KR102083064B1

KR102083064B1 - 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제

Info

Publication number: KR102083064B1
Application number: KR1020170102427A
Authority: KR
Inventors: 임융호; 이영한; 고동수; 신순영
Original assignee: 건국대학교 산학협력단; 동덕여자대학교 산학협력단
Priority date: 2017-08-11
Filing date: 2017-08-11
Publication date: 2020-02-28
Also published as: KR20190017496A

Abstract

본 발명은 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것으로, 본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 항암 활성이 우수하므로, 항암제로 유용할 수 있다.

Description

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제{pentadienone-resveratrol derivative, a method for producing the same, and an anticancer drug containing the same}

본 발명은 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

칼콘(chalcone)은 식물이차대사물의 일종으로 다양한 생물학적 효능을 보이기 때문에 많은 연구자들이 chalcone 유도체에 관심을 보여왔다. 칼콘(chalcone)이 항암효과를 보이는 이유 중 하나는 α,β-unsaturated carbonyl group을 가지고 있기 때문인데 α,β-unsaturated carbonyl group은 Michael acceptor로 작용하여 Glutathione에 작용하여 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 생성하고 [J Agri Food Chem 63:7731(2015)], 그 결과로 암세포를 죽인다고 알려 있다 [Nature Rev 8:579(2009)]. 세포는 외부의 침입에 대비하여 ROS를 항상 생성하고 있는데 정상세포에서는 ROS의 생성이 세포를 죽음으로 이르게 하지 않는다. 그러나 암세포에서는 이미 ROS의 level이 높은 상태이므로 약간의 추가적인 ROS 생성만으로도 세포를 죽음에 이르게 하는 threshold를 넘어서게 함으로써 암세포가 죽음에 이르게 된다 [Nature Rev 8:579(2009)]. 본 발명자들은 α,β-unsaturated carbonyl group을 두 개 포함하는 chalcone 유도체의 일종인 pentadienone을 디자인하였다. 또한 resveratrol도 식물이차대사물의 일종으로 포도씨에 많이 함유된 것으로 알려져 있는데 미약하기는 하나 항암효과를 보이는 것으로 알려져 있다 [Molecules.;22(6). pii: E1014. (2017) doi: 10.3390/molecules22061014].

두 가지 서로 다른 모핵을 가진 분자들은 신규성을 가지면서 기존의 생물학적 효능을 유지하기 때문에 시도할 만한 가치가 있기 때문에 본 발명자들은 pentadienone과 resveratrol을 동시에 가지는 새로운 저분자 화합물을 디자인하고 합성하였다. 항암효과를 측정하는 여러 가지 방법들 중 암세포에 대한 cytotoxicity를 측정하는 방법이 널리 사용되고 있는데 이들 중 clonogenic long-term survival assay는 다른 방법들보다 실험 기간이 길다는 단점을 가지는 반면 유사한 구조를 가진 저분자 화합물들의 cytotoxicity를 잘 구분한다는 장점을 가지기 때문에 본 발명에 따른 유도체들의 항암효과를 clonogenic long-term survival assay를 사용하여 측정하였다.

모든 세포들은 다양한 기작에 의한 세포분열을 통해 정상적으로 증식하며 성장한다. 세포분열은 세포주기 과정을 통해 이루어진다. 세포주기는 크게 간기(Interphase)와 유사분열기(Mitotic phase) 단계로 구성된다. 간기는 세포들이 세포분열에 필요한 각종 단백질의 합성이 일어나는 G1 기(gap1 phase) 기와 DNA 합성이 일어나는 S 기(synthesis phase), 유사분열을 위한 성장이 진행되는 G2 기(gap2 phase)로 구분된다. M기는 전기(prophase), 중기(metaphase), 후기(anaphase), 종기(telophase)로 구분되어 세포핵분열이 일어나게 된다.

세포주기의 진행은 사이클린(Cyclin) 단백질과 사이클린 의존성 키나아제(Cyclin Dependent Kinase, CDK) 효소와의 복합체가 세포주기의 각 단계를 조절 한다. 그중에서도 사이클린-디1(Cyclin-D1) 은 G1기에서 S기로 진행하는데 있어 중요한 역할을 하는 단백질이다. Cyclin D 단백질이 CDK4 혹은 CDK6와 복합체를 이루면 망막모세포종 단백질(Retinoblastoma protein, pRb)을 인산화 시킨다. 전사인자인 E2F와 결합되어 있는 pRb 단백질이 인산화되면 E2F 활성이 촉진되어 DNA 합성에 필요한 다양한 유전자 발현을 촉진하여 G1 기에서 S기로의 세포주기 진행이 시작 된다 [Seminars Cancer Biol. 6, 99 (1995)]. G2기에서는 cyclin B 단백질이 CDK1 효소와 복합체를 이루어 활성 되면, 핵막이 붕괴되고 핵속에 퍼져있는 염색사(chromatin)가 굻고 짧아져 염색체(chromosome)로 되면서 핵분열 과정인 M기의 진행이 시작되면서, 1개의 모세포가 두 개의 딸세포를 생성하여 세포 증식이 일어나게 된다 [Seminars Cancer Biol. 6, 99 (1995)].

정상세포에서는 이러한 세포주기 조절 기작이 정상적으로 일어나 세포분열과 증식이 적절히 시행되어 세포수가 알맞게 조절된다. 반면, 암세포에서는 비정상적인 세포주기 진행 등의 원인으로 세포의 과도한 증식과 성장이 발생하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 암세포에서는 cyclin D의 유전자 증폭현상이나 단백질이 과발현 상태로 관찰되었다. [Am. J. Pathology 147, 545 (1995)]. 따라서, cyclin D 단백질의 발현량을 감소시키면 pRB의 인산화가 정상적으로 이루어지지 않고, 그에 따라 세포주기가 G1단계에서 멈추게 머무르게 되며, cyclin B 단백질이 제대로 발현되지 않으면 M기의 진행이 억제되어 핵분열이 제대로 이루어지지 않아, 궁극적으로 암세포의 증식이 억제되어 암 치료에 적용할 수 있다.

미세소관(microtubule)은 α-와 β- 튜불린(tubulin) 이량체(dimer)가 중합(polymerization)되어 길고 속이 빈 원통형 고분자로 구성된 필라멘트 단백질이다. 미세소관은 튜블린의 중합 및 해중합(depolymerization) 과정에 의해 조절되는 매우 역동적인 구조이며, 이 동적인 변화는 다양한 세포 기능을 수행하는 데 중요하다. 세포분열이 진행되고 있지 않은 세포에서 미세소관은 세포골격(cytoskeleton)을 이루어 세포 모양을 유지시켜주며, 세포 이동 및 세포내 물질 수송 같은 기능을 수행한다. 세포가 유사분열 (mitosis)에 들어가게 되면, 미세 소관은 유사분열의 전기(prophase)에 세포 양극에 존재하는 중심체(centrosome)로부터 생성되어 방추사(mitotic spindle)가 되고, 중기(metaphase)에는 염색체 중심부에 위치하는 키네토코아(kinetochores)에 부착하여 염색체를 세포 적도판에 일렬로 정렬시킨다. 유사분열 M기의 후기(anaphase)에는 튜뷸린의 해중합이 일어나면서 자매 염색분체(sister chromatid)가 양극으로 정확하게 분리되어 이후 생성되는 딸세포가 각각 하나의 핵을 가질 수 있게 하는 역할을 한다.

미세소관이 세포주기 진행과정 중에 비정상적으로 중합 또는 해중합이 되면 염색체 재배열과 분리가 제대로 일어나지 않게 되어, 결국에는 G2/M기에서 세포주기가 정지되고 세포 사멸이 유도 될 수 있다. 따라서, 효과적인 항암제 개발 방법 중 하나는 미세소관의 중합과 해중합 과정을 차단하여 암세포의 유사분열 과정을 차단함으로서 암세포의 성장을 억제시키면서 세포사멸을 유도하는 것이다. 실제로, 현재 암치료제로 널리 사용돠고 있는 탁세인(taxane) 계열은 미세소관과 결합하여 튜뷸린 중합체의 분해를 막아 암세포의 분열과정을 차단함으로써 항암 효과를 나타내며, 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 및 콜키친(colchicine) 계열 항암제는 튜뷸린의 조립을 방지하여 튜뷸린 중합체가 형성되는 것을 방해함으로써 항암 효과를 보이고 있다. 현재 시판중인 탁세인 계열 항암제는 탁솔(Taxol)과 도세탁셀(Docetaxel)이 있으며 (Breast cancer 2004,11,82-85; Annual Review of Medicine 1997,48,353-374), 빈카 알칼로이드계열 항암제에는 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristin), 빈데신(vindesin) 및 비노렐빈(vinorelbine)이 있다 (Journal of Medicinal Chemistry 2009,52,134-142).

공개특허공보 10-2008-0052391호

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,

R은 C_6-10의 아릴 또는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자가 하나 이상 포함된 5-7 원자 헤테로아릴이며,

상기 헤테로아릴에는 C_6-8의 아릴이 융합(fused)될 수 있고,

상기 C_6-10의 아릴은 하이드록시, 니트로 및 C_1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기가 1종 이상 치환될 수 있다.)

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,

화합물 2와 과량의 아세톤을 알돌축합중합을 통해 화합물 3을 얻는 단계(단계 1); 및

상기 단계 1에서 얻은 화합물 3과 화합물 4를 유기용매에 용해시킨 뒤 과량의 수산화 칼륨을 첨가하고 실온에서 20-48시간 교반하여 화합물 1을 얻는 단계(단계 2);

를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,

상기 R은 제 1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물은 항암 활성이 우수하므로, 항암제로 유용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 1-26의 clonogenic assay 실험결과이다.
도 2는 에러바와 함께 나타낸 GI₅₀값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 13에 의한 세포주기 진행 차단 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 13을 대장암세포에 적용시 cyclin D와 cyclin B1 단백질 발현이 감소되는 효과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 13이 튜불린 중합체 생성을 억제시킨다는 실험 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염

[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,

상기 헤테로아릴에는 C_6-8의 아릴이 융합(fused)될 수 있고,

바람직하게,

상기 R은 C_6-8의 아릴 또는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 헤테로 원자가 하나 이상 포함된 5-6 원자 헤테로아릴이며,

상기 헤테로아릴에는 C_6-7의 아릴이 융합(fused)될 수 있고,

상기 C_6-8의 아릴은 하이드록시, 니트로 및 C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기가 1종 이상 치환될 수 있는 것을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게,

상기 R은 4-니트로페닐, 3,4-다이메톡시페닐, 3-메톡시페닐, 4-메톡시페닐, 2,3,4-트리메톡시페닐, 2,4,5-트리메톡시페닐, 2-하이드록시-5-니트로페닐, 5-브로모-2-하이드록시페닐, 3-니트로페닐, 2-플루오로페닐, 3-플로오로페닐, 4-플루오로페닐, 3-하이드록시페닐, 4-브로모페닐, 4-클로로페닐, 3,5-다이메톡시페닐, 3,4,5-트리메톡시페닐, 퓨란-2-일, 벤조[b]티오펜-2-일 또는 피리딘-2-일인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물의 바람직한 예로는 하기의 화합물 군을 들 수 있다.

1)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

3)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3,4-다이메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

5)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

6)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4-메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 ;

8)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2,3,4-트리메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

9)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

11)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2-하이드록시-5-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

12)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(5-브로모-2-하이드록시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

13)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

14)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2-플루오로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

15)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-플루오로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

16)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4-플루오로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

18)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-하이드록시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

19)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4-브로모페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

20)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4-클로로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

21)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3,5-다이메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

22)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3,4,5-트리메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

23)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(퓨란-2-일)펜타-1,4-디엔-3-온;

24)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(벤조[b]티오펜-2-일)펜타-1,4-디엔-3-온; 및

25)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(피리딘-2-일)펜타-1,4-디엔-3-온.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 유기용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조하여 제조되거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조하거나 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은 염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 이성질체, 광학 이성질체 등을 모두 포함한다.

제조방법

본 발명은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,

포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:

[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,

상기 R은 제 1항의 화학식 1에서 정의한 바와 같다.)

본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, CH₂Cl₂, 헥산, 디메틸포름아미드(DMF), 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 클로로벤젠 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게, 에탄올을 사용할 수 있다.

암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에 있어서,

상기 헤테로아릴에는 C_6-8의 아릴이 융합(fused)될 수 있고,

상기 C_6-10의 아릴은 하이드록시, 니트로, C_1-5의 직쇄 또는 측쇄 할로겐화알킬 및 C_1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기가 1종 이상 치환될 수 있다.)

바람직하게,

상기 헤테로아릴에는 C_6-7의 아릴이 융합(fused)될 수 있고,

상기 C_6-8의 아릴은 하이드록시, 니트로, C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 할로겐화알킬 및 C_1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환기가 1종 이상 치환될 수 있는 것을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게,

상기 R은 4-니트로페닐, 2,3-다이메톡시페닐, 3,4-다이메톡시페닐, 2-메톡시페닐, 3-메톡시페닐, 4-메톡시페닐, 2,4-다이메톡시페닐, 2,3,4-트리메톡시페닐, 2,4,5-트리메톡시페닐, 2,4,6-트리메톡시페닐, 2-하이드록시-5-니트로페닐, 5-브로모-2-하이드록시페닐, 3-니트로페닐, 2-플루오로페닐, 3-플로오로페닐, 4-플루오로페닐, 3-(트리플루오로메틸)페닐, 3-하이드록시페닐, 4-브로모페닐, 4-클로로페닐, 3,5-다이메톡시페닐, 3,4,5-트리메톡시페닐, 퓨란-2-일, 벤조[b]티오펜-2-일, 피리딘-2-일 또는 티오펜-3-일인 것을 특징으로 한다.

2)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2,3-다이메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

4)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2-메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

7)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2,4-다이메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

10)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(2,4,6-트리메톡시페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

15)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3- 플루오로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

16)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(4- 플루오로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

17)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-(트리 플루오로메틸)페닐)펜타-1,4-디엔-3-온;

24)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(벤조[b]티오펜-2-일)펜타-1,4-디엔-3-온;

25)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(피리딘-2-일)펜타-1,4-디엔-3-온; 및

26)(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(티오펜-3-일)펜타-1,4-디엔-3-온.

상기 암은 대장암, 유방암, 췌장암, 골수암 등일 수 있고, 바람직하게는 대장암일 수 있다.

본 발명의 화합물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.001~100 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.01~35 mg/kg/일이다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.07~7000 mg/일이며, 바람직하게는 0.7~2500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 제조

실시예 1 내지 26의 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체를 합성한 방법은 하기 반응식1에 나타낸 바와 같다. 이중 구체적으로 11번 화합물의 제조 방법은 아래와 같고 나머지 화합물들도 유사한 방법에 의해 합성하였다.

구체적으로, 알칼리 용액에서 화합물 2(2.5mmol, 745mhg)를 11ml의 과량의 아세톤에 용해시키고 5ml의 2M NaOH용액을 첨가하였다.

반응혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반한 뒤, 150ml의 얼음물에 부어서 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 진공 여과하고 추가반응에 사용하였다.

상기 침전물 (1mmol, 338mg) 및 2-퓨란알데하이드(1mmol, 96mg)를 에탄올 10ml에 용해시킨 뒤, 나트륨에톡사이드(2mmol, 136mg)를 첨가하고 실온에서 20시간 동안 교반하였다.

반응 완료 후, 혼합물을 얼음물에 붓고 3N HCl(pH=3)로 산성화 시켜 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 진공하에 여과하고 차가운 에탄올로 세척하고, 재결정하여 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 11을 얻었다(수율 25%, 용융점:120-122℃).

[반응식 1]

합성으로 얻은 실시예 1 내지 26의 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체들의 구조와 이름은 아래 표와 같다.

실시예	R	Mass (calcd./found)	Name	GI₅₀
1		472.1760/472.1757	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)penta-1,4-dien-3-one	0.75
2		487.2121/487.2109	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2,3-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.33
3		487.2121/487.2074	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3,4-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.16
4		457.2015/457.2009	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	2.81
5		457.2015/457.1985	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.20
6		457.2015/457.2006	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(4-methoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	4.23
7		487.2121/487.2079	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2,4-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	5.73
8		517.2226/517.2209	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2,3,4-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.63
9		517.2226/517.2220	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2,4,5-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	4.21
10		517.2226/517.2211	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2,4,6-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	5.04
11		488.1709/488.1718	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2-hydroxy-5-nitrophenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.09
12		521.0964/521.0980	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(5-bromo-2-hydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.38
13		472.1760/472.1774	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3-nitrophenyl)penta-1,4-dien-3-one	0.35
14		445.1815/445.1806	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(2-fluorophenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.11
15		445.1815/445.1815	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3-fluorophenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.16
16		445.1815/445.1786	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(4-fluorophenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.08
17		495.1783/495.1771	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3-(trifluoromethyl)phenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.37
18		443.1858/443.1833	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3-hydroxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	3.09
19		505.1014/505.1013	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(4-bromophenyl)penta-1,4-dien-3-one	3.73
20		461.1520/461.1537	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(4-chlorophenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.49
21		487.2121/487.2079	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3,5-dimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	1.16
22		517.2226/517.2186	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)penta-1,4-dien-3-one	3.39
23		417.1702/417.1685	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(furan-2-yl)penta-1,4-dien-3-one	4.93
24		483.1630/483.1643	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(benzo[b]thiophen-2-yl)penta-1,4-dien-3-one	4.95
25		428.1862/428.1863	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(pyridin-2-yl)penta-1,4-dien-3-one	0.66
26		433.1474/433.1477	(1E,4E)-1-(2-((E)-4-methoxystyryl)-4,6-dimethoxyphenyl)-5-(thiophen-3-yl)penta-1,4-dien-3-one	1.10

<실험예 1> 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체들의 구조 동정을 위한 핵자기공명분광 실험과 고성능질량분석실험

본 발명의 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체들의 구조를 확인하기 위하여 핵자기공명분광실험을 수행하였다. 합성한 시료들 중 일부를 제외한 모든 시료들은 deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO-d₆)에 약 50mM의 농도가 되도록 녹였다. 유도체 1과 11은 deuterated dimethylformamide (DMF-d7)에 녹였고, 유도체 6,13,17,19,20,24,25 는 deuterated chloroform (CHCl₃-d)에 녹였다. 그 이유는 용해도 차이 때문에 가장 잘 녹는 용매에 유도체들 녹이기 위하여 세가지 다른 용매를 사용하였다. 중수소용매에 녹인 시료들은 2.5-mm NMR tube에 옮겨서 핵자기공명분광실험에 사용하였다. 실험에 사용한 기기는 Avance 400 spectrometer system (9.4 T; Bruker, Karlsruhe, Germany) 이었고 실온에서 실험을 수행하였다. 수소핵자기공명분광(¹H-NMR) 실험은 relaxation delay, 90° pulse, spectral width, number of data points, digital resolution값들은 각각 1 sec, 11.8μs, 5,500Hz, 32K, 0.34Hz/point로 사용하였다. 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR) 실험은 위의 값들이 각각 3 sec, 15.0 μs, 21,000 Hz, 64 K, 0.64 Hz/point를 사용하였다. 일부 유도체들에 대해서는 구조 확인에 이차원핵자기공명분광 실험이 필요하여서 correlation spectroscopy (COSY), heteronuclear multiple quantum correlation (HMQC), heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) 실험들을 수행하였고 data point는 2K × 256 (t₂×t₁)으로 사용하였다. 자세한 실험 방법은 기존에 논문에 발표한 방법을 따랐다 [Magn Reson Chem 51:364]. 실험 결과 얻은 수소핵자기공명분광(¹H-NMR) data와 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR) data는 아래 표와 같다.

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 1 내지 5의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	1	2	3	4	5
H-2''	7.67 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.8)	7.56 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.7)
H-3''	7.02 (d, 8.7)	6.95 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.8)	6.95 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.7)
H-5''	7.02 (d, 8.7)	6.95 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.8)	6.95 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.7)
H-6''	7.67 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.8)	7.56 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.7)
4''-OCH₃	3.86 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)
H-1''α	7.20 (d, 16.1)	7.08 (d, 15.9)	7.08 (d, 15.9)	7.080 (d, 16.0)	7.07 (d, 16.0)
H-1''β	7.52 (d, 16.1)	7.35 (d, 15.9)	7.355 (d, 15.9)	7.35 (d, 16.0)	7.36 (d, 16.0)
H-3'	6.95 (d, 2.2)	6.83 (d, 2.3)	6.83 (d, 2.1)	6.82 (d, 2.2)	6.82 (d, 2.2)
H-5'	6.70 (d, 2.2)	6.60 (d, 2.3)	6.60 (d, 2.1)	6.60 (d, 2.2)	6.59 (d, 2.2)
4'-OCH₃	3.97 (s)	3.88 (s)	3.88 (s)	3.88 (s)	3.87 (s)
6'-OCH₃	4.01 (s)	3.91 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)
H-1'β	8.19 (d, 16.0)	7.98 (d, 15.9)	7.94 (d, 15.9)	7.95 (d, 16.0)	7.96 (d, 15.9)
H-1'α	7.28 (d, 16.0)	7.08 (d, 15.9)	7.08 (d, 15.9)	7.06 (d, 16.0)	7.10 (d, 15.9)
H-1α	7.61 (d, 16.1)	7.27 (d, 16.1)	7.17 (d, 16.1)	7.26 (d, 16.1)	7.28 (d, 16.1)
H-1β	7.79 (d, 16.1)	7.82 (d, 16.1)	7.546 (d, 16.1)	7.87 (d, 16.1)	7.55 (d 16.1)
H-2	8.08 (d, 8.7)	-	7.357 (d, 1.4)	-	7.29 (d, 1.9)
H-3	8.32 (d, 8.7)	-	-	7.079 (dd, 8.4, 1.0)	-
H-4	-	7.13 (dd, 8.1, 2.4)	-	7.41 (ddd, 8.4, 7.7, 1.6)	7.25 (d, 8.0)
H-5	8.32 (d, 8.7)	7.12 (dd, 8.1, 6.4)	6.97 (d, 9.0)	6.98 (ddd, 7.7, 7.7, 1.0)	7.32 (dd, 8.0, 8.0)
H-6	8.08 (d, 8.7)	7.39 (dd, 6.4, 2.4)	7.20 (dd, 9.0, 1.4)	7.73 (dd, 7.7, 1.6)	6.99 (dd, 8.0, 1.9)
2-OCH₃	-	3.72 (s)	-	3.82 (s)	-
3-OCH₃	-	3.82 (s)	3.81 (s)	-	3.78 (s)
4-OCH₃	-	-	3.80 (s)	-	-
5-OCH₃	-	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 6 내지 9의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	6	7	8	9
H-2''	7.48 (d, 8.8)	7.55 (d, 8.7)	7.55 (d, 8.5)	7.55 (d, 8.6)
H-3''	6.901 (d, 8.8)	6.95 (d, 8.7)	6.95 (d, 8.5)	6.94 (d, 8.6)
H-5''	6.901 (d, 8.8)	6.95 (d, 8.7)	6.95 (d, 8.5)	6.94 (d, 8.6)
H-6''	7.48 (d, 8.8)	7.55 (d, 8.7)	7.55 (d, 8.5)	7.55 (d, 8.6)
4''-OCH₃	3.825 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)
H-1''α	6.94 (d, 15.9)	7.08 (d, 16.1)	7.08 (d, 16.1)	7.08 (d, 15.9)
H-1''β	7.31 (d, 15.9)	7.33 (d, 16.1)	7.33 (d, 16.1)	7.35 (d, 15.9)
H-3'	6.72 (d, 2.0)	6.82 (d, 2.2)	6.82 (d, 2.0)	6.83 (d, 2.0)
H-5'	6.43 (d, 2.0)	6.59 (d, 2.2)	6.60 (d, 2.0)	6.59 (d, 2.0)
4'-OCH₃	3.89 (s)	3.87 (s)	3.88 (s)	3.88 (s)
6'-OCH₃	3.89 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)
H-1'β	8.09 (d, 15.9)	7.91 (d, 15.9)	7.94 (d, 16.1)	7.92 (d, 15.9)
H-1'α	7.07 (d, 15.9)	7.02 (d, 15.9)	7.06 (d, 16.1)	7.05 (d, 15.9)
H-1α	6.899 (d, 16.0)	7.12 (d, 16.2)	7.16 (d, 16.1)	7.17 (d, 16.0)
H-1β	7.61 (d, 16.0)	7.81 (d, 16.2)	7.73 (d, 16.1)	7.88 (d, 16.0)
H-2	7.45 (d, 8.7)	-	-	-
H-3	6.88 (d, 8.7)	6.61 (d, 2.3)	-	6.71 (s)
H-4	-	-	-	-
H-5	6.88 (d, 8.7)	6.57 (dd, 8.6, 2.3)	6.86 (d, 8.9)	-
H-6	7.45 (d, 8.7)	7.66 (d, 8.6)	7.53 (d, 8.9)	7.32 (s)
2-OCH₃	-	3.81 (s)	3.77 (s)	3.82 (s)
3-OCH₃	-	-	3.75 (s)	-
4-OCH₃	3.833 (s)	3.82 (s)	3.84 (s)	3.85 (s)
5-OCH₃	-	-	-	3.75 (s)

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 10 내지 13의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	10	11	12	13
H-2''	7.55 (d, 8.6)	7.66 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.5)	7.47 (d, 8.7)
H-3''	6.95 (d, 8.6)	7.01 (d, 8.7)	6.96 (d, 8.5)	6.90 (d, 8.7)
H-5''	6.95 (d, 8.6)	7.01 (d, 8.7)	6.96 (d, 8.5)	6.90 (d, 8.7)
H-6''	7.55 (d, 8.6)	7.66 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.5)	7.47 (d, 8.7)
4''-OCH₃	3.77 (s)	3.85 (s)	3.77 (s)	3.82 (s)
H-1''α	7.07 (d, 16.1)	7.19 (d, 16.1)	7.09 (d, 16.0)	6.93 (d, 16.1)
H-1''β	7.31 (d, 16.1)	7.52 (d, 16.1)	7.36 (d, 16.0)	7.30 (d, 16.1)
H-3'	6.81 (d, 2.0)	6.95 (d, 2.2)	6.83 (d, 1.8)	6.72 (d, 2.3)
H-5'	6.59 (d, 2.0)	6.68 (d, 2.2)	6.60 (d, 1.8)	6.43 (d, 2.3)
4'-OCH₃	3.87 (s)	3.97 (s)	3.88 (s)	3.89 (s)
6'-OCH₃	3.90 (s)	4.00 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)
H-1'β	7.87 (d, 16.1)	8.17 (d, 16.1)	7.96 (d, 16.0)	8.14 (d, 15.9)
H-1'α	6.98 (d, 16.1)	7.25 (d, 16.1)	7.05 (d, 16.0)	7.116 (d, 15.9)
H-1α	7.28 (d, 16.0)	7.68 (d, 16.1)	7.369 (d, 16.0)	7.120 (d, 15.9)
H-1β	7.95 (d, 16.0)	8.03 (d, 16.1)	7.79 (d, 16.0)	7.65 (d, 15.9)
H-2	-	-	-	8.36 (dd, 1.5, 1.5)
H-3	6.28 (s)	7.17 (d, 8.9)	6.94 (d, 9.0)	-
H-4	-	8.15 (dd, 8.9, 3.0)	7.375 (dd, 9.0, 2.5)	8.19 (dd, 8.1, 1.5)
H-5	6.28 (s)	-	-	7.54 (dd, 8.1, 8.1)
H-6	-	8.63 (d, 3.0)	7.88 (d, 2.5)	7.79 (dd, 8.1, 1.5)
2-OCH₃	3.81 (s)	-	-	-
4-OCH₃	3.84 (s)	-	-	-
6-OCH₃	3.81 (s)	-	-	-
2-OH	-	-	10.64 (s)	-
3-OH	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 14 내지 18의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	14	15	16	17	18
H-2''	7.56 (d, 8.7)	7.565 (d, 8.7)	7.55 (d, 9.0)	7.48 (d, 8.7)	7.57 (d, 8.7)
H-3''	6.94 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.7)	6.94 (d, 9.0)	6.90 (d, 8.7)	6.96 (d, 8.7)
H-5''	6.94 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.7)	6.94 (d, 9.0)	6.90 (d, 8.7)	6.96 (d, 8.7)
H-6''	7.56 (d, 8.7)	7.565 (d, 8.7)	7.55 (d, 9.0)	7.48 (d, 8.7)	7.57 (d, 8.7)
4''-OCH₃	3.77 (s)	3.77 (s)	3.77 (s)	3.83 (s)	3.78 (s)
H-1''α	7.07 (d, 15.9)	7.07 (d, 16.1)	7.07 (d, 16.1)	6.94 (d, 16.0)	7.083 (d, 16.1)
H-1''β	7.35 (d, 15.9)	7.36 (d, 16.1)	7.34 (d, 16.1)	7.31 (d, 16.0)	7.36 (d, 16.1)
H-3'	6.82 (d, 2.0)	6.82 (d, 2.0)	6.81 (d, 2.0)	6.72 (d, 2.3)	6.83 (d, 2.2)
H-5'	6.59 (d, 2.0)	6.59 (d, 2.0)	6.59 (d, 2.0)	6.44 (d, 2.3)	6.60 (d, 2.2)
4'-OCH₃	3.88 (s)	3.88 (s)	3.87 (s)	3.90 (s)	3.88 (s)
6'-OCH₃	3.89 (s)	3.91 (s)	3.90 (s)	3.91 (s)	3.91 (s)
H-1'β	7.99 (d, 16.0)	7.99 (d, 16.0)	7.96 (d, 15.9)	8.14 (d, 15.9)	7.96 (d, 15.9)
H-1'α	7.07 (d, 16.0)	7.09 (d, 16.0)	7.08 (d, 15.9)	7.11 (d, 15.9)	7.088 (d, 15.9)
H-1α	7.35 (d, 16.0)	7.36 (d, 16.0)	7.22 (d, 16.0)	7.07 (d, 16.0)	7.16 (d, 16.0)
H-1β	7.67 (d, 16.0)	7.568 (d, 16.0)	7.58 (d, 16.0)	7.65 (d, 16.0)	7.51 (d, 16.0)
H-2	-	7.62 (dd, 10.5, 2.2)	7.77 (dd, 8.6, 5.7)	7.77 (s)	7.13 (s)
H-3	7.28 (dd, 10.6, 7.8)	-	7.24 (dd, 9.6, 8.6)	-	-
H-4	7.48 (dddd, 7.8, 7.8, 6.0, 1.8)	7.25 (ddd, 8.4, 8.4, 2.2)	-	7.63 (d, 7.7)	6.85 (dd, 7.8, 2.5)
H-5	7.26 (dd, 7.8, 7.8)	7.46 (ddd, 8.4, 8.0, 6.0)	7.24 (dd, 9.6, 8.6)	7.49 (dd, 7.7, 7.7)	7.22 (dd, 7.8, 7.8)
H-6	7.87 (ddd, 7.8, 7.8, 1.8)	7.52 (d, 8.0)	7.77 (dd, 8.6, 5.7)	7.68 (d, 7.7)	7.10 (dd, 7.8, 2.5)
2-OCH₃	-	-	-	-	-
4-OCH₃	-	-	-	-	-
6-OCH₃	-	-	-	-	-
2-OH	-	-	-	-	-
3-OH	-	-	-	-	9.60 (s)

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 19 내지 22의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	19	20	21	22
H-2''	7.47 (d, 8.6)	7.47 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.5)	7.56 (d, 8.7)
H-3''	6.90 (d, 8.6)	6.90 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.5)	6.94 (d, 8.7)
H-5''	6.90 (d, 8.6)	6.90 (d, 8.7)	6.94 (d, 8.5)	6.94 (d, 8.7)
H-6''	7.47 (d, 8.6)	7.47 (d, 8.7)	7.56 (d, 8.5)	7.56 (d, 8.7)
4''-OCH₃	3.83 (s)	3.83 (s)	3.77 (s)	3.76 (s)
H-1''α	6.93 (d, 16.1)	6.93 (d, 15.9)	7.07 (d, 16.1)	7.08 (d, 16.1)
H-1''β	7.29 (d, 16.1)	7.29 (d, 15.9)	7.36 (d, 16.1)	7.37 (d, 16.1)
H-3'	6.71 (d, 2.2)	6.71 (d, 2.2)	6.82 (d, 1.6)	6.83 (d, 2.3)
H-5'	6.43 (d, 2.2)	6.43 (d, 2.2)	6.59 (d, 1.6)	6.60 (d, 2.3)
4'-OCH₃	3.891 (s)	3.891 (s)	3.87 (s)	3.88 (s)
6'-OCH₃	3.894 (s)	3.893 (s)	3.90 (s)	3.90 (s)
H-1'β	8.11 (d, 15.9)	8.11 (d, 15.9)	7.97 (d, 15.9)	7.96 (d, 15.9)
H-1'α	7.07 (d, 15.9)	7.08 (d, 15.9)	7.09 (d, 15.9)	7.10 (d, 15.9)
H-1α	6.99 (d, 16.0)	6.98 (d, 16.0)	7.28 (d, 16.0)	7.26 (d, 16.1)
H-1β	7.55 (d, 16.0)	7.57 (d, 16.0)	7.51 (d, 16.0)	7.55 (d, 16.1)
H-2	7.34 (d, 8.4)	7.41 (d, 8.5)	6.88 (d, 1.6)	7.06 (s)
H-3	7.48 (d, 8.4)	7.32 (d, 8.5)	-	-
H-4	-	-	6.55 (dd, 1.6, 1.6)	-
H-5	7.48 (d, 8.4)	7.32 (d, 8.5)		-
H-6	7.34 (d, 8.4)	7.41 (d, 8.5)	6.88 (d, 1.6)	7.06 (s)
H-7	-	-	-	-
3-OCH₃	-	-	3.77 (s)	3.81 (s)
4-OCH₃	-	-	-	3.70 (s)
5-OCH₃	-	-	3.77 (s)	3.81 (s)

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 23 내지 26의 수소핵자기공명분광(¹H-NMR)

Position	23	24	25	26
H-2''	7.55 (d, 8.7)	7.49 (d, 8.7)	7.45 (d, 8.6)	7.55 (d, 8.7)
H-3''	6.96 (d, 8.7)	6.92 (d, 8.7)	6.88 (d, 8.6)	6.95 (d, 8.7)
H-5''	6.96 (d, 8.7)	6.92 (d, 8.7)	6.88 (d, 8.6)	6.95 (d ,8.7)
H-6''	7.55 (d, 8.7)	7.49 (d, 8.7)	7.45 (d, 8.6)	7.55 (d, 8.7)
4''-OCH₃	3.78 (s)	3.82 (s)	3.80 (s)	3.77 (s)
H-1''α	7.07 (d, 16.1)	6.94 (d, 16.0)	6.92 (d, 16.1)	7.07 (d, 16.1)
H-1''β	7.32 (d, 16.1)	7.32 (d, 16.0)	7.30 (d, 16.1)	7.34 (d, 16.1)
H-3'	6.81 (d, 2.2)	6.72 (d, 2.3)	6.70 (d, 1.8)	6.82 (d, 2.0)
H-5'	6.59 (d, 2.2)	6.44 (d, 2.3)	6.41 (d, 1.8)	6.59 (d, 2.0)
4'-OCH₃	3.87 (s)	3.90 (s)	3.87 (s)	3.87 (s)
6'-OCH₃	3.90 (s)	3.91 (s)	3.88 (s)	3.89 (s)
H-1'β	7.92 (d, 15.9)	8.12 (d, 15.9)	8.14 (d, 15.9)	7.94 (d, 15.9)
H-1'α	7.04 (d, 15.9)	7.08 (d, 15.9)	7.14 (d, 15.9)	7.06 (d, 15.9)
H-1α	6.90 (d, 15.8)	6.89 (d, 15.9)	7.54 (d, 15.6)	7.09 (d, 15.9)
H-1β	7.43 (d, 15.8)	7.84 (d, 15.9)	7.64 (d, 15.6)	7.62 (d, 15.9)
H-2	-	-	-	7.93 (d, 3.1)
H-3	6.96 (d, 3.4)	7.38 (s)	7.38 (d, 7.4)	-
H-4	6.65 (dd, 3.4, 1.8)	7.74 (dd, 6.5, 2.6)	7.68 (ddd, 7.4, 7.4, 1.9)	7.61 (dd, 5.0, 3.1)
H-5	7.85 (d, 1.8)	7.35 (dd, 6.5, 2.4)	7.23 (dd, 7.4, 4.5)	7.63 (d, 5.0)
H-6	-	7.36 (dd, 6.7, 2.6)	8.63 (dd, 4.5, 1.9)	-
H-7	-	7.78 (dd, 6.7, 2.4)	-	-
3-OCH₃	-	-	-	-
4-OCH₃	-	-	-	-
5-OCH₃	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 1 내지 7의 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR)

Position	1	2	3	4	5	6	7
C-1''	130.93	129.5	129.6	129.5	129.5	130.08	129.5
C-2''	129.2	128.1	128.1	128.1	128.1	128.2	128.1
C-3''	115.2	114.3	114.3	114.3	114.3	114.41	114.3
C-4''	160.8	159.3	159.3	159.3	159.3	159.8	159.3
C-5''	115.2	114.3	114.3	114.3	114.3	114.41	114.3
C-6''	129.2	128.1	128.1	128.1	128.1	128.2	128.1
4''-OCH₃	56.0	55.2	55.2	55.2	55.16	55.46	55.2
C-1''α	133.4	132.0	131.8	131.95	132.0	131.7	131.8
C-1''β	125.6	124.4	124.6	124.6	124.6	125.8	124.6
C-1'	115.9	114.6	114.8	114.7	114.7	116.3	114.8
C-2'	142.9	141.3	141.0	141.2	141.2	141.5	141.0
C-3'	105.2	104.1	104.0	104.1	104.0	103.8	104.0
C-4'	163.3	161.6	161.4	161.5	161.5	161.5	161.4
C-5'	98.7	97.8	97.8	97.8	97.8	97.8	97.8
C-6'	162.2	160.6	160.5	160.6	160.6	160.8	160.4
4'-OCH₃	56.3	55.5	55.5	55.5	55.5	55.6	55.5
6'-OCH₃	56.6	55.9	55.9	55.9	55.9	55.8	55.9
C-1'β	138.8	136.9	136.3	136.6	136.9	137.2	135.9
C-1'α	129.1	128.1	128.4	128.3	128.1	128.9	128.6
C=O	189.8	188.7	188.6	188.8	188.8	189.8	188.6
C-1α	131.30	127.2	124.3	126.3	126.7	124.5	123.86
C-1β	140.0	135.9	142.4	136.6	141.8	142.5	136.9
C-1	142.8	128.2	127.5	123.0	136.1	127.8	115.9
C-2	130.4	148.1	110.5	158.1	113.1	130.14	159.8
C-3	125.0	152.8	149.0	111.8	159.6	114.44	98.3
C-4	149.3	114.8	151.1	132.00	121.2	161.6	162.8
C-5	125.0	124.3	111.6	120.7	129.9	114.44	106.3
C-6	130.4	118.9	123.4	128.4	116.4	130.14	130.0
2-OCH₃	-	60.8	-	55.6	-	-	55.7
3-OCH₃	-	55.8	55.59	-	55.23	-	-
4-OCH₃	-	-	55.63	-	-	55.50	55.7
5-OCH₃	-	-	-	-	-	-	-
6-OCH₃	-	-	-	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 8 내지 14의 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR)

Position	8	9	10	11	12	13	14
C-1''	129.5	129.5	129.6	131.0	129.5	129.9	129.5
C-2''	128.1	128.1	128.0	129.2	128.1	128.2	128.2
C-3''	114.2	114.2	114.3	115.2	114.3	114.4	114.3
C-4''	159.3	159.3	159.3	160.8	159.3	159.9	159.3
C-5''	114.2	114.2	114.3	115.2	114.3	114.4	114.3
C-6''	128.1	128.1	128.0	129.2	128.1	128.2	128.2
4''-OCH₃	55.1	55.2	55.2	56.0	55.2	55.5	55.2
C-1''α	131.9	131.8	131.7	133.1	132.0	132.2	132.1
C-1''β	124.5	124.5	125.1	125.6	124.4	125.4	124.4
C-1'	114.6	114.8	114.8	116.1	114.7	115.7	114.5
C-2'	141.1	141.0	140.9	142.6	141.1	142.1	141.4
C-3'	104.0	104.0	104.1	105.1	103.9	104.1	104.1
C-4'	161.4	161.3	161.3	163.0	161.5	162.0	161.7
C-5'	97.8	97.8	97.8	98.7	97.8	97.8	97.8
C-6'	160.5	160.5	160.4	162.1	160.6	161.1	160.7
4'-OCH₃	55.4	55.5	55.47	56.3	55.5	55.6	55.5
6'-OCH₃	55.8	55.9	55.90	56.6	55.9	55.9	55.9
C-1'β	136.3	135.9	135.3	137.9	136.7	138.7	137.3
C-1'α	128.2	128.8	129.0	129.9	128.7	128.1	128.1
C=O	188.5	188.6	189.4	190.1	188.8	189.0	188.5
C-1α	125.0	123.5	124.8	128.6	126.4	129.0	128.4
C-1β	136.4	136.5	133.3	137.0	135.7	139.4	133.3
C-1	121.0	114.3	105.0	123.6	123.8	137.0	122.4
C-2	152.8	154.0	161.2	166.2	156.3	122.5	160.8
C-3	141.8	97.6	91.0	118.2	118.4	148.8	116.1
C-4	155.5	152.6	163.2	127.7	133.8	124.4	132.3
C-5	108.4	143.1	91.0	140.2	110.7	130.0	125.0
C-6	123.2	110.8	161.2	125.8	130.3	134.1	129.1
2-OCH₃	61.3	56.3	55.93	-	-	-	-
3-OCH₃	60.4	-	-	-	-	-	-
4-OCH₃	56.0	55.8	55.53	-	-	-	-
5-OCH₃	-	56.2	-	-	-	-	-
6-OCH₃	-	-	55.93	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 15 내지 21의 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR)

Position	15	16	17	18	19	20	21
C-1''	129.5	129.5	130.0	129.5	130.0	130.0	129.5
C-2''	128.14	128.1	128.2	128.1	128.2	128.2	128.13
C-3''	114.2	114.3	114.4	114.3	114.3	114.3	114.3
C-4''	159.3	159.3	159.9	159.3	159.8	159.8	159.3
C-5''	114.2	114.3	114.4	114.3	114.4	114.4	114.3
C-6''	128.14	128.1	128.2	128.1	128.2	128.2	128.13
4''-OCH₃	55.1	55.2	55.5	55.1	55.5	55.5	55.1
C-1''α	132.0	131.9	132.1	131.9	131.9	131.9	131.9
C-1''β	124.5	124.6	125.5	124.6	125.7	125.7	124.6
C-1'	114.6	114.7	115.9	114.67	116.0	116.0	114.7
C-2'	141.3	141.2	142.0	141.1	141.8	141.8	141.2
C-3'	104.0	104.0	104.0	104.0	104.0	104.0	104.1
C-4'	161.6	161.5	162.0	161.5	161.8	161.8	161.6
C-5'	97.8	97.8	97.8	97.8	97.8	97.7	97.8
C-6'	160.6	160.6	161.0	160.5	160.9	160.9	160.6
4'-OCH₃	55.5	55.5	55.6	55.5	55.6	55.6	55.5
6'-OCH₃	55.9	55.9	55.9	55.9	55.8	55.8	55.9
C-1'β	137.2	136.8	138.4	136.7	138.1	138.0	136.7
C-1'α	128.07	128.1	128.3	128.1	128.4	128.4	128.07
C=O	188.7	188.6	189.3	188.6	189.5	189.5	188.8
C-1α	127.7	126.3	128.1	126.3	127.0	126.9	126.9
C-1β	140.3	140.6	140.6	142.1	141.1	141.0	142.0
C-1	137.3	131.4	136.1	136.0	134.1	133.7	136.9
C-2	114.4	130.8	124.8	119.5	129.8	129.5	106.3
C-3	162.5	115.9	131.4	157.7	132.2	129.2	160.7
C-4	117.0	163.2	126.6	117.6	124.5	136.1	102.6
C-5	130.8	115.9	129.5	129.9	132.2	129.2	160.7
C-6	125.0	130.8	131.5	114.73	129.8	129.5	106.3
C-7	-	-	-	-	-	-	-
C-8	-	-	-	-	-	-	-
C-9	-	-	-	-	-	-	-
3-OCH₃	-	-	-	-	-	-	55.4
4-OCH₃	-	-	-	-	-	-	-
5-OCH₃	-	-	-	-	-	-	55.4
3-CF₃	-	-	122.6	-	-	-	-

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 22 내지 26의 탄소핵자기공명분광(¹³C-NMR)

Position	22	23	24	25	26
C-1''	129.5	129.5	130.0	130.0	129.5
C-2''	128.1	128.13	128.2	128.2	128.1
C-3''	114.2	114.3	114.4	114.3	114.3
C-4''	159.3	159.3	159.8	159.7	159.3
C-5''	114.2	114.3	114.4	114.3	114.3
C-6''	128.1	128.13	128.2	128.2	128.1
4''-OCH₃	55.2	55.2	55.5	55.4	55.2
C-1''α	131.9	132.0	132.0	132.0	131.9
C-1''β	124.5	124.5	125.0	125.3	124.6
C-1'	114.7	114.6	116.0	115.8	114.7
C-2'	141.1	141.2	141.9	141.9	141.1
C-3'	104.0	104.1	103.9	103.8	104.0
C-4'	161.5	161.6	161.9	161.8	161.5
C-5'	97.8	97.8	97.8	97.7	97.8
C-6'	160.6	160.6	161.0	161.0	160.5
4'-OCH₃	55.5	55.5	55.8	55.7	55.5
6'-OCH₃	55.9	55.9	55.6	55.5	55.9
C-1'β	136.6	136.5	138.0	138.2	136.5
C-1'α	128.2	128.05	128.6	128.7	128.1
C=O	188.7	188.0	189.1	189.9	188.9
C-1α	125.8	123.4	127.7	129.8	125.8
C-1β	142.3	128.6	135.5	140.8	135.8
C-1	130.3	-	-	-	-
C-2	106.1	151.0	140.7	153.7	129.8
C-3	153.1	116.5	129.3	124.9	138.1
C-4	139.6	113.0	124.5	136.8	126.1
C-5	153.1	146.0	125.0	124.1	127.7
C-6	106.1	-	126.3	150.1	-
C-7	-	-	122.6	-	-
C-8	-	-	140.3	-	-
C-9	-	-	139.9	-	-
3-OCH₃	56.0	-	-	-	-
4-OCH₃	60.1	-	-	-	-
5-OCH₃	56.0	-	-	-	-
3-CF₃	-	-	-	-	-

또한, 핵자기공명분광 실험으로 동정한 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체들의 구조를 재확인하기 위하여 고성능질량분석(high-resolution mass spectrometry (HR/MS) 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 기기는 ultraperformance liquid chromatography (UPLC)-hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer with a Waters Acquity UPLC system (Waters Corp., Milford, MA) 이었고 실험 방법은 기존에 논문에 발표한 방법을 따랐다 [Magn Reson Chem 54:382]. 실험으로 얻은 질량값과 이론적으로 얻은 질량값들은 위의 표에 삽입한 결과와 같고 이론적으로 예측한 질량값과 본 실험에서 얻은 값들은 잘 일치한 결과를 얻었다.

<실험예 2> clonogenic long-term survival assay

HCT116 사람 대장암세포를 ATTC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic 용액 (Invitrogen Life Technologies)을 포함한 DMEM (Invitrogen Life Technologies) 배양액을 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

기하급수적으로 성장하는 HCT116 세포를 24-웰 조직 배양 플레이트 (BD Falcon; Becton Dickinson, SanJose, CA, USA)에 5 x 10³세포/웰로 파종하고 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체를 0, 1, 5, 10 및 20μM농도로 처리하였다.

7일 후 6% 글루타르 알데하이드 (glutaraldehyde)와 0.5% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet) 용액을 1:1로 섞어준 혼합액을 세포에 첨가한 후 15분 동안 반응시켜 남아있는 세포를 염색하였다. 본 발명에 따른 화합물 1-26에 의한 HCT116 대장암 세포의 성장 억제능은 CCK-8 키트 (Cell Counting Kit-8; Dojindo 회사, 일본)를 이용하여 측정하였다. HCT116 대장암세포를 96-well 세포 배양판에 1 x 10⁴ 개 되도록 분주한 후 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체를 처리하고 각각 24 시간과 48 시간 후에 CCK-8 용액 10 ㎕를 첨가하였다. 2 시간 후에 세포배양액의 흡광도를 450 nm에서 측정하여 세포 생존능을 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 1-26을 처리한 세포군에서는 처리 농도에 의존적으로 세포 성장이 감소되는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 화합물에 의해 HCT116 대장암세포의 증식이 저해되었음을 시사하는 것이다.

<실험예 3> 암세포 콜로니 형성 저해 효과 분석

암세포 콜로니 형성 저해 효과는 densitometry를 이용하여 측정하였고 half maximal cell growth inhibitory concetrations (GI₅₀) 값은 SigmaPlot 프로그램을 이용하여 얻었는데 표준편차 오차 막대와 함께 GI₅₀ 값은 도 2와 같으며 0.35 uM에서 5.73uM의 범위이다(표 1참조).

<실험예 4> 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체의 기전 확인

펜타디엔온-레스베라트롤 유도체 1-26 중 가장 우수한 암세포 콜로니 형성 저해 효과를 보인 (350nM) (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 (하기 구조식 1참조)에 대해서 추가적인 생물학적 실험을 수행하였다.

[구조식 1]

통상적으로 세포내 DNA 함량 측정을 통하여 세포주기 진행과정 (Cell cycle progression)을 분석한다. 세포 주기 중에서 G1기 세포는 2N 함량의 DNA를 포함하며, S기 세포는 2N과 4N 사이의 양을, G2기와 M기 세포는 4N DNA 양을 포함한다. 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체에 의해 암세포의 세포 주기 진행이 손상 받는지의 여부를 유세포 분리 측정기(Flow cytometer; BD Science, 미국)를 이용하여 조사하였다. HCT116 대장암 세포는 ATTC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies, USA)와 Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies, USA)이 포함된 DMEM (Invitrogen Life Technologies) 배양액에서 1 x 10⁶의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

HCT116 대장암 세포에 20 μM 농도의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리하고 24시간 후에 세포를 수확하여 70% 에탄올로 세포를 고정시켰다. PI(Propidium Iodine)를 30분간 반응하여 세포내 DNA를 염색한 후, DNA 양의 변화를 측정함으로써 세포주기를 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군 세포에서 G1 세포 주기를 가지는 세포는 약 53%였지만 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리한 세포군에서는 30%로 감소하였다. S 주기 세포는 대조군 세포와 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리한 세포에서 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나, 대조군에서 G2/M 주기를 가지는 세포는 21%였지만 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리한 세포군에서는 40%로 크게 증가하였다. 이때, 세포사멸을 의미하는 sub-G1 세포의 양은 대조군 2%에서 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리한 세포군은 4%로 증가 되는 것이 관찰되었다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 화합물은 HCT116 대장암 세포의 G2/M기 진행을 차단하여 암세포의 증식을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체에 의한 세포주기 진행 차단 분자 기전 확인

(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온에 의한 세포주기 진행 차단 분자 기전을 규명하기 위하여 G1과 G2/M 세포주기 진행에 중요한 역할을 하는 cyclin D1과 cyclin B 단백질의 발현량을 분석하기 위하여 Western blot analysis를 수행하였다.

상기와 같이 HCT116 대장암 세포를 배양한 후, 20 μM 농도의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리한 후 6, 12, 24 시간 후에 세포를 수확하였다. 수확된 세포에 20 mM HEPES 완충용액 + 1% Triton X-100 + 10% 글리세롤 + 150 mM NaCl + 10 ㎍/㎖ leupeptin + 1 mM PMSF 가 함유된 세포용해액을 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 상층의 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함되도록 제조된 세포 용해액을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포 단백질들을 분자량별로 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filter)에 옮긴 후 cyclin D1과 cyclin B1 단백질을 인지하는 일차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현양이 변화되지 않는 GAPDH 단백질을 인지하는 일차항체 (Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인자하는 이차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템 (Chemiluminescence detection system; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 이용하여 X-ray 필름상에서 각 단백질의 발현 변화를 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타난바와 같이, 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온을 처리하면 시간 의존적으로 cyclin D와 cyclin B1 단백질 발현양이 점차 감소되어, 처리 24시간 후에는 단백질양이 거의 검출되지 않았다. 이때 대조 단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았다.

이러한 결과는, 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온화합물이 대장암세포에 작용하면 cyclin D와 cyclin B1 단백질 발현을 감소시켜, 세포주기 진행을 차단시킨다는 것을 의미하는 것이다.

<실험예 6> 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체의 튜불린 중합체 생성 억제 확인

칼콘 모핵을 가지는 일부 유도체는 튜불린 중합체 생성을 억제하여 G2/M 세포주기의 진행을 차단하는 것으로 알려져 있다 (J Agric Food Chem 2013,61,1258812597). 세포를 용해시키면 중합되지 않은 튜불린 단백질은 수용층 분획(soluble fraction)에서 검출되지만, 튜불린 중합체가 생성되면 비수용층인 미립자 분획(particulate fraction)에서 검출된다 (J Agric Food Chem 2013,61,1258812597). 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온이 튜불린 중합체 생성을 방해하여 G2/M 세포주기 진행을 억제시켰는지 확인하였다.

상기와 같이 HCT116 대장암 세포를 배양한 후, 20 μM 농도의(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 (유도체13)과 2 μM Taxol, 50 nM Colchicine을 각각 24 시간 동안 처리하였다. 세포를 수확하고, 20 mM HEPES (pH 7.2), 1% Triton X-100, 10% glycerol, 10 μg/mL leupeptin, 1 mM phenylmethanesulfonyl fluoride가 함유된 저삼투압 완충액(hypotonic buffer)에서 용해시키고, 12,000 rpm에서 30 분간 원심 분리하여 상등액의 비중합체 튜불린을 함유하는 수용성 분획층 (Soluble)과 불용성 튜불린 중합체를 함유하는 미립자 분획층 (Particulate)을 분리하였다. 튜불린 항체를 이용하여 면역블롯을 실시하였다. 액틴(Actin)은 미립자 분획에 대한 대조군으로서 사용하였고, GAPDH는 수용성 분획에 대한 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 튜뷸린 중합체의 분해를 억제하는 항암제인 탁솔(Taxol)은 미립자 분획층 (Particulate)에서 튜불린 단백질이 검출되지만 수용층에서는 검출되지 않았다. 반면에, 튜뷸린 중합을 억제하는 콜키신(Colchicine)을 처리하면 튜불린 단백질이 미립자 분획층에는 검출되지 않고 수용층에서 검출되었다. 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온(유도체13)을 처리하면 콜키신과 유사하게 튜불린 단백질이 미립자 분획층에는 검출되지 않고 수용층에서 검출되었다. 이러한 실험 결과는 본 발명의 (1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온이 튜불린 중합체 생성을 억제하여 유사분열의 M기 진행을 차단한다는 것을 의미한다.

결론적으로, 본 발명에 따른 펜타디엔온-레스베라트롤 유도체는 대장암세포에 작용하면 cyclin D와 cyclin B1 단백질 발현을 감소시키고, 튜불린 중합체 생성을 억제시켜, 암세포의 G2/M 세포주기 진행을 차단시킴으로써, 암세포의 증식을 억제시키는 항암 효과를 가진다는 결론을 얻게 되었다.

약제의 제조예

본 발명에 따른 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<약제 제조예 1> 산제의 제조

본 발명 화합물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<약제 제조예 2> 정제의 제조

본 발명 화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조

본 발명 화합물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<약제 제조예 4> 주사제의 제조

본 발명 화합물 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명 화합물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조

본 발명 화합물 1.0 g

아세트산나트륨 0.3 g

메틸파라벤 0.1 g

프로필파라벤 0.02 g

염화나트륨 적량

HCl 또는 NaOH pH 조정 적량

정제수 적량

통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 본 발명 화합물 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.

<약제 제조예 6> 액제의 제조

본 발명 화합물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
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하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이,
화합물 2와 과량의 아세톤을 알돌축합중합을 통해 화합물 3을 얻는 단계(단계 1); 및
상기 단계 1에서 얻은 화합물 3과 화합물 4를 유기용매에 용해시킨 뒤 과량의 수산화 칼륨을 첨가하고 실온에서 20-48시간 교반하여 화합물 1을 얻는 단계(단계 2);
를 포함하는 제1항의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조방법:
[반응식 1]

(상기 반응식 1에서,
상기 R은 3-니트로페닐이다).
제 5항에 있어서,
상기 단계 2의 유기용매는 에탄올, 테트라하이드로퓨란(THF), 벤젠, KOH/MeOH, MeOH, 톨루엔, CH₂Cl₂, 헥산, 디메틸포름아미드(DMF), 디이소프로필에테르, 디에틸에테르, 디옥산, 디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤 및 클로로벤젠으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
(1E,4E)-1-(2-((E)-4-메톡시스티릴)-4,6-다이메톡시페닐)-5-(3-니트로페닐)펜타-1,4-디엔-3-온 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
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제 7항에 있어서,
상기 암은 대장암, 유방암, 췌장암 및 골수암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물
제11항에 있어서,
상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.