JP2012100668A - Ｔｍ４ｓｆ５の機能を阻害する抗がん物質のスクリーニング方法及びカルコン系の化合物を含有する抗がん用組成物 - Google Patents

Ｔｍ４ｓｆ５の機能を阻害する抗がん物質のスクリーニング方法及びカルコン系の化合物を含有する抗がん用組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】ＴＭ４ＳＦ５による腫瘍の形成と発生及び転移を阻害する抗がん物質のスクリーニング方法の提供。および、前記方法によりスクリーニングされた抗がん物質、特に、スルホンアミド及びスルホネートカルコン系の化合物及びこれを有効成分として含有する抗がん用組成物の提供。
【解決手段】特定の配列のポリペプチドを発現する腫瘍タンパク質であるＴＭ４ＳＦ５（transmembrane 4 L6 family member 5）を発現するがん細胞を培養して抗がん候補物質にて処理した後、前記ＴＭ４ＳＦ５の発現と関連する種々の分子的な機序による諸現象に基づいて腫瘍生成及び転移に対する拮抗作用を示す物質を抗がん物質としてスクリーニングする方法、前記方法によりスクリーニングされたカルコン系の化合物及びこれを有効成分とする抗がん組成物に関する。
【選択図】図５

Description

本発明は抗がん物質のスクリーニング方法に係り、さらに詳しくは、ＴＭ４ＳＦ５による腫瘍の形成と発生及び転移を阻害する化合物のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、該方法により抗がん物質としてスクリーニングされたカルコン系の化合物及びこれを有効成分として含有する抗がん用組成物に関する。
トランスメンブラン４ Ｌ６ファミリーメンバー５（transmembrane 4 L6 family member 5：ＴＭ４ＳＦ５またはＬ６Ｈ）は腫瘍特異抗原であるＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）と相同性を有するタンパク質であって、前記ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）は、トランスメンブラン４ Ｌ６ファミリー（transmembrane 4 L6 family）に属する。トランスメンブラン４ Ｌ６ファミリーに属するタンパク質は、ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）に加えて、ＩＬ−ＴＭＰ、Ｌ６Ｄなどがある。腫瘍特異抗原として知られている前記ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）は、直腸がん、肺がん、乳房がん、さらには卵巣がんなどにおいて高く発現されていることが知られており、ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）と相同性を有するタンパク質であるＴＭ４ＳＦ５（Ｌ６Ｈ）もまたすい臓がん、胃がん、直腸がん、さらに肝がんなど種々のがん細胞において高く発現されると当業界に報告されている(Muller-Pillasch, F. et al., Gene, 208:25, 1998、 Pascual-Le Tallec, L. et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 87:501, 2002)。また、ＴＭ４ＳＦ１（Ｌ６）に比べてＴＭ４ＳＦ５のｍＲＮＡのレベルは胃がん組織においては低く発現された場合があるが、肝がん細胞株と胃がん細胞株においては高く発現されたものであるとも報告されている(Kaneko, R. et al., Am. J. Gastroenterol., 96(12):3457, 2001)。
これらの研究に基づいて、近年、米国特許ＵＳ６、３５０、５８１Ｂ１においてＴＭ４ＳＦ５が新規な発がん遺伝子として登録されており（ＴＵＡＮと表記）、本発明者によってＣｏｓ７繊維芽細胞にＴＭ４ＳＦ５を人為的に発現させた結果、アクチン構造の再構成と接着斑の形成、及び接着斑キナーゼ（focal adhesion kinase：ＦＡＫ）のアミノ酸チロシン９２５番のリン酸化が、インテグリンα２により引き起こされること、及びこのような現象は細胞成長因子を含む血清により阻害、調節されることを研究結果として報告している(Lee, S.Y. et al., Exp. Cell Res., 312:2983, 2006)。
しかしながら、腫瘍形成におけるＴＭ４ＳＦ５の分子的な機序はほとんど知られていないのが現状である。すなわち、分子的なレベルにおけるＴＭ４ＳＦ５タンパク質の機能及びその発がん機能に係る証拠は生化学的、細胞生物学的に全く知られていない。
一方、カルコンは食用の植物に豊富に存在する物質であって、フラボノイドまたはイソフラボノイドの前駆体として知られている。前記のカルコンの誘導体は植物の黄色色素の構成成分であって、植物の色合いに影響するだけではなく、有害な紫外線から植物を保護する役割を果たすこともある（天然物化学研究法、ウ・ウォンシク著、ソウル大学出版部）。カルコン誘導体は菊科植物であるハルシャギク属に多量存在する。代表的なカルコン類には２’、６’−ジヒドロキシ−４’−メトキシカルコン、カルタミンなどがあり、これらは桂皮、紅花、胡椒などの植物に含有されている。ジヒドロカルコンは主としてバラ科及びカラムラサキツツジ科植物に含有されており、りんごに存在するジヒドロカルコンであるフロリジンはりんごの病気に対する抵抗力と関係があると報告されている。
このようなカルコン誘導体は、例えば、抗原虫性(Liu, M. et al., J. Med. Chem., 44:4443, 2001)、抗炎症性(Babu, M.A. et al., Bioorg. Med. Chem., 10:4035, 2003)、免疫調節(Barfod, L. et al., int. immunopharmacol., 2:545, 2002)、一酸化窒素阻害(Rojas, J. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 12:1951, 2002)、抗がん(Kumar, S.K. et al., J. Med. Chem., 46:2813, 2003)、抗ＨＩＶ(Artico, M. et al., J. Med. Chem., 41:3984, 1998)活性など極めて様々な薬物学的な活性を示すことが知られている。
また、大韓民国公開特許１０−２００３−００３６９９３号公報には、前記カルコン化合物が基底膜成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（Matrix metalloproteinase、ＭＭＰ）の活性を阻害する性質を有していることが記載されている(Park, K.H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:5514, 2004)。
カルコン系の化合物の中でも、スルホンアミドまたはスルホネート基が置換されたカルコン系の化合物には自然に存在するカルコン系の化合物が有していない特異な生物学的特性があることが報告されている。特に、本発明者により、スルホンアミドカルコン系の化合物が高いα−グルコシダーゼ阻害活性を有していることが報告されている(Park, K.H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 15:5514, 2004、大韓民国公開特許１０−０７５１８９９）。加えて、本発明者により、スルホネートカルコン系の化合物が選択的なカリウムイオンチャンネル阻害活性を有していることも報告されている(Park, K.H. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2007)。
しかしながら、これまで、前記スルホンアミド及びスルホネートカルコン系の化合物が発がん遺伝子であるＴＭ４ＳＦ５を阻害する機序を通じて抗がん機能を発現するということは全く解明されていない。
そこで、本発明者らは、ヒトのがん細胞において現れるＴＭ４ＳＦ５の発がん遺伝子としての機能は、上皮間葉転換（epithelial-mesenchymal transition：ＥＭＴ）現象の促進、接触阻止現象の消失（loss of contact inhibition）によるものであり、これは、ＦＡＫのリン酸化及び細胞質内のｐ２７ｋiｐ１タンパク質の蓄積によるＲｈｏＡタンパク質の活性阻害及び細胞形態の変化につながる一連の過程を通じてなされるという新たな経路を見出し、前記諸現象に基づいてＴＭ４ＳＦ５の発現による腫瘍の形成と発生及び転移を阻害する抗がん物質をスクリーニングするために鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。
［発明の詳細な説明］
《技術的課題》
本発明の目的は、ＴＭ４ＳＦ５による腫瘍の形成と発生及び転移を阻害する抗がん物質のスクリーニング方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記方法によりスクリーニングされた抗がん物質、特に、スルホンアミド及びスルホネートカルコン系の化合物及びこれを有効成分として含有する抗がん用組成物を提供することにある。
［技術的解決方法］
上記の目的を達成するために、本発明は、下記のステップを含む、抗がん物質のスクリーニング方法を提供する：
（ａ）配列番号２のポリペプチドを発現するがん細胞を培養した後、抗がん候補物質で処理するステップ、
（ｂ）前記抗がん候補物質で処理されたがん細胞に対して、
（ｉ）接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）を構成するアミノ酸配列のうち５７７番位のチロシンのリン酸化の確認、（ｉｉ）ＦＡＫのＲｈｏ−ＧＴＰase activating protein（ＲｈｏＧＡＰ）への結合、またはＦＡＫのＧＴＰase Regulator Associated with ＦＡＫ（ＧＲＡＦ）への結合測定、（ｉｉｉ）細胞質内ｐ２７Ｋiｐ１の発現量及び細胞質内安定化測定、（ｉｖ）ＲｈｏＡの活性測定、及び（ｖ）Ｒａｃ１の活性測定、
の少なくとも１つを検出するステップ、及び
（ｃ）抗がん候補物質で処理しない場合に比べて、
（ｉ）ＦＡＫの５７７番位のチロシンのリン酸化減少、（ｉｉ）ＦＡＫのＲｈｏＧＡＰへの結合、またはＦＡＫのＧＲＡＦへの結合抑制、（ｉｉｉ）細胞質内ｐ２７Ｋiｐ１発現減少及び細胞質内安定化、（ｉｖ）ＲｈｏＡ活性増加、または（ｖ）Ｒａｃ１活性減少
の事象が現れた場合に、抗がん候補物質を抗がん物質として選択するステップ。
本発明において、前記ステップ（ｂ）は、細胞の形態確認、細胞接着関連のタンパク質発現確認、細胞間接触パターンまたは接触生長確認、α平滑筋アクチン（α−smooth muscle actin:α−ＳＭＡ）タンパク質またはビメンチンタンパク質の発現確認、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現確認及び上皮間葉転換（epithelial-mesenchymal transition、ＥＭＴ）確認よりなる群から選ばれる１以上をさらに行い、前記ステップ（ｃ）は、細胞の形態がロッド状から多角形に戻るか、あるいは、細胞接着関連のタンパク質の発現が減少するか、あるいは、細胞−細胞間の接触が維持されるか、あるいは、細胞生長の接触阻止現象が現れるか、あるいは、α−ＳＭＡタンパク質またはビメンチンタンパク質の発現が減少するか、あるいは、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現が増加するか、あるいは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が減少する場合をさらに含むことを特徴としてもよい。
本発明において、前記ステップ（ｂ）は、細胞外基質（extracellular matrix）または血清の存在下での細胞の移動又は運動性確認、細胞外基質を構成するコラーゲンゲルへの浸潤確認、細胞外基質複合体を構成するマトリゲルへの浸潤確認及びＭＭＰ活性測定よりなる群から選ばれる１以上をさらに行い、前記ステップ（ｃ）は、細胞外基質または血清の存在下で細胞の移動又は運動性が減少するか、あるいは、コラーゲンゲル中における浸潤が減少するか、あるいは、マトリゲル中における浸潤が減少するか、あるいは、ＭＭＰ活性が減少する場合をさらに含むことを特徴としてもよい。
本発明は、また、前記方法によりスクリーニングされた、下記の化学式１または化学式２で表わされる抗がん用のカルコン系の化合物及びこれを有効成分として含有する抗がん用組成物、並びに前記化合物の抗がん治療及び予防の用途を提供する。
式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールである。

式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールである。
本発明の他の特徴及び具現例は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲からなお一層明らかになる。
図１は、ＳＮＵ４４９ｐ、ＳＮＵ４４９Ｃｐ、Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７、Ｔ１６細胞の写真及びウェスタンブロットの結果である。 図２は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐに対してローダミン標識ファロイジンで染色したアクチン写真である。 図３は、表記のタンパク質に対するウェスタンブロットの結果である。 図４は、ＲｈｏＡとＲａｃ１に対するin vitroプルダウンアッセイによる活性分析結果である。 図５は、ＳＮＵ４４９ｐ、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するウェスタンブロット分析結果である。 図６は、図５のいくつかの細胞のＲｈｏＡ活性分析結果である。 図７は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｐＥＧＦＰとｓｈＴＭ４ＳＦ５を一緒に導入して２４時間培養後、ローダミン標識ファロイジン及びＤＡＰＩを蛍光染色した写真である。 図８は、ＦＡＫ−ＲｈｏＡ間の信号伝達に対する模式図である。 図９は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞におけるｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ、ＧＲＡＦ、ＦＡＫ抗体を用いたウェスタンブロット分析結果である。 図１０は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に（ＨＡ）３−tagged ＦＡＫ野生型タンパク質とＹ５７７Ｆ突然変異タンパク質を過剰発現した後のウェスタンブロット分析結果である。 図１１は、対照群細胞にＦＬＡＧ−tagged ＧＲＡＦタンパク質を過剰発現した後の蛍光免疫染色写真である。 図１２は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対する蛍光免疫染色写真である。 図１３は、核と細胞質を分画化した後、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質に対する抗体とα−チューブリンに対する抗体を用いたウェスタンブロット分析結果である。 図１４は、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質発現レベルとＳｅｒ１０リン酸化に対する、表記の抗体を用いたウェスタンブロット分析結果である。 図１５は、ｐ２７ＫiＰ１のセリン１０番のアミノ酸残基のリン酸化と関連するＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対する蛍光免疫染色写真である。 図１６は、ｐ２７ｋiｐ１またはＧＡＰＤＨの遺伝子のｍＲＮＡへの転写を確認するためのＲＴ−ＰＣＲ分析結果及びウェスタンブロットの結果である。 図１７は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をｐＥＧＦＰとｓｈＴＭ４ＳＦ５を一緒に導入した後、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質とＤＡＰＩで細胞核を免疫蛍光染色法により染色した写真である。 図１８は、図示の抗体を用いてウェスタンブロット分析した結果である。 図１９は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に（ＨＡ）−tagged ＦＡＫ野生型タンパク質とＹ５７７Ｆ突然変異体を過剰発現させた後のウェスタンブロット分析結果である。 図２０は、肝がん細胞株Ｈｕｈ７に対して様々なｓｈＲＮＡを導入した後のウェスタンブロット分析結果である。 図２１は、免疫蛍光染色法により染色した写真である。 図２２は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞にＦＬＡＧ−tagged ｐ２７ｋiｐ１タンパク質を過剰発現させた後の免疫蛍光染色法による共焦点顕微鏡写真である。 図２３は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞においてｐ２７ｋiｐ１の発現を阻害した後の免疫蛍光染色写真である。 図２４は、図示の抗体を用いたウェスタンブロット分析結果である。 図２５は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に活性型ＲｈｏＡ６３Ｌ突然変異ベクターを導入した後のアクチン構造を免疫染色した写真である。 図２６は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にＬＰＡを処理した後の免疫染色写真である。 図２７は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｍＤiａ活性型の突然変異体、活性型のＲａｃ１（Ｒａｃ１ ６１Ｌ）及び活性型のＰＡＫ１（ＰＡＫ１−ｃａａｘ）を導入した後に免疫蛍光染色分析を行った写真である。 図２８は、細胞接触と関連するタンパク質に対するウェスタンブロット分析結果である。 図２９は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するＥ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１タンパク質の免疫染色分析結果である。 図３０は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞においてｐ２７ｋiｐ１発現を阻害した場合、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１タンパク質の免疫染色分析結果である。 図３１は、ｓｈＲＮＡとｓｈＴＭ４ＳＦ５を発現するＨｕｈ７細胞におけるウェスタンブロット分析結果である。 図３２は、前記樹立された細胞株にＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２４時間処理した後、ＺＯ１の位置を免疫染色した写真である。 図３３は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＤＡＰＩで細胞核を染色した写真（矢印：細胞分裂と核が重なり合った部分）及び１２時間おきに１回ずつ測定した細胞数のグラフである。 図３４は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞が重なり合って細胞分裂を示す染色写真である（矢印：細胞分裂中にある核）。 図３５は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＴＭ４ＳＦ５が発現されるＴ７、Ｔ１６、及びＴ３の細胞周期のＳ期分布を調べてまとめたグラフである。 図３６は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｓｈＲＮＡとｓｈＴＭ４ＳＦ５を導入した後、フローサイトメトリーを用いてＳ細胞周期を分析したグラフである。 図３７は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＢｒｄＵ浸透免疫染色法を用いてＳ期に入った細胞の分布を分析した結果である。 図３８は、ＬＰＡを処理したＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＢｒｄＵ浸透免疫染色法を用いてＳ期に入った細胞の分布を分析した結果である。 図３９は、ｐ２７ｋiｐ１ｓｈＲＮＡアデノウィルスを感染させたＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＢｒｄＵ浸透免疫染色法を用いてＳ期に入った細胞の分布を分析した結果である。 図４０は、ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞にＥ−カドヘリンを再発現させたＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ細胞に対してＢｒｄＵ浸透免疫染色法を用いてＳ期に入った細胞の分布を分析した結果である。 図４１は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ（Ｃｐ）、ＳＮＵ４４９Ｔ１６（Ｔ１６）、及びＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ（Ｔ１６ｍ）細胞に対する、表記の分子の発現レベルに対する調査結果である。 図４２は、ＳＮＵ４４９Ｔ１６（Ｔ１６）及びＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ（Ｔ１６ｍ）細胞に対してβ−カテニン、ＺＯ１、またはＥ−カドヘリンを免疫染色した写真である。 図４３は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＤＭＳＯまたはＴＳＡＨＣ（４’−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン）を表記の濃度にてそれぞれ処理した後、生存細胞の数を数えて記録したグラフである。 図４４は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にＤＭＳＯまたは２０μＭのＴＳＡＨＣを処理し、ＢｒｄＵを２４時間かけて浸透させた後、蛍光染色法により確認した写真である。 図４５は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＤＭＳＯまたは２０μＭ ＴＳＡＨＣを処理した後のＥ−カドヘリンまたはβ−カテニンの免疫染色写真である。 図４６は、表記のタンパク質のウェスタンブロット分析結果である。 図４７は、ｐ２７ｋiｐ１の蛍光免疫染色分析結果である。 図４８は、in vitro ＲｈｏＡ活性分析結果である。 図４９は、ＤＮＡとアクチンの免疫染色写真である。 図５０は、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対してＰＮＧaseＦ及びＥｎｄｏＨ酵素を処理した後のウェスタンブロットの結果である。 図５１は、ＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞及び発現しない細胞に対するＴＳＡＨＣの処理による生長／増殖の変化を示すグラフである。 図５２は、ＳＮＵ４４９細胞株のソフトアガーアッセイを行った結果である。 図５３は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９Ｔｐ、及びＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ細胞による腫瘍形成の結果とＴＳＡＨＣによる腫瘍生成の低下の度合いを観察した結果である。 図５４は、腫瘍組織に対するＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）染色結果及び免疫組織化学染色法により分析した結果である。 図５５は、ＴＭ４ＳＦ５により形成された腫瘍組織におけるｐ２７ｋiｐ１、ｐＳ１０ｐ２７ｋiｐ１及びＴＭ４ＳＦ５タンパク質に対してウェスタンブロットを行った結果である。 図５６は、ＴＳＡＨＣの腹腔注射による腫瘍の体積及び動物の体重を測定した結果グラフである。 図５７は、ＴＭ４ＳＦ５による接触阻止消失現象の模式図である。 図５８は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞において、傷が満たされる度合いに対する光学顕微鏡観察写真である。 図５９は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＴｐ細胞において、細胞の移動の度合いを示すクリスタルバイオレット染色後、光学顕微鏡写真及びその染色を溶かし出して２６０ｎｍの波長において吸光度を測定した結果グラフである。 図６０は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞のコラーゲンゲル上に浸潤する現象を光学顕微鏡にて観察した写真である。 図６１は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞のマトリゲル上に浸潤した細胞を光学顕微鏡にて観察した写真及びその細胞数のグラフである。 図６２は、ＳＮＵ４４９Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７、及びＴ１６細胞におけるＭＭＰｓ酵素活性関係のゼラチンジモグラフィの結果及びＭＭＰ９とα−チューブリンタンパク質の発現の度合いを免疫ブロットにて確認した結果である。 図６３は、ＳＮＵ４４９Ｐ細胞において、ＭＭＰ−２ルシフェラーゼ及びＭＭＰ−９ルシフェラーゼの分析を用いて各遺伝子のプロモーターの転写機能活性を比較したグラフである。 図６４は、ＴＭ４ＳＦ５が発現される各種の細胞をマウスの尾静脈に注入後、肺組織に形成された腫瘤写真及び転移がんの存在を示すＨ＆Ｅ染色写真である。 図６５は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するＴＳＡＨＣ処理時またはＴＳＡＨＣ未処理時における、移動した細胞の染色写真及び細胞数に対するグラフである。 図６６は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するＴＳＡＨＣ処理時またはＴＳＡＨＣ未処理時における、コラーゲンゲルにおける浸潤性現象に対する写真である。 図６７は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するＴＳＡＨＣ処理時またはＴＳＡＨＣ未処理時における、マトリゲルにおける浸潤性に対するグラフである。 図６８は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対するＴＳＡＨＣ処理時または未処理時におけるＭＭＰ２及び９ジモグラフィの遂行結果である。 図６９は、ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対して図示の化合物を処理した後の前記細胞の形態変化に関する光学顕微鏡写真である。
本発明は、一観点において、腫瘍誘導因子として作用するＴＭ４ＳＦ５（transmembrane 4L 6 family member 5）発現と関連する様々な細胞生物学的及び生化学的な現象に基づく抗がん物質のスクリーニング方法に関する。
本発明の配列番号１で表わされるポリヌクレオチドから発現される配列番号２で表わされるポリペプチドにより形成される腫瘍タンパク質であるＴＭ４ＳＦ５（transmembrane 4L 6 family member 5）は腫瘍特異的な抗原であるＬ６と相同性を有するタンパク質である。前記ＴＭ４ＳＦ５は非水溶性のタンパク質であって、細胞膜を通過する４個の領域と、細胞外に存在する２個の環構造、及び細胞質に存在する２個の末端構造を有しており、すい臓がん、胃がん、直腸がん、肝がんなど種々のがん細胞において高く発現することが知られている。
ＴＭ４ＳＦタンパク質はインテグリンなどの細胞付着分子と複合体を形成して巨大なテトラスパニンウェブをなして、細胞の付着、増殖及び移動などの様々な生物学的機能に寄与すると推定されている。単層よりなる上皮組織は隣り合う細胞間の細胞−細胞接触によるものであって、Ｅ−カドヘリンなどの細胞接触に預かる分子間の強い相互結合により、あるいは、インテグリン膜水溶体が細胞外基質となるタンパク質と結合することにより細胞基底部に強く付着して存在する。強く連結された単層組織の崩壊は上皮細胞としての機能を失い、１次的な腫瘍細胞体から腫瘍細胞が離脱してしまう。
インテグリンは細胞付着に関連する受容体のファミリーであって、細胞付着がインテグリンと細胞外基質との結合により起こる場合、様々な細胞内信号伝達物質が活性化されてその機能を行い、アクチンフィラメントの再構成にも寄与する。インテグリンによる細胞付着と関連する信号伝達物質としてＦＡＫ及びＲｈｏＡ-ＧＴＰａｓｅ（Ｒｈｏ−ＧＴＰase activating protein）などが存在する。
本発明者らは、ＳＮＵ４４９（ＫＣＬＢ Ｎｏ．００４４９）肝がん上皮細胞においてＴＭ４ＳＦ５はインテグリンによる信号伝達と密接に関連していることを確認し、この関連性を下記の観察により推定した：
（１）ＴＭ４ＳＦ５の発現はｐＹ３９７ＦＡＫではなく、ｐＹ５７７ＦＡＫを増加させる。
（２）Ｙ５７７ＦＦＡＫ突然変異はＴＭ４ＳＦ５によるＦＡＫとＲｈｏＧＡＰとの結合を阻害する。
（３）ＴＭ４ＳＦ５の発現はＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰまたはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の相互作用による結合を促すことによりＲｈｏＡの活性を阻害する。
（４）前記機序とは別に、ＴＭ４ＳＦ５の発現は細胞質内に存在するｐ２７ｋiｐ１の発現増加及び安定化に寄与し、これはＲｈｏＡの活性阻害につながる。
すなわち、本発明者らは、前記観察結果に基づいて鋭意努力した結果、ＴＭ４ＳＦ５の分子的なレベルにおける前記ＴＭ４ＳＦ５タンパク質の機能及びその発がん機能を生化学的及び細胞生物学的に究明した。
Ｒｈｏファミリータンパク質の特性
細胞の付着及び離脱と関連するＧＴＰ−結合タンパク質であるＲｈｏファミリータンパク質の代表例としてＲｈｏＡ及びＲａｃ１があるが、これらは、ＧＴＰが結合されると生理的な活性を示し、ＧＤＰが結合されると非活性となってその機能を中止する。一般に、前記Ｒｈｏファミリータンパク質は低いＧＴＰａｓｅ活性を有しており、細胞の付着時に現れる接着斑（focal adhesion、ＦＡ）及びインテグリンの集合と解離に重要な役割を果たす。ＲｈｏＡＧＴＰａｓｅはＲｈｏＡ、Ｒａｃ１及びＣｄｃ４２よりなり、その下位信号伝達媒介分子であるＬＩＭＫ、ＰＡＫ１、ＭＬＣＫ、ｍＤiａ、ＲＯＣＫなどのタンパク質により、アクチン重合体の形成及びマイオシン軽鎖リン酸化を通じてアクチンの再構成に重要な役割を果たす。
ＦＡへの信号伝達成分の集合はＦＡＫの活性に依存するが、これは、ＦＡＫによるタンパク質のリン酸化により他のタンパク質が結合可能な位置が露出されるためである。すなわち、ＦＡＫが欠如した細胞においてはＦＡの形成が増加する。すなわち、ＦＡＫ内チロシンのリン酸化はＦＡ形成を促す。また、ＦＡＫは細胞の運動性にも預かるが、ＦＡＫが過剰発現されると運動性が増加し、浸透能が増加する。
このようなＦＡＫの活性はＲｈｏＡタンパク質と密接に関連しているが、ＦＡＫが欠如した細胞においてはＲｈｏＡ活性が増加されている。これは、ＦＡＫのＣ−末端に結合しているＲｈｏＧＡＰ（Ｒｈｏ−ＧＴＰase activating protein）及びＧＲＡＦ（ＧＴＰase Regulator Associated with ＦＡＫ）がＦＡＫのリン酸化によりＲｈｏＧＡＰを刺激してＲｈｏＡの活性を低下させるためである。
しかしながら、Ｒｈｏファミリータンパク質のうちＲａｃ１は前記ＲｈｏＡの作用とは反対である。すなわち、Ｒａｃ１が活性化されるとＦＡの形成が減少し、細胞の移動を増進させる。細胞の移動を阻害するＦＡ構造物が解離されると、ＦＡの破壊を誘導する成長因子の刺激による細胞移動が促されるためである。
ＴＭ４ＳＦ５の発現によるＦＡＫのリン酸化及びＲｈｏＡの活性低下
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５の発現はｐＹ３９７ＦＡＫではないｐＹ５７７ＦＡＫを増加させ、ＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰまたはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の相互作用による結合を促すということを見出した。
ｐＹ５７７ＦＡＫはＦＡＫタンパク質を構成するアミノ酸のうち５７７番位にあるチロシンをリン酸化させたものである。このため、ＴＭ４ＳＦ５の発現によるｐＹ５７７ＦＡＫの増加はＦＡＫのリン酸化増加を意味し、これは、ＲｈｏＧＡＰタンパク質を刺激してＲｈｏＧＡＰ−ＦＡＫまたはＧＲＡＦ−ＦＡＫ間結合を促し、これは、ＲｈｏＡの活性の低下につながる。しかしながら、Ｒａｃ１の活性は増加する。この明細書における図８に、ＦＡＫ−ＲｈｏＡ間の信号伝達はＲｈｏＧＡＰと関連するという模式図を示している。
ＦＡＫタンパク質の５７７番のアミノ酸であるチロシンをリン酸化（ｐＹ５７７ＦＡＫ）した場合及びｃ−Ｓｒｃタンパク質の４１６番のアミノ酸であるチロシンをリン酸化（ｐＹ４１６ｃＳｒｃ）した場合に、Ｒａｃ１とＲｈｏＡの活性を調べてみた結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてＲａｃ１の活性はいずれも増加するのに対し、ＲｈｏＡの活性はいずれも減少することを確認した（図３及び図５）。このようなＴＭ４ＳＦ５によるｐＹ５７７ＦＡＫの増加とＲｈｏＡ活性阻害の現象は、ＴＭ４ＳＦ５に対するｓiＲＮＡを用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害するとさらに反転することが分かる（図４及び図６）。
さらに、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞において、そうではない母細胞に比べてＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ間の結合、若しくはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合が強く結合することが分かり（図９）、ＦＡＫタンパク質の５７７番のアミノ酸チロシンをフェニルアラニンに置換した突然変異タンパク質を発現させた場合にはＴＭ４ＳＦ５によるＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ間の結合、またはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合が減少する結果を示している（図１０）。
これにより、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてはＦＡＫからＲｈｏＡにつながる一連の信号伝達過程においてｐＹ５７７ＦＡＫが重要な役割を果たすということが推察でき、前記結果を踏まえて、ｐＹ５７７ＦＡＫ発現が減少したり、ＦＡＫ−ＲｈｏＧＡＰ間の結合またはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合が抑制されたり、Ｒａｃ１の活性が減少したり、ＲｈｏＡ活性が促される場合には前記腫瘍形成タンパク質であるＴＭ４ＳＦ５の発現が抑制されることが分かる。
ＴＭ４ＳＦ５の発現による細胞質内ｐ２７ ｋiｐ１ タンパク質の蓄積及びＲｈｏＡの活性低下
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてｐ２７ｋiｐ１タンパク質が顕著に高い濃度にて存在し、これは、細胞質内におけるｐ２７ｋiｐ１ｍＲＮＡ及びｐ２７ｋiｐ１タンパク質の高い安定化に起因することを見出した（図１２）。これに対し、ＴＭ４ＳＦ５が発現されない細胞においてｐ２７ｋiｐ１は、その量も少ないが、存在するほとんどが核に位置している（図１３）。
ｐ２７ｋiｐ１は核中におけるサイクリン依存性キナーゼ（cyclin-dependent kinase：ＣＤＫ）の阻害因子であって、腫瘍抑制機能をすることが知られている。前記ｐ２７ｋiｐ１の細胞質への移動は、細胞周期のＧ０からＧ１に転移される間に１０番のセリン残基がリン酸化されることにより行われる。前記ｐ２７ｋiｐ１Ｓｅｒ１０のリン酸化は、キナーゼのスタスミンとの相互作用（Kinase interacting with Stathmin：ＫiＳ）及びＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質によりなされるか、あるいは、成長が止まっている細胞またはin vitro環境においてＭiｒｋ／ｄｙｒｋ１Ｂ及びＥｒｋ１／２によりそれぞれなされる。
このようなＳｅｒ１０位のリン酸化は、Ｔｈｒ１８７またはＴｈｒ１５７位よりもＴＭ４ＳＦ５の発現とさらに有意に関連しており、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞質内への位置移動及び安定化に寄与する。すなわち、ｐＴ１５７ｐ２７ｋiｐ１とｐＴ１８７ｐ２７ｋiｐ１はＴＭ４ＳＦ５の発現による諸現象との関連性がない。このため、ＴＭ４ＳＦ５が発現される肝がん細胞などにおいてｓｈＲＮＡなどを用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害すると、ｐ２７ｋiｐ１の発現及びセリン１０番の残基のリン酸化が減少し、さらに、細胞質内に存在するｐ２７ｋiｐ１タンパク質もまた減少する（図１９及び図２０）。これは、最近報告されているｐ２７ｋiｐ１Ｓ１０Ａ突然変異タンパク質が発現される形質転換マウスにおいて発がん遺伝子Ｒａｓによるｐ２７ｋiｐ１の細胞質への移動が阻害されるという結果と一致する。
一方、最近の報告によれば、細胞質内に存在するｐ２７ｋiｐ１タンパク質は、直接的に結合してＲｈｏＡを活性化可能なＧＴＰ置換タンパク質（ＧＥＦ）のＲｈｏＡへの結合を抑えることにより、ＲｈｏＡ信号伝達活性を阻害することが知られている。このような細胞質内のｐ２７ｋiｐ１蓄積によるＲｈｏＡ信号伝達間の関係を究明するために、ＲｈｏＧＴＰａｓｅを活性化させたときのｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞内位置変化を調べてみた。ＲｈｏＡを活性化させたり、その下位伝達媒介因子であるｍＤiａを活性化させたり、ＲｈｏＡの活性因子であるＬＰＡを処理した場合、細胞質内のｐ２７ｋiｐ１タンパク質発現レベルもさらに減少する結果を示している（図２７）。これは、ＲｈｏＡ信号伝達が活性化されると、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質がそれ以上安定化できず、細胞質ではない核中に位置してしまうためである。すなわち、細胞質内のｐ２７ｋiｐ１とＲｈｏＧＴＰａｓｅとの間には相互調節の連結環が存在する。このため、ＴＭ４ＳＦ５の発現はｐ２７ｋiｐ１の発現増加及び細胞質における安定化に寄与し、これは、ＲｈｏＡタンパク質の活性阻害につながる。
しかしながら、ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１蓄積に基づくＲｈｏＡ活性阻害現象と、ＴＭ４ＳＦ５によるＦＡＫ／ＲｈｏＧＡＰｓタンパク質間の結合に基づくＲｈｏＡ活性阻害現象は別々に起こる信号伝達経路である。これは、Ｙ５７７Ｆ ＦＡＫ突然変異タンパク質（チロシン５７７番がフェニルアラニンに変わった変異体）を過剰発現させると、ｐ２７ｋiｐ１の発現とセリン１０番の残基のリン酸化にはいかなる影響も与えないためである（図１８）。
また、ｐ２７ｋiｐ１の細胞質内の蓄積は、前記ＲｈｏＡ活性とは対照的にＲａｃ１タンパク質は活性化させる。すなわち、活性化されたＲａｃ１及びその下位伝達媒介体であるＰＡＫ１の発現はｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞質内蓄積を引き起こす（図２７の下）。
ＴＭ４ＳＦ５によるＲｈｏＡの活性低下に基づく細胞形態の変化
ＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞である肝がん細胞（ＳＮＵ４４９）のアクチンは強い繊維状の構造に広がった多角形の細胞形態を維持しており、ＴＭ４ＳＦ５が発現された細胞（ＳＮＵ４４９Ｔｐ）におけるアクチンは非正常的な束が長いロッド細胞形態に沿って形成されている（図２）。
このような細胞形態の変化に預かる信号伝達を媒介するＲａｃ１の活性及びＲｈｏＡの活性について、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてＲａｃ１の活性は増加するのに対し、ＲｈｏＡの活性は減少する。これは、ＴＭ４ＳＦ５に対するｓiＲＮＡを用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害することにより再び反転される。すなわち、前記ｓiＲＮＡが導入された細胞は母細胞と同様に強い繊維状のアクチン構造を有する多角形の細胞形態に復元されるが、そうではない細胞は依然としてＴＭ４ＳＦ５発現の影響により非正常的な束が形成された細胞形態を構成する（図７）。
また、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞はｐ２７ｋiｐ１が高く発現されるという特徴があるため、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質の変化もまた細胞形態の変化に影響する。ＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞にｐ２７ｋiｐ１を過剰発現させると、細胞の形態が長くなり（図２２）、これとは逆に、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてｐ２７ｋiｐ１の発現阻害またはセリン残基のリン酸化を阻害する突然変異であるｐ２７ｋiｐ１Ｓ１０Ａを処理すると、細胞の形態も多角形の母細胞と同じ形態に変化する（図２３）。
要するに、前記細胞質のｐ２７ｋiｐ１による細胞形態の変化とＲｈｏ信号伝達との間の関係と関連して、ＴＭ４ＳＦ５が発現された細胞においてＲｈｏＧＴＰａｓｅが活性化（ＲｈｏＡ活性化、ｍＤiａ活性化またはＬＰＡ処理）されると、ＲｈｏＡ信号伝達の活性化によりｐ２７ｋiｐ１タンパク質がそれ以上安定化できずに核中に位置してしまい、細胞質におけるｐ２７ｋiｐ１タンパク質の発現レベルが減少し、長尺状の細胞形態が母細胞と同じ多角形に戻る。これに対し、活性化されたＲａｃ１及びその下位伝達媒介体であるＰＡＫ１の発現はＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞の形態を長く変化させ、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞質内蓄積を引き起こす（図２７）。
このため、結論的に、細胞質内のｐ２７ｋiｐ１とＲｈｏＧＴＰａｓｅとの間には相互調節の連結環が存在し、細胞質のｐ２７ｋiｐ１によるＲｈｏＧＴＰａｓｅの活性調節はＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞形態の変化を誘導するということである。このような細胞形態の変化は後述する現象とも関連がある。
ＴＭ４ＳＦ５の発現によるＥＭＴ現象及び細胞間接触
（１）細胞間接触現象の減少及び上皮間葉転換の（ＥＭＴ、epithelial-mesenchymal transition）誘導
本発明者らは、ＴＭ４ＳＦ５発現による細胞質へのｐ２７ｋiｐ１の蓄積は細胞−細胞間接触消失及びＥＭＴ現象を誘導することを見出した。
細胞間の接触におけるＲｈｏＡタンパク質の活性変化は細胞の種類とその信号伝達の特徴に依存するが、上述したＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１タンパク質の蓄積によるＲｈｏＡの活性阻害現象は細胞中のアクチン構造の変化をもたらし、これは、カドヘリン／カテニンタンパク質複合体を通じての細胞−細胞接触とも関連する。
ＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞においては、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ１、デスモプラキンなどの細胞接触タンパク質が多量発現し、細胞接触部位によく整列して存在する。これに対し、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においては、前記細胞接触タンパク質の発現は減少されているだけではなく、細胞間接触が上手になされず、散発的な発現パターンを示す（図２９）。しかしながら、Ｅ−カドヘリンの発現抑制転写因子であるｓｎａiｌ１もまた同時発現減少されることにより、ｓｎａiｌ１に非依存的で、且つ、ＴＭ４ＳＦ５に依存的なＥ−カドヘリンの発現減少を示す（図２９）。
これに対し、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞には、上皮間葉転換（ＥＭＴ、epithelial-mesenchymal transition）に預かるＳＭＡタンパク質（図２８）及びビメンチンタンパク質が高く発現される。このような上皮細胞の移動は細胞の形態形成及び傷治癒などの生理的な過程に重要な役割を果たし、慢性炎症及び腫瘍転移過程に預かる。
ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１タンパク質の蓄積によるＲｈｏＡの活性阻害現象はアクチンフィラメントの非正常的な再構成を誘導するため、細胞の形態が長くなり、このような細胞形態の変化は細胞−細胞間の吸着が崩壊するＥＭＴ現象を誘導する。要するに、ＴＭ４ＳＦ５によるＳＭＡタンパク質の発現とＥＭＴ現象はＲｈｏＡの活性阻害により起こり、細胞形態の長さの変化につながると言える。
このため、ＴＭ４ＳＦ５が発現された細胞においてｐ２７ｋiｐ１タンパク質の発現を阻害すると、ＥＭＴ現象が阻止されながら細胞−細胞接触が維持される。これは、ｐ２７ｋiｐ１の発現が阻害されることにより、ｐ２７ｋiｐ１が細胞質ではない核内にさらに多く蓄積されることにより、長く伸びていた細胞の形態が母細胞と同じ多角形の細胞形態に変わるためである。このように、ｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞内における位置、すなわち、核と細胞質における位置調節は細胞の形態と細胞との間の接触形成に寄与する。
加えて、内生性のＴＭ４ＳＦ５を有するＨｕｈ７肝がん細胞株に対してｓｈＲＮＡを用いてその発現を阻害すると、ＨＧＦによる細胞間の接触消失現象が阻害されるため、前記ＴＭ４ＳＦ５はある信号伝達体系下において本質的にＥＭＴを誘導すると考えられる。
（２）接触阻止現象の消失
本発明者らはＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においては前記ＥＭＴ現象により細胞間に高密度にて互いに接触される環境においても隣り合う細胞の存在を認知できずに持続的に細胞分裂及び増殖を維持する、すなわち、細胞接触による生長阻止現象が失われることを確認した。
生長の接触阻止現象は、細胞が隣り合う他の細胞と接触したときにそれ以上分裂せず生長が止まるような現象を意味する。既存の報告によれば、Ｅ−カドヘリンによる細胞−細胞接触は細胞の増殖と腫瘍生成を抑制することが知られており、最近の報告文献によれば、接触阻止が起こる間に細胞の広がり現象が減少し、成長が止まるということである。このため、ＥＭＴ現象などにより細胞が互いに接触されていないならば、細胞は隣り合う他の細胞を認識することができずに継続的な分裂をする結果、接触阻止現象が失われるであろう。
ＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞は多角形の細胞形態を帯びるため、増殖していて、経時的に接触阻止現象によりそれ以上生長しなくなるという飽和曲線を描くが、ＴＭ４ＳＦ５が発現される長い形態の細胞は細胞間接触消失を誘導するために核が重なり合って存在する程度に細胞が密集しているにも拘わらず、継続的な細胞分裂が起こる（図３３）。
また、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においては母細胞に比べてＳ期に存在する細胞集団がさらに多く（図３５）、ｓｈＲＮＡを用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害すると、Ｓ期に存在するこのような細胞集団が減る（図３６）。
すなわち、ＴＭ４ＳＦ５の発現による細胞間接触現象減少及びＥＭＴ現象は細胞生長の接触阻止現象を消失させる。図５７は、これに対する模式図を示している。図５７によれば、発がん遺伝子であると推定されるＴＭ４ＳＦ５の過剰発現は細胞質内のｐ２７ｋiｐ１の発現及び安定化を引き起こし、これは、ｈＫiＳまたはＰＫＢ／Ａｋｔによるセリン１０番の残基のリン酸化によるものであり、ＴＭ４ＳＦ５によるｐＹ５７７ＦＡＫとＦＡＫ／ＲｈｏＧＡＰｓとの結合によりＲｈｏＡの活性が阻害される。Ｒａｃ１の活性はＲｈｏＡの不活性化と相反する関係をもって存在するが、ＲｈｏＡとＲａｃ１の下位信号伝達媒介体であるｍＤiａとＰＡＫはアクチンの構造変化と細胞内の収縮性を調節してしまい、これは、細胞形状の変化につながるため、このような細胞形態の変化は細胞間接触消失現象を誘導して、隣り合う細胞を認識できずに継続的に生長してしまい、接触阻止現象を引き起こしてしまうのである。
ＴＭ４ＳＦ５による細胞移動、浸潤及びがん転移
上述したように、ＴＭ４ＳＦ５の発現と関連があるＦＡＫが過剰発現されたり、Ｒａｃ１が活性化されると、細胞の運動性が増加し、Ｒｈｏ活性及びＥＭＴ現象による上皮細胞の移動は細胞の形態形成及び傷治癒などの生理的な過程に重要な役割を果たし、さらに、慢性炎症及び腫瘍転移過程に必須である。
このため、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株の場合の方が、発現されない細胞株に比べて移動性が大きい（図５８及び図５９）。このような細胞の移動に伴い、細胞は付着部位から分離されて周りの細胞外基質内に浸潤される。ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞は細胞外基質を構成するコラーゲンゲルにＴＭ４ＳＦ５を発現しない細胞よりもさらに効率よく浸潤するだけではなく（図６０）、様々な細胞外基質複合体であるマトリゲルに効率よく浸潤する（図６１）。
前記作用は部分的にＭＭＰｓ（matrix metalloproteinase）のタンパク質分解作用によりなされる。ＭＭＰｓはＺｎ２＋依存的なペプチド分解酵素であって、細胞の基質を分解する能力を有している。これらのうちＭＭＰ−２とＭＭＰ−９はゼラチンとフィブロネクチン基質を分解するが、これらは、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞（ＳＮＵ４４９Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７及びＴ１６など）内においてその活性が高い（図６２）。特に、ＭＭＰ−９は酵素活性だけではなく、遺伝子発現活性も高い（図６２の途中）。
ヌードマウスがん転移モデルを用いた実施例９から明らかになったように、ＴＭ４ＳＦ５を発現するがん細胞において前記細胞移動性及び浸潤性由来のがん転移性はin vivoにおいても現れる。
総合的にみたとき、ＴＭ４ＳＦ５の腫瘍誘導因子としての機能はin vitro細胞とin vivo動物においていずれも細胞の成長が適切に調節されずに継続的に分裂させるため、肝がん細胞などにおいてＴＭ４ＳＦ５の発現はＦＡＫのリン酸化増加及び細胞質内のｐ２７ｋiｐ１タンパク質の蓄積によるＲｈｏＡタンパク質の活性阻害を引き起こして、持続的な細胞成長、顕著な細胞周期Ｓ期への進入、細胞形態の変化及び付着−非依存的な生長を引き起こす。そして、このＴＭ４ＳＦ５の発現細胞株をヌードマウス（in vivo動物）に注入すると腫瘍が形成される。
そこで、本発明者らは、腫瘍誘導因子として働くＴＭ４ＳＦ５（transmembrane 4L 6 family member 5）発現と関連する上記の様々な細胞生物学的及び生化学的現象に基づいて抗がん物質のスクリーニング方法を発明した。
本発明において使用する「抗がん」という用語は、がんの成長を抑制または予防するものを意味する。「がんの成長を抑制または予防する」とは、治療または処理しなかったときと比較時にがんの成長及びがん転移を減少させることを含む概念である。前記「がん転移」は腫瘍（がん）細胞が身体の遠く離れた部分に拡散される過程を意味する。この明細書において前記用語は転移過程により発生されるがんも含む。
本発明の方法においては配列番号２で表わされるポリペプチドを発現するがん細胞を培養する。前記ポリペプチドを発現する代表的な場合として、配列番号１で表わされるポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号２で表わされるポリペプチドを発現するがん細胞はＴＭ４ＳＦ５タンパク質を発現する細胞株であって、一具体例として、上皮細胞においてＴＭ４ＳＦ５が持続的に発現されるＳＮＵ４４９肝がん細胞株（ＫＣＬＢ Ｎｏ．００４４９）を製作し、これを培地において培養することにより行うことができる。前記ＳＮＵ４４９細胞の代わりにＳＮＵ３９８細胞（ＫＣＬＢ Ｎｏ．００３９８）を使用してもよい。
本発明において、配列番号１で表わされるヌクレオチドからポリペプチドを発現するがん細胞としては、例えば、すい臓がん細胞、胃がん細胞、肝がん細胞、大腸がん細胞、脳がん細胞、または肺がん細胞または人為的に製造したがん細胞などが挙げられるが、ＴＭ４ＳＦ５腫瘍タンパク質を発現する細胞であれば非制限的に使用可能である。上記の「人為的に製造したがん細胞」としては、例えば、遺伝子操作を含むクローン技術によりＴＭ４ＳＦ５腫瘍タンパク質を発現する細胞が挙げられる。
本発明の方法は、次いで、前記工程において培養された細胞を抗がん候補物質にて処理するステップを含む。好ましくは、ＴＭ４ＳＦ５が細胞内において特異的に誘導する現象を調節すると予想される化合物を処理する。
最後に、抗がん候補物質にて処理しない場合と比較して、前記処理した化合物が後述する抗がん機能のうち１以上の機能を示す物質を抗がん物質として決定する。
本発明においては、前記物質の抗がん機能を、上述したＴＭ４ＳＦ５発現と関連する様々な細胞生物学的及び生化学的現象を基に以下のように定義する：
（ｉ）ＦＡＫの５７７番のチロシン位置のリン酸化減少
（ｉｉ）ＦＡＫ−ＲｈｏＧＡＰ、もしくはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合抑制
（ｉｉｉ）細胞質内ｐ２７Ｋiｐ１タンパク質発現減少
（ｉｖ）ＲｈｏＡの活性増加
（ｖ）Ｒａｃ１の活性減少
前記方法において、ＴＭ４ＳＦ５発現による細胞の形態及び細胞接触パターンと関連する上述した特徴に基づいてさらに後述する抗がん機能のうち１以上の機能を示す物質を抗がん物質として決定する：
（ｖｉ）細胞の形態がロッド状から多角形に戻る
（ｖｉｉ）細胞接触関連タンパク質の発現減少
（ｖｉｉｉ）細胞−細胞間接触が維持される
（ｉｘ）細胞生長の接触阻止現象が現れる
（ｘ）ＳＭＡ（α−smooth muscle actin）タンパク質またはビメンチンタンパク質の発現減少、またはＥ−カドヘリンタンパク質の発現増加
（ｘｉ）上皮間葉転換（ＥＭＴ）減少
このとき、（ｖｉｉ）における前記細胞接触関連タンパク質はＥ−カドヘリン、ＺＯ１（zonula occludens−１）、β−カテニン及びデスモプラキンよりなる群から選ばれ、（ｉｘ）における前記細胞生長の接触阻止の現象は、細胞数の減少、細胞周期のＳ期に存在する細胞集団の減少または多層増殖の抑制を意味する。すなわち、多層増殖が抑制されて細胞が接触されると単層にのみ伸び、それ以上増殖がなされないことを言う。また、前記細胞数の減少または細胞周期のＳ期に存在する細胞集団の減少は、前記ＴＭ４ＳＦ５及びそれと相互作用する膜タンパク質のＮ結合型グリコシレーションの不活性によりなされる。
加えて、上記の方法において、ＴＭ４ＳＦ５による細胞の移動性、浸潤性増加と関連する上述した特徴に基づいてさらに後述する抗がん機能のうち１以上の機能を示す物質を抗がん物質として決定することもできる：
（ｘｉｉ）細胞外基質若しくは血清の存在下における細胞の移動又は運動性減少
（ｘｉｉｉ）細胞外基質を構成するコラーゲンゲル中における浸潤性抑制
（ｘｉｖ）細胞外基質複合体であるマトリゲル中における浸潤性抑制
（ｘｖ）ＭＭＰ活性減少（発現減少）
このとき、前記ＭＭＰの好適な例として、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９が挙げられる。
すなわち、腫瘍誘導因子、若しくは、ＥＭＴ誘導因子ＴＭ４ＳＦ５の発現の抑制は、ＦＡＫのリン酸化または活性変化阻害、細胞質内のｐ２７Ｋiｐ１発現蓄積によるＲｈｏＡ活性低下阻害、Ｒａｃ１及びＲｈｏＡを含むＲｈｏＧＴＰａｓｅの活性変化による細胞形態の変化阻害、上皮間葉転換［分化、ＥＭＴ現象（Epithelial-Mesenchymal Transition）または変換分化］の誘導抑制、Ｓ期への進行抑制、接触抑制の消失により、結果的に多層増殖の誘導抑制、吸着−非依存的な増殖またはソフトアガー内における増殖抑制、細胞移動性及び浸潤性阻害、ヌードマウスにおけるがん遺伝子発現がん細胞の注入による腫瘍形成及び転移抑制などの諸現象により確認することができる。
本発明は、他の観点において、前記方法によりスクリーニングされた、ＴＭ４ＳＦ５に対する抗がん機能を有する抗がん物質に関する。「ＴＭ４ＳＦ５に対する抗がん機能」とは上述した通りである。好ましくは、下記の化学式１または２で表わされるカルコン系の化合物を抗がん物質として決定する。

式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、好ましくは、メチル、ベンジル、ｐ−トルイル、ｐ−ニトロフェニルまたはｐ−フルオロフェニルである。

式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールであり、好ましくは、メチル、ベンジル、ｐ−トルイル、ｐ−ニトロフェニルまたはｐ−フルオロフェニルである。
本発明の抗がん物質は、さらに好ましくは、下記表１に記載のカルコン系の化合物である。表１の化合物のうち化合物１で示すＴＳＡＨＣ［４’−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン］が代表的な化合物である。



前記表１に記載の化合物１から９７はそれぞれ以下の通りである。
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（メタンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−フルオロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−フルオロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ニトロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−アミノベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（メタンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
３'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
２'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｏ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（メタンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−トルエンベンゼンスルホニルアミノ）−２−クロロ−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２−ヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
４'−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、５−ジヒドロキシカルコン
大韓民国公開特許１０−２００３−００３６９９３にはカルコン系の化合物が基底膜成分を分解するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性を阻害する性質を有していることを記載しているが、カルコン系の化合物の抗がん機能については全く言及していないだけではなく、本発明の前記化学式１または２で表わされるカルコン系の化合物はその構造上スルホン基（ＳＯ３−）またはスルホンアミド基（ＳＯ２ＮＨ−）を含有していることを特徴としている。すなわち、カルコン系の化合物のＴＭ４ＳＦ５に対する抗がん活性（機能）は前記スルホン基（ＳＯ３−）由来のものである。
特に、この明細書の実施例１２において、カルコンのＡ−リング（左リング）にＯＨ、ＮＨ２、またはＯＣＨ３を置換基として有している場合には、ＴＭ４ＳＦ５の機能を通じて多層構造に伸びる現象を阻害する抗がん性が観察されないが、本発明のカルコン系の化合物でのようにスルホニル基が導入されたスルホンアミドカルコンまたはスルホネートカルコンにおいてはＴＭ４ＳＦ５機能阻害による抗がん活性が観察されることを示している。すなわち、カルコン化合物において、「スルホン基（スルホニル）」の導入は現在知られているカルコン誘導体とは全く異なる独特な抗がん活性を発現させる。
本発明の実施例においては、これらのうち代表的な化合物であるＴＳＡＨＣ［４’−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン］（表１の１番化合物）を用いて抗がん機能を確認した。
前記カルコン系の化合物はＴＭ４ＳＦ５による現象を特異的に阻害する拮抗剤として機能する。ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株に、前記ＴＳＡＨＣを含むカルコン系の化合物のうち１以上を処理すると、継続的な生長曲線がカルコン系の化合物の濃度、処理時間により依存的に減少し（図４３の右）、細胞周期Ｓ期への進入（図４４）、及び細胞間の接触が復活される（図４５）。これに対し、本発明のカルコン系の化合物薬物の効果はＴＭ４ＳＦ５が発現されない細胞においては全く効果がないことが判明された（図４３の左）。
さらに、ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１、ｐＳ１０ｐ２７ｋiｐ１、ｐＹ５７７ＦＡＫの発現の度合い及びＳＭＡまたはビメンチンの発現においても、前記カルコン系の化合物により効果的に減少し（図４６）、ＴＭ４ＳＦ５が発現されたＳＮＵ４４９細胞株であるＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞株に本発明のカルコン系の化合物を処理すると、細胞質に存在するｐ２７ｋiｐ１がそれ以上安定化できずに減少する（図４７）。
本発明のカルコン系の化合物、特にＴＳＡＨＣは腫瘍誘導因子ＴＭ４ＳＦ５及びそれと相互作用する膜タンパク質のＮ結合型グリコシレーション活性に影響を与えて、ＴＭ４ＳＦ５が細胞膜において（若しくは、テトラスパニン−ウェブ）インテグリンなどを含む他のタンパク質との結合を通じて発がん機能を行う上で妨害若しくは抑制効果を来たす。
このような側面は、ＴＳＡＨＣを処理時にＴＭ４ＳＦ５のＮ結合型グリコシレーション部分のＦＮＧａｓｅＦに対する感受性の向上により確認することができる（図５０）。このため、本発明のＴＳＡＨＣなどのカルコン系の化合物はＴＭ４ＳＦ５そのものを攻撃してＮ結合型グリコシレーション作用の構造的な面に変化を与えてＴＭ４ＳＦ５のタンパク質−タンパク質結合（テトラスパニン−ウェブ内における結合）に影響を与えることにより、ＴＭ４ＳＦ５による発がん機能を抑制すると類推することができる。
加えて、本発明のカルコン系の化合物はＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞におけるＲｈｏＡの活性阻害現象を修復させ（図４８）、長く変化されていた細胞の形態から多角形の形態に復帰させる（図４９）。これは、ＴＭ４ＳＦ５が発現による諸現象を抑制していることを示す結果であって、ＴＭ４ＳＦ５に対して拮抗剤として働く本発明のカルコン系の化合物に対してＴＭ４ＳＦ５による腫瘍形成の治療薬物としての効能を予測可能にする。
また、ＴＭ４ＳＦ５による細胞の移動、浸潤現象もまた本発明のカルコン系の化合物、例えば、ＴＳＡＨＣにより効率よく阻害される。すなわち、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株はＴＳＡＨＣを処理することにより細胞の移動性（図６５）、コラーゲンゲルにおける浸潤性（図６６）及びマトリゲルにおける浸潤性（図６７）がいずれも有効に阻害される。これは、本発明のカルコン系の化合物が細胞の移動性に預かるＭＭＰｓの酵素活性を阻害することを意味し（図６８）、これは、ＴＳＡＨＣがＴＭ４ＳＦ５による腫瘍誘導だけではなく、腫瘍細胞の転移過程をも有効に阻害可能であることを示唆している。
本発明は、さらに他の観点において、前記カルコン系の化合物のうち、好ましくは、前記表１に記載の化合物のうちいずれか１種若しくはそれ以上を有効成分として含有する抗がん用組成物を含む。この明細書の実施例８においては、表１に記載の化合物のうち１種（ＴＳＡＨＣ）のみを処理しても抗がん機能を示すことを確認した。
本発明による前記カルコン系の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態であるカルコン誘導体の形態で使用することができる。
前記塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸により形成された酸付加塩が有用である。すなわち、前記カルコン誘導体は当該技術分野における通常の方法により薬学的に許容される酸付加塩から形成可能である。遊離酸としては、無機酸と有機酸を使用することができ、無機酸としては、塩酸、臭酸、硫黄酸、リン酸などを使用することができ、有機酸としては、クエン酸、酢酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、コハク酸、酒石酸、４−トルエンスルホン酸、エムボン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸などを使用することができる。好ましくは、無機酸としては塩酸、有機酸としてはメタンスルホン酸を使用することができる。
また、本発明による前記カルコン誘導体は、薬学的に許容可能な塩だけではなく、通常の方法により製造可能なあらゆる塩、水和物、溶媒和物をいずれも含むことができる。
臨床的な使用のために、本発明による前記カルコン系の化合物またはその塩形態などは単独で投与可能であるが、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩解剤、コーティング物質、乳化剤、懸濁剤、溶媒、安定化剤、吸収促進剤及び／または軟膏基材を混合することにより特定の使用及び好適な目的に適するように剤型化された薬剤学的な混合物の形態で一般的に投与可能である。前記混合物は、経口用、注射用、直腸用または外用投与用として使用可能である。
さらに詳しくは、上述したように、前記カルコン系の化合物またはその塩を含有する前記薬剤学的な抗がん用組成物は経口的に投与可能であり、例えば、錠剤、コーティング錠剤、糖衣錠、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤、液剤、乳化剤または懸濁剤などの剤型であってもよい。また、投与は、直腸に投与、例えば、座剤を用いて投与可能であり、局所的または経皮的に投与、例えば、軟膏、クリーム、ゲルまたは液剤を用いて投与可能であり、または、非経口的に投与、例えば、注射用の溶液を用いて投与可能である。
錠剤、コーティング錠剤、糖衣錠、硬質または軟質ゼラチンカプセル剤の製造のために、本発明のカルコン系の化合物は薬剤学的に不活性な無機または有機賦形剤（薬剤学的に許容される担体）と一緒に混合可能である。錠剤、コーティング錠剤、糖衣錠、硬質ゼラチンカプセル剤に適当な賦形剤の例には、ラクトース、メーズ澱粉またはその誘導体、タルクまたはステアリン酸またはその塩が含まれる。軟質ゼラチンカプセル剤に用いられて好適な賦形剤には、例えば、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固形または液体ポリオールなどが含まれる。しかしながら、活性成分の性質により、軟質ゼラチンカプセル剤にいかなる賦形剤も不要になる場合がありうる。液剤及びシロップ剤の製造のために使用可能な賦形剤には、例えば、水、ポリオール、スクロース、転化糖及びグルコースが含まれる。注射用の溶液の製造のために使用可能な賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物性オイルが含まれる。座剤及び局所または経皮適用用の製造のために使用可能な賦形剤には、例えば、天然オイルまたは硬化油、ワックス、脂肪及び半固形または液体ポリオールが含まれる。
さらに、前記薬剤学的な組成物は、保存剤、溶解剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、色素、芳香剤、浸透圧調節用の塩、緩衝剤、コーティング剤または抗酸化剤を含むことができ、それらは治療学的に価値のある他の薬剤を含むこともできる。
結果的に、経口投与用の薬剤学的な剤型は顆粒剤、錠剤、糖コーティング錠剤、カプセル剤、丸剤、懸濁剤または乳化剤であってもよく、非経口用の剤型、例えば、靜脈内、筋肉内または皮下、剤型用としては滅菌水溶液の剤型が使用可能であり、これは、等張性溶液を作成するために他の物質、例えば、塩またはグルコースを含むことができる。抗腫瘍剤は、また、座剤またはペッサリーの剤型にて投与可能であり、または、ローション、溶液、クリーム、軟膏または散布剤の形態で外用的に適用可能である。
本発明のカルコン系の化合物の１日容量レベルは経口または非経口用に投与されるときに５〜２０００ｍｇである。１回投与または２回以上の分割投与が可能である。しかしながら、実際の投与量は投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び疾患の重症度などの種々の関連因子に照らして決定する必要がある。このため、前記投与量はいかなる方法によっても本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
特に、下記の実施例においては肝がん細胞株だけを使用しているが、この他にも、すい臓がん細胞、胃がん細胞、肝がん細胞、大腸がん細胞、脳がん細胞、乳房がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、食道がん、膀胱がん、または肺がん細胞などのヒト由来の様々な種類のがん組織及びがん細胞株が使用可能であるということは当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１：ＴＭ４ＳＦ５によるがん細胞培養
（１）細胞株樹立
ＴＭ４ＳＦ５（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．：ＮＭ−００３９６３）が持続的で且つ安定的に発現される細胞株を樹立するために、ヒトの肝がん細胞であるＳＮＵ４４９細胞（ＫＣＬＢ Ｎｏ．００４４９）に対照群ベクターであるｐＬＮＣＸ（Clontech Laboratories inc.、PaloAlto、ＣＡ）とＴＭ４ＳＦ５入りｐＬＮＣＸを有するレトロウィルスを感染させた。
ＴＭ４ＳＦ５発現レトロウィルスを作成するために、プラスミドｐＬＮＣＸのＨiｎｄ III／ＣｌａＩ制限酵素サイトに、Ｈｕｈ７（ＪＣＲＢ Ｎｏ．０４０３）細胞のｃＤＮＡプールからＰＣＲ方法により得たｃＤＮＡを挿入した後、ＰＴ６７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１２２８４）に導入して安定的にＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞を得て培養することにより、ＴＭ４ＳＦ５を発現するレトロウィルスを製作した（Experimental Cell Research, 312:2983, 2006）。以下、前記対照群ベクターを挿入したＳＮＵ４４９細胞はＳＮＵ４４９Ｃｐ（またはＣｐ）で表記し、ＴＭ４ＳＦ５が発現させてなるＳＮＵ４４９細胞はＳＮＵ４４９Ｔｐ（またはＴｐ）で表記する。
ＴＭ４ＳＦ５発現レトロウィルスをＳＮＵ４４９細胞に感染させた後、形成された細胞集団を全て集めた細胞株（ＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ）と単一細胞集団を分離して樹立した細胞株（ＴＭ４ＳＦ５が発現されるＴ３、Ｔ７、Ｔ１１及びＴ１６細胞）を樹立した。
そして、ＴＭ４ＳＦ５の発現が抑制されるＨｕｈ７細胞株を作成するために、ＴＭ４ＳＦ５に対するｓｈＲＮＡを導入した後、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）を用いてｓｈＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞だけを選択的に分離した。この細胞株に対して１０％ＦＢＳ、０．２５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した後、２００μｇ／ｍｌのＧ４１８入りまたは２００μｇ／ｍｌのＧ４１８未添加のＲＰＭi−１６４０培地において５％ＣＯ２及び３７℃の培養機により培養して使用した。
（２）材料及び方法
１．ＴＭ４ＳＦ５抗体の製作
ｐＧＥＸ−５Ｘ２ベクター（Phamacia Biotech.）にＴＭ４ＳＦ５のｃ−末端部位（アミノ酸２２９番から５９４番までを制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて切断）を挿入製作してその塩基配列を確認した。ＤＨ５αバクテリアからＩＰＴＧに誘導された組換えタンパク質を得るために０．３％ＳＤＳとタンパク質分解酵素阻害剤が含まれているＰＢＳを用いた。タンパク質抽出後、電気泳動されたＳＤＳゲルから抗原を抽出してマウスに免疫した。合計で３回の免疫反応を誘導した後、マウスから血清を得て組換えタンパク質と動物細胞抽出物に対する免疫反応性を検査した。
２．タンパク質分離及びウェスタンブロット分析
様々な実験条件において得られた細胞溶解物を、種々の条件下の細胞をＰＢＳ溶液により洗い取った後にＲＩＰＡ緩衝溶液を用いて用意した。特定の場合、明示された発現ベクターを導入したり、ＴＭ４ＳＦ５に対するｓｈＲＮＡを発現させたり、ｐ２７ｋiｐ１に対するｓiＲＮＡを発現するアデノウィルスを感染させる条件の細胞が用いられた。
加えて、１０μＭのシクロヘキシミドを明示した時間中に処理した細胞も用いられた。このような溶解物のタンパク質は定量化して同量使用され、ホスホ−Ｙ５７７ＦＡＫ、ホスホ−Ｙ４１６Ｓｒｃ、ｃ−Ｓｒｃ、ＲｈｏＡ、ｐ１２０ｃｔｎ、β−カテニン、ｐＳ１０ｐ２７ｋiｐ１、ＦＡＫ、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ１、Ｒａｃ１、ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ、ｐ２７ｋiｐ１、ＧＲＡＦ、ｈＫiＳ、デスモプラキン、α−チューブリン、α−カテニン、さらにα−smooth muscle actin（ＳＭＡ）に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。
３．免疫蛍光染色法分析
細胞内のタンパク質を蛍光免疫染色するために、細胞を１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ−１６４０により予めコーティングしておいたカバーガラスの上に載せ、細胞の形態が揃って完全に付着するまで３７℃において一日中培養した。細胞に上述の特定の遺伝子を導入させたり様々なウィルスを感染させる場合には、上記した時間中に培養した後に使用したり、１０ｍＭリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）を処理した細胞はカバーガラスに付着させた後、１時間かけて処理した後に使用した。蛍光免疫染色法は当該タンパク質の１次抗体を反応させた後、余剰の抗体を洗い取った後、蛍光物質が付着された２次抗体と反応させて再び洗い取って蛍光分析可能なスライドを作成し、アクチンの染色法はローダミンが付着されたファロイジンを反応させて行われた。
使用された抗体はＥ−カドヘリン、β−カテニン、ＦＬＡＧ、ＤＡＰＩ（４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン）、ｐ２７ｋiｐ１、さらにＺＯ１（zonula occludens−１）などが使用された。蛍光免疫染色がなされたカバーガラスは観察のためにスライドに載せて蛍光顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡により観察した。
４．ＲＴ−ＰＣＲ
Ｐ２７ｋiｐ１のｍＲＮＡレベルを調べるためにＲＴ−ＰＣＲをＴＭ４ＳＦ５非発現若しくは発現細胞株にアクチノマイコンＤを処理して様々な時間帯に細胞からトータルＲＮＡを抽出してそれからｍＲＮＡを得た後、ｐ２７Ｋiｐ１に対するプライマーを用いてＰＣＲ方法により行った。使用されたプライマーはセンス（５’−ｔａａ ｃｃｃ ｇｇｇ ａｃｔ ｔｇｇ ａｇａ ａｇ−３’：配列番号３）とアンチセンス（５’−ｇｃｔ ｔｃｔ ｔｇｇ ｇｃｇ ｔｃｔ ｇｃｔ ｃ−３’：配列番号４）であった。
５．ｐ２７ｋiｐ１の細胞質タンパク質層と核タンパク質層の分画化
ＴＭ４ＳＦ５が発現されるＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞とＴ１６細胞におけるＰ２７ｋiｐ１の細胞質発現と核内発現量を調べるためにLiangら（Nature Medicine, 8:1153-1160, 2002）が提示した方法により分画化が行われた。
６．ソフトアガーアッセイ
６０ｍｍ培養皿に０．７％アガーと１０％ＦＢＳが含まれた培養液を予め敷いて固めた後、その上に１０６個の細胞を０．３％アガーと１０％ＦＢＳが含まれた細胞培養液と一緒に投入した。これらの培養皿は５％ＣＯ２が与えられる３７℃培養機において２５日間培養され、２日おきに２００μｇ／ｍｌＧ４１８と１０％ＦＢＳが含まれた培養液に交替した。形成された細胞集団はデジタルカメラ付き顕微鏡により観察、記録した。
７．統計の分析
データの意味のある差を得るために平均値の比較をスチューダントｔ−ｔｓｅｔにより行った。ｐ値が０．０５以下である場合にその差は意味あると言える。
実施例２：ＴＭ４ＳＦ５によるｐＹ ５７７ ＦＡＫタンパク質発現及びＲｈｏＡの活性阻害
（１）ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞の形態学的な特性
実施例１において樹立されたＴＭ４ＳＦ５が発現されないＳＮＵ４４９母細胞（ＳＮＵ４４９ｐまたはｐ）、対照群ベクターが持続的に発現されるＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞及びＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株（ＳＮＵ４４９Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７、及びＴ１６）に対する各細胞の形態を光学顕微鏡を用いて確認し、さらにＴＭ４ＳＦ５に対する抗体及びα−チューブリンに対する抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
そして、ＴＭ４ＳＦ５の発現有無による細胞の様々なアクチン構造を調べるために、対照群細胞（ＳＮＵ４４９Ｃｐ）及びＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞（ＳＮＵ４４９Ｔｐ）をガラスカバースリップの上に生長させた後、ファロイジンが付着されたローダミンにより染色した。
その結果、クローン由来のＴ３、Ｔ７、Ｔ１６及びＴｐはＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞であるＳＮＵ４４９ｐ細胞と比較したとき、細胞形態の側面においてその長さの伸張が起こっていることが確認された（図１）。そして、ＳＮＵ４４９細胞のアクチンを蛍光染色法により染色して観察した結果、強い繊維状の構造に広がった多角形の細胞形態を維持しており、ＴＭ４ＳＦ５が発現されるＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞においてアクチンは非正常的な束が長い細胞形態に沿って形成されていた（図２）。
（２）ｐＹ５７７ＦＡＫ発現による効果
上述した細胞形態の変化に預かる信号伝達を調べるために、実施例１において樹立されたＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞株（ＳＮＵ４４９Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７、及びＴ１６）において、ＦＡＫタンパク質の５７７番のアミノ酸であるチロシンがリン酸化されたｐＹ５７７ＦＡＫタンパク質発現の度合い、ｃ−Ｓｒｃタンパク質の４１６番のアミノ酸であるチロシンがリン酸化されたｐＹ４１６ｃＳｒｃタンパク質発現の度合い、Ｒａｃ１活性及びＲｈｏＡ活性を調べてみた。前記全体の細胞溶解物を集めて、図３及び図５に表記のタンパク質に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行ったり試験管内においてＲｈｏＡとＲａｃ１をプルダウンしてその活性を分析した。
また、ＴＭ４ＳＦ５に対するｓｈＲＮＡ（ｓｈＴＭ４ＳＦ５）を用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害する場合の変化を観察した。母細胞であるＳＮＵ４４９ｐ、対照群細胞であるＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＴＭ４ＳＦ５が発現される各種の細胞において、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対するｓｈＲＮＡ、ランダムな塩基配列を有するｓｈＲＮＡ及びＴＭ４ＳＦ５に対するｓｈＲＮＡを導入した後に細胞を回収してウェスタンブロット分析とＲｈｏＡ活性分析を行った。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される前記細胞においてはｐＹ５７７ＦＡＫタンパク質とｐＹ４１６ｃＳｒｃタンパク質発現及びＲａｃ１活性は増加されていたが、ＲｈｏＡ活性は減少されていることを確認した（図３及び図５）。そして、ＴＭ４ＳＦ５による前記ｐＹ５７７ＦＡＫの増加とＲｈｏＡ活性阻害現象はＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害することにより再び反転することが分かる（図４及び図６）。
そして、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｐＥＧＦＰとｓｈＴＭ４ＳＦ５を一緒に導入して２４時間後にカバースリップの上に載せ、２４時間の培養時間が経過した後、ファロイジンが付着されたローダミンとＤＮＡ染色のためのＤＡＰＩを一緒に蛍光染色した結果、前記ｓｈＴＭ４ＳＦ５が導入された細胞は対照区に属するＳＮＵ４４９細胞と同様に強い繊維状のアクチン構造を有する多角形の細胞形態に修復されるが、そうではない隣り合う細胞は依然としてＴＭ４ＳＦ５発現の影響により細胞形態の変化が現れないことを確認した（図７）。
（３）ＲｈｏＡ活性阻害
併せて、ＲｈｏＧＡＰタンパク質を通じてのＲｈｏＡの不活性化過程におけるｐＹ５７７ＦＡＫの役割を調べてみた。Ｃｐ細胞とＴｐ細胞から得られた細胞溶解物に対してＦＡＫに対する抗体を用いて免疫沈降法を行い、免疫沈降された混合物はｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ、ＧＲＡＦ、ＦＡＫ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。また、前記ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に（ＨＡ）３−ｔａｇｇｅｄ ＦＡＫ野生型タンパク質とＹ５７７Ｆ突然変異タンパク質を一時的に過剰発現させて、２日後に細胞溶解物を免疫沈降法を行って図１０において表記している抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
その結果、ＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ間の結合、若しくはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合が、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞において、そうではないＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞に比べて強く結合することが分かる（図９）。そして、このようなＴＭ４ＳＦ５によるＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ間の結合若しくはＦＡＫ−ＧＲＡＦ間の結合はＦＡＫタンパク質の５７７番のアミノ酸チロシンをフェニルアラニンに変えた突然変異タンパク質を発現させることにより減少される結果を示し（図１０）、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞からＲｈｏＡにつながる一連の信号伝達過程においてｐＹ５７７ＦＡＫが重要な役割を果たすということを推察することができた。
また、ＦＡＫと関連するＧＴＰａｓｅ調節因子であるＧＲＡＦに対して、対照群細胞にＦＬＡＧ−ｔａｇｇｅｄ ＧＲＡＦを一時的に過剰発現して２４時間後に上述した方法に従いカバースリップの上に載せ、一日中に培養した後、アクチンとＦＬＡＧ抗体を用いて蛍光免疫染色法を行った結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現されない対照群細胞におけるＧＲＡＦまたはｐ１９０ＲｈｏＧＡＰの一時的な発現は細胞形態の変化を引き起こすことを確認した（図１１）。
このため、結論的にＳＮＵ４４９細胞において発現されるＴＭ４ＳＦ５はＲｈｏＡの活性を阻害して細胞長さの伸長を誘導し、これは、ＦＡＫ−ｐ１９０ＲｈｏＧＡＰ若しくはＦＡＫ−ＧＲＡＦタンパク質間の相互作用によるものであることが分かる。
実施例３：ＴＭ４ＳＦ５による細胞質内のｐ２７ ｋiｐ１ の蓄積効果
（１）ＴＭ４ＳＦ５の発現によるｐ２７ｋiｐ１の発現増加
ＴＭ４ＳＦ５によるＲｈｏＡ活性阻害現象がｐ２７ｋiｐ１による効果であるかどうかを調べるために、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をｐ２７ｋiｐ１に対する抗体とＤＡＰＩを用いて蛍光免疫染色した。そして、前記細胞の核と細胞質を実施例１−（２）−５）における方法に従い分画化してｐ２７ｋiｐ１に対する抗体とａ−チューブリンに対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてｐ２７ｋiｐ１タンパク質が顕著に高濃度にて細胞質に位置することが分かる（図１２）。これに対し、ＴＭ４ＳＦ５が発現されない対照群細胞においては少量ではあるがほとんどが核に位置していた（図１３）。
ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１発現レベルとＳｅｒ１０リン酸化の関係を調べるために、実施例１において樹立した様々な細胞株溶解物を得て図１４に表記の抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った結果、このようなｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞質における存在はｈＫＩＳ（human Kinase-interantigwith Stathmin）タンパク質と活性化されたＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質によりアミノ酸１０番のセリンのリン酸化を通じてなされることを確認した（図１４）。
また、アクチノマイシンＤ（１０ｍｇ／ｍｌ、ＡｃｔＤ）が処理された細胞からＲＮＡを分離してｐ２７ｋiｐ１及びＧＡＰＤＨをＲＴ−ＰＣＲ分析し、シクロヘキサミド（１０ｍＭ、ＣＨＸ）を処理した細胞の溶解物を得てｐ２７ｋiｐ１に対する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った後、その結果として得られるバンドの強度を測定して対照群となるバンドの強度に対する増減をグラフにて示した（図１６）。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてｐ２７ｋiｐ１タンパク質発現が顕著に増加されることはｐ２７ｋiｐ１ｍＲＮＡとタンパク質の高い安定化のためであることが確認され（図１５）、このような現象はＴＭ４ＳＦ５に対するｓiＲＮＡを用いてその発現を阻害したとき、細胞形態の変化がＴＭ４ＳＦ５が発現されないＳＮＵ４４９細胞の形態に戻り、細胞質においてｐ２７ｋiｐ１タンパク質発現レベルも減少されると共にセリン残基のリン酸化もまた起こらない結果からなお一層明らかになった（図１７）。
さらに、ＴＭ４ＳＦ５が細胞質のｐ２７ｋiｐ１タンパク質の安定化に預かるという仮説はＴＭ４ＳＦ５が内生的に発現される様々な肝がん細胞においても有効であることが分かる。
内生的にＴＭ４ＳＦ５を発現している肝がん細胞株に対して、ＧＦＰのｓｈＲＮＡ、ランダムな塩基配列（Ｓｃｒ）を有するｓｈＲＮＡ及びＴＭ４ＳＦ５に対するｓｈＲＮＡを導入して、４８時間後に得た全体の細胞溶解物及びＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞の溶解物に図１８に表記の抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った結果、内生的に発現されるＴＭ４ＳＦ５の発現の阻害はｐ２７ｋiｐ１発現及びＳｅｒ１０のリン酸化レベルを減少させ（図１８）、ＳＮＵ４４９ＴｐＴｐ細胞に（ＨＡ）−ｔａｇｇｅｄ ＦＡＫ野生型タンパク質とＹ５７７Ｆ突然変異を過剰発現させた後、表示された抗体によりウェスタンブロット分析を行った結果、Ｙ５７７ＦＦＡＫ突然変異タンパク質はｐ２７ｋiｐ１の発現レベルやＳｅｒ１０のリン酸化には影響しなかった（図１９）。また、Ｈｕｈ７肝がん細胞株にＳｃｒまたはｓｈＴＭ４ＳＦ５と一緒にｐＥＧＦＰを導入してｐ２７ｋiｐ１とＤＡＰＩを免疫蛍光染色法により染色した結果、内生的に発現されるＴＭ４ＳＦ５の阻害は細胞質に存在するｐ２７ｋiｐ１を減少させることを確認した（図２１）。
この結果はＴＭ４ＳＦ５の発現がｐ２７ｋiｐ１の発現増加及び細胞質における安定化に寄与し、これは、ＲｈｏＡタンパク質の活性阻害につながることを証明している。特に、図１９の結果はｐ２７ｋiｐ１の発現とＦＡＫタンパク質のリン酸化は互いに関連性がないことを示唆し、これは、ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１タンパク質及びＲｈｏＡ活性阻害現象とＴＭ４ＳＦ５によるＦＡＫ／ＲｈｏＧＡＰｓ結合によるＲｈｏＡ活性阻害現象は別個の信号伝達機序において寄与されたものであることが分かる。
（２）細胞質のｐ２７ｋiｐ１蓄積による細胞形態変化
実施例２から明らかなように、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞は細胞形態が長く、前記実施例３−（１）から明らかなように、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞はｐ２７ｋiｐ１が高く発現されるという特徴があるため、このようなｐ２７ｋiｐ１タンパク質の変化が細胞形態の変化にいかなる影響を与えるかを調べてみた。
実施例１において樹立したＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞にＦＬＡＧ−ｔａｇｇｅｄ ｐ２７ｋiｐ１野生型タンパク質を過剰発現させ、４８時間後に前記細胞をＤＡＰＩ、ファロイジンが付着されたローダミン、及びＦＬＡＧに対して免疫蛍光染色を行って共焦点顕微鏡により観察した結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現されない母細胞にｐ２７ｋiｐ１を過剰発現させたときに細胞の形態が長くなることを確認した（図２２）。
そして、前記ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をｓiＲＮＡｐ２７ｋiｐ１アデノウィルスを用いて２４時間かけて感染させ、ＦＬＡＧ−ｔａｇｇｅｄ ｐ２７ｋiｐ１Ｓ１０Ａを導入して２４時間かけて培養した後、免疫蛍光染色を行ない、得られた細胞溶解物を図２４に明示された抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
その結果、このようにＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてｐ２７ｋiｐ１の発現阻害と一緒にセリン１０番がアラニンに変わってその残基のリン酸化が起こらない突然変異体であるｐ２７ｋiｐ１Ｓ１０Ａを一緒に導入して発現すると、細胞質への移動が阻害され、細胞の形態も多角形のＳＮＵ４４９若しくはＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞と同じ形態に変化していることを確認することができた（図２３及び図２４）。
前記ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｐＥＧＦＰと活性化された形態のＲｈｏＡ６３Ｌ突然変異ベクターを一緒に導入してアクチンの構造を免疫染色した結果、活性化されたＲｈｏＡにより細胞形態変化の反転が起こり、多角形をなしていた（図２５）。
細胞質のｐ２７ｋiｐ１による細胞形態の変化とＲｈｏＡ信号伝達間の関係を究明するために、ＲｈｏＧＴＰａｓｅを活性化させたときの細胞形態の変化とｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞内位置変化を調べてみた。
先ず、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をカバースリップの上に培養した後、ＲｈｏＧＴＰａｓｅを活性化させる因子であるＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）１０ｍＭを１時間かけて処理してＤＡＰＩとｐ２７ｋiｐ１を免疫染色した。その結果、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞においてＬＰＡ（リゾホスファチジン酸）は細胞質のｐ２７ｋiｐ１を減少させた（図２６）。
また、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｐＥＧＦＰとｍＤiａ活性型突然変異を導入し、且つ、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞にｐＥＧＦＰと活性型のＲａｃ１（Ｒａｃ１６１Ｌ）またはＰＡＫ１（ＰＡＫ１−ｃａａｘ）を導入して免疫蛍光染色分析を行った。その結果、驚くことには、ＲｈｏＡの下位伝達媒介因子であるｍＤiａの活性化が細胞の形態をＳＮＵ４４９若しくはＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞と同じ多角形に戻る結果を示し、細胞質内のｐ２７ｋiｐ１タンパク質発現レベルも再び減少される結果を示していた（図２７）。
これは、ＲｈｏＡ信号伝達の活性化によりｐ２７ｋiｐ１タンパク質がそれ以上安定化できず、核中に位置するためであると推察することができる（図２６、図２７の上）。これに対し、活性化されたＲａｃ１とその下位伝達媒介体であるＰＡＫ１の発現はＴＭ４ＳＦ５が発現されない細胞であるにも拘わらず、細胞の形態を長く変化させてｐ２７ｋiｐ１タンパク質の細胞質内蓄積を引き起こした（図２７の下）。
この結果からみたとき、細胞質内のｐ２７ｋiｐ１とＲｈｏＡ及びＲａｃ１を含むＲｈｏＧＴＰａｓｅとの間には相互調節の連結環が存在し、細胞質のｐ２７ｋiｐ１によるＲｈｏＧＴＰａｓｅの活性調節はＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞形態の変化を誘導することが分かる。
実施例４：ＴＭ４ＳＦ５によるＥＭＴ現象
ＴＭ４ＳＦ５が細胞−細胞間接触の調節にも影響するかどうかを調べてみた。先ず、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞とそうではない対照群細胞の溶解物により細胞−細胞接触形成に預かるタンパク質の発現レベルを免疫ブロット方法を用いて確認した。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５非発現細胞株においてはＥ−カドヘリン、ＺＯ１、デスモプラキンなどの細胞接触タンパク質の発現が大幅に増加されていたが、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてはその発現が減少されていた。しかしながら、上皮間葉転換（ＥＭＴ）に預かるＳＭＡタンパク質は高く発現されていた（図２８）。
さらに、高密度にて培養したＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をカバースリップの上に載せた後、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１タンパク質の発現パターンを免疫染色法を用いて調べてみた結果、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９細胞とＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞においては細胞接触部位によく整列されて存在していたＥ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１などが、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においては細胞間接触が上手になされず、散発的に分布する発現パターンを示していた（図２９）。
ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞にｐ２７ｋiｐ１に対するｓｈＲＮＡアデノウィルスを実施例１において説明した通りに感染させた後、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１タンパク質の免疫染色した結果、ｐ２７ｋiｐ１の発現が阻害されたら、Ｅ−カドヘリン、β−カテニン、ＺＯ１タンパク質が規則的な形態に再配列され（図３０）、ＳＭＡ発現が減少されることを確認した。
また、内生的に発現されるＴＭ４ＳＦ５がＥＭＴ現象の調節にいかなる役割を果たすかを究明するために、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＴＭ４ＳＦ５を発現するＨｕｈ７細胞に対してＴＭ４ＳＦ５とａ−チューブリンの発現を調べ（図３１）、ＨＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）を２４時間かけて処理した後、ＺＯ１を免疫染色した結果を観察した。
Ｈｕｈ７細胞株は、ＴＭ４ＳＦ５発現有無とは無関係に、コロニーをなして成長する特性があるため、細胞間接触パターンが相当良好である。このため、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）を用いてＥＭＴ現象を誘導させた後、ＴＭ４ＳＦ５が細胞−細胞間接触の形成に及ぼす影響を観察した。その結果、ＨＧＦによるＨｕｈ７細胞の分散現象（若しくは、接触崩壊）がＴＭ４ＳＦ５が阻害されたＨｕｈ７細胞において低減することを観察することができた。このため、ＴＭ４ＳＦ５が細胞−細胞間接触の消失を引き起こしていることが分かる（図３２）。
実施例５：ＴＭ４ＳＦ５による細胞生長の接触阻止現象の消失
ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をカバースリップの上において培養した後、ＤＮＡとアクチン構造をＤＡＰＩにより染色した結果を図３３及び図３４に示す。
矢印にて示す部分は細胞分裂と核が重なり合う部分を示し、細胞がそれ以上成長する空間がないにも拘わらず継続的に分裂し続けていることを示す。また、これらの細胞の生長速度を測定するために６ウェル培養皿に５Ｘ１０４個の細胞をはじめとして１２時間おきにその数を数えて記録した結果をグラフにて示す。実際にＴＭ４ＳＦ５が発現される４４９Ｔｐ細胞株の生長曲線は継続的に増加するパターンを示し、対照群細胞である４４９Ｃｐ細胞株は経時的に増殖していて、接触阻止現象によりそれ以上成長しなくなる飽和曲線を描いていた。このような特徴は細胞が低密度にて存在する状況においても現れる。すなわち、低密度の細胞のうちＴＭ４ＳＦ５発現する細胞は核が重なり合って細胞分裂などをしながら増殖をするが、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９細胞とＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞は高密度にて互いに接触される環境においてはそれ以上生長しないという特徴を示している（図３４）。
また、ＴＭ４ＳＦ５が発現される様々な細胞株（Ｔ７、Ｔ１６、及びＴ３）の細胞周期のＳ期分布を調べてみた結果、ＴＭ４ＳＦ５を発現しないＳＮＵ４４９細胞と、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞細胞に比べてＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞においてＳ期に存在する細胞集団がさらに多量であると分かる（図３５）。ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞に対照群ｓｈＲＮＡとｓｈＴＭ４ＳＦ５を導入した後、プロピジウムヨード法によりＤＮＡを染色して流速細胞分析機を用いて細胞周期を分析した結果、ｓｈＲＮＡを用いてＴＭ４ＳＦ５の発現を阻害したとき、Ｓ期に存在する細胞集団が低減することを確認した（図３６）。
ＢｒｄＵ浸透免疫染色法を用いた調査においても、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞はそうではない細胞に比べてＤＮＡ合成中のＳ基の細胞分裂が顕著に高く存在することが分かる（図３７）。このような現象は、ＬＰＡによるＲｈｏＡの活性化や（図３８）、ｐ２７ｋiｐ１の発現阻害（図３９）、さらにはＥ−カドヘリンの再発現（図４０）などを通じて特異的にＤＮＡ合成中のＳ基の細胞分裂が阻害されると現れた。
特に、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現を再び高めるＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ細胞（ＳＮＵ４４９Ｔ１６細胞由来であるため、ＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍと称する。）は、ＴＭ４ＳＦ５が発現されるにも拘わらず、細胞間の接触がＴＭ４ＳＦ５非発現細胞と同じパターンを示し（図４２）、ＳＭＡタンパク質の発現が減少する結果を示している（図４１）。
このため、上記の結果からみたとき、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞にＥ−カドヘリンの発現を再び増加することにより、ＴＭ４ＳＦ５はＥＭＴ現象を通じて細胞生長の接触阻止現象を消失させ、これは、細胞間の接触と接触による生長阻止現象との間において緊密な機能の関連性があることを示唆している。
実施例６：ＴＭ４ＳＦ５により形成された腫瘍組織の特徴
ＴＭ４ＳＦ５による腫瘍発生効果を２種類の方法により検証した。先ず、ＴＭ４ＳＦ５が発現されたり発現されない様々な細胞を付着−非依存的な生長環境下に放置した。２７日間ソフトアガーにおいて培養した後に観察した。実施例１の６）において言及した方法によりＳＮＵ４４９細胞株をもってソフトアガーアッセイを行い、ソフトアガー培養皿に細胞を培養してから２７日目に位相差顕微鏡により細胞コロニーの様子を観察・記録した。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞はそうではない細胞に比べて細胞コロニーが顕著に多量生存していることが分かる。しかしながら、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞にＥ−カドヘリンを再発現させた４４９Ｔ３ｍ、Ｔ１６ｍ細胞においては細胞コロニーの形成が顕著に低減していた。このため、ＴＭ４ＳＦ５によるＥＭＴ現象は細胞付着−非依存的な生長と関連するということを推定することができた（図５２）。
次に、ＴＭ４ＳＦ５を発現したり発現しない様々なＳＮＵ４４９細胞株をヌードマウスに注入した。ヌードマウスはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊＢｇi−ｎｕ（Orient.Co.Ltd）を基本種とし、全て生後４〜５週齢、体重が約２０ｇの雌性だけを使用した。滅菌消毒されたねずみかごにおいて滅菌された水と飼料を供給し、層板気流を持続的に維持したクリーンベンチ中に放置して清浄な環境を維持し、全ての術式もクリーンベンチ中において行った。
ヌードマウスの昼夜間生物学的な周期のために室内灯を１２時間は点灯し、且つ、１２時間は消灯した。ＳＮＵ細胞株を基本細胞株として、ＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９Ｔｐ、ＳＮＵ４４９Ｔ１６、ＳＮＵ４４９Ｔ１６ｍ細胞の浮遊液を遠心分離して細胞を濃縮し、血球計により細胞数を１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／２００μｌに算定して、用意された細胞を２６ゲージの注射針を用いて１ｃｃ注射器によりヌードマウスの脇腹に皮下注射接種した。注射後、実験動物はソウル大学前臨床実験室動物飼育法により維持され、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞による腫瘍形成を観察、記録した。
ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株は腫瘍形成に優れていたが、母細胞（４４９ｐ）と対照群細胞（４４９Ｃｐ）、４４９Ｔ３ｍ、Ｔ１６ｍ細胞はこれといった腫瘍が形成されていなかった（図５３）。
そして、ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を注射したマウスから得られた腫瘍組織をＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）染色法により染色してその組織形態を観察し、ｐ２７ｋiｐ１とｐＳ１０ｐ２７ｋiｐ１発現パターンを免疫組織化学染色法により分析した。免疫化学組織染色法によりＴＭ４ＳＦ５が誘導した腫瘍組織の中央部位は死滅した細胞集団が大幅に現れ、細胞質に存在するｐ２７ｋiｐ１とセリン１０番の残基のリン酸化も増加されて現れた（図５４）。さらに、前記組織から得られたタンパク質溶解物を用いてウェスタンブロット分析を行った結果、ＴＭ４ＳＦ５による腫瘍組織は、そうではない細胞による組織と比較したとき、ｐ２７ｋiｐ１の発現レベルとリン酸化レベルが高く現れた（図５５）。
実施例７：ＴＭ４ＳＦ５による細胞の移動性増加
（１）細胞の移動性分析
Boyden Transwell chamber 24 well plates(Costar, Cambridge, MA)を使用した。ポリカーボネートフィルター（８μｍ porosity）上のチャンバーにＳＮＵ４４９Ｃｐ及びＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を５ｘ１０４セル／ウェルずつ１日中に３７℃、５％のＣＯ２培養機において無血清ＲＰＭＩ(Roswell Park Memorial Institute)培地にて培養した後、２４時間後にインサートチャンバー上方のメンブレンを綿棒によりよく拭き取り、７０％メタノールに約７分間浸してメンブレン下方にある細胞を固定した。
このようにＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を高密度になるように培養した後、適当な厚さのワウンドを形成した後、経時的にワウンドが満たされる度合いを観察し、光学顕微鏡により記録した。その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株の場合、そうではない細胞株に比べて傷回復速度が増加されることを確認した（図５８）。
また、前記ＳＮＵ４４９Ｃｐ、Ｔｐ細胞株をトランスウェルのインサートウェルにおき、無血清培地において培養し、インサートの下チャンバーには１０％の血清または無血清培地を入れて細胞の経時移動の度合いを観察するために、０．００５％クリスタルバイオレットにより１分間染色した後、ＰＢＳにより３回洗浄して光学顕微鏡により前記染色された細胞を観察した（図５９の上の写真）。前記染色薬を溶解して２６０ｎｍの波長において吸光度を測定して図表化した（図５９の下グラフ）。その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株の場合、そうではない細胞株に比べて細胞移動性が増加されることを確認した（図５９）。
（２）ジモグラフィ分析
分泌されたＭＭＰｓの基質分解活性を測定するためにゼラチンジモグラフィを行った。図６２に示す細胞株を６０ｍｍ培養皿に放置した後、１８時間後に血清を除去した培養液に交替して２４時間さらに培養した。分泌されたＭＭＰｓタンパク質を得るために培養上清だけを取って濃縮した。ＭＭＰｓの基質となるゼラチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥの分離ゲル（ランニングゲル）に添加し、減圧条件下において電気泳動した後、１％トリトンＸ−１００緩衝溶液において再変成させ、次いで、酵素反応緩衝溶液（１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１５Ｍ ＮａＣｌと５０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５）により３７℃において１８時間反応させた。この後、０．５％クマシーブリリアントブルー（Coomassie brilliant blue）Ｒ２５０により３時間染色させた後、１０％酢酸、３０％メタノールにおいて透明なバンドが現れるまで脱色した。
その結果、ＭＭＰ−２と９はゼラチンとフィブロネクチン基質を分解するが、ＴＭ４ＳＦ５が発現されるＳＮＵ４４９Ｔｐ、Ｔ３、Ｔ７、及びＴ１６細胞においてその活性が高くなっていることを確認した。すなわち、ＴＭ４ＳＦ５によりＭＭＰｓ酵素活性が増加されることを確認した（図６２）。
そして、ＳＮＵ４４９Ｐ細胞にＭＭＰ−２ルシフェラーゼとＭＭＰ−９ルシフェラーゼを様々な濃度のｐｃＤＮＡ３．１−ＭｙｃＨiｓ−ＴＭ４ＳＦ５と一緒に導入した後、３６時間後にルシフェラーゼ活性を測定して、各ＭＭＰ遺伝子プロモーターの転写活性を比較した結果、ＭＭＰ−９は、酵素活性だけではなく、遺伝子発現活性も高いことを確認した（図６３）。これより、ＴＭ４ＳＦ５はＭＭＰｓ遺伝子発現活性にも影響することが分かる。
（３）３Ｄコラゲンを用いた細胞の浸潤性分析
細胞の浸潤性を分析するためにCytodex-3マイクロキャリアを用いた。ＳＮＵ４４９ＣｐとＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を細胞をマイクロキャリアビーズに付着して培養し、血清と培地成分入りのコラーゲンゲルに混ぜて３７℃において培養した後、経時的に現れる現象を観察した。また、ＴＭ４ＳＦ５が発現されるＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞がコラーゲンゲル中に浸潤する現象をも光学顕微鏡により観察した（図６０）。
また、上記のＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞の浸潤性を分析するために、実施例７−（１）において言及したBoyden Transwell chamber 24 well platesのインサートにマトリゲルを入れて３７℃において固めた後、上述した方法に従い細胞を培養して２４時間後にインサートの上方のメンブレンを綿棒によりよく拭き取り、３６時間後にメンブレンの下方に浸潤された細胞を染色して観察した。その結果、上記のＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞が様々な細胞外基質複合体であるマトリゲルを有効に浸潤することを確認した（図６１）。
実施例８：ＴＭ４ＳＦ５機能を阻害する抗がん物質（拮抗剤）の選択
ＴＭ４ＳＦ５が細胞内において特異的に誘導する現象を調節すると予想される化合物のうち、前記表１に示すカルコン系の化合物を本発明の方法によりスクリーニングした。図６９に記載のカルコン化合物もまた抗がん候補物質として使用した。
上述した抗がん機能を示す候補物質を本発明の抗がん物質として決定したが、スクリーニングされた代表的な化合物を前記表１に示す。
前記抗がん物質の抗がん機能をより確実に調べるために、表１の化合物のうちＴＳＡＨＣ［４’−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン］を使用した。
ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞株にＴＳＡＨＣを処理したとき、継続的な生長曲線がＴＳＡＨＣの濃度、処理時間により依存的に減少することを観察し（図４３の右）、細胞周期Ｓ期への進入（図４４）、そして細胞間の接触が復活されることを確認した（図４５）。
これに対し、ＴＳＡＨＣ薬物の効果については、ＴＭ４ＳＦ５が発現されない細胞においては全く効果がないことが分かる（図４３の左）。さらに、ＴＭ４ＳＦ５によるｐ２７ｋiｐ１、ｐＳ１０ｐ２７ｋiｐ１、ｐＹ５７７ＦＡＫの高い発現や度合い、さらにＳＭＡの発現はＴＳＡＨＣにより有効に減少されることが分かる（図４６）。また、４４９Ｔｐ細胞株にＴＳＡＨＣを処理した結果、細胞質に存在するｐ２７ｋiｐ１が減少することから（図４７）、ＴＳＡＨＣがＴＭ４ＳＦ５に対する拮抗作用をすることによりｐ２７ｋiｐ１タンパク質がそれ以上安定化できないことが分かる。加えて、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞におけるＲｈｏＡの活性阻害現象を修復させ（図４８）、長く変化されていた細胞の形態が、多角形のＴＭ４ＳＦ５が発現されない対照群細胞株と同じ形態に戻ることを確認することができた（図４９）。
また、ＴＳＡＨＣの処理時にＴＭ４ＳＦ５のＮ結合型グリコシレーション部分のＦＮＧａｓｅＦに対する感受性が向上することを確認した（図５０）。この結果から、ＴＳＡＨＣはＴＭ４ＳＦ５そのものを攻撃してＮ結合型グリコシレーションの構造的な側面に変化を与えてＴＭ４ＳＦ５のタンパク質−タンパク質結合（テトラスパニン−ウェブ内における）に影響することにより、ＴＭ４ＳＦ５による機能を抑制することができると推定可能である。
さらに、ＴＳＡＨＣの処理は、内生的にＴＭ４ＳＦ５を発現する細胞については細胞の生長若しくは増殖を抑制したが、発現しない細胞株は根本的にいかなる影響を及ぼさなかった（図５１）。このため、これらの結果からみて、ＴＭ４ＳＦ５に対して拮抗剤として作用するカルコン系の化合物がＴＭ４ＳＦ５による腫瘍形成の予防及び治療に効果があることを確認した。
カルコン系の化合物が示すＴＭ４ＳＦ５阻害率（iＣ５０）を表２に示す。
実施例９：本発明のカルコン誘導体の人体がん細胞株に対する試験管内細胞毒性
本発明の化合物カルコン誘導体の人体がん細胞株に対する試験管内細胞毒性を調べるために、１９８９年アメリカの国立がん研究所（ＮＣi：National Cancer institute）において開発したスルホロダミンＢ（ＳＲＢ）方法を使用した。
この実験に使用した人体がん細胞株として、ＨＣＴ１５（colon adenocarcinoma、結腸がん；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２５）、ＰＣ−３（prostate adenocarcinoma、前立腺がん；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）、Ａ−５４９（lung carcinoma、肺がん；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）が挙げられ、胃がん細胞はいずれも生命工学研究所において継代培養中のものを使用した。
前記人体がん細胞株は１０％子牛血清が含まれているＲＰＭi１６４０培地（ギブコ社カタログｎｏ．３１８００）を用いて、３７℃の温度条件下、５％の二酸化炭素培養機において培養し、継代は１週間につき２回行った。
細胞を付着面から分離するときには、０．２５％トリプシン（シグマ社製）及び３ｍＭＣＤＴＡ（１、２−シクロヘキサンジアミンテトラアセト酸、シグマ社製）をリン酸塩緩衝溶液（シグマ社製）に溶解させた溶液を使用した。
検索用の試料（表１に記載のカルコン化合物誘導体）は少量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、シグマ社製）に溶かして実験に必要となる濃度まで実験用の培地において希釈して最終的なＤＭＳＯの濃度が０．５％以下になるようにし、数段階（最終濃度：３０、１０、３、１、０．３μｇ／ｍＬ）に亘って希釈された試料溶液はがん細胞に加える前に０．２２μｍマイクロフィルター（ミリポア社製）によりろ過して無菌状態にした。次いで、通常のＳＲＢ法により人体がん細胞株に対する細胞毒性を測定した。
本発明の化合物カルコン誘導体の人体がん細胞株に対する細胞毒性（ＥＤ５０、μｇ／ｍＬ）を下記表３に示す。

上記の結果は、本発明のカルコン系の化合物が人体がん細胞株に対する細胞毒性を示すために抗がん剤として使用可能であることを示唆する。
実施例１０：ＴＳＡＨＣの腫瘍形成抑制効果
（１）ＴＳＡＨＣ投与
前記実施例６に従い用意したヌードマウスに対して、形成された腫瘍の長さと幅をキャリパーにより２日おきに１回ずつ測定して下記の公式（Volume (mm3) = Length × Width2 × 1/2、Length：長径、Width：短径）により腫瘍の体積を算出した。
ヌードマウスに誘発された腫瘍の体積が２００ｍｍ３のサイズにて着床された後、任意に２群に分けて（５ｍｇ／ｋｇと５０ｍｇ／ｋｇ）生理食塩水にＴＳＡＨＣを懸濁させて２日おきに１回ずつ３週間２６ゲージの注射針を用いて腹腔内注射する方法により投与した。
（２）腫瘍組織の免疫組織化学検査とウェスタンブロット分析
ヌードマウスは、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を注入してから６週目に、またはＴＳＡＨＣを投薬してから３週目に頸椎脱臼の方法により犠牲し、免疫組織化学検査のために腫瘍組織を切開し、ホルムアルデヒドにより固定した後にパラフィン標本にした。組織のタンパク質発現レベルをウェスタンブロットにより分析するために抽出した腫瘍組織は直ちに液体窒素を用いて凍結標本にして０．１％ＳＤＳ入りのＲＩＰＡ緩衝溶液に溶解させてタンパク質混合物を得て分析した。用意された６μｍ厚さのパラフィン切片に対しては、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）染色と免疫組織化学検査を行った。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞を移植したマウスの腫瘍（個体数＝６）は持続的に大きくなるのに対し、ＴＳＡＨＣを５ｍｇ／Ｋｇ、若しくは５０ｍｇ／Ｋｇ濃度にて腹腔注射したマウスの腫瘍はそれぞれ約４５％、８８％だけそのサイズが減少することを確認した（図５６）。
実施例１１：ＴＳＡＨＣのがん転移抑制効果
（１）がん転移実験動物モデル樹立
がん転移実験動物モデルの準備は、上述した腫瘍誘導モデルと同じ方法により行われた（実施例６参照）。ＳＮＵ４４９Ｃｐ、ＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞の浮遊液を遠心分離して細胞を濃縮し、血球計により細胞数を１Ｘ１０７と算定して用意された細胞を１ｃｃ注射器及び２９ゲージのインシュリン注射針を用いてヌードマウス尾靜脈に血管注射して接種した。３週間放置後、マウスを犠牲して肺組織を摘出した後、ホルマリンにより固定してＨ＆Ｅ（ヘマトキシリン・エオシン）染色を行った。
その結果、ＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞の場合、肺組織に腫瘤が形成されていることを確認した（図６４）。図６４における矢印の個所が腫瘤部位であって、細胞が密集している個所である。
（２）ＴＳＡＨＣのＴＭ４ＳＦ５による細胞の移動性及び浸潤性抑制効果
ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を６−ウェル培養皿におき、２４時間後にＴＳＡＨＣ２０μＭを処理して１８時間培養した後、トランスウェルチャンバーのインサートウェルに移した。１８時間後に移動した細胞を固定、染色して光学顕微鏡により観察し、その数を数えてグラフ化した（図６５）。その結果、ＴＭ４ＳＦ５による細胞の移動性がＴＳＡＨＣにより阻害されることを確認した。
また、ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞をマイクロキャリアビーズに付着してＴＳＡＨＣ２０μＭと一緒に１８時間かけて培養した。ビーズ−細胞を血清と培地成分入りのコラーゲンゲルに混ぜ、培養を表記の時間だけ行いながら観察、記録した結果、ＴＭ４ＳＦ５による細胞の浸潤性がＴＳＡＨＣにより阻害されることを確認した（図６６）。
上記の如き方法によりマトリゲルが厚くコーティングされたトランスウェルチャンバーを用いて２４時間かけて培養した後、マトリゲルを通過した浸潤性の細胞数を数えてグラフ化した結果、マトリゲルにおける浸潤性もまた有効に阻害されることを確認した（図６７）。
そして、Ｃｐ細胞とＴｐ細胞にＴＳＡＨＣ２０μＭを２４時間かけて処理した。２４時間後、血清を除去した培地に交換した後、１８時間かけて培養した。培養液を取って濃縮した後、上述した方法に従いジモグラフィを行った結果、ＴＭ４ＳＦ５によるＭＭＰｓ酵素活性がＴＳＡＨＣにより阻害されることを確認した（図６８）。
この結果は、ＴＳＡＨＣがＴＭ４ＳＦ５による腫瘍誘導だけではなく、腫瘍細胞の転移過程もまた有効に阻害可能であることを示唆している。
実施例１２：ＴＳＡＨＣ類似体との効果比較
最後に、ＴＭ４ＳＦ５が預かる現象においてＴＳＡＨＣと構造的に類似する誘導体の効果を観察した。このとき、使用したＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）及びカルコン類似体の化学構造は下記の通りである。
ＳＮＵ４４９Ｃｐ細胞とＳＮＵ４４９Ｔｐ細胞を６−ウェル培養皿に敷き、前記図に示す薬物を２０μＭずつ２４時間かけて処理した後、光学顕微鏡を用いて細胞の形態変化を観察、記録した。
その結果、図６９に示すように、ＴＳＡＨＣと構造がほとんど同様であるものの、異なるＲ基で置換された薬物は、同じ濃度条件（２０μＭにて２４時間処理）下においてＴＳＡＨＣは有効にＴＭ４ＳＦ５が発現される細胞の成長を多層に成長せずに単層に成長させ、同時に細胞の形態をＴＭ４ＳＦ５が発現しないＳＮＵ４４９対照群細胞のように変化させることを確認した。これにより、ＴＭ４ＳＦ５による細胞成長阻害効果はＴＳＡＨＣ化合物の特定のＲ基により調節されることを類推することができる。
前記ＴＳＡＨＣ類似体は、前記化学構造式に示すように、カルコンのＡ−リング（左リング）にＯＨ、ＮＨ２、またはＯＣＨ３を置換基として有しているが、この場合には、ＴＭ４ＳＦ５の機能を通じて多層に成長する現象を阻害する抗がん性が観察されなかったが、ＴＳＡＨＣのようにスルホニル基が導入されたスルホンアミドカルコンにおいては、ＴＭ４ＳＦ５機能阻害を通じての抗がん活性が観察された。すなわち、スルホニルの導入により現在知られているカルコン誘導体とは全く異なる独特な抗がん活性を観察することができた。
以上述べたように、本発明は、腫瘍形成におけるＴＭ４ＳＦ５の発現と関連する分子的な機序に基づく抗がん物質のスクリーニング方法であって、腫瘍生成及び転移に対する拮抗作用をする治療及び予防目的の物質をスクリーニングする上で有用である。また、前記方法によりスクリーニングされたカルコン系の化合物を含有する抗がん用組成物は、体重の減少、肝及び脾臓という臓器に対して外傷的な異常を来たすことなく、しかも、毒性反応無しに抗がん効果を示すことから、抗がん用の薬剤として有効に使用可能であるというメリットがある。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施様態に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかであろう。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定まると言えるであろう。

Claims (12)

  1. 下記のステップを含む、抗がん物質のスクリーニング方法：
    （ａ）配列番号２のポリペプチドを発現するがん細胞を培養した後、抗がん候補物質で処理するステップ、
    （ｂ）前記抗がん候補物質で処理されたがん細胞に対して、:
    （ｉ）接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）を構成するアミノ酸配列のうち５７７番位のチロシンのリン酸化の確認、
    （ｉｉ）ＦＡＫのＲｈｏ−ＧＴＰase activating protein（ＲｈｏＧＡＰ）への結合、またはＦＡＫのＧＴＰase Regulator Associated with ＦＡＫ（ＧＲＡＦ）への結合測定、
    （ｉｉｉ）細胞質内ｐ２７Ｋiｐ１の発現量及び安定性測定、
    （ｉｖ）ＲｈｏＡの活性測定、及び
    （ｖ）Ｒａｃ１の活性測定、の少なくとも１つを検出するステップ、及び
    （ｃ）抗がん候補物質で処理しない場合に比べて、
    （ｉ）ＦＡＫの５７７番位のチロシンのリン酸化減少、
    （ｉｉ）ＦＡＫのＲｈｏＧＡＰへの結合、またはＦＡＫのＧＲＡＦへの結合抑制、
    （ｉｉｉ）細胞質内ｐ２７Ｋiｐ１発現及び安定性減少、
    （ｉｖ）ＲｈｏＡ活性増加、または
    （ｖ）Ｒａｃ１活性減少の事象が現れた場合に、抗がん候補物質を抗がん物質として選択するステップ。
  2. 前記細胞質内ｐ２７ＫiＰ１は、前記ｐ２７ＫiＰ１を構成するアミノ酸配列の中１０番位のセリン残基がリン酸化されていることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記ステップ（ｂ）は、細胞の形態確認、細胞接着関連のタンパク質発現確認、細胞間接触パターンまたは接触生長確認、α平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）タンパク質またはビメンチンタンパク質の発現確認、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現確認及び上皮間葉転換（ＥＭＴ）確認、よりなる群から選ばれる１以上をさらに行い、
    前記ステップ（ｃ）は、細胞の形態がロッド状から多角形に戻るか、あるいは、細胞接着関連のタンパク質の発現が減少するか、あるいは、細胞−細胞間の接触が維持されるか、あるいは、細胞生長の接触阻止現象が現れるか、あるいは、α−ＳＭＡタンパク質またはビメンチンタンパク質の発現が減少するか、あるいは、Ｅ−カドヘリンタンパク質の発現が増加するか、あるいは、上皮間葉転換（ＥＭＴ）が減少する場合をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞接着関連タンパク質はＥ−カドヘリン、zonula occludens−１（ＺＯ１）、β−カテニン及びデスモプラキンよりなる群から選ばれることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記細胞生長の接触阻止現象は、細胞数の減少、細胞周期のＳ期に存在する細胞集団の減少または多層増殖の抑制であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  6. 前記細胞数の減少または細胞周期のＳ期に存在する細胞集団の減少は、細胞膜タンパク質のＮ結合型グリコシレーションの不活性によることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 前記ステップ（ｂ）は、細胞外基質または血清の存在下での細胞の移動又は運動性確認、細胞外基質を構成するコラーゲンゲルへの浸潤確認、細胞外基質複合体を構成するマトリゲルへの浸潤確認及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性測定よりなる群から選ばれる１以上をさらに行い、
    前記ステップ（ｃ）は、細胞外基質または血清の存在下で細胞の移動又は運動性が減少するか、あるいは、コラーゲンゲル中における浸潤が減少するか、あるいは、マトリゲル中における浸潤が減少するか、あるいは、ＭＭＰ活性が減少する場合をさらに含むことを特徴とする請求項１または請求項３に記載の方法。
  8. 前記ＭＭＰはＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 前記がん細胞はすい臓がん、胃がん、肝がん、大腸がん、脳がん、乳房がん、甲状腺がん、膀胱がん、食道がん、子宮がん及び肺がんからなる群より選択されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 下記の化学式１または化学式２で表わされる抗がん用のカルコン系の化合物：


    式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールである；
    式中、Ｒ１はＲ４ＳＯ２−であり、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立して水素またはヒドロキシ基であり、前記Ｒ４はＣ１〜Ｃ５のアルキルまたは水素、ハロゲン、ニトロ及びＣ１〜Ｃ５のアルキルよりなる群から選ばれる１以上の置換基を有するＣ６〜Ｃ１０のアリールである。
  11. 次の化合物からなる群より選択される１以上の抗がん用のカルコン系の化合物：
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３−ヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ベンゼンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（メタンスルホニルアミノ）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−フルオロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−フルオロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ニトロベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−アミノベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（メタンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−トルエンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ３′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ２′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホニルアミノ）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−フルオロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−ニトロベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｏ−アミノベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ベンゼンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（メタンスルホニルアミノ）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−トルエンベンゼンスルホニルアミノ）−２−クロロ−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−４−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２−ヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、５−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−３、４−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、３−ジヒドロキシカルコン、
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、４−ジヒドロキシカルコン及び
    ４′−（ｍ−ヒドロキシベンゼンスルホネート）−２、５−ジヒドロキシカルコン。
  12. 請求項１０または請求項１１のカルコン系の化合物を有効成分として含有する抗がん用組成物。
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