CN107850542B - 光检测装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的光检测装置包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴(4)沿线状的流移动而成的；激光束照射部，其在流路部的多个流柱排列的方向上导入激光束(3)，对多个流柱进行照射；和光检测部，其从与排列平面垂直的方向检测因激光束的照射而从多个流柱产生的发光。油的折射率(no)与液滴的折射率(nd)之差为‑0.02≤nd‑no≤0.05。

Description

光检测装置
技术领域
本发明涉及在油中将样品分割为大量的液滴之后进行分析的光检测装置。
背景技术
近年来，在油中将样品溶液分割为体积从皮升至纳升等级的液滴1万个～1千万个，在各液滴的内部发生基于样品成分的反应，检测各液滴的反应结果，由此来高精度、高灵敏度地进行样品的分析的液滴数字分析法备受瞩目。分析对象有核酸、蛋白质等各种各样，但控制成绝大多数的液滴中含有0个或1个分析对象，由此具有得到源自单一分析对象的反应结果，或者能够定量样品中所含的分析对象的绝对个数的优点。通过控制成例如各液滴中含有0个或1个构成样品的细胞，能够定量源自单一细胞的特定抗原量的平均值和方差，或者能够定量源自单一细胞的基因突变的比例。其中，应用于PCR的液滴数字PCR(以下称为ddPCR(droplet digital PCR))已经显着发展，并且预期不仅被应用于研究领域，而且被应用于诊断领域。
作为现有的定量PCR的主要方法的实时PCR，通过逐次测量每个热循环的扩增反应的进行度来定量样品中原本存在的分析对象基因。但是，为了实施该方法，需要事先测量分析对象基因的各个稀释系列的相对于热循环次数扩增反应的进行度，将其用作校准曲线。但是，在样品中的分析对象基因的扩增效率与取得校准曲线时的扩增效率不同的情况下，会发生定量结果与事实不同的情况。与之相对地，ddPCR由于数字计数样品中原本存在的分析对象基因来定量，所以不需要校准曲线，不容易受到分析对象基因的扩增效率的变化所致的影响，因此是简便且高精度的定量PCR。例如在从试样提取基因组后，按每个PCR试剂将其分割成大量的液滴，并进行数字化的PCR扩增反应。使用根据有无突变而发出荧光的TaqMan探针等，测量单个液滴的荧光并对阈值以上的荧光进行数字计数。通过采用大量的液滴能够以比较低的成本看到低频度的基因突变，这方面非常优秀。
当前，作为ddPCR装置，产品化的有Bio-Rad公司的QX200、RainDanceTechnologies公司的RainDrop等。各种ddPCR装置都是同样的机制。Bio-Rad公司的ddPCR装置的机制如非专利文献1的图1所示。首先，将含有PCR试剂的样品20微升和油放入设置于ddPCR装置的树脂制的液滴形成盒中，利用负压吸引和流动聚焦喷嘴机构在油中形成1纳升体积的液滴2万个左右。各液滴通过添加表面活性剂而在油中稳定化。接着，将油中的大量的液滴用移液管移动到现有的微量滴定板上的一个孔中，并使用现有的热循环仪执行PCR直到滴定终点(end point)。接着，再次在ddPCR装置中，一边负压吸引油中的大量的液滴一边使之在形成于树脂制的微芯片内的通道中排成一排而流动，进而在通道中追加油由此扩大液滴间隔使之流动，通过对通道照射激光光束来依次照射各个液滴，依次测量来自各个液滴的发光荧光。在此，在PCR前包含分析对象基因的液滴在PCR后受到扩增而发出强的荧光，与之相对地，在PCR前不包含分析对象基因的液滴在PCR后不受到扩增而仅发出弱的荧光。即，通过对荧光强度设定适当的阈值，对具有超过阈值的荧光强度的液滴的个数、具有低于阈值的荧光强度的液滴的个数分别进行数字计数，高精度地定量样品中所含的分析对象基因的绝对量。
另一方面，在ddPCR中，使用矿物油，硅油，氟油等各种油，但通常由于油和液滴的折射率不同，所以当对液滴照射激光束时，会在界面处发生散射。专利文献1中提案有，为了避免或减少这种液滴界面处的散射，使油和液滴的折射率一致或接近。由此，能够以高灵敏度检测源自存在于液滴内部的细胞的散射光。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2015/015199A2
非专利文献
非专利文献1：Anal.Chem.2011，83，8604-8610
发明内容
发明要解决的课题
当前，在已经产品化的所有ddPCR装置中，PCR前的液滴形成的工序是对8个样品并行地进行，而PCR后的液滴的荧光检测工序由于是对各样品依次进行，所以需要更长的时间。例如，在RainDance Technologies公司的RainDrop中，根据其产品手册，8个样品的液滴形成用约30分钟完成，而各样品的荧光检测分别需要约30分钟，所以8个样品的荧光检测需要约4小时。为了以更高的灵敏度、更高的精度和更宽的动态量程进行分析对象的检测，只要对各样品形成更大量的液滴即可，但是如果这样做，液滴形成和荧光检测的各工序所需的时间之差进一步扩大。另外，在要分析的样品的个数超过8个的情况下，例如在分析96个样品的情况下，液滴形成工序的并行度提高到12倍，同样在30分钟完成该工序比较容易，但是由于荧光检测工序难以并行化，所以需要12倍的约48小时这样不切实际的时间。即，ddPCR装置的液滴的荧光检测的工序是限制整体速度的工序，如果能够使该工序的吞吐量增大，则不仅能够大幅缩短现有的分析时间，而且能够在切实际的时间内完成更高的灵敏度、更高的精度和更宽的动态量程的分析。
为了使ddPCR装置的液滴的荧光检测的工序的吞吐量增大，尽管只要使本工序并行化即可，但是由于荧光检测系统大而昂贵，所以如果将荧光检测系统简单地并行化，则等同于将ddPCR装置本身并行化，是不切实际的。于是，本发明的目标在于，不大幅增大荧光检测系统的大小和成本，排列多个通道并且并行地不会降低速度和灵敏度地对在各通道中流动的液滴进行荧光检测。更具体地说，目标在于，将多个通道平行地排列在同一个微芯片内的同一个平面上，通过与各通道的长轴垂直且沿上述排列平面照射的“激光束横向入射”，来照射各通道，并从与上述排列平面垂直的方向检测来自在各通道内流动的各液滴的发光荧光。
但是，在尝试上述的激光束横向入射的结构时，由于激光束的散射和折射的影响，其结果并不好。如后所述，进行精密的探讨的结果，发现大致有两个独立的原因。第一个原因在于，由于在各通道中流动的液滴与油之间存在折射率差，所以各液滴起到凹透镜或凸透镜的作用，而且这种透镜在横穿激光束的方向上移动，所以激光束从入射轴扩散或其行进方向变动，而无法有效地使激光束到达后段的通道。在专利文献1中，尽管提案有通过使液滴与油的折射率一致或接近来避免或者减少激光束的液滴界面的散射的方案，但是该文献的探讨的目的在于高灵敏度地检测源自在单个通道流动的液滴中所含的细胞的散射，并不像以用激光束横向入射来对在本发明作为对象的多个通道流动的液滴进行荧光检测为目的。另外，在该文献中，对于液滴与油的折射率差、和液滴的透镜效应所致的激光束的行为的关系完全没有进行定量分析。即，液滴和油的折射率各自的值是多少、它们的折射率差是多少时，对于多个通道的激光束横向入射较好地进行或者不能较好地进行，是不明了的。第二个原因在于，形成在微芯片内的各通道的两个侧表面不垂直于各通道的排列平面，而是倾斜成锥形，并且液滴或油的折射率与微芯片的部件的折射率不同，所以激光束随着通过多个通道的侧面会向一个方向折射，从上述的排列平面散逸。
本发明通过分别解决上述两个原因，提案一种用于实现对于液滴和油所流动的多个通道的激光束横向入射的方法。
用于解决课题的技术方案
本发明的光检测装置包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴沿线状的流移动而成的；激光束照射部，其在流路部的多个流柱排列的方向上导入激光束，对多个流柱进行照射；和光检测部，其从与排列平面垂直的方向检测因激光束的照射而从多个流柱产生的发光。流柱形成于排列在微芯片内的排列平面上的多个通道的内部、在空气中排列在排列平面上的多个毛细管的内部、或者排列在微芯片内的排列平面上的多个通道汇合而形成的单个通道的内部。
在此，对于第一个原因，根据激光束光线追踪模拟的结果，不论液滴的折射率nd和油的折射率no各自的值如何，通过使两者的折射率差为-0.02≤nd-no≤0.05，更优选为-0.01≤nd-no≤0.03，使对于多个流柱的激光束横向入射良好地起作用。即，通过满足这些条件，即使在例如将流柱保持在内部的某个通道内因油中的液滴的透镜效应而使激光束多少受到影响，也能使充分强度的激光束到达后段的通道。但是，现有方法的PCR溶液的折射率典型的是与水相同为折射率1.33，所以液滴的折射率典型的是nd＝1.33。因此，在该情况下，油的折射率no优选为1.30≤no≤1.34的范围内，更优选与液滴同样为折射率1.33。
对于第二个原因，提出了以下三个解决方案。第一解决方案为，为了形成流柱而设置在微芯片内的各通道的两侧面相对于排列平面接近垂直，具体来说，是两者所成的角度收于90±1.5度。由此，能够抑制激光束从排列平面散逸。这样的微芯片虽然难以通过注塑成形等量产性的方法制作，但是能够用切削加工等来制作。
第二个解决方案为，不是由排列在微芯片内的多个通道来形成多个流柱，而是由排列在同一个平面上的多个毛细管(玻璃制的毛细管)的内部空间来构成多个流柱。在此，已知有如下的多焦点方式：通过分别适当调整各毛细管的周围的介质(空气或液体)的折射率、毛细管的材质(玻璃)的折射率、毛细管的内部的介质的折射率、毛细管的外径和毛细管的内径来控制成使各毛细管发挥作为凸透镜的作用，通过使与各毛细管的长轴垂直且沿排列平面入射的激光束在毛细管排列内反复聚光而能够进行各毛细管的激光束照射。该方式适用于作为Life technologies公司产品化的毛细管DNA测序仪的Applied Biosystems3500xL遗传分析仪。该产品在同一个平面上排列24个毛细管，通过多焦点方式进行基于激光束横向入射的24个毛细管的激光束照射和荧光检测。由于在各毛细管内部进行基于电泳的DNA测序，所以在各毛细管内部填充含有8M尿素和电泳分离用聚合物的水溶液。已知含有8M尿素的水溶液的折射率为1.41程度，与水的折射率1.33相比较大。
另一方面，在本发明中，使液滴的折射率为1.33，油的折射率接近1.33是优选条件之一。然而，在上述产品的结构中，如果将毛细管的内部的折射率1.41的溶液用折射率1.33的溶液替换，则多焦点方式不起作用，不能进行基于激光束横向入射的24个毛细管的照射和荧光检测。根据激光束光线追踪模拟的结果，通过使毛细管为外径227μm以下，或者内径25μm以上，或者使外径/内径为4.5以下，即使在用折射率1.33的溶液充满各毛细管的内部的情况下，也能够使多焦点方式起作用，能够进行基于激光束横向入射的24个或更大量的毛细管的照射和荧光检测。
第三个解决方案为，使液滴和油在形成于微芯片内的多个通道中流动，分别取出在它们的下游部相邻的通道间的分隔壁，使多个通道汇合为宽度大的单个通道，使激光束横向入射到在该汇合通道中的排列平面上形成的多个流柱，由此避免激光束的各通道的侧面的折射和从排列平面散逸，能够进行对多个流柱的激光束照射和荧光检测。该方法中，采用使从各通道移动到汇合通道的液滴和油成为层流状态以使得将个别(单独)的通道整齐排列为一排而流动的液滴不会在汇合通道中彼此混合的多鞘流方式是很重要的。另外，汇合为单个通道的多个通道，也能够由多个毛细管构成。
发明效果
根据本发明，能够使作为以ddPCR为代表的液滴数字分析法的限速瓶颈部分的检测部的吞吐量增大，由此能够实现分析的高速化、高吞吐量增大。这些特长特别是在将分析用于诊断时发挥效果。
对上述以外的课题结构和效果，通过以下的实施方式的说明而明了。
附图说明
图1是具有15个通道的微芯片的示意图。
图2是表示使激光束横向入射，在第一个通道内距离X为40μm的位置配置有液滴时的激光束光线追踪结果的图。
图3是表示距离X为30μm时的激光束光线追踪结果的图。
图4是表示距离X为20μm时的激光束光线追踪结果的图。
图5是表示距离X为10μm时的激光束光线追踪结果的图。
图6是表示距离X为0μm时的激光束光线追踪结果的图。
图7是表示液滴的折射率为1.47时的激光束光线追踪结果的图。
图8是表示液滴的折射率为1.48时的激光束光线追踪结果的图。
图9是表示15个通道的激光束照射效率的图。
图10是表示使液滴的折射率变化时的第一个和第六个通道的激光束照射效率的变化的图。
图11是表示使油的折射率变化时的第一个和第六个通道的激光束照射效率的变化的图。
图12是排列有多通道的微芯片的结构例的截面示意图。
图13是表示通道侧面的模锻斜度与激光束照射效率的关系的图。
图14是排列有多通道的微芯片的结构例的示意图。
图15是表示微芯片的激光照射和荧光检测部的结构例的概略图。
图16是表示荧光检测部的变形例的示意图。
图17是表示荧光检测部的变形例的示意图。
图18是表示荧光检测部的变形例的示意图。
图19是表示荧光检测部的变形例的示意图。
图20是表示荧光检测部的变形例的示意图。
图21是包括排列于空中的多毛细管的光检测装置的概略图。
图22是表示在使激光束横向入射到多毛细管的系统中，将内径固定为50μm，使外径变化时的激光束光线追踪结果的图。
图23是表示24个毛细管的激光束照射效率的图。
图24是表示毛细管外径与对于毛细管编号12的毛细管的激光束照射效率的关系的图。
图25是表示在使激光束横向入射到多毛细管的系统中，将外径固定为150μm，使内径变化时的激光束光线追踪结果的图。
图26是表示24个毛细管的激光束照射效率的图。
图27是表示毛细管内径与对于毛细管编号12的毛细管的激光束照射效率的关系的图。
图28是表示在使激光束横向入射到多毛细管的系统中，将外径固定为100μm，使内径变化时的激光束光线追踪结果的图。
图29是表示24个毛细管的激光束照射效率的图。
图30是表示毛细管内径与对于毛细管编号12的毛细管的激光束照射效率的关系的图。
图31是表示在通道中追加油的微芯片的结构例的示意图。
图32是表示对多个通道进行激光束横向入射的微芯片的结构例的示意图。
图33是表示具有汇合通道的微芯片的结构例的示意图。
图34是表示具有汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图。
图35是表示具有汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图。
图36是表示从与多个通道的排列平面垂直的方向追加油的微芯片的结构例的示意图。
图37是表示具有汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图。
具体实施方式
首先，通过激光束光线追踪模拟来定量研究液滴和油在通道中流动对于通道排列的激光束横向入射有什么影响。如图1所示，在微芯片1的内部，将多个通道2排列在同一个平面上。以下将上述平面称为排列平面。图1(a)是与各通道2的长轴垂直的微芯片1的截面示意图，图1(b)是从与排列平面垂直的方向看的微芯片1的正面示意图，都仅描绘了照射激光束的部分的附近。微芯片1的材质适合为透明的树脂或玻璃，此处采用折射率为1.53的环烯烃聚合物(COP)。15个通道2以200μm的间隔平行排列，并且各通道2的横截面形状是边长为50μm的正方形。对各通道从左侧起依次附加No.1～No.15的通道编号。各通道的内部充满折射率为1.48的矿物油。除此之外，图2～图7中，在No.1的通道2中，在规定的位置配置有一个由直径40μm、折射率1.33的水溶液构成的液滴。在此，不管液滴的位置如何，液滴的周围总是充满油。
图2～图8表示在各条件下，在相对于图1的通道排列从左侧起将激光束3以缩小到直径40μm的状态与各通道2的长轴垂直且沿排列平面地进行照射时的进行了激光束3的光线追踪模拟的结果。各图中(a)和(b)与图1的(a)和(b)同样，表示微芯片1的截面示意图和正面示意图。图2～图6的(c)表示照射No.1的通道2的激光束3的位置的(b)的放大图，在通道2的内部，液滴4配置于规定的位置。这些图中，为了容易看液滴4，描绘了液滴4的轮廓。
激光束3由300个无限小宽度的光束要素构成，并且这些光束要素的位置在直径40μm的内部均匀且随机地配置。而且，入射至微芯片1之前的激光束3，其合计强度设为1.00(100％)，各光束要素具有相等的1/300(0.33％)的强度。在光线追踪模拟中，对于每个光束要素，在向微芯片1的入射面、向充满了油的各通道2的入射面、从各通道2的出射面、向由水溶液构成的液滴4的入射面、从液滴4的出射面等折射率发生变化的位置每次都应用斯涅尔定律和菲涅耳定律，对折射光的行进方向和强度进行了追踪。但是，在光束要素在折射率发生变化的位置发生全反射的情况下，对反射光的行进方向和强度进行了追踪。各图表示通过这样计算而得的300个光束要素的光路。以上的光线追踪模拟在三维模型上执行，但各图中为了清楚起见，用投影到与各通道2的长轴垂直的平面上的二维图像表示。另外，在通过这样计算而得的300个光束要素中，按每个通道2提取通过其内部的光束要素，将它们在该位置的强度的合计计算为激光束照射效率。即，在300个光束要素全部以零强度衰减照射通道的内部时，设该通道的激光束照射效率为1.0。
图9是对于图2～图6的各条件，计算了通道编号对应的激光束照射效率的结果。激光束照射效率表示在三维模型上计算而得的结果。之后，如用图22(a)和图23说明的那样，为了获得与市售的毛细管DNA测序仪同等以上的荧光检测灵敏度，各通道的激光束照射效率只要为0.4以上即可。此外根据经验可知，如果各通道的激光束照射效率为0.2以上，则能够得到实用的荧光检测灵敏度。
图2是表示液滴4与激光束3的距离为X＝40μm时的结果的图。在此，距离X是指从激光束的中心轴至液滴的中心的距离。如图2(c)所示，激光束3不与液滴4接触，所以激光束3不受液滴4的影响，显示与液滴不存在时同样的行为。由于各通道2的截面为正方形，所以各光束要素向各通道2的侧面的入射角总是为0度，不发生折射。因此，激光束3使直径和中心轴不发生变化地在通道排列内行进，并且穿刺状地高效照射所有通道2。图9的●绘点表示此时各通道2的激光束照射效率。由于在各折射率变化点产生激光束反射损失，所以随着通道编号的增加，激光束照射效率略微降低，但是在各通道2获得大致相等的激光束照射效率。
图3是表示液滴4与激光束3的距离为X＝30μm时的结果的图。如图3(c)所示，激光束3与液滴4接触，仅接触的光束要素受到折射。由于液滴4的折射率1.33低于周围的油的折射率1.48，所以液滴4相对于激光束3起到凹透镜的作用。因此，图3(b)和(c)中，液滴4存在于比激光束3的入射中心轴靠上侧，而上述激光束3的折射处于相反侧，即，在比激光束3的入射中心轴靠下侧行进。另一方面，与液滴4不接触的光束要素，与图2同样，沿激光束3的入射中心轴行进，对各通道2的照射作出贡献。图9的▲绘点表示此时的各通道2的激光束照射效率。由于激光束3与液滴4的接触程度小，所以对激光束照射效率的影响也小。液滴4对激光束3的折射的影响用No.1～No.3的通道2的激光束照射效率的降低量表示，No.3以后的通道2没有看到影响。
同样图4、图5和图6分别是表示液滴4与激光束3的距离为X＝20μm、10μm和0μm时的结果的图。随着距离X的减少，激光束3与液滴4的接触程度增大，液滴4的凹透镜效应增大，导致激光束3更大的折射。图6的X＝0μm时，液滴4与激光束的中心(轴)一致，所以图6(b)和(c)中激光束3的折射所致的行进方向相对于激光束3的入射中心轴上下对称。图9的■、○和△绘点分别表示图4、图5和图6中的各通道2的激光束照射效率。随着距离X的减少，通道编号对应的激光束照射效率的衰减程度增大，X＝0时激光束3的折射程度最大，No.6以后的通道2的激光束照射效率基本为零。即，很明显，即使液滴4和油的折射率各自一定，根据液滴4与激光3的相对位置，各通道2的激光束照射效率也大幅变化。
图7是表示在图6的条件(X＝0μm)下液滴的折射率从1.33上升到1.47时的结果的图。可知，液滴4的折射率1.47接近油的折射率1.48的结果是，液滴4的凹透镜效应降低，激光束3的折射程度降低，基于激光束横向入射的多个通道的激光束照射和荧光检测成为可能。而且，图8是表示在图6的条件(X＝0μm)下液滴的折射率从1.33上升到1.48时的结果的图。可知，液滴4的折射率1.48与油的折射率1.48一致的结果是，液滴4的凹透镜效应消失，激光束3的折射消失，与图2所示不存在液滴4的情况同样，激光束3不使直径和中心轴变化地在通道排列内行进，能够穿刺状地高效照射所有的通道2。
图10是表示包括图7和图8的结果在内的详细研究了图6的条件(X＝0μm)下使液滴的折射率nd从1.33变化到1.63时的激光束照射效率的变化的结果的图。此时，油的折射率no固定为1.48。●绘点表示No.1的通道的激光束照射效率，○绘点表示No.6的通道的激光束照射效率。No.6的通道是从No.1的通道离开1mm的位置，被选择作为判断激光束横向入射的可否起作用的指标。可知，No.6通道的激光束照射效率随着液滴的折射率nd从1.33接近油的折射率no＝1.48而上升，当液滴的折射率nd与油的折射率no＝1.48一致时最大，随着液滴的折射率nd超过油的折射率no＝1.48离开而降低。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使液滴的折射率nd为1.46≤nd≤1.53即可。即，可知，只要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.02≤nd-no≤0.05即可。另外可知，为了获得能够进行更高灵敏度的荧光检测激光束照射效率0.4以上，只要使液滴的折射率nd为1.47≤nd≤1.51即可。即，可知，只要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.01≤nd-no≤0.03即可。
图11是表示详细研究了与图10相反在图6的条件(X＝0μm)下使油的折射率no从1.48变化到1.18时的激光束照射效率的变化的结果的图。此时，液滴的折射率固定为nd＝1.33。●绘点表示No.1的通道的激光束照射效率，○绘点表示No.6的通道的激光束照射效率。可知，No.6通道的激光束照射效率随着油的折射率no从1.48接近液滴的折射率nd＝1.33而上升，当油的折射率no与液滴的折射率nd＝1.33一致时最大，随着油的折射率no低于液滴的折射率nd＝1.33远离而降低。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使油的折射率no为1.28≤no≤1.35即可。即，可知，只要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.02≤nd-no≤0.05即可。另外可知，为了获得能够进行更高灵敏度的荧光检测激光束照射效率0.4以上，只要使油的折射率no为1.30≤no≤1.34即可。即，可知，只要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.01≤nd-no≤0.03即可。
从图10和图11的结果可知，无论液滴和油各自的折射率如何，将两者的折射率差nd-no设为-0.02≤nd-no≤0.05对于使激光束横向入射发挥作用方面是有效的，更优选的可以将折射率差nd-no设为-0.01≤nd-no≤0.03。不用说，消除折射率差，使液滴与油的折射率一致是更优选的。
接着，在图12中用与各通道2的长轴垂直的截面图表示微芯片1的结构例。微芯片1的材质是透明的树脂或玻璃等。如图12(a)所示，一般来说，微芯片1通过将表面为平的上侧基板17和表面具有多个槽的下侧基板18用粘合面19结合，将上述槽转换为通道2来制作。但是，在利用模具以树脂的注塑成形制作下侧基板18的情况下，即，在用能够量产、容易降低制造单价的方法制作下侧基板18的情况下，需要从模具卸下成形品(下侧基板18)时的模锻斜度，所以不是如图12(a)所示使通道2的截面形状为正方形或长方形，而是如图12(b)所示使通道2的截面形状为梯形。此时，从微芯片1的侧面沿排列平面入射的激光束3，在各通道2的左右的两侧面受到同一方向的折射，所以新发现了会伴随通过多个通道2从排列平面散逸的课题。更具体地说，在各通道2的内部(液滴或油)的折射率比微芯片1的折射率小的情况下，如图12(b)所示，激光束向比排列平面靠下侧散逸。反之，在各通道2的内部(液滴或油)的折射率比微芯片1的折射率大的情况下，激光束向比排列平面靠上侧散逸。不论在哪种情况下，即使液滴与油的折射率一致，多个通道2的同时照射也变得困难。
图13是表示研究从图12(a)的条件(模锻斜度0度)起使模锻斜度增大时的激光束照射效率的结果的图。其中，微芯片的部件的折射率保持1.53不变，通道内部的液滴和油的折射率都不是1.48而是1.33。模锻斜度定义为从多个通道的排列平面与各通道的侧面所成角度减去90度而得的角度，或者为从通道截面的四边形的底边与侧边所成角度(梯形的底角)减去90而得的角度。●绘点表示No.1的通道的激光束照射效率，○绘点表示No.6的通道的激光束照射效率。模锻斜度为0度时的激光束照射效率与图11中油的折射率为1.33时的激光束照射效率相同。图13的激光束照射效率在模锻斜度0度时左右对称，随着模锻斜度的增大或减少而减少。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使模锻斜度为±1.5度以内即可。另外可知，为了获得能够进行更高灵敏度的荧光检测激光束照射效率0.4以上，只要使模锻斜度为±1.0度以内即可。
作为制作如图12(a)所示的微芯片1的方法，例如可以考虑通过切削来加工下侧基板的槽。但是，这种加工方法不适合量产，具有制造单价变高的缺点。于是，如图12(c)所示，设计了除了上侧基板17、下侧基板18以外还由多个中间基板20来构成微芯片1，并且用粘合面19、21结合的方法。这里，多个中间基板20构成相邻的2个通道2之间的壁和两端的通道2与微芯片1的两侧面之间的壁分布为单独的基板。因此，在进行上述的粘合的结合之前，使各自的中间基板20的侧面以相对于通道的排列平面接近90度、进而将各自的中间基板20的侧面研磨到镜面状是比较容易的。
[实施例1]
根据图12(c)的结构，制作材质为玻璃的微芯片1。将15个通道2在激光束照射位置以200μm间隔排列在同一个平面上。各通道2的截面为边长50μm的正方形，相对于两侧面的排列平面的角度为90±0.5度。对于15种的各个样品，将总体积20微升在油中分割为约60万个体积34皮升的液滴后进行PCR，将各样品的液滴和油通过负压吸引而将液滴以排列成一排的状态导入到上述15个通道2中使之流动。此时，液滴的尺寸在球状的情况下为直径40μm。
在此，根据之前的探讨可知，为了有效地进行基于激光束横向入射的检测，需要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.02≤nd-no≤0.05，优选为-0.01≤nd-no≤0.03。本实施例中，油使用折射率为1.375的信越化学工业株式会社制造的硅油KF-96L-0.65cs。另一方面，液滴通过与PCR试剂一起包含25％的蔗糖，而将其折射率调整为1.375，使其与油的折射率一致。一般认为，在PCR溶液中混入蔗糖是经常进行的，不会妨碍PCR。
本实施例中，对各样品中所含的基因组中的1处或3处的基因突变量进行绝对定量。在1处的基因突变定量的情况下，当在各液滴的内部存在作为对象的基因突变时使PCR的扩增有效，通过激光束照射发出主波段为560～580nm的荧光。另一方面，在3处的基因突变定量的情况下，分别对3处并行地进行PCR，在各自的基因突变存在时独立地使扩增有效，发出不同的荧光。即，用3色的荧光来识别3处的扩增。3色的荧光的主波段为520～540nm、560～580nm和600～620nm。
不含有任何基因突变的液滴产生比较弱的荧光或散射光，所以能够通过上述扩增来识别并检测发出比较强荧光的液滴，并对个数进行计数。为了更高灵敏度地检测这种液滴，能够利用3色的波段的油和液滴的激光束照射所致的拉曼散射光之差。3色的波段的拉曼散射光的强度比率与各荧光的不同，所以能够高精度地识别拉曼散射光和荧光。
图14(a)是排列有多通道的微芯片1的例子的正面示意图。为了简单起见，通道2仅描绘了4个。在各通道2的两端分别设置有入口13和出口14，液滴和油的流动从入口13向出口14的方向进行。本实施例中，微芯片1构成光检测装置的流路部，在各通道2的内部形成流柱。将从激光光源5出射的激光束3从微芯片1的侧面沿通道2的排列平面与各通道的长边方向垂直地导入。通道2的排列间隔构成为在中央的激光束照射位置较密、在两端的入口13和出口14较疏。激光光源5和微芯片1的激光束3照射的区域，构成激光束照射部。
图14(b)是表示为了通过扩大激光束照射位置的在各通道2的内部流动的液滴的间隔来提高检测精度，而增加了对各通道2在入口13与激光束照射位置之间追加油的机构的结构例的示意图。按每个通道2从2处油入口15导入油，从2个方向向各通道2导入油。所追加的油与从入口13导入的液滴和油一起从出口14被排出。
图15是表示光检测装置的整体结构的概略图，表示微芯片1的激光束照射部和光检测部的结构例。在光检测部中，从与排列平面垂直的方向检测通过激光束3的照射而从各流柱的液滴个别地产生的发光。图15(a)是从与各通道2的长轴平行的方向看的图，图15(b)是从与各通道2的长轴垂直的方向看的图。
将从激光光源5出射的波长505nm、输出10mW的激光束3以缩小到直径40μm的状态从微芯片1的侧面沿多个通道2的排列平面入射，对各通道2进行照射。在各通道2中流动的液滴，在横穿照射激光束3的位置时，接受激光束3的激励，发出与PCR相应的荧光。即，如果液滴中含有分析对象的基因突变则发出强的荧光，如果不含则仅发出弱的荧光。从各通道2发出的荧光，由荧光检测光学系统检测。即，通过共用的聚光透镜6变换成平行光束，透过滤光片和衍射光栅7，由成像透镜8在传感器9的传感器面上成像。滤光片是为了在荧光检测时切断作为背景光的激光束3的波长而设置的，作为色散元件的衍射光栅是为了使荧光色散来进行多色检测而设置的。在此，在如进行1处基因突变定量的情况那样并不一定需要进行荧光的多色检测的情况下，能够省掉滤光片和衍射光栅7中的衍射光栅。以下对进行多色检测的情况进行说明。如图15(a)所示，来自不同的通道2的发光荧光，在传感器9的传感器面上的不同位置成像，所以能够识别并检测它们。另一方面，如图15(b)所示，来自各通道2的发光点11的发光荧光，在各通道2的长边方向即与激光束3的光轴垂直的方向上色散而成像，所以能够识别并检测各波长的荧光。
聚光透镜6和成像透镜8各自为了减轻像差的影响来提高成像性，优选为组合透镜。使用市售的单眼反光相机镜头或显微镜用的物镜是有效的。聚光透镜6和成像透镜8可以为相同规格的透镜，也可不同。
在现有的毛细管DNA测序仪等中，利用同样的荧光检测光学系统检测来自多个毛细管的发光荧光，但此处也可以使用二维的CCD传感器或CMOS传感器作为传感器9。在本实施例中，虽然也可以使用同样的二维传感器，但当液滴的流速快时，会有拍摄速度跟不上，产生漏检的液滴的问题。于是，本实施例中替代二维传感器配置了多个一维的线列传感器12。一般来说，二维传感器中，在行方向和列方向上二维配置的传感器中，对于在行方向上一维排列的传感器元件统一进行包括AD转换的数据取得，在列方向上依次转移该步骤来进行全部传感器元件的数据取得。因此，二维传感器的数据取得时间，与曝光时间独立，与一维传感器的数据取得时间相比，与列的数量相应地有时需要数千倍的时间。本实施例中，如图15(b)所示，配置了分别检测3处波段：520～540nm、560～580nm、600～620nm的3个线列传感器12。不仅能够对于各线列传感器的各传感器元件统一进行包括AD转换的数据取得，而且能够对于各线列传感器并行地进行上述数据取得。通过采用以上的结构，能够对于构成各线列传感器12的全部传感器元件进行100kHz的高速数据取得。由此，能够不会遗漏地对以1kHz在各通道2流动的液滴、即在1秒间有千个通过激光束3的液滴进行多色检测。
数据处理部10通过分析传感器9的检测数据，将关于15种样品的作为分析对象的3处基因突变的绝对数量和相对于全基因组的比率导出。以上表示了为了独立地对3处基因突变进行绝对定量而进行3色检测的例子，但一般来说可以为了独立地对N处(N＝1、2、3……)的基因突变进行绝对定量而进行N色检测。或者，即使为M<N的M色检测(M＝2、3、4……)，也能够通过针对每个分析对象使M色的强度比改变来独立地对N处(N＝3、4、5……)的基因突变进行绝对定量。
作为图15的传感器9，使用图17所示的光电倍增管阵列32也是有效的。由此，能够更高速且更高灵敏度地对来自多个通道2的发光荧光同时地进行多色检测。
图16(a)是表示图15所示的微芯片1的激光照射和荧光检测部的结构的变形例的示意图。本例中，激光束横向入射到排列于微芯片的多通道，用各自不同的光纤和不同的光电倍增管来检测来自多通道的发光。作为光检测器，替代线列传感器12，通过使用光电倍增管30，实现比图15所示的光检测装置更高速且更高灵敏度的荧光检测。光电倍增管30的尺寸一般来说比线列传感器12大，所以难以采用与图15(b)同样的光学系统。于是，采用利用光纤28将发光点和光检测器连接的结构。激光束3的照射所致的来自各通道2的发光分别由个别聚光透镜27聚光，入射到光纤28的一端。从光纤28的另一端出射的发光分别再次由个别聚光透镜29聚光，经由滤光片入射到光电倍增管30，被高速且高灵敏度地检测出。由于本结构不具有分光机构，所以在像1处基因突变定量的情况那样进行单色检测的情况下是有效的。在此，尽管能够预先调整各个别聚光透镜27和与它们连接的各光纤的一端的相对位置，但是对不同的微芯片1每次调整各个别聚光透镜27与各通道2的相对位置很麻烦。于是，在各微芯片1设置引导件，使得能够容易地调节各个别聚光透镜27与各通道2的相对位置。
图16(b)表示图16(a)的进一步的变形例，是能够对来自各光纤的出射光进行多色检测的光检测装置的示意图。首先，将个别聚光透镜27不是与光纤28而是与微芯片1一体化，预先调整各通道2与各个别聚光透镜27的相对位置。这种结构能够在微芯片1的制作工序中通过注塑成形等容易地实现。一般来说，各通道2与各个别聚光透镜27之间的相对位置，与各个别聚光透镜27和各光纤28的一端的相对位置相比较来高精度地求取。因此，根据图16(b)的结构，使位置调整整体上变得容易。另外，图16(b)中，为了进行多色检测，在将从各光纤28的另一端出射的发光分别用个别聚光透镜29聚光之后，用分色镜31分割，分别利用不同的光电倍增管30检测出。图16(b)中表示了对各发光进行2色检测的例子，但当然3色以上的多色检测也能够利用同样的结构来应对。
图17是表示将来自多个光纤28的出射光不是像图16那样利用各自不同的光电倍增管30来检测，而是用将多个光电倍增管一体化而成的单个光电倍增管阵列32来检测的光检测装置的例子的示意图。在此使用滨松光子株式会社销售的8通道线性阵列PMT(H9530)。本传感器有8个2.0×2.5mm的检测区域，以2.8mm间隔排列而成。能够以与1通道的光电倍增管30和同等的灵敏度和速度各自独立地检测入射到各检测区域的光。将各光纤28的光出射端以2.8mm间隔排列，将来自各光纤28的出射光分别用个别聚光透镜29聚光，使之入射到不同的检测区域，以1MHz高灵敏度地检测出。通过利用数据处理部10对1MHz的检测数据进行累计处理，进一步提高灵敏度。由于本结构不具有分光机构，所以在像1处基因突变定量的情况那样进行单色检测的情况下是有效的。
图18是表示将图17的结构发展到多色检测的例子的示意图。从激光光源5至个别聚光透镜29的结构与图17相同。图18是从图17的右侧看的图，仅描绘了排列在图17的最右侧的光纤28的光出射端。各光纤28的出射光分别用个别聚光透镜29变为平行光束之后，利用4种分色镜31四分割为在同一方向行进的4色的平行光束。在此，各分色镜31对于各光纤28可以为1个共用的部件。光电倍增管阵列32使用滨松光子株式会社销售的64通道二维阵列PMT(H7546)。本传感器有8×8＝64个2.0×2.0mm的检测区域，以2.3mm间隔排列而成。二维阵列中，将一维设定为多个光纤28的排列方向，将另一维设定为分色镜31形成的平行光束的分割方向，由此独立地以1MHz高灵敏度地对来自多个通道2的发光荧光进行四色检测。在此，源自来自多个通道2的发光的各分割平行光束所入射的检测区域，并不一定要是一个，也可以跨多个检测区域进行。在这种情况下，利用数据处理部10对各平行光束入射的多个检测区域的检测信号进行累计处理是有效的。
图19是图18的变形例，是表示将图18的光纤28和分色镜31的顺序调换而成的光检测装置的结构例的示意图。图19与图18同样是从激光束的照射轴方向看的图，包括微芯片1在内描绘。来自各通道2的激光束照射位置的发光点11的发光荧光分别利用个别聚光透镜27聚光，利用4种分色镜31四分割为在同一方向行进的4色的平行光束，分别入射到不同的光纤28的一端。从各光纤28的另一端出射的发光分别再次由个别聚光透镜29聚光，入射到光电倍增管阵列32的各检测区域，被高速且高灵敏度地检测出。图19的结构与图18相比所需的光纤28的个数成为4倍，但是有光纤28的光出射端与光电倍增管阵列32的检测区域的位置对齐变得容易的优点。
图20是是为了相比图16的情况进一步降低装置成本，而利用1个光电倍增管30独立地检测来自多个通道2的的光检测装置的结构例的示意图。将多个光纤28经由光纤开关33被集成为单个集成光纤34中，并且将来自集成光纤34的出射光利用个别聚光透镜29聚光之后，利用光电倍增管30检测出。光纤开关33具有仅将多个光纤28中的任一个与集成光纤34光学连接，将该光纤28的传输光传输到集成光纤34的功能。在此，通过每0.1毫秒(以10kHz)对多个光纤28依次反复连接，利用单个光电倍增管30分时检测来自多个通道2的发光。
作为光纤开关33的方式，存在使多个光纤28与单个集成光纤34的相对位置机械地滑动来切换光学连接的方式、使来自多个光纤28的出射光分别反射的机械控制微镜的角度来切换入射到集成光纤34的光纤28的方式等。在此，作为光纤开关33，使用能够更高速且稳定的切换的液晶快门阵列。将来自各光纤28的出射光用个别聚光透镜转换为平行光束，分别经由个别的液晶快门入射到不同的光纤。这些光纤在后段被集成为集成光纤34。由于液晶快门通过电控制高速地控制开闭，所以能够高速且容易地切换各光纤28与集成光纤34的光学连接。这种光纤开关由于不需要机械动作，所以也能够获得高稳定性。当利用光纤开关33切换光纤28时，光电倍增管30的检测信号用数据处理部10进行对应，能够独立、高速且高灵敏度地检测来自各通道2的发光。
以上的图15～图20所示的光检测装置的结构例，对以形成于微芯片1的内部的多个通道2的激光照射所致的发光为对象的情况进行了说明，但是这种对象并没有限定，能够对排列了多个发光点的任意的对象发挥同样的效果。本实施例中，特别是以使液滴和油在各通道的内部流动，通过激光照射从液滴发出荧光的情况为对象，但是这些光检测装置的用途并不限定于这样的情况。在高速且高灵敏度地检测来自多个发光点的发光的情况，特别是在进行多色检测的情况下，也发挥同样的效果。
[实施例2]
本实施例的光检测装置，不是在微芯片内部形成多个流柱，而是由多个毛细管的内部空间构成。即，本实施例中，利用整齐排列在排列平面上的多个毛细管构成光检测装置的流路部。
图21是本实施例的光检测装置的概略图。图21表示向多个毛细管16的激光束照射部和荧光检测部的结构例，与实施例1的图15(a)对应。在没有特别说明的情况下，是与实施例1同样的结构、方法。将24个折射率1.46的石英玻璃制的毛细管16在空气中排列在排列平面上。在毛细管16内，分散在油中的多个液滴形成沿线状的流移动的流柱。对各毛细管16从左侧起依次附加No.1～No.24的毛细管编号。在毛细管的外径为100～323μm、内径为10～50μm、激光束照射位置的排列间隔为150μm或370μm的范围对激光束横向入射有效的条件进行了探讨。本实施例中，激光束照射部由激光光源5和激光束3照射多个毛细管16的区域构成。另外，光检测部设置在与毛细管的排列平面垂直的方向。
对于24种的各个样品，将总体积20微升在油中分割为约60万个体积34皮升的液滴后进行PCR，将各样品的液滴和油通过负压吸引而将液滴以排列成一排的状态导入到上述24个毛细管16中使之流动。此时，液滴的尺寸在球状的情况下为直径40μm。将24个毛细管的一端直接插入到PCR后的24种样品溶液，利用另一端进行吸引，由此简化装置。
在此，根据之前的探讨可知，为了有效地进行基于激光束横向入射的检测，需要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.02≤nd-no≤0.05，优选为-0.01≤nd-no≤0.03。本实施例中，油使用通过在折射率1.29的3M公司的Fluorinert FC-43微量混合高折射率物质而制备出的折射率1.33的油。另一方面，液滴使用折射率1.33的标准的PCR溶液，使之与油的折射率一致。另外，为了使液滴在油中稳定化，将作为表面活性剂的RainDance Technologies公司的EA-surfactant混合1％到油中。
对于空中的24个毛细管排列的激光束横向入射，进行与图2～图8同样的激光束光线追踪模拟。在图22、图25和图28所示的激光束光线追踪模拟的结果中，为了使每个毛细管容易看到，对各毛细管的外径描绘了轮廓。
图22(a)是表示外径323μm、内径50μm、排列间隔370μm且用折射率1.41的溶液充满毛细管内部时的结果的图。横向入射的激光束为直径50μm。本条件与市售的毛细管DNA测序仪的条件相同，多焦点方式起作用，能够进行使横向入射的激光束穿刺状地贯通所有毛细管的照射。这是从毛细管阵列的左侧进行激光束横向入射的结果，而将其扩展到将激光束二分割为强度各为50％，将它们从毛细管排列的左右两侧横向入射时的情况求得的各毛细管的激光束照射效率的结果在图23中用△绘点表示。
如图22(a)所示，即使在多焦点方式起作用的情况下，激光束因在各毛细管的外表面的反射损失而随着毛细管编号的增加激光束照射效率降低，但是如上所述通过使激光束从毛细管排列的两侧横向入射，各自衰减抵消，能够对各毛细管得到比较均匀的激光束照射效率。根据图23的△绘点的结果，24个毛细管的激光束照射效率的平均值为47％，CV值为11％，可知效率和均匀性两者都极为优秀。在排列于中央的毛细管编号12或13的毛细管，激光束照射效率为最小的42％。即，只要各毛细管的激光束照射效率为0.4以上，就能够实现与市售的毛细管DNA测序仪同等以上的高灵敏度的荧光检测。此外，根据经验可知，如果各毛细管的激光束照射效率为0.2以上，则能够得到实用水平的荧光检测灵敏度。
图22(b)是表示从图22(a)的条件将毛细管内部的溶液的折射率从1.41降低到本实施例的条件的1.33时的结果的图。相比各毛细管的玻璃部分的凸透镜作用，内部的凹透镜作用胜出，多焦点方式变得不起作用，激光束从毛细管排列平面的发散变得显著。图23的▲绘点表示用与△绘点同样的方法求取的激光束照射效率。激光束照射效率急剧降低，变为平均值17％、CV值78％，效率和均匀性都大幅劣化，可以认为是对24个毛细管的同时照射不适当的条件。
为了解决上述明显出现的新的课题，如图22(c)～(f)所示，通过使毛细管的外径减少到300μm、250μm、200μm和150μm，来增大玻璃部分的凸透镜作用。其他条件与图22(b)相同。其结果是，如预计的那样，随着外径的减少，多焦点方式变得起作用了。图23的□绘点、■绘点、○绘点和●绘点分别是对外径300μm、250μm、200μm、和150μm同样求得激光束照射效率的结果。根据图23可知，通过使各毛细管的外径小于250μm，多焦点方式急剧地起作用。即，可知，能够同时、高速且高灵敏度地对来自在24个毛细管流动的大量的液滴的发光荧光进行多色检测。
图24是表示对上述进行更详细的探讨的结果的图，对毛细管编号12的毛细管表示了毛细管的外径和激光束照射效率的关系。可知，在毛细管的外径从250μm减少到200μm的过程中多焦点方式变得起作用，激光束照射效率急剧提高。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使毛细管的外径为227μm以下即可。
图25是表示对于外径150μm、内径10μm～50μm、排列间隔150μm且内部用折射率1.33的溶液充满的24个毛细管的空中排列的激光束横向入射进行了同样的激光束光线追踪模拟的结果的图。图25(a)是内径50μm时的结果，与图22(f)的不同点在于排列间隔从370μm缩小到150μm。图26的●绘点是同样计算此时的激光束照射效率的结果，平均值为46％、CV值为12％与图23的●绘点同等，可知效率和均匀性两者都极为优秀。
图25(b)、(c)、(d)、和(e)分别是表示从图25(a)的条件将内径缩小到40μm、30μm、20μm和10μm时的结果的图。随着内径的缩小，这次毛细管的内部的凹透镜作用变强，多焦点方式再次变得不起作用，激光束从毛细管排列平面的发散变得显著。图26的○绘点、■绘点、□绘点和▲绘点分别是对内径40μm、30μm、20μm和10μm同样求得激光束照射效率的结果。根据图26可知，通过使各毛细管的内径大于30μm，能够使多焦点方式起作用。即，可知，能够同时、高速且高灵敏度地对来自在24个毛细管流动的大量的液滴的发光荧光进行多色检测。
图27是表示对上述进行更详细的探讨的结果的图，对毛细管编号12的毛细管表示了毛细管的内径和激光束照射效率的关系。可知，在毛细管的内径从30μm增大到40μm的过程中多焦点方式变得起作用，激光束照射效率急剧提高。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使毛细管的内径为34μm以上即可。
图28是表示对于外径100μm、内径10μm～50μm、排列间隔150μm且内部用折射率1.33的溶液充满的24个毛细管的空中排列的激光束横向入射进行了同样的激光束光线追踪模拟的结果的图。相比图25的情况，通过将毛细管的外径进一步缩小，进一步增强了玻璃部分的凸透镜作用。图28(a)是表示内径50μm时的结果的图，与图25(a)的不同点在于外径从150μm缩小到100μm。图29的●绘点是同样计算此时的激光束照射效率的结果，平均值为46％、CV值为12％与图26的●绘点同等，可知效率和均匀性两者都极为优秀。
图28(b)、(c)、(d)和(e)分别是表示从图28(a)的条件将内径缩小到40μm、30μm、20μm和10μm时的结果的图。随着内径的缩小，这次毛细管的内部的凹透镜作用变强，多焦点方式再次变得不起作用，激光束从毛细管排列平面的发散变得显著。图29表示○绘点、■绘点、□绘点和▲绘点分别是对内径40μm、30μm、20μm和10μm同样求得激光束照射效率的结果。根据图29可知，通过使各毛细管的内径大于20μm，能够使多焦点方式起作用。即，可知，能够同时、高速且高灵敏度地对来自在24个毛细管流动的大量的液滴的发光荧光进行多色检测。
图30是对上述进行更详细的探讨的结果的图，表示毛细管的内径与毛细管编号12的激光束照射效率的关系。可知，在毛细管的内径从20μm增大到30μm的过程中多焦点方式变得起作用，激光束照射效率急剧提高。可知，为了获得实用水平的荧光检测灵敏度所需的激光束照射效率0.2以上，只要使毛细管的内径为25μm以上即可。像这样，用于使多焦点方式起作用的内径的阈值比图27的情况缩小，是为了通过外径的缩小来增强凸透镜作用。
图22～图30的结果显示，在各毛细管的玻璃部分的凸透镜作用和内部的凹透镜作用的平衡在倾向于凸透镜一方的情况下，多焦点方式起作用。凸透镜作用是外径越小越强，凹透镜作用是内径越小越强，所以通过使外径/内径之比小于一定值能够使多焦点方式起作用。根据图24的结果可知，只要使外径/内径之比为227/50＝4.5以下即可。根据图27的结果可知，只要使外径/内径之比为150/34＝4.4以下即可。根据图30的结果可知，只要使外径/内径之比为100/25＝4.0以下即可。即，可知，外径/内径之比优选为至少4.5以下，更优选为4.0以下。
本实施例中进行处理的1个液滴在球状的情况下尺寸为直径40μm。现有的ddPCR的荧光检测部中，通道短轴宽度(毛细管内径)＞液滴直径。例如，如果使用内径为50μm的毛细管则满足上述条件，能够良好地进行液滴的荧光检测。但是另一方面，有时通过使通道短轴宽度(毛细管内径)＜液滴直径来发挥新的效果。例如，通过使用内径30μm的毛细管，液滴在毛细管内部成为被压扁的状态，液滴的界面的曲率变得比液滴为球时的曲率小。此时，液滴对于激光束的透镜作用变小，所以在检测在多个通道或毛细管流动的液滴方面是有利的。
[实施例3]
本实施例的光检测装置，形成于与多个通道相同的微芯片内部。在没有特别说明的情况下，是与实施例1同样的结构、方法。微芯片采用折射率1.53的环烯烃聚合物(COP)。对于多种的各个样品，将总体积20微升在油中分割为约500万个体积4皮升的液滴后进行PCR，将各样品的液滴和油通过负压吸引而将液滴以排列成一排的状态导入到24个通道中使之流动。此时，液滴的尺寸在球状的情况下为直径20μm。
在此，根据之前的探讨可知，为了有效地进行基于激光束横向入射的检测，需要使液滴的折射率nd与油的折射率no之差nd-no为-0.02≤nd-no≤0.05，优选为-0.01≤nd-no≤0.03。本实施例中，油使用折射率为1.33的Bausch&Lomb公司制造的Perfluoro-phenanthrene Aqsia。另一方面，液滴使用折射率1.33的标准的PCR溶液，使之与油的折射率一致。另外，为了使液滴在油中稳定化，将作为表面活性剂的Dolomite Microfluidics公司的Pico-Surf1混合1％到油中。
如图31所示，在现有的ddPCR装置的荧光检测部中，使大量的液滴4在通道22中排成一排流动，进而在通道中追加油由此扩大液滴间隔使之在宽度大的通道2内流动，通过对通道2照射激光束3来依次照射各个液滴4，依次测量来自各个液滴的发光荧光。在位于比激光束3的照射位置更靠流的上游的通道22，大量的液滴排列一排，但其间隔较密。当从两个方向从连接的通道23对通道22追加供给油时，在通道2中，大量液滴保持排列成一排，并且排列间隔变疏。在通道22和23与通道2的中间存在通道24。通道2的短轴宽度大于通道22的短轴宽度。通道24的短轴宽度与通道22的短轴宽度同等或比它小。它们的结构形成于同一微芯片的内部。
以下探讨排列多个通道22以激光束横向入射进行照射的结构。图32、图33为了简单仅描绘了3个通道22，当然个数并不限于3个。
如图32(a)所示，将图31的结构在同一微芯片的内部并排，且对多个通道2应用激光束横向入射。图32(b)是表示与图32(a)的激光束3的照射位置的各通道2的长轴垂直的截面图。如图32(b)所示，与图12(b)同样，各通道2的截面为梯形形状，所以激光束3在通过各通道2的侧面时在一个方向上受到折射，会从通道2的排列平面散逸。即，可知在图32的结构中，难以统一检测在多个通道2流动的液滴。
于是，如图33所示，去除激光束3的照射位置的各通道2之间的分隔壁，将多个通道2汇合到单个汇合通道25中。汇合通道25的激光束3的中心轴方向的宽度比多个通道22的宽度的总和大。在同一微芯片的内部制作这种结构通过注塑成形等量产性的方案是可能的。在本例的情况下，由设置有单个汇合通道25的微芯片构成光检测装置的流路部，分散于油中的多个液滴在汇合通道25内沿线状的流移动的流柱被保持有多排。通过在同一个平面上形成多个通道22，能够使从各通道22流出而形成在汇合通道25内的多个流柱排列在排列平面上。另外，多个流柱在汇合通道25的内部具有照射激光束3的部分。
根据这样的结构，能够避免在图32成为问题的各通道2的侧面的激光束3的折射，所以激光束3在汇合通道25的内部在排列有多个流柱的方向行进，能够对从各通道22和24流出的流柱的液滴进行照射和荧光检测。但是，由于存在激光束3在汇合通道25的入射侧面折射的情况，所以通过使激光束3相对于通道22的排列平面从平行倾斜地入射到流路部的汇合通道25，调节成在汇合通道25的内部使激光束3与流柱的排列平面平行是有效的。
在此，如图33所示，使从各通道22和24流出的流柱的液滴4在汇合通道25中彼此不混合、即在汇合通道25中也是从各通道22和24流动的液滴各自保持排列成一排而在设置于汇合通道25的排列平面上流动是很重要的。为此，需要在汇合通道25的内部使液滴和油成为层流。
图34是表示具有流路部即汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图。在图33所示的结构的情况下，汇合通道25的激光束3的中心轴方向的宽度，比图32的各通道2的激光束3的中心轴方向的宽度的合计大。为了在该条件下维持层流，在图33中从通道23供给的油量，必须必图32的情况多，层流的控制也较困难。于是，如图34所示，从与各通道22的排列平面垂直的2个方向连接通道23，从该2个方向追加供给油。图34(a)是从与通道22的排列平面垂直的方向看的图，图34(b)是从与排列平面平行的方向看的图。根据这样的结构，能够使各通道22的间隔比图32或图33的情况缩小，其结果是，能够使汇合通道25的激光束3的中心轴方向的宽度比图33的情况缩小。于是，各通道23不必一定需要与各通道22的排列平面垂直，也可以相对于排列平面倾斜。总之，只要是能够缩小各通道22的排列间隔的结构即可。图34中，汇合通道25的激光束3的中心轴方向的宽度与图32的各通道2的激光束3的中心轴方向的宽度的合计相等。即，图34中从通道23供给的油量可以与图32的情况相等，层流的控制能够与图31或图32同样地进行。
图35是表示具有汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图，表示图34的变形例。分散于油中的多个液滴沿线状的流移动的流柱，在汇合通道25内的排列平面上被保持有多排。通过使追加供给油的通道23从与各通道22的排列平面垂直的一个方向接近，并在排列平面上弯折成直角，来与各通道22连接。图35(a)是从与各通道22的排列平面垂直的方向看的图。图35(b)是图35(a)的通道23和通道22的连接部的截面图。即，根据图35的结构，与图33同样，能够在与各通道22内的液滴4和油的流的方向垂直的方向追加油，并且与图34同样，能够缩小各通道22的排列间隔。
图36是表示通过使图32的通道23的结构与图34相同，来缩小通道2的排列间隔的结构例的示意图。即，各通道22中，从与通道22的排列平面垂直的方向供给油。与图32同样，各通道2不汇合而保持分离。在这样的结构的情况下，虽然不能避免图32(b)所示的激光束3的各通道2的侧面的折射的影响，但是由于通道2的排列间隔缩小，所以具有激光束3在从排列平面散逸之前能够照射的通道2的数量增大的效果。
图37是表示具有汇合通道的微芯片的另一结构例的示意图，表示图34的变形例。各通道22分别由毛细管构成，在汇合通道25的内部从各毛细管流出的液滴4的多个流柱在排列平面上移动。图37(a)是从与通道22的排列平面垂直的方向看的图，图37(b)是从与排列平面平行的方向看的图。在各通道22的内部流动的液滴4和油从各通道22的末端被排出到汇合通道25而形成流柱的同时，从通道26供给的油包围各通道22的周围而在与流柱相同的方向流动。其结果是，与图34的情况同样，从各通道22排出的液滴4不会彼此混合，分别形成流柱而保持排列成一排在排列平面上移动。即，在汇合通道25的内部，调节成液滴和油成为层流。
[实施例4]
本实施例中，表示将本发明应用于ddPCR以外的分析方法。将作为样品的体积1毫升的大容量的试样中所含的大肠杆菌的个数进行数字计数。将1毫升试样在油中分割成34皮升的液滴越3千万个，另一方面将1毫升的试剂在油中分割成34皮升的液滴越3千万个，分别一对一混合，制作出68皮升的液滴约3千万个。这能够使用现有技术的微芯片设备来进行。在微芯片设备中，将在通道α中流动的试样的1个液滴、在通道β中流动试剂的1个液滴在统一了通道α和通道β的通道γ中混合的工序，对大量的液滴连续地进行。此时，混合的各液滴的尺寸在球状的情况下为直径50μm。试剂包括溶解大肠杆菌的酶和当大肠杆菌的降解产物结合时发出荧光的DNAzime传感器。另外，为了确认不包含大肠杆菌的液滴的存在，在上述试剂中混合了一定浓度的具有与上述不同的发光波长的荧光体。由此，所有的液滴含有同种且等浓度的荧光体，能够对所有的液滴进行数字计数。
将制作出的液滴组转移到样品容器，在室温下放置2小时，由此进行大肠杆菌的溶解及其降解产物与DNAzime传感器结合的反应。之后，在图34所示的流路部和激光束照射部的结构中，在排列有100个通道22的微芯片上，将上述液滴组分割成100份导入到通道22并使之流动。接着，在汇合通道25中，通过使激光束3横向入射，并行地照射从各通道22排出而形成各个流柱的多个液滴，从与流柱的排列平面垂直的方向同时检测出发光荧光。
液滴的检测速度对于各通道22为1kHz，即1秒间检测1000个。假如仅对1个通道进行检测，则检测所有的3千万个液滴需要8小时以上。本实施例中，由于使用100个通道能够以同等的检测速度并行检测，所以仅用5分钟就能够检测3千万个液滴。
另外，本发明并不限定于上述的实施例，也包括各种变形例。例如，上述实施例是为了易于理解地说明本发明而详细说明的，并不限定于必须包括说明的所有结构。此外，能够将一个实施例的结构的一部分替换到另一个实施例的结构，此外，还能够在一个实施例的结构中加入另一个实施例的结构。此外，能够对各实施例的结构的一部分进行其它结构的追加、删除、替换。
附图标记说明
1 微芯片
2 通道
3 激光束
4 液滴
5 激光光源
6 聚光透镜
7 滤光片和衍射光栅
8 成像透镜
9 传感器
10 数据处理部
11 发光点
12 线列传感器
13 入口
14 出口
15 油入口
16 毛细管
17 上侧基板
18 下侧基板
20 中间基板
22 通道
25 汇合通道
27 个别聚光透镜
28 光纤
29 个别聚光透镜
30 光电倍增管
31 分色镜
32 光电倍增管阵列
33 光纤开关
34 集成光纤。

Claims (20)

1.一种光检测装置，其特征在于，包括：
折射率no的油；
折射率nd的液滴，所述油的折射率no与所述液滴的折射率nd之差为-0.02≤nd-no≤0.05；
在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在所述油中的多个所述液滴沿线状的流移动而形成的；
激光束照射部，其在所述流路部的所述多排流柱所排列的方向上导入激光束，对所述多排流柱进行照射；和
光检测部，其从与所述排列平面垂直的方向检测因所述激光束的照射而从所述多排流柱产生的发光。
2.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述油的折射率no与所述液滴的折射率nd之差为-0.01≤nd-no≤0.03。
3.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述液滴的折射率nd为nd＝1.33，
所述油的折射率no为1.30≤no≤1.34。
4.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱形成于排列在微芯片内的所述排列平面上的多个通道的内部，
所述多个通道的截面形状为四边形，所述激光束所透射的侧面与所述排列平面所成角度在90±1.5度的范围内。
5.如权利要求4所述的光检测装置，其特征在于：
所述多个通道在所述照射的所述激光束的光轴方向的宽度小于所述液滴为球状时的球的直径。
6.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，
所述多个毛细管的外径为227μm以下。
7.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，
所述多个毛细管的内径为25μm以上。
8.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，
所述多个毛细管的外径相对于内径的比率为4.5以下。
9.如权利要求6所述的光检测装置，其特征在于：
所述多个毛细管的内径小于所述液滴为球状时的球的直径。
10.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱在设置于微芯片内的单个通道的内部具有要被所述激光束照射的部分。
11.如权利要求10所述的光检测装置，其特征在于：
所述多排流柱在排列于所述微芯片内的同一个平面上的多个通道的内部具有比要被所述激光束照射的部分靠流的上游的至少一部分，
所述单个通道在所述激光束的中心轴方向的宽度大于所述多个通道的宽度的总和。
12.如权利要求11所述的光检测装置，其特征在于：
连接有对所述多个通道的每一个追加供给油的通道。
13.如权利要求12所述的光检测装置，其特征在于：
所述油的追加供给的方向相对于所述同一个平面倾斜。
14.如权利要求12所述的光检测装置，其特征在于：
所述油的追加供给的方向与所述同一个平面垂直。
15.如权利要求10所述的光检测装置，其特征在于：
导入到所述流路部的激光束的中心轴相对于所述排列平面倾斜。
16.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述光检测部具有多个线列传感器。
17.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述光检测部具有波长色散元件和多个线列传感器，利用彼此不同的线列传感器检测波长不同的发光。
18.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
所述光检测部具有多个光电倍增管或单个光电倍增管阵列。
19.如权利要求18所述的光检测装置，其特征在于：
由所述多个光电倍增管或所述单个光电倍增管阵列经由彼此不同的光纤检测从各流柱产生的发光。
20.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：
各液滴含有同种且等浓度的荧光体。
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