KR101457638B1 - 피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그것을 포함하는 항암 조성물 - Google Patents

피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그것을 포함하는 항암 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그것을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그들의 사람 대장암 세포에서 G1 세포주기 진행 억제 효과를 갖는 항암제용 약학조성물에 관한 것이다.

Description

피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그것을 포함하는 항암 조성물{A pyrazolylnaphthalenol derivative, preparation method thereof and composition for anti-cancer comprising the pyrazolylnaphthalenol derivative}
본 발명은 피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그것을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 피라졸릴나프탈레놀 유도체, 그 제법 및 그들의 사람 대장암 세포에서 G1 세포주기 진행 억제 효과를 갖는 항암제용 약학조성물에 관한 것이다.
모든 세포들은 다양한 기작에 의한 세포주기 조절을 통해 정상적으로 증식하며 성장한다. 세포주기의 과정은 크게 간기(Interphase)와 분열기(Mitotic phase)로 나뉜다. 전자는 또다시 세 개의 과정으로 나뉘는데, 세포들이 세포분열에 필요한 각종 단백질의 합성이 일어나는 G(1)-phase와 DNA 합성이 일어나는 S-phase, 세포분화 과정인 유사분열(Mitosis-phase) 단계이다. 세포분열과정에 관여하는 각종 사이클린(Cyclin) 단백질은 사이클린 의존성 키나아제(Cyclin Dependent Kinase, CDK)라고 불리는 인산화 효소와 cyclin/CDK 복합체를 형성하여 세포주기의 단계를 조절 한다. 그중에서도 사이클린디-1(Cyclin D1) 은 G1 단계에서 S 단계로 진행하는데 있어 중요한 역할을 하는 단백질이다. 사이클린디1(cyclin D1)이 CDK4, 혹은 CDK6과 복합체를 이루어 활성화 상태가 되면 망막모세포종 단백질(Retinoblastoma protein, pRb)을 인산화시킨다. 망막모세포종 단백질은 전사인자인 E2F단백질에 결합하여 세포주기를 G1단계에서 멈추게 하는데 CycD1에 의해 인산화 되면 비활성화 상태가 되어 E2F가 떨어져 나가게 된다. [Seminars Cancer Biol. 6, 99 (1995)]. 이로써 E2F가 전사인자로 활성화되고 세포주기 진행을 위한 단백질의 전사 및 번역과정이 원활히 이루어지면서 세포주기가 G1단계에서 S 단계로 넘어간다. 정상세포에서는 이러한 세포주기 조절 기작이 정상적으로 일어나 세포분열과 증식이 적절히 시행되어 세포수가 알맞게 조절된다. 반면, 암세포에서는 비정상적인 세포주기 진행 등의 원인으로 세포의 과도한 증식과 성장이 발생하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 암세포에서는 사이클린디1(cyclin D1)의 유전자 증폭현상이나 단백질이 과발현 상태로 관찰되었다. [Am. J. Pathology 147, 545 (1995)]. 따라서 사이클린디1(cyclin D1)의 발현량을 감소시키면 pRB의 인산화가 정상적으로 이루어지지 않고, 그에 따라 세포주기가 G1단계에 머무르게 되어 암세포의 비정상적인 세포분열 및 증식을 막아 암 치료에 적용할 수 있다.
wogonin은 G1 phase arrest를 통하여 tumor cell을 억제하는 것으로 알려져 있는데, 이 물질의 구조는 5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone으로서 플라보노이드의 일종이다. Baikal Skullcap으로 알려진 식물로부터 유래된 물질인데 이 식물은 동약의학에서 황금으로 불리는 약용식물에 속한다. 플라보노이드는 식물 유래 이차대사물의 일종으로서 C6-C3-C6의 탄소 골격을 가지는 화합물들을 지칭하고, 플라본은 C6-C3 탄소 골격이 4H-chromen-4-one으로 이루어진 플라보노이드의 일종이다. 이와 같은 플라본을 비롯한 플라보노이드들은 페놀기를 주된 골격으로 하는 구조를 가지기 때문에 히드록시기 또는 메톡시기가 치환된 다양한 유도체들이 발견되고 있다. wogonin 역시 두 개의 히드록시기와 한 개의 메톡시기를 치환기로 가진 플라본의 일종이다.
다양한 기전을 가진 항암제와 다양한 구조를 가진 항암제들이 많이 알려져 있으나 현재까지도 꼭 풀어야할 숙제로 남아 있는 부분이 항암제의 부작용과 독성 문제이다. 이를 해결하기 위한 방법의 하나는 천연물 유래 항암제의 개발이라고 할 수 있다.
관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020080092260호는 암 세포에 대한 세포독성 효과(cytotoxic effect)를 가지는 의약 조성물 및 그 제조방법을 제공하고, 상기 의약 조성물은 플라보노이드 화합물을 포함하여 이루어진다고 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 고안된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 항암제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 항암제 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다:
Figure 112012086754850-pat00001
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 X는 F 또는 Cl, R1 및 R2는 H 또는 OCH3인 것을 특징으로 함.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2에 기재된 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
Figure 112012086754850-pat00002
[화학식 2]
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 사이클린디1(cyclin D1) 단백질 발현은 감소시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다:
Figure 112012086754850-pat00003
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 X는 F 또는 Cl, R1 및 R2는 H 또는 OCH3인 것을 특징으로 함.
또한 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
Figure 112012086754850-pat00004
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 X는 F 또는 Cl, R1 및 R2는 H 또는 OCH3인 것을 특징으로 함.
또 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다:
Figure 112012086754850-pat00005
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 X는 F 또는 Cl, R1 및 R2는 H 또는 OCH3인 것을 특징으로 함.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 대장암에 대한 항암효과를 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 2-히드록시나프틸-4-메톡시-칼콘(2-hydroxynaphthyl4-methoxy chalcone)과 4-클로로페닐하이드라진 염화물(4-chlorophenylhydrazine hydrochloride)을 반응시키는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물 제조방법을 제공한다.
Figure 112012086754850-pat00006
[화학식 1]
상기 화학식 1에서 X는 F 또는 Cl, R1 및 R2는 H 또는 OCH3인 것을 특징으로 함.
본 발명의 상기 유도체는 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물의 형태로 사용될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올,아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나,또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p -톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은,예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 상기 유도체의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트,만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 함암용 약학적 조성물은 상기 유도체에 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물과 조합하여 사용할 수 있는 항암제로는 세포성장억제 계열의 지노스타틴(zinostatin), 피라루비신(pirarubicin), 이다루비신(idarubicin), 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate), 스트렙토조신(streptozocin), 지노스타틴 스티말라머(zinostatin stimalamer) 등이 있고, 항체 계열의 렌티난 (lentinan), 프로코다졸(procodazol), 세라시스(TheraCys), 온코백-CL(OncoVAX-CL),우크라인(ukrain), BCG 백신(BCG vaccine), 시졸필란(sizofilan) 등이 있다. 또한, 호르몬 계열의 아미노글루테시미드(aminoglutethimide), 파드로졸 (fadrozole), 포르메스탄(formestane), 트릴로스탄(trilostane) 등이 있고, 그 외 계열로 라족산(razoxane), 에토포시드 포스페이트(etoposide phosphate), 빈데신(vindesine), 니트라크린(nitracrine), 트레티뇬(tretinoin), 암사크린 (amsacrine), 비노렐빈(vinorelbine), 소부족산
(sobuzoxane) 등이 있다. 그 외에도 사이타라빈, 독소루비신, 다우노루비신, 마이톡산트론, 사이오구아닌, 머캅토퓨린, 프리드니손, 에토포사이드, 아스파라지나제, 빈크리스틴, 다우노루비신, 프리드니손, 사이클로포스파마이드, 5-FU, 패클리탁솔 등과 병용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유도체 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수,덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 본 발명의 유도체를 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 유도체를 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨,만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol),마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술,호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명자들은 wogonin과 같이 식물 유래 물질을 이용하여 세포주기에서 G1 phase arrest를 유도하는 새로운 물질을 디자인하고자 하였다. 본 발명에서는 long-term survival clonogenic assay 방법을 사용하였는데 이 방법은 장시간 시험함으로써 근소한 친환기의 차이에도 항암효과는 확실하게 구별되는 장점을 갖는다. 플라보노이드와 같이 C6-C3-C6 탄소 골격을 가지면서 기존에 알려진 플라보노이드 유도체들의 구조를 피하기 위하여 가운데 C3 골격을 디히드로피라졸로 치환한 새로운 플라보노이드 유도체들을 합성하였고 이들에 대한 G1 phase arrest를 유도 효과를 측정한 결과 우수한 유도 효과가 관찰되어서 항암제로의 사용이 가능하다고 판단되어 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 효과적인 항암제를 찾기 위하여 피라졸릴나프탈레놀 유도체들을 고안하여 합성하고 이들에 대한 대장암 세포의 세포주기 진행 억제 효과를 관찰하였다. 피라졸릴나프탈레놀 유도체들은 대장암세포의 G1 세포주기 진행을 억제함으로써, 암예방 및 항암제용 약학조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 피라졸릴나프탈레놀 유도체들은 대장암 세포의 G1 세포주기 진행 억제 효과를 보임으로써 암 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK96)의 수소핵자기공명분광스펙트럼이다. (400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 2는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK96)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼이다. (100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 3은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK96)의 고분해능질량분석 스펙트럼이다. (제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 기기 사용)
도 4는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK100)의 수소핵자기공명분광스펙트럼이다. (400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 5는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK100)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼이다. (100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 6은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK100)의 고분해능질량분석 스펙트럼이다. (제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 기기 사용)
도 7은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK101)의 수소핵자기공명분광스펙트럼이다. (400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 8은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK101)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼이다. (100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 9는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK101)의 고분해능질량분석 스펙트럼이다. (제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 기기 사용)
도 10은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK107)의 수소핵자기공명분광스펙트럼이다. (400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 11은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK107)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼이다. (100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 12는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK107)의 고분해능질량분석 스펙트럼이다. (제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 기기 사용)
도 13은 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK109)의 수소핵자기공명분광스펙트럼이다. (400MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 14는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK109)의 탄소핵자기공명분광스펙트럼이다. (100MHz 브루커 핵자기공명분광기기 사용)
도 15는 피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK109)의 고분해능질량분석 스펙트럼이다. (제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 기기 사용)
도 16은 대장암 세포에서 피라졸릴나프탈레놀 유도체들의 세포성장 억제 효과이다.
도 17은 대장암 세포에서 피라졸릴나프탈레놀 유도체 DK107의 cyclin D1 발현 억제 효과이다.
도 18은 대장암 세포에서 피라졸릴나프탈레놀 유도체 DK107의 G1 세포주기 진행 억제 효과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 피라졸릴나프탈레놀 유도체들의 합성
본 발명에서는 화학식 1로 표시되는 피라졸릴나프탈레놀 유도체들은 아래 반응식에 나타낸 방법을 사용하여 다음과 같이 합성하였다.
Figure 112012086754850-pat00007
출발물질로 사용된 2-히드록시나프틸-4-메톡시-칼콘(2-hydroxynaphthyl4-methoxy chalcone)은 다음의 방법을 사용하여 얻었다. 2-히드록시-1-아세토나프톤 (1,1.9g,10mmol)과 4-메톡시벤즈알데히드 (2,1.4g,10mmol)를 30 mL 에탄올에 교반 하면서 녹인 후 온도를 약 3OC낮춘 다음에 50% KOH용액을 3.5 mL 천천히 첨가하였다. 그 다음 상온에서 20시간 교반 후 얼음물에 가하여 냉각시키고, 6N 염산(HCl)으로 중화시켜 생성된 고체를 감압 여과하여 칼콘 (chalcone) 화합물을 82% (2.4 g)의 수율로 얻었다. 2-히드록시나프틸-4-메톡시-칼콘(2-hydroxynaphthyl4-methoxy chalcone, 608 mg, 2 mmol)과 4-클로로페닐하이드라진 염화물 (4-chlorophenylhydrazine hydrochloride, 358 mg, 2 mmol)를 20 ㎖의 에탄올에 녹인 후에 90℃에서 10시간 환류 교반시킨다. 반응 혼합물을 상온으로 천천히 식히고, 형성된 고체를 차가운 에탄올로 씻으면서 감압여과 하여 피라졸린 화합물 DK-96을 650 mg (76 %)의 수율로 얻었다. 유사한 반응 방법을 사용하여 피라졸린 유도체 DK100, DK101, DK107, DK109을 합성하였고 상온으로 냉각 시 고체가 형성되지 않을 경우, 용매를 감압여과 하고, 잔사를 컬럼 크로마토그라피를 통하여 정제하였다.
최종산물의 확인을 위해 핵자기공명분광 실험을 수행하였다. 사용한 기기는 브루커사 400MHz 기기였다. 또한 핵자기공명분광법으로 확인한 유도체의 구조를 재확인하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였다. 사용한 기기는 제올사 (Jeol Ltd., Tokyo, Japan)의 JMS700 HREIMS (high-resolution electron impact ionization mass spectrometer) 였다. 핵자기공명분광법으로 확인 유도체들의 수소와 탄소의 위치에 따른 명명법은 아래 [화학식 3]의 번호를 따랐다.
Figure 112012086754850-pat00008
[화학식 3]
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (1-(1-(4-chlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-3-yl)naphthalen-2-ol ; DK96)의 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 도 1과 도 2에 나타낸 바와 같고 화학적이동도는 아래와 같다.
1H NMR (400MHz, CHCl3-d) δ 12.11 (s, 1H, 2’-OH), 7.92 (d, 1H, H-8’, J = 8.5 Hz), 7.77 (d, 1H, H-5’, J = 8.0 Hz), 7.75 (d, 1H, H-4’, J = 9.0 Hz), 7.40 (ddd, 1H, H-7’, J = 1.2, 6.9, 8.5 Hz), 7.31 (ddd, 1H, H-6’, J = 1.2, 6.9, 8.0 Hz), 7.27 (d, 1H, H-3’, J = 9.0 Hz), 7.24 (d, 2H, H-2’’/H-6’’, J = 8.8 Hz), 7.16 (d, 2H, H-3’’’/H-5’’’, J = 8.9 Hz), 6.93 (d, 2H, H-2’’’/H-6’’’, J = 8.9 Hz), 6.88 (d, 2H, H-3’’/H-5’’, J = 8.8 Hz), 5.21 (dd, 1H, H-5, J = 7.6, 11.3 Hz), 4.31 (dd, 1H, H-4, J = 11.3, 16.7 Hz), 3.78 (s, 3H, 4’’-OCH3), 3.68 (dd, 1H, H-4, J=7.6, 16.7Hz); 13C NMR (100MHz, CHCl3-d) δ 159.4 (C-4’’), 157.4 (C-2’), 150.5 (C-3), 142.6 (C-1’’’), 132.7 (C-1’’), 131.9 (C-4’), 131.9 (C-9’), 129.4 (C-5’), 129.1 (C-3’’’/C-5’’’), 129.0(C-10’), 127.2 (C-2’’/C-6’’), 126.8(C-7’), 125.0 (C-4’’’), 123.2 (C-8’), 123.1 (C-6’), 119.2 (C-3’), 114.8 (C-2’’’/C-6’’’), 114.7 (C-3’’/C-5’’), 109.1 (C-1’), 63.8 (C-5), 55.3 (4’’-OCH3), 48.8 (C-4).
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK96)은 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질로서 C26H21ClN2O2의 분자식을 갖는다. 핵자기공명분광법으로 확인한 이 화합물의 구조를 확증하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였고, 이론적인 분자량이 428.1292이었고 실험으로 얻은 분자량은 428.1295이었기 때문에 이 화합물은 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올로 확인되었다. 이 화합물의 고분해능질량분석 스펙트럼은 도 3과 같다.
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (1-(1-(4-chlorophenyl)-5-(2,4-dimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-3-yl)naphthalen-2-ol ; DK100)의 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 도 4와 도 5에 나타낸 바와 같고 화학적이동도는 아래와 같다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.23 (bs, 1H, 2’-OH), 8.26 (d, 1H, H-8’, J = 8.6 Hz), 7.82 (d, 1H, H-5’, J = 8.0 Hz), 7.81 (d, 1H, H-4’, J = 9.0 Hz), 7.47 (ddd, 1H, H-7’, J = 1.0, 6.9, 8.6 Hz), 7.32 (ddd, 1H, H-6’, J = 1.0, 6.9, 8.0 Hz), 7.23 (d, 1H, H-3’, J = 9.0 Hz), 7.19 (d, 2H, H-3’’’/H-5’’’, J = 9.0 Hz), 7.05 (d, 1H, H-6’’, J = 8.5 Hz), 6.89 (d, 2H, H-2’’’/H-6’’’, J = 9.0 Hz), 6.63 (d, 1H, H-3’’, J = 2.3 Hz), 6.48 (dd, 1H, H-5’’, J = 2.3, 8.5 Hz), 5.51 (dd, 1H, H-5, J = 6.1, 12.0 Hz), 4.02 (dd, 1H, H-4, J = 12.0, 17.6 Hz), 3.87 (s, 3H, 2’’-OCH3), 3.73 (s, 3H, 4’’-OCH3), 3.08 (dd, 1H, H-4, J = 12.0, 17.6 Hz); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 159.9 (C-4’’), 157.2 (C-2’’), 154.3 (C-2’), 148.2 (C-3), 143.6 (C-1’’’), 132.6 (C-9’), 130.4 (C-4’), 128.7 (C-3’’’/C-5’’’), 128.2 (C-5’), 128.0 (C-10’), 127.1 (C-6’’), 126.9 (C-7’), 124.1 (C-8’), 122.9 (C-6’), 121.6 (C-4’’’), 121.1 (C-1’’), 118.2 (C-3’), 113.9 (C-2’’’/C-6’’’), 112.0 (C-1’), 105.0 (C-5’’), 98.9 (C-3’’), 57.1 (C-5), 55.7 (2’’-OCH3), 55.2 (4’’-OCH3), 46.0 (C-4).
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK100)은 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질로서 C27H23ClN2O3의 분자식을 갖는다. 핵자기공명분광법으로 확인한 이 화합물의 구조를 확증하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였고, 이론적인 분자량이 458.1397이었고 실험으로 얻은 분자량은 458.1395이었기 때문에 이 화합물은 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4-디메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올로 확인되었다. 이 화합물의 고분해능질량분석 스펙트럼은 도 6과 같다.
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (1-(5-(2,4-dimethoxyphenyl)-1-(4-fluorophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-3-yl)naphthalen-2-ol ; DK101)의 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 도 7과 도 8에 나타낸 바와 같고 화학적이동도는 아래와 같다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.25 (bs, 1H, 2’-OH), 7.82 (d, 1H, H-5’, J = 7.8 Hz), 7.81 (d, 1H, H-4’, J = 8.9 Hz), 7.47 (ddd, 1H, H-7', J = 1.2, 6.8, 8.5 Hz), 7.31 (ddd, 1H, H-6’, J = 1.2, 6.8, 7.8 Hz), 7.25 (d, 1H, H-3’, J = 8.9 Hz), 7.10 (d, 1H, H-6’’, J = 8.5 Hz), 7.10 (d, 1H, H-8’, J = 8.5 Hz), 7.02 (m, 2H, H-3’’’/H-5’’’), 6.90 (m, 2H, H-2’’’/H-6’’’), 6.64 (d, 1H, H-3’’, J = 2.4 Hz), 6.49 (dd, 1H, H-5’’, J = 2.4, 8.5 Hz), 5.47 (dd, 1H, H-5, J = 6.9, 12.0 Hz), 4.00 (dd, 1H, H-4, J = 12.0, 17.5 Hz), 3.87 (s, 3H, 2’’-OCH3), 3.74 (s, 3H, 4’’-OCH3), 3.09 (dd, 1H, H-4, J = 6.9, 17.5 Hz); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 159.9 (C-4’’), 157.2 (C-2’’), 154.5 (C-4’’’), 154.3 (C-2’), 147.5 (C-3), 141.8 (C-1’’’), 132.6 (C-9’), 130.2 (C-4’), 128.1 (C-10’), 128.0 (C-5’), 127.1 (C-6’’), 126.8 (C-7’), 124.1 (C-8’), 122.8 (C-6’), 121.5 (C-1’’), 118.2 (C-3’), 115.5 (C-3’’’/C-5’’’), 113.6 (C-2’’’/C-6’’’), 112.1 (C-1’), 105.0 (C-5’’), 98.8 (C-3’’), 57.7 (C-5), 55.7 (2’’-OCH3), 55.1 (4’’-OCH3), 46.0 (C-4).
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK101)은 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질로서 C27H23FN2O3의 분자식을 갖는다. 핵자기공명분광법으로 확인한 이 화합물의 구조를 확증하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였고, 이론적인 분자량이 442.1693이었고 실험으로 얻은 분자량은 442.1771이었기 때문에 이 화합물은 1-(5-(2,4-디메톡시페닐)-1-(4-플루오로페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올로 확인되었다. 이 화합물의 고분해능질량분석 스펙트럼은 [도 9]와 같다.
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (1-(1-(4-chlorophenyl)-5-(2,4,5-trimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-3-yl)naphthalen-2-ol ; DK107)의 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 도 10과 도 11에 나타낸 바와 같고 화학적이동도는 아래와 같다.
1H NMR (400MHz, CHCl3-d) δ12.12 (s, 1H, 2’-OH), 7.96 (d, 1H, H-8’, J = 8.5 Hz), 7.77 (dd, 1H, H-5’, J = 1.3, 8.0 Hz), 7.75 (d, 1H, H-4’, J = 8.9 Hz), 7.42 (ddd, 1H, H-7’, J = 1.3, 6.9, 8.5 Hz), 7.31 (ddd, 1H, H-6’, J = 1.3, 6.9, 8.0 Hz), 7.27 (d, 1H, H-3’, J = 8.9 Hz), 7.17 (d, 2H, H-3’’’/H5’’’, J = 9.0 Hz), 6.93 (d, 2H, H-2’’’/H-6’’’, J = 9.0 Hz), 6.68 (s, 1H, H-6’’), 6.56 (s, 1H, H-3’’), 5.56 (dd, 1H, H-5, J = 7.0, 11.5 Hz), 4.33 (dd, 1H, H-4, J = 11.5, 16.8 Hz), 3.89 (s, 3H, 2’’-OCH3), 3.88 (s, 3H, 4’’-OCH3), 3.65 (s, 3H, 5’’-OCH3), 3.55 (dd, 1H, H-4, J = 7.0, 16.8 Hz); 13C NMR (100MHz, CHCl3-d) δ 157.3 (C-2’), 151.3 (C-3), 150.6 (C-2’’), 149.5 (C-4’’), 143.6 (C-5’’), 142.9 (C-1’’’), 132.1 (C-9’), 131.9 (C-4’), 129.5 (C-5’), 129.2 (C-3’’’/C-5’’’), 129.1 (C-10’), 126.9 (C-7’), 124.9 (C-4’’’), 123.4 (C-8’), 123.2 (C-6’), 119.7 (C-1’’), 119.3 (C-3’), 114.7 (C-2’’’/C-6’’’), 110.5 (C-6’’), 109.5 (C-1’), 97.6 (C-3’’), 58.4 (C-5), 56.7 (5’’-OCH3), 56.4 (2’’-OCH3), 56.3 (4’’-OCH3), 47.4 (C-4).
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK107)은 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질로서 C28H25ClN2O4의 분자식을 갖는다. 핵자기공명분광법으로 확인한 이 화합물의 구조를 확증하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였고, 이론적인 분자량이 488.1503이었고 실험으로 얻은 분자량은 488.1506이었기 때문에 이 화합물은 1-(1-(4-클로로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올로 확인되었다. 이 화합물의 고분해능질량분석 스펙트럼은 도 12와 같다.
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (1-(1-(4-fluorophenyl)-5-(2,4,5-trimethoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-3-yl)naphthalen-2-ol ; DK109)의 수소핵자기공명분광스펙트럼과 탄소핵자기공명스펙트럼은 각각 [도 13]과 [도 14]에 나타낸 바와 같고 화학적이동도는 아래와 같다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 10.22 (bs, 1H, 2’-OH), 8.25 (d, 1H, H-8’, J = 8.5 Hz), 7.83 (d, 1H, H-5’, J = 8.0 Hz), 7.82 (d, 1H, H-4', J = 9.0 Hz), 7.46 (ddd, 1H, H-7’, J = 1.2, 6.9, 8.5 Hz), 7.32 (ddd, 1H, H-6’, J = 1.2, 6.9, 8.0 Hz), 7.23 (d, 1H, H-3’, J = 9.0 Hz), 7.02 (m, 2H, H-3’’’/H-5’’’), 6.93 (m, 2H, H-2’’’/H-6’’’), 6.82 (s, 1H, H-6’’), 6.75 (s, 1H, H-3’’), 5.54 (dd, 1H, H-5, J = 6.3, 12.0 Hz), 3.98 (dd, 1H, H-4, J = 12.0, 17.5 Hz), 3.88 (s, 3H, 2’’-OCH3), 3.79 (s, 3H, 4’’-OCH3), 3.58 (s, 3H, 5’’-OCH3), 3.11 (dd, 1H, H-4, J = 6.3, 17.5 Hz); 13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 154.5 (C-4’’’), 154.2 (C-2’), 150.5 (C-2’’), 149.0 (C-4’’), 147.4 (C-3), 142.8 (C-5’’), 141.8 (C-1’’’), 132.6 (C-9’), 130.2 (C-4’), 128.1 (C-10’), 128.0 (C-5’), 126.8 (C-7’), 124.0 (C-8’), 122.9 (C-6’), 120.5 (C-1’’), 118.1 (C-3’), 115.5 (C-3’’’/C-5’’’), 113.7 (C-2’’’/C-6’’’), 112.2 (C-1’), 111.3 (C-6’’), 98.5 (C-3’’), 57.3 (C-5), 56.5 (2’’-OCH3), 56.2 (5’’-OCH3), 55.7 (4’’-OCH3), 46.0 (C-4).
피라졸릴나프탈레놀 유도체 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올 (DK109)는 현재까지 보고되지 않은 새로운 물질로서 C28H25FN2O4의 분자식을 갖는다. 핵자기공명분광법으로 확인한 이 화합물의 구조를 확증하기 위하여 고분해능질량분석법을 이용하였고, 이론적인 분자량이 472.1798이었고 실험으로 얻은 분자량은 472.1877이었기 때문에 이 화합물은 1-(1-(4-플루오로페닐)-5-(2,4,5-트리메톡시페닐)-4,5-디히드로-1H-피라졸-3-일)나프탈렌-2-올로 확인되었다. 이 화합물의 고분해능질량분석 스펙트럼은 도 15와 같다.
실시예 2. 대장암 세포에서 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체의 세포성장 억제 효과
HCT116 대장암 세포를 ATTC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies), Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies) 포함한 DMEM (Invitrogen Life Technologies) 배양액을 2일에 한 번씩 100-mm 세포배양접시에 1 x 106의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 화합물의 세포증식 억제 효과는 암세포의 콜로니 형성능 평가 (Colonony forming assay)를 통하여 세포 성장 억제 여부를 측정하였다. HCT116 대장암 세포를 24-well 배양접시에 well 당 6000개 세포로 분주한 후 0, 10, 20, 40 μM 농도의 각종 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 화합물 (DK96, DK100, DK101, DK107, DK109)을 처리하고, 7일 후 6% 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde)와 0.5% 크리스탈바이올렛 (crystal violet) 용액을 1:1로 섞어준 혼합액을 세포에 첨가한 후 15분 동안 반응시켜 남아있는 세포를 염색하였다. 그 결과 도 16에 나타난 바와 같이 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 화합물을 10 μM 농도 이상으로 처리했을 때 농도 의존적으로 암세포의 콜로니 형성능이 점차 감소되는 것이 관찰되었다. 이러한 사실로 부터 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 DK96, DK100, DK101, DK107, DK109 화합물은 대장암세포의 증식 억제 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 3. 대장암 세포에서 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 DK107 의 Cyclin D1 발현 억제 효과
본 발명의 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체중에서 세포성장 억제 효과가 가장 뛰어난 DK107 화합물에 의한 세포주기 조절 효과를 확인하였다, HCT116 세포에 DK107을 처리한 후 암세포의 성장에 중요한 세포주기 조절 단백질인 사이클린디1(cyclin D1)의 발현량을 웨스턴 블롯법(Western blot assay)으로 분석하였다. HCT116 대장암 세포는 ATTC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen Life Technologies)와 Antibiotic-Antimycotic solution (Invitrogen Life Technologies)이 포함된 DMEM (Invitrogen Life Technologies) 배양액에서 1 x 106의 접종 밀도(seed density)로 계대하면서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
HCT116 세포에 20 μM 농도의 DK107 화합물을 처리한 후, 24, 48 시간 후에 세포를 수확하였다. 수확된 세포에 20 mM HEPES 완충용액 + 1% Triton X-100 + 10% 글리세롤 + 150 mM NaCl + 10 ㎍/㎖ leupeptin + 1 mM PMSF 가 함유된 세포용해액을 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 상층의 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함되도록 제조된 세포 용해액을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포 단백질들을 분자량별로 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filter)에 옮긴 후 사이클린디1(cyclin D1) 단백질에 대한 일차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현양이 변화되지 않는 GAPDH 단백질을 인지하는 일차항체 (Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인자하는 이차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템 (Chemiluminescence detection system; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 이용하여 X-ray 필름상에서 각 단백질의 발현 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 17에 나타난바와 같이, 본 발명의 DK107을 처리하면 시간 의존적으로 사이클린디1(cyclin D1) 단백질 발현양이 점차 감소된다는 사실을 확인하였다. 이때 대조 단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았다. 이러한 결과는, 본 발명의 DK107 화합물이 대장암세포에 작용하면 사이클린디1(cyclin D1) 단백질 발현은 감소시켜, 세포주기 진행을 억제시킴으로써 암세포의 성장을 억제시킨다는 것을 시사하는 것이다.
실시예 4. 대장암 세포에서 브로모디메톡시크로메닐칼콘 유도체 DK107 의 G1 세포주기 진행 억제 효과
통상적으로 세포내 DNA 함량 측정을 통하여 세포주기 진행과정 (Cell cycle progression)을 분석한다. 세포 주기 중에서 G1 주기 세포는 2N 함량의 DNA를 포함하며, S기 세포는 2N과 4N 사이의 양을, G2기와 M 주기 세포는 4N DNA 양을 포함한다. 사이클린디1(cyclin D1) 단백질은 G1 세포 주기의 진행을 촉진하는 단백질이므로, DK107에 의해 CycD1 단백질이 감소되면 암세포의 세포 주기 진행이 손상 받는지의 여부를 유세포 분리 측정기(Flow cytometer; BD Science, 미국)를 이용하여 조사하였다.
HCT116 세포를 웨스턴 블롯 분석법과 동일하게 배양한 후, DK107을 처리 하고 0, 24, 48 시간 후에 트립신-EDTA(1%)을 첨가해 세포를 배양기에서 떼어낸 후, 70% 에탄올로 세포를 고정시켰다. PI(Propidium Iodine)를 30분간 반응하여 세포내 DNA를 염색한 후, DNA 양의 변화를 측정하였다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 정상적으로 성장하고 있는 HCT116 대장암세포에서 G1 세포 주기를 가지는 세포는 약 56.4%였지만 DK107을 처리한 세포군에서는 처리 24 시간 후 60.1%로 증가하였으며, 처리 48시간 후에는 748%로 증가하였다. 또한, 정상 세포의 S 기는 26.2% 였지만, DK107을 처리한 세포에서 S 주기 세포는 처리 24 시간과 48 시간 후에 각각 20.78%와 15.5%로 시간에 따라 점차 감소하였다. 정상 세포의 G2/M 주기 세포는 14.52% 였지만, DK107을 처리한 세포에서 G2/M 주기 세포는 처리 24 시간과 48 시간 후에 각각 14.3%와 6.5%로 시간에 따라 점차 감소하였다. 이때, 세포사멸을 의미하는 sub-G1 세포의 양은 DK107 처리에 의해 약하게 증가되었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 DK107 화합물은 HCT116 대장암세포의 G1기에서 S기로의 세포주기 진행을 차단하여 암세포의 성장을 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 하기 화학식 1의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물:
    Figure 112014079628045-pat00010

    [화학식 1]
    상기 화학식 1에서 X는 Cl, R1 및 R2는 OCH3인 것을 특징으로 함.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 대장암에 대한 항암효과를 가지는 것을 특징으로 하는 항암용 약학 조성물.
  5. 하기 화학식 1의 화합물을 인 비트로에서 대장암 세포에 처리하여 인 비트로에서 대장암 세포의 성장을 억제하는 방법:
    Figure 112014079628045-pat00032

    [화학식 1]
    상기 화학식 1에서 X는 Cl, R1 및 R2는 OCH3인 것을 특징으로 함.
  6. 하기 화학식 1의 화합물을 인 비트로에서 대장암 세포에 처리하여 대장암 세포의 G1기에서 S기로의 세포주기 진행을 차단하는 방법:
    Figure 112014079628045-pat00033

    [화학식 1]
    상기 화학식 1에서 X는 Cl, R1 및 R2는 OCH3인 것을 특징으로 함.

  7. 삭제
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