JP2009017892A - 細胞取扱装置、組織再生用組成物及び組織再生方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】流動性媒体と、当該流動性媒体中に浮遊する細胞の足場となる粒子形状の細胞足場粒子とを有し、前記細胞足場粒子は生体吸収性材料からなるとともに、当該細胞足場粒子は細胞接着性を有する構成の組織再生用組成物とする。
【選択図】図10
Description
ところで、このような目的を達成するための研究をする中で、以下に挙げる課題があることもわかったので、本発明では、これらの課題を解決することも目的としている。
具体的には、多くの細胞は足場に接着しなければ生存・増殖できないので、細胞は足場となる培養容器の壁面に接着している。このため、細胞を生体移植する際には、容器表面に貼り付いた細胞を剥離する必要が生じる。この細胞を物理的に剥離したり、トリプシンやEDTA等の薬剤を用いて剥離することもできるが、これらの操作は、細胞に対して悪影響を及ぼす可能性がある。また、このような細胞の操作は、設備の整った施設で高度な技術を持った者以外では実施が難しい。
従って、本発明は従来に比べて簡便な構成でありながら汚染を防ぎつつ良好に細胞を保存でき、且つ、細胞移植治療において、容器から細胞を剥離する処理を行うことなく、容易に当該細胞を生体へ注入することの可能な細胞取扱装置を提供することも目的とする。
本目的を達成するため、本願発明者らは、本発明の細胞取扱器具として、細胞を含有した流動性の取扱対象物を液密に貯留可能な細胞取扱装置であって、少なくとも、前記細胞と接触する部位の少なくとも一部において、細胞の生存に必要な量のガス(呼吸のための酸素ガス、pH維持のための炭酸ガスなど)を透過させる領域が設けられている構成とした。
本発明におけるガス透過性領域とは、酸素透過度が0.1mL/cm2・24hr・atm以上の領域である。ガス透過性領域の面積についてはとくに制限はないが、細胞取扱装置が細胞懸濁液と接触する部分における総酸素透過量が、1mL/24hr・atm以上であることが、細胞に必要な酸素を十分に供給する上で好ましく、とくに好ましいのは10mL/24hr・atm以上である。
一方、比較的優れたガス透過性を有する材料を用いる場合には、前記細胞取扱装置の全体をこの材料で構成する必要は無く、少なくとも細胞貯留部分において、細胞懸濁液と接触する内壁に部分的に設ければよい。この場合、矩形状、円形状などの形状で、所定の面積を有する領域として形成すれば良い。
前記本体部の一部にガス透過性領域を設ける場合に、優れたガス透過性を有するもの例として、多孔質膜が挙げられる。この多孔質膜では孔径を制御することで、液密性を維持することが可能であるので、液密を確保できる程度の孔に加工した膜を用いれば、比較的小さな面積であっても十分なガス透過量を確保することができることが解かっている。
シリンジタイプの細胞取扱装置の場合に、細胞を貯留する本体部の形態としては、筒状の容器(外筒体)に直接細胞を貯留する形態のもの、及び押圧力の作用によって、内部空間が縮小可能な蛇腹形状のもの、バック状のもの、チューブ形状などいわゆる袋状の容器を外筒体に収納した形態のものが挙げられる。前者の場合には、外筒体、液密性を確保するためのキャップ、押し子などにガス透過性領域を形成することが望ましい。後者の形態の場合、内部に収納した容器の少なくとも一部にガス透過性領域を形成することで、細胞へのガス供給が可能となり、そして、特に、後者の場合、袋状の容器を外筒体に収納した状態において、袋状の容器内と装置外部との間でガス交換が可能なよう、袋状の容器以外の部分(押し子や、外筒体などの部位)においてガス透過性領域を形成することが望ましい。また、袋状の容器は、着脱自在として、装着した状態での細胞の保存・培養はもとより、脱離した状態での細胞の保存・培養を実施することもできる。この容器自体が、液密なものであると同時にガス透過性を備えるからである。
このように細胞取扱装置の内面の細胞接着性を低減することで、保存中に細胞が細胞取扱装置壁面に接着するのを抑制することができる。これによって、再生医療の現場では以下のような効果が得られる。
ここで、細胞を人体に移植する場合、培養液に細胞を懸濁したものを人体に移植する手法が一つの試みとしてあるが、この手法では、流動性が高いため細胞が流れてしまい、細胞が移植部位に巧く生着し難い。この問題を解決するために、細胞が流れてしまわないように、移植用細胞を分散用マトリックス(高粘性溶液、例えばゼラチン、コラーゲンなど)に分散して得られた懸濁液(高粘性溶液)を患部に移植する方法が試みられているが、この手法では、分散用のマトリックスが障壁となって移植部位に巧く生着しない。しかし、上記した組織再生用組成物は、粒子の表面に細胞が接着するものであるので、細胞移植を試みた場合、このような問題が生じにくく、良好に細胞が生着することが判っている。
そして、このような細胞培養粒子からなる組織再生用組成物を、上述したシリンジ仕様を有する細胞取扱装置中に保存しておけば、移植時には、当該細胞取扱装置から容易且つ迅速に生体に細胞を移植することができる。このため、例えば体力に乏しい乳児や老人等の患者の手術を軽減することができるなど、その他、再生治療において患者の負担を減らすことが可能である。
本発明の組織再生方法においては、基本的に以下のステップが含まれる。
i.生体から細胞を採取する採取ステップ
まず、特定の細胞を生体より採取する。
ii.分離・純化ステップ
採取した細胞をFACS(フローサイトメトリー)等により分離・純化する。
その後、細胞を細胞取扱装置に保存する。
iv.増殖ステップ
細胞を保存した細胞取扱装置を細胞培養設備(CPC)等において保存する。そして当該細胞培養設備等において、細胞取扱装置中の細胞を増殖及び必要に応じて分化誘導させる。
上記細胞取扱装置を用い、増殖及び分化誘導させた細胞を生体に移植する。
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ここで、iiiからvのステップにおいて、以下の実施の形態1〜8に示すようなシリンジタイプの細胞取扱器具を用いることによって、保存・運搬・増殖・移植の再生医療の全ての工程において、同じ装置による一環した取り扱いが可能となるので、細胞を他の容器に移し替えなくても良く、次の工程に、安全且つ迅速に進むことができ、迅速な治療が可能となる。
特に、再生医療の現場における細胞の移植時にはその有用性が高く、通常の医療用シリンジと同様に操作し、保存した細胞を生体に移植することができる。このため、高度且つ熟練した技術を持つ者に限らず、容易に且つ迅速に細胞移植を行うことができる。また、細胞を保存しながら搬送することもできる。
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また、実際の再生医療の現場では、各ステップを行なう場所が、互いに離れている場合も多いが、本発明の細胞取扱装置は、液体を密封して取り扱うこともできるので、離れた場所に細胞を搬送するのにも適している。
ここで、細胞懸濁液には、再生医療の治療用途などに用いられる各種細胞を含ませることができる。細胞には、治療の目的に応じて前述した様々な細胞種を使用することが可能である。当該細胞種に特に制限はなく、具体例には胚性幹細胞(embryonic stem cells;ES細胞)、胚性生殖細胞(embryonicgerm cells;EG細胞)、体性幹細胞(adult stem cells;AS細胞、成人幹細胞とも言う)、間葉系幹細胞、神経幹細胞、血管内皮幹細胞、造血系幹細胞、肝幹細胞等の幹細胞の他に、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞、毛母細胞、血球細胞等の分化した細胞またはその前駆細胞を挙げることができる。このように、胚性幹細胞を始め、各分化の度合いが異なる幹細胞や、各組織に分化した細胞を用いることができる。中でも、接着性細胞を用いる場合、細胞非接着性を細胞取扱装置に付与したり、微粒子状の足場を用いることが有効になる。接着性細胞は、増殖・分化の際の足場を必要とするからである。
すなわち、培養細胞にヒト間葉系幹細胞(human mesenchymal stem cell)を用いる場合、440mLのhuman mesenchymal stem cell basal medium(POIETICS社,米国)にmesenchymalcell growth supplement(50mL)、L−Glutamine(10mL)、penicillin/streptomycin(0.5mL)を添加して培養液とすることができる。
以下、シリンジ仕様の細胞取扱装置を用いて、細胞懸濁液を保存する場合について詳細に説明する。
1.本発明の細胞取扱装置に関して
(実施の形態1)
1−1.シリンジ型細胞取扱装置1の構成
図1は、本発明の細胞取扱装置の一例である実施の形態1のシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す図である。図1(A)は斜視図、図1(B)は側面図、図1(C)は図1(B)のX−X’断面図である。
図1に示されるシリンジ型細胞取扱装置1の構成は、大きく分けてシリンジ本体部2、プランジャ(押し子またはピストンとも称する)40等からなる。シリンジ本体部2の中には細胞懸濁液100が貯留されている。
筒状体3は、前端側面には円盤状の天面110と、そこにルアー部120が突出するように形成されている。ルアー部120の先端は、通常はキャップ60が施される。シリンジ本体部2の後端12側からはプランジャ40が挿入され、これによってシリンジ本体部2内部が液密に封止される。なおルアー部120はこの他に内部を樹脂などで封止し、使用時(細胞移植時)に封止を破るようにしてもよい。
プランジャ40は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等の材料を射出成形してなり、十字断面形状の本体42の両端に、径方向に広がる円盤状の端部が形成された構造を持つ。前記端部の一方はシリンジ本体部2内部に軸方向に挿入されるプランジャヘッド部43であって、他方の端部はユーザが指で押圧し、プランジャ40をシリンジ本体部2内部に押し込むための押圧端部41である。
(細胞非接着性材料について)
ここで、「細胞が接着しにくいか否かの評価」言い換えると「細胞非接着性の有無についての評価」は、例えばフォーカルコンタクト(接着斑)を形成する加担タンパク質を免疫学的手法によって検出することや、細胞付着数を計数することで行うことができる。
また表面に負電荷を有する材料としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、スチレンスルホン酸、アルギン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸またはデルマタン硫酸を表面に結合した材料を挙げることができる。これらの中でも、表面にカルボキシル基を有する材料がとくに好ましい。当該材料の表面は平滑な方が細胞の非接着性に優れるので好ましい。
なお、当該細胞非接着性材料を用いて細胞と接触するガスケット部分を構成することが望ましい。
筒状体3の周壁30には、筒状体3の厚み方向に貫通する貫通孔が設けられている。ここでは図1(A)に示すように、当該シリンジ軸方向を長手方向とする短冊状スリット31が複数(ここでは4本)としているが、この短冊状スリット31は貫通孔の形状の一例であって、その形状及び個数はこれに限定するものではない。
上記ガス透過性材料としては、細胞懸濁液100に対しては非透過性の(すなわち液密に保持できる)ガス透過性樹脂を用いることができる。このガス透過性樹脂は、例えばシリコーン樹脂、ポリ−4−メチル−1−ペンテン(P4M1P)、ポリイソプレン、ポリブタジエン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、低密度ポリエチレン及びポリスチレン等である。これらのガス透過性材料は、プラスチック材料の中では比較的良好なガス透過性を有しているが、厚さが増すとガス透過性が低下する。このためガス透過膜20の肉厚は、通常は200μm以下の厚みであることが望ましく、特に100μm以下であることが好ましい。
ここで、上記ガス透過膜20の材料として、多孔質膜材料である前記疎水性材料等を用いるか、もしくは前記ガス透過性樹脂材料のシリコーン樹脂、ポリエチレンやポリスチレンを用いることによって、ガス透過膜20にガス透過性と、細胞非接着性の両方の性能を持たせることができるので更に望ましい。前記疎水性材料には、細胞非接着性を呈するものが多く見られる。
1−2.シリンジ型細胞取扱装置1の効果
実施の形態1のシリンジ型細胞取扱装置1は、筒状体3が細胞懸濁液100に対して非透過性の材料からなり、その周面30にスリット31が形成され、当該領域に細胞懸濁液100に対して非透過性で且つガスに対して透過性を有する性質を持つ材料でガス透過性領域21が形成されている。これにより、筒状体3はガス透過性である必要はないので、上記した各種材料を用いて、通常の射出成形等の工程により容易に作製できる。また、シリンジとして必要な剛性と強度を確保することも容易である。
更にシリンジ型細胞取扱装置1は、医療用シリンジ仕様に作られているので、再生医療における使用時にはルアー部120の先端のキャップ60を外し、ルアー部120と針、血管留置カテーテルまたはその他の導管を接続する。そして、プランジャ40の押圧端部41を指で押し込むだけで細胞を生体内に注入することができる。従って、通常のシリンジの操作とほぼ同様の操作で、煩雑な操作を必要とせず、高度な技術を有する熟練した者でなくても細胞を生体の患部に注入することができ、容易且つ迅速に再生医療を実施することができる。
また、シリンジ型細胞取扱装置1は、シリンジ本体部2の筒状体3及びガス透過膜20の一方又は両方を細胞非接着性材料から構成した場合、細胞懸濁液100と接触する内壁の一部或いは全体において細胞は貼り付かない。これにより細胞は、培養液中に浮遊した状態で保存されるので、シリンジ型細胞取扱装置1から細胞を生体に移植する際においては、細胞を筒状体3の内壁から剥離処理する工程が不要となり、その分工程の煩雑さをなくすことが可能である。また、細胞が培養液中で浮遊しているので、プランジャ40を押し込むだけで細胞を培養液とともにスムーズにシリンジ型細胞取扱装置1内部から生体へ移植させることができる。
なお、一般的に細胞は培養液(或いは培地)とともに培養保存するが、本実施の形態1のシリンジ型細胞取扱装置1を利用して、細胞懸濁液ごと生体にそのまま注入する場合には、生体に安全な組成の培養液を選ぶ必要がある。
(実施の形態2)
図2は、本発明の細胞取扱装置の一例である実施の形態2のシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す断面図である。実施の形態1との違いは、シリンジ本体部2において、筒状体3の周壁に貫通孔を設けないかわりに、当該筒状体3の天面1100にガス透過性領域が形成されている点にある。このガス透過性領域は、具体的には、シリンジ本体部2を成形する際に、天面1100部分だけをガス透過性材料で形成してもよいし、天面1100に貫通孔を開設し、当該貫通孔を覆うようにガス透過膜を溶着或いは接着により液密に配設することにより形成してもよい。
このような構成を有する実施の形態2のシリンジ型細胞取扱装置1によっても、実施の形態1とほぼ同様の効果(ガス交換性、細胞懸濁液100からの気泡除去、及び容易且つ迅速に細胞移植できる等の効果)が奏される。
更に本実施の形態2のシリンジ型細胞取扱装置1では、実施の形態1とは異なり、シリンジ本体部2の円筒状の内壁には貫通孔が設けられていないので、気泡除去操作を行う際には、ルアー部120を上方に向けてプランジャ40をシリンジ本体部2内部からルアー部120側に押し込むようにすると、容易に気泡を天面1100近傍に集め、液漏れを最小限に抑えながら当該気泡を天面1100より容易に除去することができるので望ましい。これにより、細胞懸濁液100中の気泡の混入を防ぎつつ細胞を良好に生体側へ移植することができるといった効果も奏される。
また、プランジャヘッド44を細胞非接着性材料で構成し、細胞が貼り付かないように工夫することも望ましい。
図3は、本発明の細胞取扱装置の実施の形態3におけるシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す断面図である。上記実施の形態1及び2との違いは、シリンジ本体部2が従来のシリンジの本体と同様の筒状体で構成され、プランジャヘッド44がガス透過性材料で構成されている点に特徴を有する。ガス透過性材料は上記実施の形態1或いは2で挙げたものを用いることができる。
なお、本実施の形態3でも、シリンジ本体部2並びにプランジャヘッド44を上記した細胞非接着性材料で構成することが好ましい。
また、本実施の形態3のシリンジ型細胞取扱装置1では、当該ガス透過性を有するプランジャヘッド44を通じ、細菌等による汚染の発生を防ぎつつ、細胞懸濁液100中の細胞が外部とガス交換が行えるので、細胞の活性低下を抑制しながら良好に細胞保存がなされる。また、細胞懸濁液100中に含まれる気泡がプランジャヘッド44から外部に効果的に除去され、気泡により細胞破壊が生じるのを防止する効果も奏される。
また、本実施の形態3では、プランジャヘッド44全体がガス透過性を有する構成例を示したが、本発明はこれに限定せず、例えば従来と同様の弾性部材でプランジャヘッドの本体を作製しておき、その主面に貫通孔を設けて、これによって形成された貫通部分を覆うようにガス透過性領域(例えばガス透過膜)を配設してプランジャヘッドを構成してもよい。
図4は、本発明の細胞取扱装置の実施の形態4におけるシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す外観図である。本実施の形態4の特徴は、シリンジ本体部2を前記細胞非接着性材料で構成するとともに、シリンジ本体部2にガス透過性領域は設けず、シリンジ本体部2のルアー部120先端に、ガス透過膜131をフィルターとして備えるフィルター付きキャップ130を配設した点にある。ガス透過膜の材料(ガス透過性材料)、及び細胞非接着性材料は上記各実施の形態1〜3で挙げたものを用いることができる。
また、実施の形態4のシリンジ型細胞取扱装置1における気泡除去操作も実施の形態3と同様に、予めキャップ130を上方へ向けてプランジャ40を押し込むことにより、ルアー部120周辺(及びガス透過膜131周辺)に細胞懸濁液100中の気泡を集中させ、これを良好に除去することができる。
ここで、実施の形態1〜4で挙げたガス透過膜20、131、天面1100、或いはプランジャヘッド44には、前述した疎水性材料からなる多孔質膜を用いるか、シリコーン樹脂、ポリエチレンやポリスチレン等のガス透過性樹脂材料を用いることで、ガス透過性とともに細胞非接着性を持たせ、より細胞を細胞懸濁液100中で良好に浮遊させて貯留またはスムーズに細胞移植することができる。
上記実施の形態1〜4では、シリンジ本体部2全体を細胞非接着性材料で構成する例を示したが、本発明ではシリンジ本体部2全体を当該細胞非接着性材料で構成する必要はなく、細胞懸濁液100と接触する内壁のみを細胞非接着性材料で構成するようにしてもよい。また、細胞懸濁液100と接触するシリンジ本体部2の内壁を部分的に細胞非接着性材料で構成するようにしても、それなりの効果が望める。しかしながら、本発明の効果を十分に得るためには、やはり細胞懸濁液100と接触するシリンジ本体部2の内壁全体をできるだけ細胞非接着性材料で構成するか、シリンジ本体部2全体を細胞非接着性材料で構成するのが望ましい。
ここでは従来技術にかかるシリンジと本発明に掛かるシリンジの性能を比較するために、下記a〜gのパターンに基づく各シリンジ内で細胞培養を行い、細胞の生存率を計測した。本発明品としては、実施の形態2及び4のシリンジを採用した。
図5は、実験結果を示すデータである。
a.浮遊細胞培養用シャーレを用いた培養
b.従来構成(ポリプロピレン製)の医療用シリンジを用い、ルアー部先端をキャップして密閉した状態での培養
c.実施の形態2の医療用シリンジ(天面にガス透過膜配設、シリンジ本体部を細胞非接着性材料で作成)を用い、ルアー部先端をキャップで密閉した状態での培養
d.実施の形態2の医療用シリンジ(天面にガス透過膜配設、シリンジ本体部を細胞非接着性材料で作成)を用い、ルアー部先端に実施の形態4のフィルター付きキャップ(小型)を装着した状態での培養
e.実施の形態2の医療用シリンジ(天面にガス透過膜配設、シリンジ本体部を細胞非接着性材料で作成)を用い、ルアー部先端に実施の形態4のフィルター付きキャップ(大型)を装着した状態での培養
*****
aにおける浮遊細胞培養用シャーレ(面積21cm2)では、浮遊系での培養とした。
各サイズは以下の通りである。
小型フィルター付きキャップのガス透過膜面積;約43mm2
大型フィルター付きキャップのガス透過膜面積;約113mm2
シリンジ内容積;10mL
ガス透過性天面面積;約70mm2
*****
ここで、細胞生存率の具体的な評価方法としては以下の通りである。
StemSpan medium(Stemcell Technology)
50ng/mL murine stem cell factor(mSCF;Peprotech)
20ng/mL human flt−3−ligand(Peprotech)
20ng/mL murine thrombopoietin(mTPO;Stemcell Technology)
・添加抗生物質の種類;0.05μg/mL ストレプトマイシン
図5に示す実験結果から、まず従来の医療用シリンジを用いたbでは、細胞の失活が激しいのに対し、実施例のシリンジであるdとeのパターンが最も高い性能が得られることが分かった。この結果は、実施例のシリンジでは、シリンジ本体部の天面に設けられたガス透過膜と、ルアー部に装着されたフィルター付きキャップによって高いガス交換性能が得られ、シリンジ内部に貯留された細胞懸濁液に対して良好にガス交換が行われ、結果として優れた細胞保存性能が発揮されたことを表していると思われる。
(実施の形態5)
図6は、実施の形態5の細胞取扱装置200の構成を示す外観図である。
このような細胞取扱装置200の優れた性能は、再生医療における使用時にも発揮される。すなわち、使用時にはキャップ60をはずしてルアー部203に針、又はカテーテルを装着し、生体内部の所定位置に合わせ、本体周壁部201の後端部202を手動または治具により押圧するだけで、汚染の発生を回避して内部の細胞を生体側に容易かつ迅速に注入できる。また、装置一部に多孔質膜を使用する場合には、後端部202を押圧することで細胞懸濁液100中の気泡除去操作も効率的に行うことが可能である。
図7は、実施の形態6の細胞取扱装置300の構成を示す外観図である。
当該細胞取扱装置300は、前記細胞取扱装置200と同様のガス透過性及び可撓性を有する材料からなり、その本体周壁部301が細長い袋(チューブ)状に形成されている。本体周壁部301の先端部にはルアー部303が形成され、非使用時には、当該ルアー部303にキャップ60が嵌合されることで内部が液密に保たれる。更に本体周壁部301には、後端部302側から扁平環状の扱きリング304が挿通されている。細胞懸濁液100(不図示)は、細胞取扱装置300の内部において液密に貯留される。
当該細胞取扱装置300によれば、再生医療における使用時には、まずキャップ60を外してルアー部303に針、又はカテーテルを装着し、本体周壁部301の後端部302を保持する。そして、指で扱きリング304を前方へ移動させる。このような簡単な操作を行うだけで、扱きリング304の圧力を受けて本体周壁部301が押圧され、ルアー部303より細胞懸濁液100を吐出させることができる。これにより、実施の形態5とほぼ同様に、汚染の発生を回避して内部の細胞を生体側に容易かつ迅速に注入できるという効果が奏されるのである。
(実施の形態7)
図8は、実施の形態7におけるシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す断面図である。
筒状体3及びプランジャ40は、一般的なシリンジに用いられている材料で作製することができる。筒状体3はほぼ筒状に形成されており、前端側面には、中央部に穿孔部11を持つ円盤状の天面110が形成されている。
また、バッグ50に求められるガス透過性は、細胞取扱装置の表面積、細胞の充填量、細胞の種類及び保存条件等により異なってくるが、細胞取扱装置に充填された細胞が生存するのに十分な量であることが必要である。ガス透過性は、バッグ50の内壁に部分的に持たせるようにすればよいが、ガス透過効率を十分に得るためには、バッグ50の内壁部分全体、あるいはバッグ50全体をガス透過性材料で構成するのが望ましい。
なお、ルアー部51に良好にキャップ60を装着する目的で、バッグ50において、少なくともルアー部51を、ある程度剛性を有する材料で構成するのが望ましい。
プランジャ40は、全体的には実施の形態1と同様のものであるが、プランジャヘッド43を構成する弾性部材において、シリンジ軸方向に沿って複数の孔431が形成された特徴を持つ。この孔431を流通路として、バッグ50内部の細胞懸濁液100が、バッグ50外部(プランジャヘッド43より外部)とガス交換可能なように工夫されている。
このような構成を有する実施の形態7のシリンジ型細胞取扱装置1では、その第一の特徴として、バッグ50が細菌の侵入等による汚染を防止しつつガス透過性を持っており、バッグ50内部の細胞懸濁液100中に含まれる細胞が、バッグ50を介して、プランジャヘッド43の孔431、及びルアー部51と穿孔部11との間隙から外部とガス交換可能になっている。従って細胞懸濁液100中の細胞は、生存に必要な酸素をバッグ50の外部より取り込むことができるので、バッグ50内で活性低下することなく良好に保存される。
本実施の形態7及び後述する実施の形態8のバッグ50の材料としては、実施の形態1〜6で挙げたガス透過膜20、131や天面1100、プランジャヘッド44、細胞取扱装置200、300と同様に、前述した疎水性材料からなる多孔質膜を用いるか、シリコーン樹脂、ポリエチレンやポリスチレン等のガス透過性樹脂材料を用いることで、バッグ50にも細胞非接着性を持たせ、より細胞を細胞懸濁液100中で良好に浮遊させて貯留することができる。こうすることで、従来のように細胞を取り出す際に薬剤(トリプシンやEDTA等剥離剤)を用いたり、温度変化処理を行って細胞取扱装置から細胞を剥離する手間が不要となり、細胞の物理的・化学的損傷を防ぎ、作業効率を大幅に向上させることができる。また、このような剥離処理や、細胞の洗浄処理等の煩雑な操作が要らないため、迅速な再生医療の処方が可能となり、細胞移植を受ける患者への負担も軽減できる。
なお、このとき本実施の形態7のシリンジ型細胞取扱装置1では、バッグ50を多孔質膜で構成する際に、膜の孔径を前記所定の大きさに設定することによって、バッグ50に加圧力が掛かっても液漏れを生じにくくなっている。このため、気泡除去時に貴重な細胞懸濁液100が漏出して失われるのを防止できる。この効果は、特に細胞量の確保が制限される際に有効である。
本実施の形態7のシリンジ型細胞取扱装置1では、少なくとも筒状体3とプランジャ40は細胞懸濁液100が接触しないので、再利用が可能である。
(実施の形態8)
図9は、実施の形態8におけるシリンジ型細胞取扱装置1の構成を示す断面図である。
バッグ破断手段13は、具体的には鋭利な金属刃や針状部材で構成することもできる。図9ではバッグ破断手段13として金属刃を設ける例を示しているが、破棄時の処理を考慮する必要のある場合、当該バッグ破断手段13は例えばシリンジ本体部と同様の樹脂部材で構成することもできる。
更に、本実施の形態8のシリンジ型細胞取扱装置1では、図9に示すように、天面110に設けられたルアー部120の開口部121を流通路としてバッグ50の先端部53が外気に露出しているため、実施の形態7に比べて更に良好にガス交換及び気泡除去を行えるという効果がある。
上記実施の形態1〜8で説明した細胞取扱装置の形状は、当然ながら例示に過ぎず、これ以外の形状であってもよい。すなわち、少なくとも内部に液密に細胞を貯留可能な細胞取扱装置であって、少なくとも前記細胞と接触する細胞取扱装置の内壁のうち一部以上が細胞非接着性材料、またはガス透過性材料で構成されていればよい。
2.本発明の組織再生用組成物について
図10は、本発明にかかる組織再生用組成物の部分拡大図である。この組織再生用組成物は、細胞培養粒子1000と、これを含む流動性媒体2000(例えば培養液)とから構成される。
当図に示すように細胞培養粒子1000は、流動性媒体2000に複数にわたり分散されており、生体吸収性材料から形成された足場粒子1001の表面に、複数の細胞1002が接着された構成を有する。なお細胞1002の接着数は、個々の足場粒子1001によって変化がある。
一方、細胞1002には、治療の目的に応じて前述した様々な細胞種を使用することが可能である。当該細胞種に特に制限はなく、具体例には胚性幹細胞(embryonic stem cells;ES細胞)、胚性生殖細胞(embryonic germ cells;EG細胞)、体性幹細胞(adult stem cells;AS細胞、成人幹細胞とも言う)、間葉系幹細胞、神経幹細胞、血管内皮幹細胞、造血幹細胞、肝幹細胞等の幹細胞の他に、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、心筋細胞、神経細胞、腱細胞、脂肪細胞、膵細胞、肝細胞、腎細胞、毛母細胞、血球細胞等の分化した細胞またはその前駆細胞を挙げることができる。このように、胚性幹細胞を始め、各分化の度合いが異なる幹細胞や、各組織に分化した細胞を用いることができる。中でも、接着性細胞を用いる場合、増殖・分化の際の足場を提供できるので有効である。ここで、接着性細胞とは、造血系幹細胞中の血球系細胞を除外した細胞の殆どが含まれる。
更に、上記流動性媒体2000としては、一般的な培養液の他に培養液以外の媒体、例えば生理食塩水、リン酸緩衝液などを使用することもできる。しかしその場合は、細胞培養に使用した培養液をこれらの媒体と置換する必要がある。
細胞培養の操作手順の例としては、まず、生体から細胞を分離・精製し、目的とする細胞を選別する。その後、必要に応じて細胞増殖因子を添加して増殖または標的細胞への分化誘導をかけるとともに、培養液中で細胞培養粒子1000を添加しゆっくりと攪拌しながら培養する。この際、細胞増殖因子など細胞増殖に必要な成分を細胞培養粒子に含有させてもよい。
なお、細胞1002の足場粒子1001への接着性をより向上させるために、足場粒子1001表面を、公知の手法(オゾン処理、UV処理、プラズマ処理などの物理的な処理、硫酸処理、塩酸処理などの化学的な処理、コーティング処理など)によって細胞接着性向上処理を施しておくことが望ましい。コーティング材料の例としては、しては、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ポリリジン、フィブリン(プレクロッティング処理を含む)、フィブリノーゲン及びゼラチンまたはコラーゲンで被覆する構成である。更に粒子自体に、各種増殖因子、ホルモンなどの生理活性物質を固定、吸着させてもよい。このような構成によれば、足場粒子1001自体の機械的強度が良好になり、細胞1002の接着性も向上するとともに、治癒効果も高めることが可能となる。
(粒子状の組織再生用組成物による効果)
以上の構成を持つ組織再生用組成物によれば、細胞1002は足場粒子1001の表面において、増殖または標的細胞へ分化誘導させることができるが、この期間中、細胞1002は足場粒子1001とともに微細な細胞培養粒子1000となって培養液中で浮遊した状態となり、全体として流動性を有している。そして再生医療の使用時には、細胞培養粒子1000をそのまま生体に注入して細胞移植することができる。
このようなシリンジタイプの細胞取扱装置による細胞移植の手技としては、足場を埋植してない患部に細胞注入する手技や、予め患部に埋植した足場に対して、繰り返し細胞注入する手法など、が考えられる。後者の手技は、徐々に患部を治癒再生させたい場合(軟骨再生や、乳房再生など)に有効である。
足場粒子1001は、生体注入後に所定期間が経過すると、生体に吸収されて消失するので、移植後に足場を除去する手術も不要となる。このため、患者に対する負担を著しく低減でき、特に、体力に乏しい乳児や老人等の患者に対する負担も軽減することできる。
本発明の組織再生用組成物を再生医療に適用する例としては、生体の患部に注入することにより、変形性関節症、慢性関節リュウマチ、偽関節、歯周病、進行性筋ジストロフィー症、心筋梗塞、脳血管障害、パーキンソン病、脊髄損傷、腱損傷、糖尿病、肝機能障害、消化器機能不全、皮膚損傷、白血病、血液系疾患等に対する治療に利用できる。
なお、以上の説明では、細胞種として再生治療用の細胞を利用する例を示したが、本発明の細胞取扱装置及び組織再生用組成物に用いる細胞としては、再生治療以外の治療用細胞、またはそれ以外の細胞を用いてもよい。
Claims (5)
- 流動性媒体と、当該流動性媒体中に浮遊する細胞の足場となる粒子形状の細胞足場粒子とを有し、
前記細胞足場粒子は生体吸収性材料からなるとともに、
当該細胞足場粒子は細胞接着性を有する構成である
こと特徴とする組織再生用組成物。 - 前記足場粒子の直径が10μm以上2000μm以下の範囲である
ことを特徴とする請求項1に記載の組織再生用組成物。 - 前記足場粒子が多孔質である
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の組織再生用組成物。 - 前記足場粒子には、細胞の接着性が向上する処理が施されている
ことを特徴とする請求項1から3の何れかに記載の組織再生用組成物。 - 前記細胞は、細胞増殖に足場が必要とされる接着性細胞群から選ばれた細胞である
ことを特徴とする請求項1から4の何れかに記載の組織再生用組成物。
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