したベクターに対
応するバンドを、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｅｘ ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ Ｋｉｔを用いてゲルから精製し、そしてＤＮＡを、５０μｌ ＴＥを用い
て溶出した。ＤＮＡ濃度を、サンプルのＯＤ２６０を測定することによって評価
した。
（（Ｇ）クローニング）
適切に消化し、そして精製した７５ｎｇのベクターおよび各ＯＲＦに対応する
消化し、そして精製したフラグメントを、１：１ フラグメント／ベクターのモ
ル比で１０〜２０μｌの最終容量中、製造業者らによって供給された緩衝液の存
在下で４００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）を用いて連結した。反応物を、１６℃で一晩インキュベートした。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５コンピテント細胞における形質転換を、以下のように実
施した：連結反応物を、２００μｌのコンピテントＤＨ５細胞と混合し、氷上で
３０分間インキュベートし、次いで、４２℃で９０秒間インキュベートした。氷
上で冷却した後、０．８ｍｌのＬＢを添加し、そして細胞を振とうさせながら３
７℃で４５分間インキュベートした。１００μｌおよび９００μｌの細胞懸濁液
を、別々の寒天ＬＢ １００μｇ／ｍｌ アンピシリンプレートに播き、そして
このプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。６ｍｌ ＬＢ １００μｇ
／ｍｌ アンピシリン中で無作為に選択したクローンを増殖させ、製造業者らの
指示書に従ってＱｉａｇｅｎ Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔを用いてＤＮＡを抽出し、そして制限クローニング部位に特異的な制限酵
素を用いて２μｌのプラスミドミニ調製物を消化することによって、形質転換体
のスクリーニングを実施した。消化したプラスミドミニ調製物のアガロースゲル
電気泳動後、ポジティブクローンを、適切な分子量マーカー（ＤＮＡマーカーＩ
ＩＩまたはＩＸ、Ｒｏｃｈｅ）との比較によって評価されるように、制限フラグ
メントの正確なサイズに基づいて選択した。
（（Ｈ）発現）
１μｌの各ｒｉｇｈｔプラスミドミニ調製物を、その組換えタンパク質の発現
に適したコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株２００μｌ中に形質転換した。すべてのｐ
ＥＴ２１ｂ＋組換えプラスミドをＢＬ２１ ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ）Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞中に形質転換し、一方、すべてのｐＧＥＸ−ＮＮ組換えプラスミドおよ
びすべてのｐＧＥＸ−ＮＮＨ組換えプラスミドを、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ）中に形質転換した。ＬＢ／Ａｍｐ寒天プレート上に形質転換混合物をプレー
ティングしそして３７℃で一晩インキュベートした後、単コロニーを、３ｍｌの
ＬＢ １００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種し、そして３７℃で一晩増殖させ
た。この一晩培養物７０μｌを、２ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ中に接種し、そしてｐＥ
ＴクローンのＯＤ６００が０．４〜０．８の値になるまでかまたはｐＧＥＸクロ
ーンのＯＤ６００が０．８〜１の値になるまで、３７℃で増殖させた。その後、
そのミニ培養物にＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄチオ−ガラクト−ピラノシド）
を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。１ｍＭ ＩＰＴＧを使用
してｐＥＴクローンを誘導し、一方、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを使用してｐＧＥＸ
クローンを誘導した。３７℃で３時間インキュベーションした後、最終ＯＤ６０
０をチェックし、そしてその培養物を氷上で冷却した。０．５ｍｌ培養物を遠心
分離した後、その細胞ペレットを、５０μｌのタンパク質ローディングサンプル
緩衝液（６０ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１
０％ｖ／ｖグリシン、０．１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー、１００ｍＭ Ｄ
ＴＴ）中に懸濁し、そして、１００℃で５分間インキュベートした。０．１ＯＤ
６００培養物に対応する量の煮沸サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー
ブルー染色によって分析して、誘導されたタンパク質のバンドの存在を確認した
。
（組換えタンパク質の精製）
単コロニーを、２５ｍｌ ＬＢ １００μｇ／ｍｌアンピシリン中に接種し、
そして３７℃で一晩増殖させた。この一晩培養物を、５００ｍｌ ＬＢ／Ａｍｐ
中に接種し、そして２５℃で振盪しながら、ｐＥＴクローンについてＯＤ６００
が０．４〜０．８の値になるまで、またはｐＧＥＸクローンについてＯＤ６００
が０．８〜１の値になるまで、増殖させた。その後、その培養物にＩＰＴＧを添
加することによってタンパク質発現を誘導した。ｐＥＴクローンは、１ｍＭ Ｉ
ＰＴＧを使用して誘導し、一方ｐＧＥＸクローンは、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを使
用して誘導した。２５℃で４時間インキュベーションした後、最終ＯＤ６００を
チェックし、そしてその培養物を氷上で冷却した。６０００ｒｐｍでの遠心分離
（ＪＡ１０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）の後、その細胞ペレットを、精製のため
に処理するか、または−２０℃で凍結した。
（（Ｉ）Ｅ．ｃｏｌｉからの可溶性Ｈｉｓタグ化タンパク質の精製手順）
１．そのペレットを、−２０℃から氷浴へと移し、そして１０ｍｌの５０ｍＭ
ＮａＨＰＯ４緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で再構成し、４０〜
５０ｍＬ遠心管中に移し、そして以下の概略により細胞を破壊する：
２．Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓにおいてそのペレットを破壊し、インライン（ｉ
ｎ−ｌｉｎｅ）洗浄しながら３回通過を行う。
３．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。可能ならば、ロー
ターＪＡ ２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−２０（１８０
００ｒｐｍ、１５分）を使用する。
４．１ｍｌ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹
脂を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラムを、５０ｍＭリン酸緩衝液、３００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化する。
５．遠心分離ペレットを−２０℃で貯蔵し、そしてその上清をカラムにローディ
ングする。
６．フロースルーを収集する。
７．カラムを、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）の５０ｍＭリン酸緩衝液、
３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄する。
８．１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール緩衝液、５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ
ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で再度洗浄する。
９．４．５ｍｌ（１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ）の２５０ｍＭイミダゾ
ール緩衝液、５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて
、カラムに結合したタンパク質を溶出させ、そして、対応する各々約１．５ｍｌ
の３つの画分を収集する。各管に、１５μｌのＤＴＴ ２００ｍＭ（最終濃度２
ｍＭ）を添加する。
１０．最初の２つの画分のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定
し、各サンプルから１０μｇタンパク質アリコートを収集し、そしてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分析する。（サンプルが希釈され過ぎた場合、２１μｌ＋７μｌロ
ーディング緩衝液をローディングすることに注意のこと）。
１１．収集した画分を＋４℃にて貯蔵し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ。
１２．免疫のために、０．５ｍｌ中で各々が４０％グリセロール中１００μｇの
アリコート４〜５個を調製する。希釈緩衝液は、上記の溶出緩衝液＋２ｍＭ Ｄ
ＴＴである。免疫するまで、そのアリコートを−２０℃で貯蔵する。
（（Ｊ）封入体からのＨｉｓタグ化タンパク質の精製）
以下のプロトコルに基本的には従って、精製を実行した：
１．遠心分離によって、５００ｍｌ培養物から細菌を収集する。必要な場合は、
細菌ペレットを−２０℃で貯蔵する。抽出のために、氷浴上で、１０ｍｌの５０
ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中に各細菌ペレットを再懸濁する
。
２．再懸濁した細菌を、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓで破壊し、２回通過を行う。
３．３５０００×ｇで１５分間遠心分離し、そしてペレットを収集する。Ｂｅｃ
ｋｍａｎローターＪＡ ２５．５０（２１０００ｒｐｍ、１５分）またはＪＡ−
２０（１８０００ｒｐｍ、１５分）を使用する。
４．５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシ
エチル）−ホスフィン塩酸塩、Ｐｉｅｒｃｅ）、６Ｍ塩化グアニジウム（ｐＨ８
．５）で遠心分離ペレットを溶解する。磁気棒を用いて約１０分間攪拌する。
５．上記のように遠心分離し、そして上清を収集する。
６．１ｍｌのＮｉｃｈｅｌ飽和Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）カラムを、製造業者の推奨に従って、十分な数調製する。５ｍｌのＨ２Ｏ
でそのカラムを２回洗浄し、そして５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＴＣ
ＥＰ、６Ｍ塩化グアニジウム（ｐＨ８．５）で平衡化する。
７．工程５からの上清を、このカラム上にローディングし、そして５ｍｌの５０
ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、１ｍＭ ＴＣＥＰ、６Ｍ尿素（ｐＨ８，５）で
洗浄する。
８．１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、６Ｍ尿素
、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．５）でカラムを洗浄する。可能なさらなるコント
ロールのために、最初の５ｍｌを収集して取っておく。
９．４．５ｍｌの緩衝液（２５０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣ
ｌ、６Ｍ尿素、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．５）を含む）で、カラムに結合した
タンパク質を溶出する。３つの１．５ｍｌアリコートにこの溶出緩衝液を添加し
、そして対応する３つの画分を収集する。各画分に、１５μｌ ＤＴＴ（最終濃
度２ｍＭ）を添加する。
１０．Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により溶出タンパク質濃度を測定し、そして約１０μ
ｇのタンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
１１．４０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、２Ｍ尿素
、０．５アルギニン、２ｍＭ ＤＴＴ、０．３ ＴＣＥＰ、８３．３ｍＭイミダ
ゾール（ｐＨ８．５）中に、−２０℃でタンパク質を貯蔵する。
（（Ｋ）Ｅ．ｃｏｌｉからのＧＳＴ−融合タンパク質の精製手順）
１．−２０℃から氷浴へと細菌ペレットを移し、そしてプロテアーゼインヒビタ
ー（ＣＯＭＰＬＥＴＥＴＭ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、２５ｍ
ｌ緩衝液ごとに１錠）の混合物を添加した７．５ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で
再懸濁する。４０〜５０ｍｌ遠心管へと移し、そして以下の手順に従って超音波
処理する：
ａ）プローブを、管の底から約０．５ｃｍの位置にする
ｂ）管をクランプでブロックする
ｃ）管を氷浴に浸す
ｄ）ソニケーターを以下のように設定する：Ｔｉｍｅｒ→Ｈｏｌｄ、Ｄｕｔｙ
Ｃｙｃｌｅ→５５、Ｏｕｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌ→６。
ｅ）時間経過１分で１０インパルスのサイクルを５回実施する（すなわち、１
サイクル＝１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｂ．１０インパルス＋約４５秒
ホールド；ｃ．１０インパルス＋約４５秒ホールド；ｄ．１０インパルス＋約４
５秒ホールド；ｅ．１０インパルス＋約４５秒ホールド。
２．約３０〜４００００×ｇで１５〜２０分間遠心分離する。例えば、ローター
Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ ２５．５０を２１０００ｒｐｍで１５分間使用する。
３．−２０℃にて遠心ペレットを貯蔵し、そして上清を、以下のようにしてクロ
マトグラフィーカラムにローディングする。
４．０．５ｍｌ（≡１ｍｌ懸濁物）のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂ樹脂）を含むＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムを、２ｍ
ｌ（１ｍｌ＋１ｍｌ）Ｈ２Ｏで洗浄し、その後、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４
ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化する。
５．上清をカラムにローディングし、そしてフロースルーを捨てる。
６．カラムを、１０ｍｌ（２ｍｌ＋２ｍｌ＋４ｍｌ）のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で
洗浄する。
７．４．５ｍｌの５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、１０ｍＭ還元グルタチオン（ｐＨ
８．０）を１．５ｍｌ＋１．５ｍｌ＋１．５ｍｌのように添加して、カラムに結
合したタンパク質を溶出させ、そして、対応する各々約１．５ｍｌの３つの画分
を収集する。
８．最初の２つの画分のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定し
、各サンプルからの１０μｇタンパク質アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分
析する。（サンプルが希釈され過ぎた場合、２１μｌ（＋７μｌローディング緩
衝液）をローディングすることに、注意すること）。
９．収集した画分を＋４℃にて貯蔵し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を待つ。
１０．免疫する予定の各タンパク質について、０．５ｍｌ中で各々が４０％グリ
セロール中１００μｇのアリコート４〜５個を調製する。希釈緩衝液は、５０ｍ
Ｍ ＴＲＩＳ・ＨＣＬ、２ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ８．０）である。免疫するまで、
そのアリコートを−２０℃で貯蔵する。
（血清学）
（（Ｌ）免疫のプロトコル）
１．４匹の６〜７週齢のＣＤ１雌性マウスのグループを、１００μｌ中に再懸濁
した組換えタンパク質２０μｇで免疫した。
２．各グループ４匹のマウスに、３回投与を１４日間間隔スケジュールで与えた
。
３．免疫は、タンパク質の腹腔内注射を介して行い、最初の投与については等量
の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）とともに、そしてその後の２回投与に
ついては不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）とともに行った。
４．各免疫の前に血清を収集した。３回目の免疫の１４日後にマウスを屠殺し、
そして収集した血清をプールして、−２０℃で貯蔵した。
（（Ｍ）マウス血清を用いる、Ｃｐｎ基本小体タンパク質のウェスタンブロッ
ト分析）
ＳＤＳローディング緩衝液（１×：６０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８
）、５％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、１０％ ｖ／ｖグリセリン、０．１％ Ｂｒｏｍｏ
ｐｈｅｎｏｌ Ｂｌｕｅ、１００ｍＭ ＤＴＴ）と混合し９５℃で５分間煮沸し
た約４μｇのタンパク質を含む、基本小体のアリコートを、１２％ ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル上にローディングした。このゲルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動緩衝液（
２５０ｍＭ ＴＲＩＳ，２．５ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅおよび０．１％ ＳＤＳを
含む）を使用して泳動した。このゲルを、ニトロセルロース膜上に２００ｍＡに
て３０分間エレクトロブロットした。この膜を、ＰＢＳ、３％スキムミルク粉末
を用いて３０分間ブロックし、そして適切な血清希釈物（１／１００）とともに
４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ
）で２回洗浄した後、１：３０００希釈したペルオキシダーゼ結合体化二次抗マ
ウス抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに、この膜を２時間インキュベートした。このニ
トロセルロースを、ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１０分間２回洗浄し
、そして１回ＰＢＳで洗浄し、その後、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ）により発色させた。
ウェスタンブロットにて示されるレーンは、（Ｐ）＝免疫前コントロール血清
；（Ｉ）＝免疫血清である。
（（Ｎ）マウス血清を用いる、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ基
本小体のＦＡＣＳ分析）
１．２×１０５個の基本小体（ＥＢ）／ウェルを、９６ウェルＵ底プレート中で
２００μｌのＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡで洗浄し、そして４℃にて１２０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離した。
２．その上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１０μｌのＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡ
中に再懸濁した。
３．ＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡ中に希釈した１０μｌマウス血清を、最終希釈１
：４００までＥ．Ｂ．懸濁物に添加し、そして氷上で３０分間インキュベートし
た。
４．１８０μ ＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡを添加することによってＥＢを洗浄し
、そして４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
５．上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１０μｌのＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡ中に
再懸濁した。
６．１０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的Ｒ−フ
ィコエリトリン結合体化）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、カタログ番号１１５−１１６−０７２）
を、最終希釈１：１００までこのＥＢ懸濁物に添加し、そして暗いところで３０
分間、氷上でインキュベートした。
７．１８０μ ＰＢＳ−０．１％ ＢＳＡを添加することによってＥＢを洗浄し
、そして４℃にて１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
８．５．上清を捨て、そしてＥ．Ｂ．を、１５０μｌのＰＢＳ−０．１％ ＢＳ
Ａ中に再懸濁した。
９．Ｅ．Ｂ．懸濁物を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎ
ｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ ＵＳＡ）のサイトメトリーチャン
バーに通し、１０．０００事象を得た。
１０．Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓ
ｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ ＵＳＡ）を使用し、Ｅ．Ｂ．シグナ
ルに対する形態学的ドットプロットを（前方散乱パラメーターおよび側方散乱パ
ラメーターを使用して）描くことによって、データを分析した。その後、蛍光対
数スケールのＦＬ２強度に対するヒストグラムプロットを作製し、ＥＢの形態学
的領域を想起した。
注意：ＦＡＣＳの結果は、ネイティブ抗原の接近性の程度に依存するだけでな
く、組換え抗原により惹起される抗体（これは、ネイティブのタンパク質構造と
比較して、変化する程度で正確にフォールディングする構造を有し得る）の質に
も依存する。従って、たとえＦＡＣＳアッセイがネガティブに見えても、このこ
とは、そのタンパク質が表面上で豊富でも接近可能でもないとは、必ずしも意味
しない。例えば、ＰｏｒＢ抗原は、ＦＡＣＳにおいてネガティブな結果を生じる
が、表面に露出された中和抗原である［ＫｕｂｏおよびＳｔｅｐｈｅｎｓ（２０
００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：７７２〜７８０］。
（（Ｏ）２次元電気泳動タンパク質マップの質量分析）
ＦＢ／９６株から段階的に精製したＥＢを、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ再水和緩衝
液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、２％（ｗ／ｖ）ＡＳ
Ｂ １４）［Ｃｈｅｖａｌｌｅｔら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．１９
：１９０１〜９］、２％（ｖ／ｖ）Ｃ．Ａ． ３−１０ＮＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、２ｍＭトリブチルホスフィン、６５
ｍＭ ＤＴＴ）を用いて、最終濃度５．５ｍｇ／ｍｌで可溶化した。サンプル（
２５０μｇタンパク質）を、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐｓ（７ｃ
ｍ、ｐＨ３〜１０、非直線）に一晩吸着させた。ＩＰＧｐｈｏｒ Ｉｓｏｅｌｅ
ｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて、等電集束法を実施した。ＰＡＧＥ分離の前に、集
束したストリップを、４Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール
、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５ｍＭトリブチルホスフィン、２．５％（ｗ／ｖ）ア
クリルアミド、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）中で、記載されるよ
うに、インキュベートした［Ｈｅｒｂｅｒｔら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ
ｏｒ．１９：８４５〜５１］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、９〜１６％の直線アクリル
アミド勾配上で実施した。ゲルを、コロイド状のクマシー（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ）を用いて染色した［Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９８）Ｅｌｅｃｔｒ
ｏｐｈｏｒ．１９：３５５〜６３］。染色したゲルを、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｄｅ
ｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用い
て、８ビットおよび５０μｍ／ピクセルにてスキャンした。マップイメージに、
ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ ２Ｄ Ｅｌｉｔｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ
３．１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて
注釈をつけた。タンパク質スポットを、Ｅｔｔａｎ Ｓｐｏｔ ｐｉｃｋｅｒ（
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してこのゲル
から切り出し、そして真空遠心分離機にて乾燥した。質量分析のためのサンプル
のゲル中消化およびペプチド抽出を、Ｗｉｌｍら［Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３
７９：４６６〜９］により記載されるように実施した。サンプルを、ＺＩＰ Ｔ
ＩＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩し、５０％アセトニトリル、０．１％
ＴＦＡ中のα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸飽和溶液を用いて抽出し、そ
してＳＣＯＵＴ ３８１マルチプローブプレート（Ｂｒｕｋｅｒ）上に直接ロー
ディングした。Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ上でス
ペクトルを得た。既知の標準ペプチドの組み合わせを使用して、スペクトルを較
正し、サンプルに近接したスポット中に位置付けた。得られた単一同位体ピーク
についての値を、コンピュータープログラムＭａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉ
ｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）を使用するデータベースサーチのために使用した。
すべてのサーチを、制約条件として誤差２００〜５００ｐｐｍを使用して実施し
た。代表的ゲルを、図１９０にて示す。
（実施例１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５５２）を発
現させた（配列番号１；ｃｐ６５５２）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６５５２ヌクレオチド配列（配列番号２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．１２７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１Ａに示される
ようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した
。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエ
スタンブロット（図１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１Ｃ）のために使用
した。
このｃｐ６５５２タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（
Ｃｐｎ０２７８）。
これらの実験により、ｃｐ６５５２は、表面露出した免疫アクセス可能な（ｉ
ｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原であ
ることが示される。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３６）を発
現させた（配列番号３；ｃｐ６７３６）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６７３６ヌクレオチド配列（配列番号４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９１７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図２Ａに示される
ようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した
。両方のタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタ
ンブロット（図２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２Ｃ）のために使用した
。
このｃｐ６７３６タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（
Ｃｐｎ０４５３）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６７３６は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７５１）を発
現させた（配列番号５；ｃｐ６７５１）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６７５１ヌクレオチド配列（配列番号６）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９２３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図３Ａに示される
ようにＧＳＴ融合物として精製し、そしてまたｈｉｓタグ化形態で精製した。Ｇ
ＳＴ融合組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウ
エスタンブロット（図３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３Ｃ）のために使
用した。
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６７５１は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７５２）を発
現させた（配列番号７；ｃｐ６７５２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７５２ヌクレオチド配列（配列番号８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．１３８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図４Ａに示される
ようにｈｉｓタグ産物として精製し、そしてまたＧＳＴ融合物としても精製した
。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を
ウエスタンブロット（４Ｂ）において使用し、そしてｈｉｓタグ化タンパク質を
ＦＡＣＳ分析（４Ｃ）のために使用した。
このｃｐ６７５２タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された
（Ｃｐｎ０４６７）。
これらの実験により、ｃｐ６７５２は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８５０）を発
現させた（配列番号９；ｃｐ６８５０）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６８５０ヌクレオチド配列（配列番号１０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．３２９）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図５Ａに示される
ようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウ
スを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図５Ｂ）においておよび
ＦＡＣＳ分析（図５Ｂ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現
させた。
これらの実験により、ｃｐ６８５０は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６９００）を発
現させた（配列番号１１；ｃｐ６９００）：
Figure 2012147798
ｃｐ６９００ヌクレオチド配列（配列番号１２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．４５２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図６Ａに示される
ようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウス
を免疫し、このマウスの血清をＦＡＣＳ分析（図６Ｂ）のために使用した。ｈｉ
ｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
このｃｐ６９００タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された
（Ｃｐｎ０６０４）。
これらの実験により、ｃｐ６９００は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７０３３）を発
現させた（配列番号１３；ｃｐ７０３３）：
Figure 2012147798
ｃｐ７０３３ヌクレオチド配列（配列番号１４）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．２７２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図７Ａに示される
ようにＧＳＴ融合物として精製した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた
。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清を
ＦＡＣＳ分析（図７Ｂ）、およびウエスタンブロット（図７Ｃ）のために使用し
た。
このｃｐ７０３３タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（
Ｃｐｎ０７２８）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ７０３３は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ６１７２３２１）を発
現させた（配列番号１５；ｃｐ００１７）：
Figure 2012147798
ｃｐ００１７ヌクレオチド配列（配列番号１６）は、以下である：
Figure 2012147798
この配列は、ｃｐ００１６に関してフレームシフトしている。
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．０７５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図８Ａに示される
ようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウス
を免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図８Ｂ）においておよびＦ
ＡＣＳ分析（図８Ｃ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現さ
せた。
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ００１７は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ６１７２３１５）を発
現させた（配列番号１７；ｃｐ００１４）：
Figure 2012147798
ｃｐ００１７ヌクレオチド配列（配列番号１８）は、以下である：
Figure 2012147798
このタンパク質は、ｃｐ００１５に関してフレームシフトしている。
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜の位置を推定する（０．０４７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図９Ａに示される
ようにｈｉｓタグ産物として精製した。ＧＳＴ融合物もまた発現させた。この組
換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をイムノアッセ
イ（図９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図９Ｃ）のために使用した。
このタンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験は、ｃｐ００１４が有用な免疫原であることを示唆する。これら
の特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ６１７２３１７）を発
現させた（配列番号１９；ｃｐ００１５）：
Figure 2012147798
この配列は、ｃｐ００１４に関してフレームシフトしている。
ｃｐ００１５ヌクレオチド配列（配列番号２０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．２７４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１０Ａに示され
るようにＧＳＴ融合物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウ
スを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１０Ｂ）においておよ
びＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた。
これらの実験により、ｃｐ００１５は、有用な免疫原であることが示される。
これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ６１７２３２５）を発
現させた（配列番号２１；ｃｐ００１９）：
Figure 2012147798
この配列は、ｃｐ００１８に関してフレームシフトしている。
ｃｐ００１９ヌクレオチド配列（配列番号２２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．１８９）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１１Ａに示され
るようにＧＳＴ融合物として精製した。このタンパク質を使用して、マウスを免
疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１１Ｂ）および免疫ブロット
アッセイ（図１１Ｃ）において使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現さ
せた。
これらの実験により、ｃｐ００１９は、有用な免疫原であることが示される。
これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４６６）を発
現させた（配列番号２３；ｃｐ６４６６）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６４６６ヌクレオチド配列（配列番号２４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、このタンパク質が外膜リポタンパク質であること
を推定する（０．７９０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そしてＧＳＴ融合産物お
よびｈｉｓタグ融合産物の両方として精製した。このタンパク質のＧＳＴ融合産
物としての精製は、図１２Ａに示される。これらの組換えタンパク質を使用して
、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１２Ｂおよび１
２Ｃ）において使用した。ＦＡＣＳ分析もまた行った。
これらの実験により、ｃｐ６４６６は有用な免疫原であることが示される。こ
れらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４６８）を発
現させた（配列番号２５；ｃｐ６４６８）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６４６８ヌクレオチド配列（配列番号２６）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、このタンパク質が外膜リポタンパク質であること
を推定する（０．７９０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１３Ａに示され
るようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１３Ｂ）においてお
よびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた
。
これらの実験により、ｃｐ６４６８は、有用な免疫原であることが示される。
これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４６９）を発
現させた（配列番号２７；ｃｐ６４６９）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６４６９ヌクレオチド配列（配列番号２８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、ヘリプラズムの位置を推定する（０．９３４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１４Ａに示され
るようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１４Ｂ）においてお
よびＦＡＣＳ分析のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパク質もまた発現させた
。
これらの実験により、ｃｐ６４６９は、有用な免疫原であることが示される。
これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６０２）を発
現させた（配列番号２９；ｃｐ６６０２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６０２ヌクレオチド配列（配列番号３０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質の位置を推定する（０．０８０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１５Ａに示され
るようにｈｉｓタグ産物およびＧＳＴ融合産物の両方として精製した。組換えタ
ンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット
（図１５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図１５Ｃ）のために使用した。
このｃｐ６６０２タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された
（Ｃｐｎ０３２４）。
これらの実験により、ｃｐ６６０２は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例１６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７２７）を発
現させた（配列番号３１；ｃｐ６７２７）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６７２７ヌクレオチド配列（配列番号３２）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９１５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１６Ａに示され
るようにｈｉｓタグ産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウエスタンブロット（図１６Ｂ）においてお
よびＦＡＣＳ分析（図１６Ｃ）のために使用した。ＧＳＴ融合タンパク質もまた
発現させた。
このｃｐ６７２７タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定された
（Ｃｐｎ０４４４）。
これらの実験により、ｃｐ６７２７は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例１７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３１）を発
現させた（配列番号３３；ｃｐ６７３１）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６７３１ヌクレオチド配列（配列番号３４）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９２６）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１７Ａに示され
るようにｈｉｓタグ産物として精製した。ＧＳＴ融合タンパク質もまた発現させ
た。これらの組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清
をウエスタンブロット（図１７Ｂ；ｈｉｓタグ）においておよびＦＡＣＳ分析（
図１７Ｃ；ｈｉｓタグおよびＧＳＴ融合物）のために使用した。
このＧＳＴ融合タンパク質はまた、ヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を
含む）との良好な交差反応性を示した。ｈｉｓ融合物を用いた場合に、交差反応
性はほとんど観察されなかった。
これらの実験により、ｃｐ６７３１は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例１８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３７）を発
現させた（配列番号３５；ｃｐ６７３７）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ６７３７ヌクレオチド配列（配列番号３６）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．９４０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、そして図１８Ａに示され
るようにＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用して、マ
ウスを免疫し、このマウスの血清をイムノブロット分析ブロット（図１８Ｂ）に
おいておよびＦＡＣＳ分析（図１８Ｃ）のために使用した。ｈｉｓタグ化タンパ
ク質もまた発現させた。
このｃｐ６７３７タンパク質はまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定され（
Ｃｐｎ０４５４）、そしてヒト血清（肺炎を有する患者由来の血清を含む）との
良好な交差反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６７３７は、表面露出した免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特性は、配
列のみからは明らかではない。
（実施例１９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７０９０）を発
現させた（配列番号３７；ｃｐ７０９０）：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調されている。
ｃｐ７０９０ヌクレオチド配列（配列番号３８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜の位置を推定する（０．７９０）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図１９Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。ヒスチジン標識タンパク質をまた、発現し
た。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタン
ブロット（図１９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７０９０が有用な免疫原であることを示す。これらの特
性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７０９１）を発現
した＜配列番号３９；ｃｐ７０９１＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７０９１ヌクレオチド配列＜配列番号４０＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１０９）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２０Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した
。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブ
ロット（図２０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７０９１が有用な免疫原であることを示す。これらの特
性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２６０）を発現
した＜配列番号４１；ｃｐ６２６０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６２６０ヌクレオチド配列＜配列番号４２＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２１）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物およ
びＧＳＴ融合産物として両方を精製した。このＧＳＴ融合物を図２１Ａに示す。
この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロ
ット（図２１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２１Ｃ）のために使用した。
これらの実験はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な
交差反応を示した。
このタンパク質はまた、ｃｐ６２６０が、表面に露出しており、そして免疫的
にアクセス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示
す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６４５６）を発現
した＜配列番号４３；ｃｐ６４５６＞：
Figure 2012147798
このｃｐ６４５６ヌクレオチド配列＜配列番号４４＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１２７）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２２Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを
免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ
分析（図２２Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した
。
これらの実験は、ｃｐ６４５６が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７２９）を発現
した＜配列番号４５；ｃｐ６７２９＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６７２９ヌクレオチド配列＜配列番号４６＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２７）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２３Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを
免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図２３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ
分析（図２３Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した
。
このｃｐ６７２９タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０４４６）
において同定し、そして肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な
交差反応を示した。
これらの実験は、ｃｐ６７２９が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８４９）を発現
した＜配列番号４７；ｃｐ６８４９＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６８４９ヌクレオチド配列＜配列番号４８＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔位置を推測する（０．９３）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２４Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。また、ヒスチジン標識タンパク質としても
精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエ
スタンブロット（図２４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２４Ｃ）のために
使用した。
このｃｐ６８４９タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０５５７）
において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６８４９が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２７３）を発現
した＜配列番号４９；ｃｐ６２７３＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６２７３ヌクレオチド配列＜配列番号５０＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．９２２）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２５Ａに示されるよう
に、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換
えＧＳＴ融合物を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（
図２５Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２５Ｃ）のために使用した。
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好
な交差反応を示した。
これらの実験は、ｃｐ６２７３が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７３５）を発現
した＜配列番号５１；ｃｐ６７３５＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６７３５ヌクレオチド配列＜配列番号５２＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２２）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２６Ａに示されるよう
に、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換
えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブ
ロット（図２６Ｂ）において使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７３５が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７８４）を発現
した＜配列番号５３；ｃｐ６７８４＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６７８４ヌクレオチド配列＜配列番号５４＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．８９４）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２７Ａに示されるよう
に、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換
えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図
２７Ｂ）において使用した。このＧＳＴ融合産物を、ＦＡＣＳ分析（図２７Ｃ）
のために使用した。
このｃｐ６７８４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０４９８）
において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６７８４が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９６０）を発現
した＜配列番号５５；ｃｐ６９６０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６９６０ヌクレオチド配列＜配列番号５６＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質周辺腔位置を推測する（０．９３０）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２８Ａに示されるよう
に、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換
えタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図
２８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２８Ｃ）のために使用した。
このｃｐ６９６０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６９６０が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例２９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９６８）を発現
した＜配列番号５７；ｃｐ６９６８＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６９６８ヌクレオチド配列＜配列番号５８＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．７９０）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図２９Ａに示されるよう
に、ヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換
えＧＳＴ融合物を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（
図２９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図２９Ｃ）のために使用した。
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好
な交差反応を示した。
これらの実験は、ｃｐ６９６８が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６９９８）を発現
した＜配列番号５９；ｃｐ６９９８＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６９９８ヌクレオチド配列＜配列番号６０＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．７０７）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ融合産物（図３０
Ａ）としておよびヒスチジン標識産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合タ
ンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３０
Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３０Ｃ）のために使用した。
このｃｐ６９９８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０６９５）
において同定し、そして肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な
交差反応を示した。
これらの実験は、ｃｐ６９９８が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０２）を発現
した＜配列番号６１；ｃｐ７１０２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７１０２ヌクレオチド配列＜配列番号６２＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．３３８）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合産物を、図３
１Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この
血清を、ウエスタンブロットにおいておよびＦＡＣＳ分析（図３１Ｂ）のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１０２が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０６）を発現
した＜配列番号６３；ｃｐ７１０６＞：
Figure 2012147798
このｃｐ７１０６ヌクレオチド配列＜配列番号６４＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質位置を推測する（０．２２４）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合産物を、図３
２Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この
血清を、ウエスタンブロット（図３２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３２
Ｃ）のために使用した。
このタンパク質はまた、肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好
な交差反応を示した。
これらの実験は、ｃｐ７１０６が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２２８）を発現
した＜配列番号６５；ｃｐ７２２８＞：
Figure 2012147798
このｃｐ７２２８ヌクレオチド配列＜配列番号６６＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．０４０）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図３３Ａに示されるよう
にヒスチジン標識産物としておよびＧＳＴ融合産物として精製した（ヒスチジン
標識＝左側の矢印、ＧＳＴ＝右側の矢印）。このタンパク質を使用してマウスを
免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図３３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ
分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７２２８が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１７０）を発現
した＜配列番号６７；ｃｐ７１７０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７１７０ヌクレオチド配列＜配列番号６８＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細菌の外膜位置を推測する（０．９３６）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製したＧＳＴ融合タンパク質を
、図３４Ａに示す。このＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この
血清を、ウエスタンブロット（図３４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図３４
Ｃ）のために使用した。
このｃｐ７１７０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験（Ｃｐｎ０８５４）
において同定した。
これらの実験は、ｃｐ７１７０が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７０７２）を発現
した＜配列番号６９；ｃｐ７０７２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７０７２ヌクレオチド配列＜配列番号７０＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．６８８）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物（図
３５Ａ）としておよびＧＳＴ融合産物（図３５Ｂ）として精製した。この組換え
ヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタン
ブロット（図３５Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、このｃｐ７０７２タンパク質が有用な免疫原であることを示
す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８７９）を発現
した＜配列番号７１；ｃｐ６８７９＞：
Figure 2012147798
このｃｐ６８７９ヌクレオチド配列＜配列番号７２＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．６４６）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製されたＧＳＴ融合産物を図３
６Ａに示す。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この
血清を、ウエスタンブロット（図３６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、このｃｐ６８７９タンパク質が有用な免疫原であることを示
す。これらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７６７）を発現
した＜配列番号７３；ｃｐ６７６７＞：
Figure 2012147798
このｃｐ６７６７ヌクレオチド配列＜配列番号７４＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．０８３）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この精製されたヒスチジン標識産物を
図３７Ａに示す。この組換えヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫
し、この血清を、ウエスタンブロット（図３７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析
（図３７Ｃ）のために使用した。このＧＳＴ融合物をまた、ウエスタンブロット
（図３７Ｄ）において使用した。
このｃｐ６７６７タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し、そ
して肺炎を患った患者由来の血清を含む、ヒト血清と良好な交差反応を示した。
これらの実験は、このｃｐ６７６７が有用な免疫原であることを示す。これら
の特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７１７）を発現
した＜配列番号７５；ｃｐ６７１７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６７１７ヌクレオチド配列＜配列番号７６＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、周辺質位置を推測する（０．９３９）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ融合産物（図３８
Ａ）として、ヒスチジン標識産物としてそしてＧＳＴ／ヒスチジン融合産物とし
て精製した。このタンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタ
ンブロット（図３８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、このｃｐ６７１７が有用な免疫原であることを示す。これら
の特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例３９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６５７７）を発現
した＜配列番号７７；ｃｐ６５７７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６５７７ヌクレオチド配列＜配列番号７８＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔位置を推測する（０．９３２）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物（図
３９Ａ）としておよびＧＳＴ融合産物（図３９Ｂ）として精製した。この組換え
ＧＳＴ融合タンパク質を使用してマウスを免疫し、この血清を、ウエスタンブロ
ット（図３９Ｃ）においておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
このｃｐ６５７７タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６５７７が、有用な免疫原であることを示す。これらの
特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例４０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６４４６）を発現
した＜配列番号７９；ｃｐ６４４６＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ６４４６ヌクレオチド配列＜配列番号８０＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１７７）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてヒスチジン標識産物とし
ておよびＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質を、
図４０Ａに示す。この組換えヒスチジン標識タンパク質を使用してマウスを免疫
し、この血清を、ウエスタンブロット（図４０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析
のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４４６が、有用な免疫原であることを示す。これらの
特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例４１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０８）を発現
した＜配列番号８１；ｃｐ７１０８＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７１０８ヌクレオチド配列＜配列番号８２＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、外膜位置を推測する（０．９２１）。
タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして図４１Ａに示されるよう
に、ＧＳＴ融合産物として精製した。この組換えタンパク質を使用してマウスを
免疫し、この血清を、ウエスタンブロット（図４１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ
分析（図４１Ｃ）のために使用した。ヒスチジン標識タンパク質をまた発現した
。
このｃｐ７１０８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ７１０８が、表面に露出しており、そして免疫的にアク
セス可能なタンパク質であり、そしてこれは有用な免疫原であることを示す。こ
れらの特性は、配列単独からは明らかではない。
（実施例４２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２８７）を発現
した＜配列番号８３；ｃｐ７２８７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを強調する。
このｃｐ７２８７ヌクレオチド配列＜配列番号８４＞は、以下の通りである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜位置を推測する（０．１０６）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４２Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４２
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
ｃｐ７２８７タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験で同定し、肺炎を有する
患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ７２８７は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０５）を発現
させた＜配列番号８５；ｃｐ７１０５＞：
Figure 2012147798
ｃｐ７１０５ヌクレオチド配列＜配列番号８６＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１００）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４３Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４３
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な
交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ７０１５は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８０２）を発現
させた＜配列番号８７；ｃｐ６８０２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６８０２ヌクレオチド配列＜配列番号８８＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．０６０）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４４Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４４
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
これらの実験により、ｃｐ６８０２は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６３９０）を発現
させた＜配列番号８９；ｃｐ６３９０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６３９０ヌクレオチド配列＜配列番号９０＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９３２
）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４５Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４５
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な
交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６３９０は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２７２）を発現
させた＜配列番号９１；ｃｐ９２７２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６２７２ヌクレオチド配列＜配列番号９２＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．４８）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４６Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４６
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な
交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６２７２は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１１１）を発現
させた＜配列番号９３；ｃｐ７１１１＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ７１１１ヌクレオチド配列＜配列番号９４＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１００）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４７Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４７
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このｃｐ７１１１タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し、肺炎を
有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ７１１１は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４４５５８８６）を発現
させた＜配列番号９５；ｃｐ００１０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ００１０ヌクレオチド配列＜配列番号９６＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２２）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４８Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４８
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このｃｐ００１０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し、肺炎を
有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ００１０は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例４９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６２９６）を発現
させた＜配列番号９７；ｃｐ６２９６＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６２９６ヌクレオチド配列＜配列番号９８＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、細胞質位置が推定される（０．５２３）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図４９Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図４９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図４９
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
これらの実験により、ｃｐ６２９６は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６６６４）を発現
させた＜配列番号９９；ｃｐ６６６４＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６６６４ヌクレオチド配列＜配列番号１００＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．２６８）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物（図５０Ａ
）として、ｈｉｓタグ化したタンパク質として、そしてＧＳＴ／ＨＩＳ融合物と
して精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、このマウスの血清を
ウェスタンブロット（図５０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５０Ｃ）に用いた。ｈ
ｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
ｃｐ６６６４タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定し（Ｃｐｎ０３
８５）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を示し
た。
これらの実験により、ｃｐ６６６４は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６６９６）を発現
させた＜配列番号１０１；ｃｐ６６９６＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６６９６ヌクレオチド配列＜配列番号１０２＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．４６３）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５１Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図５１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５１
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な
交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ６６９６は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７９０）を発現
させた＜配列番号１０３；ｃｐ６７９０＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６７９０ヌクレオチド配列＜配列番号１０４＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１５１）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図
５２Ａ）、およびｈｉｓタグ化した産物として精製した。組換えタンパク質を用
いてマウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５２Ｂ）およ
びＦＡＣＳ分析（図５２Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発
現させた。
ｃｐ６７９０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥにおいて同定した（Ｃｐｎ０
５０３）。
これらの実験により、ｃｐ６７９０は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８７８）を発現
させた＜配列番号１０５；ｃｐ６８７８＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６８７８ヌクレオチド配列＜配列番号１０６＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．２０４）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ化産物として（
図５３Ａ）、そしてＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いて
マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５３Ｂ）およびＦ
ＡＣＳ分析に用いた。
これらの実験により、ｃｐ６８７８は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７２２４）を発現
させた＜配列番号１０７；ｃｐ７２２４＞：
Figure 2012147798
ｃｐ７２２４ヌクレオチド配列＜配列番号１０８＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．１６４）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５４Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図５４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５４
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
このタンパク質もまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な
交叉反応性を示した。
これらの実験により、ｃｐ７２２４は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１４０）を発現
させた＜配列番号１０９；ｃｐ７１４０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ７１４０ヌクレオチド配列＜配列番号１１０＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．６５０）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５５Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図５５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５５
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
これらの実験により、ｃｐ７１４０は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７３０６）を発現
させた＜配列番号１１１；ｃｐ７３０６＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ７３０６ヌクレオチド配列＜配列番号１１２＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９２３
）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ産物として（図
５６Ａ）およびＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウ
スを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５６Ｂ）およびＦＡＣ
Ｓ分析（図５６Ｃ）に用いた。
ｃｐ７３０６タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し（Ｃｐｎ
０９７９）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を
示した。
これらの実験により、ｃｐ７３０６は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１３２）を発現
させた＜配列番号１１３；ｃｐ７１３２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ７１３２ヌクレオチド配列＜配列番号１１４＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、ペリプラズム位置が推定される（０．９１５
）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ｈｉｓタグ化産物として（
図５７Ａ）またはＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５７Ｂ）およびＦＡ
ＣＳ分析（図５７Ｃ）に用いた。
これらの実験により、ｃｐ７１３２は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６７３３）を発現
させた＜配列番号１１５；ｃｐ６７３３＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６７３３ヌクレオチド配列＜配列番号１１６＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２４）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図５８Ａに示されるように
ｈｉｓタグ産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図５８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図５８
Ｃ）に用いた。ＧＳＴ融合タンパク質もまた、発現させた。
ｃｐ６７３３タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐ
ｎ０４５１）。
これらの実験により、ｃｐ６７３３は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例５９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８１４）を発現
させた＜配列番号１１７；ｃｐ６８１４＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６８１４ヌクレオチド配列＜配列番号１１８＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．０７０）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図
５９Ａ）またはｈｉｓタグ化産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図５９Ｂ）およびＦＡ
ＣＳ分析（図５９Ｃ）に用いた。
これらの実験により、ｃｐ６８１４は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例６０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８３０）を発現
させた＜配列番号１１９；ｃｐ６８３０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドは、強調されている。
ｃｐ６８３０ヌクレオチド配列＜配列番号１２０＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、外部膜位置が推定される（０．９２６）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図
６０Ａ）またはｈｉｓタグ化産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマ
ウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図６０Ｂ）およびＦＡ
ＣＳ分析（図６０Ｃ）に用いた。
ｃｐ６８３０タンパク質もまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定し（Ｃｐｎ
０５４０）、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清と良好な交叉反応性を
示した。
これらの実験により、ｃｐ６８３０は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例６１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７６８５４）を発現
させた＜配列番号１２１；ｃｐ６８５４＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６８５４ヌクレオチド配列＜配列番号１２２＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、内部膜位置が推定される（０．４６１）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、図６１Ａに示されるように
ＧＳＴ融合産物として精製した。組換えタンパク質を用いてマウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図６１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図６１
Ｃ）に用いた。ｈｉｓタグ化したタンパク質もまた、発現させた。
これらの実験により、ｃｐ６８５４は表面が露出しており、免疫的に利用しや
すいタンパク質であり、そして有用な免疫原であることが示される。これらの特
性は、配列のみからは明らかでない。
（実施例６２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ４３７７１０１）を発現
させた＜配列番号１２３；ｃｐ７１０１＞：
Figure 2012147798
ｃｐ７１０１ヌクレオチド配列＜配列番号１２４＞は、以下のとおりである：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムにより、細胞質位置が推定される（０．２０６）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図６
２Ａ）またはｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、マウ
スを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６２Ｂ）およびＦＡＣＳ（図６
２Ｃ）分析において使用した。
このタンパク質はまた、肺炎を有する患者由来の血清を含むヒト血清との良好
な交差反応性を示した。
これらの実験は、ｃｐ７１０１が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能な（
ｉｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原で
あることを示す。これらの特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例６３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１０７）を、
発現させた＜配列番号１２５；ｃｐ７１０７＞：
Figure 2012147798
ｃｐ７１０７ヌクレオチド配列＜配列番号１２６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜位置を予測する（０．１００）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図６
３Ａ）またはｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、マウ
スを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６３Ｂ）およびＦＡＣＳ（図６
３Ｃ）分析において使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１０７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４６７）を、
発現させた＜配列番号１２７；ｃｐ６４６７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６４６７ヌクレオチド配列＜配列番号１２８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜のリポタンパク質を予測する（０．７９０）
。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物および
ＧＳＴ融合タンパク質として、図６４Ａに示すように精製した。この組換えｈｉ
ｓタグタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット
（図６４Ｂ）において使用した。この組換えＧＳＴ融合タンパク質をまた使用し
て、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６４Ｃ）においておよ
びＦＡＣＳ分析（図６４Ｄ）のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４６７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６７９）を、
発現させた＜配列番号１２９；ｃｐ６６７９＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６６７９ヌクレオチド配列＜配列番号１３０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜位置を予測する（０．１４９）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物（図６
５Ａ）およびＧＳＴ融合産物（図６５Ｂ）として精製した。この組換えタンパク
質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６５Ｃ）に
おいておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６６７９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８９０）を、
発現させた＜配列番号１３１；ｃｐ６８９０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６８９０ヌクレオチド配列＜配列番号１３２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜位置を予測する（０．９４０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
、図６６Ａに示すように精製した。この組換えタンパク質を使用して、マウスを
免疫し、その血清をウェスタンブロット（図６６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分
析のために使用した。ｈｉｓタグタンパク質もまた発現された。
これらの実験は、ｃｐ６８９０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ６１７２３２３）を、
発現させた＜配列番号１３３；ｃｐ００１８＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ００１８ヌクレオチド配列＜配列番号１３４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９３５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図６７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図６７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ００１８が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２６２）を、
発現させた＜配列番号１３５；ｃｐ６２６２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６２６２ヌクレオチド配列＜配列番号１３６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．６６０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図６８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図６８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２６２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例６９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２６９）を、
発現させた＜配列番号１３７；ｃｐ６２６９＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６２６９ヌクレオチド配列＜配列番号１３８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質位置を予測する（０．４１２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図６９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図６９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２６９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２７０）を、
発現させた＜配列番号１３９；ｃｐ６２７０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６２７０ヌクレオチド配列＜配列番号１４０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロットにおいておよびＦＡＣＳ分析のために使用した（図
７０Ｂ）。
ｃｐ６２７０タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐ
ｎ００１３）。
これらの実験は、ｃｐ６２７０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４０２）を、
発現させた＜配列番号１４１；ｃｐ６４０２＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６４０２ヌクレオチド配列＜配列番号１４２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質を予測する（０．１５８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４０２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５２０）を、
発現させた＜配列番号１４３；ｃｐ６５２０＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６５２０ヌクレオチド配列＜配列番号１４４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、細胞質を予測する（０．２６５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７２Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６５２０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５６７）を、
発現させた＜配列番号１４５；ｃｐ６５６７＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６５６７ヌクレオチド配列＜配列番号１４６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．６９４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７３Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６５６７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５７６）を、
発現させた＜配列番号１４７；ｃｐ６５７６＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６５７６ヌクレオチド配列＜配列番号１４８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．７６５８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図７
４Ａ）、ｈｉｓタグ産物およびｈｉｓタグ／ＧＳＴ融合産物として精製した。こ
の組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロッ
ト（図７４Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析（図７４Ｃ）のために使用した。
ｃｐ６５７６タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（Ｃｐ
ｎ０３００）。
これらの実験は、ｃｐ６５７６が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６０７）を、
発現させた＜配列番号１４９；ｃｐ６６０７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６６０７ヌクレオチド配列＜配列番号１５０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物（図７
５Ａ）として、またＧＳＴ融合産物として精製した。このＧＳＴ融合タンパク質
を使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図７５Ｂ）にお
いておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６６０７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６２４）を、
発現させた＜配列番号１５１；ｃｐ６６２４＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６６２４ヌクレオチド配列＜配列番号１５２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１６８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてｈｉｓタグ産物として
精製した（図７６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７６Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
ｃｐ６６２４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６６２４が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７２８）を、
発現させた＜配列番号１５３；ｃｐ６７２８＞：
Figure 2012147798
ｃｐ６７２８ヌクレオチド配列＜配列番号１５４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１８７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７７Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
ｃｐ６７２８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６７２８が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８４７）を、
発現させた＜配列番号１５５；ｃｐ６８４７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６８４７ヌクレオチド配列＜配列番号１５６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７８Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８４７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例７９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６９６９）を、
発現させた＜配列番号１５７；ｃｐ６９６９＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ６９６９ヌクレオチド配列＜配列番号１５８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、内膜を予測する（０．１２６）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図７９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図７９Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６９６９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例８０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１０９）を、
発現させた＜配列番号１５９；ｃｐ７１０９＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ７１０９ヌクレオチド配列＜配列番号１６０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．８８７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図８０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図８０Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１０９が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例８１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１１０）を、
発現させた＜配列番号１６１；ｃｐ７１１０＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ７１１０ヌクレオチド配列＜配列番号１６２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．８２７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として
精製した（図８１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、そ
の血清をウェスタンブロット（図８１Ｂ）においておよびＦＡＣＳ分析のために
使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１１０が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
図１９１は、それぞれが本明細書中で同定された、ｃｐ７１０５、ｃｐ７１０
６、ｃｐ７１０７、ｃｐ７１０８、ｃｐ７１０９およびｃｐ７１１０の間の構造
的関係の模式図を示す。これら６つのタンパク質を、関連の外膜結合タンパク質
の新規ファミリーにグループ分けし得る。これらのタンパク質は、一般に反復構
造を有する（ｐｍｐファミリーを参照のこと）。
（実施例８２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１２７）を、
発現させた＜配列番号１６３；ｃｐ７１２７＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ７１２７ヌクレオチド配列＜配列番号１６４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９２０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８
２Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を
使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８２Ｂ）におい
ておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１２７が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例８３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１３３）を、
発現させた＜配列番号１６５；ｃｐ７１３３＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ７１３３ヌクレオチド配列＜配列番号１６６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、外膜を予測する（０．９２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８
３Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を
使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８３Ｂ）におい
ておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７１３３が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例８４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２２２）を、
発現させた＜配列番号１６７；ｃｐ７２２２＞：
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドが強調される。
ｃｐ７２２２ヌクレオチド配列＜配列番号１６８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリスムは、ぺリプラズムを予測する（０．９３５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図８
４Ａ）として、そしてまたｈｉｓタグ形態で精製した。この組換えタンパク質を
使用して、マウスを免疫し、その血清をウェスタンブロット（図８４Ｂ）におい
ておよびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７２２２が、表面露出され、かつ免疫アクセス可能なタ
ンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、配列
のみからは明らかではない。
（実施例８５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２２５）を、
発現した＜配列番号１６９；ｃｐ７２２５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７２２５ヌクレオチド配列＜配列番号１７０＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１６）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物とし
て精製した（図８５Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２２５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例８６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２４８）を、
発現した＜配列番号１７１；ｃｐ７２４８＞；
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを、ハイライトにする。
ｃｐ７２４８ヌクレオチド配列＜配列番号１７２＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、ペリプラズムと推定する（０．９３２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図８６Ａ）およびｈｉｓタグ化形態においても精製した。組換えタンパク質
を使用してマウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８
６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
ｃｐ７２４８タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ７２４８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例８７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２４９）を、
発現した＜配列番号１７３；ｃｐ７２４９＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７２４９ヌクレオチド配列＜配列番号１７４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５７１）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図８７Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２４９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例８８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２６１）を、
発現した＜配列番号１７５；ｃｐ７２６１＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７２６１ヌクレオチド配列＜配列番号１７６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．８４８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図８８Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図８８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２６１が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例８９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３０５）を、
発現した＜配列番号１７７；ｃｐ７３０５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７３０５ヌクレオチド配列＜配列番号１７８＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５０８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図８９Ａ）および二重ＧＳＴ／ｈｉｓ融合体としても精製した。組換えタン
パク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロッ
ト（図８９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３０５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３４７）を、
発現した＜配列番号１７９；ｃｐ７３４７＞；
Figure 2012147798
推定シグナルペプチドを、ハイライトにする。
ｃｐ７３４７ヌクレオチド配列＜配列番号１８０＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．２４９７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図９０Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を
使用してマウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９０
Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３４７が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３５３）を、
発現した＜配列番号１８１；ｃｐ７３５３＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７３５３ヌクレオチド配列＜配列番号１８２＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１３０８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図９１Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７３５３が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７４０８）を、
発現した＜配列番号１８３；ｃｐ７４０８＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７４０８ヌクレオチド配列＜配列番号１８４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１２３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物とし
て精製した（図９２Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７４０８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４２４）を、
発現した＜配列番号１８５；ｃｐ６４２４＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４２４ヌクレオチド配列＜配列番号１８６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２５０２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図９３Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を
使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９
３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９３Ｃ；ＧＳＴ融合体）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４２４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４４９）を、
発現した＜配列番号１８７；ｃｐ６４４９＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４４９ヌクレオチド配列＜配列番号１８８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．２０８４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図９４Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。組換えタンパク質を
使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９
４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９４Ｃ；ＧＳＴ融合体）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４４９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４９５）を、
発現した＜配列番号１８９；ｃｐ６４９５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４９５ヌクレオチド配列＜配列番号１９０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２８０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図９５Ａ）。組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。こ
のマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９
５Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４９５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５０６）を、
発現した＜配列番号１９１；ｃｐ６５０６＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６５０６ヌクレオチド配列＜配列番号１９２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．５７１）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ（図９６
Ａ）およびＧＳＴ癒合産物（図９６Ｂ）としても精製した。ＧＳＴ融合タンパク
質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（
図９６Ｃ）およびＦＡＣＳ分析（図９６Ｄ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６５０６が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８８２）を、
発現した＜配列番号１９３；ｃｐ６８８２＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６８８２ヌクレオチド配列＜配列番号１９４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．３６２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図９７Ａ）。このタンパク質を使用して、マウスを免疫した。この
マウスの血清を、ウエスタンブロット（図９７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図９７
Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８８２が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６９７９）を、
発現した＜配列番号１９５；ｃｐ６９７９＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６９７９ヌクレオチド配列＜配列番号１９６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．３６０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図９８Ａ）。ＧＳＴ融合体タンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析
（図９８Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６９７９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例９９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７０２８）を、
発現した＜配列番号１９７；ｃｐ７０２８＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７０２８ヌクレオチド配列＜配列番号１９８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１４５３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図９９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した
。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図９９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（
図９９Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７０２８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１００）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３５５）を、
発現した＜配列番号１９９；ｃｐ７３５５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７３５５ヌクレオチド配列＜配列番号２００＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１４３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図
１００Ａ）およびｈｉｓタグ産物として精製した。このタンパク質を使用して、
マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１００Ｂ）お
よびＦＡＣＳ分析（図１００Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３５５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３８０）を、
発現した＜配列番号２０１；ｃｐ７３８０＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７３８０ヌクレオチド配列＜配列番号２０２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．１３６２）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１０１Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０１Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析（図１０１Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３８０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６９０４）を、
発現した＜配列番号２０３；ｃｐ６９０４＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６９０４ヌクレオチド配列＜配列番号２０４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．０３５８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物とし
て精製した（図１０２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０２Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
ｃｐ６９０４タンパク質をまた、２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した。
これらの実験は、ｃｐ６９０４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６９６４）を、
発現した＜配列番号２０５；ｃｐ６９６４＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６９６４ヌクレオチド配列＜配列番号２０６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．０９１）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て（図１０３Ａ）およびｈｉｓタグ形態においても精製した。この組換えタンパ
ク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット
（図１０３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析（図１０３Ｃ）に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６９６４が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３８７）を、
発現した＜配列番号２０７；ｃｐ７３８７＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７３８７ヌクレオチド配列＜配列番号２０８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．０４３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ化融合産
物（図１０４Ａ）としておよびＧＳＴ融合体（図１０４Ｂ）としても精製した。
この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウ
エスタンブロットおよびＦＡＣＳ分析（図１０４Ｃ；ｈｉｓタグ化）に使用した
。
これらの実験は、ｃｐ７３８７が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２８１）を、
発現した＜配列番号２０９；ｃｐ６２８１＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６２８１ヌクレオチド配列＜配列番号２１０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５３７３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１０５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０５Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２８１が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０６および実施例１０７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６３０６）を、
発現した＜配列番号２１１；ｃｐ６３０６＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６３０６ヌクレオチド配列＜配列番号２１２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１６７）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３４）もま
た、発現した＜配列番号２１３；ｃｐ６４３４＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４３４ヌクレオチド配列＜配列番号２１４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６８５９）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてｈｉｓタグ産物（図
１０６Ａ；６３０６＝レーン２〜４；６４３４＝レーン８〜１０）として精製し
た。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を
、ウエスタンブロット（図１０６Ｂおよび１０７）ならびにＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６３０６およびｃｐ６４３４が、表面に曝露され、そし
て免疫アクセス可能なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用
であることを示す。これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７４００）を、
発現した＜配列番号２１５；ｃｐ７４００＞；
Figure 2012147798
ｃｐ７４００ヌクレオチド配列＜配列番号２１６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔と推定する（０．９２４）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１０８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０８Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ７４００が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１０９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６３９５）を、
発現した＜配列番号２１７；ｃｐ６３９５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６３９５ヌクレオチド配列＜配列番号２１８＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６３０７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１０９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１０９Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６３９５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６３９６）を、
発現した＜配列番号２１９；ｃｐ６３９６＞；
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ｃｐ６３９６ヌクレオチド配列＜配列番号２２０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．６０９５）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１１０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１０Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６３９６が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４０８）を、
発現した＜配列番号２２１；ｃｐ６４０８＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４０８ヌクレオチド配列＜配列番号２２２＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．２１７１）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図
１１１Ａ）およびｈｉｓタグ化融合体としても精製した。このｈｉｓタグタンパ
ク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット
（図１１１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４０８が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３０）を、
発現した＜配列番号２２３；ｃｐ６４３０＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４３０ヌクレオチド配列＜配列番号２２４＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５１４０）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１１２Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１２Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４３０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３９）を、
発現した＜配列番号２２５；ｃｐ６４３９＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４３９ヌクレオチド配列＜配列番号２２６＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．１６２８）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１１３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１３Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４３９が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４４０）を、
発現した＜配列番号２２７；ｃｐ６４４０＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４４０ヌクレオチド配列＜配列番号２２８＞は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．０４８１）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物（図
１１４Ａ）としておよびｈｉｓタグ化産物としても精製した。この組換えタンパ
ク質を使用して、マウスを免疫した。このマウスの血清を、ウエスタンブロット
（図１１４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４４０が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４７５）を、
発現した＜配列番号２２９；ｃｐ６４７５＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４７５ヌクレオチド配列＜配列番号２３０＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜と推定する（０．５３７３）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１１５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１５Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４７５が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４８２）を、
発現した＜配列番号２３１；ｃｐ６４８２＞；
Figure 2012147798
ｃｐ６４８２ヌクレオチド配列＜配列番号２３２＞は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質と推定する（０．４６０７）。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そしてＧＳＴ癒合産物とし
て精製した（図１１６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
た。このマウスの血清を、ウエスタンブロット（図１１６Ｂ）およびＦＡＣＳ分
析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４８２が、表面に曝露され、そして免疫アクセス可能
なタンパク質であること、およびこれが、免疫源として有用であることを示す。
これらの特性は、配列単独から明白ではない。
（実施例１１７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４８６）が発
現された（配列番号２３３；ｃｐ６４８６）：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ｃｐ６４８６ヌクレオチド配列（配列番号２３４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７４７４）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１１７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１１７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６４８６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１１８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５２６）が発
現された（配列番号２３５；ｃｐ６５２６）：
Figure 2012147798
ｃｐ６５２６ヌクレオチド配列（配列番号２３６）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１２９６）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１１
８Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組
換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブ
ロット（図１１８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６５２６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１１９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５２８）が発
現された（配列番号２３７；ｃｐ６５２８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６５２８ヌクレオチド配列（配列番号２３８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１６６８）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１１９Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、この
マウスの血清をウェスタンブロット（図１１９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用し
た。
これらの実験は、ｃｐ６５２８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６２７）が発
現された（配列番号２３９；ｃｐ６６２７）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６２７ヌクレオチド配列（配列番号２４０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７１９８）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２０Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、この
マウスの血清をウェスタンブロット（図１２０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用し
た。
これらの実験は、ｃｐ６６２７が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６２９）が発
現された（配列番号２４１；ｃｐ６６２９）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６２９ヌクレオチド配列（配列番号２４２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．５７７６）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合タンパク質と
して精製した（図１２１Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し
、このマウスの血清をウェスタンブロット（図１２１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６６２９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３２）が発
現された（配列番号２４３；ｃｐ６７３２）：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ｃｐ６７３２ヌクレオチド配列（配列番号２４４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．２１９６）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２２Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、この
マウスの血清をウェスタンブロット（図１２２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用し
た。
これらの実験は、ｃｐ６７３２が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３８）が発
現された（配列番号２４５；ｃｐ６７３８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７３８ヌクレオチド配列（配列番号２４６）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．１５８７）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２３Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、この
マウスの血清をウェスタンブロット（図１２３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用し
た。
これらの実験は、ｃｐ６７３８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７３９）が発
現された（配列番号２４７；ｃｐ６７３９）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７３９ヌクレオチド配列（配列番号２４８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２１９０）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２４Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１２４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６７３９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４１）が発
現された（配列番号２４９；ｃｐ６７４１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４１ヌクレオチド配列（配列番号２５０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２８６９）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２５Ａ）この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、この
マウスの血清をウェスタンブロット（図１２５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用し
た。
これらの実験は、ｃｐ６７４１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４２）が発
現された（配列番号２５１；ｃｐ６７４２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４２ヌクレオチド配列（配列番号２５２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２３３８）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２６Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１２６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６７４２が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４４）が発
現された（配列番号２５３；ｃｐ６７４４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４４ヌクレオチド配列（配列番号２５４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．３８３３）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１２７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６７４４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４５）が発
現された（配列番号２５５；ｃｐ６７４５）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４５ヌクレオチド配列（配列番号２５６）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．２２５３）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１２８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１２８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６７４５が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１２９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４７）が発
現された（配列番号２５７；ｃｐ６７４７）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４７ヌクレオチド配列（配列番号２５８）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１４４７）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１２
９Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組
換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブ
ロット（図１２９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７４７が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７５６）が発
現された（配列番号２５９；ｃｐ６７５６）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７５６ヌクレオチド配列（配列番号２６０）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．３９９４）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６７５６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７６１）が発
現された（配列番号２６１；ｃｐ６７６１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７６１ヌクレオチド配列（配列番号２６２）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１５７４）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３
１Ａ）として、ヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組換えタ
ンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット
（図１３１Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７６１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７６６）が発
現された（配列番号２６３；ｃｐ６７６６）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７６６ヌクレオチド配列（配列番号２６４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．６１５８）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３
２Ａ）として、およびヒスチジン（ｈｉｓ）タグ化産物として精製した。この組
換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブ
ロット（図１３２Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７６６が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８０４）が発
現された（配列番号２６５；ｃｐ６８０４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８０４ヌクレオチド配列（配列番号２６６）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．０６０）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３３Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６８０４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８０５）が発
現された（配列番号２６７；ｃｐ６８０５）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８０５ヌクレオチド配列（配列番号２６８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７１１）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３４Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３４Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６８０５が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８１３）が発
現された（配列番号２６９；ｃｐ６８１３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８１３ヌクレオチド配列（配列番号２７０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．４２９１）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３５Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３５Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ６８１３が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８４４）が発
現された（配列番号２７１；ｃｐ６８４４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８４４ヌクレオチド配列（配列番号２７２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．１７８６）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物（図１３
６Ａ）として、およびヒスチジンタグ化産物として精製した。この組換えタンパ
ク質を使用して、マウスを免疫し、このマウスの血清をウェスタンブロット（図
１３６Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８４４が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２０１）が発
現された（配列番号２７３；ｃｐ７２０１）：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ｃｐ７２０１ヌクレオチド配列（配列番号２７４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．３１０２）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３７Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２０１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２５１）が発
現された（配列番号２７５；ｃｐ７２５１）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２５１ヌクレオチド配列（配列番号２７６）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．４５４５）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３８Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２５１が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１３９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２８８）が発
現された（配列番号２７７；ｃｐ７２８８）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２８８ヌクレオチド配列（配列番号２７８）は、以下である：
Figure 2012147798
Figure 2012147798

ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．５９８９）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１３９Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１３９Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７２８８が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１４０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３５９）が発
現された（配列番号２７９；ｃｐ７３５９）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３５９ヌクレオチド配列（配列番号２８０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜（０．７４５３）を予測する。
このタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、そしてＧＳＴ融合産物として精
製した（図１４０Ａ）。この組換えタンパク質を使用して、マウスを免疫し、こ
のマウスの血清をウェスタンブロット（図１４０Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に使用
した。
これらの実験は、ｃｐ７３５９が表面に露出しており、そして免疫接触可能タ
ンパク質であり、そしてこれが有用な免疫原であることを示している。これらの
特性は、配列のみからは明らかではない。
（実施例１４１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３７４）が発
現された（配列番号２８１；ｃｐ７３７４）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３７４ヌクレオチド配列（配列番号２８２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質（０．２９３０）を予測する。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、Ｇ
ＳＴ融合産物として（図１４１Ａ）、またｈｉｓタグ化形態で精製した。この組
換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブ
ロットにおいて（図１４１Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３７４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能な（ｉ
ｍｍｕｎｏａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）タンパク質であり、そして有用な免疫原であ
ることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４２）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３７７）が発
現された（配列番号２８３；ｃｐ７３７７）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３７７ヌクレオチド配列（配列番号２８４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２９２６）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、Ｇ
ＳＴ融合産物として（図１４２Ａ）、またｈｉｓタグ化形態で精製した。この組
換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブ
ロットにおいて（図１４２Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７３７７が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７４０７）が発
現された（配列番号２８５；ｃｐ７４０７）：
Figure 2012147798
ｃｐ７４０７ヌクレオチド配列（配列番号２８６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１３１９）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、Ｇ
ＳＴ融合産物として精製した（図１４３Ａ）。この組換えタンパク質を使用して
マウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４３
Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７４０７が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４４）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３２）が発
現された（配列番号２８７；ｃｐ６４３２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４３２ヌクレオチド配列（配列番号２８８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５３９４）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４４Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
４Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４３２が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３３）が発
現された（配列番号２８９；ｃｐ６４３３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４３３ヌクレオチド配列（配列番号２９０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．４０６８）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４５Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
５Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４３３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６４３）が発
現された（配列番号２９１；ｃｐ６６４３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６４３ヌクレオチド配列（配列番号２９２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６８５９）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４６Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
６Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６６４３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７２２）が発
現された（配列番号２９３；ｃｐ６７２２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７２２ヌクレオチド配列（配列番号２９４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６６６８）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４７Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
７Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７２２が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２５３）が発
現された（配列番号２９５；ｃｐ７２５３）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２５３ヌクレオチド配列（配列番号２９６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５３９４）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４８Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
８Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７２５３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１４９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２６４）が発
現された（配列番号２９７；ｃｐ６２６４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６２６４ヌクレオチド配列（配列番号２９８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２８１７）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１４９Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１４
９Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２６４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１５０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２６６）が発
現された（配列番号２９９；ｃｐ６２６６）：
Figure 2012147798
ｃｐ６２６６ヌクレオチド配列（配列番号３００）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．３５９０）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１５０Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５
０）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２６６が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１５１）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８９５）が発
現された（配列番号３０１；ｃｐ６８９５）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８９５ヌクレオチド配列（配列番号３０２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３２６４）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１５１Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５
１Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８９５が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１５２および実施例１５３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６２８２）が発
現された（配列番号３０３；ｃｐ６２８２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６２８２ヌクレオチド配列（配列番号３０４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６２）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３７３）もま
た発現された（配列番号３０５；ｃｐ７３７３）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３７３ヌクレオチド配列（配列番号３０６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．１０６９）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５２Ａ；６２８２＝レーン８および９
；７３７３＝レーン２〜４）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免
疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５２Ｂおよび１
５３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６２８２およびｃｐ７３７３が表面曝露され、かつ免疫
アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している
。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１５４、実施例１５５、実施例１５６、実施例１５７および実施例１
５８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４１２）が発
現された（配列番号３０７；ｃｐ６４１２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４１２ヌクレオチド配列（配列番号３０８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４８６４）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３１）もま
た発現された（配列番号３０９；ｃｐ６４３１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４３１ヌクレオチド配列（配列番号３１０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２１１５）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４４３）もま
た発現された（配列番号３１１；ｃｐ６４４３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４４３ヌクレオチド配列（配列番号３１２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５５８５）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４９６）もま
た発現された（配列番号３１３；ｃｐ６４９６）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４９６ヌクレオチド配列（配列番号３１４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．５９８９）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６５４）もま
た発現された（配列番号３１５；ｃｐ６６５４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６５４ヌクレオチド配列（配列番号３１６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．０７３０）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５４Ａ；６４１２＝レーン２〜３；６
４３１＝レーン１１〜１２；６４４３＝レーン５〜６；６４９６＝レーン８〜９
；６６５４＝レーン１０；レーン１、４、７におけるマーカー）。これらの組換
えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロ
ットにおいて（図１５４Ｂおよび１５５、１５６、１５７および１５８）、およ
びＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４１２、ｃｐ６４３１、ｃｐ６４４３、ｃｐ６４９６
およびｃｐ６６５４が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり
、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、これらの配列
からだけでは明らかとならない。
（実施例１５９および実施例１６０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４７７）が発
現された（配列番号３１７；ｃｐ６４７７）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４７７ヌクレオチド配列（配列番号３１８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１２８）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４３５）もま
た発現された（配列番号３１９；ｃｐ６４３５）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４３５ヌクレオチド配列（配列番号３２０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞膜周辺腔を予測する（０．４０４４）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１５９Ａ；６４３５＝レーン２〜４；６
４７７＝レーン５〜７）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し
、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１５９Ｂおよび１６０
）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４７７およびｃｐ６４３５が表面曝露され、かつ免疫
アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であることを示している
。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１６１、実施例１６２および実施例１６３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４４１）が発
現された（配列番号３２１；ｃｐ６４４１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４４１ヌクレオチド配列（配列番号３２２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細菌内膜を予測する（０．１３２）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４８）もま
た発現された（配列番号３２３；ｃｐ６７４８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４８ヌクレオチド配列（配列番号３２４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．１７０）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８８１）もま
た発現された（配列番号３２５；ｃｐ６８８１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８８１ヌクレオチド配列（配列番号３２６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２４９）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１６１Ａ；６４４１＝レーン７〜９；６
７４８＝レーン２〜３；６８８１＝レーン４〜６）。これらの組換えタンパク質
を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて
（図１６１Ｂ、１６２および１６３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４４１、ｃｐ６７４８およびｃｐ６８８１が表面曝露
され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であるこ
とを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１６４、実施例１６５および実施例１６６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４４４）が発
現された（配列番号３２７；ｃｐ６４４４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４４４ヌクレオチド配列（配列番号３２８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２０３１）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４１３）もま
た発現された（配列番号３２９；ｃｐ６４１３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４１３ヌクレオチド配列（配列番号３３０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６１８０）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３９１）もま
た発現された（配列番号３３１；ｃｐ７３９１）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３９１ヌクレオチド配列（配列番号３３２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１４８９）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物およびＧＳＴ融合産物として精製した（図１６４Ａ；６４４
４＝レーン１１〜１２；７３９１＝レーン２〜３；６４１３＝レーン４〜６）。
この組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエス
タンブロットにおいて（図１６４Ｂ、１６５および１６６）、およびＦＡＣＳ分
析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４４４、ｃｐ６４１３およびｃｐ７３９１が表面曝露
され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であるこ
とを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１６７、実施例１６８、実施例１６９および実施例１７０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４６３）が発
現された（配列番号３３３；ｃｐ６４６３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４６３ヌクレオチド配列（配列番号３３４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１５１０）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５４０）もま
た発現された（配列番号３３５；ｃｐ６５４０）：
Figure 2012147798
ｃｐ６５４０ヌクレオチド配列（配列番号３３６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３０８６）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４３）もま
た発現された（配列番号３３７；ｃｐ６７４３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４３ヌクレオチド配列（配列番号３３８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．２７６９）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７０４１）もま
た発現された（配列番号３３９；ｃｐ７０４１）：
Figure 2012147798
ｃｐ７０４１ヌクレオチド配列（配列番号３４０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１０２２）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１６７Ａ；６４６３＝レーン２〜４；６
５４０＝レーン５〜７；６７４３＝レーン８〜９；７０４１＝レーン１０〜１１
）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を
、ウエスタンブロットにおいて（図１６７Ｂ、１６８、１６９および１７０）、
およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６４６３、ｃｐ６５４０、ｃｐ６７４３およびｃｐ７０
４１が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な
免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとな
らない。
（実施例１７１、実施例１７２および実施例１７３）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６３２）が発
現された（配列番号３４１；ｃｐ６６３２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６３２ヌクレオチド配列（配列番号３４２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６２７）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６４８）もま
た発現された（配列番号３４３；ｃｐ６６４８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６４８ヌクレオチド配列（配列番号３４４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６０７４）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６４９７）もま
た発現された（配列番号３４５；ｃｐ６４９７）：
Figure 2012147798
ｃｐ６４９７ヌクレオチド配列（配列番号３４６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１４５）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１７１Ａ；６６３２＝レーン５〜７；６
６４８＝レーン８〜１０；６４９７＝レーン２〜４）。これらの組換えタンパク
質を使用してマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおい
て（図１７１Ｂ、１７２および１７３）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した
。
これらの実験は、ｃｐ６６３２、ｃｐ６６４８およびｃｐ６４９７が表面曝露
され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり、そして有用な免疫原であるこ
とを示している。これらの特性は、配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１７４、実施例１７５、実施例１７６、実施例１７７および実施例１
７８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２００）が発
現された（配列番号３４７；ｃｐ７２００）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２００ヌクレオチド配列（配列番号３４８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３６７２）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２３５）もま
た発現された（配列番号３４９；ｃｐ７２３５）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２３５ヌクレオチド配列（配列番号３５０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．３２１４）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７２６８）もま
た発現された（配列番号３５１；ｃｐ７２６８）：
Figure 2012147798
ｃｐ７２６８ヌクレオチド配列（配列番号３５２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．１２３５）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３７５）もま
た発現された（配列番号３５３；ｃｐ７３７５）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３７５ヌクレオチド配列（配列番号３５４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．００４９）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７３８８）もま
た発現された（配列番号３５５；ｃｐ７３８８）：
Figure 2012147798
ｃｐ７３８８ヌクレオチド配列（配列番号３５６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４６１）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこれらのタンパク質を
、ｈｉｓタグ化産物として精製した（図１７４；７２００＝レーン２〜３；７２
３６＝レーン４〜５；７２６８＝レーン６〜８；７３７５＝レーン９〜１０；７
３８８＝レーン１１〜１２）。これらの組換えタンパク質を使用してマウスを免
疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１７４、１７５、
１７６、１７７および１７８）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ７２００、ｃｐ７２３５、ｃｐ７２６８、ｃｐ７３７５
およびｃｐ７３８８が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタンパク質であり
、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、配列からだけ
では明らかとならない。
（実施例１７９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７２３）が発
現された（配列番号３５７；ｃｐ６７２３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７２３ヌクレオチド配列（配列番号３５８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．６０９５）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１７９Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１７
９Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７２３が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１８０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７４９）が発
現された（配列番号３５９；ｃｐ６７４９）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７４９ヌクレオチド配列（配列番号３６０）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．２９９６）。
タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され、そしてこのタンパク質を、ｈ
ｉｓタグ化産物として精製した（図１８０Ａ）。この組換えタンパク質を使用し
てマウスを免疫し、このマウスの血清を、ウエスタンブロットにおいて（図１８
０Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析のために使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７４９が表面曝露され、かつ免疫アクセス可能なタン
パク質であり、そして有用な免疫原であることを示している。これらの特性は、
配列からだけでは明らかとならない。
（実施例１８１、実施例１８２、実施例１８３、実施例１８４および実施例１
８５）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６３０１）が発
現された（配列番号３６１；ｃｐ６３０１）：
Figure 2012147798
ｃｐ６３０１ヌクレオチド配列（配列番号３６２）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、細胞質を予測する（０．４６２１）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６５５８）もま
た発現された（配列番号３６３；ｃｐ６５５８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６５５８ヌクレオチド配列（配列番号３６４）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．４６３０）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６３０）もま
た発現された（配列番号３６５；ｃｐ６６３０）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６３０ヌクレオチド配列（配列番号３６６）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．７０９２）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６３３）もま
た発現された（配列番号３６７；ｃｐ６６３３）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６３３ヌクレオチド配列（配列番号３６８）は以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは、内膜を予測する（０．７２８３）。
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６６４２）もま
た発現された（配列番号３６９；ｃｐ６６４２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６６４２ヌクレオチド配列（配列番号３７０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは内膜を予測する（０．５２８８）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＧＳＴ融合産物として精製した
。組換えタンパク質を、マウスを免疫するために使用し、その血清をウエスタン
ブロット（図１８１〜１８５）およびＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６３０１、ｃｐ６５５８、ｃｐ６６３０、ｃｐ６６３３
およびｃｐ６６４２が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質であり、そして
これらが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、これらの配列単独か
らは明らかでない。
（実施例１８６）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６３８９）を発
現した（配列番号３７１；ｃｐ６３８９）：
Figure 2012147798
ｃｐ６３８９ヌクレオチド配列（配列番号３７２）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細胞質を予測する（０．３１９３）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＧＳＴ融合産物として（図１８
６Ａ）、そしてまたｈｉｓタグ化形態で精製した。組換えタンパク質を、マウス
を免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８６Ｂ）および
ＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６３８９が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質で
あり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列
単独からは明らかでない。
（実施例１８７）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６７９２）を発
現した（配列番号３７３；ｃｐ６７９２）：
Figure 2012147798
ｃｐ６７９２ヌクレオチド配列（配列番号３７４）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細胞質を予測する（０．１８０）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ｈｉｓタグ化産物として精製し
た（図１８７Ａ；レーン２〜４）。組換えタンパク質を、マウスを免疫するため
に使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８７Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６７９２が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質で
あり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列
単独からは明らかでない。
（実施例１８８）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８６８）を発
現した（配列番号３７５；ｃｐ６８６８）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８６８ヌクレオチド配列（配列番号３７６）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは細菌の細胞質を予測する（０．３２５）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ｈｉｓタグ化産物として精製し
た（図１８８Ａ；レーン２〜３）。組換えタンパク質を、マウスを免疫するため
に使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８８Ｂ）およびＦＡＣＳ分析に
使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８６８が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質で
あり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列
単独からは明らかでない。
（実施例１８９）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７６８９４）を発
現した（配列番号３７７；ｃｐ６８９４）：
Figure 2012147798
ｃｐ６８９４ヌクレオチド配列（配列番号３７８）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムは内膜を予測する（０．１６２）。
このタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、ｈｉｓタグ化産物として（図１８
９Ａ）、そしてまたＧＳＴ／ｈｉｓ形態で精製した。組換えタンパク質を、マウ
スを免疫するために使用し、その血清をウエスタンブロット（図１８９Ｂ）およ
びＦＡＣＳ分析に使用した。
これらの実験は、ｃｐ６８９４が表面露出され、免疫利用可能なタンパク質で
あり、そしてこれが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、この配列
単独からは明らかでない。
（実施例１９０）
以下のＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質（ＰＩＤ ４３７７１９３）を、
２Ｄ−ＰＡＧＥ実験において同定した（配列番号３７９；ｃｐ７１９３）：
Figure 2012147798
推定リーダーペプチドに下線を引く。
ｃｐ７１９３ヌクレオチド配列（配列番号３８０）は、以下である：
Figure 2012147798
ＰＳＯＲＴアルゴリズムはペリプラズムを予測する（０．９２５）。
これは、ｃｐ７１９３が、ＥＢにおいて免疫利用可能なタンパク質であり、こ
れが有用な免疫原であることを示す。これらの特性は、タンパク質の配列単独か
らは明らかでない。
本発明が、例のみのために記載されており、そして改変が本発明の精神および
範囲内に維持されながらなされ得ることが、理解される。
表ＩＩ−Ｃｐｎ遺伝子を増幅するために用いられたプライマーの配列
Figure 2012147798
Figure 2012147798

Figure 2012147798

表ＩＩＩ−ＦＡＣＳ分析での最良の結果を有するタンパク質
Figure 2012147798
Figure 2012147798

表ＩＶ−Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓにおいて見出されないＦＡＣＳ陽性タン
パク質
Figure 2012147798
表Ｖ−２Ｄ電気泳動に続くＭＡＬＤＩ-ＴＯＦによって同定されたタンパク質
Figure 2012147798

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
JP2012107538A 2000-07-03 2012-05-09 Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫化 Pending JP2012147798A (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0016363.4 2000-07-03
GB0016363A GB0016363D0 (en) 2000-07-03 2000-07-03 Immunisation against chlamydia pneumoniae
GB0017047.2 2000-07-11
GB0017047A GB0017047D0 (en) 2000-07-11 2000-07-11 Immunisation against chlamydia pneumoniae
GB0017983A GB0017983D0 (en) 2000-07-21 2000-07-21 Immunisation against chlamydia pneumoniae
GB0017983.8 2000-07-21
GB0019368.0 2000-08-07
GB0019368A GB0019368D0 (en) 2000-08-07 2000-08-07 Immunisation against chlamydia pneumoniae
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