JP2009291788A - 圧力駆動プラグによる輸送と反応のための装置および方法 - Google Patents

圧力駆動プラグによる輸送と反応のための装置および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】基板内部の少なくとも1つのプラグの内部における反応を誘導する好適な方法を提供すること。
【解決手段】基板の第1流路へ搬送流体を導入する手段(ステップ)と、搬送流体に対して非混和性を持つ少なくとも2つの異なるプラグ流体を1つ以上のプラグ形成領域の第1流路へ導入する手段と、プラグ流体混合物を含む少なくとも1つのプラグを形成するために基板で流体の流れを誘発することを目的として第1流路に圧力を適用(加圧)する手段を備え、プラグ断面積がプラグ形成領域の第1流路断面積と本質的に同一であることを特徴とする、基板内部の少なくとも1つのプラグの内部における反応を誘導する方法。
【選択図】なし

Description

（発明の背景）
非線形力学は、マイクロフルイディック（微細流体）とともに、本発明による装置の設
計および方法において中心的な役割を果たす。マイクロフルイディックは、通常、ミクロ
レベルの寸法である流路網(チャンネル・ネットワーク)を通り流体の輸送処理を行う。(
「チップ上の実験室（LOC）」とも称される)マイクロフルイディック・システムは、マイ
クロスケール化学または生物学的分析(マイクロ総合分析システム)の手段となりうる。マ
イクロフルイディック・システムの主な利点は、その高速試剤と低消費量にある。したが
って、医療診断および高度な処理能力を伴うスクリーニングの分野において非常に有望で
ある。マイクロフルイディック・システムの高度な平列構造は、巨視的な量におよぶ化学
的および生物学的な化合物合成(例：化学兵器破壊・調合薬合成)の手段となりうる。その
利点はより高度に物質および熱輸送を制御しうるということである。
一般的にマイクロフルイディック・システムは、流体を流路経由でポンプによりくみ出
す手段を必要とする。最も一般的な方法として、圧力駆動によるものと、電気浸透流(EOF
)駆動によるものとの2種類が挙げられる。EOF駆動による流れの魅力は、複雑なネットワ
ーク （網状組織）においてでさえも容易に制御できるというところにある。EOF駆動によ
る流れは平坦なプラグ（栓、または塊）気形状の速度プロフィールを持つ。すなわち、流
体速度は壁付近および流路中央において同じであることを示す。したがって、少量の複数
検体が流路に連続注入される場合、これらのプラグは重複せずに (低度の分散で)輸送さ
れる。この場合、分散のほとんどはプラグ間の拡散から帰する。EOFの主な欠点は、流路
壁の荷電表面部二重層の動きにより生じるため、荷電不純物による表面異物に大いに影響
を受けやすいということである。DNAが一律に負の電荷をもち壁に吸着しないので、DNA分
析・操作において、負の電荷をもつ面にある流路を使う場合には問題ないかもしれない。
しかしながら、電荷を頻繁に伴い、荷電表面に吸着する傾向をもつタンパク質に関係する
場合の用途において、これは大きな妨げとなりえる。さらに、大抵の場合、高電圧を伴う
ものは望まれず、なお、ポータブルアナライザーのような高電圧源を利用できない場合が
ある。
典型的に、圧力駆動による流れはEOFとくらべると著しく界面化学に影響されにくい。
圧力駆動による流れの主な欠点は、EOFのように平らなプロフィールをもたず、通常、放
物線状の流れのプロフィールを持っているということである。流路中央の溶質は、流路壁
付近の溶質よりはるかに速く流れる(平均流速の約2倍)。圧力駆動の流れは、放物線状の
速度プロフィールにおいて、通常、大きく分散する。流路に注入された溶質のプラグは、
流路形状に順応して直ちに歪み伸長する。流路中央から壁方向及び反転方向の拡散による
溶質輸送によって、この歪みは多少減少するが、流路に沿う分散発生により歪みが大きく
なる(この分散を総括してテイラーの分散と呼ぶ）。
テイラーの分散によりサンプル（試料）プラグが広がり薄くなる。サンプルのいくつか
がプラグの後にテール状(尾状)に残る場合が多々ある。これらテールの重なりは、通常、
その他プラグ内サンプルの二次汚染につながる。このため、サンプルは頻繁に緩衝液洗浄
(バッファー洗浄)により隔離され、流路内へと個々に導入される。一方、長い緩衝液プラ
グでサンプルをインターリーブする(すなわち、サンプル間の緩衝液でシステムを洗う)こ
とにより、システムの処理能力（コントロール）を低下させる。
EOFにおける送流は本質的に線形である。すなわち、２つの反応原系がプラグに導入さ
れ、EOFによって輸送される場合、その滞留時間(および反応速度)は、単に、流路内輸送
距離を速度で割ることにより計算することができる。当線形輸送は、流路長さと流量を適
切に調節することにより滞留時間の精密な制御を可能にする。対照的に、圧力駆動の流れ
分散作用においてプラグが移動するのには通常広範な滞留時間を要し、結果として時間的
管理能力が低下する。
ここでの時間的管理は重要である。多くの化学・生化学作用は特定の時間内に生じる。
そして、反応時間測定値により、試剤濃度または反応性を示すことができる。典型的に静
止流体式器機がこれらの測定の手段となる。これらの器機は乱流に依存して試剤を混合し
、最小限の分散量でそれらを輸送する。
通常、乱流は直径大および多流量のチューブ内で生じる。
したがって、静止流体式器機は、多くの試剤(ml/秒単位レベル)を要する傾向がある。
静止流体式のマイクロフルイディック機器は、試剤消費量が少な目(通常μL/分)であり、
科学器具（例：診断用装置）として効果的に利用できる可能性がある。これまで、マイク
ロフルイディック装置は、通常、圧力駆動による流れが分散されることにより(小規模分
散ではあるが)EOFを多大に遅延させるため、静止流体式器機に対抗することができないで
いた。
さらに、マイクロフルイディック・システムでの混合は、(大型システムにおける乱流
に対し)流れが層流であるため、流体を送る方法が何であろうと、速度低下が頻繁に見ら
れる。層流での混合は拡散に依存し、DNAとタンパク質のような大型分子の場合は特に遅
くなる。
さらに、マイクロフルイディック・システムによる微粒子処理は困難であるといえる。
細胞がこれらの緩衝液と同密度であるため水性緩衝液内細胞の懸濁(けんだく)が比較的容
易である一方、流体と同密度でない微粒子は、流路の底に沈降する傾向があり、それによ
り最終的には流路をふさいでしまう。
それ故に、微粒子を除去するために、分析用サンプルを頻繁にろ過する必要がある。
（発明の要約）
発明による基板内部反応の伝導方法とは、基板第１流路に搬送流体を導入すること、第1
流路に少なくとも2本のプラグ流体を導入すること、そして、プラグ流体の混合物を含む
実質上同一のプラグを形成すべく基板内流体の流れを誘導するために第一流路に圧力を加
えることが可能であるものとする。プラグ流体は搬送流体に対し不混和性を持つ。プラグ
形成中に、プラグ断面は第1流路断面に実質的似ているため、プラグが第1流路の壁全体に
著しく接することになる。プラグ形成後、プラグ断面は流路断面より縮小する可能性があ
る。搬送流体の薄い層が消える場合もあるが、通常、この層は流路の壁とプラグの間に存
在する。一般的に、流路における初期形成時と各プラグサイズが著しく類似する。さらに
、流路内プラグのキャピラリー数は、一般的に1未満、というよりも ≦約0.2が好ましく
、さらに ≦約0.1がより理想である。
1本以上のプラグ流体（流体塊）からプラグが形成される場合、急速な流体混合が生じ
る。流路が直線でない場合、プラグ内部の混合はさら増加する(例：カオス的流れの発生
時)。非周期流路の設計はプラグ内部の急速混合を誘導するのに好ましい。他の場合にお
いて、混合速度を緩めたり、もしくは、屈曲した流路を用いたり、流体粘度を変えたり、
プラグ流体の組成を変えたり、さらには、管理可能な旋回機能を使用することにより制御
することもできる。
本発明による装置は1本以上のプラグ流体を融合する(組合せる)手段となりうる。プラ
グ流体を単一または複数の入口から導入することができる。プラグ流体が単一の入口によ
って導入される場合、第1流路への導入に先立って大幅な混合が生じないように、入口の
まさに上流で混合されるのが好ましい。プラグ流体が複数の入口によって導入される場合
、異なるプラグ流体から成るプラグが出口前で一連のプラグに融合される(すなわち、一
連のプラグはプラグ流体の混合物から構成され形成される)ように、複数のプラグ流体の(
粘度、プラグ寸法、プラグ流体・搬送流体界面（接触面）の表面張力、またはプラグ流体
・流路壁界面の表面張力といった)物理的性質が調節される。あるいは、単一のプラグ流
体から成るプラグを形成するために、プラグ流体を個別の流路へ導入することもできる。
その時、これらの流路は単一の融合した流路へと融合される。基板内部の連続的な輸送
は、単一の合流した流路内で融合されたプラグを形成する。
本発明による装置は、プラグを2本以上の流路へと分割する手段となりうる。
上記の装置と技術を使い、重合・(小型分子とタンパク質等の) 結晶化・ナノ粒子合成・
不安定中間体の形成・酵素触媒作用の反応・分析評価、タンパク質結合などの、様々な反
応作用を誘導することができる。複数反応を、同時にまたは連続して誘導することができ
る。
さらに、本発明にのっとって、本発明は1つ以上の基板から構成される装置を備える。
発明の装置及び方法は、詳細に渡り下記されるように、制限されることなく多様な実施
形態や変更(修正)形態を備える。
（項目１）
基板の第1流路へ搬送流体を導入する手段(ステップ)と、搬送流体に対して非混和性を持
つ少なくとも2つの異なるプラグ流体を1つ以上のプラグ形成領域の第1流路へ導入する手
段と、プラグ流体混合物を含む少なくとも1つのプラグを形成するために基板で流体の流
れを誘発することを目的として第1流路に圧力を適用(加圧)する手段を備え、プラグ断面
積がプラグ形成領域の第1流路断面積と本質的に同一であることを特徴とする、基板内部
の少なくとも1つのプラグの内部における反応を誘導する方法。
（項目２）
搬送流体が油を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目３）
搬送流体にフッ素化物を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目４）
フッ素添加油がパーフルオロデカリンまたはパーフルオパーハイドロフェナントレンであ
ることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
（項目５）
搬送流体が少なくとも1つの界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目６）
プラグ流体の少なくとも1つが試剤と溶媒を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法
。
（項目７）
プラグ流体の少なくとも1つが溶媒と界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項1に記載
の方法。
（項目８）
プラグ流体が少なくとも1つの入口を通って導入されることを特徴とする、請求項1に記載
の方法。
（項目９）
プラグ流体の体積流量調節によりプラグに含まれるプラグ流体の濃度を調節する手段をさ
らに備えた、請求項1に記載の方法。
（項目１０）
プラグがキャピラリー数<約0.2で形成されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目１１）
プラグ流体の反応により少なくとも1つのプラグ内部に不溶性反応生成物が形成されるこ
とを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目１２）
プラグ流体の反応により少なくとも1つのプラグ内部に溶性反応生成物が形成されること
を特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目１３）
プラグ流体が単一の入口を通って第1流路へ導入されることを特徴とする、請求項1に記載
の方法。
（項目１４）
入口における又は入口前のプラグ流体が特異的な（はっきりと識別できる）層流であるこ
とを特徴とする、請求項13に記載の方法。
（項目１５）
プラグ流体が2つ以上の入口を通って第1流路へ導入されることを特徴とする、請求項1に
記載の方法。
（項目１６）
プラグ内におけるプラグ流体の混合を加速する手段をさらに備えた請求項1に記載の方法
。
（項目１７）
流路に沿った幾何学様式(形状）の変化により混合が加速されることを特徴とする、請求
項16に記載の方法。
（項目１８）
流路が1つ以上の曲がり角、屈曲、および直線部またはそれらの組み合わせを備えること
を特徴とする、請求項17に記載の方法。
（項目１９）
「ベーカーによる変態の（補助）定理」の実装を目的として設計された流路形状を通して
プラグを流すことにより混合が加速されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
（項目２０）
プラグ流体または搬送流体の少なくとも1つの構成を変化することにより混合が加速され
ることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
（項目２１）
プラグ流体または搬送流体の少なくとも1つの粘度を変化することにより混合が加速され
ることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
（項目２２）
流路壁のパターンを変化することにより混合が加速されることを特徴とする、請求項16に
記載の方法。
（項目２３）
第1流路または分岐流路の少なくとも一部分の親水特性を変化することにより混合が加速
されることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
（項目２４）
第1流路または分岐流路の少なくとも一部分の電荷を変化することにより混合が加速され
ることを特徴とする、請求項16に記載の方法。
（項目２５）
少なくとも1つのプラグが第1流路のプラグ形成領域下流にある別のプラグと融合する手段
をさらに備える、請求項1に記載の方法。
（項目２６）
第1流路および基板上の第2流路へ搬送流体を導入する手段を備えた第１および第２流路が
流体交流（伝達）することを特徴とする、および、搬送流体に対して非混和性を持つ第1
プラグ流体を第1プラグ形成領域の第1流路へ導入する手段と、搬送流体に対して非混和性
を持つ第2プラグ流体を第2プラグ形成領域の第2流路へ導入する手段と、第1プラグ流体を
含む第1プラグ集合体そして第2プラグ流体を含む第2プラグ集合体の形成を目的として基
板で流体の流れを誘導するために圧力を適用(加圧)する手段を備えた、プラグ断面積がプ
ラグ形成領域の流路断面積と本質的に同一であることを特徴とする、そして、第1プラグ
集合体からの少なくとも1つのプラグが第2プラグ集合体からの少なくとも1つのプラグと
融合することを特徴とする、基板内部における反応を誘導する方法。
（項目２７）
プラグの第1および第2集合体の各断面が本質的に類似していることを特徴とする、請求項
26に記載の方法。
（項目２８）
プラグの第1および第2集合体が異なる相対速度であることを特徴とする、請求項26に記載
の方法。
（項目２９）
第1流路においてプラグ形成領域下流の2箇所以上へとプラグを分裂させる手段をさらに備
えた請求項1に記載の方法。
（項目３０）
少なくとも1つのプラグを２箇所以上に分裂させ、従って、プラグ形成箇所の下流に第2流
路が存在すことを特徴とする空間(流路)を通過して第１プラグ集合体が第2流路へと送ら
れる手段をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目３１）
第1流路の断面寸法が第2流路の断面寸法と異なることを特徴とする、請求項30に記載の方
法。
（項目３２）
第1流路の断面寸法が第2流路の断面寸法とほぼ等しいことを特徴とする、請求項30に記載
の方法。
（項目３３）
第1流路内の圧力が第2流路の圧力と異なることを特徴とする、請求項30に記載の方法。
（項目３４）
第1および第2流路の合流地点またはその付近に収縮(圧縮)作用が存在することを特徴とす
る、請求項30に記載の方法。
（項目３５）
搬送流体からの少なくとも1つのプラグを分離する手段をさらに備えた請求項1に記載の方
法。
（項目３６）
第1流路のプラグ形成領域下流において少なくとも1つのプラグの存在を検出する手段をさ
らに備えた請求項1に記載の方法。
（項目３７）
反応生成物の検出をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目３８）
反応監視能力をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目３９）
反応速度の監視能力をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目４０）
プラグの少なくとも1つの光学特性を測定する能力が監視機能に含まれることを特徴とす
る、請求項38に記載の方法。
（項目４１）
搬送流体およびプラグ流体の屈折率が本質的に類似していることを特徴とする、請求項1
に記載の方法。
（項目４２）
基板流路沿いの一箇所以上で監視が行われることを特徴とする、請求項38に記載の方法。
（項目４３）
多大なる数の基板を並行して消耗する機能をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目４４）
流体を一定期間停止する機能をさらに備えた請求項1に記載の方法。
（項目４５）
重合反応を特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目４６）
搬送流体を基板の第1流路へ導入する手段と、少なくとも1つのプラグ形成領域における少
なくとも第1および第2プラグ流体を第1流路へ導入する手段と、少なくとも第1および第2
プラグ流体を備えるプラグ形成を目的として基板における流体の流れを誘発するために第
1流路に圧力を適用(加圧)する手段を備えた、少なくともプラグのいくつかにおいて結晶
が形成されることを特徴とする、物質の結晶化方法。
（項目４７）
物質がナノ粒子であるところの、請求項46に記載の方法。
（項目４８）
物質が、タンパク質、DNA、RNA、病原体、薬剤、薬剤同質異像または小型分子であるとこ
ろの、請求項46に記載の方法。
（項目４９）
物質が、タンパク質、DNA、RNA、病原体、薬剤、薬剤同質異像または小型分子2つ以上の
錯体であるところの、請求項46に記載の方法。
（項目５０）
第1プラグ流体がタンパク質を含み、第2プラグ流体が沈殿剤を含むことを特徴とする、請
求項46に記載の方法。
（項目５１）
第1および第2プラグ流体間の界面を作り出す手段をさらに備えた請求項50に記載の方法
。
（項目５２）
第1流路長さ分(流体が第1流路を通過する間)界面が十分に維持されることを特徴とする
、請求項50に記載の方法。
（項目５３）
プラグの蒸発をさらに備えた請求項46に記載の方法。
（項目５４）
一定の期間にわたり流体の流れを停止する機能をさらに備えた請求項46に記載の方法。
（項目５５）
反応により不安定中間体が生じることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
（項目５６）
非直線部を少なくとも1つ備えた少なくとも1つの流路と、前述流路と流体が交流してい
る少なくとも1つのプラグ流体入口と、前述流路と流体が交流している少なくとも1つの搬
送流体入口と、前述流路内部に流体の流れを生成する手段を備えた、少なくとも1つの基
板を備える装置。
（項目５７）
流体の流れが減速するところの、流路沿い膨張範囲1つ以上をさらに備えた請求項56に
記載の装置。
図1Aは、プラグ内の急速混合を誘導するために使うことができる流路構造の概略図。図1B(1)-(4)は、基本的な流路構造の一連の周期的変化を示す概略図。図1C(1)―(4)は、図1Aにおいて示される基本設計要素と、図10B(1)―(4)において示される一連の周期的変化に基づく代替要素のシーケンスから生じる一連の非周期的な組み合わせを描いた概略図。 図2Aは、流路の層流輸送とプラグ輸送を対比する概略図。図2B(1)は、プラグ内部での屈曲する流路を通過する急速混合を図示する写真(右上)を示す図。図2B(2)は、流路屈曲により、PFD非存在下では、層流内の混合加速現象が生じないことを表す写真(右下)を示す図。 図3は、0.5μL/分と1.0μl/分の流量で、湾曲した流路における水性プラグ流体と油(搬送流体)からのプラグ流れを示す写真(右側)と概略図(左側)を示す図。 図4は、油と複数プラグ流体の注入によるプラグ形成を図示する写真(下部)と概略図(上部)を示す図。 図5は、反応および混合作用を制御するために異なる幾何学形状の組み合わせを用いて油および複数プラグ流体の注入による2段階に渡るプラグ形成反応を図示する概略図。 図6は、プラグ分割・融合の両方を可能とする複数の入口を持つマイクロフルイディック・ネットワークの一部を示す概要描写。この概略図は、同時に誘導される2反応を示す図。(最初の2反応による混合の中間である)第３反応は精密な時間的遅延を利用して誘導される。 図7(a)-(b)は、均一総流速にて屈曲流路を通るプラグ内の急速混合(a)と層流における小規模な混合(b)を図示するマイクロ写真(10μ秒の露光)を示す図。図7(c)は、Fluo-4溶液とCaCl2溶液プラグ内部の急速混合から生じる、蛍光性を時間平均して示す偽色彩法マイクロ写真(2秒の露光、個々のプラグは見えない)を示す図。図7(d)は、プラグを通って移動した距離関数(左)と所定流量にてその距離を移動するのに要した時間関数(右)に基づき、画像から得た相関的且つ正規化補正後の蛍光強度（I）の線グラフを示す図。図7(e)は、(c)の溶液の層流における小規模混合から生じる弱い蛍光性の偽色彩法マイクロ写真(2s露光)を示す図。 図8は、各階段の屈折角度が90°の階段流路における流量約0.5μL/分と約1.0μL/分での急速混合を図示する写真(右側)と結線図(左側)を示す図。 図9は、各階段の屈折角度が135°の階段流路における流量約1.0μL/分と約0.5μL/分での急速混合を図示する結線図(左側)と写真(右側)を示す図。 図10a）は、プラグ内の乱流を三次元共焦点可視化したものを描く概略図。図10b）は、三次元流の可視化に好ましいシーケンスを示す線グラフ。 図11は、マイクロフルイディック流路を流れるプラグの「ベーカーによる変態の（補助）定理」を実装および可視化するために設計された流路形状の概略図を示す図。 図12は、個別の流路または流路の垂直分岐に流れるプラグの混合(上)と分裂（下）を表す写真。 図13は、プラグ内の急速混合(とがった吸収頂点を伴う範囲)および従来の溶液混合によって形成されたCdSナノ粒子のUV-VIS領域を示す図。 図14は、単相水性層流(図14A)および水不混和性パーフルオロデカリン(perfluorodecaline)により囲まれる水性プラグ(図14B)内のPDMSマイクロフルイディック流路のCdSナノ粒子合成を図示する概要図(左側)と写真(右側)を示す図。 図15は、プラグ内部のCdSナノ粒子合成の概要描写を示す図。 図16は、プラグのトラッピングを図示する、発明によるマイクロフルイディック装置の概要説明図。 図17は、タンパク質結晶化可変組成を伴いプラグを形成するマイクロフルイディック方式の略図図。 図18は、水性プラグ流体・搬送流体界面の界面化学を変えることにより、不均質核生成を制御する方法の概要描写を示す図。 図19は、本発明によるマイクロフルイディック・ネットワークを手段とする核生成と成長の分別方法を示す概要図。 図20は、混合に対する精密且つ再現可能なレベルにおよぶ制御能力を可能にし、タンパク質結晶化に対する混合効果を定める手段となりうる二つの方法を図示する概要図。 図21は、クロライト‐チオ硫酸塩反応が不安定な点を図示する反応線図。 図22A-Dは、単一視像から動態情報を得る手段となりうる発明によるマイクロフルイディック・流路形状の様々な事例を示す概要図。 図23は、マイクロフルイディック・ネットワークの略図(左側)と、流路高さ15μmと2μmのネットワーク用パラメーターの表を示す図。 図24は、(a)タンパク質吸着に対する抵抗力を備え、(b)陽の荷電を持ち、及び(c)負の電荷を持つ、単分子層を形成するフッ素添加界面活性剤の事例を表す反応スキームを示す図。図24bは、アミンまたはグアニジニウム群のプロトン化による水との相互作用により、荷電された中性界面活性剤の化学構造を示す。図24cは、カルボン酸群の脱プロトン化による水との相互作用により、荷電された中性界面活性剤の化学構造を示す。 図25は、異なる水性流濃度によるプラグ形成を示す写真 ( a・ b・ cの右側 ) だけでなく、プラグ内部の水溶液濃度を制御する手段となりえるマイクロフルイディック・ネットワーク( a・ b・ cの左側 )の概要図。 図26は、マイクロフルイディック・ネットワークの概要図(aとbの左側)と、流れ方式を示すために赤と緑の色素で水性流を染色したネットワーク内プラグ形成部位の写真(aとbの右側)を示す図。 図27は、直線のマイクロ流路を通過するプラグ内部流れの再循環を伴う混合作用に対する初期条件の効果を示す写真と線グラフを示す図。図27a1は、(黒い矢印よって指される)再循環中の流れが、初期プラグ表半面・裏半面の試剤溶液と効率的に混合した状態を示す概要図。図27a2は、(黒い矢印よって指される)再循環中の流れが、初期プラグ表半面・裏半面の試剤溶液と効率的に混合しなかった状態を示す概要図。図27bは、入口部(左側)を示す概要図、およびプラグの様々な周期・長さの測定値を表す画像写真を示す図。図27c１は、異なった長さのプラグにおいてFe(SCN)x (3-x)+複素数の相関的光学強度のグラフを示す図。図27c2）は、各プラグが1.3mmの距離を横断する場合を除いて図7c1と同様。 図28は、移動方向に関連したプラグの異なる部位を示すために、従来の表記法で描かれたプラグ概要描写を示す図。 図29a-bは総流速の関数(図29a)と水の割合(図29b)を表す、プラグ周期および長さの線グラフ。 図30は、プラグ周期・長さと総計流速におけるプラグ内部の流れ方式との依存性が低いことを図示する写真を示す図。 図31は、水の割合が各々0.20、0.40および0.73だった場合のプラグ周期と長さの分布を示す棒グラフ。 図32は、マイクロフルイディック・ネットワークの図(左側)と共に、プラグ・トラップがマイクロフルイディック・ネットワーク内の結晶形成に不要であることを表す写真(中央と右側)を示す図。 図33a-d(左側)は、同一又は非同一寸法の流路を備えるマイクロフルイディック・ネットワークの平面図(左側)と写真(右側)を示す図。図33aは、写真に示されるように、T字型流路にてまれに生じるプラグ融合を示す図。図33bは、Y字型合流地点(表示されている拡大図参照)における、異なるタイミングで到達するプラグ間に生じるプラグ融合を示す図。図33cは、同相の融合（合流地点にある少なくとも2本のプラグが同時に到達した時に生じるプラグ融合、2対の入口において異なる油・水の割合により生じる異なるサイズから成るプラグが同時に到達した時に生じるプラグ融合、等)を示す図。図33dは、後に続く2本のプラグ流れの相関的な速度の変動によりもたらされた欠陥(つまり標準又は理想条件の下においてプラグ融合が生じないという異常)を図示する。 図34a-cは、流路網を上から見た状態を概要図(a、左側)と写真(b、c)のおのおのに示した図。図34aは、実験に使用された流路網の概要図。図34bは、プラグが第１プラグの約半サイズのプラグへと分裂する状態を示す写真図。図34cは、P1 < P2時に生じたプラグの非対称分裂を表す写真を示す図。 図35は、マイクロフルイディック・ネットワークを利用して、合流地点付近における圧縮の無い状態で生じたプラグの分裂を示す概要図(a、左側)と写真(b、c)。 図36は、結晶化を伴ったマイクロフルイディック・ネットワークの線図(左側)だけでなく、マイクロフルイディック流路水源内の水プラグ内で成長（増加）したリゾチーム結晶の写真(右側)を示す図。 図37は、自触媒作用を伴う(且つ不安定ともいえる)反応混合物による小規模な化学信号を拡張する手段となりうる、発明によるマイクロフルイディック装置を示す概要図。 図38は、分子レベルで検知する手段となりうる多段化学を増幅する方法を図示する概要図。 図39は、マイクロフルイディック・ネットワークの図解(左側)と、PDMSの壁に付着した水プラグの写真(右側)を示す図。 図40は、蛍光発生基質(チップ上酵素反応動力学)により、リボヌクレアーゼA（RNA分解酵素A）による反応速度データを測定する手段となるマイクロフルイディック・ネットワークの概要描写(左側)、及び、 リボヌクレアーゼ Aと蛍光発生基質間の反応速度データを線グラフで示す図。 図41は、マイクロフルイディック・ネットワークの図解(左側)だけでなく、マイクロフルイディック・ネットワークの水滴部位の写真(中央と右側、T＝時間)を示す図。 図42は、マイクロフルイディック・ネットワークの概要図(左側)と、勾配が流量変化により形成されたマイクロフルイディック・ネットワークのインク・プラグ部位の写真(右側)を示す図。 図43は、マイクロフルイディック・ネットワークの概要図(左側)と、勾配によりマイクロフルイディック・ネットワークに形成されたリゾチーム結晶の写真(右側)を示す図。 図44は、分離した試剤Bの水性サンプルを水流に注入することにより、最初の勾配がどのように発生しうるかを示す概要描写を示す図。 図45aは、試剤の流量変化によりチップ上での希釈を成し遂げうることを実証する手段となりうるマイクロフルイディック・ネットワークの略図を示す図。青い長方形は、図45cとdに記されている画像の視野を描く図。図45bは、マイクロ流路内プラグにおいて希釈したフルオレスセイン(蛍光色素)溶液の蛍光性を測定することにより、当希釈法を数量化したグラフを示す図。
（発明の詳細な説明）
「分析」という用語は典型的に、分類・試験・測定・最適化・識別・総合・追加・ろ過・
分解または混合を含む、物理学・化学・生化学・生物学的分析に関係する工程または手段
に関係する。
「分析ユニット」という用語は、典型的に化学物質に対し一タイプ以上の分析を実施す
ることを特徴とする、基板または流路内の一部分又は部位に関係する。
「搬送流体」という用語は、プラグ流体に対し不混和性をもつ流体に関係する。搬送流
体は、極性・無極性群の両方またはその半群の物質を備えうる。
「流路」という用語は一般的に、少なくとも部分的な開口を備えうるが、典型的には包
囲された導管（ダクト）に関係する。且つ、化合物・溶媒・溶液・乳剤・又は分散に関係
するかもしれない同質もしくは異質でありうる、1つ以上の物質タイプまたは混合物タイ
プが、流路を通過しえる。前述のうちのいずれか一つは、固形・液体・または気相形態で
ありえる。流路は、管状、円筒状、長さに伴い同一又は変形形態の寸法(例えば、テーパ
ー状、等）、及び長方形・円形・三角形等の長さに伴い1つ以上の断面形状のような、形
態・形状を伴うと推測できる。流路は一般的に、重合体、金属、ガラス、合成、又はその
他の比較的無活性な材質を含み且つ適合する材質からなる。本申請書では、「流路」とい
う用語は、装置における用途に適切な寸法を備えるマイクロ流路に関係する。流路網とは
、一般的に接続中もしくは相互伝達する流路の重複度に関係する。流路は、バルブなど別
種の導管を通し他の少なくとも1本の流路に接続されうる。
「化学物質」という用語は、物質、化合物、混合物、溶液、乳剤、分散、分子、イオン
、二量体、重合体やタンパク質などの高分子、有生分子、沈殿物、結晶、化学系半群また
は群、粒子、ナノ粒子、試剤、反応生成物、溶媒あるいは液体に関係する。前述のうちの
いずれか一つは、固形、流体、あるいは気態として存在するかもしれず、一般的に分析の
対象となりえる。
「検出領域」という用語は、化学物質が先決特性または特徴に基づいて識別、測定、選
別されることを特徴とする基板または流路の一部分あるいは部位に関係する。
「装置」という用語は、ウェットエッチングまたはドライエッチング、かつまたは従来
のリソグラフィ技術、あるいはソフトリソグラフィのようなマイクロマシーニング技術な
どの技術を手段として、製作または製造された装置に関係する。本申請書において、「装
置」という用語は、マイクロファブリケーション（微細加工）された装置として、称され
る又は認識される又は分類されるものに関係する。発明による装置は、各側面の寸法が約
0.3cmから約15cm(6インチ・ウエハー同等)、および約1マイクロメータから約1cmの厚さを
備えうるが、装置の寸法はこれらの範囲外となりうる。
「識別領域」という用語は、他のいかなる少なくとも1本の流路に進入するために流体
の流れ方向が変更しえることを特徴とする、分岐流路などのような基板または流路の一部
分もしくは部位に関係する。
「下流」という用語は、流体が初期点を通過後に到達する最初の位置に関係する。フロ
ー装置循環中の場合、「下流」とは、流れが再び初期点を交差する前の流動経路に沿って
さらに前進したところの位置に関係する。「上流」とは、流体が基板または装置の与えら
れた初期点に達する又は通過する前に、その流体が達する又は通過するだろう流動経路の
ある時点に関係する。
「流れ」という用語は、固体または液体のような流体の、いかなる動作をも意味する。
例として、発明による基板または基板構成要素において、あるいは発明にのっとる方法に
関係する基板または基板構成要素において（例：発明によるマイクロフルイディック基板
の流路を通り）、プラグ流体・搬送流体・またはプラグの動作が流れを形成する。いかな
る力も流れを形成する手段となりうる。いかなる特定の理論あるいはアクション・メカニ
ズム(実施機構)に制限されるものではないが、流れを供給する力の例としては、圧力・毛
管作用・電気浸透・電気泳動・誘電泳動・光ピンセット・およびそれらの組み合わせが挙
げられる。
「不混和性」という用語は、相がある種の機械的または物理学的撹拌作用を受けた後で
さえも、少なくとも２相または２流体が少なくとも部分的に分離し続ける又は分離したま
まになるなどの、特定条件または一組の条件（例：温度かつまたは圧力）の下において、
少なくとも２相あるいは２流体の混合時に生じる抵抗力に関係する。
不混和性を伴う相または流体は一般的に、物理的にかつまたは化学的に識別可能、もし
くは、少なくともある程度まで分離しうる。
「吸込口(インレットポート)」という用語は、プラグ流体を受け入れる基板の一部に関
係する。吸込口は、化学物質の基板浸入を促進する吸込流路、水源または貯水溝、開口、
および他の機構を備える。望ましくは、基板は1つ以上の吸込口を備えうる。吸込口は、
流路と流体伝達しうる、あるいはバルブにより流路から分離しうる。
「ナノ粒子」という用語は、一般的に約1〜100ナノメーター(nm)の長さ尺度を持つ、原
子・分子・高分子の粒子に関係する。
典型的に、ナノ粒子の新しい識別特性と機能は、一般に100nm未満の物質の限界長さ尺
度で観察および発生しうる。ナノ粒子はナノサイズの構造を可能にする手段となりうる。
そして、より大規模な材質構成要素やシステムおよび体系へと統合されうる。ある特定の
場合、ナノ粒子に関係する新しい特性と現象の限界長さ尺度は、1nm未満(例：約0.1nmで
の原子操作)あるいは100nm以上(例：ナノ粒子により強化された重合体は、約200〜300nm
において、ナノ粒子と重合体の間で局部ブリッジまたは結合剤として機能するなど、ユニ
ークな機構を備える）。
「核生成組成」という用語は、結晶形成にふさわしい条件の下における結晶化機能を備
える1つ以上の核を含む物質または混合物に関係する。例として、蒸発、試剤濃度の変化
、沈殿剤などの物質添加、固形物を種とする形成、機械的撹拌、あるいは核生成の組成と
の界面上での干渉に伴って生じる結晶化により、核生成の組成が誘導されうる。
「出口（アウトレットポート）」という用語は、プラグ流体、搬送流体、またはプラグ
あるいは反応生成物を収集または分布する基板の一部に関係する。望ましくは、基板は1
つ以上の出口を備えうる。
「粒子」という用語は、いかなる物質の個別形態あるいはユニット形態を意味する。「
粒子」という用語は、原子、分子、イオン、二量体、重合体あるいは有生分子に関係する
。
「微粒子」という用語は、原子、分子、イオン、二量体、重合体あるいは有生分子など
のような粒子の群または集塊に関係する。
微粒子は、固形物を有したり非常に固い場合があり、さらに、多孔性であったり部分的
に空洞を有するかもしれない。液体またはガスを含んでいるかもしれない。さらに、微粒
子は同質のものまたは異質的なものかもしれない。すなわち、それらは1つ以上の物質あ
るいは材質を備えうる。
本発明によると、少なくとも1本のプラグ流体が本質的に混合できないところの搬送流
体へ導入される場合に「プラグ」が基板において形成される。装置内における流体の流れ
は、例として、圧力、放射、熱、振動、音波、電界、又は磁界の存在またはアプリケーシ
ョンから、直接あるいは間接的に生じる推進力または刺激により誘導される。本発明によ
るプラグ断面は、サイズは異なりえるが、プラグ形成時に形成される流路断面に事実上類
似していることとする。プラグが融合またはプラグ・トラップ内部でトラッピングした場
合、プラグの断面が変化するかもしれない。例えば、プラグがより広い流路に入るとき、
通常、その横断面は拡大する。
さらに、本発明によると、プラグ形状が異なりうる。例えば、球状かもしれないし、非
球状かもしれない。プラグの形状は、流路の形状に依存しないかもしれない(例：プラグ
が長方形流路内を移動する歪んだ球体でありうる。ここでいうプラグは、水性プラグ流体
が油などの無極疎水性流体により囲まれていることを特徴とする1つ以上の試剤かつまた
は試剤反応作用により形成された1つ以上の生成系を含む水性プラグ流体を備えるプラグ
の形をしているかもしれない。プラグはまた、主として水性流体で囲まれる無極・疎水性
流体を備えるプラグの形をしているかもしれない。プラグは、疎水性・親水基の両方ある
いはその半群を備える一層以上の分子層により包まれうる。「プラグ」という用語はまた
、1つ以上の小さめのプラグ(すなわちプラグ内部のプラグ)を備えるプラグに関係する。
プラグに含まれる試剤と反応生成物の相関量は、プラグ内に生じる反応などの要素に常
に依存する。好ましくは、少なくとも2本のプラグ流体の混合物がプラグに含まれている
ものとする。
「プラグ形成領域」という用語は、発明による吸込口と基板上第1流路との合流地点に
関係する。好ましくは、第1流路からの流体にプラグ形成領域で形成されたプラグ流体が
流入できるために、吸込口へと導入された流体が第1流路の流体と「非互換性」(つまり不
混和性)を有するものとする。
「プラグ流体」という用語は、反応すなわち沈降反応が生じうることを特徴とする流体
、もしくは反応すなわち沈降反応の発生を利用する流体に関係する。いくつかの実施形態
において、試剤を含まないプラグ流体が少なくとも1本存在しうるが、典型的にプラグ流
体は溶媒と試剤を含む。試剤は、溶媒に対し溶性あるいは不溶性のどちらでもありうる。
プラグ流体は界面活性剤を含みうる。本発明において、少なくとも2本の異なるプラグ流
体が用いられる。両プラグ流体が試剤を含む場合一般的に混和性をもつが、各プラグ流体
の試剤が少なくとも1つの生成系または中間体に形成反応をおよぼしえる限り、これら2本
のプラグにもたらされる混和性は不完全でありうる。
「重合体（ポリマー）」という用語は、互いに反復結合する2つ以上の基礎成分(「mers
」-特定部類に属する化合体)を備えるあらゆる物質あるいは化合物を意味する。例えば、
「二量体」は2つの基礎成分がともに連結された化合物である。重合体は縮合と付加重合
体の両方に関係する。縮合重合体の代表例として、ポリアミド、ポリエステル、タンパク
質、ウール、絹、ポリウレタン、セルロースおよびポリシロキサンなどが挙げられる。付
加重合体の例として、ポリエチレン、ポリイソブチレン、ポリアクリロニトリル、ポリ(
塩化ビニル)およびポリスチレンが挙げられる。他の例は、導電性重合体あるいは光屈折
性重合体など、重合体の電気的性質または光学的性質(例えば非線形光学的性質)が高まる
ことに関係する。重合体には、線形および分岐型重合体がある。
「タンパク質」という用語は、一般的に、特定のシーケンスで通常共に連結する一組の
アミノ酸に関係する。天然タンパク質と人工たんぱく質とがありえる。本申請書において
、「タンパク質」という用語は、半群または群を含むために組み替えられたアミノ酸シー
ケンスに関係する。その例として、糖分、重合体、有機金属群、蛍光群または発光群、分
子内または分子間での電子伝達などの工程を増強するもしくは工程に関与する半群あるい
は群、たんぱく質が特定の整合または一連の整合を備えることを促進または誘導する半群
あるいは群、タンパク質が特定の整合または一連の整合を備えることを妨害もしくは抑制
する半群あるいは群、タンパク質フォールディング(折りたたみ）を誘導・増強もしくは
抑制する半群あるいは群、あるいはアミノ酸シーケンスに組込まれそのシーケンスの化学
・生化学・生物学的特性の変更を目的とするその他の半群または群など、が挙げられる。
本申請書において、タンパク質の例としてはこれらに限定されないが、細胞工程又は細胞
活動などの過程に関与する酵素、構造要素、抗体、ホルモン、電子担体、およびその他の
高分子が挙げられる。
タンパク質の特徴として、一次構造・二次構造・三次構造・四次構造の4レベルにわた
る構造を有するといことが挙げられる。
「反応」という用語は、物理学・化学・生化学・生物学的変態に関係する。これらの変
態は通常、反応原系、試剤、相、搬送流体あるいはプラグ流体を例とする少なくとも1つ
の化学物質に関係し、そしてまた、(物理学・化学・生化学・生物学的変態の場合には)共
有結合、非共有結合、ファンデルワールス結合、水素結合あるいはイオン結合などの1つ
以上の結合の分裂または形成に関係する。本用語は、共有結合と非共有結合、相転移、変
色、相転移、結晶化、分解、発光、光吸収・放射特性の変化、温度変化あるいは熱吸収あ
るいは放射、整合の変化、そしてタンパク質などの高分子フォールディングまたは変性だ
けではなく、総合反応、中和反応、分解反応、変位反応、酸化還元反応、沈降反応、結晶
化、燃焼反応、そして重合反応などの典型的な化学反応に関係する。
「試剤」という用語は、追加反応または一連の反応を受けるかもしれない1つ以上の反
応生成物あるいは中間体を生成するために、基板上に存在する他のプラグ流体の構成要素
1つ以上または試剤を含む搬送流体と伴って、少なくとも１タイプの反応を受けたりそれ
に関与したりする(例：反応率または平衡状態位置に影響を及ぼすことにより関与する)、
プラグ流体の構成要素に関係する。
放射・熱・温度または圧力変化・超音波・触媒から帰する刺激により別の試剤や中間体
または生成系での試剤変態反応を引き起こす誘導反応が、プラグ流体に含まれる試剤にも
たらされるかもしれない。また、他のプラグ流体または試剤を含む搬送流体の構成要素1
つ以上に相互作用で相転移するなどの反応(例えば沈降反応）が、試剤にもたらされるか
もしれない。
「基板」という用語は、装置またはチップの作成又は製作に用いられた1つ以上の材質
の層や部品に関係する。本申請書において、「基板」という用語は、従来の又は認知のい
かなるマイクロ加工技術により組み立てられたあらゆる基板に関係する。
「基板」という用語はさらに、装置またはチップの、全本体あるいはその本体から取り
外し可能又は着脱式の一部、一領域、又は一画に関係する。
基板は、ガラス、シリコン、シリコーン・エラストマー、およびこれらに限定されない
がポリプロピレンまたはポリエチレンが例として挙げられる重合体などの、1つ以上の材
質から成りうる。
プラグ形成、一連のプラグ勾配生成、プラグ試剤濃度の変化、プラグ内急速混合、およ
び混合時間の尺度構成を目的とした、発明による様々な装置と方法の詳細説明を下記する
。その中でも特に、流路によるプラグの融合、分裂かつまたは選別に関する詳細な説明が
論じられている。当説明により、様々な製品の製作・分析から、電子工学・医学・診断学
および薬学へのアプリケーション等の範囲に及ぶ様々な用途における、発明による様々な
装置と方法の実用性を裏付けする根拠が確立される。プラグおよびプラグ内に生じる工程
の検出・測定方法も、他のアプリケーションと共に記述されている。
粒子分離・選別、合成、非線形・（線形）確率システムの調査、不安定自触媒作用混合
物による非線形増幅、化学増幅用確率化学システムの利用、反応速度測定、過程の時間的
管理、反応速度測定ダイナミック・レンジ拡大、超高速測定、タンパク質結晶化、そして
界面化学の動的制御などが、発明による装置と方法に関係する様々なアプリケーションと
して挙げられる。
これらに加え、発明による装置と方法は、その他の広範囲にわたるアプリケーションを
提供する。例として、発明による装置と方法は、一連の時間尺度(例：結晶化の場合、数
十マイクロ秒単位から数時間または数週間単位)での、また、一連の溶液量(例：フェムト
リットル単位から数百ナノリットル単位)での溶液や反応作用に関する効果的で迅速かつ
精密な操作とモニタリング(監視)の手段となる。
発明の一態様において、発明による様々な装置と方法は、マイクロフルイディックがも
つ次の問題1件以上を克服する手段となる。第一に、マイクロフルイディック流路では大
幅な溶質分散は試剤消費量増加が生じるために、長期の時間尺度(例えば分単位から時間
単位)での実験または測定が困難になる。発明による様々な装置と方法は、非混合性の搬
送流体によりプラグ内部に閉じ込められている試剤を局部集中することにより、この難問
を克服することを目的とする。
第二に、溶液混合スピードが遅い場合、極度に短い時間尺度（例：ミリ秒単位よりも短
い尺度）での実験、試験、または反応が要されることになるが、これは、既存の技術では
困難というよりも不可能である。
さらに、乱流に基づいた混合技術はサンプル消費量を法外に増加させる。本発明にのっ
とって、プラグ内部の混合作用によりこの難問に取り組むことが好ましい。発明による様
々な装置と方法は、乱流に依存するのではなく、むしろ混合作用を加速するためにカオス
的移流に依存することが好ましい。カオス的移流がもたらす利点は、小規模および大規模
の両流路において効率的に作用することが期待されるということである。
第三に、装置内部表面の化学物質に対する制御を達成することは、装置が小規模の場合
に極めて重要でありうる。したがって、非常に望ましい条件として、小型装置内の界面化
学を制御することが可能であるということが例として挙げられる。発明による装置と方法
にのっとって、好ましくはプラグとそれらを囲む不混和性流体の接点で結集する設計を伴
う界面活性剤の念入りな選択により、溶液が露出される界面化学を好ましくは制御する。
発明による装置と方法はまた、例として小型化と高速化が重要視されるマイクロフルイ
ディック従来の分野における手段を提供する。
したがって、発明による装置と方法は高度な処理能力をもつ化学または生物物理学的測
定、化学合成、粒子形成およびタンパク質結晶化などに用いられる様々なツールを開発す
るための手段となりうる。
また、内蔵型プラットホームとしても、または既存の技術（特に不混和性流体の流れに
依存するもの）と組み合わせることによって、高度処理能力をともなうスクリーニング、
コンビナトリアル合成、分析および診断の手段ともなりうる。
ここで重要なのは、発明による装置はオートメーションおよびロボット工学技術による
作動に適合しうるということである。例として、高度処理能力を備える生体分子構造・機
能分類用超オートメーション・システムの基本原理として応用してもよい。したがって、
発明による様々な装置と方法は、生物学・化学・生物物理学・生物工学および医学(例：
診断学)の分野における、高速かつ経済的でアクセス可能(手頃)な合成・分析および測定
の手段を提供する。
発明による装置と方法は、この他にも多数の可能性に満ちた用途を提供する。例として
、レイノルズ数低値でのカオス的混合は、不安定な化学反応を制御するための重要なツー
ルとして利用することができる。さらに、発明によるシステムと装置は、非常に不安定な
(もしくは爆発性を持つ)中間体を生成する反応を制御かつまたは監視する手段となりうる
。
また、自触媒作用反応に関係する反応または工程を制御または監視するにあたり有益に
なりうる。例として、純粋過酸化水素(H2O2)は低コストという利点に加え非常に効果的な
酸化体であるが、その自触媒分解（変質）作用により、たびたび保管および取り扱い時の
爆発をもたらすという問題がある。発明によるマイクロフルイディック・システムの場合
、好ましくは、H2O2が原位置（in-situ）において生成され、カオス的流れにより安定し
、化学兵器および細菌戦の病原体を破壊する手段となる。
これらのシステム中の不安定な混合物が、発明にのっとって形成されたプラグ内部にお
いて局部集中されるので、1つ以上のプラグ内で時折生じる自触媒分解（変質）がそれら
のプラグ内に局部集中されたままになる。それによって、システム全体に関係する破局反
応を防ぐ。さらに、高度な処理能力を供給するのと並行してマイクロフルイディック・リ
アクトルの大規模なシーケンスを機能しうる。
また、発明による装置と方法を用いて、単一ネットワーク内にある複数の自触媒作用の
反応を結合することも可能である。例として、サンプルプラグはそれ自体よりも小さい多
数のプラグに分裂し、個々の増幅階段流へと転送されうる。階段流流出物に含まれるもの
は、システム中の検体パターンに相当するパターンを持っているので、人工ニューラル・
ネット(ANN)(Jackson,R.B.a.T. Neural Computing : An Introduction, Hilger, New
York,1991;Zornetzer et al.,An Introduction to Neural and Electronic Networks
,Academic Press,San Diego,CA, 1990. )のアルゴリズムを用いて、これらのパターン
を分析しえる。例として、血液または唾液分析において生じるパターンは、人間と動物な
どを例とする生態にたずさわる一定の正常状態または異常状態(例：疾病、疲労、汚染、
中毒)に匹敵しうる。
さらにまた、発明にのっとり、非線形化学反応がANNアルゴリズムを手段として、検出
だけでなく分析も実施できる知的マイクロフルイディック・システムを作り出すことが可
能となりうる。例として、増幅後に、本発明による流路は典型的に、ヒドロゲル作動バル
ブを操作する材質を十分に含んでいる(Liu et al.,"Fabrication and characterization
of hydrogel-basedmicrovalves,"J.Microelectromech.Syst. 2002, vol.11, pp. 45
-53;Yu et al.,"Responsive biomimetic hydrogel valve for microfluidics," Appl.
Phys.Lett.2001,vol.78,pp.2589-2591;Beebe et al., "Functional hydrogel struc
tures for autonomous flow control inside microfluidicchannels," Nature, 2000, vo
l. 404,588.)。
これらのバルブは、サンプルプラグ組成機能をもち、システム内部の流れを制御する手
段となりえる。これにより、前送り網(feed-forward-network)が作り出され、分析の手段
となりうる。同様に、 (例として、ヒドロゲル・バルブで入力流れを制御することにより
)逆送り網(feed-backward-network)さえも作り出され、分析の手段となりうる。このよう
な非線形ネットワークは、流路接続により事前にプログラムされたパターンを認識する(H
jelmfelt et al.,"Pattern-Recognition in Coupled Chemical Kinetic Systems,"Scie
nce, 1993, 260, 335-337. )ためだけでなく、非線形ネットワーク自体を再構成するこ
とによりパターンを学ぶ手段となりうる(Jackson, R. B. a. T. Neural Computing :An
Introduction, Hilger, New York,1991 ;Zornetzer et al., An Introduction to Neur
al and Electronic Networks,Academic Press,SanDiego, CA,1990.)。このような知的
マイクロフルイディック装置は、恐らく、完全に自律した検出・分析および信号処理を行
うことが出来るなど、現代の生物学的システムおよび人工システムによるものをしのぐ、
前例無き能力を備えうるものである。
また、発明による装置と方法は、分類を要し微量でのみ利用可能である何千もの新しい
有生分子を識別する手段であるゲノミクスとプロテオミクスにおいて有用である。特に、
ゲノミクスとプロテオミクスにおける成功事例として挙げられるのは、タンパク質結晶化
に効果的な高度処理能力機構の需要増加である。X線の構造判定はタンパク質構造分類の
主な方法として応用され続けている。しかしながら、結晶化作用を理解するための著しい
努力にもかかわらず、その合理的な研究方法案のヒントとなる一般理論さえも発見されて
おらず、高分子結晶化作用の大部分は未だ実験的知識の分野として認識されるままである
。結果として、タンパク質結晶に最も広く用いられている方法は実験的スクリーニングで
ある。
発明による装置と方法のアプリケーションを下記に続ける。例として、問題の多くは、
高度処理能力の速度とタンパク質結晶化に携わるものである。タンパク質構造判定とタン
パク質間の相互作用を量的に確認する場合、少なくとも次の技術的課題２項目が挙げられ
る。(1)ロボット工学技術の大部分は未だ、既存の方法を単にオートメーション化するだ
けであるにもかかわらず、多くの場合、小規模な研究所には賄えない金額を要する。そし
て(2)結晶化工程に対するさらに優れた制御能力を備える新しい概念による方式が必要と
される。さらに、結晶化試験のセットアップ（準備）と観察は、通常、秒単位から数日に
及ぶ周期にわたり、マイクロリットル量以下という微量の流体処理に関係する。
したがって、本発明による様々な装置と方法は、溶性・膜タンパク質の高度な処理能力
を伴う結晶化の今までに無い効果的な手段を提供する設計がされている。発明によるシス
テムは、数千にわたる結晶化を分単位で試験できる簡易且つ経済的なセットアップ方を提
供するだけでなく、結晶化に至る混合および核生成などの工程に関する独特な時間的管理
を可能にする。また、本発明によるシステムは、核生成など短い時間尺度で生じる現象だ
けでなく、結晶成長など長期にわたる時間尺度で生じる現象を制御することにより、タン
パク質結晶化を制御する手段となりうる。
その上、本発明による装置と方法は、時間領域が10−5 −10−7秒という高度な処理能
力・動力学・生物物理学的測定の手段となりうる。好ましくは、本発明による様々な装置
と方法が必要とする各種溶液量は、約数ナノリットルから数マイクロリットルのみである
。このような装置と方法のアプリケーションは、酵素反応動力学とRNAフォールディング
、そしてナノ粒子分類・合成の研究に関係する。その詳細を後述する。
（流路と装置）
発明の一態様として、出口とは別の入口を備える第1流路を備える1つ以上の基板をとも
なう装備が装置にはなされている。状況に応じて、第1流路と流体が伝達する1本以上の第
2流路(又は分岐流路)、第1流路と流体が伝達する少なくとも1つの搬送流体貯水溝、第1流
路と流体が伝達する少なくとも2つのプラグ流体貯水溝、そして基板内部の流体に連続的
な圧力を加えるための手段も装備可能である。
発明による装置は、少なくとも1つの基板を好ましくは備えている。
基板は、プラグのトラッピングが生じえることを特徴とする流路に沿った、1つ以上の
拡張部位または領域を備えうる。本発明による基板は多くの接続する流路を備えうる。
装置は1つ以上の出口または吸込口を備えうる。また、各出口と吸込口は、水源または
貯水溝と伝達しうる。入口と出口は、接続されている流路または貯水溝と流体伝達するか
もしれない、または1つ以上のバルブを含んでいるかもしれない。
いかなる手段においても流体を入口から流路へ導入することができる。典型的に、入口
に入る流体の流量を制御できることを特徴とするシリンジポンプが手段となりうる。
およそ同一サイズのプラグ又はプラグ形成領域内の流路断面とよく似たサイズの断面を
備えるプラグがプラグ群により形成されるように、プラグ形成領域には通常、プラグ流体
入口と搬送流体を含む流路の合流地点が備えられている。ある実施形態において、基板は
複数プラグ形成領域を備えうる。
異なるプラグ形成領域は各々、基板上の同一又は異なる流路に接続されてもよい。好ま
しくは、加圧されたプラグ流体が第1流路を通過する搬送流体の流れる角度で第1流路へ導
入されるようにサンプル入口が第1流路と交差する。例として、T字型合流地点でサンプル
入口と第1流路が交差する（例：サンプル入口が第1流路に垂直なるように［つまり90度で
］交差する）のが好ましい実施形態。しかしながら、サンプル入口はいかなる角度でも第
1流路と交差しうる。
第1流路もまた、例えばT字形やY字形を形成しながら、別の合流地点または「分岐点」
で2本以上の分岐流路と伝達しうる。
用途に合わせて、他の形状および流路の幾何形状を用いてもよい。模範的な実施形態に
おいて、交差する流路間の角度は約60度〜約120度の範囲内である。特定模範角度は45度
、60度、90度、120度である。識別領域の精密な境界は必要ないが好ましい。
本発明による第1及び分岐流路は、各別々に、直線または1つ以上の屈曲を備えうる。基
板に関連する屈曲角度は約10度以上となりうる（好ましくは、約 135度・180度・270度ま
たは360度以上)。
発明のある実施形態における基板は、プラグ形成領域またはその付近で第1流路と伝達
する少なくとも1つの吸入口と、第1流路やプラグ形成領域の全範囲もしくは一部分の中に
あるまたはこれらの領域に一致する検出領域と、検出領域を伴う検出器を備えている。あ
る特定の実施形態において、装置に2つ以上のプラグ形成領域が備えられているかもしれ
ない。例として、分析ユニットが、第1プラグ形成領域で第1流路と伝達する第1吸込口と
、第2プラグ形成領域で第1流路と伝達する第2吸込口(好ましくは第1プラグ形成領域の下
流)とを備える場合に実施形態が実現する場合などがある。
別の実施形態において、発明による基板は、搬送流体の加圧流が通過する第1流路と、
プラグ形成領域で第1流路と交差しプラグ流体の加圧流が通過する2本以上の入口流路とを
備えうる。
好ましくは、これらの入口流路は並列しており、おのおの直角に第1流路と交差する。
異なるプラグ形成領域から導入されるプラグの混合を特徴とする特定の実施形態において
、入口流路が第1流路に沿って互いに隣接していることが好ましい。例として、第一流路
の直径60μmがプラグ形成領域またはその付近で30μmに逓減(ていげん)しうる。それから
また、入口流路直径が約30μmであるのが好ましく、且つ、プラグ混合が好まれる実施形
態においては、第一流路が端から端まで入口流路直径とほぼ同等の距離(つまり約30μm)
で離れているのが好ましい。
発明による実施形態においては、基板にもまた流路に沿う検出領域が備わっている。例
えば、試剤のような化学物質に関する1つ以上の特性を分析するために、独立してまたは
共に作用する複数の検出領域と検出器が備えうる。
検出領域は、プラグ形成領域またはその下流の第1流路部の中にある又はそれと伝達も
しくは一致する。実施形態を選別する際には、検出領域が、識別領域もしくは分岐点また
はその上流の第1流路部の中にある又はそれと伝達もしくは一致する。検出領域の精密な
境界は必要ではないが好ましい。
発明による典型的な基板は、メイン吸収口下流にあるプラグ形成領域にある第1流路と
伝達する1つ以上のプラグ流体入口に加えて、第1流路の一部であり且つ第一流路に直接供
給または伝達する搬送流体入口を備える（個々の異なるプラグ流体入口が異なるプラグ形
成領域で第1流路と好ましくは伝達する)。
異なるプラグ流体または溶液から形成されたプラグの流れはいかなる順序においても開
始されうる。例として、第1プラグ流体を含む水溶液の流れを、第1プラグ形成領域の第1
入口から開始しうる。続いて、水性第2プラグ流体のプラグの流れを、第1入口下流の第2
プラグ形成領域にある第２入口から開始しうる。
（流路、基板、および装置の製作）
ソフトリソグラフィを例とする従来のフォトリソグラフィ(写真平版)技術またはマイクロ
加工技術を用いてシリコン基板・チップまたは装置をエッチングすることにより、発明に
よる基板と装置が製作される。ポリジメチルシロキサン を用いるマイクロフルイディッ
ク装置の製作は前ですでに述べられている。これらの製作およびその他の方法は、低コス
トの小型化された装置を提供する手段となりえ、ソフトリソグラフィの場合には、改善さ
れた柔軟性、安定性および機械的耐久性のような有利な特性を持つ強固な装置を提供する
手段となりえる。好ましくは、光学的検出が用いられる場合、プラグ・搬送流体・および
基板材質などから発する光拡散性が発明により最小限に保たれる。発明による装置は、比
較的低コストでセットアップが簡単である。
発明による流路、基板および装置を製作する手段となりうる機械加工方法 (例：マイク
ロ加工方法)は、その巧みな技術で世に知られており、回転塗布・化学蒸着法のような膜
蒸着（膜形成）工程・レーザー製作またはフォトリソグラフィ技術・または湿式化学エッ
チング又はプラズマエッチングなどのいずれかに関係する。
光学透明シリコーンゴム上またはポリジメチルシロキサン(PDMS) 上で（好ましくはPDM
S上で）流路が成形されうる。これは、例として半導体製作において用いられる同タイプ
の結晶シリコンウエハーにこれらの流路の陰画をエッチングして流路を型鋳造することに
より実行しえる。半導体機構をパターン化するのと同じ又は類似した技術が、流路パター
ンを形成する手段となりえる。流路製作の一方法として、硬化処理されていないPDMSを例
としてペトリざら底に置かれた型に注ぐというものがある。好ましくは、硬化を促進する
ために型を焼成す。硬化後、PDMSは型から取り外されてトリミングされる。例えばコルク
ボーラーまたはシリンジ針のようなツールを用いてPDMSに穴加工しうる。表面に親水性を
もたらすことが望まれる場合は、使用前にPDMS流路をHCl熱浴に浸してもよい。それから
、流路の底あるいは床または上部を形成する手段となりうる顕微鏡カバースリップ(又は
他の適切な平面状のいかなるもの)の上に、PDMS流路を設置することができる。
発明による基板は、ガラスまたは重合体またはシリコン半導体集積回路素子またはシリ
コーン・エラストマーのような材質から好ましくは製作される。
例として、基板の寸法は 各側面約0.3cmから約7cm、厚さ約1ミクロンから約1cmに及ぶ
かもしれないが、これ以外の寸法が適合されるかもしれない。
基板は通常、入口流路と流体伝達する吸込口の流体貯水溝または水源で構造しうる。貯
水溝は、基板中および第1流路中への流体導入を好ましくは促進する。
サンプルが装置内へ進入できるように、吸込口は基板の床のように開口が備えられてい
るかもしれない。吸込口はまた、（流体供給管でありうる）Teflon（登録商標）パイプま
たは液体クロマトグラフィーやHPLCパイプなどの適切な配管部品を接続するのに適合する
コネクタを備えているかもしれない。このような処置は、プラグ形成領域で望まれる圧力
を得るために、正圧流体の導入を促進することを目的とする。
製作工程を経た流路と他の構成要素を含む基板は、（他の透明または不透明カバー材質
も使用可能だが）好ましくは薄いガラスや水晶のような透明カバーで覆われ密封されてい
ることが好ましい。精密且つ効率的な製作方法を確立すべく充実した開発が重ねられた技
術であるという点で、シリコンは好ましい基板材質であるといえるが、ポリテトラフルオ
ロエチレンのような重合体を含む他の材質を用いてもよい。流路、バルブおよび他の要素
を備える分析装置は、様々な基板材質で設計し製作することができる。外部放射線源また
は検出器が使用される場合、流体への光学アクセスを可能にするために、検出領域は透明
なカバー材質で覆われていることが好ましい。例として、シリコン基板をPYREX（登録商
標）カバースリップと陽極結合するには、両構成要素を水性H2SO4/H2O2浴槽で洗浄してか
ら水でゆすぎ、それから、一例として450Vの電圧をかけながら約350℃まで加熱すること
により成し遂げることができる。
サンプルの流れ・混合を目的とした様々な流路を基板上で製作することができ、これら
の流路を検出点・識別点・または選別点として基板やチップまたは装置上のいかなる部位
にも配置することができる。また、異なる時間・距離で検出器の視野に流体を入れるため
に、基板中に流路を設計することもできる。精密な時間・距離で流体の流れを融合または
分裂するための流路を設計することもできる。
一群のマニホールド(共通流路へ繋がる又は共通流路から繋がるいくつかの流路から成
る領域）は、異なる分析ユニットから複数の分岐流路を通り適切な溶液出口に向かうプラ
グの動きを促進することに関係しえる。
マニホールドは、異なるレベルの深さで基板内に好ましくは製作される。したがって、
発明による装置は、各ユニットの分岐流路から溶液を集結し、溶液を出口へと導くマニホ
ールドに送ることができる複数の分析ユニットを備えうる。出口は、例として配管のセグ
メントまたはサンプル管（例：標準の1.5ml遠心分離管）接続の受け側として適合しうる
。またマイクロピペットを用いても集結操作が可能である。
（プラグ形成方法）
発明による様々な流路、基板および装置は、主としてプラグ形成・操作のために使われ
る。
好ましい実施形態において、プラグ流体が第1流路への導入時または導入前に著しい混
合作用をしめさない。プラグ流体が、入口または入口前で別個の層流を形成しうる。それ
らは追加流体により分離されうる。
あるいは、それらのプラグ流体は、異なるサイズの入口を経由して搬送流体に導入され
うる。
プラグ内のプラグ流体濃度は、プラグ流体の体積流量を調節することにより調節しうる
。さらに、第1流路と分岐流路[複数可]の直径が異なりうる。
図2Aは、流路の層流輸送とプラグ輸送を対比する概略図である。プラグ輸送を示す下図
において(赤と青で印される)水性試剤2種は、仕切り(ディバイダ) 水性流により分離する
ところの層流を形成する。プラグ形成後、プラグ流体が混合する時点で、流展する油と共
に3本の流れが流路に入る。一般的に、プラグ輸送中にプラグ流体の急速混合がプラグ内
に生じる。それと対照的に、上図に示されるように、層流輸送では流体混合の激しい分散
が徐々に生じる。上図において、dlがd=0からの距離を示し、Uが流速を示すとして、所定
の一点dlの時間tをt１≒d１ /Uから概算することができる。下図において、時間tlはtl
= dl/Uから得ることができる。
図2Bは、水プラグおよび油プラグ内混合(上部の略図と写真)、および水性プラグ流体の
みを備える層流内混合(下部の略図と写真)を示す写真と概要図を示す。油(ここの場合は
搬送流体)は基板の流路200番に導入される。油の代わりに層流による混合がなされる場合
、水が(油の200番に相当する)207番の流路に導入される。201番と202番と203番の吸込口
から（そして層流の場合は、204番、205番、206番の吸込口から）3本の水性プラグ流体が
搬送流体に導入する。
好ましいスキームとは、水性プラグ流体が、好ましくは短距離または最短距離で搬送流
体に接する前に、共流するといったものである。好ましい実施形態において、共流するプ
ラグ流体が横断する距離は流路幅とほぼまたは実質的に等しいとされる。
上図が示す中央または第2水性プラグ流体は、淡水、緩衝液、溶媒、もしくは異なるプ
ラグ流体でありうる。水性流体が搬送流体と接触する前に、中央の水性プラグ流体がまず
は他の2本の水性プラグ流体を好ましくは分離する。したがって、間に入る(中央の)水性
プラグ流体が搬送流体に接する前に、外部水性プラグ流体2本の反応または混合を防いだ
り、遅らせたり、最小限に抑えうる。非分岐流路に沿って継続すること、分裂後に流路内
へ進入すること、別流路からのプラグと融合すること、または出口を通り基板の外に出る
ことが、プラグ形成領域で形成されるプラグには可能である。油の非存在下では、著しい
混合が生じない又は単なる局部的な混合しか生じない状態において、水性プラグ流体が層
流へと流れる状況が図2に表されている。これと対照的に、プラグ内でプラグ流体は大部
分あるいは完全に混合する。
図3は、水性プラグ流体と油(搬送流体)から0.5μL/分(上部の概要図と写真)と1.0μL/
分(下部の概要図と写真)の流量で湾曲した流路内を流れるプラグ流れを示す写真と概要図
を示す。このスキームは、滑らかなかどまたは曲線状に湾曲した流路に沿って流れる細長
いプラグにおける試剤混合の増強を可能にする。3本の水性プラグ流体が個別の吸込口301
番〜306番に導入される間、搬送流体は基板上吸込口300番と307番に導入される。図2のよ
うに、好ましいスキームとは、プラグ流体が好ましくは短距離または最短距離で、搬送流
体に接する前に、まず共流するといったものである。好ましい実施形態において、共流す
るプラグ流体(例：水性プラグ流体)が横断する距離は流路幅とほぼまたは実質上等しいと
される。中央または第2水性プラグ流体は淡水、緩衝液、溶媒、またはプラグ流体を備え
うる。そして、水性プラグ流体が搬送流体（この場合、油）と接触する前に、中央の水性
プラグ流体が好ましくは最初に他の2本の水性プラグ流体を分離する。したがって、間に
入る(中央の)水性プラグ流体は、油（又は搬送流体）に接する前に、2本の外部水性プラ
グ流体の反応または混合を防いだり、遅らせたり、最小限に抑えうる。
図4は、油および複数プラグ流体の注入によるプラグ形成を図示する写真と概要図を示
す。図4は別個のプラグ流体5本を示すが、一本のプラグ流体が5本未満又は5本以上のプラ
グ流体を別々に基板へ導入することもある。プラグ流体を形成する試剤または溶媒が異な
るかもしれない、あるいは、それらのうちのいくつかは同一または類似するものかもしれ
ない。図2のように、水性プラグ流体が個別の吸込口401〜405番に導入される一方、油は
基板の吸込口400番に導入される。それから、水プラグは406番の出口を流れる。好ましい
スキームは、水性プラグ流体が、好ましくは短距離または最短距離で、油に接する前にま
ず共流するといったものである。好ましい実施形態において、共流するプラグ流体が横断
する距離は流路幅とほぼまたは実質上等しいとされる。1本以上の水性プラグ流体は、淡
水、緩衝液、溶媒、またはプラグ流体を備えるかもしれない。そして、水性プラグ流体が
油と接触する前に、少なくとも1本の水性プラグ流体が最初に少なくとも他の2本の水性流
を分離することが好ましい。したがって、水性流が油に接する前に、間に入る少なくとも
1本の水性プラグ流体が外部の水性流2つの反応または混合を防ぐかまたは遅らせるまたは
最小限に抑えるとする。図5は、図4と類似して、いくつかの試剤が複数の入口から導入す
ることができるマイクロフルイディック・ネットワークを示す。
さらに、図5は、試剤4種（A、B、CおよびD）がプラグにより混合されるところの屈曲部
を備える流路を示す。図5において示されるように、水性流が502番と504番と506番の吸込
口に導入される一方、試剤A、B、CおよびDは501番と503番と505番と507番の吸込口に導入
される。図5は、様々な混合段階におけるプラグを表している。様々な混合段階とは次の
ことを特徴とする。混合物50番は初期のA+B混合物に相当する。混合物51番は初期のC+D混
合物に相当する。混合物52番は混合工程後のA+B混合物に相当する。混合物53番は混合工
程後のC+D混合物に相当する。そして、混合物54番はA+B+C+D混合物に相当する。
等式
C.n. = Uμ/γ Eqn.(1)
から算出されるキャピラリー数C.nが低数値の時に、選択的プラグ形成が生じる。 等式
(1) において、Uは流速、μはプラグ流体または搬送流体の粘度、そしてγは水と界面活
性剤の界面における表面張力である。
異なる粘度または本質的に同一粘度の溶媒によって、プラグが形成されうる。好ましく
は、実験または反応において使われる条件とパラメーターは、キャピラリー数値結果が約
0.001≦C. n. ≦約10の範囲内におさまるものとする。好ましくは、粘度や速度などのパ
ラメーター設定値はプラグ形成が確実に行われるようなものとする。理論に関わらず、流
れが停止しない限りC. n.は≦約0.2となり、そしてプラグ流体・搬送流体界面の表面張力
が溶液と壁の接触面の表面張力より低い限り、プラグ形成が持続すると考えられている。
流れが停止した場合、C. n.は0である。
搬送流体にパーフルオロデカリンが使われプラグ流体が水性であるところの一実施形態
において、当システムをC.n.値約0.1 (300 mm s-1) まで操作しえることが発見された。
このシステムにおいて、C.n.値が約0.2以上に上昇した時点でプラグ形成が不規則になっ
た。パーフルオロデカリン粘度は5.10×10-3kg m-3 s-1で、プラグと搬送流体の界面にお
ける表面張力は13×10-3 N m-1であった。
プラグ流体と搬送流体の割合変化、またはプラグ流体と搬送流体流れの相関的体積流量
の変化などの技術により、そのサイズが、例として、流路断面寸法(dが流路の断面寸法で
あるところの「d」)の約1〜4倍となるように、プラグの長さを制御することができる。水
性流の流量が搬送流体より低い場合に短いプラグが形成される傾向がある。プラグ流体流
量が搬送流体より多い場合に長いプラグが形成される傾向がある。
ある近似値において、dが流路断面寸法であるところの2xd3とプラグ量が等しくなる。
したがって、例をとると、約16ピコリッター(pL)から16ナノリットル(nL)のプラグ量に相
当する20×20から200× 200μ22の横断面積を伴う流路において、プラグを形成すること
ができることになる。流路サイズは、約500μm(量に換算すると約250nLに相当)またはそ
れ以上に増大しうる。流路サイズは、例として、1μm(量に換算すると約１フェムトリッ
トルに相当)まで縮小しえる。大き目のプラグが、特にタンパク質結晶化のような特定の
アプリケーションにおいて有用である一方、小さ目のプラグは、超高速度での反応速度測
定のようなアプリケーションにおいて特に有用である。
好ましい一実施形態において、プラグは個々の容量を維持しながら、流路のサイズと形
状に順応（一致）する。したがって、プラグは、幅の広い流路からより狭い流路へ移動す
るにつれて、好ましくはより長くより薄くなり、その逆もまた同様である。
プラグ流体は、溶媒と、状況に応じて反応原系を備えうる。発明における手段に適した
溶媒は、プラグ流体で使われているようなものであり、有機溶媒、水性溶媒、油、あるい
はメタノールとエタノール、メタノールおよび水などを例とする同一または異なるタイプ
の溶媒混合物に関係する。発明による溶媒は、極性・無極性溶媒に依存する中極性のもの
を含む極性溶媒・無極性溶媒に関係する。好ましい実施形態において、超純水(例：カラ
ムクロマトグラフィーを例とする18MΩの固有抵抗)、10mMのトリスHC1および1mMの EDTA(
TE)緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水または緩衝酢酸溶液を、溶媒としてもよい。試剤と互
換性をもつその他の溶媒を使ってもよい。
発明における手段に適した反応原系は、合成した小型分子、生体分子(例：タンパク質
、DNA、RNA、炭水化物、糖分など)、金属と金属イオンなどに関係する。
プラグ内試剤濃度は変更可能である。発明によるある実施形態において、大半のプラグ
が単一分子以上または粒子以上のものを含まないように充分なレベルの薄さに試剤濃度を
調整しうる。これにより、プラグが2つ以上の分子または粒子を含む確立がわずかとなる
。他の実施形態において、プラグ流体の試剤濃度は、反応生成物量を最大限にするのに充
分な濃度に調節しうる。
油を含む搬送流体、好ましくはフッ素添加された油を含む搬送流体が適している。例と
して、パーフルオロデカリン（perfluorodecaline）またはパーフルオロペルヒドロフェ
ナントレン（perfluoroperhydrophenanthrene） のような粘性流体、パーフルオヘキサン
（perfluorohexane）のような非粘性流体、そしてその混合物(搬送流体とプラグ流体の粘
度調和に特に有用)などが挙げられる。
フルオリナーツ(Fluorinertz)液体TM(3M社, St. Paul, MN, USA) のような市販のフッ
素添加化合物を使用してもよい。
搬送流体やプラグ流体、またはその両方は、表面張力を低下させる物質(例：界面活性
剤)等の添加物を含みうる。プラグ流体内に界面活性剤を含むことが望ましくない場合、
プラグ流体と相対する搬送流体の中に存在する他の溶性物質もまたその手段となりうる。
界面活性剤は、プラグのサイズ、流れおよび均一性の制御および最適化を促進する手段と
なりうる。
例として、界面活性剤は、交差する流路へのプラグ押出成形または注入に要されるせん
断力を低下させる手段となりうる。界面活性剤は、プラグ容量や周期、または交差する流
路にプラグが離脱する割合または頻度に影響を及ぼすかもしれない。さらに、界面活性剤
は、流体によって流路壁の湿潤性を制御する手段となりうる。発明による一実施形態にお
いて、プラグ流体の少なくとも1つは、界面活性剤を少なくとも1つ備えている。
手段となりうる好ましい界面活性剤の例としてはこれらに限定されないが、搬送・プラ
グ流体と互換性をもつなどを特徴とする界面活性剤が挙げられる。
典型的な界面活性剤として、TweenTM、SpanTM、ZonylTM(デュポン社、Wilmington, DE,
USA)などのフッ素添加界面活性剤が挙げられる。例として、搬送流体がフッ素添加流体
で、プラグ流体が水溶液である場合、親水基をもつフッ素添加界面活性剤が好ましい。
しかしながら、界面活性剤の中には、そのアプリケーションによって、それほど望まし
くないものがありうる。例えば、水性プラグが、(生化学反応を含む)化学反応マイクロリ
アクターとして、または生体適合物質の分析かつまたは選別に使用される場合、SDSのよ
うな水溶性界面活性剤によりプラグ内容の特性が奪われるまたは不活性化することがあり
うる。
搬送流体がプラグよりも流路の壁を優先的に湿潤することが好ましい。この条件が満た
される場合、通常、プラグは流路の壁に接することなく搬送流体の薄い層により壁から離
されたままの状態となる。この条件下で、プラグの安定性が保たれ、その流路に残留物を
残さない。好ましくは、適切な界面活性剤の選択などにより表面張力を設定することで、
プラグ流体よりも優先的な搬送流体による流路壁の湿潤が達成される。好ましくは、プラ
グ流体−流路壁界面における表面張力(例：水−PDMS界面における表面張力約38 mN/m)は
、プラグ流体−搬送流体界面の表面張力(例：搬送流体パーフルオロデカリンに含まれる1
0%の1H,1H,2H,2Hパーフルオオクタノール〔perfluorooctanol〕などの界面活性剤を伴う
水−搬送流体界面における表面張力約13mN/m）よりも高い設定となる。この条件が満たさ
れない場合、プラグは、流路壁に吸着し、円滑な輸送が行われない傾向にあり(例：lH,lH
,2H, 2Hパーフルオオクタノールの非存在により、水−パーフルオロデカリン界面におけ
る表面張力が55mN/mで、水−PDMS界面の表面張力〔例：約38 mN/m〕より高数値）、その
結果、プラグはPDMS流路の壁に吸着する。
フッ素添加界面活性剤の導入時、流路(PDMS、フッ素添加無し)と搬送流体(フッ素添加
油)の壁が、化学上本質的に異なるため、壁−水界面上において、界面活性剤が油−水界
面の表面張力を選択的に低下させる。
これにより、流路壁に付着しないプラグの形成が可能になる。
懸滴方法として知られるものを手段として（他の方法を手段とする場合もあるが）界面
における表面張力を測定しうる。せん断によりプラグの破滅を避けるのに充分な表面張力
が好ましい。
プラグ流体と搬送流体は1つ以上の入口から導入されうる。特に流体は、プラグ流体ま
たは搬送流体のいずれかを含む空圧作動シリンジ貯水溝を通って基板に導入されるかもし
れない。プラグは相対応力の変更により搬送流体において生成されるかもしれない。プラ
グ流体がプラグ形成領域内の搬送流体と接触後に分離したプラグへと剪断変形する。
発明において、プラグ形成領域で、第1流路を通過する搬送流体の流れにプラグ流体を
導入することによりプラグが形成される。圧力差によるもの、または弁作用によるものな
ど、望ましい流れ制御のいかなる方法を用いても、流れの応力と方向を制御することがで
きる。これにより、1つ以上の望ましい分岐流路または出口にプラグを移動させることが
可能となる。
発明による好ましい実施形態において、物理的または化学的特性・標識・特質またはタ
グの検出または測定に基づき、ミクロレベルの流れにおいて1つ以上のプラグは力学的に
検出・分析・分類・または選別される。
第1流路の流れは、必ずしもではないが一般的に、連続的であり、停止・開始・反転・
速度変更等の動向を示しうる。選別に先立って、非プラグ流体は、(入口の水源または流
路等の)サンプル吸込口へと導入され、使用に向けて装置を水和・調整するためにプラグ
形成領域を通って(例:毛管作用によって)誘導される。同様に、 (例：「停滞」空気の）
基板を取り除き使用に向けて調整するために、緩衝液または油もまた、第1流路と直接伝
達するメイン吸込口に導入することができる。望ましくは、例として出口に緩衝液または
油を加えることによりその圧力を調節または均一化することもできる。
例として吸入口に送られる加圧シリンジを伴うメインおよびサンプル吸入口での圧力調
節により、プラグ形成領域圧もまた調整することができる。プラグ形成領域で油と水の流
量差を制御することにより、生成されたプラグのサイズと周期を調整しうる。あるいは、
プラグ形成領域に入る溶液の流れを制御することによりプラグサイズと周期を制御してい
るプラグ形成領域のサンプル吸入口、又はそこへ接続されているサンプル吸入口の、どち
らにもバルブを設置または適合しうる。
周期およびプラグ容量はまた、流路直径かつまたは流体粘度に依存するかもしれない。
（プラグ内混合）
図7(a)-(b)は、同値の総流速にて屈曲流路を通るプラグ内急速混合(a)と層流内のごく
わずかな混合作用(b)を図示するマイクロ写真(10p.s露光)を示す。水性流は、図7(a)-(b)
に示される吸入口700番〜705番に導入された。図7(c)と7(e)において、Fluo-4は吸入口70
6番と709番に導入され、緩衝液は吸入口707番と710番に導入され、CaCkは吸入口708番と7
11番に導入された。図7(c)は緩衝ナトリウム・モルホリノプロパンスルホン酸水溶液（aq
ueous sodium morpholinepropanesulfonate buffer） (20μM、pH 7.2)内のFluo-4溶液(5
4μM)とCaCl2溶液(70μM)から成るプラグ内部の急速混合により生じる時間平均された蛍
光性を示す偽色彩法マイクロ写真(2s露光、個々のプラグは見えない)を示す。この緩衝液
は中間水性流としても用いられた。図7(d)は、プラグを通り移動した距離の関数(左)と所
定流量でその距離を移動するのに要した時間の関数(右)に基づき、画像から得た相関的且
つ正規化補正後の蛍光強度（I）の線グラフを示す。全流路幅にわたる強度が測定された
。「PFD：水」の総体積流(μL min-1の流量)は、0.6 : 0.3、 1.0 : 0.6、12.3 : 3.7、1
0: 6、20: 6であった。図7(e)は、(c)で使用された溶液の層流における小規模な混合から
生じる弱い蛍光性の偽色彩法マイクロ写真(2s露光)を示す。全流路の深さは45μm。吸入
口流路の幅は50μmで、屈曲流路の幅は28μm：Re（レイノルズ数） -(約)5.3 (水)、 -(
約)2. 0 (PFD)。
図8は、各階段の屈折角度が90°の階段流路において約0.5μL/分(上部の概要図と写真)
と約1.0μl/分(下部の概要図と写真)の流量における急速混合を図示する写真と結線図を
示す。その一方、 図9は、各階段の屈折角度が135°の階段流路において約1.0μL/分(上
部の概要図と写真)と約0.5μL/分(下部の概要図と写真)の流量における急速混合を図示す
る結線図と写真を示す。
搬送流体が流路806番と807番(図9の流路906番と907番)に導入される一方、水性流は図8
の吸入口800番〜805番(図9の吸入口900番〜905番)に導入される。その時に形成されるプ
ラグは、出口808番と809番(図8)そして出口908番と909番(図9)を通る。図8と図9に見られ
るように、(他の流路にみられる急カーブと比べて比較的)なだらかなカーブを伴う流路で
はなく、多重階段を伴う流路に沿ってプラグが輸送されている。このような多重階段型流
路の利点は、プラグ内部の物質混合をさらに促進しうるということである。
混合を加速または改善する手段となりうるアプローチがいくつかある。これらのアプロ
ーチは、混合制御機能を備える幾何学様式により流路を設計する手段となりうる。流動プ
ラグ内部流れと対称する直線流路移動中のプラグ内部流れが相違するように、前者を摂動
させることにより、流れを制御することができる。
例として、流路の幾何学様式の変化(例：屈曲流路の適用)、プラグ流体の組成変化(例
：粘度変化）、搬送流体の組成変化(例：プラグ形成の粘度または表面張力が異なる搬送
流体層流のいくつかを適用する―この事例においては典型的に混合に対する影響が及ぼさ
れ、他の場合には増強作用が生じる）、さらに、流路壁のパターン変化(例：親水性・疎
水性あるいは差動荷電パッチ〔patches〕が流動中のプラグと相互作用し、その内部の混
合増強をもたらすべく時間周期的な流れを誘導すること)により、流れの摂動をもたらす
ことができる。
プラグ内の混合を増強するために、様々な流路設計を実装することができる。
図1Aは基本的な流路設計の略図を示し、図1Bは基本的な流路設計の一連の周期的変化を
示している。図1Cは、図1Aにおいて示される基本設計要素と、図1B(1)―(4)において示さ
れる一連の周期的変化に基づく代替要素のシーケンスにより生じる一連の非周期的組み合
わせを示す。これらの周期的変化による影響を可視化した場合、その非周期的組み合わせ
は周期的な流れから生じる対称性を、好ましくは無効にする手段となる(図1Cを参照)。こ
こにおいて、関連するパラメーターは、チャネル幅、流路幅、周期、曲率半径、および曲
り方向に基づく曲りのシーケンスである。基本設計のパラメーターを、c＝路幅、 l＝周
期、そしてr＝曲率半径のように定義する。
基本設計において、「左」と「右」が流路内のプラグ経路に沿う中心線と相関関係にある
ところの(左、右、左、右)としてシーケンスを定義することができる。
図1B(1)-4は、基本設計における一連の周期的変化の概要図を示す。図laのパラメータ
ー定義に基づいて、少なくとも1つの可変パラメーターを定義するのが好ましい。図1B(1)
において、チャネル幅はc/2である。図1B(2)において、周期は2lである。そして、図1B(3
)において、曲率半径は2rである。図1B(4)において、曲率半径はr/2、シーケンスは(左、
左、右、右)。
図1C(1)-(4)は、図1B(1)―(4)における周期的変化の一連要素と図1Aにおいて示される
基本設計要素を組み合わせることにより形成された、一連の非周期的組み合わせの概要図
を示す。図1C(1)において、図1Aで示される基本設計の周期(ここにおいて「a」と表記)と
、図1B(1)で示される代替の流路周期パターン(ここにおいて「bl」と表記)は、a +b 1 +
a+…から得られる。図1C(2)において、非周期的組み合わせは+b2+aから得られる。図1C(3
)に示される流路(ここにおいて「c3」と表記)において、非周期的組み合わせは+c3+aから
得られる。図1C(4)に示される流路(ここにおいて「c4」と表記)において、（右・左）シ
ーケンスが特異性を持つパターンで導入され、通常(左、右)シーケンスの反復が観察され
る。この特異性を加えることによって、 (左、右、左、右)+(右、左)+(左、右、左、右)
というシーケンスになる。
混合作用を加速する別のアプローチとしては、ベーカーによる変態の（補助）定理とし
て知られるものを応用し、マイクロフルイディック・チップ上の合理的設計を伴うカオス
的流れに依存するものがある。
ベーカーによる変態の(補助)定理による急速混合を達成するにあたり、流体の方向転換
は重大な要素となる。ベーカーによる変態の(補助)定理によると、アンフォールディング
(引き伸ばし）とフォールディング(折りたたみ）のシーケンスが、2つの構成要素の光条
厚さ(混合が拡散によって生じなければならない距離)の指数関数の減少をもたらす。あら
ゆるフォールディング‐アンフォールディング作用において、（異なる数値の場合もある
が）一般的に因数２の数により光条厚さを低下させる。理想的条件において、光条厚さ(S
T)は下の等式(2)で表すことが出来る。したがって、理想条件下において、シーケンスn数
のフォールディング‐アンフォールディング・方向転換作用で、
ST(tn)=ST(t0)× 2-n Eqn.(2)
により得られる指数関数の減少が光条厚にもたらされる。等式(2)において、ST(tn)はtn
時の光条厚さ、ST(t0)はt0時の初期光条厚さとして示され、nはフォールディング‐アン
フォールディング・方向転換作用の数を示す。
発明にのっとって、ベーカーによる変態の(補助)定理は、直線領域と急な曲りを伴うシ
ーケンスから成る流路を作り出すことにより好ましくは実装される。図11は、マイクロフ
ルイディック流路を流れるプラグのベーカーによる変態の(補助)定理を実装し可視化する
ことを目的とした流路の幾何学設計の概要図を示す。他の設計もまた手段となりうる。流
路屈曲角度およびその直線部長さは、表記されている流れ方式に対応する最適な混合作用
を生じさせることを前提に選択される。関連する特定の用途または反応に応じて、異なる
直線経路長さおよび異なる屈曲を適用することができる。
（ベーカーによる変態の補助定理の一周期に匹敵する）流路の直線部112番と急な屈曲
部111番のペアをそれぞれ流動するプラグには、一連の方向転換とアンフォールディング
およびフォールディング作用がもたらされる。流路直線部において、プラグ流れは通常の
再循環流となる。急な屈曲点では通常、プラグが波動し、その結果、方向転換をもたらす
。これは、急な内角の勾配圧力がはるかに高く、外部の壁に沿う移動経路がより広範のた
めに起こる現象である。ベーカーによる変態の(補助)定理に基づく当混合法は非常に効果
的であり、したがって、好ましい混合タイプの一例として挙げられる。特に、この種の混
合は、拡散による試剤混合に要される時間を速やかに削減することを可能にする。
流量限界が典型的に流路サイズに依存しないキャピラリー数（C.n.）によって設定され
るので、異なるサイズの流路でほぼ均一の流量にてプラグ形成を維持することができると
考えられている。定流量時の混合時間( t miX)は、流路サイズ(d)の縮小に伴って減少す
るかもしれない。第1に、大型・小型流路両方の試剤を混合するには、同ｎ数のフォール
ディング‐アンフォールディング‐方向転換サイクルが要されると推定される。当仮定(n
=5)は、前に測定したd=55マイクロメータ(μm)とd=20マイクロメータ(μm)の流路におけ
る混合の場合とほぼ一致する。各サイクルにおいて、プラグがプラグ長さの約２倍の距離
(約3d)以上移動する必要がある。それ故に、15dを移動する時間とほぼ等しい混合時間、
および流路サイズ（tmiX~ d）とともに直線的に減少することが推測される。25-μmの流
路において約1msで混合できる方法を手段とし、好ましくは1-μmの流路において約40μs
での混合が可能になる。
マイクロ秒単位の混合時間を達成するには、通常、小型流路を使う必要がある。
小型流路により流れを送るためには、通常、高圧が必要とされる。
理論に関わらず、理論モデリングは、直径dの流路で混合が生じるたのに必要とされる
おおよそのサイクル数（往復動数）は、
n×22n ≒ dU/D Eqn. (3)
から得られる。等式(3)において、nはサイクル数、Uは流速、Dは拡散定数を示し、一サイ
クルは6dに等しいと想定され、さらに、対流と拡散の時間尺度が一致するときに混合が生
じるとする。混合時間は、主としてサイクル数によって定められる。当結果は、混合が、
単に流路直径に正比例して加速されるのではないだろうことを示す。例として、dが因数1
0の数により減少するとき、混合時間はd×Log(d)=10×Log(10)の因数により減少する。設
計が適切になされている流路の場合、1μm流路の混合時間は約20μsに制限されるかもし
れない。しかしながら、(タンパク質結晶化等に関係する)低流量又は長い流路の場合でさ
えもなお、著しい混合が生じえる。さらに、理論に関わらず、因数10の数による流量Uの
増加は、因数Log (U)/U=(Log (10))/10の数による混合時間の減少につながると推測され
る。
発明による流路での混合作用を可視化するために、マーカ色素(a colored marker)を単
一のプラグ流体に用いることができる。プラグ内マーカ色素の初期分布は、細目にわたる
プラグ形成要素に強く依存することが認められている。移流する搬送流体への不動水性プ
ラグ押出成形時に、搬送流体とプラグ流体の相互作用に対する剪断変形が、渦を引き起こ
し、この渦によりマーカ色素が異なるプラグ領域に再分布された。この渦の形成をここで
「旋回（twirling）」と呼ぶ (図27bを参照)。旋回が本質的にあらゆるRe値と速度で認め
られたため、旋回はレイノルズ数(Re)が高値の場合にのみ生じる現象ではないといえる(
図30を参照)。しかしながら、この渦流れ方式は、速度によって多少影響されるようであ
る。
旋回の様々な特性と行動が認められた。旋回は、プラグの方側から反対側に(例：プラ
グの右側から左側に)輸送することによりマーカを再分布した。最小限の強度変動が認め
られた時点、つまり、マーカがプラグ一帯に平等に分布された時点で、最も効果的な混合
が認められた。研究対象となったあらゆる長さを伴うプラグの形成において旋回が認めら
れた反面、混合工程における旋回の重要度はプラグの長さに依存するということも認めら
れた。例として、長いプラグより短いプラグに伴う旋回の方がはるかに激しいということ
が認められた。
また、長いプラグの場合、旋回の影響はわずかな部分にのみ及び、プラグ内マーカ分布
への影響もわずかであることも認められた。それ以上に、形成中プラグ先端がマイクロチ
ャンネル壁の右側に接触する前の地点では、旋回がその先端でのみ生じた。
また、プラグにおける旋回量は、先端を通過した搬送流体量と関係あるということが認
められた。旋回およびその混合作用への影響に関する実験結果によると、直線流路を移動
するプラグ内混合発生に対する理想的条件を定める際に、旋回は(最も重要な要素である
と断言できないとしても)最も重要な要素の1つであるということが判明した。なぜなら、
旋回を引き起こすことによって混合を促進、旋回を防ぐことによって完全混合を抑えうる
からである。
混合の抑制は、(図5と図6において示されるもの例とする)いくつかの反応スキームにお
いて重要でありうる。試剤Bに試剤Aを混合する際、そしてまた試剤Dに試剤Cを混合する際
に、全４試剤すべてをいっぺんに混合せずに、選択的に各ペアを混合することが、これら
の反応スキームにより可能になる。後に、例としてプラグが流路屈曲部を移流する際に、
全４試剤すべての混合作用が生じる。当アプローチにより、いろいろな反応を異なったタ
イミングで生じさせることが可能になる。さらに、プラグ流体間の界面（例として、タン
パク質結晶化方法に要される界面〔図20〕）が生成されなければならない場合に、混合を
抑えることが重要となりうる。
形成中プラグ先端の渦により、混合の可視化と分析が複雑となるかもしれない。この渦
は、短いプラグの場合に通常大きな影響をもたらすが、長いプラグの場合はわずかな影響
しか及ぼさない。混合の可視化に関係するアプリケーション用基板には、細長いプラグが
形成されるようにプラグ形成領域に狭い流路を備える設計がなされている。プラグ形成領
域の直ぐ下流で、流路寸法が拡張するのが好ましい。流路[複数可]の拡張領域で、表面張
力によりプラグが拡張し、短い球形となる。これにより、プラグ内部のマーカ分布が維持
される。
当アプローチは、様々なサイズを伴うプラグの内部混合を比較的容易に可視化するため
の手段を提供する。ビデオ顕微鏡は水滴に含まれるマーカ色素分布の観察手段となりうる
。共焦点顕微鏡もまた標準的な蛍光マーカ三次元分布を可視化する手段となりうる。
aCa2+/Fluo-4-4反応により、可視化を補足または確認することができる。当反応は、ミ
リモル単位の濃度で約1μsの半減期を伴って生じると推測される。したがって、約10μs
またはそれ以上の時間尺度で生じる混合を測定する手段となりうる。
プラグ内流れに関する三次元可視化の少なくとも一方法が次の議論において説明されて
いる。三次元におけるカオス的輸送の可視化は、特に小規模の場合、非常に難しい作業で
ある。二次元システムを用いて予測を生み出すことにより、三次元のマイクロフルイディ
ック流路を移動するプラグに関する見識を得ることができるかもしれない。二次元システ
ムに関係する実験とシミュレーションは、二次元の液体プラグ内のカオス的流れを確実に
する流路の設計に役立てることができる。共焦点顕微鏡検査は流路の安定した継続的な三
次元の流れを数量化する手段として使われてきた。しかしながら、共焦点顕微鏡などの光
学機器には器械的制限があるため、高解像度での観察、例としてカオス的流れの自己相似
的次元分裂構造特性を高解像度で観察するために、流れを十分に可視化することができな
い可能性がある。それでもやはり、全面的な流れのダイナミクスを捕らえ、(島状に分布
した)非カオス的局所領域の非存在を確認しうる。好ましくは、可視化の過程で対象とな
る流路(周期的または非周期的)はPDMSのソフトリソグラフィを手段として製作される。PD
MSレプリカ（複製）は、共焦点顕微鏡を使って流れを観察するために、ガラス製の薄いカ
バースリップにより密封されるのが好ましい。
発明による一実験において、一連の回線走査により、プラグ内部の蛍光マーカ三次元分
布の画像を得ることができる。図10aは、プラグ内カオス的流れを三次元共焦点で可視化
したものを示す概要図である。プラグは3つの層流から形成されるのが好ましい。中間流1
1番は蛍光マーカを含んでいることが好ましい。
好ましくは、中間流11番は体積流量が低い状態で流路システムに注入される。マーカの
流れを流路における適切な部位に置くために、二面流10番・12番の体積流量を調節するの
が好ましい。
カール・ツァイスLSM 510のような共焦点顕微鏡を手段とするのが好ましい。LSM510は
、約0.38ms/512ピクセルまたは約0.2ms/100ピクセルの線における回線走査能力を備える
。拡散による干渉が最小限の状態における流れを可視化するために、好ましくは約0.2μm
の蛍光性微小球体および蛍光的に標識付けされた高分子量の重合体を手段とするのが好ま
しい。幅100μm、深さ100μmといった寸法の流路が手段となりうる。回線走査技術は、長
さ約800-μmの油流れにより分離している長さ200-μmのプラグを伴うものなど、様々なシ
ーケンスに応用されうる。
ビームをxとz方角に固定しy方向に沿って前後に繰り返し走査するのが好ましい。x方角
へのプラグの動きが、好ましくはx方向に沿う解像度を提供する。幅100μrnの流路を横切
る100ピクセルの回線走査はｙ方向に約1μm/ピクセルの解像度を提供する。約1μm/ピク
セルの解像度をもたらすために、回線走査を一プラグ当たり約200回実施することが好ま
しい。約2000μs/秒で移動する200μmのプラグの場合、(200μm)/(2000 μm/秒) = 0. 1
秒または線一本に当たり約0.5 msで実施されるのが好ましい。
* 図10bにおいて示されるシーケンスは、三次元のカオス的流れを可視化する手段とな
るのが好ましい。プラグが約500μmで移動できるように、走査間隔に約0.3msの遅延を伴
い、各回線走査に約0.2msかかるのが好ましい。プラグが約0.2μmでx方向に移る時に、あ
る程度の光学的歪が約0.2msの走査中に生じるかもしれない。しかしながら、これらの歪
みは適用手段の解像能力に相応すると認識されている。x方向の所定位置において、プラ
グ10本分のx-y断面をとるためにz方向に沿う各点において約10秒間、一連の回線走査を実
施することが好ましい。プラグ内の蛍光マーカ分布の全面的な三次元画像を得るために、
z方向走査を1μm間隔で行うことが好ましい。プラグが流路に沿って移動時のプラグ内蛍
光マーカ三次元分布の変化などの情報を取得するために、x方向にある異なる位置で当方
式を繰り返すことが好ましい。
周期的摂動の場合には、上記の方式により回復されたy-z面プラグの蛍光断面は、ポア
ンカレ断面を表わし、初めの薄い色素層の発展に対応する。小型プラグの形成に際する水
相旋回によりプラグ全体にわたり過度な色素が分布され、可視化の確実性を低下しかねな
い。プラグ形成領域に小さいネックを設計し、それから第一方向転換を下流方向において
開始することにより、このような旋回を防ぐことが好ましい。当アプローチは、流れの可
視化に効果的に実用されており、反応誘導管理に有用でありうる。
（プラグ融合）
本発明は、さらに基板内におけるプラグの融合方法を提供する(図12の上を参照)。プラ
グは前述で説明されたのように形成される。異なるプラグ流体を個別に流路へ導入するこ
とにより異なる試剤を含むプラグを形成することが可能である。異なる試剤を含む複数の
プラグは、本質的に類似する又は異なる粘度を有するかもしれない。異なる試剤を含む複
数のプラグは各々、本質的に類似する又は異なるサイズを有するかもしれない。異なる試
剤を含む複数のプラグの相対速度が異なるという条件の下に、これらのプラグが流路にお
いて融合する。様々な方法で融合地点を制御することが可能である。その方法例として、
プラグ流体入口の位置変化によるもの、(流体を形成するプラグの1つを第2流路へ導入す
る場合)流路合流地点の位置変化によるもの、プラグのサイズ変化によるもの、本質的に
同サイズのプラグの粘度または表面張力変化によるもの、異なるプラグ集合体の輸送速度
調節によるもの、などが挙げられる。
図12(上欄の写真)で示されるように、プラグ120番・121番がT字形の流路あるいはT字形
の流路領域を通過するように導くまたは通過することを可能にすることにより、プラグを
融合しうる。結果として融合したプラグ122番は、個別の流路またはそれに垂直(図12)ま
たは非垂直(図33)でありうる流路分岐を流れる。融合プラグ122番にさらなる融合あるい
は分裂が生じるかもしれず、もしくは、一種以上の特性化・測定・検出・選別(分類)・ま
たは分析など1つ以上の反応または「処理」が同プラグに帰されうるところの、基板上に
ある別の流路・流路分岐・範囲または領域へと同プラグを導きうる。
一実施形態において、大小のプラグが個別の流路またはそれらが融合する共通流路に向
かう流路分岐を流れる。大型(大きい)プラグが小型(小さい)プラグより速く流れるため、
大型プラグと小型プラグが同地点で同時に合流しない場合は、大型プラグが小型プラグに
追いつき互いに融合するという過程を経てから最終的に融合プラグが形成される。大型プ
ラグと小型プラグが同地点あるいは領域でまともに真っ向から合流した場合、それらが即
結合し融合プラグが形成される。融合プラグに分裂(下記に説明）あるいはさらなる融合
が生じるかもしれず、 もしくは、一種以上の特性化・測定・検出・選別(分類)・または
分析など1つ以上の反応または「処理」が同プラグに帰されうるところの、基板上にある
別の流路・流路分岐・範囲または領域へと同プラグを導きうる。
他の実施形態において、二つのプラグがほぼ同時に流路共通点・部位・又は領域に到達
し単一プラグを形成するように、その流路合流点・部位・又は領域に向かって流れるプラ
グの到達時間を制御することによりプラグ融合が可能になる。
他の実施形態において、弓形・半円形・又は円形流路は、プラグ融合の効率を向上する
手段を提供する。故に、例として、よりコンパクトな基板の範囲あるいは領域内において
より多くの頻度で融合が生じることになる。当スキームにおいて、弓形・半円形・又は円
形流路又は流路分岐が本来違相にあるプラグの対(ペア)を同位相に存在するプラグの対に
変換するため又はその変換補助するため、共通流路に向かい個別の流路を流れるプラグを
従来よりも短い距離あるいは短い時間で融合しうる。
特に、弓形・半円形・又は円形流路又は流路分岐により遅れプラグが先行プラグに追い
つき、融合することが可能になり、それによって、一定期間または基板上の一定範囲また
は領域において融合するプラグ数を増加させることになる。
（プラグの分裂かつまたは選別）
本発明はさらに、基板内プラグ分裂方法を提供する。第2流路がプラグ形成箇所下流にあ
る開口(経路)を通して、プラグの始部を第2流路へ送ることによりプラグを分裂すること
が可能である、あるいは、流路の「Y字型」交差点でプラグを分裂しうる。両実施形態に
おいて、元のプラグは始部と別の部分に分かれて分裂する。そしてその後、各片は個別の
流路(あるいは出口)へと送られる。一旦形成されたプラグが分割、あるいは、融合された
プラグが分裂しうるかのどちらかである。図6は、複数の入口(試剤A・B・C・D用入口601
番・603番・605番・607番；水性流用入口602番・604番・606番)によりプラグ分割および
融合の両機能を備えるマイクロフルイディック・ネットワークの一部を図示する概要図を
示す。この概要図は、同時に誘導される2反応を示す。(最初の2反応による混合の中間で
ある）第3反応は精密な時間的遅れを利用して誘導される。プラグは反応前と反応後のど
ちらでも分裂しうる。図6はさらに、初期混合物60(A+B)と初期混合物61(C+D)から、混合
溶液62(A+B)と63(C+D)およびこれら四成分の混合物64(A+B+C+D)にいたる、様々な混合過
程におけるプラグを示す。
図12(下部の写真)において示されるように、プラグ123番・124番をT字形流路またはT字
形の流路領域を通過するように誘導またはその通過を可能にすることにより、プラグを分
裂しうる。好ましい実施形態において、プラグが分裂する範囲または合流地点は、その合
流地点よりある程度離れたところに存在するプラグの直径に比例して細め又は多少収縮し
たものでありうる。結果として生じた分裂プラグ125番は、垂直(図12)または非垂直(図33
)でありうる個別の流路または流路分岐を流れる。分裂プラグ125番に融合あるいはさらな
る分裂が生じるかもしれず、もしくは、一種以上の特性化・測定・検出・選別(分類)・ま
たは分析など1つ以上の反応または「処理」が同プラグに帰されうるところの基板上にあ
る別の流路・流路分岐・範囲または領域へと同プラグを誘導しうる。
別の実施形態において、分岐する親水性・疎水性流路を利用することにより油搬送流体
から水プラグを分裂または選別することが可能である。流路または流路面が優勢的に親水
性または疎水性を有するように、流路または流路領域の前処理により流路を親水性または
疎水性にする。より詳細に渡り下記に論じられるように、ポリジメチルシロキサン (poly
dimethylsiloxane)における急速プロトタイピング(試作)のような方法を手段として、親
水性流路表面を備えた基板を製作しうる。流路表面をシラン処理または熱処理のいずれか
によって疎水性にすることが可能である。例として、(トリデカフルオロ〔tridecafluoro
〕-1,1,2,2-テトラハイドロオクチル〔tetrahydrooctyl〕)-1-トリクロロシラン・ガス〔
trichlorosilane vapor〕(United Chamical Technologies社)を、流路表面のシラン処理
用搬送ガスとして乾燥窒素を伴う基板の入口に適用しうる。
一旦プラグが個別の流路へ分裂したならば、さらなる反応原系を含むその他のプラグと
共に分裂プラグを融合することにより、さらなる反応作用を生じさせることが出来る。
誘電泳動のような方法または技術を用いて、流体の流れにおいてプラグおよびそこに含
まれる試剤/生成物の操作を遂行することが可能である。
正味荷電を持たず互いに関連して正または負の荷電をもつ領域を伴う誘電性物体の動き
が、誘電泳動によりもたらされると考えられている。プラグ且つまたは粒子の存在下にお
ける交流の不均等な電界は、プラグ且つまたは粒子を電気的に極性化し、結果として誘電
泳動力をもたらす。粒子と懸濁化剤の誘電性分極率に依存して、誘電性粒子は磁界の強さ
が強い領域または弱い領域のどちらかに向かって移動する。従来の半導体技術を使って、
マイクロ加工された装置中の力場を制御するために基板上に電極を製作することが可能で
ある。
誘電泳動は、電気的導体である物体を動かすのに特に適している。イオンのパーマネン
ト・アラインメントを防ぐために交流(AC)を用いることが好ましい。メガヘルツ頻度はネ
ット・アラインメント、引力および比較的長距離の運動をもたらすのに適している。
発明において、レーザーなどの集中光線でプラグおよびそこに含まれる試剤/生成物を
偏向および移動させるために放射圧を手段とすることが可能である。
温度差または圧力差をもたらすことにより、あるいは基板の1つ以上の流路間または発
明による方法に勾配を備えることにより、流れを形成・制御することが可能である。
プラグを含む流体と搬送流体の両方が、比較的低値のレイノルズ数（例として10−2）
を伴うことが好ましい。レイノルズ数は、流体濃度・速度および一定の断面範囲における
流路粘度間の反比例関係を表わす。より粘着性が高く、密度が低めで、流れの遅い流体の
レイノルズ数は低値を示すため、乱流を生じさせることなく転換・停止・開始・逆転がよ
り簡単にできる。製作された流体システムは、サイズが小さく、速度が低速のため、大抵
の場合レイノルズ数低領域(Re<<l)に属する。当形態において、(乱流と二次流れを引き起
こす)内部効果は数えるに足らないレベルであり、粘着効果によりそのダイナミクスが左
右される。これらの条件は分析を行う際に有利であり、発明による装置によって提供され
る。従って、レイノルズ数100未満、一般的に50未満、好ましくは10未満、さらに好まし
くは5未満、最も好ましくは1未満で、発明による装置を操作することが好ましい。
（検出と測定）
本発明のシステムは、標準顕微鏡のような機器を用いての光測定に非常に適している。例
として、PDMSは可視部において透明である。基板構築にPDMSを使う場合、PDMSネットワー
クを覆うか密閉するのにガラスまたは石英ガラスのカバースリップを手段としうる。それ
によって、可視光線、紫外線、または赤外線で特性化されうる一式の流路を構築しうる。
蛍光測定は吸収測定より高感度が強いので、好ましくは、後者の代わりに前者を実行する
。光学測定によりプラグを監視する場合、搬送流体およびプラグ流体の屈折率は、本質的
に類似していることが好ましいが、場合によっては異なりうる。
発明によるプラグを基盤とするシステムにより、典型的に簡易的な様式で相対濃度(又
は濃度変化)を測定することが可能である。
いくつかの事例において、絶対的濃度を例とするものの量的光学測定を実行する際にプ
ラグを手段とすることは、非水平状態の油と水の界面がプラグを囲んでいるために複雑な
作業となる。これらの湾曲した界面はレンズのように機能し、放射光線の減少または光学
的歪みをもたらしうる。このような歪みは、例として成長中のタンパク質結晶を目視観測
する際に悪影響を及ぼしたり、もしくはその妨げとなったりするかもしれない。かなりの
圧力勾配を流れるプラグの表面と裏面で当界面が適合されうる形状が複雑なために、これ
らの損失(減少)を正確にモデリングすることは通常困難である。
発明にのっとって、屈折率整合などの技術を使うことによりこの問題を克服するか最小
限に抑えることが可能である。減少と歪みは、水相の屈折率(ηD)と非混和性搬送流体の
屈折率の間の差に依存する。好ましくは、分析に用いられる搬送流体の屈折率が、水およ
び水成緩衝液の屈折率(表1)に本質的に類似していること（例：フッ素添加油が、589nmで
ナトリウムDライン付近の水の屈折率に近い屈折率を有するなど）。
好ましくは、検出または測定に関係するアプリケーション用搬送流体は、観察用波長に
おいて一般に使用される水溶液の屈折率と整合する屈折率をもつものであること。量的蛍
光測定用にシステムを口径測定(調整)するために、プラグに既知の蛍光色素濃度が含まれ
ていることが好ましい。プラグからの蛍光性が測定され、次に、油の非存在下における流
路内の同蛍光色素溶液から発する蛍光性と好ましくは比較される。屈折率整合が生じる場
合、プラグからの蛍光強度(Ｉ)は、水性流の画分調整後、水溶液からの蛍光強度に本質的
に類似しているかまたは等しいと考えられている。
Iplug = Isolution×Vwater/(Vwater+Voil) Eqn.(3)。
等式(3)において、Vは流体の流れの体積流量。界面の湾曲部を多く備える小型プラグは理
想的なプラグ反応よりも大きな偏差を示すと推測される、つまり、これらの小型プラグは
より大きな光学歪みを生じる傾向がある。
必要な場合、屈折率非整合に伴う誤差を断定するために部分的測定を行なう。未知の流
体を分析する場合、または二流体の屈折率整合および粘度整合間における妥協が要される
場合に、これらの測定データが役立つ。
表1： 特定のマイクロフルイディック装置実施形態において用いられた流体いくつか
の物理的性質。
検出器とは、流体が検出領域を通過する時に流体の物理的特性を評価するためのいかな
る装置または方法でありえる。適する検出器の例としてCCD検出器が挙げられる。好まし
い検出器は顕微鏡のような光学検出器である。これらは、既知の技術を用いて顕微鏡から
出力された画像または情報を処理するコンピュータ且つ又は他の画像処理装置または画像
補強装置につながれているかもしれない。例として、分子をサイズまたは分子量により分
析または選別することが可能である。生成された生成物濃度または所定時間に残存する反
応原系濃度の測定により、反応作用を監視することが可能である。酵素が酵素基板の化学
反応を触媒する範囲で、酵素を分析且つまたは選別することが可能である。(その反面、
酵素によって触媒された化学反応レベルに基づき酵素基板を分析〔例：選別〕することが
可能である)。タンパク質の存在または量に関する光学示度を得るために各細胞またはビ
リオン(ウイルス粒子)を光学検出器を用いて検査（検討）することにより、それらが特定
のタンパク質を含んでいるか生成するかどうかによって、生体微粒子または細胞およびビ
リオンのような分子を選別することが可能である。化学薬品そのものを、例として特殊蛍
光によって検知できるかもしれない。または、標識付けしたり、もしくは例として（少な
くとも限界量の)望まれるタンパク質の存在下で検知可能信号を出力するタグと関連した
りできるかもしれない。
希望特性を有する化学物質と有さない化学物質とを区別する目的で分析における重要特
性(または複数特性)を十分に識別・検知または測定することができるという条件の下に、
発明による技術を手段として化学物質のいかなる特性[複数可]をも識別または測定するこ
とが事実上可能である。例として、プラグ流体や反応生成物またはプラグを(例：選別に
よって)分析する基盤として、微粒子サイズや搬送流体に対する試剤の疎水性などを用い
ることが可能である。
好ましい実施形態において、装置内の検出ウィンドーまたは検出領域を通過時に、光学
検知可能な群または半群または化合物(ここにおいて「タグ」と呼ばれる)から送られる信
号の強度に基づいてプラグが分析される。選択限界または選択範囲内で一定タグ量または
タグレベルを有するプラグを基板上の所定の出口または分岐流路に誘導することが可能で
ある。タグ信号を顕微鏡により収集または光電子増倍管(PMT)のような検出器により測定
しうる。PMT信号をディジタル化し且つ弁作用に基づく方法などによって流れを制御する
ために、好ましくはコンピュータを用いる。あるいは、タグ且つ又はそれに相応する特性
または標識の基準として（例：プラグ選別などを必ずしも継続して行わず、評価目的のた
めだけに）信号を記録又は数量化することができる。
発明による一実施形態において、感光性半導体素子のような検出器の直径は流路幅より
も大きいため、(流路長さに伴って)長さが幅を上回る検出領域を形成する。このような検
出領域の容積は、半導体素子×半導体素子径の数値を上回り、流路横断面にほぼ等しいも
のとなる。化学物質またはタグを検知するため、あるいは化学物質またはタグが希望特性
を備えているかどうか判定するために、その希望特性により測定可能な光エネルギー放射
等の反応が生じるように化学物質を刺激する機器(例: レーザー、レーザー半導体素子、
水銀灯のような高輝度ランプ等の光源 )を検出領域は備えうる。ランプ使用の実施形態に
おいて、検出領域を除く全領域において流路を光線から保護することが好ましい。
レーザー使用の実施形態において、一式の検出領域一帯を走査するためにレーザーを設
置することが可能である。さらに、分析ユニットを含む基板と同じ基板にレーザー半導体
素子を製作しうる。あるいは、半導体素子からのレーザー光線が検出領域[複数可]上にあ
たるように、分析または選別用基板に隣接する第2基板(つまりレーザー半導体素子・チッ
プ)にレーザー半導体素子を組み入れてもよい。
好ましい実施形態において、集積半導体レーザー且つ又は集積感光性半導体素子検出器
が発明による装置内シリコンウェーハー上に備えられている。当設計は、そのコンパクト
なサイズおよび放射線発光用または放射用の光学経路が短目という利点を備え、それによ
り、例として、光学歪みを最小限に抑える。
各プラグが検出領域中に流れ込む時に、そのプラグ特性または特質を検査（調査）しう
る（例：一定の特性または特質が存在するかどうかを断定するために、プラグからの対応
信号またはプラグに含まれる化学物質を検知および測定しうる。その時、信号は、質的ま
たは量的な特性に相応しうる）。典型的に、信号量は臨在特性の度合いに相応する。例と
して、分子サイズ・反応中に形成された生成物量[複数可]・残留する反応原系量[複数可]
、細胞により発現された酵素の効能または量、ある分子が別の分子に結合または混成する
といったような陽性または陰性反応、または酵素によって触媒された基板の化学反応が、
信号の強度によって示されうる。
信号に応じて、データを収集すること、且つまたは、例としてある流路から別の流路にプ
ラグを誘導するために流れ制御をアクティブ(有効)にすることが可能である。
このように、例として、検出領域のプラグ内に存在する化学物質は、関連する検出領域
における検査によって生じた信号に応じて適切な分岐流路へと選別されうる。例として、
選別用に選ばれる特性または特質に関連した分子の特性またはタグの光学検出を手段とし
てもよい。しかしながら、他の検出技術(例えば電気化学または核磁気共鳴)も手段となり
うる。
発明にのっとる一実施形態において、流路の一部は分析ユニットまたは検出領域に相当
し、好ましくは流路の床またはベースに位置する感光性半導体素子のような検出器を備え
る。流路内感光性半導体素子の受取りフィールド（円形）が、検出領域により取り巻かれ
ていることが好ましい。
検出領域の容積は、感光性半導体素子の受取りフィールドと等しい直径および感光性半
導体素子上部の流路の深さと等しい高さを持つシリンダーの容積と同じまたは本質的に類
似していることが好ましい。
感光性半導体素子からの信号は、あらゆる電気通信のいかなる形式にも適合する一本以
上の回線(ワイヤー、基板においてエッチングされた伝導性ライン等を含む)を経由してプ
ロセッサに送信されうる。プロセッサにより好ましくはこれらの信号が数値データに変換
され、例として、化学物質を前もって定義された設定値のセットと比較することにより分
析する。一実施形態において、数値データとは、信号を発する化学物質の特定タイプまた
は特性を示す化学物質から放射された光学検知可能信号の量(例えば強度)に相当する。例
として化学物質の選別方法(例：弁作用)を決定するにあたり、識別領域の能動素子を制御
するために、プロセッサがこの情報(すなわち、数値データ)を好ましくは適用する。
１つ以上の検出領域が利用される場合、レーザー半導体素子基板中にある感光性半導体
素子などの検出器は、分析ユニット検出領域の間隔に比例した間隔で個々に離れているこ
とが好ましい。すなわち、より正確に検出を行うために、検出器が、検出領域の間隔と同
じ間隔で個々に配置されることが好ましい。
プロセッサは、少なくとも1つの分析ユニットを含む基板と同じ基板に集積しうる。も
しくは、感光性半導体素子などによって検出領域[複数可]且つ又は識別領域[複数可]と接
続する電子リード線経由で基板を含む分析ユニットに独立して接続するマイクロチップを
例とするように個別形態でもありうる。プロセッサとは、コンピュータまたはマイクロプ
ロセッサでありえ、コンピュータ・メモリ、ハードディスク（またはそれと同種のもの）
といったデータ記憶装置ユニット、且つ又はモニター、プリンター且つ又はプロッターな
どのデータ出力装置に、通常、接続される。
検出領域を通過する化学物質に関連又はそれに制限されるタグなどの検出に基づく化学
物質のタイプおよび量は算定または断定することができ、また、取得したデータは、デー
タ記憶装置ユニットに格納することができる。この情報はその後さらなる処理を経て、提
示用（例：サンプル内のタンパク質、蔗糖エステルまたは他の細胞表面特性のレベルなど
を表わすヒストグラム)としてデータ出力ユニットに送られうる。リアル・タイムでサン
プルが流路を流れるデータを提示することが可能である。
望ましくは、複数分析ユニット(つまり1つ以上の検出領域)および流体が伝達し識別領
域から分岐する複数分岐流路を基板は備えうる。
当然のことながら、検出領域追加により(例えば、検出領域を識別領域の直ぐ上流、且
つ又は分岐点の直ぐ下流にある分岐流路内部に備え付けることにより)、識別領域の試剤
の位置と経緯(到達点)を監視できる。検出領域追加により得られた情報をプロセッサで処
理することにより、流路試剤速度の推定値を継続的に改訂したり、分子・微粒子・および
選択特性を有する物質が望ましい分岐流路に流れ込むことを確認したりできる。
一実施形態において、流路を継続して通る流れを循環させ、CCDカメラで空間分解され
た画像を撮り、該当するプラグの横断距離を時間に変換することにより、プラグが検知さ
れる。
別の実施形態において、プラグは、質量分析計（MS：エレクトロスプレー質量分析計な
ど)につながる流路点を経由して出口を通過した後に検知される。当実施形態において、
プラグの流量および横断距離が分かっている場合に、時間分解された情報(例：質量領域)
を得ることができる。当実施形態は、標識の使用を避けたい場合に好ましい。
（プラグ内部の試剤濃度変化）
発明による様々な装置および方法は、プラグ組成と特性の制御および操作を可能にする。
例として、プラグ内部の試剤濃度の変形形態を可能にする。発明による一様態において、
プラグ内の試剤濃度は、プラグ流体の相対流量を変えることにより変化される。これは従
来のシステムにおいて可能であるが、混合速度が遅くおよび分散の問題によって作業が複
雑になる。発明による方法は、単一設定(Setup)で濃度を変更することができるため、多
数の実験的条件(「スクリーニング」)を同時にテストするのに都合がよい。したがって、
例として、シリンジを取り外したり再度接続したりする必要がなく、また、上記の技術を
用いてプラグ中の試剤濃度を変化するために発明によるシステムの入口を補充する必要も
ない。
プラグ内部の水溶液濃度は、プラグ流体の流量変更により変化することができる(図25
を参照、例11で詳細にわたり説明されている)。図25において、パーフルオロデカリンは
流路259番〜261番を流れ、その一方、水は様々な流量で入口251番〜258番へと導入される
。
水性層流において、マイクロフルイディック流路を流れる層流の流量比率は、約1000:1
から1:1000、好ましくは100:1から1:100、さらに好ましくは1:20から20:1に変化しうる。
実際の相対濃度を、既知濃度のフルオレスセイン溶液を用いて数量化しうる。当事例に
おいて、フルオレスセイン流の強度を励起ランプの強度変動を確認する基準点として利用
することができる。
様々なタイプのアプリケーション・測定・または実験の手段として変更（修飾）されう
るまたは組込まれうる方法[複数可]の事例が次に述べられている。本発明が提供する、他
の技術に優れた利点の例証に関しては、次の事例を検討のこと。異なる工程における異な
る濃度の試剤が及ぼす影響を調べるために、試剤AとBとCのように2種類以上から成る試剤
をスクリーニングするものとする。また、ここで重要となるのは、様々な酵素および基板
濃度における、酵素の基板に対する反応が防止剤により阻止されうるという条件である。
Aが酵素、Bが基板、Cが防止剤である場合、A/水/B/水/Cのように5つの入口を備えた基板
を手段とすること、そしてAとBとCが基板に送り込まれる流量を変化することが可能であ
る。全プラグ流体の総流量を一定に保つことにより、好ましくはプラグサイズが一定に保
たれる。AとBとCの導入量が異なるため、AとBとCの濃度も変動する。スクリーニング対象
の酵素反応またはその他の反応の検知または監視が可能な限り、出発溶液の濃度を変更す
ることなく、濃度組み合わせのすべてを敏速にスクリーニングすることができる。溶液の
流れおよび線形輸送により、相互作用または反応の存在・非存在を断定できるだけでなく
、反応発生率を測定することが可能である。したがって、質および量的データを得ること
ができる。発明にのっとって、(全でないにしても)ほとんどの試剤がプラグ内部に含まれ
ているため残留物がほとんど又は全く残らない。故に、典型的に基板を作動中に洗浄する
必要はない。
濃度変化可能範囲を拡張するために、例として試剤A・B・C・D・Eの組み合わせを用い
てミクロモル溶液A、mM溶液B、およびM溶液C、などを調合しうる。当技術は、例えとして
106という数を超える因子(要素)に携わる流量制御よりも簡単でありう。また、プラグ内
部の試剤比率変更には、融合作用を複雑化する原因となるプラグサイズの変更が要される
ため、その他の既知方法を手段とすることは特にこの例において更に困難となるであろう
。
別例において、Mg2+およびH+の濃度が異なる場合、溶液中のRNAフォールディング(折り
たたみ）作用を観察しうる。従来、当作業は静止流体式の技術を使って行われてきたが、
時間がかかりRNAを比較的大量に要するという問題があった。発明による方法を用いると
、通常のml/shot単位の流れの代わりにμL/分単位の流れのみが必要とされ、且つ比較的
短い時間（例:約15分間）内に全位相空間を処理することが可能である。
小型分子によるタンパク質間相互作用媒介に関する研究や、小型分子によるタンパク質
/RNA/DNA相互作用媒介に関する研究や、タンパク質およびいくつかの小型分子に関係する
結合現象に関する研究等を例とするこれら特定の事例は、本発明の有用性を強調する。異
なる濃度を伴う数成分に関係するその他の相互作用も、発明による方法を手段として研究
されうる。
（一連のプラグ中における勾配生成）
発明による一様態において、圧力駆動による流れの分散はプラグ流体の連続的な流れに勾
配を生成する手段となる。プラグを形成することによって、勾配が「固定」される（つま
り、勾配形成の原因である分散がプラグによって止められる）。流れが水性でなければな
らないとは限らないが、水性流は様々な用途を備えている。例として、これらに限定され
ないが、その使用例を下記する。
図44は、流動中の水流に個別の試剤B水性サンプルを注入した際、初期勾配がどのよう
に発生しうるかを図示したものである。図44aにおいて、水+B混合物は流路441番を流れた
。流路443番および445番は非流動性の水+B混合物を大幅に含んでいる。油流が流路449〜4
52番によって流れ、その一方、水流は入口440番、442番、444番、および446〜448番へと
導入された。
図44dは、試剤A・B・Cが入口453番・454番・455番から導入される複数吸込システムを
示す。圧力駆動の流れにより流路伝いの試剤分散が可能となり、それにより、流路伝いに
Bの勾配をもたらす。流路範囲、流量、注入量、または複数注入時のサンプルまたは試剤
の追加頻度を適切に調整または制御することによって勾配を制御することができる。その
後、この勾配はプラグ形成によって「固定」される。これら流路のいくつかが、単一プラ
グ形成領域または接合部分へと組み合わせられることが好ましい。さらに、数成分を伴う
複雑な勾配は流れを制御することにより生成しうる。
当技術は様々なタイプの分析および合成の手段となりうる。例として、当技術はタンパ
ク質またはライソゾーム(lysozome)結晶化のためにプラグを生成する手段とすることがで
きる。図42は、流量変化による勾配形成に関係する実験を示す(実験の詳細は例17に記さ
れる)。図43は、勾配によるリゾチーム結晶形成を図示する(実験の詳細は例18に記される
)。
（不安定中間体の形成と隔離）
本発明による装置と方法はまた、不安定中間体の合成および分離の手段となりうる。発明
による装置を手段として形成された不安定中間体は、さらなる反応且つ又は分析に適した
作りを伴っていること、又は、さらなる反応且つ又は分析に適しうるところの他の装置部
に導かれることが好ましい。一様態において、不安定中間体形成のために相互反応をもた
らす少なくとも2つの異なるプラグ流体を使用する。基板の動力伝達路沿いに不安定中間
体が形成されるときに、例として反応速度に関する情報を得ることができる。このような
不安定中間体は、不安定中間体を含むプラグを別のプラグ流体と融合することにより、別
の試剤とさらなる反応を示しうる。不安定中間体の例としてはこれらに限定されないが、
遊離基、有機イオン、リビングイオン重合鎖、リビング有機金属の重合体鎖、リビング遊
離基重合鎖、局部てにフォールドされたタンパク質または他の高分子、引き伸ばされた(S
trained)分子、結晶化核、合成ナノ粒子核などが挙げられる。
不安定中間体の形成に関係する発明による装置の一アプリケーションとして高性能な生
体分子構造の特性化が挙げられる。時間分解されたモードおよび時間分解されていないモ
ードの両方で用いることができる。不安定(且つ又は反応的)中間体(例として水酸基〔OH
〕)を、一本のマイクロフルイディック流(例として、金属イオンの過酸化物との既知反応
により）生成することができる。生体分子との反応を引き起こすために、生体分子を含む
別の流れにこれらの反応核種を注入することができる。生体分子上の反応発生位置は、そ
の位置にどれだけアクセス出来るかどうかに関係する。
これは、生体分子内部で溶剤に露出または覆われた位置を識別する、または最初の生体
分子に結合する第二の生体分子によって保護される位置を識別する手段とすることができ
る。当方法は、一連の生物学的問題における機構（構造）を理解する際に適用しうる。
例としてはこれらに限定されないが、タンパク質フォールディング、タンパク質間相互
作用(タンパク質フットプリント)、タンパク質RNA相互作用、タンパク質DNA相互作用、お
よび(小型分子または別の生体分子のような)配位子[複数可]の存在下でのタンパク質間合
成物形成が挙げられる。このようなシステムを質量分析計と接続することにより、強力な
分析法の手段が提供されうる。
複合化学物質システムに関係する実験もまた、発明にのっとって行なうことができる。
例として、不安定中間体を、局部フォールディングしたタンパク質またはRNAなどの個々
のプラグにおいて多少調合することができる。その次に、例として、プラグが融合時に不
安定中間体の反応性を研究することができる。
（表面化学の動的制御）
マイクロフルイディック装置において、システムの寸法が縮小するとともに表面積対体
積率が増加するため、表面化学の制御は特に重要である。特に、タンパク質と細胞の吸着
に概して不活性な表面は、マイクロフルイディックにおいて非常に貴重な存在となる。ポ
リエチレングリコール(PEG)およびオリゴエチレングリコール(OEG)は表面上タンパク質の
非特異性吸着を減少すると認められている。金上のOEGを末端にもつアルカンチオール自
己組織化単層膜は、モデル基板として使われており、タンパク質吸着抵抗を実証および綿
密に特性化する手段として利用されてきた。溶液が露出される表面化学は、シリコーン表
面上の自己組織化単層膜、またはPDMS上のグラフトPEG含有重合体およびマイクロフルイ
ディック装置製作に用いられる他の物質を生成することにより制御することができる。し
かしながら、このような表面は大量生産するのが困難かもしれず、また、製作後（例:貯
蔵または使用中）に不安定になりうる。
発明による一様態において、水性プラグ内部の試剤は、装置‐プラグ流体界面ではなく
むしろ搬送流体‐プラグ流体界面に露出される。ペルフルオロカーボンは場合によって炭
化水素またはシリコーンより生物学的適合性が高いため、表面研究においてペルフルオロ
カーボンを搬送流体として用いることが好ましい。
このことは、手術中に乳化ペルフルオロカーボンを人体に代用血液として使用した実例
により例証される。試剤が露出される表面化学の制御および変更（修正）を、単にフッ化
PFD位相に適切な界面活性剤を導入することにより達成しうる。
さらに、界面活性剤の使用は、例として物質または微粒子の流路壁などへの不必要な吸
着に関係する問題において利点を及ぼしえる。
一定の状況または条件下で、流路の壁に付着する微粒子が生成される基板の1つ以上の
流路または領域において反応が生じうる。それらが一定の数に達した時点で、吸着性微粒
子は流路の詰まりまたは圧縮につながるか貢献するかもしれない。適切な界面活性剤を一
種以上使用するといった、発明による方法により、物質または微粒子が流路壁へと不必要
に付着または吸着することが防がれるか最小限となる、それによって、例として流路の詰
まりあるいは圧縮が生じなくなるか最小限となる。
被包性微粒子の場合、微粒子を含むプラグ外部の試剤と微粒子の直接的接触が防がれる
ため、1本以上の基板流路中の所要反応に対する被包性微粒子による妨害を(被包性でない
ものと比べて)より効果的に防ぎうる。
OEG基を末端にもつフッ素界面活性剤は、代用血液およびその他バイオ医学アプリケー
ションにおける生物学的適合性を実証すると示してきた。
好ましくは、オリゴエチレン基を末端にもつ油溶性は、一定のアプリケーションにおけ
るマイクロフルイディック装置内の界面を生成する手段とされる。
明確に定義された組成を伴う界面活性剤は合成されうる。このような合成は、上記のよ
うな界面活性剤の存在下で、好ましくは水性プラグ形成特性化の後に続く。非特異性タン
パク吸着に対する不活性物質も特徴づけられる。図24は、タンパク質吸着に対する抵抗性
、正の荷電、又は負の荷電を持つなどの条件を備える単層を形成するフッ化界面活性剤の
例を示す。OEGを末端に持つ界面活性剤の場合、油溶性に変換され水相への進入を防ぐた
めにも、これらの界面活性剤のn数は高数値n(≧16)であることが好ましい。図24において
、チオールに付着する約3〜6のEGユニットからなる化合物は、金上にあるチノール単層へ
のタンパク質吸着を防止するのに十分であり、したがって、不活性物質に好適である。さ
らにまた、過フッ化炭化水素代用血液における生物学的適合性をもつと証明されている界
面活性剤を、フッ化搬送流体への添加剤として使用してもよい。
（アプリケーション：反応速度測定と評価分析）
発明による装置および方法はまた、典型的にわずかな試剤を様々な濃度で混合して監視ま
たは分析するマイクロタイター・プレートなどにおいて行われる実験の手段となりえる。
これは、例として、必要な場合は流れを止め、可変組成を伴うプラグを形成した後にプラ
グを監視することにより実施されうる。評価分析（Assays）を位置的に暗号化(コード化)
しうる。すなわち、プラグ組成は流路内プラグ位置から推定されうるということである。
発明による装置および方法は、高性能なスクリーニングの使用することもでき、その評価
分析法は例として診断および新薬発見に有用である。特に、発明による装置および方法は
、比較的高速の反応速度測定を行なう手段とすることができる。
高速測定能力は、動態生理学の分野を革新した。タンパク質Cフォールディングおよび
シトクロムCフォールディング研究がその例として挙げられる。乱流に依存して溶液の急
速混合を実施する高速反応機器を手段としてこれらの測定が行なわれる。乱流を確立する
ためには、大型流路および大量な流量が必要とされ、故に、大量なサンプルを要する。高
速反応機構の研究用市販機器は、1ミリ秒単位でアクセス可能。改善されたキャピラリー
ガラス球ミキサー(capillary glass-ball mixer)オンチップバージョン(チップ上タイプ)
は、約0.35mL/秒を超える流量を伴う約45μsの不感時間を生じる。これらの既存方式は、
乱流を生成するのに大量な流量が要されるために概してその小型化が制限される。しかし
、発明による装置および方式により可能となった小型化技術は、例として、遺伝子操作お
よび細胞組織隔離をはじめとする(マイクログラム単位といった)わずかな量でのみ利用可
能であることに加え非常に広範囲に及ぶ生体分子の量的特性化を可能にするという利点を
持つ。さらに、いままでにないこれらの技術および機器は、広範囲に及ぶ測定可能時間尺
度を提供する。
時間的管理は様々な化学物質および生化学の工程において重要である。
典型的には、静止流体式タイプの機器は反応速度を測定する手段となる。
これらのタイプの機器は、典型的には乱流に依存して試剤を混合し、分散を最小限に抑
えつつそれらを輸送する。乱流が比較的直径大および流量多のチューブに生じるので、静
止流体式機器は大量(ml/s単位の量)の試剤を消費する傾向がある。少量 (μL/分の量) の
試剤を消費する静止流体式機器のマイクロフルイディック機器は、診断法など様々なアプ
リケーションにおいて有用である。
これまでのところ、EOFによる流れは(分散がより少ないという利点を持つが)通常速度
が遅すぎ、圧力駆動による流れは分散に悩まされる傾向があるという点で、マイクロフル
イディック装置は静止流体式機器に対抗できないでいた。その上に、混合工程とは通常ど
ちらのシステムであろうと非常に時間のかかる工程である。
静止流体式の機器は典型的にはミリ秒以下の混合速度を有し、このような高速混合が要
される実験に役立つことがある。同様に、発明の装置および方式はミリ秒以下での測定を
可能にする。本発明は、約1ミリ秒(ms)または約10ミリ秒以上そして0.5秒内の時間尺度に
て生じる反応において、あるいは測定に要される溶質量が最重要条件である時に、特に有
利となりえる。
さらに、プラグが2種の無効分を伴って生成される場合、そのプラグは流路を下降して
輸送されるに際にマイクロリアクタとして機能しうる。その次に、光学的性質といったプ
ラグ特性を、流路または基板の一点または領域からの距離関数で測定または監視すること
ができる。プラグが一定流量で輸送される場合、反応時間はその輸送距離に基づいて断定
することができる。
プラグ容量を流路端から質量分析計(例：エレクトロスプレー質量分析計)に注入するこ
とにより、プラグが流路から出る際のプラグ組成を綿密に調べうる。流路端との伝達時間
は流量変更により異なる。例として複数の距離および時点で質量分析計を用いてプラグ容
量を調べるために、複数の出口を流路沿いに設計しうる。
発明による装置および方法の利点はプラグが連続的に形成される場合、本質的に低速な
観察方式を手段とすることができるということである。例として、約10cm/秒の流量で原
点から約1mmの距離を流動するプラグは約10ms歳(約10ms経たもの)である。この場合、本
発明は、例として、実質的に時間制限無く10ms歳のプラグを繰り返し測定するのに、比較
的低速な(時間的余裕のある）検出方式の使用を可能にするという点で特に有利である。
対照的に、静止流体実験において反応を一度(約9〜11ミリ秒以内)に観測するデータ収集
時間は一回につき約2ミリ秒のみである。なおまた、本発明は、異なる原点からの距離で
流路を観測するだけで、複合反応に関係する情報を数回同時に取得することを可能にする
。
反応時間を流路上の様々な地点で監視することができる（各地点は異なる反応または混
合時間伴う）。一定の流体流量uを前提として、流路に沿う様々な時点tl、t2、t3・・・t
nに基づき、各反応時間を断定しうる。したがって、地点nとn-1各組の間の距離(時間tnと
tn-1に相当)が、任意のn値と同値の場合、流路上n点に相応する反応時間はtn=nl/uから算
定されうる。したがって、あらゆる任意の時間tnにおいて、理にかなうように繰り返し反
応を監視することが可能となる。原則的に、本発明の基板は、一定流量で監視されるべき
流路の長さを延長するだけで、または流路の一定距離上の流量を減少させるだけで、より
長時間にわたる反応の監視が可能になる(例として図22を参照)。図22において、次のもの
を下記の入口へ導入することができる。すなわち、酵素を入口2201、2205、2210、2215番
へ、緩衝液を入口2202、2206、2211、2216番へ、基板を入口2203、2207、2212、2217番へ
、緩衝液を入口2204、2208、2213、2218番へ、抑制剤を入口2228、2209、2214、2219番へ
と導入することができる。図22において、搬送流体は2220、2221、2222、2223の流路部を
左から右に流れる。点線の正方形2224、2225、2226、2227によって囲まれた流路部は、流
路に沿う様々な地点の反応を監視するための視野を表わす。
同原理は、流路沿いの共通原点から地点nに伝達する距離が2の乗数または倍数で別の流
路に伝達する距離と異なるところにおいて、本発明の代替実施形態に適応する。このこと
は以下の議論により、さらに明確化されうる。
一定の流体流量uを前提として、流路に沿う様々な時点tl、t2、t3・・・tnに基づき、
各反応時間を断定しうる。 したがって、地点nとn-1各組の間の距離(時間tnとtn-1に相当
)が、任意のn値と同値の場合、流路上n点に対応する反応時間はtn=nl/uから算定されうる
。図22(c)に示されるような比較的複雑な流路幾何学様式において、それに相応する方程
式は、様々な地点nにおける反応時間は2の乗数または倍数で変動することを示すtn=2(n-1
)1/uであらわされる。
一面において、発明による流路は、異なる反応時点に対応する異なる領域を視野に置く
手段となる。
発明による流路は、完全な反応プロフィールの測定や、一連の直線状に分割された時点
の測定や(初期の酵素学的反応速度の測定に要されるものなど)、一連の指数関数的に分割
された時点の測定(例：一次反応速度測定または他の指数分析)をはじめとする様々な測定
を可能にする。画像フレームにおける時間尺度は、例として総流量および全流路長さの変
更に伴い、マイクロ秒単位から秒単位へと変化しえる。
図22A-Dは、単一視像から動的情報を得るための発明によるマイクロフルイディック流
路の様々な幾何学様式例を示す。図示されている流路システムは、抑制剤の存在下での酵
素反応動力学測定などの研究に適する。図22Dにおいて示される装置は、開閉可能な複数
の出口を備える。図22Dにおいて示される装置において、一度に一つだけの出口が開いて
いることが好ましい。最高速度での流量において、長さlの短い流体経路を通る流れの圧
を低減するために上端の出口が開いていることが好ましい。流量が低下するにしたがって
、同総圧で測定できるように、その他の出口も開き、より長い経路とより広範囲なダイナ
ミック・レンジを供給することが好ましい。
図22において、nは反応混合物が時間tnで移動した一定の流路長さlのセグメント数であ
る(反応時間および流路長さに関連する説明については73ページ第2段落全般を参照のこと
)。これらのシステムは、流量変化による試剤比率の制御を可能にする。当システムは、
さらに酵素阻害を迅速に定量化することを可能にする。
例えば、バナジウム(vanadium)イオンやオキソバナジウム(oxovanadium)イオン・ヌク
レオシド錯体、および5'-ジホスホアデノシン(diphosphoadenosine)3'-リン酸エステルお
よび5'-ジホスホアデノシン2'-リン酸エステルを例とする他の小型分子などの、既知の抑
制剤と併用してリボヌクレアーゼAを使用することができる。データ収集および実験にお
けるLineweaver-BurkプロットまたはEadie-HofsteeプロットまたはHanes-Wolfeプロット
の作成により、反応速度を特性化しうる。数マイクロリットルだけのタンパク質と抑制剤
溶液で実験を実施しうる。当性能は、マイクログラム量レベルといった微量でのみ利用可
能な新タンパク質および抑制剤を特性化するのに特に役立つ。。
発明にのっとって、光学顕微鏡などから得られた単一画像を分析することにより、蛍光
性信号による反応速度測定を行なうことができる。(約2秒の)長期露光が(約2ミリ秒の)高
速反応速度測定に使用されてきた。
これは、流れが連続的なシステムにおいて、距離を流量で割った値に時間が等しいため
に可能であった。発明にのっとる流れが連続的な形態(状態）において、アクセス可能時
間の尺度は約400秒まで延長しえる。この時間は、流れが大幅に減速した場合または停止
した場合、数日または数週間まで延長しえる。典型的にこの時間尺度は、(通常シリンジ
ポンプの安定性によって制限されるが、圧力ポンプの使用により改善されうる)約1mm/sの
低流量を伴う流路長さ(例：直径3インチのチップ上で約1メートル以下)に依存する。最高
速度における時間尺度は、通常混合時間に制限されるものだが、本発明においては約20ま
で減少しうる。混合時間は通常２つの主な要因により制限される。その要因とは、(1) 混
合距離(例：流路幅のおよそ10-15倍)、そして(2)流量(例：およそ400mm/s、流れを送るの
に要されるキャピラリー数および圧力降下に依存する)、である。混合距離は、通常、流
量にほとんど影響されない。適切なマイクロフルイディック流路設計あるいはマイクロフ
ルイディック流路網設計によって、広範囲にわたる速度実験を行なうことができる。
流路サイズの縮小は通常混合時間の短縮につながる。しかし、それはまた、流れを送る
のに必要な圧力の増加にもつながる。下記の方程式は、長方形毛管を流れる単相の圧力降
下ΔP(Pa単位)を表わす。
ΔP=28.42 U μl/a b Eqn.(9)
等式(9)において、U(m/s)は流速(キログラム/メーター-秒)、kg m-1s-1)は流体の粘度、l
(m)は毛管長さ、a(m)は毛管高さ、そしてb(m)は毛管幅を指す。通常、マイクロフルイデ
ィック装置がどれだけの圧力に耐えられるかには物理的限界がある(例: PDMSは約3気圧、
ガラスおよびSiは約5気圧)。当限界は小規模な流路において非常に重要であり、流路の全
長に限界を及ぼし、したがって測定の(最大圧力÷混合距離の流量が維持されうる)ダイナ
ミック・レンジを制限することになる。
図23は、15μmと2μmの流路高さを伴う発明によるマイクロフルイディック・ネットワ
ークを描く。図23に示される流路設計は、流路断面の変更により約100個のダイナミック
・レンジに達する方法を図示する。これらの条件下で、巻線流路の混合時間は概算約25μ
s、蛇行流路の観察時間は概算約3msである。
図23が示すように、急速混合が2μm × 1μm(高さ×幅)の流路で生じ、2μm×3μm の
流路で測定される。図23の表は、流路断面寸法の関数に基づく圧力降下と流速と流動時間
の分布を示す。プラグが安定性を維持し減速しながら20-μm幅の流路から50-μm幅の流路
に移動する場合、lμm幅の流路から3μm幅の流路への遷移が円滑に行われるものとする。
流路幅を変更することは容易であり、容易にマスク設計に組入れることができる。例とし
てケイ素ウェーハー上で順次スピンする2種の異なる高さを有するフォトレジスト層など
を手段として、流路の高さを変更できる。その後、二段階露光方式が望ましい断面寸法を
伴うマイクロフルイディック・ネットワークを確保する手段となりうる。
本発明による装置および方式の別の実施例においては、枯草菌リボザイムのRNase P触
媒反応領域(P RNA C-領域)のフォールディングを発明による流路を使って調査することが
できる。RNAフォールディングは、既存技術の限界により、概して未解決のままになって
いる重要問題である。RNA機能別組織構造の進化機構の設計・修正・および解明において
、三次構造におけるRNAフォールディングの律速段階を理解することが重要となる。
P RNA C-領域のフォールディングは、アンフォールド状態(U)と中間体状態(I)と原型(N
、フォールド状態)といった３種の関連形式に関係すると認識される。本来の二次構造お
よびいくつかの三次構造は最初の1ミリ秒内にフォールディングする(RNAが本来の寸法の
約90%まで圧縮される)が、静止流体のような従来の技術ではこの時間的条件（Time Regim
e）に関わる問題をを解決することができない。発明による流路と基板を手段とすること
により、Mg2+添加条件下でのP RNAフォールディング反応速度の時間的依存性を研究する
ことができる。
吸光度評価分析、ロウリー(Lowry)評価分析、ハートリー・ロウリー(Hartree-Lowry)評
価分析、ビウレット(Biuret)評価分析、ブラッドフォード(Bradford)評価分析、BCA評価
分析など、当技術分野で周知の様々なタイプの評価分析法(例：タンパク質評価分析)は、
発明による装置および方法と共に併用または適合することができる。溶液内タンパク質は
約280および200nmの最大吸光度を伴う紫外線を吸収する。芳香環を伴うアミノ酸が最大吸
光度280nmをもたらす主な要因である。ペプチド結合が、最大値200nmをもたらす主な要因
である。吸光度評価分析にはいくつかの利点がある。吸光度検定は、試剤追加または定温
放置を必要としないので、高速かつ便利である。
タンパク質原基を調合する必要もない。当評価分析法はタンパク質を消費せず、タンパ
ク質濃度と吸光度が線形関係にある。さらに、当評価分析は紫外線分光測光器だけを手段
として行なうことができる。
ロウリーの評価分析はよく引き合いに出され、最も一般的に用いられているタンパク質
評価分析法であり、細胞分画、クロマトグラフィー分画、酵素調合などを目的とする正確
なタンパク質測定方法の中で最も推奨されるものであった。同原理に基づくシンコニン酸
(BCA)評価分析法はさらに、一過程のみで実施できるという利点を持っている。けれども
、ロウリー法の修正バージョンはすべて室温にて行われる。ロウリー評価分析法のハート
リー・バージョン(より少量の試剤のみを必要とする最新の修正バージョン)は、一定の種
類のタンパク質への感度を改善し、食塩水との互換性に欠けるという心配もあまり無く、
より多くの線形反応をもたらし、飽和作用がさらに生じにい。
ハートリー-ロウリー評価分析法において、二価銅イオンは、アルカリ条件下において
一価イオンとなり、ペプチド結合を伴う錯体を形成する。
一価銅イオンおよびチロシン原基やトリプトファン原基やシステイン原基はフォリン試
薬に反応し、モリブデン/タングステン(青)に変形する不安定生成物を生成する。標準液(
原基）で給液がなされることに加えて、評価分析は赤外線電球とフィルターを備える分光
測光器のみを必要とする。ガラスまたは低価格のポリスチレン・キュベットが手段とされ
うる。
ビウレット評価分析は、その原理においてロウリー法と類似するが、20分間の単一定温
放置を必要とする。ビウレット評価分析において、アルカリ条件下で、２つ以上のペプチ
ド結合を含む物質は、試剤中に銅塩を伴う紫色錯体を形成する。ビウレット評価分析の利
点として、妨害要因(アンモニウム塩がそういった要因の一つである)が全くといって無い
ことと、ロウリー法または紫外線吸収方式とよりも小規模の偏差が報告されていることが
挙げられる。
しかしながら、ビウレット法ははるかに多くの原料を消耗する。ビウレット法は、収率
にこだわらないバッチ形態の原料に適した一般的なタンパク質評価分析である。給液に用
いられる標準液に加えて、450nmの領域内で最大伝送率を伴う可視光線分光測光器が必要
とされる。ガラスまたは低価格のポリスチレン・キュベットが手段とされうる。ブラッド
フォード評価分析法は非常に高速で、ロウリーの評価分析法とほぼ同量のタンパク質を使
用する。極めて正確であり、範囲外サンプルを数分で再テストすることができる。ブラッ
ドフォード法の一般的な用途、特に細胞分画のタンパク質含有量断定およびゲル電気泳動
用タンパク質濃度評価での使用が推奨される。
発色試薬、タンパク質原基および取扱説明書などの評価分析資料は、Bio‐Rad株式会社
から入手可能。当評価分析の基準は、タンパク質への結合が生じる際にコマシーブリリア
ントブルーG-250(Coomassie Brilliant Blue G-250)酸性溶液に対する最大吸光度が465nm
から595nmに変化するという観察に基づく。
両疎水性およびイオン相互作用は、色素の陰イオン形態を安定させて、その結果目に見
える変色を引き起こす。色素‐アルブミン合成溶液の消衰係数は10倍の濃度範囲に対して
一定であることから、評価分析は有用であるといえる。給液に用いられる標準液(基準液)
に加えて、可視領域境界線上で595nmの領域内最大伝送を伴う可視光線分光測光器が必要
とされる(通常必要とされる特別なランプまたはフィルターは不要)。ガラスまたはポリス
チレン・キュベットが手段とされうるが、発色試薬によりこれら両方が着色される。使い
捨てのキュベットが推奨される。
ビシンコニン酸(BCA)評価分析用ツールはPierce社(ロックフォード、IL)によるキット
形態で入手可能である。当手順はマイクロタイター・プレート方式(microtiter plate me
thods)に極めて適応しうる。BCAは、ロウリー法と同じ目的(理由)で使用される。BCA評価
分析法は、一段階作業のみを要するという点で有利であり、また、アルカリ条件下で発色
試薬が安定している。ロウリーの評価分析におけるフォリン試薬を用いて成し遂げられる
とともに、BCAは二価銅イオンをアルカリ条件下にて一価イオンに変形する。BCAの利点は
、試剤がアルカリ条件下でかなり安定していること、および試剤を銅溶液に含むことが可
能なため一過程のみで処理工程を完了しうるということである。ロウリー法同様、モリブ
デン/タングステン(青)の生成物が生成される。給液に用いられる標準液に加えて、562nm
の設定で伝送を行う可視光線分光測光器が必要とされる。ガラスまたは低価格のポリスチ
レン・キュベットが手段とされうる。
上記の評価分析法で測定可能な濃度領域は、波長280nmでの光吸収で約20マイクログラ
ムから3mgにわたり、波長205nmでの光吸収で約1〜100マイクログラムにわたり、ロウリー
評価分析の修正バージョンでは約2〜100マイクログラムにわたり、ビウレット評価分析法
では約1〜10mgにわたり、ブラッドフォード評価分析法では約1〜20マイクログラムにわた
り、そしてBCA評価分析法では約0.2〜50マイクログラムにわたる。様々な蛍光または蛍光
変化に基づく評価分析が開発されており、発明の方式および装置を手段として実施しえる
。
様々な物理学上・化学上評価分析のに関する説明は、Remington : The Science and Pr
actice of Pharmacy, A. R. Gennaro (ed. ), Mack Publishing Company, chap. 29,"Ana
lysis of Medicinals,"pp. 437-490 (1995) およびそこの引用文献において詳細にわたり
記述されている。なおまた、同参考文献の第30章でも様々な生物試験法の詳述が提供され
る。
そこに記される評価分析には、酸塩基反応、沈降反応、レドックス反応および錯形成反
応に基づく滴定評価分析、分光測定法、電気化学方式、クロマトグラフィー方式、および
ガス定量評価分析法のようなその他の方式、容積測定および旋光・比重および放射能測定
に関係する評価分析が含まれる。その他、そこに記される評価分析として、酵素含有物質
の評価分析、近似評価分析、アルカロイド薬評価分析、そしてピロゲン試験・細菌内毒素
試験・降圧物質試験・また生物反応性試験(生体内および生体外)のような生物試験が含ま
れる。
さらに、Reinington : The Science and Practice of Pharmacy, A. R . Gennaro (ed.
), Mack Publishing Company, chap. 31,"Clinical Analysis, "pp. 501-533 (1995) お
よびそこの引用文献において、血液および他の体液に関係する様々な特性化・定量化の方
式の詳述が提供されている。特に、赤血球、ヘモグロビン、紡錘細胞、網状赤血球、血糖
、非タンパク窒素合成物、酵素、電解質、血液量と赤血球生成メカニズム、血液凝固のよ
うな様々な体液成分に関する、様々な試験および評価分析の詳述が当参照文献には含まれ
る。
（非線形・確率的検出）
確率的挙動は、多くの化学反応(例：無機化学薬品反応といった自己触媒反応、燃焼、爆
発)および鎌状赤血球貧血の重合作用において認められる。結晶化も自触媒作用工程の一
つであると言えうる。これらの反応に対する理論的対応(処理)方法のいくつかが開発され
てきている。これらの反応は、混合に対して高度に敏感である傾向がある。広範囲にわた
り研究されてきたNaClO2とNa2S2O3間に生じる確率的な自触媒作用の化学反応(亜塩素酸塩
―チオ硫酸塩反応)を考えてみる。当反応メカニズムを、反応(1)と(2)により説明するこ
とができる。
4S2O3 2-+ClO2 -+4H+ 2S4O6 2-+2H2O+Cl- rate (v) α[H+]
(1)
S2O3 2-+2 ClO2 -+H2O 2SO4 2-+2H++2Cl- rate (v) α[H+]2[Cl] (2
)
[H+]はH+の濃度を表わす。低速反応(1)は、反応混合物に対して若干のアルカリ性pH=7.
5で優性となり、反応混合物のアルカリ性pHを維持する(当反応速度vが[H＋]に正比例する
ため、その反応作用によりH+が消費され、自抑制性をもたらす)。反応(2)は、酸性pHで優
性となる(当反応速度は[H+] 2[C1-]に比例して変動するため、その反応作用により両H＋
とC1＋が生成され、超自触媒作用をもたらす)。図21は、曲線211・212番に関連する2反応
の反応線図を示す。特定のpH価で、当２反応(ここで反応211番および反応212番とする)の
速度は、不安定限界点において等しくなる。当限界点におけるNaC102およびNaS203反応混
合物の寿命はその攪拌工程に極めて依存する。攪拌の非存在下で、溶液の確率的変動は[H
＋]の局部的増加をもたらす。このような[H＋]増加による反応212番の加速現象はわずか
なものだが、反応211番は[H＋]に高次依存性を持つため及ぼされる加速効果がはるかに大
きい。
したがって、局部変動が局部[H+]の増加をもたらす領域において、反応211番が優性と
なり、より多くのH+が生成される(これは初期変動領域から急速に拡散する)。その後、化
学波が発生し全溶液に急速な反応がもたらされる。非攪拌状態のNaC102とNaS203混合物は
数秒間だけしか安定状態を維持できない。また、これらの変動(動揺現象)は攪拌の存在下
でさえも生じうる。
図21は、クロライト‐チオ硫酸塩反応の不安定段階(点)を図示する反応線図を表す。限
界点より下の[H＋]数では、低速反応(1)が優性となる。限界点より上の[H＋]数では、自
己触媒反応(2)が優性となる。限界点と等しい[H＋]数の反応混合物は、変動がない状態に
おいて準安定状態となる。完全混合状態において、小規模な変動効果が平均化され、シス
テムが準安定状態に停滞する。不完全混合状態における[H＋]低下は、反応(2)の自触媒特
性による[H＋]増加よりもゆっくりと徐々に生じるため、反応混合物が急速に酸性化され
る。
カオス的流れが流体内部の拡散性輸送に強力な影響(「異常拡散」)を及ぼすべきことは
周知のことである。カオス的なダイナミクスが非ガウスの輸送特性(「奇妙な動力学〔str
ange kinetics〕」)をもたらしうるということもさらに認められている。カオス的混合は
効果的に変動を抑えることができる。このため、発明による一様態において、発明による
流路を用いたカオス的混合の存在下でこれらの非常に不安定な混合物を安定化できる。
当発明は、クロライト・チオ硫酸塩システムを例として含むシステムの確率的挙動に対
する混合の影響を理解する手段となりえる。
層流において、流路中央の流れプロフィールは平坦で、実質的に対流による混合は存在
しない。流路中央で発生する[H＋]に関係する変動が進展して反応混合物の完全分解を引
き起こしうる。
低速混合により、直線流路を流れるプラグが変動する可能性が低下する。渦の中心に生
じる変動が無くなるまで効率的に混合されない場合、数個のプラグに関係する1種以上の
自発反応が生じえる。本発明における蛇行流路を流れるプラグのカオス的混合は、変動が
無くなるまで効果的にその混合作用を持続する。したがって、自発反応が生じる可能性が
大幅に削減されるか、またはその可能性がゼロとなる。
単純な層流においては通常、速度勾配がほとんど又は全くなく、流路中心での混合は本
質的に生じない。したがって、臨界[H＋]で調合されたクロライト・チオ硫酸塩反応混合
物に生じる変動が拡張し、反応混合物の急速分解をもたらすことができる。層流に生じる
自己触媒反応における化学表面（Chemical Fronts）の伝搬は数値シミュレーション法に
より解析されてきたが、逆伝搬(すなわち、層流方向に上流する反応表面)に関しては現在
にいたるまで予測(推測)に頼ってきた。しかし、本発明の方式を手段として、層流状態に
おけるNaC1O2‐NaS2O3間反応に関係するこの逆伝播を観察することができた。発明にのっ
とる蛇行流路を通過するプラグのカオス的流れは変動を抑制し、安定した反応混合物をも
たらす。
もちろん、カオス的に撹拌されたプラグでさえ変動が発生しうる有限確率空間が存在す
る。発明による一様態において、これら反応の進化状態の詳細は高速ディジタル・カメラ
で監視されるようになっている。一プラグの反応が隣接するプラグの挙動に影響しないよ
うに、プラグが油によって分離され互いに伝達していない状態が好ましい。何千ものプラ
グの全挙動を網羅する統計データを、実質上同一実験条件において迅速に得ることができ
る。変動により自己触媒反応が生じるかどうかは、変動の大きさとその寿命などの要素に
依存する。変動寿命は、典型的にシステムの混合時間により制限される。攪拌されていな
い溶液の場合は、拡散作用によって混合されるためかなり速度が低下し、変動が継続して
、自己触媒反応につながりうる。
撹拌された溶液の場合は、変動寿命が比較的短いため、自己触媒反応を引き起こしえる
ほど長期間維持されるのは大規模な変動のみである。
混合時間および変動寿命は、通常、プラグサイズに依存する。プラグサイズの縮小とと
もに、混合が加速され、変動が抑制される。
しかしながら、10-8モル/リットルのH+濃度(pH=8)を含む溶液中にある極小プラグ（例
：約1μm3または10-15L）は、一プラグ当たりにわずかなH+イオン(約10-23モルまたは約6
個のH+イオン)しか含まない。このような小型プラグの形成時、これらのプラグにおけるH
+イオン数はポアソン分布を示す。
実験における多大なる挑戦は、これらのシステムでの確率的挙動が主として内部濃度変
動によるということを立証することである。
ノイズと不安定状態の原因となるその他の要因は次のとおりである: (1)異なる量の試
剤を伴うプラグ形成につながりえる導入試剤流の一時的流量変動、(2)顕微鏡の照度によ
り発生しうるマイクロフルイディック装置内溶液などの温度変動、そして(3)異なるプラ
グ表面特性の変形形態につながりえる搬送流体中の不純物による変動。
発明によるマイクロフルイディック・システムは、その非線形反応速度のために離散し
た確率的挙動を示す様々な化学・生化学工程を調査する手段となりうる。さらに、それら
は、システムで生じる極めて小規模（例：細菌性細胞の容積に相当する約1μm3）な工程
を調査する手段となりうる。極めて少量を伴うシステムにおいて、単純な反応でさえ、こ
れらの容積に局部集中された少数分子により確率的挙動を示すと推測される。
自己触媒反応は、わずかな量の自触媒高感度検出の分野における多大なる可能性を提供
する。最も幅広く使用されているハロゲン化銀写真をはじめとして、当原理において作動
するシステムがいくつかある。ハロゲン化銀写真において、光線の光子エネルギーはハロ
ゲン化銀AgX乳剤をナノメーターサイズの金属銀微粒子に分解する手段となる。その後、
銀微粒子に組み込まれたフィルム(膜)は、溶解性銀(I)塩および還元剤(ヒドロキノン)準
安定性混合物の添加によって化学的に増幅される。
金属銀の微粒子は、初めの銀微粒子の成長をうながすので、ヒドロキノンによる銀(I)
の還元を触媒する。
自己触媒反応の別例として、生物科学において広く使われる非常に効果的な増幅方式で
ある合成酵素連鎖反応(PCR)が挙げられる。
しかしながら、超高感度および増幅を伴うシステムを設計する際にジレンマが生じる。
超高感度および増幅を達成するために、典型的にシステムが極めて不安定な状態でなけれ
ばならない。一方、不安定システムはノイズに非常に敏感なうえ、寿命が非常に短い。さ
らに、自発的分解と検体によって生じた反応を不安定システムにおいて識別するのは困難
である。一様態において、カオス的混合および区画化を可能にする本発明によるマイクロ
フルイディック装置はこのジレンマを克服する手段とされる。
本発明によるマイクロフルイディック・システムの将来性を実証すべく、発明によるマ
イクロフルイディック・システムは不安定混合物を処理するために使用される。一アプリ
ケーションにおいて、発明によるマイクロフルイディック・システムをNaC1O2とNaS2O3間
における確率反応を制御する手段とすることが好ましい。当反応は、特に高感度増幅工程
に使用されるのが好ましい。
不安定なNaC1O2とNaS2O3の反応混合物を含むプラグが、限界値を超えるH+局部濃度をも
たらすのに十分なH+量を含む小型プラグと融合する場合に、急速な自己触媒反応が通常発
生する。典型的に、当自己触媒反応はH+の大量生成に結びつく。したがって、弱い化学信
号(例：少量のH+)は、不安定反応混合物によって急速に増幅される。したがって、例とし
て、当アプローチは少量のH+が生成される酵素を要するなどの生物学的反応を調査する手
段となりうる。
上記の自触媒作用システムは、その斬新さと有用性を更に引き出すいくつかの特徴を有
する。一様態において、不安定な増幅反応混合物は原位置で調合され、分解する間もなく
数ミリ秒内に消耗される。
一画に生じる反応が別の一画での反応に影響を及ぼさないようにシステムを区画化する
ことが好ましい。当区画化により、微量のサンプルだけを使い、数秒間で何千という独自
の実験を実施することが可能になる。ここで重要視すべき点は、システム内のカオス的混
合が変動を弱め、反応混合物を安定させるということである。
発明にのっとるこの制御可能な自触媒作用増幅の適用範囲は陽子やCo2+イオンの検出の
分野に限られない。
例として、(Co (III)-5-Br-PAPS)/ペルオキソ1硫酸(peroxomonosulfate)酸化反応もま
た、抗体に結合する標識付け酵素として使用しえる。例として少量のペルオキシダーゼ検
出に間接的に使用することができる。分析的に特性化された(Co (III)-5-Br-PAPS)/ペル
オキソ1硫酸(peroxomonosulfate)酸化反応は、自触媒として機能する無色のCo2+イオンを
生成するカリウムペルオキソ1硫酸と酸化における、バイオレット・ビスBis[2-(5-ブロモ
-ピリジルアゾ)-5-(N-プロピル‐N-スルホプロピル-アミノ-フェノラート]コバルト酸、(
Co (III)-5-Br- PAPS)の自触媒分解に関係する。(当反応に対する自触媒現象のオーダー
は未だ確立されていない。) (Endo etal., "Kinetic determination of trace cobalt (
II) by visual autocatalytic indication," Talanta, 1998, vol.47, pp.349-353; Endo
et al., "Autocatalytic decomposition of cobalt complexes as an indicator system
for the determination of trace amounts of cobalt and effectors," Analyst, 1996,
vol.121, pp.391-394.)。
Co (III)- [5-Br-PAPS] (還元)+HSO5 -→
Co2++[5-Br-PAPS](酸化)+ HSO4-
(Co (III)-5-Br-PAPS)とペルオキソ1硫酸のバイオレット(すみれ色の)混合物へCo2+を少
量追加することにより、急速な色素減少が生じて無色溶液が生成される。当変質現象前に
生じる時間的遅延は、溶液に追加されるCo2+の量に依存する。当反応は1×l0-1mole/Lと
いった低いCo2+濃度を検出する手段とされてきた。他のイオン(V (V)、 Cr (III)、 Cr (
VI)、 Mn (II)、 Fe (II)、 Ni (II)、 Cu (II)、およびZn (II))の存在下において、反
応は優れた選択性を示す。
発明による装置と方式は、その他の自己触媒反応に適用されうる。それらの自己触媒反
応のいくつかは無機化学、有機化学、および生物化学において説明される。Cr(III)(B82)
Mn2+またはコロイド性MnO2などの遷移金属イオン反応およびハロゲン化合物やオキソハロ
ゲン化合物の反応は多くの場合において自己触媒的である。
ランタニド元素(Eu2+)およびアクチニド系列(U4+)に関係する自触媒現象も報告されて
いる。
これらの元素はすべて、化学廃棄物、飲料水または生体液の検出および監視の際に標的
となりえるものである。生体分子のような微量の光学活性キラル不純物を検出するために
非対称自己触媒反応を手段とすることにより、興味をそそる可能性が生まれる。
これに加え、今までに無い自己触媒反応を設計することも可能である。生物学の世界に
は自触媒現象が満ち溢れている。また、多くの酵素は自己触媒性である(例：プログラム
による細胞死に関係するカスパーゼ、規制と増幅に関係するキナーゼ、および、物質(新
陳)代謝・信号伝達・血液凝固に関与するその他の酵素)。
パーフルオロデカリン(PFD)のようなペルフルオロカーボン乳剤は様々な生体分子と互
換性をもち、手術中人体において代用血液としても使用されている。酵素反応動力学の定
量測定の適応性が発明により形成されたプラグにより実証されたことから、発明により形
成されたプラグが生物学的自己触媒性の検出にも適用しうるといえる。本発明による装置
と方式の適用範囲は自触媒そのものの検出に限られない。例として、自触媒による検体の
標識付けもまた本発明の適用範囲である。生体分子は頻繁に金属ナノ粒子により標識付け
される。このような金属ナノ粒子は、金属イオンを金属に還元するのに非常に効果的な自
触媒である。好ましくは、本発明のシステムおよび方式は、DNA、RNA、または自触媒路経
由でナノ粒子により標識付けされたタンパク質の単一分子を視覚的検出する手段となる。
発明にのっとる予備実験において、プラグ内の汚染されてない微粒子形成および輸送が観
察された。
さらに、化学的還元における析出金属(例：銅、銀、金、ニッケル)およびナノ粒子の生
成もまた、自触媒作用メカニズムによって生じる。これらの反応は、一般的に無電解によ
る金属析出に適用され、微量な金属微粒子の検出に有用であるとされる。水中の金属微粒
子の存在により、作動する機械的装置の存在が示されうる。発明による一様態において、
発明による装置と方式は、微量またはごく少量存在する金属微粒子を検出する手段となる
。
本発明にのっとる装置は単純設計を伴い、原料消費量がごくわずかであり、それに加え
て耐久性に富む。高圧源を必要とせず、例として重力またはポケットサイズの圧縮空気源
を手段として操作することができる。一様態において、発明によるシステムはポータブル
および携帯型の装置に適用される。
自己触媒反応は閾値反応を示す。すなわち、非常に突発且つ一時的な未反応混合物から
反応混合物への変化を示す。時間が距離に等しい場合、短距離で生じる突然の遷移を、発
明による装置および方法を使って観察することができる。時間(また距離)は、触媒の初期
濃度に非常に敏感である。したがって、反応前にその反応システムがどれだけ移動したか
に注目すれば、サンプルの自触媒濃度を断定するのは容易である。
自己触媒工程の一例として血液凝固が挙げられる。自己触媒作用は流れおよび混合に対
して非常に敏感である。したがって、流れの非存在下で自己触媒作用を伴う実験からは、
信頼性に欠ける結果や、凝析階段流の本来の機能にほとんど関連性がない結果しか得られ
ない。従来のマイクロフルイディック・システムは血液に適用するのが難しいかもしれな
い。なぜなら、一度凝析が生じると、それにより流路がふさがれてマイクロフルイディッ
ク装置内の流れを止めてしまうからである。その上、凝結した血液は自触媒として機能す
る。たとえ流路内で凝結した血液が少量だとしても、その測定値の信頼性は低下しうる。
これらの問題は本発明の装置により克服することができる。
プラグを用いることにより、自己触媒反応を簡単に制御することができ、そしてまた、
形成されたあらゆる固体により流路が詰まったり、自己触媒残留物が残ったりすることな
く、プラグ内部に輸送され、流路外部へと排出されるため、固体クロット形成の心配がな
くなる。それに加えて、生理学的条件下の流れに類似するように、プラグ内部の流れを簡
単に制御・調節することができる。
階段流は通常表面上で始まる。故に、表面に血液凝固感応性をもたらすために、表面上
の不動組織因子(階段流開始剤)を含む微視的な玉は、一本の流れに加わりその後プラグ内
部において輸送されうる。さらに、界面活性剤の表面化学を制御する手段ともなりうる。
したがって、発明による装置および方法は例として、血液循環の実質条件下におおける
(例：血友病または血栓形成傾向のある事例における)凝析階段流機能検査の手段となりう
る。当検査は特に、診断検査の分野において価値がある。血液を一本の流れに注入し、そ
して既知濃度の凝析を引き起こすとして知られる分子(例：VIIa因子)をプラグ形成前に別
の流れを経由して投入することができる。一定流量において、正常な血液は(その一定時
間に関連する)一定距離で凝結するとされる。当凝結反応は光散乱または顕微鏡検査によ
って光学上観察することができる。血友病患者の血液はこれよりも後に凝結するとされる
。当検査タイプは外科手術前（の検査）に有用である。幼児分娩（特に母体に血友病が存
在する可能性がある場合）を円滑に進めるためにも、この種の試験は重要である。発明に
よるシステムにおいて、微量の血液だけが要されるために胎児の検査も実施しうる。
血液は、患者体内から直接注入または血液凝固阻止剤(例：EDTA)の存在下で収集し、そ
れからCa2+を加えることによりプラグにおいて再構成されうる。場合によっては、Ca2+を
追加するだけで凝析階段流初期反応をもたらしうる。
発明による装置および方法はまた、実際の血液循環の条件下における血液凝固阻止剤の
効能を評価する手段となりうる。正常な血液(単独での使用および、Ca2+または他の薬剤
との併用による再構成可)、凝析を誘発するとして知られる薬剤、および血液凝固阻止剤
として研究されている薬剤(またはその他いくつかの比較研究を要する薬剤)から、プラグ
を形成することができる。これらの薬剤濃度は流量を変えることにより変化することがで
きる。凝析発生距離に焦点を置いて、凝析を防ぐ様々な薬剤の効能が比較される。システ
ム内の流れの状態および様々な化合物の存在による、血液凝固阻止剤の効能への影響を迅
速に調査することができる。同技術はまた、凝析の起因となる薬剤(というよりもむしろ
凝析を防止する薬剤)を評価する手段ともなりうる。これらの検査は候補薬評価において
非常に貴重となりえる。
（合成）
本発明にのっとって、基板内反応を処理する方法が提供される。本発明の基板内に反応
原系を含む2つ以上のプラグ流体を導入することにより、反応が導かれる。
一様態において、プラグ流体は試剤・溶媒を含んでいるため、プラグ流体の混合が反応
生成物の形成をもたらす。別の実施形態において、プラグ流体のうち1つは試剤を含まず
単に流体のみを含みうる。当実施形態において、プラグ流体混合によりプラグ内の試剤濃
度を操作することができる。
各プラグ流体からプラグを形成しその後これらの異なるプラグを融合することにより反
応を導きえる。
融合プラグを形成するためにプラグが融合される場合、プラグの1番目と2番目の組はそ
のサイズにおいて本質的に類似または異なるかもしれない。さらに、プラグの1番目と2番
目の組は異なる相対速度を有するかもしれない。一実施形態において、マイクロフルイデ
ィック・リアクターの大規模な配列は多大な処理能力を可能にするために並列状態で作動
する。
発明による装置および方法はナノ粒子合成に使用することができる。単分散のナノ粒子
はセンサと電子部品同様に重要であるが合成するのが難しい (Trindade et al., Chem. M
at. 2001, vol. 13, pp. 3843-3858)。

一様態において、半導体および貴金属の単分散ナノ粒子は発明による流路による時間的管
理の下で合成される(Park et al, J : Phys. Chem. X, 2001, vol. 105, pp. 11630- 116
35)。高速での核生成は、急速混合によって好ましくは誘発され、それによって、これら
のナノ粒子が管理される期間中に成長することを可能にする。そのとき、それらの成長が
例としてチオールを伴う微粒子表面の不動態化により直ちに終結することが好ましい。流
量したがって成長時間を変化することにより、異なるサイズのナノ粒子が好ましくは得ら
れる。それに加えて、発明による装置は、ナノ粒子合成を監視し、それゆえに所要の特性
を伴うナノ粒子を得る手段となりえる。例として、ナノ粒子の発光色または吸収性の変化
を測定することによりナノ粒子形成を監視しうる。
さらに、主要流路上にある一定の位置で消光剤の流れを導入することによりナノ粒子の成
長を止めうる。
発明による流路で発生するミリ秒レベルの急速混合は、従来の溶液混合により合成され
たナノ粒子より小さくはるかに単分散性の強いナノ粒子の形成を確実にするのに役立ち得
る。図13は、プラグ内急速混合(先の尖った吸収頂点を持つ影が薄目の領域)によって、お
よび従来の溶液混合(影が濃い目の領域)によって形成されたCdSナノ粒子のUV-VIS領域を
示す。プラグ内で生じた合成に見られる鋭い吸収頂点は、形成されたナノ粒子が高度に単
分散であることを示す。それに加えて、青色で示される吸収頂点の転位(波長のより短い
方への転位)は、形成された微粒子が小さいことを示す。
図14A-Bは、単相且つ水性層流(図14A)のPDMSマイクロフルイディック流路において、お
よび非水溶性パーフルオロデカリンに囲まれた水性プラグ(FIG.14B)において生じたCdSナ
ノ粒子の合成を図示する。
図14A-Bにおいて、Cd2+は入口1400と1403番へ導入され、水様液流は入口1401と1404番
へ導入され、およびS2-は入口1402と1405番へ導入された。図14Aにおいて、水様液流は流
路1406番を流れた。その間、図14Bにおいて油は流路1407番を流れた。図14Aは、時間t=6
分の流路1408および1410番の一部、および時間t=30分の流路1409と1411番の一部を示す。
合成に層流を使うと大量のCdS沈殿物が流路壁上に形成されるということが、図14Aから分
かる。
合成にプラグを使用した場合、全CdSはプラグ内部で形成され、表面汚染は認められな
かった。図15は、下記の例13で詳細にわたり説明されているCdSナノ粒子の合成技術を図
示する。
次の発明による方法はナノ粒子に関係する合成の手段となりえる：(a) 均質核生成条件
下において、アクセスできない結晶構造を伴うナノ粒子核生成に自己組織化単層膜を手段
とする方法(例：核生成が生じる表面を制御することにより同質異像を制御する方式)。
(b) 一連のコアとシェルのサイズを伴うコアシェルナノ粒子を生成するためにプラグ融
合を手段とする方法。第1流路のプラグ流において、CdSe微粒子のような小さなコアナノ
粒子は数ミリ秒の内に合成しうる。そのとき、Zn+2およびS-2などを含む溶液と混合する
種としてCdSe微粒子を使用することができる。ZnS形成用種の役割をするCdSe微粒子は、
したがってCdSe(コア)/ZnS(シェル)ナノ粒子の形成を可能にする。融合工程を二度以上繰
り返すだけで二層以上を伴うコアシェル微粒子を得られうる。
(c) 複合ナノ粒子を生成するためにプラグ融合を手段とする方法。例として、個別の流
路二本からのプラグ流れを利用して、CdSeとZnSの小型ナノ粒子を形成することができる
。これらの流れを合流すると、CdSe/ZnS合成物を含むより大きなナノ粒子を形成すること
になり、その結果、微粒子の凝集につながる。原ナノ粒子を少数だけしか含まない複合ナ
ノ粒子は非中心対称の可能性があり、通常とは異なる光物理的特性を有するかもしれない
。
(d) カプセル入りの薬品や複合薬といった医学に重要なナノ粒子を合成する発明による
装置と方法を手段とする方法。
(e)コアシェル微粒子および他の複合システムの組み合わせ合成。
例として、CdSe/ZnS微粒子の発光を監視し、そして様々なコアとシェルのサイズ、コア
とシェルの様々なドーピング不純物、および微粒子表面に様々な配位子組成を備える微粒
子を生成するために条件調節しうる。これらは発明による装置を手段としてリアル・タイ
ムで処理することができる。全工程の自動化もできる。
また、本発明による装置と方法は重合体合成の手段ともなりうる。
重合反応のタイミングを正確に制御することが発明により可能となったため、分子量・
多分散・およびブロックネス(blockiness：分体の合体部が分かりづらいという点)といっ
た1つ以上の重合体特性を容易に制御または調節することができる。さらに、流路の経路
長さが特定の重合反応期間に一致するので、装置内部においてプラグを融合することによ
りブロック共重合体を精密に形成することが本発明の基板を使うことにより可能となる。
同様に、個別の分子量部分集合体から成る重合体をもたらす特定の末端基でリビングポ
リマー(重合体）鎖を終結することができる。
さらに、これに似たアプローチを使って候補薬の連結ライブラリを合成しうる。流路の
プラグ位置を利用してライブラリを暗号化しうる。流量を変化することにより可変組成を
有するプラグを生成しうる。
ライブラリを合成した組み合わせを、本発明による同マイクロフルイディック・チップ
上で行なわれるスクリーニングおよび評価分析と連結しうる。いくつかの実施形態におい
て、合成や評価分析などを実行中にプラグの融合・分裂・および選別を手段としうる。
上記される本発明の合成法はすべて、複数反応を並行して引き起こすことにより1つ以
上の巨視的な量の反応生成物を形成する手段とすることができる。
（プラグによる微粒子の分離と選別）
移動中のプラグ内部の流れは、重合体と微粒子を分離する手段となりうる。まず最初に移
動中プラグ内の流れを使ってプラグ内部の重合体または微粒子(例:プラグの前後左右どれ
かに存在する余分な重合体)の分布を確立し、そしてその次に、分裂を利用して高濃度の
重合体または微粒子を含むプラグの一部を分離および隔離するといった方法で、プラグを
分離工程に利用することができる。二個の重合体または微粒子がプラグの内部に存在して
異なる分布を確立している場合、重合体または微粒子の分離に分裂を利用しえる。当アプ
ローチは、例としてこれらに限定されないが次のものいずれかをマイクロフルイディック
・チップ上で達成する際に有用となりうる：分離、精製、濃縮、非膜透析および濾過。
（結晶化）
発明による装置および方法は、既存の結晶化法および例として新型タンパク質のスクリー
ニングおよび結晶化技術に適応できる他の方法の高速且つ低価格な小型化を可能にする。
発明による結晶化法は様々な薬剤、物質、小型分子、高分子、コロイドまたはナノ粒子、
あるいはこれらのあらゆる組み合わせに適用しうる。用途に適した多くのタンパク質構造
が結晶化に対する抵抗性を有するために未定義のままである。さらに、関心をそそる多く
のタンパク質はマイクログラムレベルの量においてのみ利用可能である。したがって、ス
クリーニング工程での分析を少量のタンパク質だけで実施せざるをえない。現在の結晶化
スクリーニング技術は、通常、ミリグラム単位で、タンパク質結晶化の理想条件を定義す
る。
発明による装置と方法は、シングルユーザーに利用可能な現在のベンチトップの方法論
を改善し、速度改善、サンプル低消費、および全く新しい結晶化制御方式を伴うより高性
能な自動化システムを可能にする。
発明によるマイクロフルイディック・システムは、小型分子または高分子の結晶化およ
びそれらの錯体に適用することができる。
例として、本発明にのっとるシステムおよび方法の例としてはこれらに限定されないが
次のものが挙げられる：(1)生体高分子(細胞質内タンパク質、細胞外タンパク質、膜タン
パク質、DNA、RNAおよびそれらの複合した組み合わせ)、(2)翻訳前後修飾生体分子(例と
してはこれらに限定されないが、ハロゲン化・脱塩基・アルキル化などの処理がなされた
核酸同様に、燐酸化・硫黄化・糖鎖形成・ユビキチン化などの処理がなされたタンパク質
が挙げられる）、(3)重原子に標識付けされたDNA、RNA、およびタンパク質(またそれらの
錯体）、セレノメチオニンに標識付けされたタンパク質および核酸(またそれらの錯体)、
ハロゲン化されたDNA、RNAおよびタンパク質(またそれらの錯体)のような慎重に被覆化さ
れた高分子、(4)ビールスの全体または大型細胞微粒子(リボソーム、レプリソーム、スプ
ライセオソーム、チューブリン・フィラメント、アクチンフィラメント、染色体などを含
む)、(5)薬品のような小型分子化合物、鉛化合物 、配位子、塩剤、および有機または有
機金属化合物、(6)小型分子/生体高分子錯体(例：薬剤/タンパク質錯体、酵素/基板錯体
、酵素/生成物錯体、酵素/調整器錯体、酵素/抑制剤錯体およびそれらの組み合わせ)、(7
)コロイド粒子、および、(8)ナノ粒子。
好ましくは、本発明による一般的な結晶化技術は、次の根本的な二工程のスクリーニン
グに関係する。すなわち、大量の小型プラグを含む比較的小規模な流路を手段とする結晶
化パラメーターの粗スクリーン、および回折品質の結晶を得るためにより大規模な流路お
よびよりプラグを手段とする精密スクリーンの二工程である。
例として、横断面寸法(50μm)2の流路および10mg/mLのタンパク質最終濃度に相応する1
50ピコリッター(pL)のプラグを使って行なわれた一回に10試行を含む粗スクリーンをおよ
そ1000回(合計10,000試行)実施するのに、通常、約1.5μLの溶液を必要とし、約(10nm)以
下の大きさの結晶を生成し、およそ15μgのタンパク質を消耗する。これらのマイクロフ
ルイディック・ネットワークにおいて、300個またはそれ以上の数に及ぶこれらのプラグ
が約1秒で形成されうる。(500μm)2の流路での最適条件下における精密スクリーンは、お
よそ50個のプラグを使用すると推測される。その他に溶液~5 μLおよびタンパク質50μg
が消耗されると推測される。これにより、(100μm)3以下の大きさ結晶を生成することが
できる。一秒毎またはそれくらいの時間でおよそ30のプラグを形成することができる。シ
ステムの処理能力は、通常プラグ形成率によって定められ、どれほど急速に流量が変化さ
れうるかによって制限されるかもしれない。周波数100ヘルツで機能する圧力制御法が利
用可能なため、PDMSマイクロフルイディック・ネットワークに適用されうる(Unger et a
l.,"Monolithic fabricated valves and pumps by multilayer soft lithography," Scie
nce 2000, vol. 288, pp. 113-116)。
外観、サイズ、光学品質および回折特性のような結晶特性を、異なる条件の下で特性化
および測定しうる。例として、二重収束鏡およびMSCクライオシステムを装備するRigaku
RU 200回転陽極X線ジェネレータの上に取り付けられたRaxis IIcX線検出器が、少なくと
も特性化および測定の一部において手段となりうる。
シンクロトロン・ビームは小さな結晶の特性化に役立ちうる。さらに、X線ビームによ
る構造研究との互換性を備える発明によるマイクロフルイディック・システムを構築する
ために、これらの装置と方法を手段としうる。
現在の結晶化への取り組みに関係する重要課題は、最適な回折特性を有する結晶の形成
条件を判断(設定)することである。
通常、結晶が成長し、分離し、増大してから、その回折特性をX線ジェネレータまたは
シンクロトロンにより判断しなければならない。マイクロフルイディック・システム内部
の結晶回折特性の断定には、壁沿いの薄い非散乱性マイクロフルイディック・システムが
望ましい。好ましくは、発明による方法を用いる当システムの内部で結晶化が起る。ここ
にそれを説明する。
結晶構造または回折特性を判断するために、結晶をX線ビームに露出する(スクリーニン
グモード)。例としてPDMS層。
ある種の塩類とともに大小の分子量有機物を含む沈殿剤は、1%以下から40%以上の濃度
、または<0.5Mから4M以上の濃度で使用されうる。溶性を保つために一定レベルのイオン
強度を要するサンプルとは異なり、水そのものが沈殿剤のように作用しうる。結晶化スク
リーンの化学的多様性を増大させるために、多くの沈降剤を互いに混合しうる。発明によ
る装置は、これらの広範囲にわたる化合物に対して優れた互換性をもつ。
沈殿剤として適用しうる塩類の包括的一覧は以下のとおりである：
酒石酸塩(Li, Na, K, Na/K,NH4)、リン酸エステル (Li, Na, K, Na/K,NH4) 、酢酸エステ
ル(Li, Na, K, NalK, Mg, Ca, Zn,NH4) 、ギ酸エステル(Li, Na, K, Na/K, Mg, NH4) 、
クエン酸塩(Li, Na, K, Na/K, NH4) 、塩化物(Li, Na, K, Na/K, Mg, Ca, Zn, Mn, Cs, R
b, NH4) 、硫酸エステル(Li, Na, K, Na/K,NH4) 、マレイン酸エステル (Li, Na, K, Na/
K, NH4) 、グルタミン酸塩 (Li, Na, K,Na/K, NH4)。
沈殿剤として適用しうる有機物質の包括的一覧は以下のとおりである：
PEG 400、 PEG 1000、 PEG 1500、 PEG2K 、 PEG 3350、 PEG 4K、 PEG 6K、 PEG 8K 、
PEG10K 、 PEG 20K、 PEG-MME 550、 PEG-MME 750、 PEG- MME 2K、 PEGMME5K 、 PEG-DM
E 2K、ジオキサン、メタノール、エタノール、2‐ブタノール、n-ブタノール、t-ブタノ
ール、ジェファミン(jeffamine)m-600、イソプロピルアルコール、2-メチル-2,4-ペンタ
ンジオール(pentanediol)、1,6ヘキサンジオール(hexanediol).
緩衝効果を有する介在物により溶液中pHを変化することができる（生体試料の典型的な
pH範囲は3〜10.5の間における任意の数値である）。また、緩衝液濃度は通常0.01〜0.25M
である。当文書に記されるマイクロフルイディック装置は、広範囲にわたるpH価、特に標
的生物に適するpH価に対して優れた互換性をもつ。
発明にのっとって、手段としうる緩衝液候補薬の包括的一覧は、以下のとおりである：
Na酢酸エステル、HEPES、Naカコジル酸塩、Naクエン酸塩、Na琥珀酸塩、NaK-リン酸エス
テル、トリス、トリスマレイン酸エステル、イミダゾールマレイン酸エステル、ビス‐ト
リスプロパン、CAPSO、CHAPS、MESおよびイミダゾール。
添加剤は標的の溶解度且つ又は活性挙動に影響を及ぼす小型分子である。このような化
合物は結晶化スクリーニングを促進するか、または標的の代替結晶形または同質異像をも
たらすことができる。添加剤は考えうる化学形態のほぼ全ての形態を有することができる
が、典型的には、一価および多価塩類(無機または有機)、酵素配位子(基板、生成物、ア
ロステリック・エフェクター)、化学的架橋剤、洗浄剤且つ又は脂質、重金属、有機金属
化合物、微量沈澱剤、および小分子量有機物などの形態を有する。
次のものは、発明にのっとって使用されうる添加剤の包括的一覧である：
2-ブタノール、DMSO、ヘキサンジオール、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコ
ール、フッ化ナトウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム、無水塩化リチウム、塩化
マグネシウム6水化物、塩化ナトリウム、塩化カルシウム二水和物、塩化カリウム、塩化
アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化アンモニウム、チオシアン酸
ナトリウム、チオシアン酸カリウム、リチウム硝酸塩、マグネシウム硝エステル6水化物
、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、ギ酸マグネシウム、ギ酸ナトリウ
ム、ギ酸カリウム、ギ酸アンモニウム、リチウム酢酸エステル二水和物、マグネシウム酢
酸エステル四水和物、酢酸亜鉛二水和物、酢酸ナトリウム三水和物、酢酸カルシウム水和
物、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム、リチウム硫酸塩一水化物、リチウム硫酸エステル
一水化物、硫酸ナトリウム十水塩、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、酒石酸塩二水和物
2ナトリウム、酒石酸ナトリウムカリウム四水和物、酒石酸２アンモニウム、リン酸二水
素ナトリウム一水化物、水素リン酸エステル２ナトリウム二水和物、カリウム二水素リン
酸塩、水素リン酸エステル２カリウム、燐酸二水素アンモニウム、塩基水素リン酸エステ
ル２アンモニウム、クエン酸３リチウム四水和物、クエン酸３ナトリウム二四水和物水和
物、クエン酸３カリウム一水化物、クエン酸水素２アンモニウム、塩化バリウム、塩化カ
ドミウム二水和物、塩化カドミウム二水和物、塩化第二銅二水和物、塩化ストロンチウム
6水化物、イットリウム塩化物6水化物、エチレングリコール、無水グリセリン、1,6ヘキ
サンジオール、MPD、ポリエチレングリコール400、トリメチルアミンHCI、グアニジンHCI
、尿素、1,2,3-ヘプタントリオール,ベンズアミジンHCI、ジオキサン、エタノール、イソ
プロパノール、メタノール、ヨウ化ナトリウム、L-システイン、EDTAナトリウム塩、NAD
、ATPジナトリウム塩、D(+) - グルコース一水化物、D(+) - スクロース、キシリトール
、スペルミジン、スペルミン４HCI、6- アミノカプロン酸、1,5-2アミノペンタン2HCl、1
,6-2アミノヘクサン、1,8-アミノオクタン、グリシン、グリシル・グリシル・グリシン、
ヘキサミンコバルト三塩化物、タウリン、ベタイン一水化物、ポリビニルピロリドンK15
、非洗浄性スルホベタイン195、非洗浄性スルホベタイン201、フェノール、DMSO、硫酸デ
キストランナトリウム塩、ジェファミンM-600、2、5つのヘキサンジオール、(+/-) -1,3
ブタンジオール、ポリプロピレングリコールP400、1,4 ブタンジオール、三次ブタノール
、1,3 プロパンジオール、アセトニトリル、ガンマ・ブチロラクトン、
プロパノール、酢酸エチル、アセトン、ジクロロメタン、n-ブタノール、2,2,2トリフ
ルオロエタノール、DTT、TCEP、ノナエチレン・グリコール・モノドデシル・エーテル、
ノナエチレン・グリコール・モノラウリル・エーテル、ポリオキシエチレン(9)エーテル
、オクタエチレン・グリコール・モノドデシル・エーテル(オクタエチレン・グリコール
・モノラウリル・エーテル)、ポリオキシエチレン(8)ラウリル・エーテル、ドデシル -
β−Dマルトピラノシド、ラウリン酸スクロース・エステル、シクロヘキシルペンチル-β
−Dマルトース配糖体、ノナエチレン・グリコール・オクチルフェノール・エーテル、N,
N - bis (3-D-グルコン酸アミドプロピル―デオキシコール酸アミン、デシル - β−Dマ
ルトピラノシド、ラウリルジメチルアミン酸化物、シクロヘキシルペンチル基-β−Dマル
トース配糖体、ra-ドデシルスルホベタイン3-(ドデシルジメチルアンモニア)プロパン-l-
スルフォナート)、ノニル-β−D-グルコピラノシド、オクチル-β−D-チオグルコピラノ
シド, OSG、N,N-ジメチルデシルアミン-β−酸化物、メチl0-(N-ヘプチルカルバモイル)
-α- D - グルコピラノシド、スクロース・モノカプロイル基、n-オクタノイル-β-D-フ
ルクトフラノシル-α-D-グルコピラノシド、ヘプチル基-β-D-チオグルコピラノシド、オ
クチル-β-D-グルコピラノシド,ＯＧ、シクロヘキシル・プロピル基-β-D-マルトース配
糖体、シクロヘキシルブタノイル-N-ヒドロキシエチルグルクアミド、n - デシルスルホ
ベタイン: 3-(デシル・ジメチルアンモニウム)プロパン-lスルフォナート、オクタノイル
-N-メチルグルカミン, OMEGA、ヘキシル-β-D-グルコピラノシド、Brij 35、Brij 58、ト
リトンX - 114、トリトンX-305、トリトンX-405、トゥイーン20、トゥイーン80、ポリオ
キシエチレン(6)デシルエーテル、ポリオキシエチレン(9) デシルエーテル、ポリオキシ
エチレン(10)ドデシルエーテル、ポリオキシエチレン(8)トリデシルエーテル、デカノイ
ル-N-ヒドロキシエチルグルカミン、ペンタエチレン・グリコール・モノオクチル・エー
テル、3- [ (3-コールアミドプロピル) - ジメチルアンモニウム]- l-プロパンスルフォ
ナート、3- [ (3-コールアミドプロピル)-ジメチルアンモニウム] ドロキシ-1-プロパン
スルフォナート、シクロヘキシルペンタノイル-N - ヒドロキシエチルグルクアミド、ノ
ナノイル-N - ヒドロキシエチルグルクアミド、シクロヘキシルプロパノール-N - ヒドロ
キシエチルグルクアミド、オクタノイル-N - ヒドロキシエチルグルクアミド、シクロヘ
キシルエタノイル-N - ヒドロキシエチルグルクアミド、ベンジル・ジメチルドデシル・
臭化アンモニウム、n-ヘキサデシル- -Dマルトピラノシド、n-テトラデシル-β-Dマルト
ピラノシド、n-トリデシル-β-Dマルトピラノシド、ドデシルポリ(エチレングリコエーテ
ル)、n-テトラデシル-N, N-ジメチルアンモニウム-1-プロパンスルフォナート、n-アンデ
シル-β-Dマルトピラノシド、n-デシルD-チオマルトピラノシド、n - ドデシルホスホコ
リン、α-D-グルコピラノシド, β-D-フルクトフラノシル・モノデカン酸エステル(スク
ロース・モノ・カプリン酸塩)、1-s-ノニル-β-D-チオグルコピラノシド、n-ノニル-β-D
-チオマルトイラノシド、N-ドデシル-N, N- (ジメチルアンモニオ) - 酪酸塩、n - ノニ
ル-β-D-マルトピラノシド、シクロヘキシル・ブチルD - マルトース配糖体、n-オクチル
-β-D-マルトース配糖体、n-オクチル-β−D- チオマルトピラノシド、n-デシルホスホコ
リン、n - ノニルホスホコリン、ノナノイルN - メチルグルカミン、1-s-ヘプチル基-β
−D-チオグルコピラノシド、n-オクチルホスホコリン、シクロヘキシル・エチルDマルト
ース配糖体、n - オクチル-N, N-ジメチル・アンモニウム-l-プロパンスルフォナート、
シクロヘキシル・メチル-β−D-マルトース配糖体。
凍結剤とは、結晶が氷ではなくむしろ硝子体ガラスに埋め込まれるように、液体窒素、
液体プロパン、液体エタン、または窒素ガスやヘリウム(全て約100-120 °K)などの起寒
剤の瞬間冷凍において、標的結晶を安定させる試剤である。いかなる分量の塩類または分
子量小型有機化合物は凍結防止剤として使用できる。代表的なものはこれらに限定されな
いが、次のものが挙げられる：MPD、PEG-400(両PEG誘導体およびより高分子量のPEG化合
物とともに)、グリセリン、糖(キシリトール、ソルビトール、エリトリトール、スクロー
ス、グルコースなど)、エチレングリコール、アルコール(短鎖と超鎖の両方、揮発性と不
揮発性の両方)、LiOAc、LiCl、LiCH02、LiN03、Li2SO4、Mg(OAc)2、NaCI、NaCH02、NaN03
など。また、本発明にのっとるマイクロフルイディック装置が製作される材料はこのよう
な一連の化合物と互換性をもちうる。
両スパース行列およびグリッドスクリーニング実験の両方を研究者にとって実施可能な
ものとするこれらの化学物質の多くは、例としてこれらに限定されないが、Hampton Rese
arch of Laguna Niguel社(CA, USA）、Emerald Biostructures of Bainbridge Island社(
WA，USA)、およびJena BioScience of Jena社(ドイツ)などの様々な製造供給元(ベンダー
)から、あらかじめ指定(定義)されたスクリーニング・キット形態で購入することができ
る。疎行列スクリーンは、できるだけ多くの沈殿剤と緩衝液そしてできるだけ少数の条件
を伴う添加剤空間(additive chemical space)のランダムサンプリングを試みる。グリッ
ドスクリーニングは典型的に、互いに対する2つまたは3つのパラメーター(例：沈殿濃度
対 pH)の組織的な変形形態から構成される。両タイプのスクリーンは結晶化試験に好
結果を伴って活用されており、また、これらのスクリーンにおいて使われる大多数の化学
物質およびそれらの組み合わせは、本発明の実施形態にのっとるチップの設計および行列
に適合する。
なおその上に、マイクロフルイディック装置の現在のおよび将来的な設計により、特定
の標的または一組の標的に対する多くの異なる化学物質による配列に関係する順応性に優
れた組合せスクリーニング(ロボット工学や手作業のいずれかによるスクリーニングでは
困難な工程)を可能にするかもしれない。後者の場合、初回通過スクリーンでの初回成功
結果を最適化するのに特に重要である。
化学物質変動性に加えて、その他多数のパラメーターを結晶化スクリーニング中に変化
することができる。そのようなパラメーターはこれらに限定されないが、次のものが挙げ
られる：(1)結晶化試験回数、(2)標的溶液と結晶化溶液の比率、(3)標的濃度、(4)標的の
二次的小型分子あるいは高分子との共結晶化、(5)水和、(6)温置時間、(7)温度、(8)圧力
、(9)接触面、(10)分子を標的とする修正（変更）、および(11)重力。
下記の記述はタンパク質について述べられているが、上記される他のサンプルタイプ(
小型分子、その他の高分子、ナノ粒子、コロイド粒子などを例とする)の結晶化にも下記
される特定の装置または方法を使用または適切に適合することができる。本発明による一
様態において、タンパク質結晶化は小型化されたマイクロバッチ形態により処理される。
その工程は2段階から成る。第一に、タンパク質、沈殿剤および添加剤濃度がこれらの溶
液の相対流量を変更することにより調節されることを特徴とするところにおいて、プラグ
が形成されることが好ましい。当段階はスクリーニング段階に該当する。一旦最適濃度が
明確になると、その最適条件で流量を一定に保つことができる。当段階において、プラグ
が成形するとともに、流路を通って輸送されることが好ましい。第二に、必要とされる数
のプラグが形成された時点で、流れが停止することが好ましい。その後、プラグが定温で
放置されうることが好ましい。発明によるいくつかの実施形態において、流れを止めずに
むしろ継続させうる。これらの実施形態において、流れが適切な速度でゆっくりと継続し
、そして結晶化発生に十分な時間(数十分から数週間に及ぶが、それよりも早い場合も遅
い場合もありうる)プラグが流路内を流れるように流路長さが十分に伸ばされる。
一様態において、プラグの形成に際する流路内の膨張によりそれらのプラグはトラッピ
ングされる。プラグが流れの存在下で形成される間、膨張は死容積(無駄容積)要素として
存在する。したがって、流路を通るプラグの流れが膨張により妨げられる心配がない。一
旦流れが停止すると、表面張力が最小のところで、プラグが表面張力により膨張範囲内に
送られる。膨張形状の例としてこれらに限定されないが、卵型、丸型、正方形、長方形、
又は星形が挙げられる。特に、星形の膨張は、膨張壁へのプラグまたは結晶の密着を防ぎ
うる。膨張の開口サイズ(膨張した経路のサイズ)と流路幅の比率は、各実験の特定条件群
に基づく実験結果ごとに異なりうる。
図16は、プラグのトラッピングを図示する発明によるマイクロフルイディック装置の概
要図である。実験において、プラグは流路内部のパーフルオロデカリン中に1日保留され
ていたが、その間プラグに変化は認められなかった(フッ素添加相と水相間での屈折率の
非整合が生じプラグ可視化の補助として導入された）。
上記の方法は、タンパク質および沈殿剤濃度に対する高度な制御能力の実現を可能にす
る。さらに、プラグサイズおよび組成を制御することにより一連の時間尺度に対する高度
な制御能力の実現を可能にする。図17は、タンパク質結晶化の可変組成によりプラグを形
成するマイクロフルイディック法の略図を示す。入ってくる流れは連続的に変化する様々
な流量を伴い、その変動流量により、様々な濃度のタンパク質・沈殿剤および添加剤を伴
ってプラグが形成されるのが好ましい。例として、図17にあるように、次のものは様々な
入口へと導入されうる。緩衝液は入口171、172番へ、PEGは入口173番へ、塩類は入口174
番へ、溶媒は入口175番へ、そしてタンパク質は入口176番へと導入されうる。これらの様
々な溶液は、パーフルオロデカリンのような搬送流体が流れる流路177番に入ることがで
きる。例として、200×80μm2の断面積を伴う長さ1メートルの流路は6nL(ナノリットル)
のプラグをおよそ200個形成する手段となりうる。各プラグが40μm3の結晶を形成するの
に十分なタンパク質を含んでいる場合、試験を200回執行して、およそ10mg/mLのタンパク
質溶液(12μgのタンパク質)の約1.2μLのみを消費することになる。これらの試験でプラ
グを形成するには、約1分あれば十分でありうる。
発明による別の様態において、マイクロバッチ・システムに関する説明で上記されるよ
うにプラグが形成された後に、結晶化工程に対するさらなる制御をもたらすために、超薄
のPDMS層(あるいは若干透水性を伴うその他の層)を通しての低速蒸発を適用することが好
ましい。蒸気拡散実験の場合に類似する結晶化位相空間によって蒸発中にゆっくりと生じ
るプラグ量減少が溶液の径路を作り出すと推測される。従って、当方法はマイクロバッチ
方法に加えて、蒸気拡散法を小型化および最適化する手段とすることができる。
蒸気拡散方法において、はるかに大きな貯水溝を伴うクローズドシステム(閉鎖系)で、
タンパク質、安定化用緩衝剤、沈殿剤且つ又は結晶化剤を含む液滴の平衡を保つことが可
能である。液滴から選択的に水が蒸発するように、通常、全面的により高濃度を伴う同じ
化学物質からタンパク質を除いたものが貯蔵溝には含まれている。正常な形態において、
これは、タンパク質濃度の漸増をもたらし、数個の結晶を形成しうる。
蒸気拡散は2つの方法で行なうことができる。最も頻繁に使われるものはハンギングド
ロップ法（Hanging Drop) と呼ばれる。液滴をガラス製のカバースリップに載せた後に、
そのカバースリップを反転して「リンブロプレート(Linbro Plate)」の小さな貯水溝を密
閉する。数時間から数週間後に、微視的な結晶が形成または継続的成長を続けうる。二つ
目の方式はシッティングドロップ法(Sitting Drop)として知られている。この方法では、
はるかに大きな貯水溝と釣り合わせるために、液滴(通常>10μL)を、「リンブロプレート
(Linbro Plate)」の「マイクロブリッジ(Micro Bridge)」かガラス板どちらかのくぼみに
載せ、それから再びクローズドシステムに置く。液滴の表面引張力が低すぎるとそれを反
転することが困難となるので、通常、液滴の表面引張力が極めて低い場合、又は液滴が20
μL以上でなければならない場合にシッティングドロップ法を用いる。また、場合によっ
ては用いる手段によって、結晶が他方よりも効率的に成長する。
別の実施形態において、プラグが形成および輸送されることにより、余分な沈殿剤とタ
ンパク質の混合が最小限に抑えられる又は防止されることが好ましい。例として、スパイ
ラル流路による温和混合は、これを達成、さらにタンパク質と沈殿剤の界面を生成する手
段となりうる。
あるいは、T分岐でプラグ2本の流れを融合させずに組み合わせることにより、拡散して
から結合するプラグを生成し、大規模な混合を生じることなく流れが停止した後に自由界
面を確立しうる。界面によるタンパク質および沈殿剤の拡散は結晶化を誘発する。これは
、自由界面拡散法(Free-Interface Diffusion)の類似形態である。上記のマイクロバッチ
または蒸気拡散どちらの形態においても実施しうる。
プラグ間の拡散を減少させるために、プラグ間の間隔が広がるか、又は油組成が変更し
えることが好ましい。例として、パラフィン油における約2.5mmの間隔を利用することが
できる。これは結晶化試験での水様液拡散に対する効果的なバリアとして実証されている
。
マイクロバッチ実験を実施する際、曲面を伴うプラグ内部の小さな結晶を視覚的に確認
することは非常に難しいかもしれない。発明による様態において、可視化向上を目的とし
て、プラグ流体の屈折率と搬送流体の屈折率の整合に基づいた方法を用いる。顕微鏡的検
出は、浅い流路を手段とすること、および水溶液(水様液）屈折率に搬送流体混合物の屈
折率を一致させることにより行なわれることが好ましい。
加えて、いままでにないその他少なくとも三種のタンパク質結晶化制御法を以下に述べ
る：(1) 表面化学を用いてタンパク質結晶の核生成を達成する方法、(2) 異なる混合方法
を使って結晶化を達成する方法、そして、(3) (絶対)空間における核生成および成長の位
相を分離することによりタンパク質結晶を種とする形成を行なう方法。
核生成の制御は、タンパク質結晶化過程における難点の1つである。
不均質核生成工程はその溶液位相工程の相当物より統計的に好ましい工程である。不均
質核生成の理想的表面は、その高分子の相当物に関する相補的な静電分布を有する。この
ような表面においての方が溶液中よりも臨界核が安定する。さらに、不均質核生成に要さ
れる過飽和度は、溶液位相核形成に要されるものよりもはるかに低い。ケイ素、結晶のミ
ネラル成分、エポキシ表面、ポリスチレンビーズおよび体毛等の表面はタンパク質結晶化
の能率に影響を及ぼすとして知られる。金上の自己組織化単層膜のメチル、イミダゾール
、水酸基およびカルボン酸終点におけるタンパク質結晶化に関する研究は、ほんのわずか
しか行われていないが、将来を期待できる好結果を生み出している。自己組織化単層膜を
用いてタンパク質結晶化を行うことにより、たんぱく質はより広範囲な結晶化形態で結晶
化し、且つ従来のシラン処理ガラスを用いた場合より高速な結晶化がなされた。
* 図18は、水性プラグ流体と搬送流体の界面における表面化学を変化することにより不
均質核生成を制御する方法の概要図である。図18において、異なる官能基を有する界面活
性剤溶液いくつかの存在下でプラグが形成される(図の左側)。図18の右側は、沈殿剤、溶
媒およびタンパク質が入口180番と181番と182番へめいめい導入されうる水相領域を示す
。界面活性剤単層の構成は、流量を変化することにより好ましくは制御される。
図18において図示される方法の別途アプリケーションにおいて、表面化学を連続的に変化
することができる。
表面化学が重要なところのスクリーニング、評価分析、結晶化および他のアプリケーショ
ンに、表面化学の操作および制御を使用することができる。
発明の一様態において、搬送流体がフルオロカーボン(過フッ化炭化水素)である場合、
フルオロ溶性界面活性剤を含む搬送流体における水性プラグの形成により、タンパク質の
不均質核生成を好ましくは制御する。界面活性剤溶液の相対的流量変化により、混合単層
または位相分離混合単層の形成をもたらしえる種々様々な形態におよぶ液体間界面の形成
につながりうる。
好ましくは、数種の界面活性剤がタンパク質結晶の不均質核生成を制御するために用い
られる。エチレングリコール単層は不均質核生成を減少するために、そして、タンパク質
の静電特性を補完する静電特性をもつ単層が不均質核生成を増強するために好ましくは手
段とされる。不均質核生成を制御するこれらの方法は、通常収集することが困難である結
晶の形成を誘発または増強するために設計される。これらの方法はまた、比較的安定性又
は整列度(制御性)に優れる異なる結晶同質異像の形成を誘発または増強する手段ともなり
うる。
上記のように、核生成制御は、高度な結晶化スクリーンにおける需要が極めて多い。核
生成制御を達成する手段となりうる一方法は、核生成結晶を希釈することによりある濃度
から別の濃度に移転する過程を含む。マクロシステムで主として蒸気拡散に適用されてき
た当方法は、核生成相と成長相の分断(非干渉化)を可能にすることを目的としていた。当
方法は、核生成が微結晶発生のかなり前に生じるので、従来の結晶化法を使って実施する
ことが難しい。
図19は、本発明によるマイクロフルイディック・ネットワークによる、これに限定され
ないが例としてタンパク質を用いての核生成と成長を分ける方法を図示する。図19の左側
は、好ましくはタンパク質と沈殿剤の高濃度により形成されるプラグを示す。図19におい
て、次のものを図示される様々な入口へと導入することができる。緩衝液を入口191と196
番へ、PEGを入口192と197番へ、沈殿剤を入口193と198番へ、溶媒を入口194と199番へ、
そしてタンパク質を入口195と200番へと導入することができる。油は流路201と202番を左
から右に流れる。流路の203と204と205番の部分は、高速核生成が生じる領域(203番)と核
生成が生じない領域(204番)、そして結晶の成長が生じる領域(205番)に一致する。適用濃
度は相平衡状態図中の核形成領域に相応するものである。一定期間にわたりプラグが流路
を通って合流地点へと移動するにしたがい、核生成が生じる。その後、好ましくは、準安
定な(核生成ではなくむしろ成長)領域(図19の右側)に相応する点で、これらのプラグがタ
ンパク質溶液を含むプラグと融合する。当段階は核生成を終了し、結晶の成長を促進する
。結合した流路が融合プラグにより充填された時に、結晶化が生じるように、流れが好ま
しくは停止し、そして核が成長できることが好ましい。
核生成流路の流量を変えることにより、核生成時間を変更することができる。
準安定領域に相応する溶液濃度を伴うより大きなプラグの種晶として核を用いることが
好ましい。既存データによると、核の形成作用に要される時間は約5分以下である。
流体混合は結晶の核生成および成長において大きな影響力をもたらす要因であると考え
られている。正確且つ再生可能なレベルの混合制御を可能にする方法が発明により提供さ
れる。図20は、これらの方法のうちの2つを図示する。沈降反応を引き起こさずに、相平
衡状態図に示される核生成ゾーンへと溶液を送り入れる混合法が好ましい。
これを達成するために、タンパク質と沈殿剤濃縮溶液間の接触を防ぐか、減少させるか
、最小限にすることにより温和混合(図20、左側)を手段とすることが好ましい。あるいは
、これを達成するために、沈殿ではなく核生成を引き起こすのに十分な速さで沈降反応ゾ
ーンの通過を可能にすることにより急速混合(図20、右側)を手段とすることが好ましい。
ここで例となる2つの方法は、温和混合のためのスパイラル流路 および急速混合のた
めの蛇行流路の使用に関係している。図20において描写される発明にのっとった2つの方
法は、タンパク質結晶化に対する混合効力を判断する手段となりえる。加えて、前述の様
々な混合制御法(例：直線流路における低速混合、非直線流路におけるカオス的混合、ま
たは旋回が生じえる又は生じえない混合)は、とりわけ結晶化に適用することができる。
上記で説明された技術のうちの一つを用いて結晶を収得後、構造測定用マイクロフルイ
ディック装置から結晶を採取しうる。他のシステムでは、タンパク質結晶は脆弱であり且
つゼラチン状となっているため、結晶を収集することが困難である。例として、堅い表面
からタンパク質結晶を採取するときにそれらの結晶に損傷が生じ使用不可能になる場合が
ある。本発明は、液体環境で結晶から核を形成および成長させることによりこの問題の解
決策を提示する。発明による様態において、界面活性剤で覆われる搬送流体の薄い湿潤層
は、成長中の結晶が堅い表面から分離することを可能にする又は促進する手段となる。結
晶形成時に、搬送流体の薄い層を利用してPDMS層からそれらを分離しうる。
上記の技術はタンパク質結晶化のところで詳細にわたり説明されているが、上記と類似
する技術もまた、他の生体分子または合成化学物質を含む他の物質の結晶化の手段となり
うるということが、当業者には明らかである。さらに、発明による装置と方法は共結晶化
を行なう手段となりうる。
例えば、タンパク質の流れ少なくとも1本、沈殿剤の流れ、および任意選択で、抑制剤
・別種タンパク質・DNAなどのような第三次化学物質を含む流れを例とするものの適用に
より、1種以上の化学物質を含む結晶を収得しうる。その後、共晶形成の最適条件を判断
するための条件を変更しうる。
（プラグによる微粒子分離・選別）
移動中プラグ内部の流れは、重合体と微粒子の分離に使用することができる。まず最初に
移動中プラグ内の流れを使ってプラグ内部の重合体または微粒子(例:プラグ前後左右の側
面内部のいずれかに存在する余分な重合体)の分布を確立し、そしてその次に、分裂を利
用して高濃度の重合体または微粒子を含むプラグの一部を分離および隔離するといった方
法で、分離工程にプラグを使用できる。2種の重合体または微粒子がプラグ内部に存在す
る時にそれらが異なる分布を確立している場合、重合体または微粒子を分離するために分
裂を手段とすることができる。
以下の事例に基づき、発明のさらなる説明を下記する。
当事例は多数の実施形態のうちの1つであり、単なる例証であるということは、当業者
には分かるはずである。特に、当事例に記される装置および方法(流路構造、バルブ、切
替えおよびフロー制御用装置および方法を含む)の適合は容易である（プラグを特性化、
分析、監視、または選別できるように、ユーザーの希望に担って、1つ以上の装置または
方法と共に使用しうる）。
[実施例1] マイクロフルイディック装置の製作および一般的な実験手順
親水性流路面を備えるマイクロフルイディック装置は、ポリジメチルシロキサンにおける
急速プロトタイピングにより製作された。流路面は、シラン処理または熱処理のいずれか
を経て疎水性とされた。流路面をシラン処理するために、(トリデカフルオロ-1,1, 2,2-
テトラハイドロオクチル)-1-トリクロロシラン(United Chemical Technologies, Inc.社
)の蒸気を搬送ガスとして、約1気圧より約40〜60mm Hg高圧で乾燥窒素を有する装置入口
に適用した。それと同時に真空作用を、大気圧より約650mm Hg低圧で装置出口に適用した
。約1〜3時間シラン蒸気があてられた。流路を熱処理するために、装置を約3時間およそ1
20 ℃の炉(オーブン)の中に放置した。ちなみに、代替として、パナソニック製1300ワッ
ト電子レンジ「The Genius」の出力(温度調整)を10に設定てし約10分間、装置を加熱する
こともできる。
ＡＫＤ社製サイエンティフィック・シリンジポンプ(モデル200)またはハミルトンアパ
ラタス（Harvard Apparatus）社製PhD2000ポンプにより、装置を通して油と水溶液を流し
た。ハミルトン社(Hamilton Company)製ガスタイト(GASTIGHT)シリンジ (10-250 μl)が
使用され、ハミルトン社製30ゲージ・テフロン（登録商標）針がシリンジを装置に取り付
けるために使用された。約0.10μL/分から約10.0μL/分にわたるの体積流量で装置を通し
て油と水溶液をポンプで流した。
クレイヨーラ特有調合法マーカーまたはフェロイン(Ferroin)指示薬(0.025M、Fisher S
cientific社)を使って水溶液に着色した。パーフルオロデカリン(95%のシス／トランス〔
cis,trans〕混合物、Acros Organics社)、パーフルオパーハイドロフェナントレン(tech.
Alfa-Aesar製)、または1H,1H, 2H, 2H- パーフルオオクタノール(98%、Alfa-Aesar製)が
、ここで使われた油には含まれていた。典型的に10:1のパーフルオロデカリンとlH, lH,
2H, 2H-パーフルオオクタノール混合物で実験が実施された。
実験における監視工程にはフォステック社製(Schott-Fostec，LLC)モデュランプ（Modu
lamps）とともにリカ(Lica)MZFLIIIステレオスコープを使用した。スポットインサイトカ
ラーカメラ(Spot Insight Color Camera)モデル3.2.0 (Diagnostic Instruments, Inc.社
)で実験写真を撮影。スポットアプリケーション バージョン3.4.0.0は当カメラでの写
真撮影に使用された。
[実施例 2] プラグを用いての水溶液濃度変更
図25A〜Cそれぞれの左側に、マイクロフルイディック・ネットワークおよび実験条件の概
要図が示されている。図25A〜Cそれぞれの右側に、異なる濃度の水性流によるプラグの形
成を図示するマイクロ写真が示されている。食用染料水溶液(赤/濃・緑/淡)および水によ
り3本の流れが構成された。溶液3種の体積流量(μL/分単位の流量)が示される。濃い色の
流れは薄い色の流れより粘着性が強い。したがって、濃い色の (粘着性強の)流れは、さ
らにゆっくりと移動し(mm/s単位の測定値)、所定の体積流量でより大きな流路の一画を占
める。
図45aは、試剤流量の変更によりチップ上での希釈を成し遂げることができることを実
証するために使われたマイクロフルイディック・ネットワークの略図を示す。
図45aにおいて、希釈緩衝液が入口452番から導入される一方、試剤は入口451と453番か
ら導入される。油流れは流路454番を流れる。青い長方形は、図45c-dに示される画像の視
野を概説する。図45bは、マイクロチャンネルのプラグにおいて希釈されたフルオレスセ
イン溶液の蛍光度測定により当希釈法を定量化したグラフを示す。CmeasuredおよびCtheo
reticat[μM]によりフルオレスセイン濃度が測定され推測される入口3個のうちの1個にフ
ルオレスセインを流すことにより実施された実験80回分のデータが示されている。図45(c
)は、45nL/秒と10 nL/秒と10nL/秒の流量をそれぞれ伴う食用染料流れ455と456と457番で
、当希釈法を図示する写真を示す。図45(d)は、10 nL/秒と45nL/秒と10nL/秒の流量をそ
れぞれ伴う食用染料流れ458と459と460番で、当希釈法を図示する写真を示す。搬送流体
は60nL/秒で流れた。
[実施例3]
長方形断面を持つマイクロチャンネル・ネットワークはPDMSにおける急速なプロトタイピ
ングにより製作された。ここで、PDMSとしてDow Corning社シルガード・ブランド製品184
シリコーン・エラストマー(Sylgard Brand 184 Silicone Elastomer)が使用され、そして
プラズマプレプII(Plasma PrepII、SPI Supplies社)で装置を密閉した。2〜4時間120℃で
装置を焼成することにより装置表面に疎水性をもたらした。
図26において、赤い水性流は赤色のマコーミック食物着色料(水、プロピレングリコー
ル、FD&C赤40と3、プロピルパラベン)、緑の水性流は1:1の比率で水と薄めた緑色のマコ
ーミックX食物着色料(水、プロピレングリコール、FD&C黄5とFD&C青1、プロピルパラベン
)、無色の流れは水。ここで使用されたPFDは、パーフルオロデカリン(シス／トランス混
合物、95%、Acros Organics社)：lH, lH, 2H, 2H-パーフルオオクタノール(Acros Organi
cs社)の比率10:1での混合物。緑色の水性流が図26bにおける入口262と263番に導入された
一方、赤色の水性流は入口260と265番に導入された。無色の水性流は入口261と264番に導
入された。流れおよびプラグの濃い陰影は、主に赤色色素によるものであり、その一方、
薄い陰影は主に緑色色素によるものである。
100μLのハミルトン・ガスタイトシリンジ(1700シリーズ、TLL)または50μL SGEガスタ
イトシリンジにより、水溶液はポンプでくみ出された。
1mLハミルトン・ガスタイトシリンジ(1700シリーズ、TLL)により、PFDをポンプでくみ
出した。ハミルトン・テフロン（登録商標）針(30ゲージ、1hub)を用いてマイクロフルイ
ディック装置にシリンジを取り付けた。
ハーバードアパラタス社製シリンジポンプ(PHD2000輸液ポンプ：特注ブロンズ・ブッシ
ングがポンプの吸い上げを安定させるために伝動機構に取付けられているもの)は、水溶
液およびPFD注入の手段となった。
マイクロ写真は、ライカ(Leica) MZ12.5実体顕微鏡およびスポットインサイトカラー・
ディジタル・カメラ(モデル＃3. 2. 0、Diagnostic Instruments社)で撮影された。
スポット最新式ソフトウェアー(バージョン3.4.0、Windows（登録商標）対応、Diagnos
tic Instruments社)は、画像収集に使用された。照明にはマシンビジョン・ストロボX‐
ストロボX1200(Machine Vision StrobeX-strobeX1200：20Hz、12μF、600V、Perkin Elme
r Optoelectronics社)を用いた。画像を得るために、カメラのシャッターを1秒間開き、
ストロボを約10μs間の閃光時間で一回フラッシュした。
画像はNIH画像ソフトウェアー「イメージJ（Image J）」を使って分析された。イメー
ジJは、図27bに示されるようなマイクロ写真からの周期およびプラグ長さを測定するため
に使われた。周期は一プラグ中心から隣接したプラグの中心までの距離に相当し、そして
、プラグ長さは、プラグ前面の最端から裏面の最端までの距離に相応するとした(前面お
よび裏面の定義に関しては図28を参照)。
当初はピクセルによる測定がなされた。しかし、流路幅50μmのピクセルで測定したも
のと比較することにより絶対測定値に変換することもできた。
プラグのFe(SCN)x (3-x)+錯体の光学強度測定を行なうために、アドビ・フォトショップ
6.0でマイクロ写真をRGBカラーモードからCMYKカラーモードに変換した。その後、同プロ
グラムを使って、マイクロ写真の黄色流路を隔離し濃淡画像に変換した。さらに当濃淡画
像の強度を転化した。プラグの末端およびプラグと流路の界面での鮮明な反射光の強度を
減少させるために、黄色流路が選択された。フォトショップでの処理後、高濃度なFe(SCN
)x (3-x)+錯体を含むプラグ領域は白く見え、その一方、低濃度の領域は黒く見えた。イメ
ージ Jを使って、プラグ前面と裏面の中間にある細い長方形のプラグ領域一帯(図27a1の
白い1点鎖線)で、強度の測定がなされた。システムのマイクロ写真撮影に使われたカメラ
では、光学濃度の線形測定を行なうことができなかったため、強度測定を定量化できなか
った。流路一帯の強度 対 相対位置に関するプロットのいくつか(図27c)は、異なる画像
部位における異なる(非同一な)照度に対する調節反応が生じたため50ユニット以下の強度
で垂直方向に変動した。
これらの調整反応は、絶対濃度が原因ではなく分布形状が原因で生じたために、正当化
されるとした。
図29a-bは、総流速(図29a)および含水率(wj、図29b)の関数で周期サイズおよびプラグ
サイズのプロットを示す。キャピラリー数(C.n.)の数値データは0.0014、0.0036、0.0072
、0.011、レイノルズ数(Re)の数値データは1.24、3.10、6.21、9.31だった。ここにおい
て、各C.n.およびRe数は含水率(wf)0.20、0.52、0.52、0.20の数値点に相当する(図29aに
おける上下方向〔Y軸〕数値点)。次には、これら一組の数値点は各々、図29aに示される
特定流速に相当する。図29bにおけるプラグは、約50ミリメートル/秒(mm/s)で移動する。
長さとサイズの全測定値は流路(50tam)の幅に相当する。
図30は、総流速においてプラグ内部のプラグ周期とプラグ長さとプラグの流れ方式の間
に依存性があまりないことを図示するマイクロ写真を示す。図30の左側は、マイクロフル
イディック・ネットワークの線図を示す。ここで、図27に示される実験と同一の溶液が使
われた。無色の水性流が入口302と303番へ導入された一方、Fe(SCN)x (3-x)+溶液は入口30
1番へ導入された。図27の実験で使用したのと同じ搬送流体は、流路l304番へ流入した。
図30の右側は、同値の含水率(0.20)と異なる総流速(上から下に20、50、100、150mm/秒)
で形成されたプラグのマイクロ写真を示す。キャピラリー数はめいめい上から下に0.0014
、0.0036、0.0072、0.011。それに相当するレイノルズ数は1.24、3.10、6.21、9.31。
図31A‐Cは、それぞれ0.20、0.40、0.73の含水率を有するところの周期およびプラグ長
さの分布を示すプロットである。全ての事例において、総流速は約50mm/秒、C.n=0.0036
、Re=3.10であった。
図27は、直線のマイクロチャンネル(微細流路)を通過するプラグ内部の流れを再循環さ
せることにより混合した時の初期状態がもたらす影響を示す。図27alは、(黒い矢印によ
って示される)流れを再循環させることにより、最初にプラグの左半面および右半面に局
部集中された試剤溶液が効率的に混合したことを示す。前・後・左・右の表記法は図28に
おけるそれと同じである。
図27a2は、(黒い矢印によって示される)流れを再循環させることにより、最初にプラグ
の左半面および右半面に局部集中された試剤溶液が効率的に混合しなかったことを示す。
図27bの左側は、マイクロフルイディック・ネットワークの概要図を示す。パーフルオロ
デカリンの搬送流体が流路273番を流れた一方、無色の水性流2本は入口271と272番へ導入
された。これらの溶液は、プラグの内部の流れ方式を混乱させなかった。
図27bの右側は、0.14〜1.00の含水率に適したマイクロフルイディック・ネットワーク
のプラグ形成領域付近に存在する様々な長さをもつプラグのマイクロ写真を示す。図27cl
は、変化する長さを伴うプラグのFe(SCN)x (3-x)+錯体の相対的光学強度のグラフを示す。
プラグが直線のマイクロチャンネルを通り長さの4.4倍の距離を移動した後、プラグ幅を
横切って、左(x=1.0)から右(x=0.0)へと強度測定がおこなわれた(図27a1-a2で白い1点鎖
線によって示される)。灰色の陰影範囲は、マイクロチャンネルの壁を示す。各プラグが1
.3mmの距離を横断したという条件を除き、図27c2は図27clと同じである。dがプラグの移
動距離で1がプラグ長さであるところにおいて、それぞれの含水率 (wf)のd/lは15.2(wf 0
.14)、 13.3(wf 0. 20)、 11.7(wf 0. 30)、 9.7 (wf 0.40)、 6.8(wf 0. 60)、 4.6 (wf
0. 73)、 2.7(wf 0. 84)。
[実施例 4] プラグの融合
異なる(T字型またはY字型の)流路合流地点、横断面および流量におけるプラグの融合を調
査する実験が行なわれた(図33a-dを参照)。
図33a-dの左側の図は、一定または非同一寸法(例：同じ又は異なる流路直径)のどちら
かを伴う流路を備えるマイクロフルイディック・ネットワークの平面図を示す。これに関
連する右上の図は、(Y字合流地点の分岐形成部を有する別個の流路2本から）共通流路に
流れ込むプラグ流れ2本の拡大図を含むマイクロ写真である。
図33aにおいて、油:水の容量比率は、油と水の入口各組において4:1だった。水性流が
入口331と333番へ導入された一方、油流れは入口330と332番へ導入された。油と水が出会
う合流地点を過ぎたところの油水結合流の流量は8.6mm/秒であった。流路(四角形)の寸法
は、50(幅)× 50(高さ)μm2であった。
図33aに示されるように、一定サイズの流路を流れるプラグは典型的にT分岐に同時に到
達した場合のみ融合した。したがって、これらの流路でのプラグ融合は希にしか生じない
。加えて、遅れプラグは典型的に、共通流路沿いの先行プラグに追いつくことができなか
った。
図33bは、Y字型合流地点に異なるタイミングで到達したプラグ間に生じるプラグ融合を
図示する(拡大図記載)。水性流が入口335と337番へ導入された一方、油流れは入口334と3
36番へ導入された。図33bにおいて、油と水が出会う合流地点を過ぎたところの油水結合
流体の流量は、流路346番(50 × 50LM2流路)では平均6.9、流路347番(25 × 50μm2流路)
では8.6mm/秒だった。油：水の容量比率は、油と水の入口各組において4:1だった。2本の
流路(分岐流路)の断面積は100 × 50μm2であり、ともに共通流路348番に流れ込んだ。図
において示されるように、その合流地点に同時に到達しない場合でさえ、より広い流路か
らのより大きなプラグは、より狭い流路からのより小さなプラグと融合することができる
。これは、一旦プラグが共通の流路に入ると、遅れをとっている大型プラグが、先を行く
小型プラグに追い付くことができるからである。
図33cは、2組の入口の異なる油水率を利用して生じた同位相における異なるサイズのプ
ラグ融合(つまり、合流地点で少なくとも2つのプラグが同時に到着した際のプラグ融合)
を描写する。水性流が入口339と341番へ導入された一方、油流れは入口338と340番へ導入
された。油:水容積比率が4:1である流路350番を通る流体の流量が6.9mm/秒であった一方
、油:水容積比率が1:1である流路349番通る流量は4.0mm/秒であった。共通流路351番(分
岐流路が合流する流路)の寸法が125 × 50μm2だった一方、Y形となっているネットワー
ク部の各分岐流路(拡大図記載)の寸法は50 ×50μm2であった。
図33dは、流れ込んでくる2本のプラグ流れの相対速度の変動によってもたらされた欠陥
(つまり、通常の又は理想の条件下において融合すべきプラグが融合しない状態)を図示す
る。水性流が入口343と345番へ導入された一方、油流れは入口342と344番へ導入された。
当実験において、油:水容積比率が4:1である流路353番を通る流体の流量が6.9mm/秒であ
った一方、1:1の油:水容積比率に起因する流路352番通る流量は4.0mm/秒であった。
Y字形の交差点にある分岐2本のうちの1本を形成する各分岐流路(拡大図記載)の寸法は5
0×50μm2であった。その一方で共通流路354番(2本の分岐流路が合流する流路)は125×50
μm2である。
[実施例 5] 収縮(圧縮)された合流地点によるプラグ分裂
収縮された合流地点を伴う流路網を用いてプラグの分裂を調査した。この場合、プラグは
合流地点を通過する際に分裂し互いに180度の角度を成す2本の分岐流路(この場合の分岐
流路と合流地点が分岐するところの流路である)へとそれぞれ流れ込んだ(流路網の平面図
をそれぞれ示す図34a-cを参照)。これらの実験において、収縮された合流地点を過ぎたと
ころで出口圧(P1とP2)がP1 P2(図34b)またはP1 < P2(図34c)のいずれかに変化した。こ
こで、相対圧力は、圧力P1およびP2以下である流路の相対的高さを調節することにより変
化した。プラグが長いほど分裂の確実性が増す傾向があるため、当分岐地点(あるいは合
流地点)はプラグ延長を目的として流路より狭く設計されている。図34aは、実験の手段と
なる流路網の概要図を示す。油と水は、入口3400番および3401番へとそれぞれ導入された
。油と水が出会う合流地点を過ぎたところの流量が4.3mm/秒だったときの油:水の比率は4
:1であった。
図34bは、初期プラグ半分の大きさであるプラグへと流れるプラグの分裂を示すマイク
ロ写真である。流路3404番(長方形)の測定断面寸法は50× 50μm2であった。分岐点の直
ぐ隣にある流路3402番の収縮した接合部分の測定面積は25× 50μm2であった。出口圧Pl
およびP2は両分岐流路中においてほぼ同値だった。ここで、ほぼ同サイズのプラグへとプ
ラグが分裂する。
図34cは、P1 <P2の時に生じたプラグの非対称的分裂(つまり、異なるサイズまたは長さ
のプラグへのプラグ分裂)を示すマイクロ写真である。このマイクロ写真は、小さ目のプ
ラグ(球状)が高圧P2の流路を流れた一方、大型プラグ(いくぶん長方形)が低圧P1の流路を
流れたことを示す。図34bで示されるように、流路3405番の各測定断面積は50× 50μm2だ
った。合流地点における流路3403番の収縮した接合部分の測定値は25× 50μm2だった。
[実施例6] 収縮された合流地点を使用しないプラグの分裂
図35b-cで示されるような収縮作用が存在しない流路網を使ってプラグの分裂を調査した
。当実験の場合はプラグが分裂しお互いに90度の角度を成す2本の流路それぞれへと合流
地点を通過した後に流れ込んでいったということを除いては、図34aに示されるものに類
似した流路網が使用された(ここでいうプラグ流れは矢印によって指されている)。油およ
び水性流(4:1の油:水性流比)は、入口3500と3501番へそれぞれ導入された。油のみの流れ
は流路3502番を流れた。全流路の断面積は50×50μm2であった。ここで適用された流量は
4.3mm/秒だった。流路網の平面図を表わす図35a-cは、流路収縮(図35b-cに見られる収縮)
の非存在下における合流地点を通過するときに当実施例のプラグは実施例3のプラグと比
べると異なった動きをするということを示す。図35cが示すように、P1<P2の時に、プラグ
は合流地点を通り抜けた後にも原型を保っていた。さらに、プラグはより低圧(図35cにお
けるP1)の流路に沿って流れ、その一方で間に入る油流れが合流地点で分裂した。合流地
点における油流れの分裂は、分岐点または合流地点上流の流路内プラグ間の分離と比較し
て、圧力Pを伴う流路を流れるプラグ間の分離時間の短縮をもたらす。
[実施例 7] マイクロフルイディック・システムによる自己触媒反応の監視
図37は、確率的自己触媒反応の調査に関係している発明によるマイクロフルイディック装
置における化学物質増幅に関係する実験設計を図示する。当事例は、酸に鋭敏なNaC1 O2
・NaS2O3間の自己触媒反応を研究するにあたり本発明の装置をどのように利用しうるかを
例証する。マイクロフルイディック・ネットワークの左側において、3本の流路から成る
入口は、流路3702番経由で水性流を、流路3701番経由でエステルを、および流路3703番経
由でエステラーゼを導入する。油は流路3713と3714番を通って流れた。エステルとエステ
ラーゼ間の反応は、少量の酸を含むプラグ3704番をもたらす。マイクロフルイディック・
ネットワークの右側において、5本の流路からなる入口は、入口3705番からNaC1O2を、入
口3706番から水性流を、入口3707番からpH指示薬を、入口3708番から第２水性流を、およ
び流路3709番経由でNaS203を導入する。搬送流体は流路3713と3714番を通って流れる。
非拡散性NaC1 O2とNaS2O3混合物は非常に不安定であり、また、その混合物におけるわ
ずかな濃度変動さえ急速な分解に結びつく。
したがって、NaC1 O2/NaS2O3混合物を含むプラグ3710番は、直ちに混合されるだけでな
く、形成後に即刻使用されなければならない。申請対象となる本実験において、屈曲した
流路によりカオス的混合が促進される。若干の酸性を有するエステルエステラーゼ反応の
プラグが接触領域3712番で不安定なNaC102/NaS203混合物のプラグと合流するときに、通
常、自己触媒反応が生じる。これら2つのプラグの急速混合が生じる際に、それによって
生じるプラグ3711番は超酸性となる。5本の流路から成る入口に導入されたpH指示薬は当
増幅工程すべてを可視化する手段となる。
[実施例 8] マイクロフルイディック装置における高感度自己増幅検出要素としての化
学反応の利用
発明による一様態において、制御されている自触媒システムによる順次的増幅は、自触
媒単一分子を含むサンプルを、十分な高濃度の自触媒を含むサンプル内へと増幅する手段
となる。これにより、増幅された自触媒が肉眼でも検出できうる。確率的挙動を示すシス
テムが高感度性および増幅を示すと推測されるが、様々な自触媒システムが発明にのっと
って使用されうる。発明によるマイクロフルイディック装置による順次的増幅は分析的に
標識付けられた反応を用いて例証することができる。無色Co2+イオンを生成するカリウム
・ペルオキソ1硫酸を伴う酸化における、バイオレットbis[2- (5-ブロモ-ピリジルアゾ)-
5- (N-プロピル基-N-スルホプロピル-アミノ酸-フェノラート]コバルト酸、(Co(III)-5-B
r-PAPS)、の自触媒分解。ここで、Co2+イオンは、自触媒として役立つ(当反応に対する自
触媒現象(m)のオーダーは未だ確立されていない。)。
Co(III)- [5-Br-PAPS] (還元)+HSO5 -
Co2+ +[5-Br-PAPS](酸化) +HS04 -(3)
(Co (III)-5-Br-PAPS)とペルオキソ1硫酸のバイオレット混合物へCo2+を少量追加するこ
とにより、無色溶液を提供すべく急速な色素減少を生じる。当分解発生前に生じる時間的
遅延は、溶液に追加されるCo2+の量に依存する。
当反応は1 xl0-10 mole/Lのように低いCo2+濃度を検出する手段とされてきた。 他のイ
オン(V (V)、 Cr (III)、 Cr (VI)、 Mn (II)、 Fe (II)、 Ni (II)、 Cu (II)、およびZ
n (II))の存在下において、反応は優れた選択性を示す。
当反応を利用して増幅を行うために、図38に示されるようなマイクロフルイディック・
ネットワークを手段とすることが好ましい。
流路において、大型プラグ内のCo (III)- [5-Br-PAPS]が還元され、ペルオキソ1硫酸化
atpH=7緩衝剤の不安定な溶液が好ましくは生成される。
発明にのっとって、これらの大型プラグは、好ましくは3種の異なるプラグサイズへと
分裂する。好ましくは、プラグサイズは第1流路で (1 m)3 = 10-15 L、第2流路で(10 μm
) 3=10-12L、そして第3流路で(100μm) 3= 10-9 L。三段階フォトリソグラフィは、これ
らのマイクロフルイディック流路の親装置(マスター)製作において好ましくは使用される
。
[実施例 9] 単一分子検出用マイクロフルイディック装置における多段化学増幅
図38は、発明によるマイクロフルイディック装置による、単一分子検出用の多段化学物質
増幅用の方法を例証する。当事例は、Co2+イオンによって自触媒されたpH=7緩衝液(入口3
802番から導入)内のCo(III)-5-Br-PAPS(入口3803番から導入)とKHSO4(入口3801番から導
入)間自己触媒反応の使用を例証する。流路3804と3805番を通って油流れが流れることを
可能とする。当反応混合物(プラグ3811番に含まれる)は不安定で、少量のCo2+3810番が追
加されただけで急速に分解する(赤で表示)。したがって、当反応混合物は好ましくは敏速
に混合され、直ちに使用される。反応混合物は、サイズが(1μm)3、(10 μm)3、 (100 μ
m)3のプラグ内ネットワークを介して好ましくは輸送される。マイクロフルイディック・
ネットワークの左側において、分析用サンプルのおよそ1μm3のプラグが流路2本の合流地
点(緑で表示)で形成される。そのCo2+イオンを含むプラグ、および反応混合物を含むプラ
グの融合は、急速な自己触媒反応に帰着する。さらなる大規模な反応混合物のプラグが増
幅に用いられるところの増幅階段流によって、プラグ内のCo2+イオン各々を、一プラグ当
たり約10l0個のCo2+イオンに増幅することができる。増幅の結果は視覚検知できる。(10
μm)3のプラグは、およそ4x10-8mole/LのCo2+イオン溶液を供給するために第3流路のより
大きな(100μm)3のプラグと好ましくは融合する。およそ10−9Lのプラグにおける自己触
媒分解により約2.4×1010のCo2+イオン(4x10-5 mole/L)を伴うプラグ3809番が生成される
。各分岐でプラグが費やす時間を制御するために、好ましくは当システムに対する慎重な
制御がほどこされる。
増幅作用に与えられる時間は、低速分解を防ぐ又は最小限に抑えうる(短)時間を維持す
る一方、増幅作用を実質的に完了するのに十分な(長)時間であることが好ましい。
プラグを融合する際に、異なるプラグサイズを手段とすることには利点がある。
サイズが約(1μm)3のプラグは、流路3806番を通って約3 x 10-9mole/LのCo2+を含むサ
ンプルの流れにより好ましくは形成される。当反応は、前述の濃度またはそれよりも低い
濃度でCo2+を検出する手段となりえる(Endo etal.,"Kinetic determination of trace co
balt (II) by visual autocatalyticindication," Talanta, 1998, vol. 47, pp. 3
49-353; Endoet al.,"Autocatalytic decomposition of cobalt complexes as an indica
tor system for the determination of trace amounts of cobalt and effectors," Anal
yst, 1996, vol. 121, pp. 391-394. )。これらのプラグは、約10- 15L相当の容量を含み
、一プラグ当たり平均1.8個のイオン(ポアソン分布に相当)で少量のコバルト・イオンを
搬送する。これらのプラグ3810番は、Co(III)-5-Br-PAPS/ペルオキソ一硫酸塩(peroxomon
osulfate)混合物(約4x10-5mole/L)を含む(1μm)3のプラグ3811番と好ましくは融合する。
錯体の自己触媒分解に際して、融合プラグ3807番におけるCo2+イオンの数は、104から1
.2x104Co2+イオン(2μm3における2X10-5mole/L)だけ増加する。これらのプラグ3807番は
、不安定混合物(約4 x 10-5mole/L)を含む(10μm)3のプラグ3811番と好ましくは融合する
。これら約10-12Lのプラグ中のCo2+イオン濃度は2x10-8mole/Lぐらいで、自己触媒分解を
誘発するのに十分であることが好ましい。Co2+イオンの数は、プラグ3808番において、約
103から約2.4x107イオン/プラグだけ増加する。出発溶液は濃いスミレ色である(Co(III)-
5-Br-PAPSに対してε=9.8x104L mol-1cm-1)。チャンネルは、少なくとも10個一続きとな
った100μmのプラグを通して光学経路を生成するように設計されていることが好ましい。
これらのプラグは、4x10-5mole/Lの出発溶液吸光度約0.4を持つ長さがおよそ1mmの光学経
路を提供する。チップ上光検出器または肉眼によって当吸光度を検出することができる。
Co2+がサンプル溶液中にある場合、自触媒の階段流は反応混合物の色の消失に帰着する。
サンプル中Co2+の濃度が低い場合、システムに確率的挙動が生じうる。つまり、Co2+イ
オンすべてにより分解階段流が発するというのではない。
しかしながら、当システムの魅力的な特徴は、数秒で何千もの試験を行い統計および平
均値を収集することができるという点である。系列し制御されている自己触媒増幅反応は
好ましくは単一イオンの視覚検出へとつながる。
[実施例 10] 酵素反応動力学
いき通った研究がなされている酵素リボヌクレアーゼA(RNase A; EC 3.1. 27.5)のミリ秒
単位のシングルターンオーバーの動力学(single-turnover kinetics)を測定するために、
発明によるマイクロフルイディック・チップが使用される。従来、これらの測定にはおび
ただしい量の酵素消費量にともない高濃度な酵素と基板の両方が必要とされたたため、こ
のような測定を行なう際にサンプル消費量が単にマイクロリットル以下にすぎないという
事実は、マイクロフルイディック・チップを格別魅力的なものとする。
反応混合物が流路を下流する時、RNase Aによって蛍光発生基質の開裂から発生する定
常的蛍光の監視により、反応速度測定が実施された(図40(a)を参照)。図40において、基
板、緩衝液およびRNase Aは、入口401番と401番と403番へそれぞれ導入された。搬送流体
は流路404番を流れた。一定反応時間t[s]における生成物量は、相応する距離に達する点d
[m]での蛍光強度から計算された(U=0.43m/秒が流速であるところの、t=d/U)。流路には、
急速なカオス的混合を誘発するために屈曲する設計、および、空間分解された一画像にお
いて反応プロフィール全体を測定しえるように顕微鏡の視野内に入る設計がなされた。生
成物阻害またはRNase A変性をもたらす要因がないと立証するために、セルウィンの試験(
Selwyn's test―Duggleby, R. G., Enzyme Kinetics and Mechanisms,Pt D ; Academic P
ress: San Diego, 1995, vol. 249, pp. 61-90; Selwyn, M. J. Biochim. Biophys. Acta
, 1965, vol. 105, pp. 193-195)が当システムにおいて実施され好結果をもたらした。
150 μMのRNase A保存溶液流量は、プラグ内部における50 μMのRNase Aを維持(保存)
するために一定に保たれた。緩衝液および基板の流量の変化(図45を参照)によって、8種
の異なる基板濃度で進行曲線が得られた。[E] o＞＞[S]oの単純反応方程式は[P] t =[S]
o (1- Exp(-kt))である。これは[E]oが初期の酵素濃度である場合と、[S] oが初期の基板
濃度である場合と、 [P] t が時間依存生成物濃度である場合と、k[s-1]がシングルター
ンオーバーの率の定数である場合とに該当する。
より正確なデータ適性値を達成するために、反応混合物fnの画分を混合するのに必要な
時間遅延Δtnが評価された。使用されたマイクロフルイディック・システムの魅力的な特
徴は、時間t=0(不感時間無し)で反応混合物を観察できるということである。この特徴は
、前述のようにフルオ-4/Ca2+システムを使って混合曲線定規を得ることにより当装置に
おけるtnとfnを断定するため(Song et al., Angew.Chem. Int. Ed. 2002, vol. 42, pp.
768-772)、および拡散定数偏差を調整するため(Stroock et al., Science, 2002, vol. 2
95, pp. 647-651)に使用された。進行曲線定規は全8種とも、1100±250 s-lの同一速度定
数を伴い優れた適性値をもたらした。より単純な理論的適性値は識別不可能な速度定数を
もたらした。これらの結果は、リボヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの劈割率が約
103 s-1であることを証明する前研究結果に一致している。
したがって、当事例は、発明によるマイクロチャンネル・チップを使って急速に経済的
に、ミリ秒レベルの分解(分割)を伴うミリ秒レベルの動きを可能にすることを実証する。
各蛍光画像が2秒で得られ、70nL以下の試剤溶液のみを要した。静止流体を伴うこれらの
実験は、少なくとも数百マイクロリットルの溶液を要するとされている。一連の濃度範囲
における実験に関係する約25回 の動力学的実験には約2μLの量で十分である。
[P]t=Σnfn[S]0(1-Exp(-k(t-Δtn)))
PDMSにおけるこれらの装置製作は単純である(McDonald, et al., AccountsClcem. Res.
2002, vol. 35, pp. 491-499)。また、実験を行うために、CCDカメラを備えた標準顕微
鏡を除いては特殊な設備を必要としない。当システムは、化学と生化学の分野における広
範囲の動態実験で、静止流体方式を補い完全にする低価格且つ経済的な補足システムとし
て役立ちうる。
[実施例 11] RNAフォールディングの反応速度
本発明のシステムおよび方法は例として数十マイクロ秒から数百秒にわたる時間を要する
フォールディングの反応速度測定を実施するために好ましくは使われる。発明によるシス
テムと方法は、少量のサンプルのみでの反応速度測定を可能にするため、何百もの異なる
RNA突然変異体のフォールディングを測定することができ、そしてフォールディングに対
する突然変異の影響を確証することができる。発明による一様態において、RNAフォール
ディングの反応速度は、異なる位置で対となったFRETにより標識付けされあらかじめ合成
されたアンフォールド(引き伸ばし)状態のRNA溶液にMg2+を入れることにより好ましくは
測定される。
発明にのっとって、一連の条件におけるフォールディング反応速度を迅速に測定するた
めに、流量を変更し、Mg2+濃度が0.04〜0.4μMの範囲で好ましくは変化する(例として図2
5a-cを参照)。発明による定常流マイクロフルイディック装置を使用することにより、何
秒間にもわたり信号を集積する能力が得られるため、その感度をさらに向上させることが
できる。
図25a-cにおいて示されるように、プラグ内部の水溶液濃度は、水性流の流量変更によ
り制御することができる。図25a-cにおいて、2本の水性流に伴う約0.6μL/分の流量およ
び約2.7μL/分の流量が第3の流れに適用されることを特徴とする入口251〜258番へと、水
性流が導入された。 2.7μL/分の体積流量率を伴う流れは、図25a-cに示される左側の入
口、中央の入口、右側の入口へとそれぞれ導入された。パーフルオロデカリンの搬送流体
は流路259、260、261番へ導入された。図25a-c各図右側の該当写真は、異なる濃度の水性
流におけるプラグ形成を図示する。食用染料の水溶液を使って、流れおよびプラグ内部の
様々な陰影(赤/濃、緑/淡)を可視化することができた。また、水を3本の流れに適用した
。色のうすい陰影は主として緑色色素によるものであり、色の濃い陰影は主として赤色色
素によるものである。色の濃い流れは色の薄い流れより粘着性が強いために、移動速度が
より遅く(ミリメートル/秒単位の速度)、一定の体積流量(μL/分単位の流量)でより広大
な流路の画分を占める。
[実施例 12] プラグ有・無でのナノ粒子実験
図15は、CdSナノ粒子155番の合成技術を図示する。一実験において、ナノ粒子がマイクロ
フルイディック・ネットワークにおいて形成された。マイクロフルイディック装置の流路
横断面積は50μm×50μm。フッ化搬送流体(パーフルオロヘキサンとlH, lH, 2H, 2H-パー
フルオオクタノールの10:1 v/v混合物)は、15μL/分で主要(メイン)流路を通って流れた
。0.80mMのCdCl2水溶液と0.80mMの3-メルカプトプロピオン酸水溶液(pH=11.4)は8μL min
-1で左端の吸込路151番を通って流れた。0.80mMポリリン酸塩Na(PO3)n水溶液(水様液）は
8μL/分で中央の吸込路152番を通って流れ、そして、0.96mMのNa2S水溶液(水様液)は8μL
min-1で右端の吸込路153番を通って流れた。
26.2mMの3-メルカプトプロピオン酸水溶液(pH=12.1)は24μM min-1で装置底の入口157
番を通って流れ、ナノ粒子成長を終結した。図15は、154番の核生成、158番の成長、156
番の終結が生じる領域又は地点に相応する流路に沿う様々な領域または地点を示す。当実
験では、実質的に単分散のナノ粒子がUV-VIS領域において形成された。
ナノ粒子はまた、マイクロフルイディック無しでも形成された。マイクロフルイディッ
ク実験において使われるものと同じCdCI2溶液、ポリリン酸塩溶液、Na2S溶液、3-メルカ
プトプロピオン酸溶液が使用された。CdCl2溶液と3-メルカプトプロピオン酸溶液0.5mLと
ポリリン酸塩溶液0.5mLとNa2S溶液0.5mLを、キュベットで混ぜ合わせた。キュベットは手
動で振られた。
混合直後に、26.2mM 3-メルカプトプロピオン酸1.5mLが反応混合物に添加され反応を終
結させた。キュベットは手動で振られた。当実験において、実質的に多分散系のナノ粒子
がUV-VIS領域において形成された。
[実施例13]
マイクロ流路網はポリジメチルシロキサン(PDMS)における急速なプロトタイピングを手
段として製作された。
PDMSは、Dow Corning社シルガード・ブランド製品184シリコーン・エラストマーから入
手(購入)された。PDMS装置は、プラズマプレプII(SPI Supplies社)によるプラズマ酸化処
理後に密閉された。2〜4時間120℃で装置を焼成することにより、装置に疎水性をもたら
した。マイクロ写真はライカMZ12.5実体顕微鏡とスポットインサイトカラー・ディジタル
カメラ(モデル3.2.0、Diagnostic Instruments社)で撮影された。照明には、マシンビジ
ョン・ストロボX‐ストロボX1200(20Hz、12μF、600V、Perkin Elmer Optoelectronics社
)を使用した。画像を得るために、カメラのシャッターを1秒間開き、ストロボを約10μs
間フラッシュした。
10μlまたは50μlハミルトン・ガスタイト・シリンジ(1700シリーズ)を使って水溶液を
ポンプでくみ出した。50μlハミルトン・ガスタイト・シリンジ(1700シリーズ)を使って
搬送流体をポンプでくみ出した。シリンジは、テフロン（登録商標）管(Weico Wire & Ca
ble社、30ゲージ)によってマイクロフルイディック装置に取り付けられた。ハーバードア
パラタス社製シリンジポンプ(PHD 2000)はマイクロチャンネルに液体を注入する手段とな
った。
マイクロバッチ法で結晶化条件を達成することが可能である。プラグサイズを維持する
ことができ、水の蒸発が防がれたことを当実験は示す。
当実施例では、水をPDMSに飽和させ染み込ませるため、実験前にPDMS装置を夜通し水に
浸した。実験中にも装置を水中に浸し続けた。実験中に、搬送流体およびNaCl溶液の流量
はそれぞれ2.7μL/分と1.0μL/分だった。搬送流体およびNaCl溶液の両テフロン（登録商
標）管を遮断することにより流れを止めた。
図16は、発明によるマイクロフルイディック装置の回路略図、および油の中に保持され
た1Mの水性NaClプラグのマイクロ写真を示す。
搬送流体は2%の1H, lH, 2H, 2H-パーフルオオクタノールを含むパーフルオロデカリン
である。
マイクロチャンネル内部で、プラグサイズは明らかな変化を見せなかった。
B. マイクロチャンネルにおける蒸気拡散結晶化：プラグからの水の蒸発制御
当実験は、装置を通常より短時間水に浸すか全く浸さないかのどちらかにより、プラグか
らの水の蒸発を制御することができることを証明する。装置の製作時に使用するPDMSの厚
さによってもまた、蒸発率を制御することができる。純水の中で装置を保管する代わりに
、食塩水または他の物質の溶液の中で装置を保管することにより、蒸発率を上げることが
できる。
プラグ・トラップは、プラグをトラップの中に押し入れるのに役立つ狭隘(きょうあい)
領域によって分離される。
当実験において、合成ガラスとPDMS装置の両方が使用された。PDMS層はマイクロチャン
ネルを備え、また、顕微鏡検査スライド(フィッシャー社、35x50-1)が基板として使用さ
れた。ガラススライドとPDMSの両方はプラズマクリーナー(Harrick)で処理された後に密
閉された。2〜4時間120℃でまず装置を焼成し、その後、(トリデカフルオロ-1,1, 2,2-テ
トラハイドロオクチル)-1-トリクロロシラン)(United Chemical Techonologies社)でシラ
ン処理することにより、装置に疎水性をもたらした。
実験中に、1.0μL/分の搬送流体の流れが確立され、その次に、水溶液の流れが0.9μL/
分の総流量で確立された。プラグ形成がマイクロチャンネル内部に認められた。その後、
出口からの圧力を加えてシリンジポンプを同時に止めることによりおよそ5〜10分間流れ
を停止した。
図41は、マイクロフルイディック・ネットワークの水プラグ領域のマイクロ写真(中央
と右側)を示す。図41(b)-(c)はおのおの、t(時間)=0およびt=2時間でのプラグを示す。赤
色の水溶液は、NaCl溶液0.5M内のウォーターマン(Waterman)赤色インク50%溶液である。
その後、インク流れは入口411、412、413番へと導入された。
油流れは流路414番を流れた。搬送流体は、2%の1H, lH, 2H, 2H-パーフルオデカノール
を含むFC-3283(3M社製フロリナート液体〔Fluorinert Liquid〕)である。PDMS中の水の蒸
発を制御することが可能であり、したがって液滴内部容量の濃度を上げることが可能であ
ることを当写真は実証する(これはマイクロバッチ法結晶化と同じである)。図41(a)は、
マイクロフルイディック・ネットワークの線図を示す。
C. 水プラグ形状および付着の制御
実験中に、1.0μL/分の搬送流体の流れが確立され、次に、水溶液の流れが2.1μL/分の流
量で確立された。プラグ形成がマイクロチャンネル内部に認められた。その後、出口から
の圧力を加えてシリンジポンプを同時に止めることによりおよそ5〜10分間流れを停止し
た。
図39は、発明によるマイクロフルイディック・ネットワークの線図(左側)を示す。油流
れが流路3904番を流れた一方、水性の流れは入口3901、3902、3903番へと導入された。図
39はさらに、マイクロフルイディック・ネットワークの水プラグ領域のマイクロ写真(右
側)を示す。当画像は、PDMS壁に付着する水プラグを示す。このような付着は、低濃度ま
たは効果の薄い界面活性剤使用時に生じる。この場合、1 H, 1 H, 2H, 2H-パーフルオオ
クタノールはlH, lH, 2H,2H-パーフルオデカノールほど効果的ではない。当実験において
、界面活性剤として2%の1 H, 1 H, 2H, 2H-パーフルオオクタノールを使っているFC-3283
(3Mのフロリナート液体)を油として使用した。
（D. タンパク質結晶化の例）
実験中に、1.0μL/分で油の流れが確立された。その後、水の流れが0.1μL/分で確立され
た。最後に、リゾチームと沈殿剤の流れが0.2 μL/分で確立された。プラグ形成がマイク
ロチャンネル内部に認められた。流路内部の流れが安定した後、水の流れを0まで減速し
た。その後、出口からの圧力を加えてシリンジポンプを同時に止めることによりおよそ5
〜10分間流れを停止した。
図36は、マイクロフルイディック流路の水源中にある水プラグにおいて成長したリゾチ
ーム結晶を表わす。リゾチーム結晶は、およそ10分でプラグ・トラップの内部および外部
の両方の水性プラグ内で姿を見せ始めた。図36に示される結晶3個の画像は流れが停止し
た1時間後に撮影された。
偏光の下で観察されたため、リゾチーム結晶が色つきに見える。これはタンパク質結晶
についても同様である。
図36の左側は発明によるマイクロフルイディック・ネットワークの線図であり、右側はマ
イクロフルイディック・ネットワークにおけるプラグ内で形成された結晶のマイクロ写真
である。沈殿剤、リゾチームおよび水は、入口3601と3602と3603番へそれぞれ導入された
。油は流路3604番を通って流れた。リゾチーム溶液は0.05Mの酢酸ナトリウム(pH 4.7)中
に100mg/mlのリゾチームを含んでいる。沈殿溶液には30%のw/v PEG(M.W.5000)、1.0MのNa
Clおよび0.05Mの酢酸ナトリウム(pH 4.7)が含まれる。搬送流体は、10%のlH, lH, 2H, 2H
-パーフルオオクタノール含むFC-3283(3M社製フロリナート液体)である。実験前にマイク
ロチャンネル装置をFC-3283/H20に1時間浸した。
図32は、プラグ・トラップがマイクロフルイディック・ネットワークにおける結晶形成
に必要とされないことを証明する。図32は、マイクロフルイディック・ネットワークの線
図(左側)を示す。沈殿剤は入口321番へ、リゾチームは入口322番へ、水性流は入口323番
へと導入された。油は流路324番を通って流れた。図32は、さらにマイクロフルイディッ
ク流路の内部で成長したリゾチーム結晶のマイクロ写真(中央と右側)を示す。実験条件は
図36のものと同じである。
[実施例 14] 荷電表面用の油溶性界面活性剤
発明にのっとって、全フッ素置換された位相に対して溶性である中性界面活性剤が、好ま
しくは正および負の電荷を持つ界面を作り出す手段とされる。水との相互作用によって(
例：アミンまたはグアニジン基のプロトン化〔図24B〕又はカルボン酸基の脱プロトン化
〔図24C〕によって）電荷を持ちえる中性界面活性剤が、好ましくは電荷を伴う表面を作
り出す手段となる。
好ましくは、電荷を伴う表面は電荷を伴う生体分子を拒絶する(はねのける)か、不動と
するか、安定させる手段となる。負の電荷を伴う表面は、表面吸着性を持たないDNAおよ
びRNAの処理に有用である。好ましくは、負と正の両方の荷電を持つ表面はタンパク質結
晶の核生成を制御する手段となる。酸性基および塩基性基(RfC(O)OH、Rf(CH2)2NH2、Rf(C
H2)2C(NH)NH2)を伴う中性のフッ化界面活性剤の多くが市販されている(Lancaster製, Flu
orochem製, Aldrich製)。
オリゴエチレン・グリコールを末端にもつ界面活性剤の合成に、パーフルオ非イオン性
界面活性剤の合成法に基づく方式(手順)の修正および改善形態が好ましくは使用される。
一様態において、オリゴエチレン・グリコールの重縮合を防ぐために、フッ素化アルコー
ルのより高い酸性度に依存して合成作用が生じる。改良された合成法は、オリゴエチレン
・グリコールのアルコール基1種の選択的ベンジル化(benzylation)、そしてその後に続く
トシレート(tosylate、トシル基)となる他種アルコール基の活性化を手段とする。
その後、「ウィリアムソンの凝縮(Williamson Condensation)」が位相移転条件下で生
じ、それから炭(活性炭)上パラジウムによる接触水素化を経て脱保護の最終段階へと進む
。
[実施例 15] フッ化界面活性剤および表面引張力存在下におけるプラグ形成
油/水の界面は、キャピラリー数(C.n.)を低数値に保つのに十分な(十分高い)表面引張力
を伴わなければならない。不水溶性フッ素界面活性剤のフッ素界面活性剤/水の界面は特
性化されていないが、これらの界面活性剤はヘキサン/水の界面上のスパンに関係するシ
ステムで認められたもの(約20 mN/m)同様のものに、表面引張力を下げると推測される。
水様液/フルオラス(fluorous)の界面の表面引張力は、ハンギングドロップ法によりフッ
素界面活性剤の存在下で好ましくは測定される。これらのような測定用に特別に構築され
たビデオ顕微鏡検査機器は界面の特性化に使用され成功結果を生み出している。図24は、
パーフルオアルキル鎖およびオリゴエチレン・グリコール基を含むフッ化界面活性剤の合
成を図示する。
[実施例 16] 流量変化による勾配形成
図42は、流量変化による勾配形成に関係する実験を示す。当実験において、マイクロチャ
ンネル・ネットワークはポリジメチルシロキサン(PDMS)における急速なプロトタイピング
を手段として製作された。流路の幅および高さは両方とも50μm。パーフルオパーハイド
ロフェナントレンに含まれる10%のlH, lH, 2H, 2H-パーフルオデカノールが油として用い
られた。0.5MのNaCl溶液におけるウォーターマン赤インク50%溶液からなる赤色水溶液は
入口421番へ導入された。油は0.5μl/分で流路424番を通って流れた。水性流は入口422と
423番へ導入された。流路にインク勾配を生じさせるために、水の総流量を0.01/分丁度の
勾配率（Ramp Rate)で20秒間に0.03 μL/分から0.23μl/分へと徐々に上げた。同時に、
インク流量を勾配率0.01μl/分で20秒間かけて0.25pl/分から0.05μl/分へと徐々に下げ
た。
総流量は一定して0.28μl/分だった。プラグ内部で確立されたインク勾配濃度が、図42
にはっきりと見られる。入口からさらに離れたプラグは、より高いインク流量で形成され
たために色が濃い目である。
[実施例 17] 勾配によるリソゾーム結晶化
図43は、勾配によるリソゾーム結晶の形成に関係する実験を図示する。流路領域436番が
最適値域にある沈殿剤濃度に関連する一方、流路領域435と437番は沈殿剤濃度が非常に低
い流路領域に関連する。当実験において、マイクロチャンネルのネットワークはポリジメ
チルシロキサン(PDMS)における急速なプロトタイピングを手段として製作された。流路の
幅は150μm、高さは100μm。パーフルオパーハイドロフェナントレンの10%の1H, 1H, 2H,
2H-パーフルオデカノールが油として使用された。
実験中に、流路434番中の油流れは1.0μl/分で確立された。その後、入口432番を通っ
て導入された水流は0.2μl/分で確立され、入口431番を通って導入されたリゾチームの流
れと入口433番を通って導入された沈殿剤の流れは0.2μl/分で確立された。プラグは流路
の内部で形成した。勾配を作り出すために、水の流量を、まずは勾配率1.5秒当たり0.01
μl/分で45秒間にわたり徐々に0.35μl/分から0.05μl/分丁度に下げ、次に、勾配率1.5
秒当たり0.01μl/分丁度で45秒間にわたり徐々に0.35μl/分まで上げ戻した。同時に、沈
殿の流量を、まずは勾配率1.5秒当たり0.01丁度で45秒間にわたり徐々に0.05丁度から0.3
5丁度まで上げ、次に、勾配率(1.5秒当たり0.01丁度)で45秒間にわたり徐々に0.05丁度ま
で下げ戻した。水および沈殿剤の流量が初期値に戻った直後に入口の配管を引き抜くこと
により、流れを止めた。当方法により生成されたプラグでは一定のタンパク質濃度が保た
れたが、沈殿剤濃度には変動が見られた(沈殿剤濃度は、流路の始点および末端で最低値
を示し、流路の中央〔真ん中の列〕で最高値に達した)。流路の中央（真ん中の列)におけ
るプラグ内部のリゾチーム結晶を観察することにより確認された結果から分かるように、
流路の中央にあるプラグだけがリゾチーム結晶化に最適の沈殿剤濃度を含んでいる。
可視化は偏光の下で行なわれた。好ましくは、沈殿剤と水の流量だけでなく、すべての
流量を変化しうる。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の方法。
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