CN114990207A - 用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用 - Google Patents

用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用 Download PDF

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CN114990207A CN202210660164.1A CN202210660164A CN114990207A CN 114990207 A CN114990207 A CN 114990207A CN 202210660164 A CN202210660164 A CN 202210660164A CN 114990207 A CN114990207 A CN 114990207A
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Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用；本方法包括制备待测孕妇血浆游离DNA文库，将待测孕妇血浆游离DNA文库与探针组中的探针进行杂交，得杂交产物，从杂交产物中收集靶序列，获得测孕妇血浆游离DNA捕获文库，将测孕妇血浆游离DNA捕获文库进行测序，判断待测孕妇及待测胎儿是否携带单基因遗传病涉及的突变基因，从待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，计算判断胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常；本发明经过杂交捕获及高通量测序实现染色体缺失或增加及50个显性基因的自发突变的一体化检测。

Description

用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及分子生物学分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用。
背景技术
出生缺陷是指婴儿出生前发生的身体结构、功能或代谢异常。出生缺陷可由染色体畸变、基因突变等遗传因素或环境因素引起,也可由这两种因素交互作用或其他不明原因所致，通常包括先天畸形、染色体异常、遗传代谢性疾病、功能异常如盲、聋和智力障碍等。我国每年1600万新生儿中约有90万新生儿患有出生缺陷，每10个家庭中就有1个家庭可能会生育患有先天缺陷的孩子。为减少出生缺陷发生，世界卫生组织(WHO)提出了出生缺陷干预“三级预防”策略，其中三级预防针对新生儿疾病的早期筛查，早期诊断，及时治疗，避免或减少致残，提高患儿的生活质量。
NIPT(无创产前筛查)作为产前检测领域出现的一种新型胎儿染色体疾病检测技术，相对传统的绒毛取样或羊膜腔穿刺等具有“侵入性”的产前检测方法而言，其通过高通量测序技术对母亲外周血中的胎儿游离DNA进行“非侵入性”产前检测，更加安全、快捷、准确，有效补充了现有的产前筛查、产前诊断体系。现有的NIPT检测染色体非整倍体直接对全基因组测序存在成本高、数据分析复杂、周期长等问题。对于单基因遗传病检测，基因诊断可以在分子水平甚至单个碱基发生改变的情况下作出诊断，被认为是比较准确、可靠的方法和手段。与新一代的测序技术(Nextgenerationsequencing，NGS)相比，传统的遗传病基因诊断技术(如Sanger测序、荧光原位杂交、比较基因组杂交、基因芯片等)存在着通量小、速度慢、精准度低、成本高等问题。而NGS本身，也存在着数据量庞大、遗传信息分析复杂的问题。目前很少有可以一体化检测染色体非整倍体和单基因病的产品，亟待开发。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒及应用，以解决目前对一体化染色体非整倍体和单基因突变检测方法缺失的问题，且实现检测简便，经过杂交捕获及高通量测序一次性检测胎儿是否有染色体缺失或增加及是否有50个显性基因的自发突变。
为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，包括探针组；所述探针组包括特异性探针；每个特异性探针包括DNA片段1；所述DNA片段1为单基因遗传病涉及的突变基因的一部分；
所述探针组的设计方法包括：获取单基因遗传病涉及的突变基因的外显子序列，并前后延伸50bp，延伸后不足50bp的扩展至50bp，提取每个区域的参考序列，去掉重复区域的序列，从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp；
所述单基因遗传病对应的突变基因包括：COL1A1基因、HRAS基因、MECP2基因、SMC1A基因、MAP2K2基因、STAT3基因、KCNQ2基因、SPTB基因、RIT1基因、NIPBL基因、HDAC8基因、STXBP1基因、ATP1A3基因、TSC2基因、KRAS基因、FGFR2基因、CBL基因、COL2A1基因、RAD21基因、COL4A5基因、ELANE基因、NF1基因、CHD7基因、PHEX基因、BRAF基因、COL1A2基因、PKD1基因、KIF11基因、SOS2基因、ANK1基因、MAP2K1基因、PRRT2基因、SYNGAP1基因、SMC3基因、FGFR3基因、SCN1A基因、NSD1基因、TSC1基因、RB1基因、SHOC2基因、CDKL5基因、SOS1基因、PTPN11基因、JAG1基因、NRAS基因、WT1基因、RAF1基因、FBN1基因、PCDH19基因和SCN2A基因。
进一步，所述探针组中的每个特异性探针从5’末端到3’末端由引物1、所述DNA片段1和引物2组成；
所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述引物1和/或所述引物2具有生物素标记。
进一步，所述试剂盒还包括引物3、引物4、引物5和引物6中的至少一种；
所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
进一步，所述试剂盒还包括接头序列组；
所述接头序列组中的序列1的5’-3’端依次为通用片段1、随机序列和防污标签序列；
所述接头序列组中的序列2的5’-3’端依次为防污标签序列和通用片段2；
所述接头序列组中的序列1的防污标签序列的3’端的最后一个碱基与序列1的通用片段1的5’端第一个碱基互补；
所述随机序列为14个碱基的随机序列；所述防污标签序列为13-14个碱基的随机序列；
所述通用片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述通用片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
进一步，所述接头序列组为以下接头序列组中的一组或多组；
接头1-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNGCAGATCAGCGTA*T
接头1-2 P-TACGCTGATCTGCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头2-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNATGTCTCACACGAG*T
接头2-2 P-CTCGTGTGAGACATAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头3-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCTAGTCTAGCGTC*T
接头3-2 P-GACGCTAGACTAGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头4-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCGTGAGATGTAGCA*T
接头4-2 P-TGCTACATCTCACGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头5-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCATACTGAGTGCA*T
接头5-2 P-TGCACTCAGTATGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
；所述接头序列组中的N为A、T、C、G中的任一一个，所述P表示磷酸化修饰；所述*T表示碱基T进行硫代修饰。
进一步，所述试剂盒包括记载有判断标准甲和乙和/或丙的载体；
所述判断标准甲用于判断待测胎儿是否有50种遗传病单基因突变；
所述判断标准甲如下：
获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度，若待测孕妇SNP Indel含有1138个致病突变位点中的任何一个点突变，则待测胎儿携带该突变位点；
所述获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度；步骤如下：
(1)制备待测孕妇血浆游离DNA文库；制备待测孕妇血浆游离DNA文库的接头为权利要求4或5中所述接头组；
(2)完成步骤(1)后，将所述待测孕妇血浆游离DNA文库与权利要求1至3中任一探针组进行杂交，得到杂交产物；
(3)完成步骤(2)后，从所述杂交产物中收集靶序列，获得靶序列捕获文库；
(4)将步骤(3)得到的靶序列捕获文库进行高通量测序，得到测序原始数据；
(5)将步骤(4)得到的测序原始数据切除接头序列、低质量碱基，过滤，然后比对到参考基因组hg19的相应位置；
(6)完成步骤(5)后，去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列，得到待测孕妇的数据；然后分析，得到SNP和INDEL的相关信息；
(7)对步骤(6)得到的信息进行注释，然后筛选，得到待测孕妇的SNP Indel；
(8)对HGMD数据库报道的位点进行注释，然后筛选获得1138个致病突变位点；如果待测孕妇的SNP Indel含有1138致病突变位点中的任何一个点突变，则待测胎儿携带相应突变基因的突变位点；否则待测胎儿不携带相应基因突变位点；根据待测孕妇携带的突变基因的突变位点，绘制目标基因缺失和重复分析图，获得待测胎儿关于所述单基因遗传病涉及的突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度；
所述判断标准乙如下：
所述判断标准乙即判断待测胎儿的目标常染色体数目是增加、减少还是正常；所述目标常染色体为13号染色体、18号染色体或21号染色体；
所述判断标准乙可如下：从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，按照下式计算待测孕妇目标常染色体Z-score；
Figure BDA0003690398190000041
ChrNZ-score for test sample：待测孕妇目标常染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇目标常染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的目标常染色体Z-score≥3，则待测胎儿的目标常染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的目标常染色体Z-score＜3，则待测胎儿的目标常染色体数目正常；如果待测孕妇的目标染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的目标常染色体数目减少；
如果目标常染色体数目增加或目标常染色体数目减少，则待测胎儿目标常染色体为非整倍体；如果目标常染色体数目正常，则待测胎儿目标常染色体为整倍体；
所述判断标准丙即判断待测胎儿的性染色体数目是增加、减少还是正常；
所述判断标准丙如下：
(1)从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，根据待测孕妇Y染色体捕获区域的reads比例判断待测胎儿性别：若待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例＞0.001，则待测胎儿性别为男性；若待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例≤0.001，则待测胎儿性别为女性；
(2)如果待测胎儿为女性，先按照下式计算待测孕妇的X染色体Z-score；
Figure BDA0003690398190000051
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3，则待测胎儿的X染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测胎儿的X染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的X染色体数目减少；
待测胎儿性别为女性时，如果X染色体数目增加或X染色体数目减少，则待测胎儿X染色体为非整倍体；如果X染色体数目正常，则待测胎儿X染色体为整倍体；
(3)如果待测胎儿为男性，首先按照如下步骤(a)-(c)获得待测孕妇的X染色体Z-score：
(a)按照下式计算正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值：
Figure BDA0003690398190000061
C：正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrXMDB：正常男性数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
％ChrYMDB：正常男性数据库中Y染色体捕获区域reads比例的平均值。
(b)按照下式计算经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例：
Figure BDA0003690398190000062
％ChrX为经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
％ChrXsample为待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
C为正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrYsample为待测孕妇Y染色体捕获区域的reads比例；
(c)按照下式计算待测孕妇X染色体Z-score：
Figure BDA0003690398190000063
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrX：经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体非捕获区域reads比例＜正常孕妇中分娩出男胎儿的Y染色体非捕获区域reads比例的平均值，则待测胎儿的X染色体数目增加、Y染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例≥正常孕妇中分娩出男胎儿的Y染色体非捕获区域reads比例的平均值，则待测胎儿的Y染色体数目增加、X染色体数目正常；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测胎儿的X染色体和Y染色体数目均正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的X染色体数目减少，Y染色体数目正常；
胎儿性别为男性时，如果X染色体数目增加或X染色体数目减少、Y染色体数目正常，则待测胎儿X染色体为非整倍体；如果Y染色体数目增加、X染色体数目正常，则待测胎儿Y染色体为非整倍体；如果X染色体和Y染色体数目均正常，则待测胎儿X染色体和Y染色体均为整倍体。
第二方面，本发明还提供上述探针组。
第三方面，本发明还提供上述试剂盒和上述探针组的应用，包括以下至少一项：
A.在制备待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的检测试剂中的应用；
B.在制备待测胎儿携带的权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因是正常、杂合或纯合检测试剂中的应用；
C.在制备待测胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常的检测试剂中的应用。
第四方面，本发明还提供一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的非疾病诊断方法，包括：
(1)制备待测孕妇血浆游离DNA文库；
(2)将所述待测孕妇血浆游离DNA文库与权利要求1所述探针组中的一种或多组探针进行杂交，得杂交产物；
(3)从所述杂交产物中收集靶序列，获得测孕妇血浆游离DNA捕获文库；
(4)将所述测孕妇血浆游离DNA捕获文库进行测序，判断待测孕妇是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因，并获得所述待测孕妇关于所述单基因遗传病涉及的突变基因的位点类型、突变频率和测序深度；判断待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的情况；
(5)从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，计算第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体的reads比例的平均值和标准方差；并根据所述平均值和标准方差判断胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常。
进一步，所述判断待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的情况，按照上述判断标准甲进行判断；
所述根据所述平均值和标准方差判断待测胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常，按照上述判断标准乙或丙进行判断。
本发明的有益效果在于：本发明经过杂交捕获及高通量测序一次性即可检测胎儿是否有染色体缺失或增加及是否有50个显性基因的自发突变；本发明检测胎儿是否有染色体缺失或增加，无需设计特异探针，只需针对常见的50个显性基因设计探针，通过杂交捕获的非特异区(非目标区域)来分析胎儿是否有染色体非整倍体。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
实施例1用于检测染色体非整倍体及单基因突变的探针制备
1、常见显性基因选择
从数据库中筛选有致病或可能致病自发突变的样本，并从中筛选自发突变频率达占比约50％的30个显性基因，及文献报道致病的显性基因30个(二者有交集的基因10个)，共计50个，具体见表1.
表1 常见致病的显性基因
Figure BDA0003690398190000081
Figure BDA0003690398190000091
Figure BDA0003690398190000101
2、探针制备
从5’末端到3’末端依次包括引物1、DNA片段1和引物2。引物1的核苷酸序列为5’-GACTACATGGGACAT-3’。引物2的核苷酸序列为5’-GGAACCTACGACGTA-3’。DNA片段1均由78个核苷酸组成。DNA片段1为50种单基因遗传病涉及的突变基因的一部分。
UCSC数据库获取50个突变基因的外显子序列并前后延伸50bp，延伸后不足50bp的扩展至50bp，提取每个区域的参考序列(参考基因组版本hg38)，去掉重复区域的序列，重复序列采用RepeatMask软件分析得到。从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp。每个区域根据外显子的GC含量不同，n会有变化，GC含量太高或太低、n越小，探针设计越密集以达到捕获的均一性提高。
根据GC含量调整探针密度公式：
D_gc＝a+a*10*|gc-0.5|
其中D_gc代表某GC含量的探针密度，a代表GC含量为50％时候的探针密度，为20。gc代表GC含量。
对探针进行生物素标记。具体步骤为：将探针混合均匀在总体积为1.2mL的ddH2O中，取其中15μL利用通用PCR引物对(由引物1:5’-bio-GACTACATGGGACAT-3’(bio表示5’末端具有生物素标记)和引物2:5’-GGAACCTACGACGTA-3’组成)进行PCR扩增(可分三管进行)，得到PCR扩增产物。
接头序列组中的序列1的5’-3’端依次为通用片段1、随机序列和防污标签序列；
接头序列组中的序列2的5’-3’端依次为防污标签序列和通用片段2；
接头序列组中的序列1的防污标签序列的3’端的最后一个碱基与序列1的通用片段1的5’端第一个碱基互补；
随机序列包括14个碱基的随机序列；防污标签序列为13-14个碱基的随机序列；
通用片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
通用片段2核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
具体为表2中的接头组。将合成的接头的干粉用高速离心机12000rpm离心，加入一定体积的pH为8.0、10mM Tris-HCl稀释至100μM；将接头1和接头2各取50μL 100μM按照表3的反应程序退火后使用。
表2UMI防污染接头组
接头名称 接头序列
接头1-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNGCAGATCAGCGTA*T
接头1-2 P-TACGCTGATCTGCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头2-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNATGTCTCACACGAG*T
接头2-2 P-CTCGTGTGAGACATAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头3-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCTAGTCTAGCGTC*T
接头3-2 P-GACGCTAGACTAGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头4-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCGTGAGATGTAGCA*T
接头4-2 P-TGCTACATCTCACGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
接头5-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCATACTGAGTGCA*T
接头5-2 P-TGCACTCAGTATGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
；所述接头序列组中的N为A、T、C、G中的任一一个，所述P表示磷酸化修饰；所述*T表示碱基T进行硫代修饰。
表3退火反应程序
步骤 温度 时间
1 95℃ 2min
2 按照0.1℃/8s下降至25℃ 约90min
3 4℃ Hold
；接头序列组中的N为A、T、C、G中的任一一个，P表示磷酸化修饰；*T表示碱基T进行硫代修饰。
检测试剂盒由富集缓冲液、杂交缓冲液、文库结合缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2、文库富集洗脱液、中和缓冲液、PCR反应液和实施例一制备的探针组组成。
富集缓冲液由3.5体积份人cot-1DNA水溶液、3.5体积份鲑鱼精DNA水溶液和3体积份引物混合液(由引物3、引物4和水组成)组成。富集缓冲液中，人cot-1DNA的浓度为35％(v/v)，鲑鱼精DNA的浓度为15％(v/v)，引物3的浓度为0.5nmol/μL，引物4的浓度为0.5nmol/μL。
杂交缓冲液：含1.25M NaCl、0.125M柠檬酸钠、0.1g/100mL BSA和7％(v/v)Tween20的水溶液。
文库结合缓冲液：含1M NaCl和1mM EDTA的pH7.5、10mM的Tris-HCl缓冲液。
漂洗缓冲液1：含0.1％(m/v)SDS的柠檬酸钠缓冲液。柠檬酸钠缓冲液为含175g/LNaCl和88g/L柠檬酸三钠的水溶液；pH值为7.4。
漂洗缓冲液2：含0.1％(m/v)SDS的柠檬酸钠缓冲液稀释液。柠檬酸钠缓冲液稀释液为1体积份柠檬酸钠缓冲液和9体积份水混合而成。
文库富集洗脱液：浓度为0.1M的NaOH水溶液。
中和缓冲液：pH7.5、1M的Tris-HCl缓冲液。
3mL PCR反应液由100μL浓度为0.05U/μL Phusion Hot Start II DNAPolymerase(Thermo公司的产品，货号为F549S)和2900μL PCR mixbuffer组成。PCRmixbuffer为含0.2mM dATP、0.2mM dTTP、0.2mM dCTP、0.2mM dGTP、5％(v/v)DMSO、2.5pmol引物5、2.5pmol引物6、4mMMgCl2、500mM KCl和0.8％(v/v)Nonidet P40的水溶液。
表4 引物及其核苷酸序列
Figure BDA0003690398190000131
N为A、T、C、G中的任一一个。
实施例2用于检测染色体非整倍体及单基因突变的方法
接头设计
孕妇游离核酸cfDNA文库的制备
取50μL游离核酸cfDNA，利用Rapid Max DNA Lib Prep Kit(abclonal，货号为RK20217)文库构建试剂盒制备待测孕妇cfDNA文库。制备待测孕妇cfDNA文库的接头为表2中任一一组。
探针序列靶向捕获
血浆分离：EDTA抗凝血管或Streck管采集待测孕妇的外周血10mL，1600g离心15min，吸取上清转移到新的低吸附1.5mL离心管。13000rpm二次离心后，上清转移到新的低吸附1.5mL离心管，提取游离核酸或-80℃保存备用。
游离核酸提取：用大体积游离核酸提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司的产品，货号为DP710)按照操作说明书提取血浆游离DNA(cfDNA)。将该cfDNA命名为待测孕妇血浆游离DNA。
取5ng获得的待测孕妇血浆游离DNA，利用KAPA Hyper文库构建试剂盒(KAPABiosystems公司的产品，货号为KK8504)制备待测孕妇血浆游离DNA文库。
取待测孕妇血浆游离DNA文库，进行Qubit定量和2％琼脂糖凝胶电泳检测。
1、配制富集体系。富集体系为100μL，由48μL待测孕妇血浆游离DNA文库(含1μg待测孕妇cfDNA)、12μL富集缓冲液、5μL探针组和35μL杂交缓冲液(65℃预热)组成。
2、完成步骤1后，取所述富集体系，置于PCR仪进行过夜杂交富集(杂交时间至少16h)，得到富集产物。
反应程序：95℃7min，65℃16h以上。
3、链霉亲和素包被磁珠的溶液的获得(链霉亲和素包被磁珠在保存液中保存，进行这一步的目的为去除保存液)
(1)取低吸附离心管，加入50μL
Figure BDA0003690398190000141
M-280链霉亲和素磁珠，然后置于磁力架1min。
(2)完成步骤(1)后，弃上清，加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠，然后短暂离心。
(3)完成步骤(2)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清，然后加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠。
(4)完成步骤(3)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清，然后加入50μL文库结合缓冲液，重悬磁珠，得到链霉亲和素包被磁珠的溶液。
4、共孵育捕获
(1)完成步骤3后，取所述低吸附离心管，加入步骤2获得的全部的富集产物，涡旋震荡5sec，然后置于室温的旋转混匀仪上1h。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架1min，弃上清。
5、洗涤和PCR扩增
(1)完成步骤4后，取所述低吸附离心管，加入500μL漂洗缓冲液1，混匀，置于旋转混匀仪旋转15min。
(2)完成步骤(1)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。
(3)完成步骤(2)后，取所述低吸附离心管，加入500μL漂洗缓冲液2(已65℃预热)，65℃孵育10min。
(4)完成步骤(3)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置2min，弃上清。
(5)重复步骤(4)两次。
进行上述步骤的目的为将没有与
Figure BDA0003690398190000151
M-280链霉亲和素磁珠结合的探针洗掉。
(6)完成步骤(5)后，取所述低吸附离心管，加入30μL文库富集洗脱液，重悬磁珠，置于室温旋转混匀仪10-20min。
(7)完成步骤(6)后，取所述低吸附离心管，置于磁力架上静置1min。
(8)完成步骤(7)后，将上清转移至离心管，然后加入40μL中和缓冲液和30μL PCR反应液，移液器吸打混匀后置于PCR仪进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR程序：98℃30sec；98℃30sec，65℃30sec，72℃30sec，15个循环；72℃5min，4℃∞。
6、纯化
完成步骤5后，取所述PCR扩增产物，利用AgencourtAMPure XP核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter公司的产品，货号为A63881)纯化，得到文库扩增纯化产物。
该文库扩增纯化产物即为待测孕妇cfDNA靶序列捕获文库。
高通量测序及数据分析
1、将得到的靶序列捕获文库甲通过Nextseq500、X Ten、NovaSeq等二代测序平台进行高通量测序，得到测序原始数据。
2、完成步骤1后，将测序原始数据用cutadapt软件(网址为：https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)切除接头序列、低质量碱基(质量值小于10)，过滤长度小于80bp序列，然后通过bwa软件MEM算法(网址为：http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对到参考基因组hg19的相应位置。
3、完成步骤2后，用GATK软件(网址为：https://software.broadinstitute.org/gatk/)去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列，然后分析数据，得到单核苷酸变异(singlenucleotide variation，SNV)和插入缺失突变(inserts and deletions，INDEL)的相关信息。
4、利用ANNOVAR软件(网址为：http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)对步骤3得到的相关信息中所有的SNP和INDEL进行注释，然后筛选掉正常人数据库(包括千人基因组计划(网址为：http://www.1000genomes.or/)、Exome Variant Server(网址为：http://evs.gs.washington.edu/EVS/)和EXAC(网址为：http://exac.broadinstitute.org/))中频率小于0.05的突变位点，错义突变使用SIFT软件(网址为：http://sift.jcvi.org/)、PolyPhen-2软件(网址为：http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、MutationTaster软件(网址为：http://www.mutationtaster.org/)和GERP++软件(网址为：http://mendel.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)进行致病性预测和保守性预测，剪切位点的改变用SPIDEX软件(网址为：http://www.deepgenomics.com/spidex)分析其致病性，将数据输出为Excel文件，命名为待测孕妇cfDNA SNP Indel。
5、获得待测孕妇携带关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度。
对HGMD数据库(人类基因突变数据库)报道的位点进行注释，然后根据筛选原则(筛选原则：pathogenic likely-pathogenic且是大突变(frameshift stopgainstoplosssplicing)且tag＝DM)筛选，获得1138个致病突变位点；如果待测孕妇SNP Indel含有1138致病突变位点中的任何一个点突变，如果待测孕妇SNP Indel含有1138致病突变位点中的任何一个点突变，则待测胎儿携带该突变位点。获得待测胎儿关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度。
判断胎儿13号染色体、18号染色体、21号染色体和性染色体是否为非整倍体
将待测孕妇游离DNA数据根据设计探针的区域以及基因组长度范围，从原始bam文件中提取非捕获区域bam文件，计算目标染色体(第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体)的reads比例的平均值(Mean)和标准方差(SD:StandradDeviation)。
参考数据库的建立
将待测者游离血浆经前述方法制备血浆游离DNA文库。从待测者血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据计算目标染色体(第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体)的reads比例的平均值(Mean)和标准方差(SD:StandradDeviation)。
待测者共450名，分别为400名正常孕妇(即分娩健康胎儿的健康孕妇)和50名男性。
450名待测者的数据共同组成参考数据库。
50名男性待测者的数据共同组成正常男性数据库。
400名正常孕妇中分娩出女胎儿的待测者的数据共同组成女胎儿数据库。
400名正常孕妇中分娩出男胎儿的待测者的数据共同组成男胎儿数据库。
参考数据库中目标染色体(第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体)非捕获区域reads比例的平均值(Mean)和标准方差(SD:Standrad Deviation)的值见表5。
表5
Figure BDA0003690398190000171
Figure BDA0003690398190000181
按照下述公式计算待测孕妇目标常染色体Z-score；
Figure BDA0003690398190000182
ChrNZ-score for test sample：待测孕妇目标常染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇目标常染色体非捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：参考数据库中目标常染色体非捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：参考数据库中目标常染色体非捕获区域reads比例的标准方差。
然后进行如下判断：如果待测孕妇的目标常染色体Z-score≥3，则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的目标常染色体Z-score＜3，则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目正常；如果待测孕妇的目标染色体Z-score≤-3，则待测孕妇胎儿的目标常染色体数目减少。
目标常染色体数目增加或目标常染色体数目减少均会造成染色体非整倍体疾病。例如，第13号染色体数目增加会造成13-三体综合征，第18号染色体数目增加会造成18-三体综合征，第21号染色体数目增加会造成21-三体综合征(即唐氏综合征)。
判断待测孕妇胎儿的性染色体数目是增加、减少还是正常。
具体步骤如下：
(1)先根据待测孕妇Y染色体非捕获区域的reads比例判断胎儿性别：若待测孕妇Y染色体非捕获区域reads比例＞0.001，则胎儿性别为男性；若待测孕妇Y染色体非捕获区域reads比例≤0.001，则胎儿性别为女性。
(2)如果胎儿为女性，先按照下述公式计算待测孕妇的X染色体Z-score；
Figure BDA0003690398190000183
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇X染色体非捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体非捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体非捕获区域reads比例的标准方差。
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3，则待测孕妇胎儿的X染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测孕妇胎儿的X染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测孕妇胎儿的X染色体数目减少。
胎儿性别为女性时，X染色体数目增加或X染色体数目减少均会造成染色体非整倍体疾病。X染色体数目增加会造成超雌综合症。X染色体数目减少会造成特纳综合征。
(3)如果胎儿为男性，首先按照如下步骤(a)-(c)获得待测孕妇的X染色体Z-score：
(a)按照下述公式计算正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值：
Figure BDA0003690398190000191
C：正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrXMDB：正常男性数据库中X染色体非捕获区域reads比例的平均值；
％ChrYMDB：正常男性数据库中Y染色体非捕获区域reads比例的平均值。
经计算，正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值为14.1356。
(b)按照下述公式计算经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例：
Figure BDA0003690398190000192
％ChrX为经转换后待测孕妇X染色体非捕获区域的reads比例；
％ChrXsample为待测孕妇X染色体非捕获区域的reads比例；
C为正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrYsample为待测孕妇Y染色体非捕获区域的reads比例。
(c)按照下述公式计算待测孕妇X染色体Z-score：
Figure BDA0003690398190000193
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrX：经转换后待测孕妇X染色体非捕获区域的reads比例；
Mean ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体非捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体非捕获区域reads比例的标准方差。
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体非捕获区域reads比例＜0.000426，则待测孕妇胎儿的X染色体数目增加、Y染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例≥0.000426，则待测孕妇胎儿的Y染色体数目增加、X染色体数目正常；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测孕妇胎儿的X染色体和Y染色体数目均正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测孕妇胎儿的X染色体数目减少，Y染色体数目正常。
400名正常孕妇中分娩出男胎儿的Y染色体非捕获区域reads比例的平均值为0.000426。
胎儿性别为男性时，X染色体数目增加或Y染色体数目增加均会造成染色体非整倍体疾病。X染色体数目增加会造成克兰费尔特综合征。Y染色体数目增加会造成超雄综合征。
实施例3无创产前一体化检测待测胎儿是否有常见显性基因突变或染色体非整倍体
取待检样本，按照实施例2中的方法进行检测。检测结果见表6，且与羊水结果一致。样本1、2、4、5、7、11、13、14、15、17、19、20等样本胎儿结果正常。
样本3，待测数据中基因RAF1的七号外显子编码区770位胞嘧啶突变为胸腺嘧啶(c.770C>T)，突变频率为0.09，即胎儿携带该位点突变。
样本6，待检测数据显示胎儿性别为男，x染色体z-score大于3，因此胎儿多一条Y染色体。
样本8，待检测数据显示胎儿性别为女，x染色体z-score大于3，因此胎儿多一条X染色体。
样本9，待检测数据18号染色体z-score大于3，因此胎儿18号染色体多一条。
样本10，待测数据中基因SOS1的10号外显子编码区1654位腺嘌呤突变为鸟嘌呤(cc.1654A>G)，突变频率为0.1165，即胎儿携带该位点突变。
样本12，待检测数据21号染色体z-score大于3，因此胎儿21号染色体多一条。
样本16，待检测数据21号染色体z-score大于3，因此胎儿21号染色体多一条。
样本18，待检测数据显示胎儿性别为男，x染色体z-score大于3，因此胎儿多一条X染色体。
表6无创产前一体化检测待测胎儿常见显性基因突变或染色体非整倍体检测结果
Figure BDA0003690398190000211
Figure BDA0003690398190000221
Figure BDA0003690398190000231
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，包括探针组；所述探针组包括特异性探针；每个特异性探针包括DNA片段1；所述DNA片段1为单基因遗传病对应的突变基因的一部分；
所述探针组的设计方法包括：获取单基因遗传病涉及的突变基因的外显子序列，并前后延伸50bp，延伸后不足50bp的扩展至50bp，提取每个区域的参考序列，去掉重复区域的序列，从第一个碱基开始截取78bp的序列做探针，再一次往后移动n个碱基，截取78bp的序列做探针，直到最后一个78bp；
所述单基因遗传病涉及的突变基因包括：COL1A1基因、HRAS基因、MECP2基因、SMC1A基因、MAP2K2基因、STAT3基因、KCNQ2基因、SPTB基因、RIT1基因、NIPBL基因、HDAC8基因、STXBP1基因、ATP1A3基因、TSC2基因、KRAS基因、FGFR2基因、CBL基因、COL2A1基因、RAD21基因、COL4A5基因、ELANE基因、NF1基因、CHD7基因、PHEX基因、BRAF基因、COL1A2基因、PKD1基因、KIF11基因、SOS2基因、ANK1基因、MAP2K1基因、PRRT2基因、SYNGAP1基因、SMC3基因、FGFR3基因、SCN1A基因、NSD1基因、TSC1基因、RB1基因、SHOC2基因、CDKL5基因、SOS1基因、PTPN11基因、JAG1基因、NRAS基因、WT1基因、RAF1基因、FBN1基因、PCDH19基因和SCN2A基因。
2.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，所述探针组中的每个特异性探针从5’末端到3’末端由引物1、所述DNA片段1和引物2组成；
所述引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述引物1和/或所述引物2具有生物素标记。
3.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括引物3、引物4、引物5和引物6中的至少一种；
所述引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述引物5的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述引物6的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括接头序列组；
所述接头序列组中的序列1的5’-3’端依次为通用片段1、随机序列和防污标签序列；
所述接头序列组中的序列2的5’-3’端依次为防污标签序列和通用片段2；
所述接头序列组中的序列1的防污标签序列的3’端的最后一个碱基与序列1的通用片段1的5’端第一个碱基互补；
所述随机序列为14个碱基的随机序列；所述防污标签序列为13-14个碱基的随机序列；
所述通用片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
所述通用片段2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求4所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，所述接头序列组为以下接头序列组中的一组或多组；
接头1-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNGCAGATCAGCGTA*T 接头1-2 P-TACGCTGATCTGCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA 接头2-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNATGTCTCACACGAG*T 接头2-2 P-CTCGTGTGAGACATAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA 接头3-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCTAGTCTAGCGTC*T 接头3-2 P-GACGCTAGACTAGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA 接头4-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCGTGAGATGTAGCA*T 接头4-2 P-TGCTACATCTCACGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA 接头5-1 CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNNNCATACTGAGTGCA*T 接头5-2 P-TGCACTCAGTATGAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
；
所述接头序列组中的N为A、T、C、G中的任一一个，所述P表示磷酸化修饰；所述*T表示碱基T进行硫代修饰。
6.根据权利要求1所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括记载有判断标准甲和乙和/或丙的载体；
所述判断标准甲用于判断待测胎儿是否有50种遗传病单基因突变；
所述判断标准甲如下：
获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度，若待测孕妇SNP Indel含有1138个致病突变位点中的任何一个点突变，则待测胎儿携带该突变位点；
所述获得待测孕妇关于50种单基因遗传病突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度；步骤如下：
(1)制备待测孕妇血浆游离DNA文库；制备待测孕妇血浆游离DNA文库的接头为权利要求4或5中所述接头组；
(2)完成步骤(1)后，将所述待测孕妇血浆游离DNA文库与权利要求1至3中任一探针组进行杂交，得到杂交产物；
(3)完成步骤(2)后，从所述杂交产物中收集靶序列，获得靶序列捕获文库；
(4)将步骤(3)得到的靶序列捕获文库进行高通量测序，得到测序原始数据；
(5)将步骤(4)得到的测序原始数据切除接头序列、低质量碱基，过滤，然后比对到参考基因组hg19的相应位置；
(6)完成步骤(5)后，去除由于PCR扩增偏好引起的重复序列，得到待测孕妇的数据；然后分析，得到SNP和INDEL的相关信息；
(7)对步骤(6)得到的信息进行注释，然后筛选，得到待测孕妇的SNP Indel；
(8)对HGMD数据库报道的位点进行注释，然后筛选获得1138个致病突变位点；如果待测孕妇的SNP Indel含有1138致病突变位点中的任何一个点突变，则待测胎儿携带相应突变基因的突变位点；否则待测胎儿不携带相应基因突变位点；根据待测孕妇携带的突变基因的突变位点，绘制目标基因缺失和重复分析图，获得待测胎儿关于所述单基因遗传病涉及的突变基因的突变位点的类型、突变频率和测序深度；
所述判断标准乙如下：
所述判断标准乙即判断待测胎儿的目标常染色体数目是增加、减少还是正常；所述目标常染色体为13号染色体、18号染色体或21号染色体；
所述判断标准乙可如下：从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，按照下式计算待测孕妇目标常染色体Z-score；
Figure FDA0003690398180000041
ChrNZ-score for test sample：待测孕妇目标常染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇目标常染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：参考数据库中目标常染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的目标常染色体Z-score≥3，则待测胎儿的目标常染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的目标常染色体Z-score＜3，则待测胎儿的目标常染色体数目正常；如果待测孕妇的目标染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的目标常染色体数目减少；
如果目标常染色体数目增加或目标常染色体数目减少，则待测胎儿目标常染色体为非整倍体；如果目标常染色体数目正常，则待测胎儿目标常染色体为整倍体；
所述判断标准丙即判断待测胎儿的性染色体数目是增加、减少还是正常；
所述判断标准丙如下：
(1)从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，根据待测孕妇Y染色体捕获区域的reads比例判断待测胎儿性别：若待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例＞0.001，则待测胎儿性别为男性；若待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例≤0.001，则待测胎儿性别为女性；
(2)如果待测胎儿为女性，先按照下式计算待测孕妇的X染色体Z-score；
Figure FDA0003690398180000042
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrNsample：待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrN reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3，则待测胎儿的X染色体数目增加；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测胎儿的X染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的X染色体数目减少；
待测胎儿性别为女性时，如果X染色体数目增加或X染色体数目减少，则待测胎儿X染色体为非整倍体；如果X染色体数目正常，则待测胎儿X染色体为整倍体；
(3)如果待测胎儿为男性，首先按照如下步骤(a)-(c)获得待测孕妇的X染色体Z-score：
(a)按照下式计算正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值：
Figure FDA0003690398180000051
C：正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrXMDB：正常男性数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
％ChrYMDB：正常男性数据库中Y染色体捕获区域reads比例的平均值；
(b)按照下式计算经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例：
Figure FDA0003690398180000052
％ChrX为经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
％ChrXsample为待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
C为正常男性数据库X染色体与Y染色体比值均值；
％ChrYsample为待测孕妇Y染色体捕获区域的reads比例；
(c)按照下式计算待测孕妇X染色体Z-score：
Figure FDA0003690398180000053
ChrXZ-score for test sample：待测孕妇X染色体z-score；
％ChrX：经转换后待测孕妇X染色体捕获区域的reads比例；
Mean ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的平均值；
S.D.％ChrX reference：女胎儿数据库中X染色体捕获区域reads比例的标准方差；
然后进行如下判断：如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体非捕获区域reads比例＜正常孕妇中分娩出男胎儿的Y染色体非捕获区域reads比例的平均值，则待测胎儿的X染色体数目增加、Y染色体数目正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≥3且待测孕妇Y染色体捕获区域reads比例≥正常孕妇中分娩出男胎儿的Y染色体非捕获区域reads比例的平均值，则待测胎儿的Y染色体数目增加、X染色体数目正常；如果-3＜待测孕妇的X染色体Z-score＜3，则待测胎儿的X染色体和Y染色体数目均正常；如果待测孕妇的X染色体Z-score≤-3，则待测胎儿的X染色体数目减少，Y染色体数目正常；
胎儿性别为男性时，如果X染色体数目增加或X染色体数目减少、Y染色体数目正常，则待测胎儿X染色体为非整倍体；如果Y染色体数目增加、X染色体数目正常，则待测胎儿Y染色体为非整倍体；如果X染色体和Y染色体数目均正常，则待测胎儿X染色体和Y染色体均为整倍体。
7.权利要求1或2所述探针组。
8.权利要求1-6任一所述试剂盒和权利要求7所述探针组的应用，包括以下至少一项：
A.在制备待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的检测试剂中的应用；
B.在制备待测胎儿携带的权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因是正常、杂合或纯合检测试剂中的应用；
C.在制备待测胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常的检测试剂中的应用。
9.一种用于检测染色体非整倍体及单基因突变的非疾病诊断方法，其特征在于，包括：
(1)制备待测孕妇血浆游离DNA文库；
(2)将所述待测孕妇血浆游离DNA文库与权利要求1所述探针组中的一组或多组探针进行杂交，得杂交产物；
(3)从所述杂交产物中收集靶序列，获得待测孕妇血浆游离DNA捕获文库；
(4)将所述待测孕妇血浆游离DNA捕获文库进行测序，判断待测孕妇是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因，并获得所述待测孕妇关于所述单基因遗传病涉及的突变基因的位点类型、突变频率和测序深度；判断待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的情况；
(5)从所述待测孕妇血浆游离DNA文库中的数据中提取非目标区域的数据，计算第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体的reads比例的平均值和标准方差；并根据所述平均值和标准方差判断待测胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常。
10.根据权利要求9所述用于检测染色体非整倍体及单基因突变的非疾病诊断方法，其特征在于，所述判断待测胎儿是否携带权利要求1所述单基因遗传病涉及的突变基因的情况，按照权利要求6所述判断标准甲进行判断；
所述根据所述平均值和标准方差判断待测胎儿的第13号染色体、第18号染色体、第21号染色体、X染色体或Y染色体数目是增加、减少或正常，按照权利要求6所述判断标准乙或丙进行判断。
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