CN106086243A - 一种无创式检测怀孕中胎儿是否健康的系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从怀孕母体的外源性生物体鉴定胎儿健康状态的生物标志物的方法，及其用于无创性确定胎儿健康状态的用途。此外本发明还公开了用于所述方法的系统和试剂盒。其中所述的健康状态为染色体异常，所述的染色体异常为21三体。

Description

一种无创式检测怀孕中胎儿是否健康的系统及其应用

技术领域

本发明涉及用于确定孕期胎儿是否健康的无创式方法。具体地，本发明涉及通过在来自怀孕女性的生物样本中评估与外源性生物体相关的生物标志物而用于检测胎儿健康状态的方法。

背景技术

目前介入式的产前诊断常见的有绒毛膜绒毛取样和羊膜穿刺术，对胎儿和母亲均具有潜在风险。而无创式的则有用孕妇血清标志物和超声波对胎儿产前筛查，但其灵敏性和特异性广受质疑。

无创产前检测(Noninvasive prenatal testing，NIPT)是指有别于传统的绒毛取样、羊水穿刺和胎儿脐静脉穿刺等侵入性产前检测手段，通过对母体血浆中存在的胎儿遗传物质进行检测，而直接对胎儿的健康情况作以检测鉴定的方法。目前NIPT通常以孕妇外周血为检测样本，扩增其中的胎儿游离DNA(cffDNA)后，采用高通量测序技术对其进行测序和计数，并结合数学模型进行数据分析，从而判断胎儿的染色体是否异常，其是目前下一代基因测序(NGS)中市场化程度最高的临床应用，中国NIPT的目标市场有望超过100亿元。

单纯疱疹是一种常见的病毒性全身疾病，主要感染起源于外胚层的皮肤、黏膜、眼和神经系统。由于妊娠期处于免疫抑制状态，易于受到单纯疱疹病毒(herpes simplexvirus，HSV)感染，通过宫内或产道传播影响胚胎发育，引发流产、早产、死胎、先天畸形、胎儿生长受限(FGR)、新生儿感染和智力低下等不良妊娠结局。目前HSV感染率有增高趋势。因此，防治HSV感染，对减少不良妊娠结局和降低远期致残率，以及保护母婴健康具有重要意义。

病原体HSV属于疱疹病毒科的α亚科，为溶细胞性感染病毒。病毒颗粒呈球形，直径120～150nm，由核心、衣壳、被膜及包膜组成。核心含160kb、分子质量约为108ku的双股DNA，衣壳呈20面体对称，外覆一层厚薄不匀的被膜，最外层为典型的脂质双层包膜，上有突起。HSV基因组DNA分子由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成，有72个基因，共编码70多种蛋白质。已经正式命名的病毒包膜糖蛋白有12种，如gB、gC、gD、gE、gG、gH、gK、gL、gM、gJ等。它们是病毒壳粒表面的抗原决定簇，与识别宿主细胞膜受体、吸附和穿入细胞以及诱导宿主的免疫反应等密切相关。根据生物学特性和抗原不同，HSV可分成HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ两种血清型，两型约有50％的核苷酸序列相同，故两型间存在着共同抗原和特异性抗原。HSV能在二倍体细胞核内复制，产生明显的细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)，核内出现嗜酸性包涵体。病毒可通过细胞间桥直接扩散。感染细胞可与邻近未感染的细胞融合形成多核巨细胞。HSV-Ⅰ主要通过直接、间接接触或飞沫传播，感染口腔、皮肤、黏膜、眼黏膜及中枢神经系统，偶见于外生殖器。HSV-Ⅱ通常为性传播，引起生殖系统感染，偶见于口腔病变，也可经胎盘宫内传播或经产道传播给新生儿。约90％以上的人群曾感染过HSV，其中很大一部分导致潜伏感染，病毒在体内可维持数年甚至终生。HSV-Ⅱ感染较为普遍，目前发生率有逐年增高趋势。其发病率与年龄、社会经济条件、多性伴等关系密切。有流行病学调查显示:妊娠期HSV感染率约为0.85％～2.6％。

Cheon等(Evidence for the relation of herpes simplex virus type 1toDown syndrome and Alzheimer’s disease[J].Electrophoresis，2001，22(3):445-448.)通过对唐氏综合征患儿脑组织神经炎性细胞因子IL-6的研究，认为妊娠期HSV感染也可能是引发唐氏综合征的病因之一。

目前，医院里常用的用于检测HSV的方法主要是通过利用基于酶联免疫吸附(ELISA)的方法检测怀孕女性的外周血中针对所述病原体的抗体而进行评估的，从而间接反映所述怀孕女性的感染状态。这些方法对检测胎儿感染一般是无效的。所述方法的一些局限性为：1)只有少数已知的病原体可以被检测到；2)每一个病原体需要相应的抗体检测试剂；3)所需要的血液量随着所需检测的病原体的数量而增加；4)这些方法非常耗时；以及5)这些方法不利于批量测试。

尽管最灵敏的直接检测病原体存在的方法时病原体培养，但其非常耗时并具有较高的失败率。因此，还没有看到病原体培养的大规模临床应用。

发明内容

本发明提供了无创式的孕期胎儿健康状态的检测方法，所述的方法为利用在来自怀孕女性的生物样本中，通过评估DNA分子来诊断所述的胎儿是否受到HSV的感染。

本发明的一个方面提供一种检测胎儿是否是健康状态的检测系统，所述的系统包括a)核酸提取系统；b)核酸检测系统；c)结果分析系统。其中所述的核酸检测系统优选为高通量测序系统。

另一个方面，本发明提将所述的系统制备用于确定胎儿染色体非整倍性的方法，所述的方法为非诊断性的，所述方法包含：a)在来自怀孕女性的生物样本中，评估来自外源性生物体的多核苷酸；b)分析所述外源性多核苷酸与现有技术公开的序列对比及其同源性情况；c)确定所述胎儿染色体是否具有非整倍性，其中所述的非整倍性为HSV感染导致。

在一个实施方案中，所述胎儿是人类胎儿。在另一个实施方案中，所述分析是采用至少1个正常对照进行的。在另一个实施方案中，所述生物样本为选自由以下所组成的组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取物。

在一个实施方案中，所述胎儿非健康状体为染色体的非整倍性。优选的，所述的非整倍性为选自由21三体性和21三体性所组成的组的常染色体异常

在第三方面，本发明提供了一种用于鉴定胎儿的健康状态的生物标志物的方法，所述方法包含：a)在来自至少一个怀孕女性的生物样本中，评估来自外源性生物体的多核苷酸的同一性和/或水平；b)对所述外源性多核苷酸的所述的同一性和/或水平进行统计学分析；以及c)如果统计学显著相关性建立，则鉴定所述非人类的多核苷酸作为针对所述健康状态的生物标志物，其中，所述胎儿的所述健康状态为无HSV感染。

在一些实施方案中，所述胎儿是人类胎儿。在一些实施方案中，所述统计分析是采用至少1个正常对照进行的。在另一个实施方案中，所述生物样本为选自由以下所组成的组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取物。在另一个实施方案中，所述外源性生物体为选自由以下所组成的组：病毒、细菌、真菌和寄生虫。在另一个实施方案中，述健康状态为选自由以下所组成的组：基因异常、和发育异常。

在第四方面，本发明提供了一组用于确定人类胎儿的21三体性的生物标志物，其为HSV的核酸片段。

在第五方面，本发明提供了一种用于确定胎儿的健康状态的方法，所述方法包含：a)在来自怀孕女性的生物样本中，通过测序多核苷酸来评估来自外源性生物体的至少一个生物标志物的同一性和/或水平；b)分析所述至少一个生物标志物的所述同一性和/或水平；以及c)确定所述胎儿的所述健康状态。在一些实施方案中，所述方法采用高通量测序。

在一些实施方案中，所述胎儿为人类胎儿。在一些实施方案中，所述生物样本为选自由以下所组成的组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取物。在一些实施方案中，步骤a)包含对来自所述生物样本的无细胞DNA进行纯化。在一些实施方案中，对所述DNA进行扩增。在一些实施方案中，对所述DNA建立文库。在一些实施方案中，步骤b)包含将从步骤a)获得的所述序列与所述生物标志物进行比较。在一些实施方案中，在步骤b)之前，从步骤a)获得的所述序列中去除与人类基因组序列相匹配的序列。在一些实施方案中，所述外源性生物体为选自由以下所组成的组：HBV、HCV、HIV、HSV、和梅毒。

在第六方面，本发明提供了一种用于确定胎儿的健康状态的系统，所述系统包含：a)用于在来自怀孕女性的生物样本中评估至少一个来自外源性生物体的多核苷酸的同一性和/或水平的手段；以及b)用于分析所述外源性多核苷酸的同一性和/或水平的手段。在一些实施方案中，所述胎儿的所述健康状态为无HBV感染。在一些实施方案中，所述小分子可以与宿主代谢相关。在一些实施方案中，用于评估至少一种多核苷酸同一性和/或水平的手段可以为测序装置。在一些实施方案中，用于分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平的手段可以为计算机。

在第七方面，本发明提供了一种用于确定胎儿的健康状态的试剂盒包含：a)本发明所提供的生物标志物；以及b)如何使用所述生物标志物的说明书。

附图说明

图1显示了用于鉴定针对胎儿健康状态的生物标志物的示例性过程。

具体实施方式

为了便于理解，所述具体实施方式是为了有助于解释技术方案而提供的，也就是说，这些实施例只用于说明目的，而不以任何方式限制本发明的范围。除非特别说明，实施方式并不表明具体条件，按照常规条件或生产商推荐的条件。

实施例1确定作为针对唐氏综合征的生物标志物的病毒

本实施例阐明了通过从怀孕女性获取外周血(5mL)、提取游离DNA、利用新的高通量技术测序，以及生物信息分析来无创性基因分析胎儿染色体非整倍性风险。外源性序列与所述宿主生物体的序列相关。本结果表明外源性序列是与所述宿主生物体的健康状态相关的。

在所述怀孕女性知情的情况下，研究人员获取外周血样本(12-24孕周)并利用条形码进行标记以便于信息分类和样本管理。从所述外周血分离血清，并从所述血清中提取游离DNA。构建DNA文库然后进行高通量测序。测序结果与人类基因组序列进行比较。那些没有被比对到人类基因组序列的被分类为非人类序列。将非人类序列与已知的病毒序列进行比较以获得唯一比对序列。图1显示了本实施例中实验步骤的流程图。

1)样本收集

样本来自怀有正常胎儿和21三体性胎儿的怀孕女性。在妇产科医生的指导下，各取5毫升母源外周血并收集于含有EDTA的管中。实验者针对每个样本进行标记，并按照分类管理样本。

2)样本分离

将血液样本在4摄氏度下以1600g离心10分钟，将上清液收集到新的管中。然后，将经过处理的血液在摄氏度下以1600g进行10分钟的第二次离心，并将上清液再次收集到管中。最后的上清液储藏在-80摄氏度指导直到进一步处理。

3)提取DNA

该步骤利用本领域常用的磁珠法DNA提取试剂盒进行。在确保所述DNA提取的结果的前提下，磁珠法的DNA提取试剂盒(DP327)成本低并且易于自动化(≥80个样本)，。

4)测序

根据生产商的DNA文库构建标准操作程序(参见标准文库构建指南http://www.illumina.com/)，利用提取的DNA构建DNA文库，然后在Illumina HiSeq2000TM上测序。

a)DNA文库构建：将DNA打断为一定大小的片段，进行末端修复，在所述DNA片段的3’末端添加碱基A,对所述DNA连接接头然后进行多聚酶链反应。终产物为两端均已连接有接头的所述DNA测序片段。

b)测序芯片制备和测序：经处理的单链DNA片段所述芯片表面的引物通过互补碱基在芯片(流动槽)上进行锚定。将无标记多核苷酸和酶加入到所述反应系统中以便进行桥式PCR反应。利用固定在流动细胞表面的接头作为一种模板，形成dsDNA(双链DNA)桥，所述dsDNA桥是由ssDNA(单链DNA)桥扩增而来。经过30个循环的扩增，每个单分子被扩增接近1000倍以成为单克隆DNA簇，并进行线性化处理。

c)边测序边合成：向所述反应系统中加入DNA聚合酶d，所述接头引物和标记有荧光染料的四种三磷酸脱氧核糖核苷(dNTP)。由于四种dNTPs的所有3’末端羟基均使用化学方式进行了保护，在每个循环过程中只加入单个dNTP。所述dNTP被加入到合成链中后，对所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶进行洗脱。加入缓冲溶液以便于荧光激发，使用激光刺激荧光信号，以优选的设备进行记录。最后，利用计算机分析产生所述测序结果。加入化学试剂对荧光信号进行淬灭，并去除所述dNTP 3'-羟基保护基团以恢复其粘性，然后加入第二核苷酸。重复所属过程直到每个模板序列完全聚合为双链。对每个循环收集的荧光信号结果的分析显示了每个模板DNA片段的序列。

5)序列比对和统计分析

利用Illumina HiSeq 2000TM对样本进行测序并产生单末端、35bp或49bp的读段，其中每个个体具有少于10X的测序深度。从NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载所述人类参考基因组(Human Genome Build 37)。BLAST与人类基因组的序列比，产生非匹配序列，即指非人类序列。从所述NCBI数据库下载病毒基因组，利用BLAST将所述非人类序列比对到病毒基因组并产生唯一比对读段。针对所述数据库中的各个病毒计算并比较所述唐氏综合征样本和正常对照样本的读段数，然后进行统计分析。针对HSV，N表示总样本数。N1表示唐氏综合征样本数，Na表示序列读段被唯一比对HSV基因组的唐氏综合征样本数。相似地，Nf表示正常对照样本数，Nd表示序列读段可以被唯一比对到HSV基因组的正常对照样本数。

表1统计表如下

使用Fisher精确检验比较唐氏综合征样本和正常对照样本之间的区别。检验公式如下：

$p=\min \[\frac{\underset{i=0}{\overset{Na}{\Σ}}\left(\begin{array}{c}Nc\\ i\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}N-Nc\\ N1-i\end{array}\right)}{\left(\begin{array}{c}N\\ Nc\end{array}\right)},\frac{\underset{i=Na}{\overset{Nc}{\Σ}}\left(\begin{array}{c}N1\\ i\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}N-N1\\ Nc-i\end{array}\right)}{\left(\begin{array}{c}N\\ Nc\end{array}\right)},\frac{1}{2}\]\×2$

如果p值小于等于0.01，该病毒被定义为名义上显著，并且可以对胎儿健康有一些影响。

6)统计结果

利用Fisher精确检验分析90例唐氏综合征样本和150例正常对照样本以找到4个具有显著性的病毒，并利用所述相同的方法在153例唐氏综合征样本和551例正常对照样本中进行验证。最终鉴定出2个显示与唐氏综合征胎儿显著相关的候选病毒(表2)。

表2与唐氏综合征显著相关的病毒

病毒名称	发现P值	验证P值	验证P值
				单纯疱疹病毒(HSV)	7.64E-5	5.47E-11	7.01E-15

实施例2实施例中样本的结果

选择10例临床HSV抗原阳性怀孕女性案例，其中5例确认为胎儿HSV抗原阳性和另外5例为阴性。另外还选取了5例HSV抗原阴性怀孕女性和胎儿作为阴性案例。从怀孕女性中收集大约5毫升的外周血液，然后进行低速离心或静态自然沉降上清液，并将上清液吸入新的管子。依据HiSeq2000TM测序构建文库的要求，利用TAKARA病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取母源血清游离DNA。所获得的DNA片段的末端修复是利用T4DNA聚合酶、KlenowTM聚合酶和T4多核苷酸酶进行的。添加末端A-残基后，将市售可得的接头(Illumina)连接到所述DNA片段上。然后所述接头连接DNA以标准多重引物进行14个循环PCR的再次扩增。使用Agencourt AMPureTMXP磁珠对PCR产物进行纯化。

对样本进行纯化，然后溶于25微升的EB缓冲液中。

确定所创建的文库是否测序仪器对于对片段分布的要求。然后通过Q-PCR方法进行定量。用定制芯片与所述文库杂交，并用Illumina HiSeq2000TM对杂交产物进行测序。装置参数的设定和操作方法依据Illumina操作手册(可以从http://www.illumina.com/support/documentation.ilmn获得)。

测序数据结果如表3所示

表3测序数据结果

将所述读段比对到HSV参考序列(NC_001806)。依据所述阳性样本和阴性样本独特读段统计结果设置临界值。所述临界值用于确定哪个样本具有HSV感染。本实施例中的方法可以感染HSV的怀孕女性中检测其胎儿是否具有HSV感染。其结果示于表4中。

表4HBV感染的结果

“++”指所述母亲和所述胎儿都被感染；“+-”指所述母亲被感染而所述胎儿未被感染；“--“指所述母亲和所述胎儿都未被感染。

在我们检测的15个样本中，只有一例样本与临床数据不一致，由此证明了本申请的方法的强大性能。

除非另外明确规定，在本文中使用的术语和短语及其变形应被解释为开放的，与限制相反。作为前述内容的例子：术语“包括”应被理解为意指“包括而不限于”等；术语“例子”用于提供在讨论中的项目的示例性实例，而不是其排他或限制性的列表；以及形容词例如“常规的”、“传统的”、“正常的”、“标准的”、“已知的”和类似意义的术语不应被解释为将所描述的项目限制到给定的时间段，或限制到在给定时间可用的项目。但替代地，这些术语应被理解为包括可以是现在或未来的任何时间可用的、已知的常规、传统、正常或标准技术。同样，用连词“和”连接的一组项目不应被理解为要求那些项目中的每一个都存在于该组中，而更确切地应被理解为“和/或”，除非另外明确地规定。类似的，用连词“或”连接的一组术语不应被理解为要求在该组中相互排斥，而更确切地应被理解为“和/或”，除非另外明确地规定。此外，虽然本发明的项目、元件或部件可以以单数形式进行描述或主张权利，复数形式被设想为在其范围内，除非明确地规定限于单数。例如，“至少一个”可以指单个或复数个，而并不限于其中之一。扩展词和短语例如“一个或多个”、“至少”、“但不限于”或其他类似短语的存在不应被理解为意味着在这样的扩展短语可能不存在的实例中较窄的情况是预期的或所需的。

尽管已经参照附图对本发明的实施例进行了详细描述，可以理解的是各种变化和需改对本领域的普通技术人是显而易见的。这种变化和修改被理解为被包含在本发明的范围内。应理解的是，本发明的各个实施例只是通过举例的方式被提出，而不是用以限制本发明。同样的，各个附图可以描述本发明的示例性结构或其他配置，其被完成来帮助理解可包括在本发明中的特征和功能。本发明不限于所示的示例性结构或配置，但可使用各种可选的结构和配置来实现。此外，虽然上面按照各种示例性实施方式和实现描述了本发明，应理解，在一个或多个单独的实施方式中描述的各个特征和功能，其应用不限于他们被描述的特定实施方式。相反，它们可单独地或以某种组合应用于本发明的其他实施方式中的一个或多个，而不管这样的实施方式是否被描述以及这样的特征是否被呈现为所描述的实施方式的一部分。因此，本发明的广度和范围不应由上面描述的示例性实施方式中的任一个限制。

Claims (9)

1.一组用于确定人类胎儿的21三体性的生物标志物，其为人单纯疱疹病毒HSV。

2.一种用于确定胎儿的健康状态的系统，所述系统包含：

a)用于在来自怀孕女性的生物样本中评估至少一个来自外源性生物体的多核苷酸同一性和/或水平的手段；以及

b)用于分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平的手段，

其中所述胎儿的所述健康状态为无HSV感染。

3.一种用于确定胎儿的健康状态的试剂盒包含：

a)利用根据权利要求1所述的方法所识别的生物标志物；以及

b)如何使用所述生物标志物的说明书。

4.权利要求1所述的标志物在制备检测试剂盒中的应用，所述的应用为：

a)在来自怀孕女性的生物样本中，评估至少一个来自外源性生物体的多核苷酸同一性和/或水平；

b)分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平；以及

c)确定所述胎儿的所述健康状态，

其中所述胎儿的所述健康状态为无HSV感染。

5.根据权利要求4所述的应用，其中所述胎儿的所述健康状态为无所述外源性生物体感染。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其中所述胎儿是人类胎儿。

7.根据权利要求4或5所述的应用，其中所述分析是采用至少1个正常对照进行的。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其中所述生物样本为选自由以下所组成的组：血清、血液、积液、尿液、骨髓、腹水、盆腔冲洗液、胸腔积液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、来自消化组织的细胞悬浮液、和粪便提取物。

9.根据权利要求4或5所述的应用，其中所述健康状态为染色体异常，所述的染色体异常为21三体。