JP2008518639A - 染色体異数性の検出方法 - Google Patents
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Abstract
胎児染色対異数性の非侵襲性検出を実証する。胎児ＲＮＡを含有する生物学的サンプル（例えば、母体血）中に存在する胎児ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子を、検出および定量し、該対立遺伝子の比率を測定する。この比率を、正倍数性胎児からなる標準コントロールと比較する。対立遺伝子比率の逸脱は、染色体異数性の存在を示す。
Description
関連出願の相互参照
本願は、２００５年３月１８日に出願された米国仮出願第６０／６６３，１７３号に対して優先権を主張する。
本願は、２００５年３月１８日に出願された米国仮出願第６０／６６３，１７３号に対して優先権を主張する。
適用されず（NOT APPLICABLE）
発明の背景
染色体異数性は、出生前および出生後生活の間の死亡率の重要な原因である。染色体異数性の評価は、伝統的に、胎児の生存能力および出生前診断の研究と関連してきた。染色体異数性の検出およびキャラクタライゼーションのための方法としては、分裂中期染色体の核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Homer, J. et al., Prenat Diagn 23:566-571 (2003)）、定量蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mann, K. Methods MoI Med 92:141-156 (2004)）、遺伝子量ＰＣＲ（Zimmermann, B. et al., Clin Chem 48:362-363 (2002)）、およびアレイによる比較ゲノムハイブリダイゼーション（array-based comparative genomic hybridization）（ＣＧＨ）（Hu, D.G. et al., MoI Hum Reprod (2004)）が挙げられる。
発明の背景
染色体異数性は、出生前および出生後生活の間の死亡率の重要な原因である。染色体異数性の評価は、伝統的に、胎児の生存能力および出生前診断の研究と関連してきた。染色体異数性の検出およびキャラクタライゼーションのための方法としては、分裂中期染色体の核型分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）（Homer, J. et al., Prenat Diagn 23:566-571 (2003)）、定量蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Mann, K. Methods MoI Med 92:141-156 (2004)）、遺伝子量ＰＣＲ（Zimmermann, B. et al., Clin Chem 48:362-363 (2002)）、およびアレイによる比較ゲノムハイブリダイゼーション（array-based comparative genomic hybridization）（ＣＧＨ）（Hu, D.G. et al., MoI Hum Reprod (2004)）が挙げられる。
胎児染色体異数性は、胎児消失に有意に寄与すると知られており、そして第１期自然流産の５０％を占める（Chitty, L. Br Med Bull 54:839- 856 (1998)）。生存可能な胎児は、特に、特定のタイプの染色体異数性に関連している。２１トリソミー、即ちダウン症候群は、８００の出生のうち１の発生を伴って出生後の生存と適合性である最も一般的な常染色体異数性である（Hook, E. B. Lancet 2:169-172 (1981)）。２１トリソミーは、カップルが出生前診断を選択する最も一般的な理由である。現在、２１トリソミー胎児および他の染色体異数性の確定的な診断は、羊水穿刺および絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）のような侵襲的手技によって得られる胎児遺伝物質の遺伝子分析に依存する。それらの侵襲的性質によって、これらの手技は、自然流産の有限の危険と関連する。したがって、他の非侵襲的アプローチが、２１トリソミー胎児を妊娠している危険性に従って妊娠を層別化するために開発されてきた。胎児消失の手技関連危険性よりも大きな危険性として定義される、本質的な危険性を有する妊娠だけが、侵襲的手技を受けるよう推奨される。現在使用されている危険性層別化戦略は、母体年齢、母体血清生化学マーカーおよび胎児超音波特徴の評価を含む（Nicolaides, K. H. et al., Prenat Diagn 22:308-315 (2002)）。
より良い感度および特異性に得るために、マーカーおよびアプローチの種々の組合せが、評価されてきており（WaId, N. J. et al., Prenat Diagn 17:821-829 (1997)）、三重テスト（triple test）、四重テスト（quadruple test）（WaId, N. J. et al., Lancet 361:835-836 (2003)）、統合テスト（integrated test）（WaId, N. J. et al., N Engl J Med 341:461-467 (1999)）および第１期スクリーニング（Wapner, R. et al., N Engl J Med 349:1405-1413 (2003)）を含む。使用される血清生化学マーカーとしては、アルファフェトプロテイン、複合体化していないエストリオール、トータルまたはフリーのベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、インヒビン−Ａおよび妊娠と関連する血漿蛋白質−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）が挙げられる。それらのスクリーニング様式により危険性が高いと示される妊娠は、結局、羊水穿刺またはＣＶＳに委ねられる。
最近、母体血漿中の循環無細胞胎児核酸の発見により、非侵襲的にサンプル化され得る胎児遺伝物質の代替供給源が提供された（Lo, Y. M. D. et al., Lancet 350:485-487 (1997); Poon, L. L. M. et al., Clin Chem 46:1832-1834 (2000)）。更に、２１トリソミー胎児を妊娠している女性の血漿中の循環胎児ＤＮＡ濃度は、正倍数性の胎児を妊娠している女性中のそれより有意に高いことが示された（Lo, Y. M. D. et al., Clin Chem 45:1747-1751 (1999); Zhong, X. Y. et al., Prenat Diagn 20:795-798 (2000)）。最近、循環胎児ＲＮＡも、母体血漿中の性別に無関係の胎児核酸マーカーのクラスとして見込みがあると示された（Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 49:727-731 (2003); Ng, E. K. O. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:4748-4753 (2003)）。したがって、循環胎児核酸定量は、妊娠の危険性層別化のためのさらなる出生前スクリーニングマーカーとして有用である。
胎盤発現されるｍＲＮＡ転写物、例えば、ヒト胎盤性ラクトゲン（human placental lactogen）（ｈＰＬ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピンベータサブユニット（human chorionic gonadotropin beta subunit）（βｈＣＧ）（Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 49:727-731 (2003)）、コルチコトロピン放出ホルモン（corticotropin releasing hormone）（ＣＲＨ）（Ng, E. K. O. et al, Proc Natl Acad Sci U S A 100:4748-4753 (2003b)）、組織因子経路インヒビター２（tissue factor pathway inhibitor 2）（ＴＦＰＩ２）、ＫｉＳＳ−１ 転移−サプレッサ（KiSS-1 metastasis-suppressor）（ＫＩＳＳ１）および胎盤特異的１（placenta-specific 1）（ＰＬＡＣ１）（Tsui, N. B. Y. et al., J Med Genet 41:461-7 (2004)）をコードするものが、母体血漿中で検出可能であると示された。これらの胎盤由来のｍＲＮＡ種は、妊娠特異的であることが知られている（Ng, E. K. O. et al., Proc Natl Acad Sci USA 100:4748-4753 (2003)；Tsui, N. B. Y. et al., J Med Genet 41:461-7 (2004)）。特に、母体血漿中のＣＲＨ ｍＲＮＡ濃度の異常な上昇が、妊娠中毒症妊娠において報告されている（Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 49:727-731 (2003)）。これらの胎盤発現されるマーカーは妊娠特異的であるが、性別および多型性に無関係であるので、それらは全ての妊娠の非侵襲的出生前評価において有用である。
染色体異数性は、異数性染色体上に局在する遺伝子の量を変化させる。変化された遺伝子量は、遺伝子の歪められた対立遺伝子比率によって反映され得る。歪められた対立遺伝子比率は、次に、異数性染色体上の遺伝子座のＲＮＡ転写物上に存在する多型の対立遺伝子の歪められた比率によって反映される。このような多型の１例は、一塩基多型（ＳＮＰ）であり、ここで、ＳＮＰ対立遺伝子の比率は、関連する染色体の異数性の存在において歪められ得る。したがって、ＲＮＡ−ＳＮＰ比率についての参照範囲は、正常な妊娠について確立され、そして胎児２１トリソミーは、該参照比率からの偏差（deviation）が観察される場合に決定され得る。分析の従来の細胞遺伝学的方法と比較して、提案される技術は、胎児細胞の事前培養を必要とせず、したがって分析時間を短縮する。さらに、母体血サンプルは、非侵襲的に得ることができ、したがって、胎児および母体の両方に対する潜在的な害を最小限にする。
発明の簡単な要旨
１つの実施形態において、本発明は、染色体が正常である胎児を妊娠している妊婦において見られる比率と比較して、妊婦の胎児由来のＲＮＡ転写物分子の対立遺伝子の比率を使用する、妊婦の胎児における染色体異常の存在を検出するための改善された方法を提供する。この様式での該比率の使用は、特に、存在する特定のＲＮＡ転写物の総濃度または特定の対立遺伝子の量を単に定量することと比較して、胎児の染色体異常を検出することにおいて優れた感度を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、染色体が正常である胎児を妊娠している妊婦において見られる比率と比較して、妊婦の胎児由来のＲＮＡ転写物分子の対立遺伝子の比率を使用する、妊婦の胎児における染色体異常の存在を検出するための改善された方法を提供する。この様式での該比率の使用は、特に、存在する特定のＲＮＡ転写物の総濃度または特定の対立遺伝子の量を単に定量することと比較して、胎児の染色体異常を検出することにおいて優れた感度を提供する。
前記方法の第１工程は、妊婦の胎児におけるＲＮＡ転写物の対立遺伝子の比率を測定することを含む。これは、妊婦からＲＮＡ含有生物学的サンプルを得ることによって達成され、ここで、該ＲＮＡ含有生物学的サンプルは胎児ＲＮＡを含有する。次いで、問題の少なくも１つの染色体由来の少なくとも１つの遺伝子座から転写されたＲＮＡから対立遺伝子が識別され、続いて、該ＲＮＡ転写物の対立遺伝子の比率が測定される。第２工程は、前記妊婦由来の前記比率と、染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦から得られた比較可能な生物学的サンプル由来の対立遺伝子の平均比率を示す標準コントロールとを比較することを包含し、ここで、標準コントロールからの該比率の増加または減少は、染色体異常を有する胎児を有する増加した危険性を示す。
ある実施形態において、本発明は、染色体異常が、２１トリソミー、１８トリソミーおよび１３トリソミーからなる群から選択されるメンバーである方法を提供する。他の実施形態において、染色体異常は２１トリソミーである。別の実施形態において、染色体異常は１３トリソミーである。さらなる実施形態において、染色体異常は１８トリソミーである。なお別の実施形態において、染色体異常はＸ染色体またはＹ染色体に関連する。
別の実施形態において、本発明は、ＲＮＡ含有生物学的サンプルを得る工程由来の前記生物学的サンプルが、母体血、母体血漿または血清、羊水、絨毛膜絨毛サンプル（chorionic villus sample）、着床前胚由来の生検材料、母体血から単離された胎児有核細胞または胎児細胞レムナント（fetal nucleated cells or fetal cellular remnants）、母体尿、母体唾液、女性生殖管の洗浄物、およびセロセンテシス（celocentesis）によって得られるサンプルからなる群から選択されるメンバーである方法を提供する。なお別の実施形態において、生物学的サンプルは、母体血である。なお別の実施形態において、生物学的サンプルは、絨毛膜絨毛サンプルである。さらなる実施形態において、生物学的サンプルは、母体血中の細胞エレメントまたは細胞レムナント（cellular remnants）を含有する。
他の実施形態において、本発明は、ＲＮＡ含有生物学的サンプルを得る工程由来の前記胎児ＲＮＡが、胎盤に由来する方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、ＲＮＡの対立遺伝子を識別する前記工程が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む方法を提供する。
さらなる実施形態において、本発明は、ＲＮＡの対立遺伝子を識別する前記工程および／または異なる対立遺伝子の比率を測定する前記工程が、プライマー伸長反応、質量分析、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識プローブを使用するハイブリダイゼーション、直接配列決定（direct sequencing）、クローニングおよび配列決定、ならびに電気泳動からなる群から選択されるメンバーを使用して行われる方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、ＲＮＡの対立遺伝子を識別すること、異なる対立遺伝子の比率を測定すること、および前の工程からの比率を標準コントロールと比較することを含む前記工程の対立遺伝子が、配列変異（sequence variation）によって区別される方法を提供する。別の実施形態において、前記配列変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。さらなる実施形態において、前記配列変異は、挿入／欠失多型である。なお別の実施形態において、前記配列変異は、シンプルタンデムリピート多型（simple tandem repeat polymorphism）である。
他の実施形態において、本発明は、前記ＲＮＡが、第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体からなる群から選択されるメンバーから転写される方法を提供する。別の実施形態において、前記ＲＮＡは、第２１染色体から転写される。さらなる実施形態において、前記ＲＮＡは、第１８染色体から転写される。なお別の実施形態において、前記ＲＮＡは、第１３染色体から転写される。
別の実施形態において、本発明は、母体血のレベルの２倍またはそれを超えるレベルで、前記ＲＮＡが胎盤において発現される方法を提供する。ある実施形態において、前記ＲＮＡは、母体血のレベルの５倍またはそれを超えるレベルで胎盤において発現される。他の実施形態において、前記ＲＮＡは、母体血のレベルの１０倍またはそれを超えるレベルで胎盤において発現される。
さらなる実施形態において、本発明は、前記ＲＮＡがｍＲＮＡである方法を提供する。別の実施形態において、前記ＲＮＡは、コラーゲンＶＩアルファ１（collagen VI alpha 1）（ＣＯＬ６Ａ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（superoxide dismutase 1）（ＳＯＤ１）、コラーゲンＶＩアルファ２（collagen VI alpha 2）（ＣＯＬ６Ａ２）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼＯサブユニット（mitochondrial ATP synthase O subunit）（ＡＴＰ５Ｏ）、ＢＴＧファミリー，メンバー３（BTG family, member 3）（ＢＴＧ３）、ディスインテグリン−ライク・アンド・メタロプロテアーゼ（レプロリシンタイプ）・ウィズ・トロンボスポンジンタイプ１モチーフ，１（a disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 1）（ＡＤＡＭＴＳ１）、ベータ位ＡＰＰ切断酵素２（beta-site APP-cleaving enzyme 2）（ＢＡＣＥ２）、インターセクチン１（intersectin 1）（ＩＴＳＮ１）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体蛋白質（amyloid beta (A4) precursor protein）（ＡＰＰ）、ＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ０複合体，サブユニットＦ６（ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit F6）（ＡＴＰ５Ｊ）、ダウン症候群重要領域遺伝子５（Down syndrome critical region gene 5）（ＤＳＣＲ５）、胎盤特異的４（placenta-specific 4）（ＰＬＡＣ４）、仮想蛋白質ＢＣ００５１０７（hypothetical protein BC005107）（ＬＯＣ９０６２５）、リボソーム蛋白質Ｌ１７（ribosomal protein L17）（ＲＰＬ１７）、セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（serpin peptidase inhibitor clade B (ovalbumin) member 2）（ＳＥＲＰＩＮＢ２）およびコラーゲンＩＶ型アルファ２（collagen type IV alpha 2）（ＣＯＬ４Ａ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子座から転写される。なお別の実施形態において、前記ＲＮＡは、一塩基多型を含む遺伝子座から転写される。他の実施形態において、前記ＲＮＡは、コラーゲンＶＩアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）およびコラーゲンＶＩアルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子座から転写される。なお他の実施形態において、遺伝子座ＣＯＬ６Ａ１ ＳＮＰから転写される前記ＲＮＡは、Ａｒｇ８５０ＨｉｓまたはＳｅｒ９３２ｓｅｒである。なお別の実施形態において、遺伝子座ＣＯＬ６Ａ２ ＳＮＰから転写される前記ＲＮＡは、Ｖａｌ７２８Ｖａｌである。
別の実施形態において、本発明は、前記ＲＮＡが胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）についての遺伝子座から転写される方法を提供する。なお別の実施形態において、前記ＲＮＡは、ＡＦ２６９２８７、ＡＫ０２７８６８、ＡＫ０９２４３１、ＢＣ０９３６８５、ＢＣ１０１６１５、ＢＣ１０１６１７、Ｌ１３１９７、ＮＭ＿１８２８３２およびＬＯＣ１９１５８５等の、ＰＬＡＣ４遺伝子の任意の変異体から転写される。なおさらに別の実施形態において、ＰＬＡＣ４遺伝子の遺伝子座から転写されるＲＮＡは、以下からなる群から選択される一塩基多型または挿入−欠失多型（insertion-deletion polymorphism）を含む：ｒｓ３８０４０２６、ｒｓ４８１８２１９、ｒｓ９９７７００３、ｒｓ７８４４、ｒｓ９０１５、ｒｓ１３６４３、ｒｓ９３０５７２９、ｒｓ９３０５７３０、ｒｓ５０１９１９５、ｒｓ５０１９１９４、ｒｓ５８４４０６９、ｒｓ１０４９９０４、ｒｓ１６９９８０８９、ｒｓ１２４８２１１６、ｒｓ１１９０９４３９、ｒｓ７２７８６５９、ｒｓ１２１０６４０９、ｒｓ１２１０６３９５、ｒｓ１２１０６４０１、ｒｓ１２１０６４３４、ｒｓ２１８３５８４、ｒｓ３９４９７２５、ｒｓ８１３０８３３、ｒｓ１０２２２１４５およびｒｓ９９８１４７８、あるいはＰＬＡＣ４−４１４７１１４５およびＰＬＡＣ４−４１４７６２３６等のＰＬＡＣ４遺伝子座内に局在する他の多型。
ある実施形態において、本発明は、前記妊婦が妊娠第１期の間にある方法を提供する。他の実施形態において、前記妊婦は、妊娠の第２期または第３期の間にある。
さらなる実施形態において、本発明は、妊婦の胎児におけるＲＮＡ転写物の対立遺伝子の前記比率が前記標準コントロールから１標準偏差より高いかまたはより低い場合、前記比較工程が、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す方法を提供する。別の実施形態において、前記比較工程は、妊婦の胎児におけるＲＮＡ転写物の対立遺伝子の前記比率が前記標準コントロールから２標準偏差より高いかまたはより低い場合、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す。ある他の実施形態において、前記比較工程は、妊婦の胎児におけるＲＮＡ転写物の対立遺伝子の前記比率が前記標準コントロールから３標準偏差より高いかまたはより低い場合、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す。
別の実施形態において、本発明は、妊婦における染色体異常を有する胎児の存在を検出するためのキットを提供する。該キットの１コンポーネントは、問題の領域を増幅するためのプライマーである。該キットの別のコンポーネントは、染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦から得られた比較可能な生物学的サンプル由来の対立遺伝子の平均比率を示す標準コントロールである。なお別の実施形態において、該キットの第３コンポーネントは、各ＲＮＡ種の異なる対立遺伝子間を識別するためのハイブリダイゼーションプローブを含む。
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、用語「染色体異常（chromosomal disorder）」は、通常、染色体の数が、通常のハプロイド数の正確な倍数でない染色体異常（chromosomal abnormality）の状態を指し：しばしば、追加の染色体が存在するか、または１つの染色体が失われている。ある場合には、「染色体異常」はまた、１以上の染色体の比率が、例えば染色体転座により、通常のハプロイド数の正確な倍数でない、染色体異常の状態を指し得る。一般的な染色体異常は、異数性である。染色体異数性の一般的な形態は、１つのさらなる染色体が存在するトリソミーである。例えば、１８トリソミーは、第３の第１８染色体が細胞中に見られる染色体異常であり、一方、２１トリソミーに苦しむ患者の細胞中には、第３の第２１染色体が存在する。染色体転座（例えば、第１４染色体の一部が余分な第２１染色体によって置換される、第２１染色体および第１４染色体の間の転座）は、部分的な２１トリソミーを引き起こし得る。
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、用語「染色体異常（chromosomal disorder）」は、通常、染色体の数が、通常のハプロイド数の正確な倍数でない染色体異常（chromosomal abnormality）の状態を指し：しばしば、追加の染色体が存在するか、または１つの染色体が失われている。ある場合には、「染色体異常」はまた、１以上の染色体の比率が、例えば染色体転座により、通常のハプロイド数の正確な倍数でない、染色体異常の状態を指し得る。一般的な染色体異常は、異数性である。染色体異数性の一般的な形態は、１つのさらなる染色体が存在するトリソミーである。例えば、１８トリソミーは、第３の第１８染色体が細胞中に見られる染色体異常であり、一方、２１トリソミーに苦しむ患者の細胞中には、第３の第２１染色体が存在する。染色体転座（例えば、第１４染色体の一部が余分な第２１染色体によって置換される、第２１染色体および第１４染色体の間の転座）は、部分的な２１トリソミーを引き起こし得る。
本明細書中で使用される場合、用語「ＲＮＡ含有生物学的サンプル」は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含有する生物学的サンプル（例えば、以下に議論するもの）をいう。ＲＮＡは、ヒトゲノムにおける予め選択された位置の少なくとも一部に対応する配列を有するリボヌクレオチドのポリマーをいう。本明細書中で使用されるＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡおよびマイクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＮＡは、ｍＲＮＡ等の、蛋白質コード配列、あるいはリボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたは十分に規定された機能を有さない他の転写された配列等の、非コード配列であり得る。ｍＲＮＡは、遺伝子のＤＮＡから転写されたＲＮＡ分子であり、そしてそれから蛋白質がリボソームの作用により翻訳される。リボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、蛋白質に翻訳されない非コードＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらの機能によってではなく、それらの起源によって識別される「低分子ＲＮＡ」のサブタイプである。マイクロＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド未満であり、そしてＤＮＡから転写されるが蛋白質へ翻訳されない。当業者は、他のタイプのＲＮＡも本発明において有用であることを理解する。
本明細書中で使用される場合、用語「胎児の」、「胎盤由来」および「胎盤発現された」は、妊婦由来の生物学的サンプル（例えば、血液）中において検出可能である特定のＲＮＡ種の起源を指す。例えば、胎児ＲＮＡ種は、胎児ＤＮＡ配列から転写されたものである。胎盤由来または胎盤発現されたＲＮＡは、胎児ＲＮＡの一種である。当業者は、他の胎児ＲＮＡも本発明において有用であることを理解する。胎盤由来または胎盤発現されたＲＮＡ種は、胎盤において転写されるものである。
本明細書中で使用される場合、用語「問題の少なくとも１つの染色体由来の少なくとも１つの遺伝子座から転写されたＲＮＡ由来の対立遺伝子を識別する」は、染色体上の特定の遺伝子座から転写された特定のＲＮＡ対立遺伝子の検出および定量を指す。対立遺伝子の検出および定量は、ハイブリダイゼーションプローブおよび定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）の使用を含む、種々の方法によって行われ得る。他の方法としては、質量分析（ＭＳ）、電気泳動、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、プライマーエクステンションマイクロアレイ、チップおよびシーケンシングの使用が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「対立遺伝子の比率」は、生物学的サンプル中の一方の対立遺伝子の集団と他方の対立遺伝子の集団の比率を指す。ある場合には、トリソミーにおいて、胎児が特定の座について３対立遺伝子性（tri-allelic）であり得ることが可能である。このような場合において、用語「対立遺伝子の比率」は、他方の対立遺伝子うちの１つに対するいずれか一方の対立遺伝子、あるいは他方の２つの対立遺伝子に対するいずれか一方の対立遺伝子の集団の比率を指す。
本明細書中で使用される場合、用語「標準コントロール」は、特定の遺伝子座、例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤｌ、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２から転写されるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の比率を測定するための、本発明の方法の使用に好適なサンプルをいう。このようなサンプルは、染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦におけるこのようなＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の平均比率を厳密に反映する、特定の遺伝子座から転写される既知の比率のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を含有する。標準コントロールはまた、平均値比率（mean ratio）、中央値比率（median ratio）、あるいは当業者に公知の別の有用な比率を示し得る。標準コントロールの測定は、以下により詳細に記載される。
本明細書中で使用される場合、用語「妊婦」は、染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦のグループを指し、そして、染色体が正常である胎児を妊娠している女性の無作為に選択されるグループの代表である、特定の特徴（例えば、問題の遺伝子座から転写されたＲＮＡ対立遺伝子の比率）を指す。この選択されるグループは、十分な数の女性を含むべきであり、その結果、これらの女性の中で問題の遺伝子座から転写されるＲＮＡ対立遺伝子のアベレージ（average）、平均（mean）、中央（median）または他の数学的関係比率が、論理的な正確さで、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦の一般的な集団におけるＲＮＡ対立遺伝子の比率を反映するようになる。母親は、妊娠第１期、妊娠の最初の約１３週の間、胎児染色体異数性の危険性についてスクリーニングされ得る。母親は、妊娠の第２期または第３期の間にもスクリーニングされ得る。妊娠第２期は、妊娠の約１４〜約２７週である。妊娠第３期は、約２８週から妊娠の終了、約４０週までである。さらに、テストのための好ましい妊娠期間はまた、テストにおいて使用されるＲＮＡマーカーに依存し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「染色体が正常である」は、染色体の数が、ハプロイド数の正確な倍数であり（例えば、ハプロイドにおいて見られる染色体数の２倍）、かつ各々の染色体が同数で存在する（例えば男性の場合における性染色体を除く；ここで、２つの異なる性染色体、ＸおよびＹが、各々１つのコピーで存在する）状態をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「標準コントロールからの比率の増加または減少」は、標準コントロールと比較した場合の該比率の正または負の変化を指す。増加は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも１００％である。同様に、減少は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも５０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％である。さらに、前記比率の増加または減少は、標準コントロールから少なくとも１標準偏差であり得る。前記増加または減少はまた、標準コントロールから少なくとも２標準偏差であり得る。前記増加または減少はまた、標準コントロールから少なくとも３標準偏差であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「一塩基多型」（ＳＮＰ）は、単一ヌクレオチドの変更を含む核酸配列変異（nucleic acid sequence variation）を指す。本発明において有用なＳＮＰとしては、以下を含むがこれらに限定されない問題の遺伝子座から転写される対応のＲＮＡ転写物上に存在するものが挙げられる：コラーゲンＶＩアルファ１（collagen VI alpha 1）（ＣＯＬ６Ａ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（superoxide dismutase 1）（ＳＯＤ１）、コラーゲンＶＩアルファ２（collagen VI alpha 2）（ＣＯＬ６Ａ２）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼＯサブユニット（mitochondrial ATP synthase O subunit）（ＡＴＰ５Ｏ）、ＢＴＧファミリー，メンバー３（BTG family, member 3）（ＢＴＧ３）、ディスインテグリン−ライク・アンド・メタロプロテアーゼ（レプロリシンタイプ）・ウィズ・トロンボスポンジンタイプ１モチーフ，１（a disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 1）（ＡＤＡＭＴＳ１）、ベータ位ＡＰＰ切断酵素２（beta-site APP-cleaving enzyme 2）（ＢＡＣＥ２）、インターセクチン１（intersectin 1）（ＩＴＳＮ１）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体蛋白質（amyloid beta (A4) precursor protein）（ＡＰＰ）、ＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ０複合体，サブユニットＦ６（ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit F6）（ＡＴＰ５Ｊ）、ダウン症候群重要領域遺伝子５（Down syndrome critical region gene 5）（ＤＳＣＲ５）、胎盤特異的４（placenta-specific 4）（ＰＬＡＣ４）、仮想蛋白質ＢＣ００５１０７（hypothetical protein BC005107）（ＬＯＣ９０６２５）、リボソーム蛋白質Ｌ１７（ribosomal protein L17）（ＲＰＬ１７）、セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（serpin peptidase inhibitor clade B (ovalbumin) member 2）（ＳＥＲＰＩＮＢ２）およびコラーゲンＩＶ型アルファ２（collagen type IV alpha 2）（ＣＯＬ４Ａ２）。このようなＳＮＰは、ＲＮＡ上の単一ヌクレオチドの変更を含むので、ＲＮＡ−ＳＮＰと呼ばれる。次いで、ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子を、本発明において使用し、妊婦から得られる生物学的サンプル中のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の比率を測定し、そして該比率を、正常な胎児を各々妊娠している妊婦のグループから得られる生物学的サンプルから得られる比率と比較する。当業者は、他のマーカーならびに挿入／欠失多型もまた本発明において有用であることを理解する。
本明細書中で使用される場合、用語「母体血」は、可能性のある妊娠について検査される女性または妊婦由来の血液サンプルまたは調製物をいう。該用語は、全血または血液のいずれの分画をも含む。「母体血」の例としては、血漿および血清が挙げられる。細胞を本質的に含有しない母体血サンプルはまた、「無細胞性（acellular）」と呼ばれ、ここで一般的に血小板は存在しない。
本明細書中で使用される場合、用語「細胞エレメントまたは細胞レムナント（cellular elements or cellular remnants）」は、生物学的サンプル中に残る細胞の部分をいい、これらとしては、血小板、アポトーシス小体および合胞体層微粒子（syncytiotrophoblast microparticles）が挙げられるがこれらに限定されない。
ＩＩ．本発明の方法
本発明は、胎児発現される転写物の妊娠特異性を使用して、胎児の染色体異数性の遺伝的決定およびしたがってその診断の確立を非侵襲的に可能にする方法を開発する。１つの実施形態において、胎児発現される転写物は、胎盤において発現されるものである。具体的には、本発明は、異数性染色体上の遺伝子によってコードされる組織特異的発現パターンを有するＲＮＡ転写物由来の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する。挿入／欠失多型およびシンプルタンデムリピート多型（simple tandem repeat polymorphism）等の他の多型もまた、本発明の方法によって検出可能である。遺伝子座の状態は、問題の遺伝子座から転写されたＲＮＡの上の情報提供的な（informative）ＳＮＰの間の比率の評価によって測定される。手短に言えば、本発明は、異数性胎児から正倍数性胎児まで、座−および組織−特異的ＲＮＡ転写物上の多型部位の対立遺伝子間の比率を比較する。
本発明は、胎児発現される転写物の妊娠特異性を使用して、胎児の染色体異数性の遺伝的決定およびしたがってその診断の確立を非侵襲的に可能にする方法を開発する。１つの実施形態において、胎児発現される転写物は、胎盤において発現されるものである。具体的には、本発明は、異数性染色体上の遺伝子によってコードされる組織特異的発現パターンを有するＲＮＡ転写物由来の一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する。挿入／欠失多型およびシンプルタンデムリピート多型（simple tandem repeat polymorphism）等の他の多型もまた、本発明の方法によって検出可能である。遺伝子座の状態は、問題の遺伝子座から転写されたＲＮＡの上の情報提供的な（informative）ＳＮＰの間の比率の評価によって測定される。手短に言えば、本発明は、異数性胎児から正倍数性胎児まで、座−および組織−特異的ＲＮＡ転写物上の多型部位の対立遺伝子間の比率を比較する。
したがって、本発明は、２１トリソミーの出生前診断に適用され得、これは、第２１染色体上の遺伝子座に由来する胎盤組織発現を有するＲＮＡ転写物上の情報提供的なＳＮＰの分析を含む。次いで、母体血中の胎盤発現されたＲＮＡ転写物の検出による情報提供的なＳＮＰ間の前記比率を比較することによって、胎児２１トリソミーが決定される。母体血中のマーカーの胎児特異性は、それらの胎盤組織発現によって与えられ、一方、異数性状態は、ＲＮＡ転写物上の情報提供的なＳＮＰ間の異常な比率によって決定される。
本発明の方法は、第２１染色体上の遺伝子座によってコードされる胎盤発現されるＲＮＡ−ＳＮＰの分析に基づく、胎児２１トリソミーの遺伝的決定およびその出生前診断を可能にする。ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子は、例えば、リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイによって識別され得、そして該遺伝子座の遺伝子量を示すそれらの間の比率が測定される。別の実施形態において、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子は、プライマー伸長そして続いての質量分析によって識別され得る。
Ａ．本発明の方法を使用して検出可能な染色体異常
本発明は、２１トリソミー等の染色体異数性の検出方法を提供する。本発明はまた、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上に存在するものまたはこれらに関連するもの等の他の胎児異数性の検出も可能にする。該方法はまた、母体血を分析する場合、胎児染色体異数性の非侵襲的検出を可能にする。ＲＮＡ−ＳＮＰ検出の有用性は、染色体異常の検出を超えて、胎児の他の遺伝的変異（genetic variations）（例えば、父性遺伝性多型および変異）の検出へ広がる。
本発明は、２１トリソミー等の染色体異数性の検出方法を提供する。本発明はまた、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体上に存在するものまたはこれらに関連するもの等の他の胎児異数性の検出も可能にする。該方法はまた、母体血を分析する場合、胎児染色体異数性の非侵襲的検出を可能にする。ＲＮＡ−ＳＮＰ検出の有用性は、染色体異常の検出を超えて、胎児の他の遺伝的変異（genetic variations）（例えば、父性遺伝性多型および変異）の検出へ広がる。
Ｂ．胎児染色体異常を検出するために本発明において有用な生物学的サンプル
本発明を実施する第１工程は、本発明の方法を使用する検査に適切な妊娠期間にある妊婦から、あるいは可能性のある妊娠に関して検査されている女性から、生物学的サンプルを得ることである。適切な妊娠期間は、上述されるように、検査される異常（disorder）および場合によっては使用されるＲＮＡマーカーに依存して変化し得る。
本発明を実施する第１工程は、本発明の方法を使用する検査に適切な妊娠期間にある妊婦から、あるいは可能性のある妊娠に関して検査されている女性から、生物学的サンプルを得ることである。適切な妊娠期間は、上述されるように、検査される異常（disorder）および場合によっては使用されるＲＮＡマーカーに依存して変化し得る。
生物学的サンプルは、母体血漿または血清を含む母体血であり得る。ある状況においては、生物学的サンプルは、無細胞性（acellular）である。他の状況においては、生物学的サンプルは、母体血中の細胞エレメントまたは細胞レムナント（cellular remnants）を含有する。他の生物学的サンプルとしては、羊水、絨毛膜絨毛サンプル、着床前胚由来の生検材料、母体尿、母体唾液、セロセンテシス（celocentesis）サンプル、胎児有核細胞または胎児細胞レムナント、あるいは女性生殖管の洗浄物から得られるサンプルが挙げられる。
生物学的サンプルが血液である場合、女性からの血液の回収は、病院または診療所が一般的に従う標準プロトコルに従って行われる。例えば３〜２０ｍｌの好適な量の末梢血が回収され、そして次の調製より前に標準手順に従って貯蔵され得る。
本発明において有用な生物学的サンプルは、胎児ＲＮＡを含有する。胎児ＲＮＡは、第２１、第１８、第１３、ＸおよびＹ染色体から転写され得る。さらに、ＲＮＡが胎盤中で発現されるレベルは、母体血またはその種々の分画中で発現されるそのレベルの２倍、５倍または１０倍あるいはそれ以上であり得る。
胎児ＲＮＡは、胎盤を含むがこれに限定されない胎児起源の任意の組織に典型的に由来し、そしてｍＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、種々の方法によって生物学的サンプルから抽出され得る。ＲＮＡ調製の一般的な方法（例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3d ed., 2001によって記載される）が続けられ得；種々の市販の試薬またはキット、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ Ｄｉｒｅｃｔ ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，バレンシア，ＣＡ）、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）シリーズ９６００ＴＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ，マディソン，ＷＩ）もまた、女性からの血液サンプルからＲＮＡを得るために使用され得る。これらの方法の２以上の組合せもまた使用され得る。サンプルの注意深い取り扱い、ＤＮアーゼでの完全な処理、および増幅と定量の工程における適切な陰性コントロールが、ＲＮＡ調製物からＤＮＡを除去するために使用されるべきである。
Ｃ．ＲＮＡ転写物の対立遺伝子を識別するための方法
ＲＮＡ転写物の対立遺伝子を識別することは、ＰＣＲ、質量分析（ＭＳ）、ゲル電気泳動、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、プライマーエクステンションアッセイ、チップ、シーケンシングおよび１以上の蛍光プローブとのハイブリダイゼーションを含む種々の方法によって達成され得る。
ＲＮＡ転写物の対立遺伝子を識別することは、ＰＣＲ、質量分析（ＭＳ）、ゲル電気泳動、パイロシーケンシング（pyrosequencing）、プライマーエクステンションアッセイ、チップ、シーケンシングおよび１以上の蛍光プローブとのハイブリダイゼーションを含む種々の方法によって達成され得る。
１．ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子のＰＣＲに基づく識別
いったんＲＮＡが生物学的サンプルから抽出されると、例えば以下の問題のＲＮＡの各々の特定のＳＮＰ対立遺伝子の量が評価され得る：ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２。
いったんＲＮＡが生物学的サンプルから抽出されると、例えば以下の問題のＲＮＡの各々の特定のＳＮＰ対立遺伝子の量が評価され得る：ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２。
選択される遺伝子の変異体もまた本発明において有用である。例えば、ＰＬＡＣ４遺伝子の有用な変異体としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定される変異体が挙げられる：ＡＦ２６９２８７、ＡＫ０２７８６８、ＡＫ０９２４３１、ＢＣ０９３６８５、ＢＣ１０１６１５、ＢＣ１０１６１７、Ｌ１３１９７、ＮＭ＿１８２８３２およびＬＯＣ１９１５８５。ＰＬＡＣ４遺伝子の遺伝子座から転写されるＲＮＡは、１以上の一塩基多型、または挿入−欠失多型を含む。ＰＬＡＣ４遺伝子から転写される例示的な多型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＳＮＰのデータベース（（ｄｂＳＮＰ）ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）アクセッション番号によって同定される多型（ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇ１７）アセンブリに基づくＰＬＡＣ４座標を有する）：ｒｓ３８０４０２６（ＰＬＡＣ４−４１４６９１６３）、ｒｓ４８１８２１９（ＰＬＡＣ４−４１４６９７６４）、ｒｓ９９７７００３（ＰＬＡＣ４−４１４７０５９１）、ｒｓ７８４４（ＰＬＡＣ４−４１４７０６９９）、ｒｓ９０１５（ＰＬＡＣ４−４１４７０８７７）、ｒｓ１３６４３（ＰＬＡＣ４−４１４７１２９６）、ｒｓ９３０５７２９（ＰＬＡＣ４−４１４７２２７２）、ｒｓ９３０５７３０（ＰＬＡＣ４−４１４７２２７７）、ｒｓ５０１９１９５（ＰＬＡＣ４−４１４７３２９５）、ｒｓ５０１９１９４（ＰＬＡＣ４−４１４７３３０２）、ｒｓ５８４４０６９（ＰＬＡＣ４−４１４７３３０６）、ｒｓ１０４９９０４（ＰＬＡＣ４−４１４７３３９２）、ｒｓ１６９９８０８９（ＰＬＡＣ４−４１４７３４９６）、ｒｓ１２４８２１１６（ＰＬＡＣ４−４１４７５５９０）、ｒｓ１１９０９４３９（ＰＬＡＣ４−４１４７５９１２）、ｒｓ７２７８６５９（ＰＬＡＣ４−４１４７６８７５）、ｒｓ１２１０６４０９（ＰＬＡＣ４−４１４７７２７３）、ｒｓ１２１０６３９５（ＰＬＡＣ４−４１４７７３４０）、ｒｓ１２１０６４０１（ＰＬＡＣ４−４１４７７４２５）、ｒｓ１２１０６４３４（ＰＬＡＣ４−４１４７７４８６）、ｒｓ２１８３５８４（ＰＬＡＣ４−４１４７７９５６）、ｒｓ３９４９７２５（ＰＬＡＣ４−４１４７８２８３）、ｒｓ８１３０８３３（ＰＬＡＣ４−４１４７８７５５）、ｒｓ１０２２２１４５（ＰＬＡＣ４−４１４８０５１２）およびｒｓ９９８１４７８（ＰＬＡＣ４−４１４８０５６４）、あるいはＰＬＡＣ４−４１４７１１４５およびＰＬＡＣ４−４１４７６２３６等のＰＬＡＣ４遺伝子座内に局在する他の多型（これらは、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４ （ｈｇ１７）アセンブリに基づく第２１染色体上のそれぞれ４１４７１１４５および４１４７６２３６のヌクレオチド座標に局在する）。当業者は、ＰＬＡＣ４における他の多型もまた本発明において有用であることを理解する。
ｄｂＳＮＰアクセッション番号は、ＳＮＰが局在するゲノム配列のＳＮＰ部分のみに言及する。ＳＮＰについて提供される配列の長さ（extent）は、転写されるゲノム配列の上流部分および下流部分の両方について選択され得る。
本発明において有用な他のＲＮＡ−ＳＮＰとしては、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇ１７）アセンブリに基づく第２１染色体上における、ＣＯＬ６Ａ１のＡｒｇ８５０Ｈｉｓ（ＣＯＬ６Ａ１−４６２４７８１７）、ＣＯＬ６Ａ１のＳｅｒ９３２Ｓｅｒ（ＣＯＬ６Ａ１−４６２４８０６４）およびＣＯＬ６Ａ２のＶａｌ７２８Ｖａｌ（ＣＯＬ６Ａ２−４６３７０３４１）が挙げられる。
大抵の場合において、当該分野において周知であるいくつかの核酸増幅手順のいずれかを使用して（上記に列挙され、そして以下により詳細に説明される）、標的配列を増幅することが望ましい。具体的には、核酸増幅は、増幅される核酸配列に相補的である配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素合成である。サンプル中に存在する標的配列の量が非常に少ない場合、核酸増幅は特に有益である。標的配列の増幅および合成されたアンプリコンの検出によって、アッセイの感度は大いに改善され、何故ならば、問題の生物またはウイルスに属するサンプル中の核酸の検出をより十分に確実とするために、より少ない標的配列がアッセイの初めに必要とされるためである。
ポリヌクレオチドの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション増幅（ligation amplification）（あるいはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））およびＱベータレプリカーゼの使用に基づく増幅方法等の方法を利用する。ストランド置換増幅（strand displacement amplification）（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ、核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence based amplification）（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）および転写関連増幅（transcription-associated amplification）（ＴＡＡ）もまた有用である。これらの方法は、当該分野において周知でありそして広く実施されている。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは、市販されている。
増幅工程の前に、問題のＲＮＡ転写物のＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を合成することが典型的に必要である。これは、逆転写（これは、別個の工程として行われ得る）によって、あるいは均一な（homogeneous）逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の変形において達成される。リボ核酸のＰＣＲ増幅に好適な方法は、RomeroおよびRotbartによりDiagnostic Molecular Biology: Principles and Applications pp.401-406において；Persing et al., eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993；Egger et al., J. CHn. Microbiol. 33:1442-1447, 1995；および米国特許第5,075,212号において記載されている。
ＰＣＲの一般的な方法は、当該分野において周知であり、従って本明細書において詳細には記載しない。ＰＣＲ法、プロトコル、およびプライマーを設計することにおける原理のレビューについては、例えば、Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N. Y., 1990を参照のこと。ＰＣＲ試薬およびプロトコルはまた、Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓのような業者から入手可能である。
ＰＣＲは、通常、熱安定性酵素を用いての自動プロセスとして実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、自動的に、変性領域、プライマーアニーリング領域、および伸長反応領域を経由して循環される。この目的のために特別に適応された機器が市販されている。
ＲＮＡ転写物配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくは、その中の標的領域をフランクする（flank）配列に相補的であり、かつこれに特異的にハイブリダイズする。増幅によって作製されたポリヌクレオチド配列は、直接、配列決定され得る。あるいは、増幅された配列は、配列分析の前にクローン化され得る。第３の可能性としては、プライマーは、対立遺伝子特異的ＰＣＲの実行のためのＳＮＰ部位と重複するように設計され得る。正しくハイブリダイズされたプライマーだけが増幅されるので、対立遺伝子特異的ＰＣＲは、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の識別を可能にする。ＰＣＲプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用され得るオリゴヌクレオチドを指し、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２等の、問題の遺伝子座から転写されたＲＮＡ種に由来するヌクレオチド配列を増幅する。上記の転写物をコードするヌクレオチド配列の増幅のためのＰＣＲプライマーの少なくとも１つは、前記遺伝子座について配列特異的であるべきである。
標的ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子のＰＣＲ増幅が、本発明を実施する際に典型的に使用されるが、当業者は、母体血サンプル中のＲＮＡ種の増幅は公知の方法［例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（transcription-mediated amplification）、および自己配列複製（self-sustained sequence replication）または核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）、これらの各々は十分な増幅を提供する］によって達成され得ることを認識する。より最近開発された分岐ＤＮＡ技術（branched-DNA technology）もまた、母体血中のＲＮＡマーカーのシグナルを増幅するために使用され得る。臨床サンプル中の核酸配列の直接定量のための分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅のレビューについては、Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998を参照のこと。
２．ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の識別のための他の方法
問題のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子はまた、当業者に周知の他の標準技術を使用して検出され得る。典型的に増幅工程が検出工程に先行するが、増幅は本発明の方法において必須とされない。例えば、ＲＮＡ転写物は、増幅工程が先行する（proceed）かどうかに関わらず、サイズ分画（size fractionation）（例えば、ゲル電気泳動）によって同定され得る。周知の技術（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001を参照のこと）に従ってアガロースまたはポリアクリルアミドゲルにおいてサンプルを泳動しそして臭化エチジウムで標識した後、標準コントロールと同一サイズのバンドの存在は、標的ＲＮＡ配列の存在の指標であり、次いで、その量が、バンドの強度に基づいてコントロールと比較され得る。あるいは、例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２をコードするＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブが使用され得、このようなＲＮＡ種の存在を検出し、そして該プローブによって与えられるシグナルの強度に基づいて、標準コントロールと比較してのＲＮＡ分子の量を示す。
問題のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子はまた、当業者に周知の他の標準技術を使用して検出され得る。典型的に増幅工程が検出工程に先行するが、増幅は本発明の方法において必須とされない。例えば、ＲＮＡ転写物は、増幅工程が先行する（proceed）かどうかに関わらず、サイズ分画（size fractionation）（例えば、ゲル電気泳動）によって同定され得る。周知の技術（Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d ed., 2001を参照のこと）に従ってアガロースまたはポリアクリルアミドゲルにおいてサンプルを泳動しそして臭化エチジウムで標識した後、標準コントロールと同一サイズのバンドの存在は、標的ＲＮＡ配列の存在の指標であり、次いで、その量が、バンドの強度に基づいてコントロールと比較され得る。あるいは、例えば、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２をコードするＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブが使用され得、このようなＲＮＡ種の存在を検出し、そして該プローブによって与えられるシグナルの強度に基づいて、標準コントロールと比較してのＲＮＡ分子の量を示す。
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他の核酸種を含む特定の核酸を検出する周知の方法である。十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、プローブは、実質的に相補的な配列にのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、種々の量の配列ミスマッチを許容するために緩和され得る。
当該分野において周知の多数のハイブリダイゼーションフォーマットとしては、液相、固相、または混合相（mixed phase）ハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。以下の文献は、種々のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットの概説を提供する：Singer et al., Biotechniques 4:230, 1986；Haase et al., Methods in Virology, pp. 189-226, 1984；Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford；およびHames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987。
ハイブリダイゼーション複合体は、周知の技術に従って検出され、そして該検出は、本発明の重要な局面ではない。標的核酸（即ち、ｍＲＮＡまたは増幅されたＤＮＡ）へ特異的にハイブリダイズし得る核酸プローブは、ハイブリダイズされた核酸の存在を検出するために典型的に使用されるいくつかの方法のいずれによっても標識され得る。検出の１つの一般的な方法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ等で標識されたプローブを使用するオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位体の選択は、選択される同位体の合成の容易さ、安定性、および半減期に起因する研究の好みに依存する。他の標識としては、フルオロフォア（fluorophores）、化学発光剤、および酵素で標識されたアンチリガンド（antiligands）または抗体へ結合する、化合物（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）が挙げられる。あるいは、プローブは、フルオロフォア、化学発光剤または酵素等の標識と直接結合され得る。標識の選択は、要求される感度、プローブとの結合の容易さ、安定性要件、および利用可能な器機類に依存する。
本発明を実施するに必要なプローブおよびプライマーは、周知の技術を使用して合成および標識され得る。プローブおよびプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載されるような自動合成器を使用して、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って化学合成され得る。オリゴヌクレオチドの精製は、ネイティブ（native）アクリルアミドゲル電気泳動またはPearson and Regnier, J. Chrom., 255:137-149, 1983に記載されるようなアニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のいずれかによる。
ＲＮＡ転写物の対立遺伝子を識別するための他の有用な方法としては、パイロシーケンシング（pyrosequencing）等の直接配列決定が挙げられる。パイロシーケンシングのプロセスは、プライマー−テンプレート複合体を含み、ここで、４個のデオキシヌクレオチド三リン酸の各々が１つずつ添加される。デオキシヌクレオチド三リン酸がＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれると、光が放射される。発生される光の量は、加えられる塩基の数に比例する。したがって、下流の配列が推測され得る。
プライマー伸長反応もまた、本発明において有用である。プライマー伸長反応は、ＳＮＰ部位に隣接する領域へハイブリダイズするプライマー伸長プライマーへのデオキシヌクレオチドおよび／またはジデオキシヌクレオチドの組み込みによりＳＮＰ対立遺伝子を識別することによって機能する。プライマーはポリメラーゼで伸長される。プライマー伸長されたＳＮＰは、質量分析によってまたはビオチン等のタグ部位によって物理的に検出され得る。特異的な標識によってタグされるかまたは特異的な質量を有するプライマー伸長産物を作製する相補的なデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドによってのみＳＮＰ部位は伸長されるので、ＳＮＰ対立遺伝子は識別され得る。
質量分析法は、ポリヌクレオチド、例えば、ＰＣＲアンプリコンまたはプライマー伸長産物の検出を可能にする。ポリヌクレオチド配列の存在は、問題のポリヌクレオチドの予想される質量と検出されるシグナルの質量とを比較することによって立証される。特定のポリヌクレオチド配列についての相対シグナル強度は、特定の対立遺伝子の相対的集団を示し、したがって、直接データから対立遺伝子比率の計算を可能にする。質量分析による遺伝子型決定法のレビューについては、Pusch et al., Pharmacogenomics 3:537-548, 2002を参照のこと。
Ｄ．ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の比率の測定
一般的に、ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の比率の測定は、サンプル中に存在する各ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の相対的集団（relative population）を計算すること、および一方のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子について測定された値を他方のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子についての値で割ることを含む。ＰＣＲベース検出システムを使用することは、対立遺伝子の一方から作製されるＰＣＲ、プライマー伸長またはハイブリダイゼーション反応産物と関連する標識強度を、ＲＮＡ転写物の他方の対立遺伝子のそれで割ることを伴う。ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の比率を測定するための他の方法としては、該対立遺伝子の各々についてのクローン化された配列の数またはシーケンシング産物（sequencing products）の量を比較することを含む。ＲＮＡ−ＳＮＰ比率はまた、質量分析によって対立遺伝子の質量シグナル強度を比較することによって測定され得る。
一般的に、ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の比率の測定は、サンプル中に存在する各ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の相対的集団（relative population）を計算すること、および一方のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子について測定された値を他方のＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子についての値で割ることを含む。ＰＣＲベース検出システムを使用することは、対立遺伝子の一方から作製されるＰＣＲ、プライマー伸長またはハイブリダイゼーション反応産物と関連する標識強度を、ＲＮＡ転写物の他方の対立遺伝子のそれで割ることを伴う。ＲＮＡ−ＳＮＰの対立遺伝子の比率を測定するための他の方法としては、該対立遺伝子の各々についてのクローン化された配列の数またはシーケンシング産物（sequencing products）の量を比較することを含む。ＲＮＡ−ＳＮＰ比率はまた、質量分析によって対立遺伝子の質量シグナル強度を比較することによって測定され得る。
あるいは、ＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、反応の間に各対立遺伝子について集積される蛍光強度の差（ΔＲｎ）から、あるいは各対立遺伝子の反応が閾値蛍光強度（Ｃｔ）を集積するために必要とされるＰＣＲサイクルの数から測定され得る。ΔＣｔおよびΔΔＲｎは、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率を反映し、何故ならば、これらの値は、ＲＮＡ対立遺伝子の量の対数に比例するためである。結果として、各対立遺伝子についての集積蛍光強度（accumulated fluorescent intensities）の差（ΔΔＲｎ）または閾値サイクル値（threshold cycle values）の差（ΔＣｔ）は、ＲＮＡ転写物についてのＳＮＰ比率を反映する。例えば、対立遺伝子Ａは、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）標識化プローブで検出され得、そして対立遺伝子Ｂは、ＶＩＣ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）等の蛍光プローブで検出され得る。ＣｔおよびΔＲｎ値は、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｂの各々から算出される。２つのＣｔ値の差は、閾値サイクル値を使用して測定され、そしてΔＣｔ値を与える。２つのΔＲｎ値の差は、集積蛍光強度を使用して測定され、そしてΔΔＲｎ値を与える。ＣｔおよびΔＲｎ値はＰＣＲ産物の存在量に対数的に関連するので、各ＲＮＡ−ＳＮＰについてのＣｔおよびΔＲｎ値の差が算出され、そしてその差（ΔＣｔおよびΔΔＲｎ値）は、これら２つのＲＮＡ対立遺伝子間のＲＮＡ−ＳＮＰ比率を反映する。
Ｅ．標準コントロールとのＲＮＡ−ＳＮＰ比率の比較
いったん対立遺伝子の比率が被験者において一旦測定されると、該比率は、胎児異数性の存在を測定するために標準コントロールと比較される。コントロールサンプル中で測定された既知の値と比較した場合に高いかまたは低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、胎児異数性の存在を示す。例えば、コントロールサンプル中で測定された既知の値と比較した場合により高いかまたはより低いＳＮＰ対立遺伝子間のΔＣｔ値、ΔΔＲｎ値または標識もしくは質量強度比は、胎児異数性の存在を示す。
いったん対立遺伝子の比率が被験者において一旦測定されると、該比率は、胎児異数性の存在を測定するために標準コントロールと比較される。コントロールサンプル中で測定された既知の値と比較した場合に高いかまたは低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、胎児異数性の存在を示す。例えば、コントロールサンプル中で測定された既知の値と比較した場合により高いかまたはより低いＳＮＰ対立遺伝子間のΔＣｔ値、ΔΔＲｎ値または標識もしくは質量強度比は、胎児異数性の存在を示す。
標準コントロールを確立するために、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦のグループを先ず選択する。これらの女性は、必ずではないが、好ましくは、本発明の方法を使用して染色体異数性等のコンディションのスクリーニングについて好適な妊娠期間内にある、同様の妊娠期間のものである。同様に、標準コントロールは、健康な非妊娠（nonpregnant）女性のグループからのサンプルを使用して確立される。選択された妊婦および彼女らが妊娠している胎児の健康状態は、生物学的サンプルを得るための上述の方法を使用して胎児遺伝子分析を行うことあるいは細胞遺伝分析（cytogenetic analysis）を含むがこれらに限定されない、十分に確立された慣用的に使用される方法によって確認される。標準コントロールは、胎児異数性の存在について検査する前に測定され得る。
さらに、健康な胎児を妊娠している健康な妊婦の選択されるグループは、合理的な規模のものでなければならず、その結果、該グループから算出されるＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２をコードするＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子のアベレージ（average）、平均（mean）または中央値（median）比率が、健康な胎児を妊娠している健康な女性の一般的な集団の中の通常またはアベレージ、平均または中央値の量を代表すると合理的にみなされ得る。場合によって、前記グループは少なくとも１０人の女性を含む。
選択されたグループの各女性において見られた個々の値に基づくＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の比率について、いったん平均値が確立されると、この値は、該ＲＮＡ種の標準と考えられる。したがって、類似比率の同一種のＲＮＡを含有する任意の血液サンプルは、標準コントロールとして使用され得る。同一種の確立されたアベレージの比率で、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２、ＡＴＰ５Ｏ、ＢＴＧ３、ＡＤＡＭＴＳ１、ＢＡＣＥ２、ＩＴＳＮ１、ＡＰＰ、ＡＴＰ５Ｊ、ＤＳＣＲ５、ＰＬＡＣ４、ＬＯＣ９０６２５、ＲＰＬ１７、ＳＥＲＰＩＮＢ２またはＣＯＬ４Ａ２をコードするＲＮＡを含有する溶液もまた、人工的に作製され得、そして標準コントロールとして役立ち得る。
コントロールサンプルにおける平均値と比較した場合に少なくとも１０％より高いＲＮＡ−ＳＮＰ比率の増加は、染色体異常を有する胎児を有する増加した危険性を示す。ある場合には、ＲＮＡ−ＳＮＰ比率の増加は少なくとも５０％より高い。他の場合においては、ＲＮＡ−ＳＮＰ比率の増加は少なくとも１００％より高い。なお別の場合においては、コントロールサンプルにおける平均値と比較した場合に少なくとも１０％より低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、染色体異常を有する胎児を有する増加した危険性を示す。他の場合において、減少は少なくとも５０％、または少なくとも９０％である。
コントロールサンプルにおける平均値よりも少なくとも１標準偏差より高いまたはより低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、染色体異常を有する胎児を妊娠している増加した危険性を示す。コントロールサンプルにおける平均値よりも少なくとも２標準偏差より高いまたはより低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、染色体異常を有する胎児を妊娠している増加した危険性を示す。コントロールサンプルにおける平均値よりも少なくとも３標準偏差より高いまたはより低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率は、染色体異常を有する胎児を妊娠している増加した危険性を示す。場合によっては、コントロールサンプルにおける平均値よりも１標準偏差未満より高いまたはより低いＲＮＡ−ＳＮＰ比率もまた、染色体異常を有する胎児を妊娠している増加した危険性を示す。
Ｆ．妊婦の胎児における染色体異常を検出するためのキット
本発明はまた、染色体異常を有する胎児の存在を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、問題の領域を増幅するためのプライマーを含む。本発明のキットにおいて有用なプライマーは、対立遺伝子の識別について上述される。プライマーは、マーカーについて特異的であり得、または非特異的様式で作用し得る。
本発明はまた、染色体異常を有する胎児の存在を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、問題の領域を増幅するためのプライマーを含む。本発明のキットにおいて有用なプライマーは、対立遺伝子の識別について上述される。プライマーは、マーカーについて特異的であり得、または非特異的様式で作用し得る。
本発明のキットの別のコンポーネントは、染色体が正常である胎児を妊娠している平均的な妊婦におけるＲＮＡ対立遺伝子比率を示す標準コントロールである。標準コントロールは、妊婦の胎児における染色体異常を検出する方法について上述されたものと同一様式で測定される。
本発明のキットはまた、各ＲＮＡ種の異なる対立遺伝子を識別するためのハイブリダイゼーションプローブを含み得る。各ＲＮＡ種の対立遺伝子は、一塩基多型、挿入／欠失多型またはシンプルタンデムリピート多型（simple tandem repeat polymorphisms）であり得る。本発明のキットにおいて有用なハイブリダイゼーションプローブは、妊婦の胎児における染色体異常を検出する方法に使用されるのと同一のハイブリダイゼーションプローブである。ハイブリダイゼーションプローブは、放射性、蛍光性、化学発光性または酵素的であり得る。プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドは、公知の技術に従って作製され得る（Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載されるような、自動合成器を使用する、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22:1859-1862, 1981）。本発明のプローブは特異的または非特異的であり得る。当業者は、上述の方法等の各ＲＮＡ種の対立遺伝子を識別する他の方法が本発明のキットにおいて有用であることを認識する。
本発明のキットは、当業者が本発明のキットにおいて有用であると認識する追加のエレメントを含み得る。
以下の実施例は、例示のためのみに提供され、限定のためではない。当業者は、変化または修飾され本質的に同様の結果を生じ得る種々の重要でないパラメータを容易に認識する。
ＩＩＩ．実施例
本発明の方法は、特定の遺伝子座についてヘテロ接合である個体における染色体異常を検出するために有用であり、該個体がその特定の遺伝子座に異常な数（例えば、正常な２の代わりに異常な３）の染色体を有しているかどうかを検出する。妊娠の場合において、生物学的サンプルは妊婦から直接採取される一方、染色体異数性について検査される個体は、妊婦が妊娠している胎児である。出生前診断についてのこのアプローチの適用の１実施形態において、遺伝子の余分なコピーが、胎盤組織において、正常な遺伝子対と共に発現される。胎盤におけるＲＮＡ対立遺伝子の比率は、遺伝子の余分なコピーの結果として、正常な胎盤のそれから逸脱する。次いで、ＲＮＡ転写物は母体血中へ放出され、そしてそれらの相対存在量（relative abundance）は、胎盤遺伝子発現プロフィールを反映する。したがって、染色体異常を有する胎児を妊娠している妊婦の血液またはそのフラクション（例えば、血漿）中のＲＮＡ対立遺伝子の比率は、正倍数性胎児を妊娠している妊婦のそれから逸脱する（図１）。
本発明の方法は、特定の遺伝子座についてヘテロ接合である個体における染色体異常を検出するために有用であり、該個体がその特定の遺伝子座に異常な数（例えば、正常な２の代わりに異常な３）の染色体を有しているかどうかを検出する。妊娠の場合において、生物学的サンプルは妊婦から直接採取される一方、染色体異数性について検査される個体は、妊婦が妊娠している胎児である。出生前診断についてのこのアプローチの適用の１実施形態において、遺伝子の余分なコピーが、胎盤組織において、正常な遺伝子対と共に発現される。胎盤におけるＲＮＡ対立遺伝子の比率は、遺伝子の余分なコピーの結果として、正常な胎盤のそれから逸脱する。次いで、ＲＮＡ転写物は母体血中へ放出され、そしてそれらの相対存在量（relative abundance）は、胎盤遺伝子発現プロフィールを反映する。したがって、染色体異常を有する胎児を妊娠している妊婦の血液またはそのフラクション（例えば、血漿）中のＲＮＡ対立遺伝子の比率は、正倍数性胎児を妊娠している妊婦のそれから逸脱する（図１）。
ＲＮＡ対立遺伝子を使用する染色体異常の検出は、胎児に特異的でありかつ母体血中に検出可能な発現レベルで存在するマーカーの同定；高胎盤発現、母体血中の該転写物を検出する能力、を有するそのマーカー上の転写される領域の同定；該転写物が妊娠特異的であるという測定；ならびに染色体異常の存在または非存在を評価するための該転写物の対立遺伝子比率の測定を必要とする。
以下の実施例は、有用なマーカーおよび転写物を同定すること、該転写物を検出しかつ該転写物が妊娠特異的であることを保証するための方法、ならびに該転写物を定量しかつ該ＲＮＡ対立遺伝子比率を測定して染色体異常を検出する方法の具体例を実証する。当業者は、他の方法および技術も本発明を実施することにおいて有用であることを認識する。
実施例１：胎児における２１トリソミーを検出するために有用なＳＮＰの同定
胎児２１トリソミーの検出に有用なＳＮＰの同定は、胎児細胞によって発現され、かつ分析される生物学的サンプル中に検出可能な濃度で存在するＲＮＡ種の同定を必要とする。
胎児２１トリソミーの検出に有用なＳＮＰの同定は、胎児細胞によって発現され、かつ分析される生物学的サンプル中に検出可能な濃度で存在するＲＮＡ種の同定を必要とする。
高胎盤発現レベルを有する胎児特異的転写物の同定
５つの第１期絨毛膜絨毛サンプル（chorionic villus sample）（ＣＶＳ）サンプルの遺伝子発現プロフィールを、各個体の組織サンプルのマイクロアレイ分析によって得た。母体血漿中の循環ＲＮＡ分子のうち胎盤発現転写物を同定するための試みにおいて、母体全血（特に、母体造血細胞）の遺伝子発現プロフィールを得、そして対応の胎盤組織のそれと比較した。妊娠初期の胎盤発現転写物を、全ての５つの比較において対応の全血サンプルと比較した場合にＣＶＳ組織においてその発現レベルが増加された転写物を選択することによって同定した。
５つの第１期絨毛膜絨毛サンプル（chorionic villus sample）（ＣＶＳ）サンプルの遺伝子発現プロフィールを、各個体の組織サンプルのマイクロアレイ分析によって得た。母体血漿中の循環ＲＮＡ分子のうち胎盤発現転写物を同定するための試みにおいて、母体全血（特に、母体造血細胞）の遺伝子発現プロフィールを得、そして対応の胎盤組織のそれと比較した。妊娠初期の胎盤発現転写物を、全ての５つの比較において対応の全血サンプルと比較した場合にＣＶＳ組織においてその発現レベルが増加された転写物を選択することによって同定した。
サンプル処理およびＲＮＡ抽出。５つの第１期胎盤組織サンプルを、治療終了（therapeutic terminations）の前にＣＶＳにより妊婦から得た。引き続いて、全てのケースの胎児核型は正常であると確認された。胎盤組織サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。６ｍｌの母体末梢血を、組織回収時と同時に回収し、そしてＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）において保存した。胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従って、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出しそしてＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。末梢血からのトータルＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を含むことを伴って、製造業者の指示書に従ってＰＡＸｇｅｎｅＴＭ血液ＲＮＡキット（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，スイス）によって抽出した。
高密度オリゴヌクレオチドアレイによる遺伝子発現分析。各サンプルについて、１０μｇの抽出されたＲＮＡを標識し、そして製造業者の指示書に従ってＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）ヒトゲノムＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，サンタクララ，ＣＡ）へハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、各アレイを洗浄しそしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）において染色した。前記チップをＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でスキャンし、そしてＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイ Ｓｕｉｔｅ ５．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して分析した。母体末梢血の代わりに胎盤組織において主に発現されかつ第２１染色体に由来する転写物を、選択した。ＣＶＳサンプル中で発現された７２２６遺伝子転写物のうち、１２４５転写物が、母体末梢血サンプルよりもＣＶＳにおいてより高い発現を有すると同定された。この転写物パネルの中で、第２１染色体上に局在する１３個の胎盤発現遺伝子を同定した（表１）。
適用可能なＳＮＰの同定および対立遺伝子頻度の測定
優勢な胎盤組織発現を有する選択された第２１染色体遺伝子座の転写領域におけるＳＮＰを、公共データベースから同定した。次いで、各ＳＮＰの対立遺伝子頻度（allele frequencies）を、中国人集団および白人集団の両方において測定した。高ヘテロ接合性率を有するＳＮＰを標的化した。
優勢な胎盤組織発現を有する選択された第２１染色体遺伝子座の転写領域におけるＳＮＰを、公共データベースから同定した。次いで、各ＳＮＰの対立遺伝子頻度（allele frequencies）を、中国人集団および白人集団の両方において測定した。高ヘテロ接合性率を有するＳＮＰを標的化した。
優勢な胎盤発現を有する１３個の第２１染色体遺伝子（表１）の中で、最も高い胎盤発現レベルを有する４個の遺伝子、即ち、コラーゲンＶＩアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、コラーゲンＶＩアルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）およびミトコンドリアＡＴＰシンターゼＯサブユニット（ＡＴＰ５Ｏ）を、続いての評価のために選択した。これらの遺伝子のエキソン内に局在するＳＮＰを、ｍＲＮＡ多型の研究を可能にするために選択した。これらのコーディング多型（coding polymorphism）の各々の対立遺伝子頻度を、対応のＳＮＰにフランキングする（flanking）ＰＣＲプライマー（表２）を使用する直接配列決定によって、１０中国人および１０白人バフィーコートＤＮＡサプルにおいて測定した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｖ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ）およびＭｏｄｅｌ ３１００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、配列決定を行った。
転写されたＳＮＰの対立遺伝子頻度を表３に示す。前記２集団のうち１集団の少なくとも３０％においてへテロ接合性であったＳＮＰを、情報提供的と考え、そしてさらなるアッセイ開発のための標的として選択した。
選択された転写物の検出能および妊娠特異性の測定
胎盤発現を伴う前記４個の第２１染色体転写物は、該４転写物の非多型領域を増幅するために開発されたリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して母体血漿において検出され得る。これらの転写物は、非妊娠女性と比較した場合に有意により高い濃度で妊婦の血漿に存在する。さらに、母体血漿中の該転写物の濃度は、子の誕生後に急激に低下する。したがって、胎盤は、母体血漿中のこれらのｍＲＮＡ転写物の主要な供給源である。
胎盤発現を伴う前記４個の第２１染色体転写物は、該４転写物の非多型領域を増幅するために開発されたリアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して母体血漿において検出され得る。これらの転写物は、非妊娠女性と比較した場合に有意により高い濃度で妊婦の血漿に存在する。さらに、母体血漿中の該転写物の濃度は、子の誕生後に急激に低下する。したがって、胎盤は、母体血漿中のこれらのｍＲＮＡ転写物の主要な供給源である。
サンプル回収および処理。６人の非妊娠女性および１０人の第１期妊婦からの全血サンプルを回収した。分娩前および分娩後２４時間の５人の第３期妊婦からの末梢血サンプルもまた採用した。１２ｍｌの血液サンプルをＥＤＴＡチューブに回収し、そして４℃で１０分間１６００×ｇで遠心分離した。次いで、血漿をプレイン（plain）ポリプロピレンチューブへ注意深く移した。血漿サンプルを、４℃で１０分間１６０００×ｇで再遠心分離した。上澄みを新しいポリプロピレンチューブへ回収した。母体血漿からのＲＮＡ抽出を、３．２ｍｌの血漿と４ｍｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）および０．８ｍｌのクロロホルムとを混合することによって行った（Ng, E. K. O. et al., Clin Chem 48:1212- 1217 (2002)）。混合物を４℃で１５分間１２０００×ｇで遠心分離し、そして水層を新しいチューブへ移した。１体積の７０％エタノールを、１体積の前記水層へ添加した。次いで、混合物を、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）へ適用し、そして製造業者の推薦に従って処理した。トータルＲＮＡを、６０μｌのＲＮＡアーゼを含まない水で溶出し、そして−８０℃で保存した。ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット，Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を行い、あらゆる混入ＤＮＡを除去した。
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、コラーゲンＶＩアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、コラーゲンＶＩアルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）およびミトコンドリアＡＴＰシンターゼＯサブユニット（ＡＴＰ５Ｏ）ｍＲＮＡの検出のために開発した。プライマーおよびＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（minor-groove-binding）（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）の配列を表４に示す。１×１０６コピーから１０コピーまでの範囲に及ぶ濃度での、それぞれのアンプリコンに特異的な高性能液体クロマトグラフィー精製一本鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｂｕｓｔｉｎ，２０００）（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）の連続希釈によって、検量線を作製した。ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤｌ、ＣＯＬ６Ａ２およびＡＴＰ５Ｏについての合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を、表４に記載する。全ての転写物の絶対濃度を、コピー／血漿ｍｌで表した。
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、組み合わされたサーマルサイクラーおよび蛍光検出器（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。前記４種の転写物の全てについて、ＰＣＲプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ）および蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、それぞれ、３００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。５μｌの抽出した血漿ＲＮＡを増幅のために使用した。複数のネガティブウォーターブランクを、各分析に含めた。
ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤｌ、ＣＯＬ６Ａ２およびＡＴＰ５Ｏ分析のために使用したサーマルプロファイルは、以下の通りであった：反応を５０℃で２分間開始させ、含まれたウラシルＮ−グルコシラーゼを作用させ、続いて６０℃で３０分間逆転写させた。９５℃で５分間変性させた後、９２℃で１５秒間の変性ならびにＣＯＬ６Ａ１およびＡＴＰ５Ｏについては５７℃、ＣＯＬ６Ａ２については５６℃、およびＳＯＤｌについては５９℃で１分間のアニーリング／伸長を使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。
胎盤発現された第２１染色体転写物は、母体血漿中で検出され得、そして妊娠特異的である。非妊娠女性、妊娠第１期および第３期における中央値（median）血漿ｍＲＮＡ濃度は、それぞれ、ＣＯＬ６Ａ１については０コピー／ｍｌ、０コピー／ｍｌおよび７２．６コピー／ｍｌ（図２Ａ）；ＳＯＤ１については２５．３コピー／ｍｌ、５３．０コピー／ｍｌおよび１５５．６コピー／ｍｌ（図２Ｂ）；ＣＯＬ６Ａ２については０．８コピー／ｍｌ、２．１コピー／ｍｌおよび８．８コピー／ｍｌ（図２Ｃ）；ならびにＡＴＰ５Ｏについては６．２コピー／ｍｌ、８８．２コピー／ｍｌおよび１２６．４コピー／ｍｌ（図２Ｄ）であった。前記４転写物の全てについて、妊娠第３期におけるそれらの血漿濃度は、非妊娠グループにおけるそれよりも有意に高かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍテスト、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤｌ、ＣＯＬ６Ａ２およびＡＴＰ５Ｏ ｍＲＮＡについてＰ＜０．０５）。さらに、分娩前の血漿サンプルにおいて、中央値ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２およびＡＴＰ５Ｏ ｍＲＮＡ濃度は、それぞれ、７２．６コピー／ｍｌ、１５５．６コピー／ｍｌ、８．８コピー／ｍｌおよび１２６．４コピー／ｍｌであった（ＣＯＬ６Ａ１ ｍＲＮＡについて図３Ａ、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡについて図３Ｂ、ＣＯＬ６Ａ２ ｍＲＮＡについて図３ＣおよびＡＴＰ５Ｏ ｍＲＮＡについて図３Ｄ）。一方、分娩後の血漿サンプルにおいて、ＣＯＬ６Ａ１、ＳＯＤ１、ＣＯＬ６Ａ２およびＡＴＰ５Ｏの中央値ｍＲＮＡ濃度は、それぞれ、０コピー／ｍｌ、５６．２コピー／ｍｌ、０．８コピー／ｍｌおよび５６．２コピー／ｍｌであった。
実施例２：リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲによる妊婦の胎児における２１トリソミーの検出
最も高い多型率（polymorphic rate）を有する２つのＳＮＰを、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲ開発のための標的として選択した。識別ハイブリダイゼーションプローブを、各ＳＮＰの異なる対立遺伝子の識別を可能にするように設計した。同一遺伝子型決定（Identical genotyping）結果を、リアルタイムＰＣＲおよび直接配列決定（これは、プローブの対立遺伝子特異性を確認した）の両方によって得た。次いで、プローブをＱＲＴ−ＰＣＲアッセイへ組み込み、ここで、胎盤組織における各ＳＮＰの異なる対立遺伝子の相対的発現レベルを先ず測定した。正常ＣＶＳおよび正常満期胎盤（term placentas）、ならびに２１トリソミー妊娠の胎盤から抽出されたＲＮＡを、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲによって評価した。２１トリソミーを有するおよび有さない妊娠における各ＳＮＰの対立遺伝子の比率は、実質的に異なり、母体血漿を使用する胎児における２１トリソミーの検出を可能にする。
最も高い多型率（polymorphic rate）を有する２つのＳＮＰを、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲ開発のための標的として選択した。識別ハイブリダイゼーションプローブを、各ＳＮＰの異なる対立遺伝子の識別を可能にするように設計した。同一遺伝子型決定（Identical genotyping）結果を、リアルタイムＰＣＲおよび直接配列決定（これは、プローブの対立遺伝子特異性を確認した）の両方によって得た。次いで、プローブをＱＲＴ−ＰＣＲアッセイへ組み込み、ここで、胎盤組織における各ＳＮＰの異なる対立遺伝子の相対的発現レベルを先ず測定した。正常ＣＶＳおよび正常満期胎盤（term placentas）、ならびに２１トリソミー妊娠の胎盤から抽出されたＲＮＡを、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲによって評価した。２１トリソミーを有するおよび有さない妊娠における各ＳＮＰの対立遺伝子の比率は、実質的に異なり、母体血漿を使用する胎児における２１トリソミーの検出を可能にする。
サンプル回収および処理。１３個の妊娠第１期および２０個の妊娠第３期からの胎盤組織サンプルを、それぞれ、治療終了（therapeutic terminations）の前または選択的帝王切開分娩（elective cesarean delivery）の直後に、絨毛膜絨毛サンプル（ＣＶＳ）により妊婦から得た。７個の２１トリソミー妊娠からの胎盤組織もまた採用した。全ての組織を上述のように処理した。
対立遺伝子特異的リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲの開発。最も高い多型率（polymorphic rate）を有する２つの情報提供的（informative）コーディングＳＮＰ、それぞれ、ＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２遺伝子のｒｓ１０５３３１２（ｄｂＳＮＰアクセッション番号）およびｒｓ２８３９１１４を選択した。対立遺伝子特異的リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、各ＳＮＰの２つの対立遺伝子の相対濃度を測定するために確立した。対立遺伝子識別を可能にするために、各々１つの対立遺伝子に特異的な、２つの蛍光発生ＭＧＢプローブを、各ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイに含ませる。前記２つのプローブを、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）およびＶＩＣ蛍光リポーター色素のいずれかで標識する。対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲシステムのプライマーおよびプローブの配列を、表５に示す。同一遺伝子型決定結果を、リアルタイムＰＣＲおよび直接配列決定（これは、プローブの対立遺伝子特異性を確認した）の両方によって得た。
対立遺伝子識別および相対的定量（relative quantification）のためのＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、それぞれ４５０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度でＰＣＲプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ）およびＭＧＢプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびに増幅のための１７ｎｇの胎盤ＲＮＡサンプルを使用して、上述の手順に従って設定した。各ＱＲＴ−ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒにおいて二重で行った。使用したサーマルプロファイルは、アニーリング／伸長工程について５９℃の温度を使用する上述のものであった。ヘテロ接合性サンプルのみを分析に含ませた。
統計解析。統計解析をＳｉｇｍａ Ｓｔａｔ ２．０３ ソフトウエア（ＳＰＳＳ）を使用して行った。
第２１染色体がコードしたＲＮＡ−ＳＮＰの相対的定量。２つの対立遺伝子の相対量は、以下の等式によって算出されるような、それらの閾値サイクル値（threshold cycle values）の差（ΔＣｔ）またはそれらの集積蛍光強度（accumulated fluorescent intensities）の差（ΔΔＲｎ）のいずれかによって決定される：
ΔＣｔ＝ＣｔＦＡＭ−ＣｔＶＩＣ
ΔΔＲｎ＝ΔＲｎＦＡＭ−ΔＲｎＶＩＣ
式中、ＣｔＦＡＭおよびＣｔＶＩＣは、対立遺伝子Ａ（ＦＡＭ標識プローブによって検出される）および対立遺伝子Ｂ（ＶＩＣ標識プローブによって検出される）の閾値サイクル値である。ΔＲｎＦＡＭおよびΔＲｎＶＩＣは、ＳＤＳ ｖ１．９ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって算出される、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｂの集積蛍光強度である。ＣｔおよびΔＲｎ値は、ＰＣＲ産物の存在量に対数的に関連し、したがって、各ＲＮＡ−ＳＮＰについてのＣｔおよびΔＲｎ値の差（ΔＣｔ値およびΔΔＲｎ値）は、２つのＲＮＡ対立遺伝子間のＲＮＡ−ＳＮＰ比率を反映する。
ΔＣｔ＝ＣｔＦＡＭ−ＣｔＶＩＣ
ΔΔＲｎ＝ΔＲｎＦＡＭ−ΔＲｎＶＩＣ
式中、ＣｔＦＡＭおよびＣｔＶＩＣは、対立遺伝子Ａ（ＦＡＭ標識プローブによって検出される）および対立遺伝子Ｂ（ＶＩＣ標識プローブによって検出される）の閾値サイクル値である。ΔＲｎＦＡＭおよびΔＲｎＶＩＣは、ＳＤＳ ｖ１．９ソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって算出される、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｂの集積蛍光強度である。ＣｔおよびΔＲｎ値は、ＰＣＲ産物の存在量に対数的に関連し、したがって、各ＲＮＡ−ＳＮＰについてのＣｔおよびΔＲｎ値の差（ΔＣｔ値およびΔΔＲｎ値）は、２つのＲＮＡ対立遺伝子間のＲＮＡ−ＳＮＰ比率を反映する。
ＳＮＰ ｒｓ１０５３３１２（ＣＯＬ６Ａ１）について、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲによって測定されたように、１つのＣＶＳ、正常な妊娠由来の６つの満期胎盤（term placentas）、および３つの２１トリソミー胎盤サンプルが、多型部位についてヘテロ接合性であった。図４において、３つの２１トリソミー胎盤についてのΔＣｔ値は、正常な妊娠から得られたＣＶＳおよび満期胎盤組織のΔＣｔ値から逸脱した。
ＳＮＰ ｒｓ２８３９１１４（ＣＯＬ６Ａ２）について、正常な妊娠由来の８つのＣＶＳおよび１３の満期胎盤、ならびに３つの２１トリソミー胎盤が、対立遺伝子特異的ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイによって遺伝子型決定されたように、ＳＮＰ座についてヘテロ接合性であった。図５Ａに示されるように、３つの２１トリソミー胎盤のΔＣｔ値は、正常な妊娠のそれから逸脱し、２つの２１トリソミーケースはより大きなΔＣｔ値を示しそして残りのケースは減少された値を示した。２１トリソミー胎盤のΔＣｔ値の逸脱（deviations）は、どの対立遺伝子が過剰発現されるかに依存して、正常な妊娠範囲を上回るかまたは下回るかのいずれかになり得る。類似の結果が、ΔΔＲｎ値を使用して得られた（図５Ｂ）。
実施例３：プライマー伸長および質量分析検出による妊婦の胎児における２１トリソミーの検出
最も高い多型率を有する２つのＳＮＰ（ＣＯＬ６Ａ１上のｒｓ１０５３３２０およびＣＯＬ６Ａ２上のｒｓ２８３９１１４）を、さらなるアッセイ開発のために標的化した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の決定を可能にした。サンプルを、質量分析を使用して処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。２１トリソミーを有しているおよび有していない妊娠についての各ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は、十分に大きく、胎児における２１トリソミーの検出が母体血漿を使用して可能である。
最も高い多型率を有する２つのＳＮＰ（ＣＯＬ６Ａ１上のｒｓ１０５３３２０およびＣＯＬ６Ａ２上のｒｓ２８３９１１４）を、さらなるアッセイ開発のために標的化した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の決定を可能にした。サンプルを、質量分析を使用して処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。２１トリソミーを有しているおよび有していない妊娠についての各ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は、十分に大きく、胎児における２１トリソミーの検出が母体血漿を使用して可能である。
胎盤組織回収および処理。第２期胎盤組織サンプルを、治療終了（therapeutic terminations）前に、２１トリソミー胎児を妊娠している妊婦から得た。第３期胎盤組織サンプルを、分娩直後に、核型が正常である胎児から回収した。胎盤組織サンプルを２つの部分に分割し、これらの一方を、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）に保存しそしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持し、他方の部分を、ＤＮＡ抽出まで−８０℃で直ぐに維持した。ＤＮＡを、製造業者の指示書に従う組織プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を使用するＱＩＡａｍｐミニキットを使用して、胎盤組織から抽出した。胎盤組織由来のトータルＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｉｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）で抽出し、そして製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙミニ−キット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で精製した。
胎盤ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅。ＲＮＡ増幅について、総計で４５０ｎｇの胎盤ＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってランダムヘキサマー（random hexamers）（ＴｈｅｒｏｍＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。５０ｎｇのトータルＲＮＡに対応する２５ｎｇのＤＮＡまたはｃＤＮＡを、各ＰＣＲ反応のために使用した（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２上のＳＮＰ座の各々の増幅のためのプライマー配列を、表６に示す。ＰＣＲプライマーは、２５μｌのＰＣＲ体積について２００ｎＭ最終濃度で使用した。ＰＣＲ条件は以下であった：９５℃で１０分間、続いて９４℃で２０秒間変性、５６℃で３０秒間アニーリング、および７２℃で１分間伸長（４５サイクルについて）、ならびに最終的に７２℃で３分間インキュベート。
プライマー伸長反応によるＳＮＰ検出。プライマー伸長反応アッセイ（primer extension reaction assays）を、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型を測定するために設計した。胎盤ＲＮＡ−ＳＮＰ遺伝子型を、胎盤ＤＮＡについて得られたものと比較した。胎盤ＤＮＡおよびＲＮＡ ＰＣＲ産物を、３７℃で４０分間続いて８５℃で５分間、エビアルカリホスファターゼ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）で処理し、過剰なｄＮＴＰを除去した。プライマー伸長プライマーと、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）およびｄＮＴＰｓの混合物とを、前記処理したＰＣＲ産物へ添加した。ＣＯＬ６Ａ１およびＣＯＬ６Ａ２上の選択されたＳＮＰをインテロゲート（interrogate）するように設計されたプライマー伸長プライマーについての配列を、表７に示す。ｔｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）を、Ｓｅｑｕｅｎｏｍからの標準ＭａｓｓＡＲＲＡＹＴＭ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤＴＭ（ｈＭＥ）アッセイプロトコルを使用する塩基伸長反応のために使用した。塩基伸長条件は以下であった：９４℃で２分間、続いて９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、および７２℃で５秒間（７５サイクルについて）。各ＳＮＰ対立遺伝子についてのプライマー伸長産物の配列を表７に示す。最終伸長産物を、ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）樹脂で処理し、反応緩衝液中の塩を除去した。約１０ｎＬの反応溶液を、ＳｐｅｃｔｒｏＰｏｉｎｔ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）ナノディスペンサーを使用して３８４フォーマットＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）上に分配した。コンパクトＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｂｒｕｋｅｒ）をデータ獲得のために使用した。全ての関連するピークの予想される分子量を、分析前に算出し（表７）、そして質量スペクトルから同定する。ＳＮＰ遺伝子型は、特定のＳＮＰ対立遺伝子に対応する質量シグナル（mass signals）の存在または非存在をスコアリングすることによって決定される。
ＳＮＰ比率の測定。質量分析データを、自動分析のためにＳｐｅｃｔｒｏＴＹＰＥＲ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）データベースへ自動的にインポートした。インテロゲートされたＳＮＰについてヘテロ接合性の胎児における２つのＳＮＰ対立遺伝子についての質量シグナルのピーク頻度（peak frequency）の比率を測定した。核型が正常である胎児および２１トリソミー胎児について得られたＳＮＰ比率を比較した。２１トリソミー胎児の胎盤ＤＮＡ ＳＮＰ比率は、ＣＯＬ６Ａ１（図６Ａ）およびＣＯＬ６Ａ２（図７Ａ）の両方上のＳＮＰについて正常な胎児について得たものから逸脱した。２１トリソミー胎児についてのＳＮＰ比率は、トリソミック第２１染色体のＳＮＰ遺伝子型に依存して、正常な胎児のそれと比較して減少または増加される。２１トリソミー胎児についてのＣＯＬ６Ａ１（図６Ｂ）およびＣＯＬ６Ａ２（図７Ｂ）ＲＮＡ転写物上のインテロゲートされたＳＮＰの胎盤組織ＳＮＰ比率もまた、正常組織について得られたものから逸脱することが示された。
実施例４：プライマー伸長および質量分析による母体血漿中の循環胎児ＲＮＡを使用しての２１トリソミー胎児の非侵襲的出生前検出
さらなるＳＮＰもまた妊婦の胎児における染色体異常の検出のために有用であることを実証するために、胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）（表１９）を研究した。プライマー伸長反応アッセイによって、胎盤組織および母体血漿サンプルのＲＮＡ−ＳＮＰ遺伝子型を測定できた。プライマー伸長産物を、質量分析を使用して分析し、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率を定量した。２１トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＰＬＡＣ４ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は、十分に大きく、胎児の２１トリソミーの検出が母体血漿を使用して可能である。
さらなるＳＮＰもまた妊婦の胎児における染色体異常の検出のために有用であることを実証するために、胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）（表１９）を研究した。プライマー伸長反応アッセイによって、胎盤組織および母体血漿サンプルのＲＮＡ−ＳＮＰ遺伝子型を測定できた。プライマー伸長産物を、質量分析を使用して分析し、ＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子比率を定量した。２１トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＰＬＡＣ４ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は、十分に大きく、胎児の２１トリソミーの検出が母体血漿を使用して可能である。
胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）遺伝子における適用可能なコーディングＳＮＰの同定および対立遺伝子頻度の測定
ＳＮＰ同定。胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）遺伝子は、胎盤で高度に発現されるが、バフィーコート細胞において低レベルで発現される。ＰＬＡＣ４遺伝子は、第２１染色体のダウン症候群重要領域に局在する。ＰＬＡＣ４遺伝子配列は表１９に列挙され、そしてＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）でのＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇｌ７）アセンブリに基づいて、第２１染色体上のヌクレオチド座標４１４６９０２８−４１４８０５８５に及ぶ。表１９に列挙されるＰＬＡＣ４遺伝子配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定される、全ての公知のかつ予想されるＰＬＡＣ４ ＲＮＡスプライシング変異体からなる：ＡＦ２６９２８７、ＡＫ０２７８６８、ＡＫ０９２４３１、ＢＣ０９３６８５、ＢＣ１０１６１５、ＢＣ１０１６１７、Ｌ１３１９７、ＮＭ＿１８２８３２およびＬＯＣ１９１５８５。多型ＳＮＰを、ＰＬＡＣ４遺伝子のエキソン／転写領域を配列決定することによって同定した。直接配列決定を、１０人の無関係の中国人妊婦からの胎盤ＤＮＡサンプルについて行った。１２ｎｇのゲノムＤＮＡを、先ずＰＣＲによって増幅した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｖ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ）およびＭｏｄｅｌ ３１００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、配列決定を行った。
ＳＮＰ同定。胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）遺伝子は、胎盤で高度に発現されるが、バフィーコート細胞において低レベルで発現される。ＰＬＡＣ４遺伝子は、第２１染色体のダウン症候群重要領域に局在する。ＰＬＡＣ４遺伝子配列は表１９に列挙され、そしてＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）でのＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇｌ７）アセンブリに基づいて、第２１染色体上のヌクレオチド座標４１４６９０２８−４１４８０５８５に及ぶ。表１９に列挙されるＰＬＡＣ４遺伝子配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号によって同定される、全ての公知のかつ予想されるＰＬＡＣ４ ＲＮＡスプライシング変異体からなる：ＡＦ２６９２８７、ＡＫ０２７８６８、ＡＫ０９２４３１、ＢＣ０９３６８５、ＢＣ１０１６１５、ＢＣ１０１６１７、Ｌ１３１９７、ＮＭ＿１８２８３２およびＬＯＣ１９１５８５。多型ＳＮＰを、ＰＬＡＣ４遺伝子のエキソン／転写領域を配列決定することによって同定した。直接配列決定を、１０人の無関係の中国人妊婦からの胎盤ＤＮＡサンプルについて行った。１２ｎｇのゲノムＤＮＡを、先ずＰＣＲによって増幅した。ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｖ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ）およびＭｏｄｅｌ ３１００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、配列決定を行った。
対立遺伝子頻度測定。ＰＬＡＣ４の転写領域における４つのコーディングＳＮＰが、中国人集団において多型であると判った（表８）。これらの４つのＳＮＰは、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇ１７）アセンブリの第２１染色体配列の、それぞれ、第２１染色体ヌクレオチド位置４１４７０５９１、４１４７１１４５、４１４７６２３６および４１４７８７５５に局在する。第２１染色体ヌクレオチド位置４１４７０５９１および４１４７８７５５で見られるＳＮＰについてのｄｂＳＮＰアクセッション番号は、それぞれ、ｒｓ９９７７００３およびｒｓ８１３０８３３である。残り２つのＳＮＰは、新規のものであり、これらを、ＵＣＳＣゲノムブラウザ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）のＨｕｍａｎ Ｍａｙ ２００４（ｈｇｌ７）アセンブリにおける第２１染色体上のそれらのヌクレオチド座標に従って、ＰＬＡＣ４−４１４７１１４５およびＰＬＡＣ４−４１４７６２３６とここで命名する。それらの対立遺伝子頻度を表９に示す。ｒｓ８１３０８３３は、前記４つのＳＮＰの中で最も多型性であるＳＮＰであり、そしてさらなるアッセイ開発のために選択した。
ＳＮＰマーカーを使用しての母体血漿中のＰＬＡＣ４ ＲＮＡの対立遺伝子比率の測定
サンプル回収および処理。第１期および第２期胎盤組織サンプルを、２１トリソミー胎児を妊娠している７人の妊婦から得た。核型が正常である胎児を妊娠している２６人の妊婦からの胎盤組織もまた、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）によって回収した。胎盤サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。末梢血サンプルを、妊娠第１期の間、１人の正倍数性胎児を妊娠している４３人の妊婦および１人の２１トリソミー胎児を妊娠している５人の妊婦から回収した。血漿サンプルを実施例１に記載されるように収穫した。
サンプル回収および処理。第１期および第２期胎盤組織サンプルを、２１トリソミー胎児を妊娠している７人の妊婦から得た。核型が正常である胎児を妊娠している２６人の妊婦からの胎盤組織もまた、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）によって回収した。胎盤サンプルを、回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。末梢血サンプルを、妊娠第１期の間、１人の正倍数性胎児を妊娠している４３人の妊婦および１人の２１トリソミー胎児を妊娠している５人の妊婦から回収した。血漿サンプルを実施例１に記載されるように収穫した。
胎盤組織からのトータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で抽出した。ＲＮＡを、１．６〜３．２ｍｌの母体血漿サンプルから抽出した。血漿１ｍｌにつき、３ｍｌのＴｒｉｚｏｌ ＬＳ試薬および０．８ｍｌのクロロホルムを添加した。混合物を、４℃で１５分間１２，０００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、水層を回収した。１ｍｌの水層当たり、５３８μｌの無水エタノールを添加した。混合物をＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）へ適用し、そして製造業者の推奨に従って処理した。トータルＲＮＡを、各カラムについて、４８μｌのＲＮアーゼを含有しない水で溶出した。２つのカラムからの最終の溶出されたＲＮＡを一緒にプールした。次いで、ＤＮアーゼ処理を行い、混入するＤＮＡを除去した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）。
逆転写およびＰＣＲ増幅。１．２５μｇの胎盤ＲＮＡまたは４８μＬの血漿ＲＮＡを、遺伝子特異的プライマー（配列は表１０に示す）を使用して、製造業者の指示書（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、それぞれ、４０μｌまたは１００μｌの反応体積において逆転写した。
各ＰＣＲ増幅反応について、４０μｌの胎盤ｃＤＮＡまたは１００μｌの母体血漿ｃＤＮＡを、それぞれ、総体積８０μｌまたは２００μｌで使用した。各反応は以下を含有した：０．６Ｘ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（０．９ｍＭ ＭｇＣｌ２含有）（Ｑｉａｇｅｎ）、各々２５μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、５０μＭのｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各々２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに０．０２Ｕ／μｌのＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲプライマー配列を表１０に示す。ＰＣＲ反応を９５℃７分間で開始させ、続いて９５℃で４０秒間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長（５５サイクルについて）、ならびに７２℃で３分間の最終インキュベーション。
プライマー伸長反応によるＳＮＰ検出および対立遺伝子比率定量。プライマー伸長反応を実施例３に記載のように行った。ＰＣＲ産物を、先ず、エビアルカリホスファターゼ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）で処理した。７７１ｎＭの伸長プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．１５ＵのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）ならびに各々６４μＭのｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）を含有する、４μｌの塩基伸長カクテルを、５μｌの水および５μｌのＰＣＲ産物と混合した。サーマルプロファイルは、９４℃で２分間、続いて９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、および７２℃で５秒間（１００サイクルについて）であった。各ＳＮＰ対立遺伝子についての伸長プライマーおよび伸長産物の配列および分子量を表１１に示す。最終伸長産物の分子量を、実施例３に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器によって測定した。ＳＮＰについてヘテロ接合性である胎児における２つのＳＮＰ対立遺伝子を示すプライマー伸長産物についてのピーク領域の比率を測定した。
リアルタイムＱＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発
ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡについてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発し、母体血漿ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度の量的差が２１トリソミー妊娠と正常妊娠との間で存在するかどうかを評価した。プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，コーラルビル，ＩＡ）、ＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（minor groove binding）（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）および較正物質（calibrator）（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）の配列を、表１２に示す。
ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡについてのＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを開発し、母体血漿ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度の量的差が２１トリソミー妊娠と正常妊娠との間で存在するかどうかを評価した。プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，コーラルビル，ＩＡ）、ＴａｑＭａｎマイナーグルーブ結合（minor groove binding）（ＭＧＢ）蛍光プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）および較正物質（calibrator）（Ｐｒｏｌｉｇｏ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）の配列を、表１２に示す。
ＱＲＴ−ＰＣＲ反応を、２５μｌの反応体積において製造業者の指示書（ＥＺ ｒＴｔｈ ＲＮＡ ＰＣＲ試薬セット，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って設定した。ＱＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００ＨＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティー，ＣＡ，ＵＳＡ）において行った。ＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブを、それぞれ、４００ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で使用した。５μｌの抽出されたＲＮＡを増幅のために使用した。サーマルサイクリングプロファイルは以下であった：反応を５０℃２分間で開始させ、続いて６０℃で３０分間逆転写。９５℃で５分変性後、４５サイクルのＰＣＲを、９５℃で１５秒間の変性および６０℃で１分間を使用して行った。
２１トリソミー胎児および正常胎児を妊娠している妊婦からの胎盤サンプルおよび母体血漿サンプルにおけるＰＬＡＣ４ ＲＮＡ対立遺伝子比率の差異の検出
核型が正常である妊娠および２１トリソミー妊娠の胎盤におけるＲＮＡ転写物対立遺伝子比率を、ＳＮＰ ｒｓ８１３０８３３を使用して比較した。対立遺伝子Ａの相対量（より低い質量の対立遺伝子、即ち、伸長産物が質量スペクトルにおいてより低い質量を実証する対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ｇの相対量（より高い質量の対立遺伝子、即ち、伸長産物が質量スペクトルにおいてより高い質量を実証する対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図８に示されるように、全ての２１トリソミーサンプルは、正常サンプルと十分に識別可能な対立遺伝子比率を示した。２１トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＧ対立遺伝子を有するトリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＡ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
核型が正常である妊娠および２１トリソミー妊娠の胎盤におけるＲＮＡ転写物対立遺伝子比率を、ＳＮＰ ｒｓ８１３０８３３を使用して比較した。対立遺伝子Ａの相対量（より低い質量の対立遺伝子、即ち、伸長産物が質量スペクトルにおいてより低い質量を実証する対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ｇの相対量（より高い質量の対立遺伝子、即ち、伸長産物が質量スペクトルにおいてより高い質量を実証する対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図８に示されるように、全ての２１トリソミーサンプルは、正常サンプルと十分に識別可能な対立遺伝子比率を示した。２１トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＧ対立遺伝子を有するトリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＡ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
ＳＮＰ ｒｓ８１３０８３３を使用して、核型が正常である胎児および２１トリソミー胎児を妊娠している女性からの母体血漿においても、ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ対立遺伝子比率を比較した。１つだけ除いて全部のトリソミーサンプルが、正常サンプルから逸脱した対立遺伝子比率を実証した（図９）。多型性マーカー（例えば、ＳＮＰ）を使用することによって母体血漿中の循環胎児特異的転写物の対立遺伝子比率を分析することにより、胎児異数性が非侵襲的に検出され得ることを、データは示す。
母体血漿中の循環ＰＬＡＣ４ ＲＮＡと胎盤ＰＬＡＣ４ ＲＮＡとの間のＳＮＰ ｒｓ８１３０８３３対立遺伝子比率について、ポジティブな相関関係（positive correlation）が見られた（図１０）（ピアソン相関関係，Ｐ＜０．０５）。この知見は、胎盤が、ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡを母体血漿へ放出する主要な供給源であるという追加の証拠を提供する。
正倍数性妊娠および２１トリソミー妊娠における循環ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡの比較
循環ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度を、核型が正常である妊娠と２１トリソミー妊娠との間で比較した。妊娠の第１期および第２期の間、正倍数性胎児を妊娠している２９人の妊婦および２１トリソミー胎児を妊娠している５人の妊婦から、血漿サンプルを回収した。血漿サンプルのＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度を、上述のリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲによって測定した。図１１に示されるように、ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡが、トリソミー血漿サンプルの全てにおいて検出された。２１トリソミー妊娠および正常妊娠についての中央値は、それぞれ、５５８１コピー／ｍｌおよび４８３６コピー／ｍｌである。統計的に有意な差は、正常な妊娠と２１トリソミー妊娠との間で血漿ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度について確立されなかった。これは、母体血漿中のＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡの単なる定量は、胎児２１トリソミーの存在の信頼性のある評価を提供しないことを実証している。
循環ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度を、核型が正常である妊娠と２１トリソミー妊娠との間で比較した。妊娠の第１期および第２期の間、正倍数性胎児を妊娠している２９人の妊婦および２１トリソミー胎児を妊娠している５人の妊婦から、血漿サンプルを回収した。血漿サンプルのＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度を、上述のリアルタイムワンステップＲＴ−ＰＣＲによって測定した。図１１に示されるように、ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡが、トリソミー血漿サンプルの全てにおいて検出された。２１トリソミー妊娠および正常妊娠についての中央値は、それぞれ、５５８１コピー／ｍｌおよび４８３６コピー／ｍｌである。統計的に有意な差は、正常な妊娠と２１トリソミー妊娠との間で血漿ＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡ濃度について確立されなかった。これは、母体血漿中のＰＬＡＣ４ ｍＲＮＡの単なる定量は、胎児２１トリソミーの存在の信頼性のある評価を提供しないことを実証している。
実施例５：プライマー伸長および質量分析による胎盤中における胎児発現されたＲＮＡを使用しての１８トリソミー胎児の検出
さらなる染色体異常が他の遺伝子を使用して検出され得ることを実証するために、セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（serpin peptidase inhibitor clade B (ovalbumin) member 2）（ＳＥＲＰＩＮＢ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５７５）を、１８トリソミーを検出する能力について研究した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の測定を可能にした。質量分析を使用してサンプルを処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。１８トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＳＥＲＰＩＮＢ２ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は十分に高く、胎児における１８トリソミーの検出が、胎盤ＲＮＡサンプルを使用して可能である。
さらなる染色体異常が他の遺伝子を使用して検出され得ることを実証するために、セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（serpin peptidase inhibitor clade B (ovalbumin) member 2）（ＳＥＲＰＩＮＢ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００２５７５）を、１８トリソミーを検出する能力について研究した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の測定を可能にした。質量分析を使用してサンプルを処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。１８トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＳＥＲＰＩＮＢ２ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は十分に高く、胎児における１８トリソミーの検出が、胎盤ＲＮＡサンプルを使用して可能である。
胎盤中のセルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２ｍＲＮＡの対立遺伝子比率の測定
胎盤発現セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２）を選択した。ＳＥＲＰＩＮＢ２遺伝子は第１８染色体上に局在する。ＳＥＲＰＩＮＢ２遺伝子のコード領域内に局在する多型ＳＮＰ（表１３）を、公共データベースから同定し、そしてアッセイ開発のために選択した。
胎盤発現セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２）を選択した。ＳＥＲＰＩＮＢ２遺伝子は第１８染色体上に局在する。ＳＥＲＰＩＮＢ２遺伝子のコード領域内に局在する多型ＳＮＰ（表１３）を、公共データベースから同定し、そしてアッセイ開発のために選択した。
サンプル回収および処理。第１期および第２期胎盤組織サンプルを、１８トリソミー胎児を妊娠している４人の妊婦から得た。核型が正常な胎児を妊娠している８人の第１期妊婦からの胎盤サンプルもまた、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）によって回収した。サンプルを回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。トータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）を使用して抽出した。抽出されたＲＮＡサンプルをＤＮアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、あらゆる混入ＤＮＡを除去した。
逆転写およびＰＣＲ増幅。０．６２５μｇの胎盤ＲＮＡを、製造業者の指示書（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って２０μｌの反応体積において逆転写した。表１４に示される配列を有するリバースＰＣＲプライマーを使用して、逆転写を行った。
ＰＣＲ増幅について、２０μｌの胎盤ｃＤＮＡを、４０μｌの総反応体積において使用した。各反応は以下を含有した：０．６Ｘ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（０．９ｍＭ ＭｇＣｌ２含有）（Ｑｉａｇｅｎ）、各々２５μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、５０μＭのｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各々２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに０．０２Ｕ／μｌのＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲプライマー配列を表１４に示す。ＰＣＲ反応を９５℃７分間で開始させ、続いて９５℃で４０秒間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長（５０サイクルについて）、ならびに７２℃で３分間の最終インキュベーション。
プライマー伸長反応によるＳＮＰ検出。プライマー伸長反応を実施例３に記載されるように行った。ＰＣＲ産物を、先ず、エビアルカリホスファターゼ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）で処理した。７７１ｎＭの伸長プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．１５ＵのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）ならびに各々６４μＭのｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）を含有する、４μｌの塩基伸長カクテルを、５μｌの水および５μｌのＰＣＲ産物と混合した。サーマルプロファイルは、９４℃で２分間、続いて９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、および７２℃で５秒間（８５サイクルについて）であった。各ＳＮＰ対立遺伝子についてのプライマー伸長産物の配列を表１５に示す。最終伸長産物の分子量を、実施例３に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器によって検出した。ＳＮＰについてヘテロ接合性である胎児における２つのＳＮＰ対立遺伝子についてのピーク頻度（peak frequencies）の比率を測定した。
正常な胎盤からの１８トリソミー胎盤におけるＳＥＲＰＩＮＢ２転写物の対立遺伝子比率の逸脱
核型が正常である妊娠および１８トリソミー妊娠の胎盤中のＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡのＳＮＰ比率を比較した。対立遺伝子Ａの相対量（より低い質量の対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ｇの相対量（より高い質量の対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図１２に示されるように、全ての１８トリソミーサンプルは、重複することなく正常なサンプルから逸脱した対立遺伝子比率を示した。１８トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＧ対立遺伝子を有する１８トリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＡ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
核型が正常である妊娠および１８トリソミー妊娠の胎盤中のＳＥＲＰＩＮＢ２ ｍＲＮＡのＳＮＰ比率を比較した。対立遺伝子Ａの相対量（より低い質量の対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ｇの相対量（より高い質量の対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図１２に示されるように、全ての１８トリソミーサンプルは、重複することなく正常なサンプルから逸脱した対立遺伝子比率を示した。１８トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＧ対立遺伝子を有する１８トリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＡ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
実施例６：プライマー伸長および質量分析による胎盤中における胎児発現されたＲＮＡを使用しての１３トリソミー胎児の検出
さらなる染色体異常が他の遺伝子を使用して検出され得ることを実証するために、コラーゲンＩＶ型アルファ２（collagen type IV alpha 2）（ＣＯＬ４Ａ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ０５６１０）を、１３トリソミーを検出する能力について研究した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の測定を可能にした。質量分析を使用してサンプルを処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。１３トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＣＯＬ４Ａ２ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は十分に高く、胎児における１３トリソミーの検出が、胎盤ＲＮＡサンプルを使用して可能である。
さらなる染色体異常が他の遺伝子を使用して検出され得ることを実証するために、コラーゲンＩＶ型アルファ２（collagen type IV alpha 2）（ＣＯＬ４Ａ２）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｘ０５６１０）を、１３トリソミーを検出する能力について研究した。プライマー伸長反応アッセイは、胎盤組織サンプルのＳＮＰ遺伝子型の測定を可能にした。質量分析を使用してサンプルを処理し、異なるＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子を識別し、そしてＲＮＡ−ＳＮＰ対立遺伝子の相対発現レベルを測定し、対立遺伝子の比率を算出した。１３トリソミーを有するおよび有さない妊娠についてのＣＯＬ４Ａ２ ＳＮＰの対立遺伝子の比率の差は十分に高く、胎児における１３トリソミーの検出が、胎盤ＲＮＡサンプルを使用して可能である。
胎盤におけるコラーゲンＩＶ型アルファ２ｍＲＮＡのＳＮＰ比率の測定
胎盤発現されるコラーゲンＩＶ型アルファ２（ＣＯＬ４Ａ２）ｍＲＮＡを選択した。ＣＯＬ４Ａ２遺伝子は第１３染色体上に局在する。ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のコード領域内に局在する多型ＳＮＰ（表１６）を、公共データベースから同定し、そしてアッセイ開発のために標的化した。
胎盤発現されるコラーゲンＩＶ型アルファ２（ＣＯＬ４Ａ２）ｍＲＮＡを選択した。ＣＯＬ４Ａ２遺伝子は第１３染色体上に局在する。ＣＯＬ４Ａ２遺伝子のコード領域内に局在する多型ＳＮＰ（表１６）を、公共データベースから同定し、そしてアッセイ開発のために標的化した。
サンプル回収および処理。第１期および第２期胎盤組織サンプルを、１３トリソミー胎児を妊娠している３人の妊婦から得た。核型が正常な胎児を妊娠している７人の第１期妊婦からの胎盤サンプルもまた、絨毛膜絨毛サンプリング（ＣＶＳ）によって回収した。胎盤サンプルを回収直後にＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ（Ａｍｂｉｏｎ（登録商標），オースティン，ＴＸ）において保存し、そしてＲＮＡ抽出まで−８０℃で維持した。トータルＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴｒｉｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン，ドイツ）で抽出した。抽出されたＲＮＡをＤＮアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、あらゆる混入ＤＮＡを除去した。
逆転写およびＰＣＲ増幅。１．２５μｇの胎盤ＲＮＡを、製造業者の指示書（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って４０μｌの反応体積において逆転写した。表１７に示される配列を有するリバースＰＣＲプライマーを使用して、逆転写を行った。
ＰＣＲ増幅について、４０μｌの胎盤ｃＤＮＡを、８０μｌの総体積において使用した。各反応は以下を含有した：０．６Ｘ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（０．９ｍＭ ＭｇＣｌ２含有）（Ｑｉａｇｅｎ）、各々２５μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、５０μＭのｄＵＴＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、各々２００ｎＭのフォワードおよびリバースプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに０．０２Ｕ／μｌのＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）。ＰＣＲプライマー配列を表１７に示す。ＰＣＲ反応を９５℃７分間で開始させ、続いて９５℃で４０秒間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長（５０サイクルについて）、ならびに７２℃で３分間の最終インキュベーション。
プライマー伸長反応によるＳＮＰ検出および対立遺伝子比率定量。プライマー伸長反応を実施例３に記載されるように行った。ＰＣＲ産物を、先ず、エビアルカリホスファターゼ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）で処理した。７７１ｎＭの伸長プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１．１５ＵのＴｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）ならびに各々６４μＭのｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，サンディエゴ，ＵＳＡ）を含有する、４μｌの塩基伸長カクテルを、５μｌの水および５μｌのＰＣＲ産物と混合した。サーマルプロファイルは、９４℃で２分間、続いて９４℃で５秒間、５２℃で５秒間、および７２℃で５秒間（１００サイクルについて）であった。各ＳＮＰ対立遺伝子についてのプライマー伸長産物の配列を表１８に示す。最終伸長産物の分子量を、実施例３に記載されるように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器によって検出した。ＳＮＰについてヘテロ接合性である胎児における２つのＳＮＰ対立遺伝子についてのピーク頻度比率を測定した。
正常な胎盤からの１３トリソミー胎盤におけるＣＯＬ４Ａ２転写物の対立遺伝子比率の逸脱
核型が正常である妊娠および１３トリソミー妊娠の胎盤中のＣＯＬ４Ａ２ ｍＲＮＡの対立遺伝子比率を比較した。対立遺伝子Ｇの相対量（より低い質量の対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ａの相対量（より高い質量の対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図１３に示されるように、全ての１３トリソミー胎盤は、重複することなく正常なサンプルから逸脱した対立遺伝子比率を示した。１３トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＡ対立遺伝子を有するトリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＧ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
核型が正常である妊娠および１３トリソミー妊娠の胎盤中のＣＯＬ４Ａ２ ｍＲＮＡの対立遺伝子比率を比較した。対立遺伝子Ｇの相対量（より低い質量の対立遺伝子）に対して対立遺伝子Ａの相対量（より高い質量の対立遺伝子）を割ることによって、前記比率を算出した。図１３に示されるように、全ての１３トリソミー胎盤は、重複することなく正常なサンプルから逸脱した対立遺伝子比率を示した。１３トリソミーサンプルの対立遺伝子比率は、２つのグループに分離した。余分なＡ対立遺伝子を有するトリソミーサンプルは、通常の範囲よりも高い対立遺伝子比率を示し、一方、余分なＧ対立遺伝子を有するサンプルは、正常な範囲よりも低い対立遺伝子比率を示した。
理解の明確のために例示および実施例によっていくぶん詳細に前述の発明を記載したが、当業者は、特定の変更および修飾が添付の特許請求の範囲内で行われ得ることを理解する。さらに、本明細書中で提供した各参照文献は、各参照文献が個々に参照により組み込まれるのと同程度に、その全体が参照により組み込まれる。
Claims (32)
- 妊婦の胎児における染色体異常の存在を検出するための方法であって、以下：
（ａ）該妊婦由来のＲＮＡ含有生物学的サンプル中の、問題の少なくとも１つの染色体由来の少なくとも１つの遺伝子座から転写されたＲＮＡ由来の対立遺伝子を識別する工程［ここで、該ＲＮＡ含有生物学的サンプルは胎児ＲＮＡを含有する］；
（ｂ）該ＲＮＡ転写物の該対立遺伝子の比率を測定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）からの比率と、染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦から得られた比較可能な生物学的サンプル由来の対立遺伝子の比率を示す標準コントロールとを比較する工程［ここで、該標準コントロールからの該比率の増加または減少は、染色体異常を有する胎児を有する増加した危険性を示す］
を含む、方法。 - 前記染色体異常が、２１トリソミー、１８トリソミーおよび１３トリソミーからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
- 前記染色体異常が２１トリソミーである、請求項２に記載の方法。
- 前記染色体異常がＸ染色体またはＹ染色体上にある、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）における生物学的サンプルが、母体血、母体血漿または血清、羊水、絨毛膜絨毛サンプル、着床前胚由来の生検材料、母体血から単離された胎児有核細胞または胎児細胞レムナント、母体尿、母体唾液、女性生殖管の洗浄物、およびセロセンテシス（celocentesis）によって得られるサンプルからなる群から選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）における生物学的サンプルが母体血である、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）における生物学的サンプルが、母体血中の細胞エレメントまたは細胞レムナントを含有する、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）における胎児ＲＮＡが胎盤に由来する、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）が逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）および／または工程（ｂ）が、プライマー伸長反応、質量分析、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識プローブを使用するハイブリダイゼーション、直接配列決定、クローニングおよび配列決定、ならびに電気泳動からなる群から選択されるメンバーを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）における対立遺伝子が、配列変異によって区別される、請求項１に記載の方法。
- 前記配列変異が一塩基多型（ＳＮＰ）である、請求項１１に記載の方法。
- 前記配列変異が挿入／欠失多型である、請求項１１に記載の方法。
- 前記配列変異がシンプルタンデムリピート多型（simple tandem repeat polymorphism）である、請求項１１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、第２１染色体、第１８染色体、第１３染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体からなる群から選択されるメンバーから転写される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが第２１染色体から転写される、請求項１５に記載の方法。
- 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、コラーゲンＶＩアルファ１（collagen VI alpha 1）（ＣＯＬ６Ａ１）、スーパーオキシドジスムターゼ１（superoxide dismutase 1）（ＳＯＤ１）、コラーゲンＶＩアルファ２（collagen VI alpha 2）（ＣＯＬ６Ａ２）、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼＯサブユニット（mitochondrial ATP synthase O subunit）（ＡＴＰ５Ｏ）、ＢＴＧファミリー，メンバー３（BTG family, member 3）（ＢＴＧ３）、ディスインテグリン−ライク・アンド・メタロプロテアーゼ（レプロリシンタイプ）・ウィズ・トロンボスポンジンタイプ１モチーフ，１（a disintegrin-like and metalloprotease (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif, 1）（ＡＤＡＭＴＳ１）、ベータ位ＡＰＰ切断酵素２（beta-site APP-cleaving enzyme 2）（ＢＡＣＥ２）、インターセクチン１（intersectin 1）（ＩＴＳＮ１）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体蛋白質（amyloid beta (A4) precursor protein）（ＡＰＰ）、ＡＴＰシンターゼ，Ｈ＋輸送，ミトコンドリアＦ０複合体，サブユニットＦ６（ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F0 complex, subunit F6）（ＡＴＰ５Ｊ）、ダウン症候群重要領域遺伝子５（Down syndrome critical region gene 5）（ＤＳＣＲ５）、胎盤特異的４（placenta-specific 4）（ＰＬＡＣ４）、仮想蛋白質ＢＣ００５１０７（hypothetical protein BC005107）（ＬＯＣ９０６２５）、リボソーム蛋白質Ｌ１７（ribosomal protein L17）（ＲＰＬ１７）、セルピンペプチダーゼインヒビタークレードＢ（オボアルブミン）メンバー２（serpin peptidase inhibitor clade B (ovalbumin) member 2）（ＳＥＲＰＩＮＢ２）およびコラーゲンＩＶ型アルファ２（collagen type IV alpha 2）（ＣＯＬ４Ａ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子座から転写される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、前記遺伝子座の少なくとも１つの一塩基多型を含む、請求項１８に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、コラーゲンＶＩアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）およびコラーゲンＶＩアルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子座から転写される、請求項１９に記載の方法。
- ＣＯＬ６Ａ１の遺伝子座から転写されるＲＮＡにおけるＳＮＰが、Ａｒｇ８５０ＨｉｓまたはＳｅｒ９３２Ｓｅｒである、請求項２０に記載の方法。
- ＣＯＬ６Ａ２の遺伝子座から転写されるＲＮＡにおけるＳＮＰが、Ｖａｌ７２８Ｖａｌである、請求項２０に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、胎盤特異的４（ＰＬＡＣ４）についての遺伝子座から転写される、請求項１８に記載の方法。
- 前記ＲＮＡが、ＡＦ２６９２８７、ＡＫ０２７８６８、ＡＫ０９２４３１、ＢＣ０９３６８５、ＢＣ１０１６１５、ＢＣ１０１６１７、Ｌ１３１９７、ＮＭ＿１８２８３２およびＬＯＣ１９１５８５等の、ＰＬＡＣ４遺伝子座から転写される任意の変異体である、請求項２３に記載の方法。
- 前記ＰＬＡＣ４遺伝子の遺伝子座から転写されるＲＮＡが、ｒｓ３８０４０２６、ｒｓ４８１８２１９、ｒｓ７８４４、ｒｓ９０１５、ｒｓ１３６４３、ｒｓ９３０５７２９、ｒｓ９３０５７３０、ｒｓ５０１９１９５、ｒｓ５０１９１９４、ｒｓ５８４４０６９、ｒｓ１０４９９０４、ｒｓ１６９９８０８９、ｒｓ１２４８２１１６、ｒｓ１１９０９４３９、ｒｓ７２７８６５９、ｒｓ１２１０６４０９、ｒｓ１２１０６３９５、ｒｓ１２１０６４０１、ｒｓ１２１０６４３４、ｒｓ２１８３５８４、ｒｓ３９４９７２５、ｒｓ８１３０８３３、ｒｓ１０２２２１４５、ｒｓ９９８１４７８、ｒｓ８１３０８３３、ｒｓ９９７７００３、ＰＬＡＣ４−４１４７１１４５およびＰＬＡＣ４−４１４７６２３６からなる群から選択される一塩基多型または挿入−欠失多型を含む、請求項２３に記載の方法。
- 前記妊婦が妊娠第１期の間にある、請求項１に記載の方法。
- 前記妊婦が妊娠第２期の間にある、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）における比率が前記標準コントロールから１標準偏差より高いかまたはより低い場合、工程（ｃ）における比較が、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）における比率が前記標準コントロールから２標準偏差より高いかまたはより低い場合、工程（ｃ）における比較が、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す、請求項１に記載の方法。
- 工程（ｂ）における比率が前記標準コントロールから３標準偏差より高いかまたはより低い場合、工程（ｃ）における比較が、染色体異常を有する胎児の増加した危険性を示す、請求項１に記載の方法。
- 妊婦における染色体異常を有する胎児の存在を検出するためのキットであって、該キットが、以下：
（ａ）問題の領域を増幅するためのプライマー；および
（ｂ）染色体が正常である胎児を各々妊娠している妊婦から得られた比較可能な生物学的サンプル由来の対立遺伝子の比率を示す標準コントロール
を備える、キット。 - さらに、以下：
（ｃ）各ＲＮＡ種の異なる対立遺伝子間を識別するためのハイブリダイゼーションプローブ
を備える、請求項３１に記載のキット。
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