JP2002532568A - 医薬／細胞と共に注入可能なヒアルロン酸誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つの哺乳動物の細胞および／または少なくとも１つの薬理学的にもしくは生物学的に活性な物質および／または微粒子（例えば、ヒアルロン酸誘導体の繊維、ミクロスフェアまたはスポンジの断片）と組み合わせた、少なくとも１つのヒアルロン酸ベンジルエステルまたは自己架橋誘導体を含有する、注入可能な生体親和性で且つ生分解性の組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、少なくとも１つの哺乳動物の細胞および／または少なくとも１つの
薬理学的にもしくは生物学的に活性な物質および／または微粒子（例えば、ヒア
ルロン酸誘導体の繊維、顆粒またはスポンジの断片）と組み合わせた、少なくと
も１つのヒアルロン酸ベンジルエステルもしくは自己架橋誘導体を含有する、注
入可能な生体親和性で且つ生分解性の組成物に関する。 （背景技術）

【０００２】 注入可能な組成物および該組成物のための担体については当該分野で良く知ら
れているが、生体親和性であり、生分解性であり、活性成分に保護的側面を与え
、活性成分のバイオアベイラビリティーを増大させるような注入可能な組成物に
対する要求がなお存在する。例えば、関節軟骨の修復の分野において、このこと
は重要である。

【０００３】 関節軟骨の修復の目的は、関節の表面を修復し、痛みを軽減し、そして組織の
更なる悪化を防止することである。今日まで、軟骨の欠損の処置に対する多数の
方法が使用されているが、それら方法の各々が欠点を有している（Tom Minasら
による「Current Concepts in the treatment of Articular Cartilage Defects
」, Orthopedics, 1997年6月, 20巻, 6号）。

【０００４】 骨髄刺激の技法は、剥離または穿孔の手法によって軟骨の下の骨組織に到達し
、その結果多能性幹細胞を含有する繊維素凝塊の生成を刺激することからなる。
該塊は引き続いて分化し、形を作り、繊維軟骨修復組織を形成する。しかしなが
ら、この組織は健康で、耐久性のある関節軟骨の機械的な性質または生理学的お
よび構造的な特性を有しない。

【０００５】 別の技法は、欠損部位中に例えば肋骨の軟骨から採取した骨膜の組織および軟
骨周囲の組織の一片を移植することを含む。該処置は硝子軟骨の発達の引き金と
なるが、修復した組織は周囲の健康な組織にあまり同化されず、移植された組織
は引き続いて骨化する。

【０００６】 自己（autologous）および同種の骨軟骨の移植片は侵襲性であり、複雑な外科
技法を要し、例えばウイルス感染などの危険をもたらす。

【０００７】 関節軟骨を再構築しようという他の試みは、それらの中に分散している同種の
軟骨細胞を有する合成基質または軟骨細胞の増殖を刺激することができる増殖因
子を移植することからなる。これらの方法は、軟骨組織をインビトロで増殖し、
次いで欠損部位に移植することを要する。最も一般的に用いられている合成基質
は、コラーゲンゲル、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸お
よびその共重合体の基質である。それら基質を使用することの主な欠点は、移植
された物質に対する免疫応答によって示される。軟骨細胞は、寒天、ヒアルロン
酸、繊維接着物質、コラーゲンおよびアルギン酸塩によって構築されたゲル中で
培養されることは知られている。しかしながら、これらのゲル中での培養は、そ
れらが一旦移植された部位に接着し、軟骨構造の再構築が可能となるのに必要な
機械的な安定性を与えない。その上、繊維などの基質中での軟骨細胞の培養物は
分化して繊維芽細胞と同じように見える細胞となる。最後に、寒天などの物質に
よって構築されたゲルは軟骨細胞の再分化を誘発するが、この化合物の使用はヒ
トの体内への適用については承認されていない。

【０００８】 関節軟骨の欠損は、支持基質なしで、単離された軟骨の懸濁液を用いて処置さ
れてきた。しかしながら、軟骨細胞はその生存能力を失い、および／または欠損
部位に留まらず、そしてそれらは繊維芽軟骨または繊維組織中に埋まった軟骨島
を形成すると考えられている（米国特許第5,723,331号）。

【０００９】 先行技術分野のこれらの欠点は、本発明により注入可能な組成物、例えば少な
くとも１つのヒアルロン酸ベンジルエステル誘導体または自己架橋誘導体を含有
するゲル中に分散した軟骨細胞または骨髄幹細胞を含有する組成物を提供するこ
とによって解決される。

【００１０】 様々な証拠が、注入目的での細胞懸濁液の使用、特に慢性的な潰瘍および火傷
の処置のためのケラチノサイトの使用に関する最近の文献（要約を参照）中に現
われている。SilvermanらによるPlast. Reconstr. Surg., 1999年6月, 103(7) 1
809-18（フィブリノーゲンおよび軟骨細胞の組み合わせ）；AtalaらによるJ. Ur
ol., 1993年8月, 150(2 ptd 2) p.745-7（軟骨細胞−アルギン酸塩ゲル）を参照
のこと。ケラチノサイトの培養物は、文献中で引用されている多数の方法（化学
的に一定の培地などと一緒の胎児ウシ血清存在下または不存在下）に従って増殖
させることができる。次いで、これらの培養物をそれらを様々な培地中に懸濁す
る宿主ベッド中に運ぶが、該培地中で最も良く引用される培地の１つは自家移植
由来および商業的由来の両方の繊維である。それらの方法を使用するのにはかな
りの不利益がある。先ず、細胞懸濁液を使用直前に調製しなければならず、そし
て細胞をそれらの利用のために使用する組成物とは異なる組成物を有する培地中
で保存すべきである。一方、特にこれらが自家移植でない場合にはビヒクルとし
て使用する繊維接着物質についての別の問題が生じ得る。

【００１１】 これらの問題は、本発明により様々な理由でヒアルロン酸をベースとする培地
中に上皮細胞（例えば、ケラチノサイト）または他の胎児由来の誘導体を分散す
ることによって解決される。製剤は完全に生体親和性であり、且つ生物学的に安
全であり、細胞生存率は完全な液体媒質の細胞懸濁液の場合よりも高い。特にこ
の最後の点は重要である。患者もしくは利用現場が成分の製造現場と遠く離れて
いる場合には、安全な輸送が問題となる。産物は輸送の間、必ず振り混ぜられ、
細胞は損傷する。この問題は解決する必要がある。しかしながら、細胞を本発明
による高い粘性の媒質中に分散すれば、宿主の媒質はクッションとして作用する
のでその問題は解決される。細胞懸濁液を処置するべき表面上に効率良く広げる
ことができるという可能性から別の利点が生するが、その利点は現在使用されて
いる方法（例えば、繊維接着物質をベースとするスプレーを含む）よりも簡単な
適用方法であるということである。

【００１２】 本発明の別の使用は、培地中に細胞を懸濁し、次いでそれらを注入することに
よって使用するという可能性に関する。他の制限されない利用法は、審美的な外
科目的でのもしくは組織欠損の充填物としての繊維芽細胞（自己）の投与、乳房
もしくは他の柔らかい身体部分の再構築などの利用のために柔らかい組織を増加
するための含脂肪細胞（自己、異種または同種）の製造、および尿失禁の処置の
ための尿道細胞（例えば、繊維芽細胞または軟骨細胞）の注入である。これら全
ての例において、ヒアルロン酸をベースとする物質は、注入のためのビヒクルと
して作用する機能および輸送の間に細胞製剤を保護する機能という二重の機能を
有する。

【００１３】 知られているとおり、ヒアルロン酸は多数の生物学的なプロセス（組織の水和
作用、プロテオグリカンの組織化、細胞の分化、増殖および血管形成）において
重要な役割を果たしている（J. AignerらによるL/ Biomed. Master. Res. 1998,
42, 172-181）。ヒアルロン酸誘導体は、該グリコサミノグリカンの全ての性質
を保ち、様々な形態に加工することが可能であって、そして誘導の種類およびそ
の割合に応じて変わる溶解度および分解時間を有するという利点がある（欧州特
許0216453B1）。その上、ヒアルロン酸誘導体は該ヒアルロン酸の構造に特定の
分子を挿入することにより新しい性質を得る。例えば、ヒアルロン酸の硫酸誘導
体は、抗凝固性を有し、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ95／25751号）に対して耐性で
ある。該組成物は生物体による免疫応答を引き起こさず、それらが含有する軟骨
細胞はそれらの表現型を保っていることが実証された。ヒアルロン酸誘導体は細
胞毒性ではなく、軟骨組織の発生に必要な細胞外基質の成分を合成することを可
能とする。その上、該誘導体は細胞に対する単なるビヒクルではなく、それらの
増殖を刺激することが可能であり、そしてそれらが分解するにつれて三次元構造
へと細胞の発生を可能とする。移植した細胞の増殖を刺激するのに加えて、ヒア
ルロン酸誘導体は組織の再生を刺激する哺乳動物の胎児の細胞外基質と同じよう
な細胞外環境を作ることができる。その上、ヒアルロン酸誘導体が分解するにつ
れてオリゴマーを放出し、それらは軟骨細胞の始原細胞のレクルートメントを刺
激し、且つ軟骨細胞のセルラインの発生を有利にする。

【００１４】 ヒアルロン酸誘導体は、幹細胞をインビトロで増殖するために不織布、スポン
ジ、顆粒、ミクロスフェア、チューブおよびガーゼの形態で（ＷＯ97／18842号
合）、およびインビトロでの繊維芽細胞およびケラチノサイトの増殖のために穿
孔した膜を有する不織布の形態で（ＷＯ96／33750号）、および軟骨細胞の増殖
のために不織布の形態で（J. AignerらによるL/ Biomad. Mater. Res., 1998, 4
2, 172-181）、三次元的な固体のスカホールドとして使用することができる。し
かしながら、今日までヒアルロン酸誘導体および哺乳動物細胞（例えば、軟骨細
胞）を含有する注入可能なゲルを製造した者はなかった。注入可能なゲルは外科
医が穏やかな侵襲性の外科技法（例えば、内視鏡による外科）を使用することを
可能にし、組成物中に取りこまれた細胞が輸送に耐え、不規則的な病変部位を完
全に満たすことを可能にする。

【００１５】 固体の担体上に細胞を播種するという方法とは違って、本発明は細胞を本発明
の記載に従って製造したゲル形態の組成物中に三次元的に均一に分散する。該組
成物は再生した組織を欠損の周囲にある軟骨組織に完全に同化することを可能と
する。本発明に記載の組成物は、軟骨欠損の表面および深部の両方の処置につい
て有利に使用することが可能である。表面の欠損は軟骨組織のみに作用した欠損
であり、一方で深部の欠損は軟骨の下の骨組織および軟骨の下の骨組織と軟骨の
間の石灰化した軟骨の層をも含む欠損である。

【００１６】 （発明の詳細な記載） 本発明は、少なくとも１つのヒアルロン酸ベンジルエステル誘導体および／ま
たは自己架橋誘導体、少なくとも１つの薬理学的におよび／または生物学的に活
性な物質（例えば、増殖因子）および／または少なくとも１つの哺乳動物細胞（
例えば、軟骨原細胞）を含有する注入可能な生体親和性で且つ生分解性の組成物
に関する。

【００１７】 １．ヒアルロン酸成分 従って、本発明はヒアルロン酸ベンジルエステルまたはヒアルロン酸の自己架
橋誘導体をベースとする注入可能な生体親和性の組成物について記載するが、そ
れらは単独でまたはそれらの互いの混合物で使用し、それらは高い生体親和性を
特徴とする。該物質はまた完全に生分解性であり、適用部位から取り除く必要が
なく、従って二次的な外科操作は避けられる。ゲル形態で製造する場合には、自
己架橋誘導体は修飾していない高分子よりも十分に大きな粘性を有し、且つ分解
時間を変えることができる物質として存在する。

【００１８】 用語「ヒアルロン酸］（これは以下「ＨＡ」とも称する）は、文献中でＤ−グ
ルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基によって構成される様々
な分子量を有する酸性の多糖類を意味するのに使用されており、このものは細胞
表面、脊椎動物の関節組織の塩基性細胞外物質、関節液、眼のガラス液、ヒトの
さい帯の組織および雄鶏の冠に存在する。

【００１９】 ヒアルロン酸は、生体中で重要な役割を果たしており、第１に多数の組織（例
えば、皮膚、腱、筋肉および軟骨）の細胞の機械的な支持物として役割を果たし
ており、従ってそれは細胞外基質の主成分である。ヒアルロン酸は生物学的なプ
ロセスにおける他の機能（例えば、組織の水和作用、潤滑、細胞の移動、細胞の
機能および分化）をも果たしている（例えば、A. BalazsらによるCosmetics & T
oiletries, 5/84号, 8−17頁を参照）。ヒアルロン酸は上記の天然の組織（例え
ば、雄鶏の冠）またはある細菌からも抽出し得る。今日、ヒアルロン酸は微生物
学的な方法によっても製造可能である。抽出によって得られる全てのヒアルロン
酸の分子量は８百万〜１千３百万の範囲にある。しかしながら、該多糖類の分子
鎖は多数の物理学的もしくは化学的要因（例えば、機械的な影響）の影響下で、
または放射剤、加水分解剤、酸化剤もしくは酵素剤の影響下で全く容易に分解し
得る。このため、もとの抽出物の通常の精製法においてはよく、低分子量の分解
した画分を得る（Balazらによる上記の引用文献を参照）。ヒアルロン酸、その
分子画分および個々の塩は薬物として使用されており、それらの使用は化粧品の
分野でも提案されている（例えば、Balazによる上記の文献およびフランス特許
第2478468号を参照のこと）。

【００２０】 用語「ヒアルロン酸」は、不適当な意味で用いられているが、上記の通り、様
々な分子量を有するＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残
基の改変を有する多糖類の全ての群またはその分解した画分を意味し、そこで複
数形の「ヒアルロン酸類」がより適当と思われるかもしれないが、本明細書にお
ける記載では、様々な形態（例えば、分子画分を含む）のヒアルロン酸を意味す
るのに単数形を使用し続ける。略号「ＨＡ」もまた、このひとまとめにした用語
を記載するのに使用する。

【００２１】 本発明は、生物学的な／薬理学的な細胞または分子の適当な担体として作用す
るヒアルロン酸誘導体を含有する、注入可能な組成物について記載する。ヒアル
ロン酸誘導体は、当該分野でよく知られている他の生体適合物質／スカホールド
よりも特に適している。生物学的な由来のシステム（例えば、死体の無細胞物質
cadaveric acellular)）と比較して、ＨＡは供給源を限定されずに容易に入手す
ることができ、そしてあまり免疫原性でない（例えば、同種免疫のドナー組織）
利点を有する。加えて、ＨＡは感染性の疾患、特にウイルスによる疾患（例えば
、ＨＶ、肝炎など）が交差混入する危険はない。より精製した生物学的な由来の
分子（例えば、コラーゲン、プロテオグリカンおよび繊維）または生体親和性の
高分子（例えば、ＰＬＬＡ／ＰＧＡ、ＰＴＦＥ）と比較して、ＨＡは異なる好ま
しい特性を有する。まず第１に、ＨＡは通常のタンパク質化合物もしくはタンパ
ク質をベースとする化合物よりも免疫原反応が小さい多糖類である。第２に、Ｈ
Ａは分子構造の修飾なしに哺乳動物種において一般的に見出され、従って非常に
よく知られており、そしてヒトの身体に耐えられる。第３に、ＨＡは成人のヒト
の場合と同様に発生においても、多数の生物学的効果を有し、このために該分子
は各修復／再生のプロセスにおいて基礎となる。最後に、更なる好ましい利点は
、ＨＡがヒトの身体のほとんど全ての組織／器官に存在し、そのものは細胞外基
質の主成分であることである。この事実と単純な高分子の組成物であることとを
併せると、ＨＡをを多数のタンパク質の細胞外基質分子（例えばコラーゲン）（
それらは組織／器官に特異的であることが非常に多い）とは異なったものとする
。この最後の点は、ヒトの身体の異なるコンパートメントに使用する一般的で且
つ生体親和性の運搬ビヒクルを設計する際に重要である。

【００２２】 ２．ベンジルエステル誘導体 本発明の第１に好ましい物質はヒアルロン酸のベンジルエステルをベースとす
るものであり、特にＨＡカルボキシ基の５０〜７５％がベンジル残基によってエ
ステル化された５０〜７５％のエステルである。ＨＡカルボキシ基の５０〜７５
％がベンジル残基によってエステル化されたベンジルエステルは「部分エステル
」と呼ばれる。その理由は、カルボキシ基の一部だけがエステル化され、残りの
カルボキシ基が遊離であるかまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（例
えば、ナトリウム、カルシウムまたはカリウム）で塩化されているからである。

【００２３】 本発明の組成物はベンジルエステルが最も好ましく、このものは該ＨＡのカル
ボキシ基の５０％がエステル化されている。本発明に記載のヒアルロン酸のベン
ジルエステルは、カルボン酸のエステル化そのものについて知られる方法によっ
て製造することができ、例えば遊離のヒアルロン酸を触媒作用の物質（例えば、
強無機酸または酸性タイプのイオン交換樹脂）の存在下でアルコール（ベンジル
アルコール）を用いて処理することによって、または無機塩基もしくは有機塩基
の存在下、目的のアルコール残基を導入することができるエーテル化剤を用いて
処理することによって製造することができる。

【００２４】 しかしながら、ヒアルロン酸ベンジルエステルは、欧州特許第0216453号に記
載する特定の方法によって製造することが好ましい。この方法は、ヒアルロン酸
の四級アンモニウム塩をエーテル化剤を用いて（非プロトン有機溶媒中が好まし
い）処理することを含む。

【００２５】 ベンジルエステルの製造については、いかなる由来のヒアルロン酸（例えば、
上記の天然の出発物質（例えば、雄鶏の冠）から抽出した該酸）を使用すること
ができる。それら酸の製造については文献に記載されており、精製したヒアルロ
ン酸を使用することが好ましい。本発明によれば、有機物質の抽出によって直接
的に得られる内在性の酸の分子画分を含むヒアルロン酸を特に使用するが、該有
機物質はその分子量が、例えば分子量が１千３百万を有する内在性タンパク質の
約９０％〜８０％（Ｍ＝１１.７〜１０.４ミリオン）〜０.２％（Ｍ＝３０,００
０）の広範囲で変わり、５％〜０.２％が好ましい。該画分は文献中に記載する
様々な方法（例えば、加水分解剤、酸化剤、酵素剤または物理的な方法（例えば
、機械的な方法または放射線法））を用いて得ることができる。従って、初期の
（Primordial）抽出物はこれらと同じ精製法（例えば、Balazsらによる上記の「
Cosmetics & Toiletries」における記載を参照のこと）中に得られることが多い
。得られた分子画分の単離および精製は、よく知られている技術（例えば、分子
ろ過）によって行なう。

【００２６】 本発明に記載する使用に適した、精製したＨＡの１つの画分は、例えばBalazs
による小冊子「Healon-A guide to its use in Opthalmic Surgery」 D. Miller
& R. Stegmannら編, John Wiley & Sons, N. Y., 81983. 5頁により記載の、「
非炎症性の−ＮＩＦ−ＮａＨＡ」ヒアルロン酸ナトリウムとして知られているも
のである。

【００２７】 ベンジルエステルの出発物質として特に重要なものは、ヒアルロン酸から得る
ことができる２つの精製した画分であり、例えば「ヒアラスチン（Hyalastine）
」および「ヒアレクチン（Hyalectin）」として知られている雄鶏の冠から抽出
される画分である。ヒアラスチン画分は平均分子量が約５０,０００〜１００,０
００を有し、一方でヒアレクチン画分は平均分子量が約５００,０００〜約７３
０,０００の範囲である。これら２つの画分を合わせた画分も単離されており、
平均分子量が約２５０,０００〜約３５０,０００を有することを特徴とする。こ
の合わせた画分はある出発物質として入手可能な全ヒアルロン酸の８０％の収率
で得ることができ、一方でヒアレクチン画分は出発物質であるＨＡの３０％の収
率で得ることができ、ヒアラスチン画分は約５０％の収率で得ることができる。
これら画分の製造については、欧州特許第0138572号に記載されている。

【００２８】 以下の実施例は、ＨＡのベンジルエステルの製造法について記載する。 実施例１−ヒアルロン酸（ＨＹ）の５０％ベンジルエステル（エステル化された
カルボキシル基は５０％で塩化された（Ｎａ）カルボキシル基は５０％である）
の製造 単量体単位が２０モル当量に相当する分子量が１７０,０００であるＨＹテト
ラブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２
０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（１０モル当量）を加え、得られた溶液を３０
℃で１２時間保つ。

【００２９】 水（６２ｍＬ）および塩化ナトリウム（９ｇ）を含有する溶液を加え、得られ
た混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（３,５００ｍＬ）中にゆっくりと注ぐ
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過し、アセトン：水（５：１）（５００ｍＬ
）を用いて３回洗浄し、アセトンで３回洗浄し、最後に３０℃で８時間真空乾燥
する。

【００３０】 次いで、その生成物を１％塩化ナトリウムを含有する水（５５０ｍＬ）に溶解
し、その溶液を絶えず撹拌しながらアセトン（３,０００ｍＬ）にゆっくりと注
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過してアセトン／水（５：１）（５００ｍＬ
）で２回洗浄し、アセトン（５００ｍＬ）で３回洗浄し、最後に３０℃で２４時
間真空乾燥する。標題の部分ベンジルエステル化合物（８.６ｇ）を得る。エス
テル基の定量測定は、R. H. CundiffおよびP. C. MarkunasによるAnal. Chem. 3
3, 1028-1130 (1961) を用いて行なう。

【００３１】 実施例２−ヒアルロン酸（ＨＹ）の７５％ベンジルエステル（エステル化された
カルボキシル基は７５％で塩化された（Ｎａ）カルボキシル基は２５％である）
の製造 単量体単位が２０モル当量に相当する分子量が２５０,０００であるＨＹテト
ラブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２
０ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（２.５ｇ、１５モル当量）を加え、得られた
溶液を３０℃で１２時間保つ。

【００３２】 水（６２ｍＬ）および塩化ナトリウム（９ｇ）を含有する溶液を加え、得られ
た混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（３,５００ｍＬ）中にゆっくりと注ぐ
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過し、アセトン：水（５：１）（５００ｍＬ
）を用いて３回洗浄し、アセトンで３回洗浄し、最後に３０℃で８時間真空乾燥
する。

【００３３】 次いで、その生成物を１％塩化ナトリウムを含有する水（５５０ｍＬ）に溶解
し、その溶液を絶えず撹拌しながらアセトン（３,０００ｍＬ）にゆっくりと注
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過してアセトン／水（５：１）（５００ｍＬ
）で２回洗浄し、アセトン（５００ｍＬ）で３回洗浄し、最後に３０℃で２４時
間真空乾燥する。標題の部分ベンジルエステル化合物（９ｇ）を得る。エステル
基の定量測定は、R. H. CundiffおよびP. C. MarkunasによるAnal. Chem. 33, 1
028-1130 (1961) を用いて行なう。

【００３４】 実施例３−ヒアルロン酸（ＨＹ）の７５％エステル（エステル化されたカルボキ
シル基は７５％で塩化された（Ｎａ）カルボキシル基は２５５である）の製造 単量体単位が２０モル当量に相当する分子量が８０,０００であるＨＹテトラ
ブチルアンモニウム塩（１２.４ｇ）を２５℃でジメチルスルホキシド（６２０
ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（２.５ｇ、１５モル当量）を加え、得られた溶
液を３０℃で１２時間保つ。

【００３５】 水（６２ｍＬ）および塩化ナトリウム（９ｇ）を含有する溶液を加え、得られ
た混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（３,５００ｍＬ）中にゆっくりと注ぐ
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過し、アセトン：水（５：１）（５００ｍＬ
）を用いて３回洗浄し、アセトンで３回洗浄し、最後に３０℃で８時間真空乾燥
する。

【００３６】 次いで、その生成物を１％塩化ナトリウムを含有する水（５５０ｍＬ）に溶解
し、その溶液を絶えず撹拌しながらアセトン（３,０００ｍＬ）にゆっくりと注
ぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過してアセトン／水（５：１）（５００ｍＬ
）で２回洗浄し、アセトン（５００ｍＬ）で３回洗浄し、最後に３０℃で２４時
間真空乾燥する。標題の部分ベンジルエステル化合物（９ｇ）を得る。エステル
基の定量測定は、R. H. CundiffおよびP. C. MarkunasによるAnal. Chem. 33, 1
028-1130 (1961) を用いて行なう。

【００３７】 ３．自己（または分子間）架橋ヒアルロン酸誘導体（ＡＣＰ誘導体） 本発明の物質として用いる自己架橋ヒアルロン酸については、欧州特許第0341
745号に開示されている。これらの自己架橋誘導体とはヒアルロン酸の分子内エ
ステルまたは分子間エステルであって、一部のカルボキシ基が同一分子および／
または異なる分子のヒドロキシル基とエステル化してラクトンまたは分子間エス
テル結合を形成する。単分子または多分子の架橋結合の生成は上記の分子内エス
テル化の結果であるので、これら「内部」エステルは他のアルコールのＯＨ基に
よる干渉はなく、「自己架橋ヒアルロン酸」（「ＡＣＰ」とも呼ばれる）とも定
義され得る。形容詞「架橋した」とは、ヒアルロン酸分子のカルボキシとヒドロ
キシとの架橋結合を意味する。

【００３８】 自己架橋した生成物は特に部分的な内部エステルであって、「架橋結合」の割
合はヒアルロン酸のカルボキシ基数の３〜１５％以内で変わることが好ましい。
製造法において、ＨＡ分子のカルボキシ基はそれらの活性化を誘発することがで
きる物質を加えることによって活性化される。活性化反応によって得られる不安
定な中間体生成物は、触媒の添加後および／または上記の同一もしくは異なるヒ
アルロン酸分子のヒドロキシルとの内部エステル結合を形成するような温度まで
昇温させた後に、自然と分離する。所望する内部エステルの程度により、カルボ
キシ官能基の全てまたは一部を活性化する（該部分的な物については過剰量の活
性化物質を用いるか、または適当な用量法によって得られる）。

【００３９】 内部エステル基に変換するカルボキシ基は、カルボキシ基を含有するヒアルロ
ン酸、または好ましくは塩化したカルボキシ基（例えば、アルカリ金属もしくは
アルカリ土類金属などの金属塩が好ましい）を含有するＨＡおよび４級アンモニ
ウム塩を有する上記の全て（以下に記載するもの）を出発として活性化すること
ができる。しかしながら、有機塩基（例えば、アミン）との塩をも出発物質とし
て使用することができる。

【００４０】 遊離であるかもしくは塩化したカルボキシ基を活性化する方法そのものについ
ては特にペプチド合成において知られており、当業者はどの方法が最も適当であ
るか、特に出発物質を遊離な形態でまたは塩の形態で使用することが適当である
かどうかを容易に決めることができる。ペプチド合成法において活性化の方法そ
のものが知られており、本発明の製造法において有用な活性化法については、例
えばBodanszky, M.,らによるIn search of new methods in peptide synthesis,
Int. J. Peptide Proten Res. 25, 1985, 449-474およびGross, EらによるThe
Peptides, Analysis Synthesis, Biology, Academic Press., Inc. 1979, １巻,
２章に記載されている。該方法に従って、カルボキシル成分を活性化し、すな
わちカルボキシル成分を反応活性体に変換する。該活性化は典型的に、反応式：

【化１】 ［式中、Ｘは電子吸引基である］ に従って酸および活性化剤との間での反応を含む。従って、カルボン酸の最も活
性な誘導体は混合酸無水物であり、このものは広義には活性化剤としてアジ化水
素酸およびＨＣｌの混合酸無水物を考えることができる、酸アジドおよび酸クロ
リドを含む。加えて、カルボキシル成分の活性化は中間体である「活性化エステ
ル」の生成によって達成することができる。これら「活性化エステル」は様々な
種類をとりうるが、特に有用な「活性化エステル」とは、ジシクロヘキシルカル
ボジイミド、ｐ−ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、ペン
タクロロフェニルエステルおよびヒドロキシルアミンのＯ−アシル誘導体（特に
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル）を用いることによって製造される
エステルである。

【００４１】 これら多数の種類の活性化法の全ての方法が、本発明の架橋したＨＡの製造に
おいて有用である。その理由は、これらの全ての方法がカルボキシル基とヒドロ
キシ基と容易に反応する置換基を必ず形成するような活性化剤との反応を含み、
その結果本発明の生成物の特徴である内部エステル結合を容易に生成し、内部エ
ステルに変換されるカルボキシ官能基の数は活性化されたカルボキシ官能基の数
に比例し、その数は使用する活性化剤の量によって決まることから重要であると
特徴付けることができるからである。

【００４２】 従って、架橋ＨＡの好ましい製造法は、遊離であるかもしくは塩化したカルボ
キシ基を有するＨＡを、できれば中間体である活性化誘導体の形成を容易にする
補助剤および／または第３級の有機塩基もしくは無機塩基の存在下でカルボキシ
官能基を活性化する剤を用いて処理すること、該混合物を加熱または照射に曝露
すること（特に、ＵＶ光を使用）、および望むならば、遊離のカルボキシ基を塩
化するかまたは塩化したカルボキシ基を遊離にすることを特徴とする。カルボキ
シ基を活性化することができる物質の１つとして、文献中に記載する物質、例え
ばペプチド合成の方法において通常使用する物質を使用することができる。しか
しながら、出発物質ＨＡの分子構造を改変したりまたは破壊するような影響を有
するものを除く。活性化エステルの生成を導く好ましい物質は、例えばカルボジ
イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンジル−イソプロピルカルボジイ
ミド、ベンジル−エチルカルボジイミド、エトキシアセトン、ウッドワード試薬
（Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３−スルホネート）、または
脂肪族、環状脂肪族もしくは芳香族炭化水素由来のハロゲン誘導体、または１つ
以上の活性基が存在することによってハロゲンが可動（mobile）されたヘテロサ
イクリックな化合物由来のハロゲン誘導体が挙げられ、該活性基としては例えば
、クロロアセトニトリル、特に２−クロロ−Ｎ−アルキルピリジンの塩（例えば
、２−クロロ−Ｎ−メチルピリジンのクロロ体）、または低級アルキル基（炭素
数が１〜６のアルキル）を有する他のアルキル誘導体が挙げられる。クロリド誘
導体の代わりに、当然他のハロゲン誘導体（例えばブロミド誘導体）を使用する
ことができる。

【００４３】 この活性化反応は有機溶媒中で行なうことができ、該有機溶媒としては特に非
プロトン溶媒、例えばジアルキルスルホキシド、ジアルキルカルボキルアミド（
特に、低級アルキルジアルキルスルホキシドであって、具体的にはジメチルスル
ホキシドである）、ポリメチレンスルホキシド（例えば、テトラメチレンスルホ
キシド）、ジアルキルもしくはポリメチレンのスルホン（例えば、テトラメチレ
ンスルホン）、スルホランおよび低級脂肪族酸の低級アルキルジアルキルアミド
（ここで、アルキル基は炭素数が最大６であり、例えばジメチルもしくはジエチ
ルホルムアミドまたはジメチルもしくはジエチルアセトアミド）が挙げられる。
しかしながら、他の溶媒をも使用することができ、これら溶媒としては必ずしも
非プロトン溶媒である必要はなく、例えばアルコール、エーテル、ケトン、エス
テルであり、例えばジメトキシエタンなどの低級脂肪族ジアルコキシヒドロカー
バイド、低沸点の脂肪族アルコールもしくはヘテロサイクリックアルコールおよ
びケトンであり、例えばＮ−メチルピロリジドンもしくはＮ−エチルピロリジド
ンなどのＮ−アルキルピロリジドンおよびヘキサフルオロイソプロパノールもし
くはトリフルオロエタノールを用いることができる。カルボキシ活性化物質とし
てハロゲン誘導体を特に塩の形態（例えば、上記の２−クロロ−Ｎ−メチルピリ
ジニウムクロリド）で使用する場合には、出発物質である多糖類の金属塩または
有機塩基の塩を用いることがより良く、例えば以下に記載する四級アンモニウム
塩（例えば、テトラブチルアンモニウム塩）を用いることが良い。これらの塩は
上記の有機溶媒に非常に可溶であるという特別な利点を有し、該溶媒中では架橋
反応は最も効果的であり、従って良い収率が保証される。混合物に酸を引きぬく
ことができる物質（例えば、有機塩基、炭酸塩、炭酸水素塩または酢酸アルカリ
塩もしくは酢酸アルカリ土類塩）または有機塩基もしくは脂肪族アミン（例えば
、トリエチルアミンまたはＮ−メチル−ピペラジン）を加えることが望ましい。

【００４４】 ４級アンモニウム塩を用いることは特に有利な方法である。該アンモニウム塩
は当該分野でよく知られており、このものは他の知られる塩と同じ方法で製造す
る。それらは、炭素数が１〜６であることが好ましいアルキル由来のものである
。テトラブチルアンモニウム塩を使用することが好ましい。四級アンモニウム塩
を使用する方法における改良は、触媒量の４級アンモニウム塩（例えば、テトラ
ブチルアンモニウムヨージド）の存在下でアルカリ金属（例えば、ナトリウム塩
またはカリウム塩）と反応させることを含む。

【００４５】 活性化剤に加えるべき、カルボキシ基の活性化を触媒する物質については、文
献中で報告されており、これらも上記の塩基と同様に好ましい。従って、例えば
カルボキシ基をイソチアゾリン塩を用いて活性化する場合には、反応混合物に少
量のトリエチルアミンを加えることが好ましい。

【００４６】 活性化中間体（特に、エステル）を形成する反応は文献内で推奨する温度で行
なうが、しかしながらこの温度は周囲の環境の要求により変わるべきものであり
、これは当業者が容易に決めることができる。内部エステル結合の生成は、かな
り広範囲にわたる温度（例えば、約０℃〜約５０℃の間であり、室温またはわず
かにそれより高い温度（例えば、２０℃〜７５）が好ましい）で生じる。適当な
波長（例えば、超音波）の照射に曝露する場合と同様に、温度の上昇は内部エス
テルの生成を容易にする。

【００４７】 ヒアルロン酸の基質はいかなる由来のものであってよく、上記の多数の種類の
ものであり得る。好ましいＨＡの出発物質は、平均分子量が約１５０,０００〜
７３０,０００の範囲であり、特に１５０,０００〜４５０,０００ダルトンであ
る。

【００４８】 加えて、分子内部架橋結合の量を変えることができるが、本発明の好ましい物
質はカルボキシ基の３〜１５％の程度が架橋しているＨＡを使用する。

【００４９】 ゲル形態で製造する場合には、架橋した誘導体は修飾していないヒアルロン酸
よりも高い粘性を有する。粘性をコントロールすることによって、分解時間およ
び接着防止の効果を変えることができる。粘度が少なくとも２００Ｐａ*／秒で
あるゲルが好ましい。粘度が少なくとも２５０Ｐａ*／秒であるゲルがより好ま
しく、少なくとも３００Ｐａ*／秒であるものがより一層好ましいが、３５０Ｐ
ａ*／秒または４００Ｐａ*／秒の粘性を有するゲルが最も好ましい。

【００５０】 以下の実施例は、本発明の物質を製造するのに有用な架橋ＨＡ生成物の製造法
について記載する。 実施例４−３％架橋したヒアルロン酸（ＨＹ）の製造 生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が３％であり、ナトリウム
で塩化されたカルボキシ基が９７％である。

【００５１】 単量体単位が１０モル当量に相当する分子量が１７０,０００であるＨＡテト
ラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でジメチルホルムアミド（２４
８ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０.０３ｇ、０.３モル当量）を加える。

【００５２】 ２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.０７６ｇ、０.３モル当量
）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を
３０℃で１５分間保つ。

【００５３】 水（１００ｍＬ）および塩化ナトリウム（２.５ｇ）によって形成される溶液
を加え、得られた混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（７５０ｍＬ）中にゆっ
くりと注ぐぐ。沈殿物が生成し、このものをろ過し、アセトン：水（５：１）（
１００ｍＬ）を用いて３回洗浄し、アセトン（１００ｍＬ）で３回洗浄し、最後
に３０℃で２４時間真空乾燥する。

【００５４】 標題化合物（４ｇ）が得られる。エステル基の定量的測定は、「Quantitative
Prgan Analysis Via Functional Groups」４版, Wiley and Sons Publication
の169〜172頁に記載のケン化法に従って行なう。

【００５５】 実施例５−５％架橋したヒアルロン酸（ＡＣＰ５％）の製造 生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が５％であり、ナトリウム
で塩化されたカルボキシ基が９５％である。

【００５６】 単量体単位が１０モル当量に相当する分子量が９５,０００であるＨＡテトラ
ブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でジメチルホルムアミド（２４８
ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０.０５１ｇ、０.３モル当量）を加える。

【００５７】 ２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド（０.１２８ｇ、０.５モル当量
）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を
３０℃で１５分間保つ。

【００５８】 水（１００ｍＬ）および塩化ナトリウム（２.５ｇ）によって形成される溶液
を加え、得られた混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（７５０ｍＬ）中にゆっ
くりと注ぐ。沈殿物が生成し、次いでこのものをろ過し、アセトン：水（５：１
）（１００ｍＬ）を用いて３回洗浄し、アセトン（１００ｍＬ）で３回洗浄し、
最後に３０℃で２４時間真空乾燥する。

【００５９】 標題化合物（３.９５ｇ）が得られる。エステル基の定量的測定は、「Quantit
ative Prgan Analysis Via Functional Groups」４版, Wiley and Sons Publica
tionの169〜172頁に記載のケン化法に従って行なう。

【００６０】 実施例６−１０％架橋したヒアルロン酸（ＨＹ）の製造 生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が１０％であり、ナトリウ
ムで塩化されたカルボキシ基が９０％である。

【００６１】 単量体単位が１０モル当量に相当する分子量が６２０,０００であるＨＡテト
ラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でＤＭＳＯ（２４８ｍＬ）に溶
解し、トリエチルアミン（０.１０１ｇ、１.０モル当量）を加え、得られた溶液
を３０分間撹拌する。

【００６２】 ２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.２５５ｇ、１.０モル当量
）のＤＭＳＯ（６０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を
３０℃で１５分間保つ。

【００６３】 次いで、水（１００ｍＬ）および塩化ナトリウム（２.５ｇ）によって形成さ
れる溶液を加え、得られた混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（７５０ｍＬ）
中にゆっくりと注ぐ。沈殿物が生成し、次いでこのものをろ過し、アセトン：水
（５：１）（１００ｍＬ）を用いて３回洗浄し、アセトン（１００ｍＬ）で３回
洗浄し、最後に３０℃で２４時間真空乾燥する。

【００６４】 標題化合物（３.９３ｇ）が得られる。エステル基の定量的測定は、「Quantit
ative Prgan Analysis Via Functional Groups」４版, Wiley and Sons Publica
tionの169〜172頁に記載のケン化法に従って行なう。

【００６５】 実施例７−１５％架橋したヒアルロン酸（ＨＹ）の製造 生成物は、分子内エステルに使用するカルボキシ基が１５％であり、ナトリウ
ムで塩化されたカルボキシ基が８５％である。

【００６６】 単量体単位が１０モル当量に相当する分子量が１７０,０００であるＨＡテト
ラブチルアンモニウム塩（６.２１ｇ）を２５℃でＤＭＳＯ（２４８ｍＬ）に溶
解し、トリエチルアミンクロリド（０.１５２ｇ、１.５モル当量）を加え、得ら
れた溶液を３０分間撹拌する。

【００６７】 ２−クロロ−１−メチルピリジニウムクロリド（０.３８２ｇ、１.５モル当量
）のＤＭＳＯ（２０ｍＬ）溶液を１時間かけてゆっくりと滴下し、その混合物を
３０℃で４５時間保つ。

【００６８】 次いで、水（１００ｍＬ）および塩化ナトリウム（２.５ｇ）からなる溶液を
加え、得られた混合物を絶えず撹拌しながらアセトン（７５０ｍＬ）中にゆっく
りと注ぐ。沈殿物が生成し、次いでこのものをろ過し、アセトン：水（５：１）
（１００ｍＬ）を用いて３回洗浄し、アセトン（１００ｍＬ）で３回洗浄し、最
後に３０℃で２４時間真空乾燥する。

【００６９】 標題化合物（３.９ｇ）が得られる。総エステル基の定量的測定は、「Quantit
ative Prgan Analysis Via Functional Groups」４版, Wiley and Sons Publica
tionの169〜172頁に記載のケン化法に従って行なう。

【００７０】 ４．動物細胞および／または分子組成 本発明の構成は、セルおよび／または生物的および／または薬理的な分子の局
部的な適用に適した最適な運搬システムを提供することにおいて、特に有用であ
る。多くの病理は、天然の宿主由来のメカニズムによる自己修復でわずかにしか
修復されない、それどころか全く修復さないことによる重大な物質の損失が原因
である。ほとんど全ての場合、その修復では生物学、組織学および機能的特徴の
点において、損傷を受けていないオリジナル組織と同等でない組織を産出する。
この点に関して、ヒト組織工学（生体親和性のスカホールドに埋め込み、または
層にしたセルの組み合わせ）は、現在、オリジナルの失われた組織を完全に再生
する可能性を持った患者に一度融合させることで、さらに成熟／分化し得る組織
状の構造を生体外で構築する可能性を提供する(参考文献：LangerおよびVacanti
, Science, 1993）。

【００７１】 その他の病理において、組織／器官が適切に機能する、または特定の疾病から
回復するという能力は、特定の生物学上の活性分子、例えば成長因子（例えば、
それ自身、当分野で周知のもの）、または例えば当分野で周知の抗生物質など、
薬理的な物質の適用に依存する。望んだ治療効果が最大限得られるように特定の
標的に運搬し、特定のウィンドウ内で作用させ、それと同時に他の組織／器官に
対しての有毒性を減少させなければなず、前述の分子を正確に運搬することは、
薬物を基礎とした治療の適用に最も難しいことである。

【００７２】 しかし、他の病理では非常に複雑な処理アプローチを要求するだろう。具体的
には、例えば代謝障害の症状などの特定の疾病は、治療薬の局部的な運搬だけで
なく、その物質の投与に対する生体相互作用の制御も必要である。範例とする１
つの例は、インスリン依存性の糖尿病（type I）の処置である。任意の治療手段
の成功は、血中グルコース・レベルが特定の値に達する場合に限って、インスリ
ンを投与することに基づいている。この場合、インスリンを作る生物の知覚系だ
けが、体の要求に適切に応答し得る。特定の場合、膵臓島細胞を細胞培養技術で
容易に操作することは実のところできないので、その他のセル・タイプ（例えば
繊維芽細胞）を遺伝子的に制御し、インスリンを発現させるように変換させるこ
とができる。これらの特定の疾病についての理想的な臨床手段は、あらかじめ特
定の生物学／薬理学的分子を適当な担体中で産生するように傾倒した細胞の局所
的な運搬で構成すべきである。本発明によるセル運搬は、動物細胞、特に成人お
よび胎児組織の両方の由来の軟骨細胞、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞
、含脂肪細胞、筋細胞、神経細胞、末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞
、腺細胞、尿道の細胞および幹細胞から成る群から選択された細胞である。

【００７３】 例えば、軟骨形成性の細胞は、既存の軟骨組織(例えばヒアリン軟骨、弾性軟
骨または繊維軟骨)から直接分離し得る。特に、軟骨形成性の細胞は関節の軟骨(
体重負荷または非体重負荷関節のいずれかから)、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、
気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨および輪状軟骨から分離し得る。そ
のような組織からの軟骨形成性細胞の分離方法は、本明細書中で以下に述べる。
もう１つの方法として、軟骨形成性の細胞は、骨髄から分離し得る。例えば、米
国特許第5,197,985および4,642,120、およびWakitani et al.(1994) J. Bone Jo
int Surg. 76: 579-591を参照（これらの開示内容は引用によって本明細書中に
包含される）。

【００７４】 ひとたび軟骨形成性の細胞を既存の組織から分離すれば、当分野で周知の従来
技法である生体外での単層培養を用いて増殖させることができる（Pollack(1975
)中の「Readings in Mammalian Cell Culture」Cold Spring Harbor Laboratory
Press、Cold Spring Harborを参照）(これらの開示内容は引用によって本明細
書中に包含される）。簡単に言えば、単層で細胞を培養し、細胞を連続的に継代
することで、軟骨形成性の細胞の個体群を膨張させることである。軟骨形成性の
細胞が細胞培養プレートの表面で互いに接触するような濃度に増殖した後に、そ
の細胞を継代する。継代過程の間、その細胞を基底からはがす。この過程はタン
パク質分解酵素（例えば、トリプシン）を含んだ溶液を、単層上に注ぐことで慣
例的に行なわれる。タンパク質分解酵素は、基底上の細胞の固定部を加水分解す
る。その結果、細胞は基底の表面からはがれる。今、懸濁液中に得られた細胞を
培養培地で希釈し、新しい組織培養皿で細胞が互いに接触しないような濃度で再
び培養する。その細胞を組織培養の表面で連続的に再び付着させ、もう一度増殖
させ始める。二者択一で、懸濁液中の細胞を当分野で周知の技法を後に使用する
ために低温保存することもできる（例えば、Pollack(前述)を参照）。

【００７５】 あらかじめ決定した大きさの1つの合成軟骨を用意するために、十分量の細胞
が繁殖するまで細胞を繰り返し継代する。結果として、生検試料から独自に分離
した軟骨形成生の細胞を少量含んだ個体群を、器内で膨張さることによって、そ
の後本発明の実施で用いるための軟骨形成生の細胞を大量に発生させ得る。

【００７６】 別の好ましい態様は、特定のプロテオグリカンおよび／またはコラーゲンから
成る軟骨の産生を増強し、または刺激するために、ポリペプチド成長因子をあら
かじめ成型したウェル中の軟骨形成性の細胞に加えることもできる。好ましい成
長因子は、以下のものを含むがこれらに制限されない：トランスフォーミング成
長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由
来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、酸性または塩基性の繊
維芽細胞成長因子（ａＦＢＦまたはｂＦＢＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケ
ラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＢＭＰ−１；ＢＭＰ−２；ＢＭＰ−３；ＢＭ
Ｐ−４；ＢＭＰ−５；およびＢＭＰ−６を含む骨形態形成因子（ＢＭＰｓ）、お
よびＯＰ−１；ＯＰ−２；およびＯＰ−３を含む骨原性タンパク質（ＯＰｓ）：
加えて、特定のプロテオグリカンおよびコラーゲンから成る軟骨の産生を増強し
、または刺激するために、アスコルビン酸をあらかじめ成型したウェル中の軟骨
形成性の細胞に加えることもできること考えられる。しかし、これらの特定の化
合物は制限されない。特定のプロテオグリカンおよびコラーゲンから成る軟骨の
産生を刺激し、または誘導することができるどのような化合物または組成も、本
発明の実施に有用であろう。

【００７７】 ４．１ 軟骨細胞分離の手順 簡単に言えば、細胞外基質からはく皮させた軟骨形成生の細胞を離すために、
軟骨形成生の細胞を含む組織を成分に分ける。その後、はく皮した細胞を、生体
外で画一的な状態の単層として分離し、増殖させた。その継代の手順はあらかじ
め決定した大きさの1つの軟骨を用意するために、十分な細胞が増殖するまで複
数回（例えば、約７から１０回の継代）繰り返して行なう。合成軟骨の複数の細
胞を層にしたパッチを用いて、３次元のものを続いて形成させるために使用し得
る個体群の軟骨形成生の細胞を、これらの過程で大量に増幅させる。

【００７８】 その後、あらかじめ成型したウェル中に画一的であるが、細胞接触、細胞接着
性表面を持つように増殖させた軟骨形成生の細胞をまいた。細胞接着性表面はウ
ェル中で培養させた軟骨形成生の細胞が、ウェル表面に付着することを妨げる。
足場を奪われた細胞は互いに相互作用し、数時間以内に細胞の凝集プラグを形成
するために凝結する。その後、軟骨形成性の細胞は、軟骨に特有の標識（例えば
、タイプIIコラーゲンおよび飽和プロテオグリカン）を産生し、分泌することで
特徴的な差異が生じ始める。タイプIIコラーゲンは軟骨中に特有に見られる。そ
の後、合成軟骨の複数の細胞を層にしたパッチを用いて、３次元のものを形成さ
せるために十分な時間、軟骨形成性の細胞をウェル中で培養した。その結果、得
られた合成軟骨パッチは新しく内生的に産生し、分泌した細胞外基質を散布した
、軟骨形成性の細胞を包含する。この手順の間に沈殿させた細胞外基質は、生化
学的および形態学的に天然の軟骨に見られる細胞外基質と同等である。具体的に
言えば、合成基質はタイプIIコラーゲンの繊維、ならびにコンドロイチン硫酸お
よびケラタン硫酸から構成される。

【００７９】 ４．２ 軟骨形成性の細胞を含む組織の分離 本発明の実施に有用な軟骨形成性の細胞は、例えば、既存の軟骨組織、軟骨膜
組織または骨髄などの細胞を含む哺乳動物の多種の供給源から採取し得る。

【００８０】 肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨およ
び輪状軟骨は軟骨形成性の細胞の供給源として有用ではあるが、関節の軟骨(体
重負荷あるいは非体重負荷の関節のいずれかからの)は、好ましい供給源である
。関節の軟骨の生検試料は、外科医が行なう関節鏡視下手術（arthroscopic sur
gery)または開放性関節手術（open joint surgery）によって容易に分離するこ
とができる。生検組織の分離に関する方法は、当分野で周知であるので、本明細
書中には記載しない。例えば、McGinty et al.,; Raven Press, New Yorkによる
「Operative Arthroscopy」(1991)を参照（これらの開示内容は引用によって本
明細書中に包含される）。

【００８１】 軟骨膜組織は軟骨の全ての型（関節の軟骨を除く）の表面を覆う膜組織である
。軟骨膜組織は、非血管新生性の潜在する軟骨組織中に置いた軟骨細胞に栄養を
供給する。骨粗鬆症を患った患者の肋（肋骨）軟骨から採取した軟骨膜組織は、
正常な関節の軟骨が病気になる、または役に立たなくなった場合に、軟骨形成性
の細胞の元を提供する。軟骨膜組織の生検試料は、当分野で周知の単純な外科手
術を用いて、肋軟骨の表面から、またはその他の方法では、耳介軟骨、鼻軟骨お
よび輪状軟骨の表面から分離することができる。例えば、Skoog et al. (1990)
Scan. J. Plast. Reconstr. Hand Surg. 24: 89-93; Bulstra et al. (1990) J.
Orthro. Res. 8: 328-335; およびHomminga et al. (1990) J. Bone Constr. S
urg. 72: 1003-1007を参照（これらの開示内容は引用によって本明細書中に包含
される）。

【００８２】 本発明の実施に有用な軟骨形成性の細胞（特有の間葉細胞）を、骨髄から分離
することも考えられる。骨髄の分離に有用な外科手術は当分野で周知であるので
、本明細書中には記載しない。例えば、Wakitani et al. (1994) J. Bone Joint
Surg. 76: 579-591を参照（これらの開示内容は引用によって本明細書中に包含
される）。

【００８３】 ４．３．剥皮された（denuded）軟骨形成細胞の調製 軟骨組織、軟骨周囲（perichondrial）組織および骨髄由来の、剥皮された軟
骨形成細胞を調製するためのプロトコルを以下に記載する。

【００８４】 Ａ．関節軟骨由来 組織を脱凝集させ、細胞外基質（extracellular matrix）から、剥皮された軟
骨形成細胞を遊離させるために、荷重（体重負荷、weight bearing）および非荷
重（非体重負荷、non-weight bearing）の両者の関節軟骨を酵素処理に付しても
よい。タンパク質分解酵素、例えばコンドロイチン分解酵素ＡＢＣ、ヒアルロニ
ダーゼ 、プロナーゼ、コラゲナーゼ（collagense）またはトリプシンを含む溶
液を関節軟骨組織に加え、細胞外基質を消化することができる。例えばWatt & D
udhia (1988) Differentiation 38: 140-147（この開示内容は引用により本明細
書中に包含される）を参照のこと。

【００８５】 好ましい手法では、関節軟骨をまず直径約１ｍｍまたはそれ以下の切片にカッ
トする。これは滅菌メスを用いて慣用的に行う。次いで、例えば０．１％コラゲ
ナーゼ（Boehringer Mannheim GmbH, Germany）を含む溶液を加えることによっ
て、切断された組織を酵素的に脱凝集させる。０．２５ｍＬ当量の切断された組
織当たり約１ｍＬのコラゲナーゼを加える。次いでこのサンプルを混合し、３７
℃で一晩（１６時間まで）、攪拌しながらインキュベートする。一晩消化した後
、組織の残留切片を遠心によって集め、上清を取り出し、例えば０．２５％コラ
ゲナーゼおよび０．０５％トリプシン（Sigma Chemical Co., St. Louis）を含
む溶液を加えて残りの軟骨切片を再消化する。０．２５ｍＬ当量の残留組織当た
り約１ｍＬの０．２５％コラゲナーゼ、０．０５％トリプシンを加える。次いで
このサンプルを混合し、３７℃で２〜４時間、攪拌しながらインキュベートする
。すべての残りの組織を遠心によってペレット化し、細胞懸濁物を収集する。コ
ラゲナーゼ、トリプシン工程を２〜４回、あるいはこの組織が完全に脱凝集され
るまで繰り返す。

【００８６】 約１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Hyclone, Logan, Utah）を補った組織培養
培地を加えることによって酵素反応を終了させる。好ましい細胞培養培地には、
例えば、１０％ＦＢＳを補ったダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Sigma
Chemical Co., St. Louis）が含まれる。別の細胞培養培地には、それぞれ１０
％ＦＢＳを補った Medium 199（Sigma Chemical Co., St. Louis）とMolecular
Cell Developmental Biology Medium 202（ＭＣＤＢ ２０２）（Sigma Chemical
Co., St. Louis）の１：１（vol/vol）混合物が含まれる。また、本発明の実施
に有用な別の細胞培養培地には、それぞれ１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭとHam'
s F-12（Ｆ１２）（Sigma Chemical Co., St. Louis）の３：１（vol/vol）混合
物が含まれる。剥皮された軟骨形成細胞を含むフラクションをまとめ、細胞増殖
および試験用に、この細胞を、約１×１０^２〜５×１０^５細胞／ｃｍ^２、好まし
くは約５×１０^２〜１×１０^５細胞／ｃｍ^２、最も好ましくは約１×１０^３〜１
×１０^４細胞／ｃｍ^２のプレート密度で細胞培養皿に播種する。

【００８７】 軟骨細胞は、前記手法を用いて、肋軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭
蓋軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨および輪状軟骨から単離することができる。

【００８８】 Ｂ．軟骨周囲組織由来 剥皮された軟骨形成細胞は、本明細書中、上の段落ＩＩ Ａに記載の手法と同
じ手法を用いて、軟骨周囲組織から単離するのが好ましい。

【００８９】 簡単には、この組織を直径約１ｍｍまたはそれ以下の切片に切断する。切断さ
れた組織をタンパク質分解酵素、例えばトリプシンおよびコラゲナーゼで繰り返
し消化する。細胞増殖および試験用に、得られた剥皮細胞を、約１×１０^２〜５
×１０^５細胞／ｃｍ^２、好ましくは約５×１０^２〜１×１０^５細胞／ｃｍ^２、最
も好ましくは約１×１０^３〜１×１０^４細胞／ｃｍ^２のプレート密度で細胞培養
皿に播種する。

【００９０】 別法として、非破壊的手法を用いて、軟骨周囲組織から軟骨形成細胞を単離す
ることもできる。この手法では、無傷の外植片組織を細胞培養皿に置き、生育培
地中に播種する。この組織内に存在する軟骨形成細胞は、この組織から組織プレ
ートの表面へ遊走し、そこで増殖を開始する。例えば Bulstra et al. (1990) J
. Orthop. Res. 8: 328-335（この開示内容は引用により本明細書中に包含され
る）を参照のこと。簡単には、切断された外植片組織の切片を、組織培養培地を
含む組織培養プレートに置く。好ましい細胞培養培地には、１０％ＦＢＳを補っ
たＤＭＥＭが含まれる。外植片組織を３７℃、５％ＣＯ_２で３〜７日間インキュ
ベートする。この間に、軟骨形成細胞は外植片から組織培養皿の表面へ遊走する
。プレートの表面に再付着した後、細胞は再び増殖を始める。

【００９１】 Ｃ．骨髄由来 軟骨形成細胞、特に間葉細胞を骨髄のサンプルから単離することができる。間
葉細胞を骨髄から単離するのに有用な手法は当分野に周知である。例えば米国特
許第５，１９７，９８５号；第４，６４２，１２０号；および Wakitani et al.
(1994, 上記) を参照のこと。

【００９２】 例えば、好ましい方法では、関心ある哺乳類から骨髄のプラグを外科手術によ
って取り出し、細胞培養培地に加える。好ましい完全生育培地は米国特許第５，
１９７，９８５号に開示されている。次いでこの混合物をボルテックスし、組織
のプラグをばらばらにする。得られた懸濁物を遠心して、粒子状物質の大きな切
片、すなわち骨断片から骨髄細胞を分離する。次いで一連の１６、１８および２
０ゲージニードルを備えたシリンジに細胞を強制的に通すことによって、この細
胞を分離し、単一細胞懸濁物を得る。次いで、骨髄由来の間葉細胞を懸濁物中に
存在する残りの細胞から選択的に分離し、ならびに／あるいは単離するため、細
胞を、約１×１０^５〜１×１０^６細胞／ｃｍ^２の細胞密度で組織培養プレートに
まく。

【００９３】 ＩＩＩ．剥皮された軟骨形成細胞のインビトロ増殖 本明細書中、上の段落ＩＩに記載されている方法を用いて、軟骨組織、軟骨周
囲組織または骨髄から単離された軟骨形成細胞を、増殖させるために、単層培養
中に置くことができる。このプロセスは単離された軟骨形成細胞数の増幅を可能
にする。主に、当業者は本質的に無限数の軟骨形成細胞を製造することができ、
それゆえ本質的に無限量の合成軟骨を製造することができる。しかし、軟骨形成
細胞は増殖時に脱分化し、軟骨特有の細胞外基質の分泌能を失うことが理解され
よう。未分化細胞が依然としてその軟骨形成ポテンシャルを維持しているかどう
かをアッセイする手法を以下に記載する。

【００９４】 ４．４ 細胞増殖 単層培養によって細胞を増殖させるためのプロトコルは当分野に周知である。
例えば Pollack (上記) を参照のこと。したがって本明細書中では詳細を記載し
ない。

【００９５】 簡単には、単層培養は、軟骨組織または軟骨周囲組織から単離された元の軟骨
形成細胞を、約１×１０^２〜５×１０^５細胞／ｃｍ^２、より好ましくは約５×１
０^２〜１×１０^５細胞／ｃｍ^２、最も好ましくは約１×１０^３〜１×１０^４細胞
／ｃｍ^２のプレート密度で細胞培養皿に播種することによって開始する。１また
はそれ以上のサイクルの継代を経た軟骨形成細胞をまた、同じプレート密度でま
く。骨髄から単離された元の軟骨形成細胞は、約１×１０^５〜１×１０^６細胞／
ｃｍ^２の細胞密度で組織培養プレートにまく。１またはそれ以上のサイクルの継
代を経た骨髄由来の軟骨形成細胞を、約１×１０^２〜５×１０^５細胞／ｃｍ^２、
より好ましくは約５×１０^２〜１×１０^５細胞／ｃｍ^２、最も好ましくは約１×
１０^３〜１×１０^４細胞／ｃｍ^２のプレート密度でプレートにまく。次いでこの
軟骨形成細胞を細胞培養培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。

【００９６】 好ましい細胞培養培地には１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭが含まれる。また、
それぞれ１０％ＦＢＳを補った Medium 199 とＭＣＤＢ ２０２の１：１（vol/v
ol）混合物を含む細胞培養培地を用いてもよい。本発明の実施に有用なさらに別
の細胞培養培地には、それぞれ１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭおよびＦ１２の３
：１（vol/vol）混合物が含まれる。

【００９７】 細胞培養が集密化（すなわち細胞がプレート表面上でお互いに接触する密度ま
で増殖）した後、細胞を継代し、新たなプレートに播種する。これは、まず吸引
によって細胞単層を覆う細胞培養培地を除去し、細胞単層をリン酸緩衝塩類溶液
（ＰＢＳ）で洗浄することによって行う。吸引によってＰＢＳを除去し、次いで
タンパク質分解酵素、すなわち０．１％トリプシンを含む溶液をこの単層に注ぐ
。タンパク質分解酵素は細胞をプレート表面にアンカーするタンパク質を加水分
解し、これによりプレート表面から細胞が遊離する。次いでこの懸濁物にＦＢＳ
を加えて最終濃度１０％（vol/vol）にすることによって、細胞懸濁物中のタン
パク質分解酵素を不活化する。次いで懸濁物中の細胞の密度を見積もり、再び細
胞を、１ｃｍ^２当たり約１×１０^２〜５×１０^５細胞、より好ましくは約５×１
０^２〜１×１０^５細胞、最も好ましくは約１×１０^３〜１×１０^４細胞の密度で
新たな細胞培養プレートにまく。継代手法を複数回、例えば７〜１０回まで、あ
らかじめ決定されたサイズの軟骨の切片を調製するのに十分な細胞が増殖するま
で繰り返す。

【００９８】 増殖細胞の懸濁物は、当分野に周知の技術を用いて無期限に寒冷保存すること
ができることが理解されよう。例えば Pollack（上記）を参照のこと。したがっ
て、軟骨形成細胞集団は以後必要が生じた時にいつでも使用できるように保存す
ることができる。

【００９９】 ４．５ 増殖細胞の軟骨形成ポテンシャルを測定するアッセイ 単層培養中で増殖した未分化の軟骨形成細胞をアッセイし、これらが依然とし
て軟骨形成ポテンシャルを維持しているかどうかを測定することができる。これ
は、この細胞を、アガロース培養と称される方法において、半固形培地中で培養
することによって行うことができる。この手法はBenya et al. (1982) Cell 30:
215-224（この開示内容は引用により本明細書中に包含される）に記載されてい
る。

【０１００】 簡単には、増殖した軟骨形成細胞を暖かい２％低融解温度アガロース（ＬＴア
ガロース）（BioRad, Richmond, Calif.）の溶液にまく。ＬＴアガロースを使用
すると、細胞に対する熱損傷を伴わずにこの細胞をアガロース中にまくことがで
きる。細胞を加える前にこのアガロースを約３９〜４１℃に冷却する。液状アガ
ロース１ｍＬに約１×１０^３〜１×１０^６細胞をまく。

【０１０１】 次いでこの細胞を、好ましくは、１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭを含む細胞培
養培地中、３７℃、５％ＣＯ_２で３〜４週間培養する。この間に、軟骨形成細胞
は複製してコロニーを形成し、細胞外基質の分泌を開始する。得られたコロニー
はアガロース内に包埋された小さい「小結節（nodules）」の外観を有する。こ
のコロニーをカウントし、当分野に周知の手法を用いて組織化学的ならびに免疫
組織化学的に細胞の軟骨形成率を測定することができる。

【０１０２】 ４．６ 骨髄間質（bone marrow stroma）由来の細胞培養の調製 骨髄間質は、滅菌条件中、標準的手法にしたがい、ヘパリン溶液（３，０００
ユニット／ｍＬ）１ｍＬを含む１０−ｍＬシリンジに連結されたヘパリン処理プ
ラスチック管を用いて、腸骨稜から吸引することによって単離できる。骨髄その
もの以外に、骨髄から単離された幹細胞を用いることも可能である。この場合、
脛骨（または他のいずれかの骨）の内側近位表面を、麻酔薬下に、小さな切開を
介して暴露する。皮下組織および骨膜を切開し、折り返して骨表面を暴露させる
。脛骨を１６または１８ゲージニードルで穿孔処理し、ヘパリン溶液（３，００
０ユニット／ｍＬ）１ｍＬを含むシリンジに連結されたヘパリン処理プラスチッ
ク管を通して骨髄を吸引する。吸引された物質を、滅菌条件下、５０ｍＬプラス
チック管に移し、１，３００ｒｐｍで１０分間遠心する。遠心された細胞を暖か
い Hank's 塩基性塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、再び遠心し、１％抗生物
質溶液（ペニシリン１０，０００ユニット、１０ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン
）、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（
１０ｎｇ／ｍＬ）および±デキサメタゾン（０．４μｇ／ｍＬ）に富むα最小必
須培地（α−ＭＥＭ）を含む完全培養培地に懸濁する。この細胞懸濁物を１ｃｍ ^２ 当たり３〜５×１０^６有核細胞の密度で３５−ｍｍ Perti カプセルに注ぐ。
間葉幹細胞を、５％ＣＯ_２および９５％空気を含む加湿雰囲気下、３７℃の完全
培養培地中でインキュベートする。

【０１０３】 ４日間の初期培養後、リン酸緩衝溶液で洗浄して未分化細胞を取り出した。培
養培地を３日ごとに交換する。

【０１０４】 細胞が約２〜３週間後に集密に達した時点で、これらを３７℃で７分間、トリ
プシン０．０５％、ＥＤＴＡ０．０２％で酵素消化して培養容器から取り出す。
完全培養培地を加えて反応を中断させ、細胞懸濁物を５０ｍＬプラスチック管に
移し、１，４００ｒｐｍで１０分間遠心する。細胞を培養培地に再懸濁し、血球
計算器でカウントする。

【０１０５】 間葉幹細胞および骨髄細胞において軟骨形成を誘導するため、大量培養技術を
用いる（初期細胞密度＞１×１０^６細胞／ｃｍ^２）。

【０１０６】 ４．７ 軟骨組織由来の細胞培養の調製 標準的外科手術手法により、関節軟骨の生検を採取する。

【０１０７】 この軟骨の検体を、０．１％コラゲナーゼ溶液を用いて酵素消化することによ
って崩壊させる。切断された組織０．２５ｍＬ当たりコラゲナーゼ約１ｍＬを加
える。この検体を混合し、３７℃で約１６時間、攪拌しながらインキュベートす
る。次いで残留組織の断片を遠心によって分離し、上清を取り出す。残りの軟骨
の断片を０．２５％コラゲナーゼおよび０．０５％トリプシンを含む溶液中での
再酵素消化に暴露する。この検体を混合し、３７℃で２〜４時間、攪拌しながら
インキュベートする。残りの組織を遠心によって分離し、消化が完了するまでこ
の処理を繰り返す。

【０１０８】 １０％胎児ウシ血清（ＦＳＢ）に富む培養培地を添加することによって、ある
いは１０％ＦＢＳに富むダルベッコの最小必須培養培地を用いて、酵素反応を中
断させる。

【０１０９】 細胞懸濁物を３〜５×１０^６細胞／ｃｍ^２の密度で３５−ｍｍ Perti 皿に注
ぐ。

【０１１０】 ５． 医薬的または生物学的に活性な成分 ＨＡの５０〜７０％ベンジルエステルおよび３〜１５％ＡＣＰ ＨＡ 誘導体は
注射投与のデリバリー系に関する優秀な担体であることがわかったため、生物学
的または薬理学的活性成分は哺乳類、例えばヒト患者に投与するのに望ましいす
べてのタイプであってよい。薬理学的に活性な物質として特に重要なのは、それ
自体当業者に既知である、抗生物質、抗炎症薬、消毒薬、活性ホルモン、抗腫瘍
薬（anti-tumoral agents）および抗ウイルス薬である。

【０１１１】 生物学的に活性な物質は好ましくは哺乳類または患者の生物学的プロセスに影
響する物質である。特に重要なのは、フィブロネクチン、ＲＧＤまたはインテグ
リン配列のような生体材料に対する細胞の接着を助ける物質、トランスフォーミ
ング成長因子β（ＴＧＦβ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来
成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、酸性または塩基性繊維芽
細胞成長因子（ａＦＢＦまたはｂＦＢＦ）、肝細胞増殖因子（hepatocyte growt
h factor, ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（keratinocyte growth factor,
ＫＧＦ）、骨形態形成タンパク質（bone morphogenic proteins, ＢＭＰＳ）、
例えばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＢ
ＭＰ−６および骨原生タンパク質（osteogenic proteins, ＯＰｓ）、例えばＯ
Ｐ−１、ＯＰ−２およびＯＰ−３のような成長因子、ＤＮＡおよびＲＮＡのよう
な特定の遺伝子または遺伝子配列または遺伝子転写物をコードする核酸、ならび
に分化／調節因子である。

【０１１２】 ６．添加成分 本発明の組成物は、少なくとも１個のベンジルエステルまたはＡＣＰ誘導体お
よび少なくとも１個の生物学的または薬理学的に活性な成分および／または哺乳
類細胞を含むゲルの形態で調製する。このゲルにはまた、例えば繊維、顆粒、ミ
クロスフェア、ナノスフェア（nanospheres）、スポンジの断片のような、１個
またはそれ以上の種々の形態の、１個またはそれ以上のヒアルロン酸の誘導体を
含ませることができる。これらの形態は、この組成物の哺乳類細胞に対するアン
カー化を提供することができ、好ましくはトータルベンジルエステルヒアルロン
酸誘導体（ＨＹＡＦＦ−１１）から構成される。この形態は好ましくは以下の手
法によって製造できる。

【０１１３】 ミクロスフェアはＥＰ０５１７５６５に記載の方法によって好ましく製造でき
る。ナノスフェアはＷＯ９６／２９９９８に記載の方法によって好ましく製造で
きる。スポンジは米国特許第４，８５１，５２１号に記載の方法によって好まし
く製造できる。繊維は米国特許第５，５２０，９１６号および第５，８２４，３
３５号に記載の手法にしたがって製造できる。

【０１１４】 実施例８−ミクロスフェア すべてＨＹＡＦＦ−１１のカルボキシル基の米国特許第４,８５１,５２１号に
記載の全ベンジルエステルヒアルロン酸誘導体を、ジメチルスルホキシド等の非
プロトン性溶媒に、５〜１０％ｗ／ｖの濃度、一般には７％ｗ／ｖの濃度で溶解
する。ポリマーが溶解したら、得られた混合物を以後、非連続相と呼ぶ。同時に
、非イオン性表面活性剤であるＡｒｌａｃｅｌ（登録商標）を１％ｗ／ｖの濃度
で含む高粘度ミネラルオイルの適当なリアクター中で混合物を調製する。以下、
この混合物を連続相と呼ぶことにする。

【０１１５】 連続相を２５℃に保ちながら１０００ＰＲＭの一定速度で撹拌し、これに、前
に記載されたように調製した非連続相を加える。これらの条件で、２相がすぐ乳
化する。２相（非連続相と連続相）の比は約１対１６である。

【０１１６】 １５分間撹拌したのち、アセチルアセテートを加える。この溶媒はこのエマル
ジョンの２つの相と完全に混和するが、ポリマーとヒトインスリンポリペプチド
に対する溶媒ではない。完全に抽出するために必要な抽出溶媒の容量は、エマル
ジョンの総体積の２.５倍であることがわかっている。抽出を促進するため、撹
拌速度を１０分間は１４００〜１５００ＲＰＭに設定し、その後５００ＲＰＭに
下げる。このようにして得られた懸濁液を撹拌しながら、フィルター圧を１気圧
に設定したフィルターを通じてスクリューポンプで吸引する。この濾過が完了し
たら、調製物を「乾燥」し且つミクロスフェアの表面に存在し得る残留したいか
なる表面活性剤も溶解するという２重効果を有する溶媒である正ヘキサンを、フ
ィルターを通じて吸引する。次いで、この生成物を適当な容器に入れて４℃で保
存する。

【０１１７】 これらの実施条件で得られる平均粒子サイズは１０μｍである。

【０１１８】 ７．本発明の組成物例 以下に、本発明による組成物の例を示す。 実施例９−自己架橋ヒアルロン酸（ＡＣＰ）または全ベンジルエステル（ＨＹＡ
ＦＦ−１１）スポンジ状断片と細胞を含有する、自己架橋ヒアルロン酸（ＡＣＰ
）のゲルの組成物 ＡＣＰ（またはＨＹＡＦＦ−１１）のスポンジを、液体窒素中で−１５０℃以
下の温度にし、加圧、篩過して１００ミクロン未満の粒度を得る。ＡＣＰの顆粒
１００ｍｇを０.５ｍＬのＡＣＰと混合する。

【０１１９】 ５〜１０ｍLのヘパリン処理骨髄を、ＡＣＰ顆粒およびゲルを含む１０〜２０
ｍLの滅菌注射器（２２ゲージ）に入れる。均質な混合物が得られるように混合
物をもう１つの注射器中へゆっくりと押し出す。

【０１２０】 細胞を骨軟骨性欠損内へこの後すぐに in vivo 注入するか、あるいは移植す
る前に３７℃にて３〜４時間ミクロスフェアに付着させることができる。

【０１２１】 細胞を予め試験管内で一定の期間（２〜３週間）増殖させる場合は、既知の細
胞数の細胞をある一定の体積に懸濁し、この培養細胞をゲルと混合する。懸濁液
の体積は、ゲルが過度に希釈されないよう計算する。

【０１２２】 別の方法は、約１〜２ｍLの骨髄および間葉性幹細胞と、スポンジ状断片１０
０ｍgとＡＣＰ粉末３５ｍgで構成される混合物とを、滅菌注射器（２２ゲージ）
内で混合することを含む。混合物を３７℃に３〜４時間保ち、粉末が水和され、
細胞がスポンジ状断片に付着するようにする。

【０１２３】 以下の実施例は、前に記載されたヒアルロン酸成分と、哺乳類細胞および／ま
たは分子成分との、様々な組合せの製造と投与を記載するものである。これらの
実施例は、皮膚、肝臓、腸などの軟かい組織と、骨や軟骨などの硬い組織のいず
れにも適用可能である。

【０１２４】 実施例１０−注射可能ヒアルロン酸誘導体ベースのゲルに取り込まれた軟骨形成
細胞による軟骨および骨軟骨欠損の処置 目的とする組成物は、軟骨形成細胞が均一に分散した少なくとも１つのヒアル
ロン酸誘導体を含有する注射可能なゲルの形態で製造することができる。このゲ
ルは、線維、顆粒、ミクロスフェア、ナノスフェア、スポンジの断片など、様々
な形態の、１またはそれ以上のヒアルロン酸の誘導体をさらに含有することがで
きる。まず、軟骨形成細胞、例えば成人の分化軟骨細胞または未分化の間葉性幹
細胞を、もとになる組織、例えば非体重負荷（non-weight-bearing）関節軟骨お
よび骨髄基質、から得る。細胞を単離し、当業者が常套的に使用する標準的な細
胞培養技術により増殖させる。欠損の大きさと深さに基づいた適当な細胞数に達
したら、二次元的表面状の培養細胞から細胞を個々に分離させ、ＡＣＰまたは部
分的にエステル化されたＨＹＡＦＦで構成されるゲル中に取り込ませる。ＨＡベ
ースの送達用ビークルの相対的な架橋またはエステル化速度は、その患者におい
て達成すべき所望の分解時間にしたがって変えることができる。ＨＡのベンジル
エステルおよび自己架橋したＨＡ誘導体の製造例は、前に報告されている。

【０１２５】 ゲルは、細胞が結果として担体中で均一に分散するようなやり方で、機械によ
って取り扱うことができる。次いで、組合せ物を、滅菌注射器および／または当
分野において外科医が常套的に使用するような関節鏡検査装置を用いることによ
り注入し、欠損した範囲を満たす。ＨＡ担体の特性によって、細胞がこの欠損に
滞留し、修復／再生過程の間にこの担体と置き換わる細胞外基質を細胞が産生し
始める。さらに、例えば間葉性幹細胞を使用する場合に、未分化の軟骨形成細胞
に委ねるため、あるいは投与した細胞および／または宿主細胞の成長を促進する
ために、送達された細胞とゲルの組合せ物に分化因子および／または成長因子を
加えることができる。

【０１２６】 実施例１１−注射可能なヒアルロン酸誘導体固体／ゲル製剤に取り込まれた軟骨
形成細胞による軟骨および骨軟骨欠損の処置 細胞外基質分子を産生しまたは付着した表面において安定化される細胞の組成
物を注入するために、担体は、ゲルに取り込まれた固体の懸濁液、微粒子の混合
物であってよい。前に投与した軟骨形成細胞によって完全には覆われない粒子に
対し、微粒子は、注入された細胞のよりどころとなる支持体としてだけでなく、
宿主由来の細胞のよりどころとなる支持体としてもはたらく。

【０１２７】 この目的とする組成物は、軟骨形成細胞が均一に分散している、ＨＡ由来の粒
子を少なくとも含む固体の懸濁液とともに、少なくとも１つのヒアルロン酸誘導
体を含むゲルの注射可能な組合せの形態で製造することができる。細胞は、実施
例１１に記載したとおりに回収し、単離し、増殖させる。次いで、細胞を、前記
のＡＣＰまたはベンジルエステル誘導体から製造された、線維、顆粒、ミクロス
フェア、ナノスフェアまたはスポンジの断片の形態の少なくとも１つのＨＡ誘導
体を含む液体媒体中で混合する。手術室内で、またはさらには細胞培養インキュ
ベーターなどのより管理された雰囲気において、室温にて、１５分〜４８時間、
好適には３０分間〜２４時間、またはより好ましくは１時間〜３時間、細胞を微
粒子に付着させる。次いで、微粒子に付着した細胞をゲル内に均一に取り込ませ
、そして上記のとおり注入する。ＨＡ由来の成分の組合せは、微粒子画分とゲル
画分との比率が考慮されるような組合せである。最適な比率は、具体的な臨床的
適用ごとに調整すべきであり、微粒子：ゲルを９：１から１：９の割合の間で変
更することができる。

【０１２８】 実施例１２−成長因子を取り込んでいるＨＡ誘導体担体の注射可能な組合せによ
る骨不癒合の処置 骨不癒合は、複雑性骨欠損または代謝異常の患者を処置するときの成形外科手
術において起きる一般的な合併症である。現時点の技術水準での骨不癒合の処置
は、薬剤投与または無細胞の生体用材料の適用によるものである。比較的最近の
方法として、宿主修復系を刺激するために特定の生物学的因子を使用して骨カル
ス形成を妨害する状態を克服するというものがある。このような生物学的に活性
な分子は、例えば、骨形成因子（ＢＭＰ）である。しかし、物質が局所的に作用
しなければならず、循環系（脈管系および／またはリンパ系）によって分散して
はならないため、当業者は様々な担体を試験している。本発明の目的とするＨＡ
由来の化合物は、この適応症に特に適している。なぜなら，ＨＡは骨伝導性（os
teo-conductive）であるだけでなく骨誘導性（osteo-inductive）でもあるから
である。このように、ある特定の量のＢＭＰが放出する一方で、ＨＡは、この生
物学的に活性なタンパク質の効果と好ましい骨形成を強化することもできる。

【０１２９】 骨内植のために使用する製剤は、ＢＭＰ、例えばＢＭＰ２、を取り込んでいる
ゲルか、またはゲルとＢＭＰを取り込んでいる微粒子との組合せである。ゲルと
微粒子の比率は、上記のように調整することができる。骨前駆体に対する直接的
なＨＡの作用により骨形成を促進する（骨誘導）ため、およびさらに組織が誘導
する骨伝導（osteoconduction）を刺激するために、後者の組合せが企図される
が、これに限定されない。さらに、例えばＢＭＰ２や特定の抗生物質を混合する
ことにより、骨成長を骨不癒合における一般的な合併症である感染から保護する
ことができる。

【０１３０】 実施例１３−ＨＡ誘導体ベースのゲルおよびゲル／固体組合せ物中の各種細胞の
注入による皮膚形成異常の処置 例えば、乳房切除または広範な顔の火傷後の、皮膚形成異常は、人の生活の質
に相当な影響を与える。現時点の技術水準での処置は、組織増強分解性物質、例
えばコラーゲン、の投与によるものである。しかし、このような仮の処置は、美
観を損なう特徴を永久に消し去るものではなく、継続的な投与が必要である。安
定した増強は、細胞外基質が正しく産生されてもとの皮膚の外形が再び確立され
る場合にのみ達成される。液体の懸濁液にて注入される細胞は、脈管系またはリ
ンパ系のいずれかによって分散されると思われ、永続的に組織化した細胞外基質
を合成する能力は低下する。担体系は、永続的な付着が起きるまでの周囲の組織
に対する一時的な安定したよりどころを保証し、ＨＡ誘導体ベースの製剤によっ
て構成することができる。さらに、文献において知られているように、ＨＡは、
ある程度、創傷治癒過程の促進において直接作用する。

【０１３１】 このように、線維芽細胞などの細胞外基質産生細胞は、これを、前記のような
ＨＡ誘導体ベースのゲル中に取り込ませることによって送達することができる。
次いで、線維芽細胞を皮下の空隙に注入し、周囲の組織への付着の自然の過程が
起こるまでその部位に固着させることができる。別法では、均一に分散した細胞
を送達するために線維芽細胞が最初に付着する、ゲル内に取り込まれた微粒子の
組合せを使用することができる。各種製剤の比率および組成は上に記載されてい
る。例えば、乳腺細胞またはアジポサイト（adypocyte）（分化したまたは未分
化の）などの線維芽細胞以外の細胞は、皮膚の陥没を満たすために使用すること
ができる。

【０１３２】 実施例１４−注射可能なヒアルロン酸誘導体固体／ゲル製剤中に取り込まれた遺
伝的に処理された細胞による自己免疫疾患の処置 自己免疫疾患は、例えば若年型糖尿病におけるインスリンまたは慢性関節リウ
マチにおける軟骨組織成分などの特定の生体因子に対する免疫系の自己反応性応
答に起因する。自己免疫疾患は、全世界で百万人が罹患している慢性の病気であ
る。現在の薬理学的プロトコルは、合併症に関して局所的または全身的に送達さ
れた総合的な抗炎症物質を投与することによる、その疾患の症状にその焦点が当
てられている。新しい時代の処置は、例えば、酵素的阻害物質または受容体アン
タゴニストなどのより強力で特異的な化合物の使用によるものであろう。しかし
、疾患の永続的な抑制は、これら物質の継続的投与を頼みとしており、薬物に関
連する合併症が進行する危険性が伴う。別の最先端の解決方法は、例えば、遺伝
的に形質転換された細胞をex vivoで使用し、免疫反応を中和する特異的な生物
学的または薬学的な物質を産生させることによる。この特定の適用では、細胞を
局所的に注入し、この細胞は、長期間、恐らくはその人の一生にわたり、その生
存が維持されなければならない。この目的のためには、細胞が適用部位と融和し
なければならないが、これは細胞がそこに最初に送達され取り込まれるような支
持体を提供することにより達成することができる。上記実施例に記載のＨＡ誘導
体は、人体のほぼすべての区画に受け入れられる特定の特性でもってこの要求を
満たしている。したがって、上に記載したように、軟骨形成細胞を回収して単離
することができる。次いで、当業者によって常套的に使用される技術を用いて、
細胞が生体による制御を受けるようにトランスフェクトし、例えば抗ＩＬ−１ま
たは抗ＴＮＦα等の抗リウマチ物質を発現させ、増殖させることができる。そし
て、細胞を、前に使用した同じビークル中にて慢性関節リウマチの患者に送達す
る。

【０１３３】 ＨＡ誘導体ベース製剤の別の応用は、in vivo 遺伝子治療プロトコルのための
遺伝物質の送達によって構成される。実施例１０に記載されたＨＡ、ＤＮＡまた
はＲＮＡの組合せを、適当な担体中にて直接注入して、例えば膵嚢胞線維症に関
与するような欠陥肺細胞をトランスフェクトする。

【０１３４】 このように本発明を記載したが、これら方法は、様々な方法で修飾することが
できることは明らかである。この修飾は、本発明の精神と目的から逸脱するもの
と考えられるべきものではなく、当分野の専門家に明らかであると思われるいか
なる修飾も請求の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/04 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アンドレア・パストレッロ イタリア、イ−35031アバーノ・テルメ （パドヴァ）、ヴィア・アレッサンドロ・ ヴォルタ３／ビ番 (72)発明者 アレッサンドラ・パヴェシオ イタリア、イ−35100パドヴァ、ヴィア・ デコラティ・アル・ヴァローレ・チヴィレ 159番 (72)発明者 ランフランコ・カレガロ イタリア、イ−36016ティエネ（ヴィチェ ンツァ）、ヴィア・モンテ・グラッパ６番 Ｆターム(参考） 4C076 AA09 AA17 AA22 BB11 BB21 CC29 CC30 EE37A EE37P EE37Q FF36 FF63 4C084 AA17 AA19 MA05 MA56 MA66 NA03 ZA961 ZA962 ZB262 ZB332 ZB352 ZC032 ZC202 4C086 AA01 AA02 EA16 MA03 MA05 MA07 MA56 MA66 NA03 ZA96 4C087 AA01 AA02 BB46 MA05 MA56 MA66 NA03 ZA96

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体および少なくとも１つ
   の生物学的にもしくは薬理学的に活性な成分および／または哺乳動物の細胞を含
   有する注入可能な生体親和性の組成物であって、そのヒアルロン酸誘導体は （ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒ
   アルロン酸のベンジルエステル （ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が、同じまたは異なるヒアル
   ロン酸分子のヒドロキシル基と自己架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導
   体 からなる群から選ばれる組成物。
2. 【請求項２】 ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基でエ
   ステル化されている、請求項１に記載の注入可能な生体親和性の組成物。
3. 【請求項３】 哺乳動物の細胞は、成人および胎児の両方に由来する軟骨細
   胞、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、含脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞
   、末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞および幹細
   胞からなる群から選ばれる、請求項１に記載の注入可能な生体親和性の組成物。
4. 【請求項４】 細胞は軟骨細胞である、請求項１に記載の注入可能な生体親
   和性の組成物。
5. 【請求項５】 生物学的に活性な成分は薬理学的に活性な成分である、請求
   項１に記載の注入可能な生体親和性の組成物。
6. 【請求項６】 薬理学的に活性な成分は抗生物質、抗炎症薬、消毒薬、活性
   ホルモン、抗腫瘍薬または抗ウイルス薬である、請求項５に記載の注入可能な生
   体親和性の組成物。
7. 【請求項７】 薬理学的に活性な成分は増殖因子、または分化／調節因子で
   ある、請求項１〜６のいずれかに記載の注入可能で生体親和性の組成物。
8. 【請求項８】 増殖因子は、トランスフォーミング成長因子、インスリン様
   成長因子、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、酸性および塩基性の繊維芽
   細胞成長因子、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト成長因子、骨形態形成タンパク
   質および骨原性タンパク質からなる群から選ばれる要素である、請求項７に記載
   の注入可能な生体親和性の組成物。
9. 【請求項９】 薬理学的に活性な成分は核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ
   )である、請求項５に記載の注入可能で生体親和性の組成物。
10. 【請求項１０】 ヒアルロン酸誘導体の繊維、顆粒、ミクロスフェア、ナノ
    スフェアまたはスポンジの断片を更に含む、請求項１〜９のいずれかに記載の注
    入可能で生体親和性の組成物。
11. 【請求項１１】 ヒアルロン酸誘導体は全ベンジルエステル誘導体である、
    請求項１０に記載の注入可能で生体親和性の組成物。
12. 【請求項１２】 生物学的にまたは薬理学的に活性な成分または細胞を注入
    投与するための少なくとも１つのヒアルロン酸誘導体の使用であって、そのヒア
    ルロン酸誘導体は、 （ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒ
    アルロン酸のベンジルエステル （ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が、同じまたは異なるヒアル
    ロン酸分子のヒドロキシル基と自己架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導
    体 からなる群から選ばれる該使用。
13. 【請求項１３】 ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基で
    エステル化されている、請求１２に記載の使用。
14. 【請求項１４】 哺乳動物細胞は成人および胎児の両方に由来する軟骨細胞
    、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、含脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、
    末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞、幹細胞およ
    び遺伝的に改良した細胞からなる群から選ばれる、請求項１２に記載の使用。
15. 【請求項１５】 細胞は軟骨細胞である、請求項１４に記載の使用。
16. 【請求項１６】 軟骨の修復のための注入可能な成分の使用であって、該組
    成物は、 （ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒ
    アルロン酸のベンジルエステル （ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が同じであるかまたは異なる
    ヒアルロン酸分子のヒドロキシル基と自己架橋している、ヒアルロン酸の自己架
    橋誘導体 からなる群から選ばれるヒアルロン酸誘導体と組み合わせて軟骨細胞を含む、該
    使用。
17. 【請求項１７】 ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基で
    エステル化されている、請求項１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】 哺乳動物の細胞の保存中および輸送中の保護のための、少
    なくとも１つのヒアルロン酸誘導体の使用であって、そのヒアルロン酸誘導体は （ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒ
    アルロン酸のベンジルエステル （ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が、同じまたは異なるヒアル
    ロン酸分子のヒドロキシル基と自己架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導
    体 からなる群から選ばれる、該使用。
19. 【請求項１９】 ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基で
    エステル化されている、請求項１８に記載の使用。
20. 【請求項２０】 哺乳動物細胞は成人および胎児の両方に由来する軟骨細胞
    、骨細胞、繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、含脂肪細胞、筋肉細胞、神経細胞、
    末梢神経系由来の細胞、内皮細胞、造血細胞、腺細胞、尿道の細胞、幹細胞およ
    び遺伝的に改良した細胞からなる群から選ばれる、請求項１８または１９に記載
    の使用。
21. 【請求項２１】 細胞は軟骨細胞である、請求項２０に記載の使用。
22. 【請求項２２】 軟骨の損傷の処置法であって、患者の関節内腔に、 （ａ）カルボキシ基の５０〜７５％がベンジル基によってエステル化されたヒ
    アルロン酸のベンジルエステル （ｂ）ヒアルロン酸のカルボキシル基の３〜１５％が、同じまたは異なるヒアル
    ロン酸分子のヒドロキシル基と自己架橋している、ヒアルロン酸の自己架橋誘導
    体 からなる群から選ばれるヒアルロン酸誘導体と組み合わせて、軟骨細胞を含む成
    分を注入することを含む、該処置法。
23. 【請求項２３】 ベンジルエステルはカルボキシ基の５０％がベンジル基で
    エステル化されている、請求項２２に記載の方法。