JP2022104813A - リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】リプログラミング因子を導入された細胞の効率的な培養方法が求められている。【解決手段】本開示によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法が提供される。また、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された細胞を継代せずに、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導すること、を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法が提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞技術に関し、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法に関する。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている（例えば、特許文献１から４及び非特許文献１、２参照。）。従来、細胞にリプログラミング因子を導入し、ｉＰＳ細胞に誘導する際には、顕微鏡等で観察しながら、幹細胞様コロニーをピペットでピックアップして継代している。

国際公開第２０００／７００７０号 国際公開第２０１０／００８０５４号 国際公開第２０１２／０２９７７０号 国際公開第２０１５／０４６２２９号

Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.

リプログラミング因子を導入された細胞の効率的な培養方法が求められている。本発明は、リプログラミング因子を導入された細胞の効率的な培養方法を提供することを目的の一つとする。

本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法が提供される。回収された全ての細胞は、混じり合っていてもよい。

上記の方法において、継代することにおいて、細胞をクローニングしなくともよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まなくともよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まなくともよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップすることを含まなくともよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく継代してもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく継代してもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養することをさらに含んでもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を三次元培養で拡大培養することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞から幹細胞を樹立することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を凍結することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を、内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系から選択される少なくとも１つに分化させることをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞から胚様体、オルガノイド、及びスフィアから選択される少なくとも１つを形成することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、体細胞に誘導する処理をした後、処理された細胞をクローニングすることをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞に遺伝子編集処理をすることをさらに含んでいてもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が、血液細胞又は線維芽細胞由来であってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入される細胞が、尿に含まれる細胞であってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入される細胞が、膀胱上皮細胞であってもよい。

上記の方法が、尿からリプログラミング因子を導入される細胞を収集することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が、複数のヒト又は複数の非ヒト動物由来であってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を閉鎖された培養器内で培養してもよい。

上記の方法において、継代時に、低濃度で播種してもよい。

上記の方法において、低濃度が、０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下であってもよい。

上記の方法において、低濃度が、播種した１１個以上の細胞同士が接触しない濃度であってもよい。

上記の方法において、低濃度が、５％以下コンフルエントであってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子がＲＮＡであってもよい。

上記の方法において、細胞にリポフェクション法によりリプログラミング因子を導入してもよい。

上記の方法において、細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入してもよい。

上記の方法において、ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターであってもよい。

上記の方法において、ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。

また、本発明の態様によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された細胞を継代せずに、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導すること、を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法が提供される。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を三次元培養で拡大培養することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を凍結することをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞を、内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系から選択される少なくとも１つに分化させることをさらに含んでいてもよい。

上記の方法が、リプログラミング因子を導入された細胞に遺伝子編集処理をすることをさらに含んでいてもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が、血液細胞又は線維芽細胞由来であってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞が、複数のヒト又は複数の非ヒト動物由来であってもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子を導入された細胞を閉鎖された培養器内で培養してもよい。

上記の方法において、リプログラミング因子がＲＮＡであってもよい。

上記の方法において、細胞にリポフェクション法によりリプログラミング因子を導入してもよい。

上記の方法において、細胞にウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入してもよい。

上記の方法において、ウイルスベクターがＲＮＡウイルスベクターであってもよい。

上記の方法において、ＲＮＡウイルスベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。

本発明によれば、リプログラミング因子を導入された細胞の効率的な培養方法を提供可能である。

実施例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 実施例１に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例１に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例１及び比較例１に係るクローナルエフィシエンシーを示すグラフである。 実施例２及び比較例２に係る細胞数を示すグラフである。 実施例２及び比較例２に係るコロニー数を示すグラフである。 実施例３及び比較例３に係るクランプ数と細胞数を示すグラフである。 実施例４及び比較例４に係る心筋拍動の有無を示す表である。 実施例４及び比較例４に係るｃＴｎＴの陽性率を示すグラフである。 実施例５及び比較例５に係る細胞数及びＰＳＡ－ＮＣＡＭの陽性率を示すグラフである。 実施例６及び比較例６に係るＳＯＸ１の陽性率及びＯＴＸ２の陽性率を示すグラフである。 実施例６及び比較例６に係るＨＡＮＤ１の陽性率及びＳＯＸ１７の陽性率を示すグラフである。 参考実施例１に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例１に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 参考実施例２に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例３に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例４に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例４に係るインフェクションから１５日目の細胞を示す写真である。 参考実施例４に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例４に係る継代１回目の細胞を示す写真である。 参考実施例５に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例５に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 参考実施例６に係るフローサイトメーターによる測定結果を示すグラフである。 参考実施例６に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 参考実施例６に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例７に係るＰＣＲの結果を示すグラフである。 実施例７に係るＴＲＡ１－６０陽性細胞を示す写真である。 実施例８に係る神経系細胞の写真である。 実施例９に係るテラトーマの写真である。 実施例１０に係るｉＰＳ細胞様のコロニーの写真である。 実施例１０に係るＯｃｔ３／４陽性細胞及びＮａｎｏｇ陽性細胞の写真である。 実施例１０に係るフローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例１０に係る心筋細胞の写真である。 実施例１０に係るＭｕｎｃｈ１３陽性細胞及びｖＧｌｕｔ陽性細胞の写真である。 実施例１１に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例１１に係る尿由来の細胞の写真である。 実施例１２に係る、ＧＦＰをコードするＲＮＡをトランスフェクトされた尿由来の細胞の写真である。 実施例１３に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１４に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１５に係る、フローサイトメーターによるドットプロットである。 実施例１６に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。 実施例１６に係る、リプログラミング因子を導入された尿由来の細胞の写真である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。

実施形態に係るリプログラミング因子を導入された細胞の培養方法は、リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、を含む。リプログラミング因子を導入された細胞は、例えば、多能性幹細胞に誘導される。多能性幹細胞は、例えば、ｉＰＳ細胞である。

リプログラミング因子を導入される細胞は特に限定されないが、例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、尿に含まれる細胞であってもよい。尿に含まれる細胞の例としては、膀胱上皮細胞が挙げられる。リプログラミング因子を導入される細胞は、ヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一人のヒト由来であってもよいし、複数人のヒト由来であってもよい。リプログラミング因子を導入される細胞は、一匹の非ヒト動物由来であってもよいし、複数匹の非ヒト動物由来であってもよい。

血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いる。

血液細胞は、例えば、単核球細胞（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞である。

単核球細胞は、血液細胞の分離用媒体、及び遠心分離装置等を用いて、血液から分離される。血液細胞の分離用媒体としてＦｉｃｏｌｌ（ＧＥヘルスケア）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。

低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから１０μＬから５０ｍＬの血液を採血し、血液が固まらないように血液にＥＤＴＡを含むキレート剤を加えて優しく混ぜる。また、ヒトリンパ球分離用の媒体（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ、ＧＥヘルスケアジャパン）を５ｍＬずつ２本の１５ｍＬチューブに分注する。５ｍＬの血液に対して５ｍＬのＰＢＳを加えて希釈し、チューブ中のヒトリンパ球分離用の媒体の上に５ｍＬずつ重層する。この時、界面を乱さないように、希釈血液をチューブの管壁を伝わらせてゆっくりと媒体上に加える。

チューブ中の溶液を、１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは４００×ｇで、４℃から４２℃好ましくは１８℃で５分から２時間、好ましくは３０分間遠心する。遠心後、チューブ中に白く濁った中間層が現れる。この白く濁った中間層は、単核球細胞を含んでいる。チューブ中の白く濁った中間層をピペットマンでゆっくりと回収し、新しい１５ｍＬチューブに移す。この際、下層は吸い取らないようにする。白く濁った中間層は、１本のチューブより１ｍＬ程度回収できる。２本分の中間層をまとめて１本のチューブに移す。

回収した単核球細胞に対し、１ｍＬから４８ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、溶液をさらに１０×ｇから１０００×ｇ、好ましくは２００×ｇ、４℃から４２℃、好ましくは１８℃で１分から６０分、好ましくは１０分間遠心する。その後、アスピレータを用いて溶液の上清を吸引して除去し、１ｍＬから１２ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。

採血管としてバキュテイナ（登録商標、ＢＤ）を使用する場合の、単核球細胞の分離方法は、以下のとおりである。

低温では単核球細胞の分離精度が悪くなる傾向にあるため、遠心機を４℃から４２℃、好ましくは１８℃に設定する。成年又は未成年のヒトから、採血管（バキュテイナ（登録商標）、ＢＤ）を用いて８ｍＬ採血し、転倒混和して抗凝固剤と混和する。その後、バランスを調整し、溶液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは１５００×ｇから１８００×ｇでスイングロータで１分から６０分、好ましくは２０分間遠心する。遠心後、血漿層である上層を取り除き、ピペッティングして単核球層とゲルに張り付いている血球を懸濁して懸濁液を得る。得られた懸濁液を、別の１５ｍＬチューブに移す。

１５ｍＬチューブの懸濁液に１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、懸濁液を４℃から４２℃、好ましくは１８℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去する。また、溶血剤（ＰｈａｒｍＬｙｓｅ（登録商標）、１０倍濃度、ＢＤ）を滅菌水で１倍濃度に希釈する。１５ｍＬチューブ中のペレットをタッピングでほぐし、１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１ｍＬの溶血剤を加える。その後、室温で遮光し、１分間から６０分間、好ましくは１分間溶液を静置する。

次に、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１４ｍＬ、好ましくは１２ｍＬのＰＢＳを加えて、４℃から４２℃、好ましくは室温で、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは２００×ｇで、１分から６０分、好ましくは５分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除去し、１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは３ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を加えて懸濁し、単核球細胞懸濁液を得る。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。

血液から単核球細胞を分離する方法は、上記の方法に限られず、例えば、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、全血単核球濃縮用ピュアセルセレクトシステム（登録商標、ＰＡＬＬ）、血球細胞除去用浄化器（セルソーバＥ、登録商標、旭化成）、及び血小板製剤用白血球除去フィルター（セパセルＰＬ、登録商標、ＰＬＸ－５Ｂ－ＳＣＤ、旭化成）等のフィルターも使用可能である。

単核球細胞は、赤血球を重力沈降又は遠心分離することにより有核細胞を分離することが可能な赤血球分離剤を用いて分離されてもよい。赤血球分離剤の例としては、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＨＥＳ４０（ＮＩＰＲＯ）が挙げられる。

また、単核球細胞としては、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ社から販売されているＣＴＬ－ＵＰ１や、Ｓａｎｇｕｉｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＰＢＭＣ－００１等を使用してもよい。

あるいは、血液細胞としては、セルバンカー１、ステムセルバンカー ＧＭＰグレード、及びステムセルバンカー ＤＭＳＯフリー ＧＭＰグレード（ゼノアック）等の細胞凍結保存液を用いて凍結保存された血液細胞を解凍して用いてもよい。

単核球細胞を解凍する際には、まず、１５ｍＬチューブに１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは８ｍＬの既知組成無血清造血細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（登録商標）１０、ロンザ）を入れておき、凍結した単核球細胞の入ったチューブを４℃から４２℃、好ましくは３７℃の温浴槽にいれて、単核球細胞を溶かし始める。その後、少し氷が残っている状態で、単核球細胞の入ったチューブを温浴槽から引きあげ、単核球細胞を既知組成無血清造血細胞培地の入ったチューブに移す。そのうち１０μＬの単核球細胞懸濁液をトリパンブルーで染色して血球計算盤でカウントする。

血液細胞は、細胞表面マーカーに基づいて分離されてもよい。血液幹・前駆細胞は、ＣＤ３４が陽性である。Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８のいずれかが陽性である。Ｂ細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０のいずれかが陽性である。マクロファージはＣＤ１１ｂ、ＣＤ６８、ＣＤ１６３のいずれかが陽性である。血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞は、例えば、自動磁気細胞分離装置及び免疫磁気ビーズを用いて、血液細胞から分離される。あるいは、予め分離された単核球細胞を用意してもよい。ただし、細胞表面マーカーに基づいて分離されていない血液細胞を用いてもよい。

ＣＤ３４陽性細胞は、幹・前駆細胞であり、リプログラミングされやすい傾向にある。また、ＣＤ３陽性細胞であるＴ細胞を用いてｉＰＳ細胞を作製すると、Ｔ細胞由来のｉＰＳ細胞はＴＣＲリコンビネーションの型を保持しているので、Ｔ細胞に効率的に分化誘導できる傾向にある。

ＣＤ３４陽性細胞の分離方法は、以下のとおりである。

１０ｍＬの無血清培地（ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０μＬのＩＬ－６（１００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＳＣＦ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＴＰＯ（３００μｇ／ｍＬ）、１０μＬのＦＬＴ３リガンド（３００μｇ／ｍＬ）、及び１０μＬのＩＬ－３（１０μｇ／ｍＬ）を加えて血球培地（血液幹・前駆細胞培地）を調製する。

６ウェルプレートの１ウェルに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬの血球培地を入れる。また、培地の蒸発を防ぐために、他の５ウェルのそれぞれに１ｍＬから６ｍＬ、好ましくは２ｍＬのＰＢＳを入れる。その後、６ウェルプレートを４℃から４２℃、好ましくは３７℃のインキュベーターに入れて温める。

２０ｍＬのＰＢＳに対し、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは８０μＬのＥＤＴＡ（５００ｍｍｏｌ／Ｌ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは２００μＬのＦＢＳを加えたカラムバッファを用意する。１×１０⁴から１×１０⁹個、好ましくは２×１０⁷個の単核球細胞を含有する単核球細胞懸濁液を１５ｍＬチューブに分注し、単核球細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから３０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１０分間遠心する。遠心後、上清を除き、単核球細胞を１００μＬから１ｍＬ、好ましくは３００μＬのカラムバッファで懸濁する。

１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に、１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び１０μＬから１ｍＬ、好ましくは１００μＬのＣＤ３４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を加える。ＦｃＲブロッキング試薬は、マイクロビーズ標識の特異性を高めるために用いられる。その後、単核球細胞懸濁液を混和して、４℃から４２℃、好ましくは４℃で１分から２時間、好ましくは３０分間静置する。

次に、１５ｍＬチューブ中の単核球細胞懸濁液に１ｍＬから１５ｍＬ、好ましくは１０ｍＬのカラムバッファを加えて希釈し、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、１５ｍＬチューブ中の上清をアスピレータで除き、１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを加えて再懸濁する。

自動磁気細胞分離装置用のカラム（ＭＳカラム、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を自動磁気細胞分離装置（ＭｉｎｉＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｕｎｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に取り付け、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて洗浄する。次に、単核球細胞をカラムに入れる。さらに、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは５００μＬのカラムバッファを入れて、カラムを１回から１０回、好ましくは３回洗浄する。その後、カラムを自動磁気細胞分離装置から外し、１５ｍＬチューブに入れる。次に、カラムに１０μＬから１０ｍＬ、好ましくは１０００μＬのカラムバッファを入れ、速やかにシリンジを押してＣＤ３４陽性細胞を１５ｍＬチューブに流出させる。

１０μＬのＣＤ３４陽性細胞懸濁液をトリパンブルーで染めて、細胞数を血球計算版でカウントする。また、１５ｍＬチューブ中のＣＤ３４陽性細胞懸濁液を、４℃から４２℃、好ましくは４℃、１００×ｇから１０００×ｇ、好ましくは３００×ｇで１分から２時間、好ましくは１０分間遠心する。遠心後、上清をアスピレータで除く。さらに、温めておいた血球培地でＣＤ３４陽性細胞を再懸濁し、ＣＤ３４陽性細胞を培養プレートにまく。その後、４℃から４２℃、好ましくは３７℃、１％から２０％、好ましくは５％ＣＯ₂でＣＤ３４陽性細胞を６日間培養する。この間、培地交換はしなくてもよい。

ＣＤ３４以外のマーカーで細胞を単離する方法は、ＣＤ３４陽性細胞を単離する方法と同様である。

細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡである。細胞に導入されるリプログラミング因子は、例えば、ＯＣＴ３／４等のＯＣＴのｍＲＮＡ、ＳＯＸ２等のＳＯＸのｍＲＮＡ、ＫＬＦ４等のＫＬＦのｍＲＮＡ、及びｃ－ＭＹＣ等のＭＹＣのｍＲＮＡを含む。リプログラミング因子ＲＮＡとして、ＯＣＴ３／４を改良したＭ₃Ｏを使用してもよい。また、リプログラミング因子ＲＮＡは、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つの因子のｍＲＮＡをさらに含んでいてもよい。これらのｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。

ｐ５３は、ガン抑制タンパク質である。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体は、体細胞に内在する野生型ｐ５３タンパク質と競合的に作用して、野生型ｐ５３タンパク質の機能を阻害し得る限り特に限定されない。ｐ５３のドミナントネガティブ変異体の例としては、マウスｐ５３のＤＮＡ結合領域に位置する２７５位（ヒトの場合は２７８位）のプロリンをセリンに点変異させたｐ５３Ｐ２７５Ｓ、マウスｐ５３の１４－３０１位（ヒトｐ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたｐ５３ＤＤ、マウスｐ５３の５８位（ヒトの場合は６１位）のセリンをアラニンに点変異させたｐ５３Ｓ５８Ａ、ヒトｐ５３の１３５位（マウスの場合は１３２位）のシステインをチロシンに点変異させたｐ５３Ｃ１３５Ｙ、マウスｐ５３の１３５位（ヒトの場合は１３８位）のアラニンをバリンに点変異させたｐ５３Ａ１３５Ｖ、マウスｐ５３の１７２位（ヒトの場合は１７５位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ１７２Ｈ、マウスｐ５３の２７０位（ヒトの場合は２７３位）のアルギニンをヒスチジンに点変異させたｐ５３Ｒ２７０Ｈ、及びマウスｐ５３の２７８位（ヒトの場合は２８１位）のアスパラギン酸をアスパラギンに点変異させたｐ５３Ｄ２７８Ｎが挙げられる。

ｍＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）又は５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）で修飾されていてもよい。ｍＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。

細胞に導入されるＲＮＡは、例えば、１本鎖ＲＮＡであり、２本鎖ＲＮＡが実質的に除去されている。また、細胞に導入されるＲＮＡは、短鎖ＲＮＡ及び夾雑物等の不純物が実質的に除去されていることが好ましい。２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを、精製及び／又は濃縮してもよい。細胞に導入する１本鎖ＲＮＡを精製する方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる精製方法が挙げられる。例えば、ＨＰＬＣによって、２本鎖ＲＮＡが、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、あるいは９０％以上除去される。あるいは、２本鎖ＲＮＡを実質的に除去するために、細胞に導入するＲＮＡを、２本鎖ＲＮＡを分解するリボヌクレアーゼで処理してもよい。

細胞に導入されるＲＮＡは、ＯＣＴ３／４のＲＮＡの完全長に直接接続されたＭＹＯＤの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）のＲＮＡをさらに含んでいてもよい。

リプログラミング因子は、例えば、リポフェクション法により細胞に導入される。リポフェクション法とは、陰性荷電物質である核酸と、陽性荷電脂質と、の複合体を、電気的な相互作用により形成し、複合体をエンドサイトーシスや膜融合により細胞内に取り込ませる方法である。リポフェクション法は、細胞へのダメージが少なく、導入効率に優れており、操作が簡便であり、時間がかからない等の利点を有する。

リプログラミング因子は、例えば、ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて培養されている細胞に導入される。例えば、細胞が単核球である場合、血液から単核球を分離した直後に、単核球にＲＮＡを導入してもよい。

ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）が使用可能である。あるいは、ＲＮＡトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＳｔｅｍＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＴｒａｎｓＩＴ（Ｍｉｒｕｓ）、ｍＲＮＡ－Ｉｎ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）、Ｊｅｔ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ （Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ－１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のリポフェクション試薬を利用してもよい。

あるいは、細胞には、例えば、ウイルスベクターを用いてリプログラミング因子を導入する。ウイルスベクターは、ＲＮＡウイルスベクターであってもよい。ＲＮＡウイルスベクターは、センダイウイルスベクターであってもよい。センダイウイルスベクターは、所定の温度以上でウイルス核酸の安定性が低下する温度感受性センダイウイルスベクターであってもよい。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸は、所定の温度未満で安定である。ウイルス核酸は、ウイルスＤＮＡであってもよいし、ウイルスＲＮＡであってもよい。ウイルス核酸はウイルスゲノムであってもよい。ウイルス核酸の安定性の低下とは、ウイルス核酸が分解すること、及びウイルス核酸の複製又は増殖が抑制されることと、の少なくとも一方であってもよい。ウイルス核酸の安定性が低下すると、ウイルス核酸の増殖、ウイルス核酸の複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方が低下する。所定の温度とは、例えば、３６．５℃以上３７．５℃以下、３６．６℃以上３７．４℃以下、３６．７℃以上、３７．３℃以下、３６．８℃以上３７．２℃以下、３６．９℃以上３７．１℃以下、あるいは３７℃である。温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性、すなわち、増殖、複製速度及び遺伝子発現レベルの少なくとも一方は、所定の温度未満で高く、所定の温度以上で低くなる。例えば、温度感受性センダイウイルスベクターは、３２℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルと比較して、３７℃で培養されている細胞における増殖速度又は遺伝子発現レベルが、１／２以下、１／３以下、１／５以下、１／１０以下、あるいは１／２０以下である。

センダイウイルスは、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ／ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子をコードする。ＨＮタンパク質は、センダイウイルスが細胞に付着する際に細胞表面のシアル酸を認識してウイルス粒子を細胞に繋留させる。Ｆタンパク質は、細胞外のプロテアーゼにより切断活性化されて、繋留されているセンダイウイルスのエンベロープと標的細胞の細胞膜の融合を触媒して感染を成立させる。Ｌタンパク質は、その修飾タンパク質であるＰタンパク質とともに、感染後に細胞質でウイルス核酸の複製と複製された多コピーの核酸からの転写を触媒する。

センダイウイルスベクターにおいてＦ遺伝子を欠失させることにより、遺伝子導入細胞から感染可能なウイルス粒子が産生されることを抑制することが可能である。また、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子の少なくとも一方に変異を導入することにより、センダイウイルスベクターを温度感受性にすることが可能である。

センダイウイルスの温度感受性（ＴＳ）変異の例としては、ＴＳ７（Ｌタンパク質のＹ９４２Ｈ／Ｌ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１２（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異）、ＴＳ１３（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１５５８Ｉ変異）、ＴＳ１４（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ変異）、ＴＳ１５（Ｐタンパク質のＤ４３３Ａ／Ｒ４３４Ａ／Ｋ４３７Ａ変異及びＬタンパク質のＬ１３６１Ｃ／Ｌ１５５８Ｉ変異）等が挙げられる。

センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失（ΔＦ）型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。

センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）／ＴＳΔＦ、ＳｅＶ１８＋／ＴＳΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）／ＴＳΔＦであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターである。ただし、センダイウイルスベクターの温度感受性変異は、これらに限定されない。

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターと温度非感受性センダイウイルスベクターとの組み合わせであってもよい。あるいは、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まなくともよい。例えば、細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターと同じ以上温度感受性を有するセンダイウイルスベクターのみであり、ＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入した温度感受性センダイウイルスベクターより温度感受性が低いセンダイウイルスベクターを含まなくともよい。

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、任意のリプログラミング因子を搭載する。細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、例えば、ＫＬＦのｍＲＮＡ、ＯＣＴのｍＲＮＡ、及びＳＯＸのｍＲＮＡをこの順序で含み、ＭＹＣのｍＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、ＭＹＣのｍＲＮＡを含み、ＫＬＦのｍＲＮＡ、ＯＣＴのｍＲＮＡ、及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まない温度感受性センダイウイルスベクターと、の組み合わせである。ただし、センダイウイルスベクターに搭載するリプログラム因子の数、組み合わせ、及び順序は任意であり、特に限定されない。

細胞に導入されるセンダイウイルスベクターは、ＫＬＦのｍＲＮＡを含み、ＯＣＴのｍＲＮＡ及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターを含んでいてもよい。ＫＬＦのｍＲＮＡを含み、ＯＣＴのｍＲＮＡ及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、温度感受性センダイウイルスベクターであってもよいし、温度非感受性センダイウイルスベクターであってもよい。ただし、本発明者らの知見によれば、温度非感受性センダイウイルスベクターを導入しないほうが、センダイウイルスベクターを導入された細胞から早期にセンダイウイルスベクターが消滅する。

ＫＬＦのｍＲＮＡ、ＯＣＴのｍＲＮＡ、及びＳＯＸのｍＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ７又はＴＳ１２、あるいはＴＳ１２である。

ＫＬＦのｍＲＮＡ、ＯＣＴのｍＲＮＡ、及びＳＯＸのｍＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ７ΔＦ又はＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＰＭ）ＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦである。

ＭＹＣのｍＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスべクターであって、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を有するセンダイウイルスベクターである。温度感受性変異は、例えばＴＳ１５である。

ＭＹＣのｍＲＮＡを含む温度感受性センダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１２ΔＦ、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１３ΔＦ、又はＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦであり、あるいはＳｅＶ（ＨＮＬ）ＭＹＣ／ＴＳ１５ΔＦである。

ＫＬＦのｍＲＮＡを含み、ＯＣＴのｍＲＮＡ及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、Ｍタンパク質にＧ６９Ｅ、Ｔ１１６Ａ、及びＡ１８３Ｓの変異を有し、ＨＮタンパク質にＡ２６２Ｔ、Ｇ２６４Ｒ、及びＫ４６１Ｇの変異を有し、Ｐタンパク質にＬ５１１Ｆ変異を有し、Ｌタンパク質にＮ１１９７Ｓ及びＫ１７９５Ｅ変異を有するＦ遺伝子欠失型センダイウイルスベクターである。ＫＬＦのｍＲＮＡを含み、ＯＣＴのｍＲＮＡ及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、上記のＴＳ７、ＴＳ１２、ＴＳ１３、ＴＳ１４、又はＴＳ１５の変異を導入したセンダイウイルスベクターより温度感受性が弱く、所定の温度以上でもＫＬＦ遺伝子を発現可能である。

ＫＬＦのｍＲＮＡを含み、ＯＣＴのｍＲＮＡ及びＳＯＸのｍＲＮＡを含まないセンダイウイルスベクターは、例えば、ＳｅＶ１８＋ＫＬＦ４／ＴＳΔＦである。

複数種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入する際には、例えば、複数種類のセンダイウイルスベクターを同時に細胞に導入する。あるいは、ある種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入してから、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、３時間以内、２時間以内、あるいは１時間以内に、全ての種類のセンダイウイルスベクターを細胞に導入することが好ましい。

細胞を感染させる際のセンダイウイルスベクターの感染多重度（ＭＯＩ）は、例えば、０．１以上、０．３以上、０．５以上、１．０以上、２．０以上、３．０以上、４．０以上、又は５．０以上である。また、ＭＯＩは、例えば、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、又は５以下である。

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であってもよいし、所定の温度以上であってもよい。センダイウイルスベクターが温度感受性センダイウイルスベクターのみであり、温度非感受性センダイウイルスベクターを含まない場合、細胞をセンダイウイルスベクターに感染させる際の温度は、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度であることが好ましい。

リプログラミング因子を導入される細胞は、接着培養されていてもよいし、浮遊培養されていてもよい。

リプログラミング因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）、ファイブロネクチン、及びビトロチン等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養されていてもよい。

リプログラミング因子を導入される細胞が培養される培地としては、例えば、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ(ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ)等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。

ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ２、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ ＥＳ／ｉＰＳ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ （登録商標）ＸＦ／ＦＦ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ ａｎｄ ＥＳ Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ－Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｆｅｅｄｅｒ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ （ＬＯＮＺＡ）、及びＰｌｕｒｉＱ（ＭＴＩ－ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等の培養器に入れられる。

細胞を浮遊培養あるいは三次元培養する場合、例えば、ゲル培地が使用される。ゲル培地は、例えば、幹細胞培地にジェランガムを終濃度が０．００１質量％から０．５質量％、０．００５質量％から０．１質量％、あるいは０．０１質量％から０．０５質量％となるよう添加することにより調製される。

ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。

あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。

ゲル培地は、例えば、ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）等の成長因子を含んでいてもよいし、含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、ｂＦＧＦ等の成長因子を、４００μｇ／Ｌ以下、４０μｇ／Ｌ以下、あるいは１０μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。

また、ゲル培地は、ＴＧＦ－βを含んでいてもよいし、含まないか、ＴＧＦ－βを６００μｇ／Ｌ以下、３００μｇ／Ｌ以下、あるいは１００μｇ／Ｌ以下の低濃度で含んでいてもよい。

ゲル培地は、撹拌されなくともよい。また、ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。

ゲル培地は、カドヘリン、ラミニン、フィブロネクチン、及びビトロネクチンからなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでいてもよい。

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度より低い温度、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。その後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、少なくとも２日、あるいは２日以上１０日以下、例えば、４．０℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３１．０℃以上、３２．０℃以上、３３．０℃以上、３３．１℃以上、３３．２℃以上、３３．３℃以上、３３．４℃以上、３３．５℃以上、３３．６℃以上、３３．７℃以上、３３．８℃以上、あるいは３３．９℃以上であり、３７．０℃未満、３６．９℃未満、３６．８℃未満、３６．７℃未満、３６．６℃未満、３６．５℃未満、３６．０℃以下、３５．０℃以下、あるいは３４．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。その後、温度を上昇させ、３６．５℃以上、３６．６℃以上、３６．７℃以上、３６．８℃以上、３６．９℃以上、あるいは３７．０℃以上であり、４０．０℃以下、３９．０℃以下、あるいは３８．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度未満、つまり、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸が安定である温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、所定の温度以上で細胞を培養してもよい。所定の温度以上で細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

細胞をセンダイウイルスベクターに感染させた後、幹細胞様のコロニーが現れ始めるまで、例えば、４．０℃以上、１０℃以上、１５℃以上、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３１．０℃以上、３２．０℃以上、３３．０℃以上、３３．１℃以上、３３．２℃以上、３３．３℃以上、３３．４℃以上、３３．５℃以上、３３．６℃以上、３３．７℃以上、３３．８℃以上、あるいは３３．９℃以上であり、３７．０℃未満、３６．９℃未満、３６．８℃未満、３６．７℃未満、３６．６℃未満、３６．５℃未満、３６．０℃以下、３５．０℃以下、あるいは３４．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。幹細胞様のコロニーが現れ始めた後、温度を上昇させ、３６．５℃以上、３６．６℃以上、３６．７℃以上、３６．８℃以上、３６．９℃以上、あるいは３７．０℃以上であり、４０．０℃以下、３９．０℃以下、あるいは３８．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。温度は１回で上げてもよいし、段階的に上げてもよい。温度を上昇させた後、細胞を培養する間、例えば２日に１回、培地を交換してもよい。

細胞にリプログラミング因子を導入し、細胞を培養した後、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種する継代を少なくとも１回実行する。その後、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。

ここで、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。

あるいは、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、リプログラミング因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。

またあるいは、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、リプログラミング因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニーどうしを混合して、同じ培養器に播種してもよい。

例えば、リプログラミング因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から全ての細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から全ての細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。リプログラミング因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。

リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、細胞は低濃度で培地あるいは培養器に播種される。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ²以上であり、０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下、１．２５×１０³ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下、０．２５×１０³ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下、０．２５×１０²ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下、あるいは０．２５×１０¹ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。本発明者らの知見によれば、リプログラミング因子を導入された細胞を継代する際、低濃度で細胞を培地に播種することにより、細胞から誘導される多能性幹細胞におけるセンダイウイルスの残存を抑制することが可能である。誘導される多能性幹細胞において、センダイウイルスが残存する細胞の割合は、例えば４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下あるいは０％である。

温度感受性センダイウイルスベクターを用いた場合、継代後、温度感受性センダイウイルスベクターのウイルス核酸の安定性が低下する所定の温度以上で細胞を培養してよい。継代後、例えば、３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養する。継代後、例えば、細胞間接着が開始するまで３６．５℃以上３８．０℃未満の温度で細胞を培養し、細胞間接着が開始した後、細胞間接着が開始するまでより高い温度、例えば、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下、４１．５℃以下、４１．０℃以下、４０．５℃以下、あるいは４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。継代後、細胞間接着が開始する前から、３７．５℃以上であり、４２．０℃以下、４１．５℃以下、４１．０℃以下、４０．５℃以下、あるいは４０．０℃以下の温度で細胞を培養してもよい。

リプログラミング因子を導入された細胞は、閉鎖された培養器内で培養され、継代されてもよい。閉鎖された培養器は、例えば、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしない。また、リプログラミング因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養してもよいし、三次元培養で拡大培養してもよい。

リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導され、多能性幹細胞が樹立された後、接着培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を多能性幹細胞として凍結保存してもよい。また、リプログラミング因子を導入された細胞が多能性幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、多能性幹細胞として凍結保存してもよい。

誘導された多能性幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する肩平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された多能性幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。

また、細胞が多能性幹細胞に誘導されたか否かは、フローサイトメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原である。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞の種と考えられる。

誘導された多能性幹細胞を、多能性幹細胞の状態とは異なる状態の体細胞に誘導してもよい。体細胞の例としては、神経細胞、網膜上皮細胞、肝細胞、β細胞、腎細胞、歯髄幹細胞、間葉系幹細胞、体性幹前駆細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、軟骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、心筋細胞、血液細胞、及び免疫細胞が挙げられる。血液細胞の例としては、赤芽球、赤血球、巨核球、及び血小板が挙げられる。免疫細胞の例としては、単球、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞が挙げられる。誘導された幹細胞を、内胚葉系、中胚葉系、又は外胚葉系に分化させてもよい。幹細胞に、胚様体、オルガノイド、及びスフィアを形成させてもよい。

細胞を神経系細胞に誘導する因子の例としては、ＡＳＣＬファミリー、ＤＬＸファミリー、ＭＹＴファミリー、ＮｅｕｒｏＤファミリー、ＳＯＸファミリー、及びＮＧＮファミリーが挙げられる。ＡＳＣＬファミリーの例としては、ＡＳＣＬ１が挙げられる。ＤＬＸファミリーの例としては、ＤＬＸ２が挙げられる。ＭＹＴファミリーの例としては、ＭＹＴ１Ｌが挙げられる。ＮＧＮファミリーの例としては、ＮＧＮ２が挙げられる。神経系細胞の例としては、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞が挙げられる。神経細胞の例としては、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞、大脳神経、介在性神経、及び視神経が挙げられる。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、アストロサイト、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。

細胞を心筋細胞に誘導する因子の例としては、ＧＡＴＡファミリー、ＭＥＦファミリー、ＴＢＸファミリー、ＭＹＯＣＤファミリー、ＭＥＳＰファミリー、及びｍｉＲ－１３３ファミリーが挙げられる。ＧＡＴＡファミリーの例としては、ＧＡＴＡ４Ａが挙げられる。ＭＥＦファミリーの例としては、ＭＥＦ２Ｃが挙げられる。ＴＢＸファミリーの例としては、ＴＢＸ５が挙げられる。ＭＥＳＰファミリーの例としては、ＭＥＳＰ１が挙げられる。

なお、本開示において、誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換(Transdifferentiation or Lineage reprogramming)、分化誘導及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。

樹立した多能性幹細胞を、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導する処理をした後、誘導処理された細胞をクローニングしてもよい。

樹立した多能性幹細胞に遺伝子編集処理をした後、遺伝子編集処理された細胞をクローニングしてもよい。

なお、リプログラミング因子を導入された細胞を全く継代せずに、リプログラミング因子を導入された細胞を、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導してもよい。細胞へのリプログラミング因子の導入方法は、上述の通りである。例えば、リプログラミング因子を導入された細胞を全く継代せずに、リプログラミング因子を導入された細胞に分化誘導因子を導入して、リプログラミング因子を導入された細胞を、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導してもよい。あるいは、リプログラミング因子を導入された細胞を全く継代せずに、リプログラミング因子を導入された細胞にホルモン又は化学物質を与えて、リプログラミング因子を導入された細胞を、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導してもよい。この場合、リプログラミング因子を導入された細胞は、クローニングされずに、体細胞に誘導される。誘導される体細胞は上述のとおりである。

（実施例１、比較例１）
ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。また、ヒト末梢血単核球細胞を血液培地に懸濁し、血球計算版を用いて単核球細胞の数を測定して、血液培地における単核球細胞数を調整した。その後、単核球細胞を、３７℃で１日間から７日間、多能性幹細胞誘導用のディッシュ上で二次元培養した。

二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。実施例１では、１回目の継代の際、ウェルプレートから全ての細胞を剥離させ、剥離して混じり合った細胞を、区別なく次のウェルプレートに播種した。これに対し、比較例１では、１回目の継代の際、コロニーピックして、クローニングした。なお、実施例１及び比較例１ともに、継代の際、１１個以上の細胞同士が接触しないよう、細胞を播種した。

次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、実施例１及び比較例１ともに、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図１に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図２に示すように、ＰＣＲによっても、実施例１に係る細胞に残存するセンダイウイルスは検出されなかった。従来のように、１１個以上の細胞同士が接着する高い濃度で細胞を播種した場合は、細胞にセンダイウイルスが残存していた。得らえたＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図３に示す。

また、細胞内のセンダイウイルスが消滅してから５日後に形成されたコロニー数を数えた。さらに、コロニー数を播種した細胞数で割り、クローナルエフィシエンシーを算出した。３回試験した結果を図４に示す。培地にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約５％から約８％であり、ばらつきが小さかった。培地にｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した場合、クローナルエフィシエンシーは約１０％から約１５％であり、ばらつきが小さかった。培地にＳｔｅｍＦｉｔを用いて１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングした場合、クローナルエフィシエンシーは１％未満になるときと、約１６％になるときがあり、クローナルエフィシエンシーにばらつきがあった。

したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、クローナルエフィシエンシーが高くなり、かつ安定することが示された。

（実施例２、比較例２）
実施例１及び比較例１と同様に継代培養して得られたｉＰＳ細胞様の細胞を剥離し、解離した。次に、約１×１０⁵個の細胞を、ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、タカラ）を用いて凍結保存した。その後、凍結細胞を融解させ、約１×１０⁴個の細胞をウェルに播種し、細胞を培養して増殖させた。播種から７日後の細胞数とコロニー数を計測した。３回試験した結果を図５と図６に示す。

図５に示すように、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代すると、凍結及び融解後の７日間培養した細胞数が約１０×１０⁴個から約１５×１０⁴個であり、ばらつきが小さかった。一方、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、凍結及び融解後の７日間培養した細胞数が約０．４×１０⁴個から約１５×１０⁴個であり、ばらつきが大きかった。したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、凍結及び融解後の細胞の増殖率が高くなり、かつ安定することが示された。

図６に示すように、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代すると、凍結及び融解後の７日間培養した細胞のコロニー数が約５００個から約８００個であり、ばらつきが小さかった。一方、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、凍結及び融解後の７日間培養した細胞のコロニー数が約３０から約６００であり、ばらつきが大きかった。したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、凍結及び融解後の細胞のコロニー形成率が高くなり、かつ安定することが示された。

（実施例３、比較例３）
実施例１及び比較例１と同様に継代培養して得られたｉＰＳ細胞様の細胞を剥離し、２．５×１０⁵個の細胞をゲル培地に懸濁し、細胞を三次元培養して、細胞にクランプを形成させた。ゲル培地に細胞を播種してから１３日後のクランプ数と細胞数を計測した。実施例１で得た細胞を２回、比較例１で得た細胞を４回試験した結果を図７に示す。

１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代すると、細胞は三次元培養されて３０００個前後のクランプを形成し、試験ごとによるばらつきが小さかった。また、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代すると、細胞は、三次元培養されて約２０００×１０²個になり、試験ごとによるばらつきが小さかった。一方、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、約７０００個のクランプを形成した試験もあったが、死滅してほぼクランプを形成しない試験もあり、試験ごとによるばらつきがおおきかった。また、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、三次元培養されて約５０００×１０²個になる試験もあったが、死滅してほぼ０個になる試験もあり、試験ごとによるばらつきがおおきかった。

したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、その後の三次元培養における細胞の増殖率及びクランプ形成能が高くなり、かつ安定することが示された。

（実施例４、比較例４）
実施例１及び比較例１と同様に継代培養して得られたｉＰＳ細胞様の細胞を剥離し、心筋細胞分化誘導キット（ＰＳＣ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｇｉｂｃｏ、登録商標）を用いて、ｉＰＳ細胞様の細胞を心筋細胞に分化させた。

具体的には、基底膜マトリックス（コーニング マトリゲル、登録商標）で底面を処理した１２ウェルプレートに、ｉＰＳ細胞様の細胞を約２×１０⁴個から約６×１０⁴個播種し、培地にｍＴｅＳＲ１を用いて細胞を培養した。ｉＰＳ細胞様の細胞を播種してから２日後、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ａで培地交換を行った。その２日後、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｂで培地交換を行った。その２日後、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍで培地交換を行った。その後、２日おきに、Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉｕｍで培地交換を行いながら、ｉＰＳ細胞様の細胞を播種してから２２日目まで細胞を培養した。

その結果、図８に示すように、心筋細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代時に全て回収され、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代された細胞は、全ての試験において２２日目に拍動を示した。一方、心筋細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、半分以下の試験においてのみ２２日目に拍動を示した。

また、ＦＡＣＳで、心筋細胞のマーカーである心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）の陽性率を検査したところ、図９に示すように、心筋細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代時に全て回収され、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代された細胞は、ｃＴｎＴの陽性率が約２０％前後であり、安定していた。一方、心筋細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、ｃＴｎＴの陽性率が約１％から約３７％とばらつきが大きかった。

したがって、１回目の継代時にリプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代し、幹細胞を樹立することにより、その後の心筋細胞のような体細胞への分化誘導能が高くなり、かつ安定することが示された。

（実施例５、比較例５）
実施例１及び比較例１と同様に継代培養して得られたｉＰＳ細胞様の細胞を剥離し、１．５×１０⁵個の細胞を細胞塊形成に適した大きさの丸底型ボトムを有する細胞培養プレート（クラレ、ＲＢ ５００ ４００ ＮＡ ６）に播種して培養した。

培地は、ＴＧＦ－β１アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）のＡＬＫ－４、－５、－７の選択的阻害剤（５００ｎｍｏｌ／Ｌ、Ａ－８３－０１、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）及びＢＭＰ Ｔｙｐｅ Ｉ レセプター（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３）の膜透過性の阻害剤（１００ｎｍｏｌ／Ｌ、ＬＤＮ１９３１８９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を添加した８ＧＭＫ培地（８％ ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎｍｏｌ／Ｌ ２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。上記阻害剤の存在下で培養された多能性幹細胞は、神経前駆細胞に分化誘導されることが知られている。

細胞を播種して５日後、８日後、及び１１日後に培地交換を行った。１４日後、細胞塊数を計測したところ、図１０に示すように、神経前駆細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代された細胞は、約２５個から約５５個のニューロスフィアを形成し、ばらつきが小さかった。一方、神経前駆細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、約１０個から約８０個の細胞塊を形成し、ばらつきが大きかった。

また、１４日後の細胞をチューブに回収して遠心を行い、細胞解離剤（ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、登録商標）で細胞塊をシングルセルに分解し、細胞数を計測後、神経細胞接着分子（Ｎ－ＣＡＭ）のポリシアル化分子を検出する抗体であるＰＳＡ－ＮＣＡＭ抗体を利用して、細胞を免疫染色し、フローサイトメトリーでＰＳＡ－ＮＣＡＭの陽性率を解析した。その結果、図１０に示すように、神経前駆細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代された細胞は、ＰＳＡ－ＮＣＡＭの陽性率が約２５％から約３０％であり、ばらつきが小さかった。一方、神経前駆細胞に分化誘導される前に、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、ＰＳＡ－ＮＣＡＭの陽性率が約５％から約１５％であり、ばらつきが大きかった。

したがって、１回目の継代時に、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代し、幹細胞を樹立することにより、その後の神経細胞のような体細胞への分化誘導能が高くなり、かつ安定することが示された。

（実施例６、比較例６）
実施例１及び比較例１と同様に継代培養して得られたｉＰＳ細胞様の細胞を剥離し、細胞を非接着ディッシュに１×１０⁵個播種して培養した。培地は、ｂＦＧＦを添加していないヒトＥＳ細胞培地を用いた。また、２日に１度、培地交換を行った。播種してから９日後、形成された胚様体（ＥＢ）をジェラチンコートされた６ウェルプレートに再播種した。その後、２日に一度培地交換を行い、再播種してから２４日目にトリプシン処理をして細胞を回収した。回収した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＳＯＸ１抗体、ＯＴＣ２抗体、ＨＡＮＤ１抗体、及びＳＯＸ１７抗体のそれぞれを用いて細胞を染色し、染色された細胞をフローサイトメーターを用いて解析した。なお、ＳＯＸ１及びＯＴＸ２は外胚葉のマーカーであり、ＨＡＮＤ１は中胚葉のマーカーであり、ＳＯＸ１７は内胚葉のマーカーである。

その結果、図１１及び図１２に示すように、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代時に全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代された細胞は、各マーカーの陽性率のばらつきが小さかった。一方、リプログラミング因子を導入された後、１回目の継代の際にコロニーピックしてクローニングされた細胞は、各マーカーの陽性率のばらつきが大きかった。したがって、１回目の継代時に、リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することにより、その後の内胚葉、中胚葉、及び外胚葉への分化能が高くなり、かつ安定することが示された。

（参考実施例１）
二次元培養されている繊維芽細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。インフェクションから１４日までに、培養温度を３７℃、３８℃に段階的に上げた。

インフェクションから１０日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュをインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃にした。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図１３に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて継代を１回のみ行った細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅していた。得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の写真を図１４に示す。

（参考実施例２）
二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。細胞を含む溶液の濃度を調整し、１１個以上の細胞同士が接着するよう、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²より高くとなるように細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。細胞が分裂し始めてから、培養温度を３８℃に上げた。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。継代２回目から継代５回目も、１１個以上の細胞同士が接着するよう、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²より高くとなるように細胞をウェルプレートに播種した。継代６回目以降は、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図１５に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、６回目の継代の前までは、細胞内にセンダイウイルスが残存していた。しかし、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した継代６回目以降は、細胞内のセンダイウイルスは急激に消滅した。

（参考実施例３）
センダイウイルスベクターキットであるＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０（登録商標、ＩＤファーマ）を用意した。ＣｙｔｏＴｕｎｅ－ｉＰＳ２．０は、リプログラミング因子としてＫＬＦ４遺伝子、ＯＣＴ３／４遺伝子、及びＳＯＸ２遺伝子を搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、リプログラミング因子としてＫＬＦ４を搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、リプログラミング因子としてｃ－ＭＹＣを搭載する温度感受性センダイウイルスベクターであるＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、を含む。

単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地（ｍＴｅＳＲ Ｐｌｕｓ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＳｔｅｍＦｉｔ（味の素））に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図１６に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、継代８回目で、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。

（参考実施例４）
二次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。途中から、温度を３８℃に上げた。

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１５日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３８℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

抗センダイウイルス抗体を用いて、インフェクションから１５日目、継代をする前の細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価した結果を図１７に示す。また、インフェクションから１５日目の細胞の写真を図１８に示す。抗センダイウイルス抗体を用いて、継代を１回した後の細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価した結果を図１９に示す。図１９に示すように、継代１回目で、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。継代１回目の細胞の写真を図２０に示す。

（参考実施例５）
ポリマー含有血液培地中で三次元培養されている単核球細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ１８＋ｈＫＬＦ４／ＴＳΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、ポリマー含有血液培地をポリマー含有ｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ポリマー含有ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。

インフェクションから１４日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となった。なお、得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の一部を培養器に播種して二次元培養したところ、ｉＰＳ細胞様のコロニーが形成された。また、メッシュを使って細胞塊を回収し、回収された細胞に細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で５分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。途中で温度を３８℃に上げた。

抗センダイウイルス抗体を用いて、継代を２回した細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、図２１に示すように、細胞内のセンダイウイルスはほぼ消滅した。継代を２回した細胞の写真を図２２に示す。

（参考実施例６）
二次元培養されている線維芽細胞に、ＳｅＶ（ＰＭ）ｈＫＯＳ／ＴＳ１２ΔＦと、ＳｅＶ（ＨＮＬ）ｈＣ－Ｍｙｃ／ＴＳ１５ΔＦと、をＭＯＩが５になるよう添加し、多能性幹細胞誘導用のディッシュを３４℃のインキュベーターに収容して、細胞を培養した。インフェクションから２日後、血液培地をｉＰＳ細胞培地に交換した。その後、ｉＰＳ細胞培地を用いて培地交換を２日に１回行った。

インフェクションから８日後、幹細胞様の細胞塊が生じた。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。インフェクションから１４日後、ディッシュに細胞剥離剤であるトリプルセレクトを添加し、室温で１分静置してから、細胞を含む溶液を吸引し、細胞を含む溶液を３７℃で５分から１０分インキュベートした。その後、ｉＰＳ細胞培地を添加し、細胞を含むｉＰＳ細胞培地を１５ｍＬチューブに回収した。血球計算版を用いて細胞数を測定し、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種して１回目の継代をした。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。その後、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになるごとに細胞を継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際も、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図２３に示すように、抗センダイウイルス抗体を用いて細胞を染色し、細胞に残存するセンダイウイルスをフローサイトメーターで評価したところ、１回目の継代の後、細胞内のセンダイウイルスは消滅していた。図２４に示すように、ＰＣＲによっても、細胞に残存するセンダイウイルスは検出されなかった。得られたＴＲＡ１－６０陽性細胞の写真を図２５に示す。

（実施例７、比較例７）
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを線維芽細胞用培地として用意した。ヒトの成人由来の線維芽細胞用培地に、線維芽細胞を懸濁して、線維芽細胞懸濁液を得た。

６ウェルディッシュの１ウェルに対して、１．５ｍＬのＰＢＳと４．８μＬのカイコ由来ラミニン（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１ ｓｉｌｋ、ニッピ）の混合液を加え、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１時間置いた。次に、アスピレータを用いてＰＢＳとラミニンの混合液をウェルから除去し、１ウェルに１．５ｍＬの線維芽細胞懸濁液を加えた。１ウェルにおける線維芽細胞の数は、０．５×１０⁵から２．０×１０⁵個であった。その後、３７℃のインキュベーター中で線維芽細胞を１日間培養した。

次に、培地を幹細胞誘導培地に交換した。交換した培地の量も１．５ｍＬであった。

チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＯＣＴ４のｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、及びＣ－ＭＹＣのｍＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１００μＬ加えた。これらのＲＮＡは、ＨＰＬＣで濃縮精製されていた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を１ウェル中の培地に加えた。その後、３７℃のインキュベーター中にディッシュを１日間置いて、細胞にＲＮＡをトランスフェクトした。以後、同様の手順によるＲＮＡトランスフェクションを１１回繰り返した。

１１回目のＲＮＡトランスフェクションの翌日、細胞を含む溶液の濃度を調整し、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をラミニンでコートされたウェルプレートに播種して１回目の継代をした。実施例７では、１回目の継代の際、ウェルプレートから剥離させた細胞全てを回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を、区別なく次のウェルプレートに播種した。これに対し、比較例７では、１回目の継代の際、コロニーピックしてクローニングした。なお、実施例７及び比較例７ともに、継代の際、１１個以上の細胞同士が接触しなかいよう、細胞を播種した。次に、ウェルディッシュを３７℃のインキュベーターに収容して、細胞を二次元培養した。その後、細胞が６０％から８０％コンフルエントになったときに細胞を１回のみ継代した。２回目以降の継代時も、濃度が０．２５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²以下となるよう細胞をウェルプレートに播種した。この際、１１個以上の細胞同士が接触しなかった。

図２６に示すように、１回目の継代から１日目で、リプログラミング因子が細胞からほぼ消滅し、１回目の継代から２日目で、リプログラミング因子が細胞から完全に消滅した。インフェクションから１０日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。ＴＲＡ１－６０陽性細胞の免疫染色写真を図２７に示す。

実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例１と同様に、クローナルエフィシエンシーのばらつきが小さかった。実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例２と同様に、増殖率及びコロニー形成能が安定していた。実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例３と同様に、三次元培養後のクランプ数と細胞数にばらつきが小さかった。実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例４と同様に、心筋細胞への分化誘導能が安定していた。実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例５と同様に、神経前駆細胞への分化誘導能が安定していた。実施例７に係る方法で樹立された幹細胞は、実施例６と同様に、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉への分化能が安定していた。

比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例１と同様に、クローナルエフィシエンシーのばらつきが大きかった。比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例２と同様に、増殖率及びコロニー形成能のばらつきが大きかった。比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例３と同様に、三次元培養後のクランプ数と細胞数にばらつきが大きかった。比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例４と同様に、心筋細胞への分化誘導能が安定していなかった。比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例５と同様に、神経前駆細胞への分化誘導能が安定していなかった。比較例７に係る方法で樹立された幹細胞は、比較例６と同様に、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉への分化能が安定していなかった。

（実施例８）
実施例１と同様に、単核球細胞にリプログラミング因子を導入した。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。その後、細胞を一度も継代していない段階で、ＭＯＩが２０になるよう、Ｎｇｎ２－Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡを発現させることができるセンダイウイルスにｉＰＳ細胞様の細胞を感染させた。センダイウイルス感染後２日目に、ウェル内の培地を、２μｇ／ｍＬの濃度でピューロマイシンを含む神経誘導培地（Ｎ３培地）に置換し、未感染の細胞を死滅させた。Ｎ３培地は、５００ｍＬのＤＭＥＭＦ１２に、１０ｍＬのＢ２７と、５ｍＬのＮ２と、濃度が６．２５ｍｇ／ｍＬの１．６ｍＬのインスリンを加えて調製した。

センダイウイルス感染後１４日目の細胞の顕微鏡写真を図２８に示す。図２８に示すように、センダイウイルス感染後、細胞が神経系細胞に誘導されていることが、形態的に確認された。

（実施例９）
実施例１と同様に、単核球細胞にリプログラミング因子を導入した。インフェクションから１４日目にほぼ全ての細胞がＴＲＡ１－６０陽性細胞となり、ｉＰＳ細胞様の形態を示した。その後、細胞を一度も継代していない段階で、ｉＰＳ細胞様の細胞を免疫不全マウス精巣に移植した。数週間後、マウスからテラトーマを摘出し、摘出したテラトーマから組織切片を作製して、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色して、顕微鏡観察した。結果を図２９に示す。組織切片中に、分泌組織様構造、神経管様構造、腸管様構造、及び軟骨、骨様構造が観察された。

（実施例１０）
チンパンジー由来の繊維芽細胞を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、チンパンジー由来の繊維芽細胞にｍＲＮＡを導入した。その結果、図３０に示すようにｉＰＳ細胞様のコロニー形成が認められた。維持培養された細胞をＯｃｔ３／４に対する抗体で免疫染色したところ、図３１（ａ）に示すように、細胞はＯｃｔ３／４陽性を示した。また、維持培養された細胞をＮａｎｏｇに対する抗体で免疫染色したところ、図３１（ｂ）に示すように、細胞はＮａｎｏｇ陽性を示した。また、図３２に示すように、誘導細胞がＴＲＡ－１－６０陽性であることを確認した。

樹立されたチンパンジー由来の幹細胞を、心筋細胞へ分化誘導した。得られた心筋細胞の写真を図３３に示す。

また、樹立されたチンパンジー由来の幹細胞を、神経細胞へ分化誘導した。得られた心筋細胞の写真を図３４に示す。神経細胞は、Ｍｕｎｃｈ１３陽性及びｖＧｌｕｔ陽性であることが確認された。

（実施例１１）
健常者の尿を３００ｍＬ採取し、５０ｍＬファルコンチューブに６本ずつ尿を分注して、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのＰＢＳをチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。遠心後、チューブから上清を除き、３０ｍＬのプライマリー培地をチューブに入れ、４００Ｇで５分間、チューブを遠心した。プライマリー培地は、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、１１３２０－０３３）に、ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ、１０４３７０２８、終濃度１０％）、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ Ｋｉｔ ＣＣ－４１２７ ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ、１０００分の１量）、及びＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｇｉｂｃｏ、１５２４００６２、１００分の１量）を添加して調製した。遠心後、チューブから上清を除き、１ｍＬのプライマリー培地で細胞を懸濁し、ジェラチンコートした２４ウェルプレートの１ウェルに細胞を播種し、３７℃のインキュベーターで細胞をインキュベートした。細胞播種後２日間はプライマリー培地を３００μＬウェルに添加し、３日目以降からは上皮細胞用培地を用いて培地交換した。上皮細胞用培地は、腎上皮細胞基本培地（Ｌｏｎｚａ）にＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ Ｋｉｔ ＣＣ－４１２７ ＲＥＧＭ （Ｌｏｎｚａ）を添加して調製した。６日間拡大培養した後の細胞の顕微鏡画像を図３５に示す。播種から７日目に細胞を１回目の継代をし、さらに細胞を拡大培養し、１回目の継代から７日目に細胞を２回目の継代をした。２回目の継代から６日目の細胞の顕微鏡画像を図３６に示す。

（実施例１２）
ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例１１で用意した尿由来の細胞を１×１０⁴個から１×１０⁵個播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、トランスフェクション試薬と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＲＮＡとの混合物を培地に添加し、当該培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。その翌日の細胞の顕微鏡画像を図３７に示す。ＧＦＰの発現が認められたことから、尿由来の細胞にトランスフェクションを行えることが示された。

（実施例１３）
ラミニン５１１をコートしたディッシュを、多能性幹細胞誘導用のディッシュとした。多能性幹細胞誘導用のディッシュに、実施例１１で用意した尿由来の細胞を１×１０⁴個から１×１０⁵個播種し、３７℃でインキュベートした。培地は上皮細胞用培地を用いた。翌日、チューブＡとチューブＢを用意し、チューブＡ中の１２５μＬのＰＢＳにＭ₃ＯのｍＲＮＡ、ＳＯＸ２のｍＲＮＡ、ＫＬＦ４のｍＲＮＡ、Ｃ－ＭＹＣのｍＲＮＡ、及びＬＩＮ２８のｍＲＮＡの混合物（１００ｎｇ／μＬ）を０．１μＬから１０²μＬ加えた。これらのＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）で修飾されていた。また、これらのＲＮＡは、ＨＰＬＣで実質的に１本鎖ＲＮＡに濃縮精製されていた。ＲＮＡの２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比（Ａ₂₆₀／Ａ₂₈₀）は、１．７１から２．１であり、タンパク質が実質的に混入していないことが確認された。また、抗２本鎖ＲＮＡ抗体Ｊ２を用いてドットブロット分析したところ、２本鎖ＲＮＡは９０％以上除去されていた。チューブＢ中の１２５μＬのＰＢＳに０．１μＬから１００μＬのリポフェクション試薬を加えた。次に、チューブＡ中の溶液とチューブＢ中の溶液を混合し、混合液を１０分間室温で放置し、全量の混合液を、Ｂ１８Ｒ等を利用せずトランスフェクション用培地に添加し、当該トランスフェクション用培地を用いて培地交換を行い、３７℃でインキュベートした。トランスフェクションは１０日間、１日に１回行った。細胞播種後、１、５、７、１４日目に観察を行った。図３８に示すように、日が進むにつれてＥＳ細胞様に細胞の形態が変化したことが認められた。

（実施例１４）
実施例１３と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、回収して混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代の際には、コロニーをピックアップせず、ディッシュ上の細胞全体を回収し、１×１０²個から１×１０⁵個の細胞をディッシュに播種した。継代してから６日目の細胞の顕微鏡画像を図３９に示す。ＥＳ細胞様の細胞が確認された。

（実施例１５）
実施例１３と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に細胞をディッシュから剥がし、一部の細胞をフローサイトメトリーで分析したところ、図４０（ａ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。また、１４日目にディッシュから剥がされた細胞を継代し、７日後にフローサイトメトリーで分析したところ、図４０（ｂ）に示すように、ＴＲＡ－１－６０陽性であることが確認された。

（実施例１６）
実施例１３と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目に全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから７日後、細胞を固定し、抗ＯＣＴ３／４抗体及び抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図４１に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＯＣＴ３／４及びＮＡＮＯＧの発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図４１（ｄ）は、抗ＯＣＴ３／４抗体を用いて染色した細胞の写真と、抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。

（実施例１７）
実施例１３と同様に、尿由来の細胞にトランスフェクションを１０日間行った。細胞を播種して１１日目から幹細胞用培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、味の素）で細胞を培養し、１４日目にトリプルセレクトを用いて全ての細胞をディッシュから剥がし、剥がして混じり合った細胞の一部を培地に播種して継代した。継代後の培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）を用いた。継代してから7日後、細胞を固定し、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて、細胞を染色した。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）による核の化学染色も行った。その結果、図４２に示すように、多能性幹細胞の特異的マーカーであるＬＩＮ２８の発現が細胞核で確認された。したがって、尿由来の細胞から、ＲＮＡを利用して多能性幹細胞を誘導できることが示された。なお、図４２（ｄ）は、抗ＬＩＮ２８抗体を用いて染色した細胞の写真と、Ｈｏｅｃｈｓｔ（登録商標）を用いて染色した細胞の写真と、を合成した写真である。

Claims (23)

1. リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、
   前記リプログラミング因子を導入された全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することと、
   を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法。
2. 前記継代することにおいて、細胞をクローニングしない、請求項１に記載の方法。
3. 前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離することを含まない、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記リプログラミング因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングすることを含まない、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記リプログラミング因子を導入された細胞であって、培養器に付着している全ての細胞を回収し、回収した細胞の少なくとも一部を培地に播種する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を遺伝子発現状態で区別することなく継代する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記リプログラミング因子を導入された細胞をリプログラミングの程度で区別することなく継代する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を凍結することをさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を、内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系から選択される少なくとも１つに分化させることをさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記リプログラミング因子を導入された細胞から胚様体、オルガノイド、及びスフィアから選択される少なくとも１つを形成することをさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導することをさらに含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記体細胞に誘導する処理をした後、前記処理された細胞をクローニングすることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記リプログラミング因子を導入された細胞に遺伝子編集処理をすることをさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記リプログラミング因子を導入された細胞が、血液細胞又は線維芽細胞由来である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記リプログラミング因子を導入される細胞が、尿に含まれる細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記リプログラミング因子を導入される細胞が、膀胱上皮細胞である、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
17. 尿から前記リプログラミング因子を導入される細胞を収集することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記リプログラミング因子を導入された細胞が、複数のヒト又は複数の非ヒト動物由来である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を閉鎖された培養器内で培養する、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
20. リプログラミング因子を導入された細胞を培養することと、
    前記リプログラミング因子を導入された細胞を継代せずに、多能性幹細胞とは異なる体細胞に誘導すること、
    を含む、リプログラミング因子を導入された細胞の培養方法。
21. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を凍結することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を、内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系から選択される少なくとも１つに誘導することをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
23. 前記リプログラミング因子を導入された細胞を閉鎖された培養器内で培養する、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法。

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