JP2002522449A - 2’−o−アミノエチルオキシエチル修飾オリゴヌクレオチド類 - Google Patents
2’−o−アミノエチルオキシエチル修飾オリゴヌクレオチド類Info
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Abstract
(57)【要約】
2’−O−修飾リボシルヌクレオシドと、このようなヌクレオシドモノマーを含有する修飾オリゴマー化合物を開示する。分子モデリング実験によって示すように増強した結合アフィニティを有するオリゴマー化合物を開示する。本発明の2’−O−修飾−ヌクレオシドはヌクレオシドの糖部分を選択的に3’エンド形態で配置する環構造を包含する。
Description
【0001】関連出願データ 本特許出願は、出願第09/130,566号(1998年8月7日出願)(
これの内容は本明細書に援用される)の一部継続出願である。
これの内容は本明細書に援用される)の一部継続出願である。
【0002】発明の分野 本発明は、ヌクレオシドモノマーと、このようなヌクレオシドモノマーを組み
込んだオリゴマー化合物と、このようなオリゴマー化合物の使用方法とに関する
。本発明のオリゴマー化合物は治療及び研究目的のために有用である。さらに詳
しくは、本発明は、オリゴマー化合物のアフィニティとヌクレアーゼ耐性とを高
める2’−O−修飾を有するオリゴマー化合物の使用に関する。
込んだオリゴマー化合物と、このようなオリゴマー化合物の使用方法とに関する
。本発明のオリゴマー化合物は治療及び研究目的のために有用である。さらに詳
しくは、本発明は、オリゴマー化合物のアフィニティとヌクレアーゼ耐性とを高
める2’−O−修飾を有するオリゴマー化合物の使用に関する。
【0003】発明の背景 たいていの疾患状態を包含する、哺乳動物におけるたいていの身体状態がタン
パク質によって影響を受けることは周知である。古典的な治療モードは、このよ
うなタンパク質の疾患誘発機能又は疾患強化機能を緩和しようと試みて、このよ
うなタンパク質との相互作用に一般に集中している。しかし、最近は、このよう
なタンパク質の合成を指示する(direct)、例えば細胞内RNAのような分子との
相互作用によって、このようなタンパク質の実際の産生を抑制することが試みら
れている。タンパク質の産生を妨害することによって、最大の治療効果と最小の
副作用とを実現することができる。好ましくないタンパク質形成をもたらす遺伝
子発現を妨害するか又は他のやり方でモジュレートすることが、このような治療
アプローチの一般的な目的である。
パク質によって影響を受けることは周知である。古典的な治療モードは、このよ
うなタンパク質の疾患誘発機能又は疾患強化機能を緩和しようと試みて、このよ
うなタンパク質との相互作用に一般に集中している。しかし、最近は、このよう
なタンパク質の合成を指示する(direct)、例えば細胞内RNAのような分子との
相互作用によって、このようなタンパク質の実際の産生を抑制することが試みら
れている。タンパク質の産生を妨害することによって、最大の治療効果と最小の
副作用とを実現することができる。好ましくないタンパク質形成をもたらす遺伝
子発現を妨害するか又は他のやり方でモジュレートすることが、このような治療
アプローチの一般的な目的である。
【0004】 特定の遺伝子発現を阻害するための1つの方法は、オリゴヌクレオチドの使用
である。オリゴヌクレオチドは現在、非常に有望な治療剤として現在受け入れら
れており、一本鎖DNA又はRNA分子にハイブリダイズすることが知られてい
る。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基をターゲットD
NA又はRNA分子の核酸塩基に水素結合させる配列特異的塩基対である。この
ような核酸塩基対は相互に相補的であるといわれる。アンチセンス阻害としても
知られる、ターゲットRNA配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合を用
いて遺伝子発現を阻害するという概念は、生きている細胞を含めた、多様な系に
おいて実証されている(例えば、Wagner等,Science(1993)
260:1510−1513;Milligan等,J.Med.Chem.,
(1993)36:1923−37;Uhlmann等,Chem.Revie
ws,(1990)90:543−584;Stein等,Cancer Re
s.,(1988)48:2659−2668)。
である。オリゴヌクレオチドは現在、非常に有望な治療剤として現在受け入れら
れており、一本鎖DNA又はRNA分子にハイブリダイズすることが知られてい
る。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基をターゲットD
NA又はRNA分子の核酸塩基に水素結合させる配列特異的塩基対である。この
ような核酸塩基対は相互に相補的であるといわれる。アンチセンス阻害としても
知られる、ターゲットRNA配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合を用
いて遺伝子発現を阻害するという概念は、生きている細胞を含めた、多様な系に
おいて実証されている(例えば、Wagner等,Science(1993)
260:1510−1513;Milligan等,J.Med.Chem.,
(1993)36:1923−37;Uhlmann等,Chem.Revie
ws,(1990)90:543−584;Stein等,Cancer Re
s.,(1988)48:2659−2668)。
【0005】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって核酸機能を破壊させるイベント(
Cohen in Oligonucleotides:Antisense
Inhibitors of Gene Expression,(1989)
CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL)は、2種類であ
ると考えられる。最初のハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻
害剤がターゲット核酸に結合し、それによって、簡単な立体障害によって、必須
タンパク質が、最もしばしばはリボソームが核酸に結合するのを妨害する停止イ
ベントである。メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド(Miller,P.
S.とTs’O,P.O.P.(1987)Anti−Cancer Drug
Design,2:117−128)と、α−アノマー・オリゴヌクレオチド
とは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を破壊すると考えられる、
最も広範囲に研究されている2種類のアンチセンス作用剤である。
Cohen in Oligonucleotides:Antisense
Inhibitors of Gene Expression,(1989)
CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL)は、2種類であ
ると考えられる。最初のハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻
害剤がターゲット核酸に結合し、それによって、簡単な立体障害によって、必須
タンパク質が、最もしばしばはリボソームが核酸に結合するのを妨害する停止イ
ベントである。メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド(Miller,P.
S.とTs’O,P.O.P.(1987)Anti−Cancer Drug
Design,2:117−128)と、α−アノマー・オリゴヌクレオチド
とは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を破壊すると考えられる、
最も広範囲に研究されている2種類のアンチセンス作用剤である。
【0006】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの停止イベントの第2種類は、細胞内RN
アーゼHによるターゲットRNAの酵素開裂を包含する。2’−デオキシリボ−
フラノシル・オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体はターゲットR
NAとハイブリダイズし、この二本鎖(duplex)がRNアーゼH酵素を活性化して
、RNA鎖を開裂させて、それによってRNAの正常機能を破壊させる。ホスホ
ロチオエート・オリゴヌクレオチドは、この種類のアンチセンス停止イベントに
よって作用するアンチセンス作用剤の最も顕著な例である。
アーゼHによるターゲットRNAの酵素開裂を包含する。2’−デオキシリボ−
フラノシル・オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体はターゲットR
NAとハイブリダイズし、この二本鎖(duplex)がRNアーゼH酵素を活性化して
、RNA鎖を開裂させて、それによってRNAの正常機能を破壊させる。ホスホ
ロチオエート・オリゴヌクレオチドは、この種類のアンチセンス停止イベントに
よって作用するアンチセンス作用剤の最も顕著な例である。
【0007】 オリゴヌクレオチドは二本鎖核酸に結合して、配列特異的形式でHoogst
een塩基対合を介して三本鎖複合体を形成することもできる(Beal等,S
cience,(1991)251:1360−1363;Young等,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:10023−1002
6)。アンチセンス治療方策と三重らせん治療方策の両方は、疾患状態の確立又
は維持に関与する又は疾患状態の確立又は維持の原因である核酸配列を対象とす
る。このようなターゲット核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物、寄生虫、
ウイルスを含めた病原性生物のゲノム中に見出すことができるか、又は本質的に
内因性でありうる。疾患状態の確立、維持又は解消に重要な遺伝子にハイブリダ
イズする又はこのような遺伝子の発現を修飾することによって、対応する状態を
治療、予防又は軽減することができる。
een塩基対合を介して三本鎖複合体を形成することもできる(Beal等,S
cience,(1991)251:1360−1363;Young等,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.(1991)88:10023−1002
6)。アンチセンス治療方策と三重らせん治療方策の両方は、疾患状態の確立又
は維持に関与する又は疾患状態の確立又は維持の原因である核酸配列を対象とす
る。このようなターゲット核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物、寄生虫、
ウイルスを含めた病原性生物のゲノム中に見出すことができるか、又は本質的に
内因性でありうる。疾患状態の確立、維持又は解消に重要な遺伝子にハイブリダ
イズする又はこのような遺伝子の発現を修飾することによって、対応する状態を
治療、予防又は軽減することができる。
【0008】 相補的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度の判定におい
て、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対的能力は特定のハイブリダ
イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。
二重らせんの融解温度(Tm)、特徴的な物理的性質は、50%のらせん形(ハ
イブリダイズした)対コイル形(ハイブリダイズしない)が存在する温度(摂氏
度)を意味する。Tmはハイブリダイゼーション複合体の形成及び破壊(融解)
を 判定するためにUVスペクトルを用いることによって測定される。ハイブリダイ
ゼーション中に生ずる塩基重層はUV吸収(淡色性(hypochromicity))の低下を
付随する。したがって、UV吸収の低下は高いTmを意味する。Tmが高ければ高
いほど、鎖間の結合の強度が大きい。
て、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対的能力は特定のハイブリダ
イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。
二重らせんの融解温度(Tm)、特徴的な物理的性質は、50%のらせん形(ハ
イブリダイズした)対コイル形(ハイブリダイズしない)が存在する温度(摂氏
度)を意味する。Tmはハイブリダイゼーション複合体の形成及び破壊(融解)
を 判定するためにUVスペクトルを用いることによって測定される。ハイブリダイ
ゼーション中に生ずる塩基重層はUV吸収(淡色性(hypochromicity))の低下を
付随する。したがって、UV吸収の低下は高いTmを意味する。Tmが高ければ高
いほど、鎖間の結合の強度が大きい。
【0009】 オリゴヌクレオチド類は例えば細胞内又は細胞外のポリペプチド、タンパク質
又は酵素のような非核酸バイオ分子に結合するときに、オリゴヌクレオチド類は
治療的にも価値がありうる。このようなオリゴヌクレオチド類はしばしば“アプ
タマー(aptamer)”とも呼ばれ、これらはタンパク質ターゲットに典型的に結合
して、タンパク質ターゲットの機能を妨害する(Griffin等,Blood
(1993),81:3271−3276;Bock等,Nature(199
2)355:564−566)。
又は酵素のような非核酸バイオ分子に結合するときに、オリゴヌクレオチド類は
治療的にも価値がありうる。このようなオリゴヌクレオチド類はしばしば“アプ
タマー(aptamer)”とも呼ばれ、これらはタンパク質ターゲットに典型的に結合
して、タンパク質ターゲットの機能を妨害する(Griffin等,Blood
(1993),81:3271−3276;Bock等,Nature(199
2)355:564−566)。
【0010】 オリゴヌクレオチド類とそれらの類似体類(オリゴマー化合物)は診断目的、
治療用途のために及び研究試薬として開発され、用いられている。治療薬として
の使用に関しては、オリゴヌクレオチドは好ましくは細胞膜を横切って輸送され
るか又は細胞に吸収されて、ターゲットDNA又はRNAと適当にハイブリダイ
ズする。これらの機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期安
定性に依存すると考えられる。治療目的のためのターゲットDNA又はRNAと
の非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション力に影響を与える非修飾
オリゴヌクレオチドの欠点(deficiency)は、多様な偏在的細胞内又は細胞外の、
ヌクレアーゼと呼ばれる核酸分解酵素によって非修飾オリゴヌクレオチドが分解
されることである。オリゴヌクレオチドが治療薬(therapeutics)又は診断薬(dia
gnostics)として有用であるためには、オリゴヌクレオチドは相補的ターゲット
核酸に対する強化された結合アフィニティを示すべきであり、好ましくはヌクレ
アーゼに対して妥当に安定であり、分解に耐性であるべきである。例えば研究試
薬としての非細胞的使用のためには、オリゴヌクレオチドは必ずしもヌクレアー
ゼ安定性を有する必要はない。
治療用途のために及び研究試薬として開発され、用いられている。治療薬として
の使用に関しては、オリゴヌクレオチドは好ましくは細胞膜を横切って輸送され
るか又は細胞に吸収されて、ターゲットDNA又はRNAと適当にハイブリダイ
ズする。これらの機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期安
定性に依存すると考えられる。治療目的のためのターゲットDNA又はRNAと
の非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション力に影響を与える非修飾
オリゴヌクレオチドの欠点(deficiency)は、多様な偏在的細胞内又は細胞外の、
ヌクレアーゼと呼ばれる核酸分解酵素によって非修飾オリゴヌクレオチドが分解
されることである。オリゴヌクレオチドが治療薬(therapeutics)又は診断薬(dia
gnostics)として有用であるためには、オリゴヌクレオチドは相補的ターゲット
核酸に対する強化された結合アフィニティを示すべきであり、好ましくはヌクレ
アーゼに対して妥当に安定であり、分解に耐性であるべきである。例えば研究試
薬としての非細胞的使用のためには、オリゴヌクレオチドは必ずしもヌクレアー
ゼ安定性を有する必要はない。
【0011】 ターゲットDNA又はRNAに対するオリゴヌクレオチドの結合アフィニティ
を高め、ヌクレアーゼ分解を阻止するためにオリゴヌクレオチド中に多くの化学
的修飾が導入されている。修飾は例えばヌクレアーゼに対する耐性を高めるため
にホスフェート・バックボーン(phosphate backbone)になされている。これらの
修飾は例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエー
トのような結合の使用と、例えば2’−O−アルキルリボースのような修飾糖部
分の使用を包含する。他のオリゴヌクレオチド修飾は、吸収(uptake)と細胞内分
配をモジュレートするためになされた修飾を包含する。ヌクレオチド間結合の性
質を劇的に変える多くの修飾も文献に報告されている。これらは非リン結合、ペ
プチド核酸(PNA’s)結合及び2’−5’結合を包含する。通常は診断及び
研究用途のための、オリゴヌクレオチドに対する他の修飾は、非同位体標識、例
えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ又は
他のレポーター分子によって標識することである。
を高め、ヌクレアーゼ分解を阻止するためにオリゴヌクレオチド中に多くの化学
的修飾が導入されている。修飾は例えばヌクレアーゼに対する耐性を高めるため
にホスフェート・バックボーン(phosphate backbone)になされている。これらの
修飾は例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエー
トのような結合の使用と、例えば2’−O−アルキルリボースのような修飾糖部
分の使用を包含する。他のオリゴヌクレオチド修飾は、吸収(uptake)と細胞内分
配をモジュレートするためになされた修飾を包含する。ヌクレオチド間結合の性
質を劇的に変える多くの修飾も文献に報告されている。これらは非リン結合、ペ
プチド核酸(PNA’s)結合及び2’−5’結合を包含する。通常は診断及び
研究用途のための、オリゴヌクレオチドに対する他の修飾は、非同位体標識、例
えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ又は
他のレポーター分子によって標識することである。
【0012】 最近10年間にわたって、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めるために又は
ターゲットmRNAに対するアンチセンス鎖のアフィニティを強化するために、
多様な合成的修飾が提案されている(Crooke等,Med.Res.Rev
.,1996,16,319−344;De Mesmaeker等,ACC.
Chem.Res.,1995,28,366−374)。オリゴヌクレオチド
中の天然の、容易に開裂されるホスホジエステル結合に代わるものとして多様な
修飾リン含有結合が研究されている。一般に、たいていのこのような修飾リン含
有結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、
ホスホネート及びホスホロジチオエートは全て、相補的ターゲットへの結合の減
少とハイブリッド安定性の低下とを有するオリゴヌクレオチドを生じる。
ターゲットmRNAに対するアンチセンス鎖のアフィニティを強化するために、
多様な合成的修飾が提案されている(Crooke等,Med.Res.Rev
.,1996,16,319−344;De Mesmaeker等,ACC.
Chem.Res.,1995,28,366−374)。オリゴヌクレオチド
中の天然の、容易に開裂されるホスホジエステル結合に代わるものとして多様な
修飾リン含有結合が研究されている。一般に、たいていのこのような修飾リン含
有結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、
ホスホネート及びホスホロジチオエートは全て、相補的ターゲットへの結合の減
少とハイブリッド安定性の低下とを有するオリゴヌクレオチドを生じる。
【0013】 “A形”構造(geometry)と呼ばれているRNAが存在し、DNAは“B形”構
造で存在する。一般に、RNA:RNA二本鎖はDNA:DNA二本鎖よりも安
定である、又はより高い融解温度(Tm)を有する(Sanger等,Prin
ciples of Nucleic Acid Structure,198
4,Springer−Verlag,New York,NY;Lesnik
等,Biochemistry,1995,34,10807−10815;C
onte等,Nucleic Acids Res.,1997,25,262
7−2634)。RNAの大きい安定性は幾つかの構造的特徴、最も著しくは、
A形構造に起因する、改良された塩基重層相互作用によるものと考えられている
(Searle等,Nucleic Acids Res.,1993,21,
2051−2056)。RNA中の2’ヒドロキシルの存在は糖を、ノーザンパ
ッカーとも呼ばれるC3’エンドパッカー方向に偏らせ、二本鎖をA形構造に有
利にする。 他方では、デオキシ核酸はC2’エンド糖パッカーに有利であり、C2’エンド
パッカー、即ち、サザンパッカーとしても知られるものは安定性の低いB形構造
を与えると考えられる(Sanger,W.(1984)Principles
of Nucleic Acid Structure,Springer−
Verlag,New York,NY)。さらに、RNAの2’ヒドロキシル
基は、RNA二本鎖の安定化に役立つ水仲介水素結合のネットワークを形成する
ことができる(Egli等,Biochemistry,1996,35,84
89−8494)。
造で存在する。一般に、RNA:RNA二本鎖はDNA:DNA二本鎖よりも安
定である、又はより高い融解温度(Tm)を有する(Sanger等,Prin
ciples of Nucleic Acid Structure,198
4,Springer−Verlag,New York,NY;Lesnik
等,Biochemistry,1995,34,10807−10815;C
onte等,Nucleic Acids Res.,1997,25,262
7−2634)。RNAの大きい安定性は幾つかの構造的特徴、最も著しくは、
A形構造に起因する、改良された塩基重層相互作用によるものと考えられている
(Searle等,Nucleic Acids Res.,1993,21,
2051−2056)。RNA中の2’ヒドロキシルの存在は糖を、ノーザンパ
ッカーとも呼ばれるC3’エンドパッカー方向に偏らせ、二本鎖をA形構造に有
利にする。 他方では、デオキシ核酸はC2’エンド糖パッカーに有利であり、C2’エンド
パッカー、即ち、サザンパッカーとしても知られるものは安定性の低いB形構造
を与えると考えられる(Sanger,W.(1984)Principles
of Nucleic Acid Structure,Springer−
Verlag,New York,NY)。さらに、RNAの2’ヒドロキシル
基は、RNA二本鎖の安定化に役立つ水仲介水素結合のネットワークを形成する
ことができる(Egli等,Biochemistry,1996,35,84
89−8494)。
【0014】 しかし、DNA:RNAハイブリッド二本鎖は通常はRNA:RNA二本鎖よ
りも安定性が低く、それらの配列に依存して、DNA:DNA二本鎖よりも高い
安定性でも、低い安定性でもありうる(Searle等,Nucleic Ac
ids Res.,1993,21,2051−2056)。ハイブリッド二本
鎖の構造は、A形構造とB形構造との中間であり、不良な重層相互作用を生じう
る(Lane等,Eur.J.Biochem.,1993,215,297−
306;Fedoroff等,J.Mol.Biol.,1993,233,5
09−523;Gonzalez等,Biochemistry,1995,3
4,4969−4982;Horton等,J.Mol.Biol.,1996
,264,521−533)。提案された機構としてのアンチセンス治療法の重
要な態様であるDNA:RNAハイブリッドの安定性は、mRNA鎖への修飾D
NA鎖の結合を必要とする。理想的には、アンチセンスDNAはmRNAとの非
常に大きい結合アフィニティを有するべきである。さもなくば、DNAとターゲ
ットmRNA鎖との間の所望の相互作用が生ずることがまれになり、それによっ
てアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効力が低下する。
りも安定性が低く、それらの配列に依存して、DNA:DNA二本鎖よりも高い
安定性でも、低い安定性でもありうる(Searle等,Nucleic Ac
ids Res.,1993,21,2051−2056)。ハイブリッド二本
鎖の構造は、A形構造とB形構造との中間であり、不良な重層相互作用を生じう
る(Lane等,Eur.J.Biochem.,1993,215,297−
306;Fedoroff等,J.Mol.Biol.,1993,233,5
09−523;Gonzalez等,Biochemistry,1995,3
4,4969−4982;Horton等,J.Mol.Biol.,1996
,264,521−533)。提案された機構としてのアンチセンス治療法の重
要な態様であるDNA:RNAハイブリッドの安定性は、mRNA鎖への修飾D
NA鎖の結合を必要とする。理想的には、アンチセンスDNAはmRNAとの非
常に大きい結合アフィニティを有するべきである。さもなくば、DNAとターゲ
ットmRNA鎖との間の所望の相互作用が生ずることがまれになり、それによっ
てアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効力が低下する。
【0015】 増強したヌクレアーゼ耐性と、ヌクレオチドに対する非常に大きい結合アフィ
ニティとを与える合成2’−修飾の1つは2’−メトキシエトキシ(MOE,2
’−OCH2CH2OCH3)である(Baker等,J.Biol.Chem.
,1997,272,11944−12000;Freier等,Nuclei
c Acids Res.,1997,25,4429−4443)。MOE置
換の直接の利益の1つは、例えばO−メチル、O−プロピル及びO−アミノプロ
ピルのような、多くの同様な2’修飾よりも大きい結合アフィニティの改良であ
る(FreierとAltmann,Nucleic Acids Resea
rch,(1997)25:4429−4443)。2’−O−メトキシエチル
置換もin vivo使用のために有望な特徴(feature)を有する、遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤であることが判明している(Martin,P.,Hel
v.Chim.Acta.1995,78,486−504;Altmann等
,Chimia,1996,50,168−176;Altmann等,Bio
chim.Soc.Trans.,1996,24,630−637;及びAl
tmann等,Nucleosides Nucleotides,1997,
16,917−926)。DNAに比べて、これらは改良されたRNAアフィニ
ティと大きいヌクレアーゼ耐性とを示す。2’−O−メトキシエチル−リボヌク
レオシド・ウィング(wings) と中央のDNA−ホスホロチオエート・ウィンドウとを有するキメラ・オリゴヌ
クレオチドも動物モデルにおける腫瘍の増殖を低用量で効果的に減ずることが判
明している。MOE置換オリゴヌクレオチドは幾つかの疾患状態においてアンチ
センス作用剤としての優れた見込みを示している。このようなMOE置換オリゴ
ヌクレオチドの1つは、CMV網膜炎の治療のための臨床トライアルで現在研究
されている。
ニティとを与える合成2’−修飾の1つは2’−メトキシエトキシ(MOE,2
’−OCH2CH2OCH3)である(Baker等,J.Biol.Chem.
,1997,272,11944−12000;Freier等,Nuclei
c Acids Res.,1997,25,4429−4443)。MOE置
換の直接の利益の1つは、例えばO−メチル、O−プロピル及びO−アミノプロ
ピルのような、多くの同様な2’修飾よりも大きい結合アフィニティの改良であ
る(FreierとAltmann,Nucleic Acids Resea
rch,(1997)25:4429−4443)。2’−O−メトキシエチル
置換もin vivo使用のために有望な特徴(feature)を有する、遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤であることが判明している(Martin,P.,Hel
v.Chim.Acta.1995,78,486−504;Altmann等
,Chimia,1996,50,168−176;Altmann等,Bio
chim.Soc.Trans.,1996,24,630−637;及びAl
tmann等,Nucleosides Nucleotides,1997,
16,917−926)。DNAに比べて、これらは改良されたRNAアフィニ
ティと大きいヌクレアーゼ耐性とを示す。2’−O−メトキシエチル−リボヌク
レオシド・ウィング(wings) と中央のDNA−ホスホロチオエート・ウィンドウとを有するキメラ・オリゴヌ
クレオチドも動物モデルにおける腫瘍の増殖を低用量で効果的に減ずることが判
明している。MOE置換オリゴヌクレオチドは幾つかの疾患状態においてアンチ
センス作用剤としての優れた見込みを示している。このようなMOE置換オリゴ
ヌクレオチドの1つは、CMV網膜炎の治療のための臨床トライアルで現在研究
されている。
【0016】 2’−O−メトキシエチル修飾の使用を含めた、オリゴヌクレオチドの既知修
飾は種々な用途のためのオリゴヌクレオチドの開発に寄与しているが、オリゴヌ
クレオチド類とそれらの類似体に強化されたハイブリッド結合アフィニティ及び
/又は増強されたヌクレアーゼ耐性を与えるさらなる修飾の必要性が当該技術分
野になおも存在する。
飾は種々な用途のためのオリゴヌクレオチドの開発に寄与しているが、オリゴヌ
クレオチド類とそれらの類似体に強化されたハイブリッド結合アフィニティ及び
/又は増強されたヌクレアーゼ耐性を与えるさらなる修飾の必要性が当該技術分
野になおも存在する。
【0017】 発明の概要 本発明は少なくとも1つの2’−O−CH2CH2−O−CH2CH2−N(R1
)(R2)修飾ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物を提供する。本発明の好
ましいオリゴマー化合物は式:
)(R2)修飾ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物を提供する。本発明の好
ましいオリゴマー化合物は式:
【化3】 [式中、Bxは複素環式塩基であり; R1とR2の各々は独立的にH、窒素保護基、置換若しくは非置換C1−C10ア
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、任意にNとOから選択される
付加的なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示される、少なくとも1つのヌクレオシドを包含す
るオリゴマー化合物である。
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、任意にNとOから選択される
付加的なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示される、少なくとも1つのヌクレオシドを包含す
るオリゴマー化合物である。
【0018】 1実施態様では、R1はH、C1−C10アルキル又はC1−C10置換アルキルで
あり、R2はC1−C10置換アルキルである。他の実施態様では、R1はC1−C10 アルキルである。さらなる実施態様では、R2はC1−C10置換アルキルであり、
置換基はNH3 +又はN(R3)(R4)である。他の実施態様では、R1とR2は両
方ともC1−C10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にNH3 +又はN
(R3)(R4)から選択される。さらに他の実施態様では、R1とR2の両方がC 1 −C10アルキルである。
あり、R2はC1−C10置換アルキルである。他の実施態様では、R1はC1−C10 アルキルである。さらなる実施態様では、R2はC1−C10置換アルキルであり、
置換基はNH3 +又はN(R3)(R4)である。他の実施態様では、R1とR2は両
方ともC1−C10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にNH3 +又はN
(R3)(R4)から選択される。さらに他の実施態様では、R1とR2の両方がC 1 −C10アルキルである。
【0019】 1実施態様では、R1とR2が、NとOから選択される少なくとも1つのヘテロ
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
C1−C12アルキルである。
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
C1−C12アルキルである。
【0020】 1実施態様では、複素環式塩基はプリン又はピリミジンであり、好ましい複素
環式塩基はアデニン、シトシン、5−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は2−アミノアデニンである。
環式塩基はアデニン、シトシン、5−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は2−アミノアデニンである。
【0021】 1実施態様では、オリゴマー化合物は約5〜約50個のヌクレオシドを含む。
好ましい実施態様では、オリゴマー化合物は約8〜約30個のヌクレオシドを含
み、好ましい範囲は約15〜約25個のヌクレオシドである。
好ましい実施態様では、オリゴマー化合物は約8〜約30個のヌクレオシドを含
み、好ましい範囲は約15〜約25個のヌクレオシドである。
【0022】 本発明はまた、式:
【化4】 [式中、Bxは複素環式塩基であり; T1とT2は独立的にOH、保護されたヒドロキシル、活性化リン基、ヌクレオ
チド間結合を形成するための反応性基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオシド、オリゴヌクレオチド、又は固体サポートへの結合である; R1とR2の各々は独立的にH、窒素保護基、置換若しくは非置換C1−C10ア
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、NとOから選択される付加的
なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示されるヌクレオシド化合物をも包含する。
チド間結合を形成するための反応性基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオシド、オリゴヌクレオチド、又は固体サポートへの結合である; R1とR2の各々は独立的にH、窒素保護基、置換若しくは非置換C1−C10ア
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、NとOから選択される付加的
なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示されるヌクレオシド化合物をも包含する。
【0023】 1実施態様では、R1はH、C1−C10アルキル又はC1−C10置換アルキルで
あり、R2はC1−C10置換アルキルである。他の実施態様では、R1はC1−C10 アルキルである。さらなる実施態様では、R2はC1−C10置換アルキルであり、
置換基はNH3 +又はN(R3)(R4)である。他の実施態様では、R1とR2は両
方ともC1−C10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にNH3 +とN(
R3)(R4)から選択される。さらに他の実施態様では、R1とR2は両方ともC 1 −C10アルキルである。
あり、R2はC1−C10置換アルキルである。他の実施態様では、R1はC1−C10 アルキルである。さらなる実施態様では、R2はC1−C10置換アルキルであり、
置換基はNH3 +又はN(R3)(R4)である。他の実施態様では、R1とR2は両
方ともC1−C10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にNH3 +とN(
R3)(R4)から選択される。さらに他の実施態様では、R1とR2は両方ともC 1 −C10アルキルである。
【0024】 1実施態様では、R1とR2は、NとOから選択される少なくとも1つのヘテロ
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
C1−C12アルキルである。
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
C1−C12アルキルである。
【0025】 1実施態様では、複素環式塩基はプリン又はピリミジンであり、好ましい複素
環式塩基はアデニン、シトシン、5−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は2−アミノアデニンである。
環式塩基はアデニン、シトシン、5−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は2−アミノアデニンである。
【0026】 1実施態様では、T1はヒドロキシル保護基である。他の実施態様では、T2は
活性化リン基又は固体サポートへの結合である。好ましい固体サポート物質は微
粒子である。CPGがより好ましい固体サポート物質である。
活性化リン基又は固体サポートへの結合である。好ましい固体サポート物質は微
粒子である。CPGがより好ましい固体サポート物質である。
【0027】 発明の詳細な説明 本発明は新規な2’−O−修飾ヌクレオシドモノマーと、これらの新規な2’
−O−修飾ヌクレオシドモノマーを組み入れたオリゴマー化合物とに関する。こ
れらの修飾は、結合アフィニティ及び/又はヌクレアーゼ耐性の増強に寄与する
、ある一定の望ましい性質を有する。
−O−修飾ヌクレオシドモノマーを組み入れたオリゴマー化合物とに関する。こ
れらの修飾は、結合アフィニティ及び/又はヌクレアーゼ耐性の増強に寄与する
、ある一定の望ましい性質を有する。
【0028】 強化された結合アフィニティを有するオリゴマー化合物を設計する場合に、考
慮すべき多くのアイテムが存在する。非常に高いRNA結合アフィニティを有す
るオリゴマー化合物を構築するための効果的なアプローチの1つは、各々が結合
アフィニティのために重要であると考えられる種々な要因に有利に寄与する、2
種類以上の異なる修飾の組み合わせに関する。
慮すべき多くのアイテムが存在する。非常に高いRNA結合アフィニティを有す
るオリゴマー化合物を構築するための効果的なアプローチの1つは、各々が結合
アフィニティのために重要であると考えられる種々な要因に有利に寄与する、2
種類以上の異なる修飾の組み合わせに関する。
【0029】 FreierとAltmannのNucleic Acids Resear
ch,(1997)25:4429−4443は最近、ターゲットRNAとオリ
ゴヌクレオチドとの二本鎖の安定性に対するオリゴヌクレオチドの構造的修飾の
影響に関する研究を発表した。この研究で、著者は200種類を超える修飾を含
有するオリゴヌクレオチド系列を検討し、これらのオリゴヌクレオチド系列を合
成し、それらのハイブリダイゼーション・アフィニティとTmとに関して評価し
ている。 研究された糖修飾は糖の2’位の置換、3’−置換、4’−酸素の置換、二環式
糖の使用及び四員環置換を包含した。チミンの5又は6位における置換、ピリミ
ジン複素環の修飾、及びプリン複素環の修飾を含めた、幾つかの複素環式塩基の
修飾も研究されている。リン含有バックボーン、リン原子を含有しないバックボ
ーン及び中性であるバックボーンを含めた、非常に多くのバックボーン修飾も研
究されている。
ch,(1997)25:4429−4443は最近、ターゲットRNAとオリ
ゴヌクレオチドとの二本鎖の安定性に対するオリゴヌクレオチドの構造的修飾の
影響に関する研究を発表した。この研究で、著者は200種類を超える修飾を含
有するオリゴヌクレオチド系列を検討し、これらのオリゴヌクレオチド系列を合
成し、それらのハイブリダイゼーション・アフィニティとTmとに関して評価し
ている。 研究された糖修飾は糖の2’位の置換、3’−置換、4’−酸素の置換、二環式
糖の使用及び四員環置換を包含した。チミンの5又は6位における置換、ピリミ
ジン複素環の修飾、及びプリン複素環の修飾を含めた、幾つかの複素環式塩基の
修飾も研究されている。リン含有バックボーン、リン原子を含有しないバックボ
ーン及び中性であるバックボーンを含めた、非常に多くのバックボーン修飾も研
究されている。
【0030】 4種類の一般的なアプローチも可能性として、RNAターゲットへのオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションを改良するために用いることが考えられる
。これらは、オリゴヌクレオチド鎖の糖及びホスフェートの、ハイブリッド形成
に有利なコンフォメーションへの予備組織化、オリゴヌクレオチドのヌクレオシ
ドモノマーの複素環式塩基に極性化可能基を添加することによる核酸塩基重層の
改良、A−U対合のために利用可能なH結合数の増加、及び好ましくない反撥相
互作用の除去を促進するためのバックボーン電荷の中和を包含する。本発明は特
にこれらのうちの最初のアプローチ、即ち、オリゴデオキシヌクレオチド鎖の糖
及びホスフェートの、ハイブリッド形成に有利なコンフォメーションへの予備組
織化を用いるが、これは他の3アプローチと組み合わせて用いることができる。
クレオチドのハイブリダイゼーションを改良するために用いることが考えられる
。これらは、オリゴヌクレオチド鎖の糖及びホスフェートの、ハイブリッド形成
に有利なコンフォメーションへの予備組織化、オリゴヌクレオチドのヌクレオシ
ドモノマーの複素環式塩基に極性化可能基を添加することによる核酸塩基重層の
改良、A−U対合のために利用可能なH結合数の増加、及び好ましくない反撥相
互作用の除去を促進するためのバックボーン電荷の中和を包含する。本発明は特
にこれらのうちの最初のアプローチ、即ち、オリゴデオキシヌクレオチド鎖の糖
及びホスフェートの、ハイブリッド形成に有利なコンフォメーションへの予備組
織化を用いるが、これは他の3アプローチと組み合わせて用いることができる。
【0031】 DNA:RNAハイブリッド二本鎖中の糖はしばしばC3’エンドコンフォメ
ーションを採る。したがって、一本鎖中の糖部分のコンフォメーション平衡をこ
のコンフォメーション方向へシフトさせる修飾が、RNAへの結合のためにアン
チセンス鎖を予備組織化する筈である。文献に報告され、研究されている幾つか
の糖修飾のうちで、例えば2’−フルオロ又は2’−アルコキシのような電気陰
性置換基の組み込みが糖コンフォメーションを3’エンド(ノーザン)パッカー
・コンフォメーション方向にシフトする。このパッカー・コンフォメーションは
、そのターゲットを有するオリゴヌクレオチドのTmの上昇をさらに助成した。
ーションを採る。したがって、一本鎖中の糖部分のコンフォメーション平衡をこ
のコンフォメーション方向へシフトさせる修飾が、RNAへの結合のためにアン
チセンス鎖を予備組織化する筈である。文献に報告され、研究されている幾つか
の糖修飾のうちで、例えば2’−フルオロ又は2’−アルコキシのような電気陰
性置換基の組み込みが糖コンフォメーションを3’エンド(ノーザン)パッカー
・コンフォメーション方向にシフトする。このパッカー・コンフォメーションは
、そのターゲットを有するオリゴヌクレオチドのTmの上昇をさらに助成した。
【0032】 2’位における置換基サイズと二本鎖安定性との間には明確な相関関係が存在
する。2’位におけるアルキル置換基の組み込みは典型的に結合アフィニティを
有意に低下させる。したがって、小さいアルコキシ基が一般に非常に有利であり
、2’位における大きいアルコキシ基は一般に不利である。しかし、2’−置換
基がエチレングリコール・モチーフを含有した場合には、ターゲットRNAへの
結合アフィニティの強い改良が観察される。
する。2’位におけるアルキル置換基の組み込みは典型的に結合アフィニティを
有意に低下させる。したがって、小さいアルコキシ基が一般に非常に有利であり
、2’位における大きいアルコキシ基は一般に不利である。しかし、2’−置換
基がエチレングリコール・モチーフを含有した場合には、ターゲットRNAへの
結合アフィニティの強い改良が観察される。
【0033】 2’−置換基に起因する大きい結合アフィニティはある程度はC3’エンド糖
パッカーを生じる2’−置換によるとされており、このパッカーが次にオリゴマ
ーに有利なA形様構造を与えることができる。これは、多様な電気陰性基(例え
ば、フルオロ及びO−アルキル鎖)による2’位の置換はC3’エンド糖パッカ
ーリング(puckering)を生じることが実証されているので、妥当な仮説である(
De Mesmaeker等,Acc.Chem.Res.,1995,28,
366−374;Lesnik等,Biochemistry,1993,32
,7832−7838)。
パッカーを生じる2’−置換によるとされており、このパッカーが次にオリゴマ
ーに有利なA形様構造を与えることができる。これは、多様な電気陰性基(例え
ば、フルオロ及びO−アルキル鎖)による2’位の置換はC3’エンド糖パッカ
ーリング(puckering)を生じることが実証されているので、妥当な仮説である(
De Mesmaeker等,Acc.Chem.Res.,1995,28,
366−374;Lesnik等,Biochemistry,1993,32
,7832−7838)。
【0034】 さらに、エチレングリコール・モチーフを含有する2’−置換基に関して、側
鎖のO−C−C−Oねじれ周囲の酸素原子間のゴーシュ相互作用(gauche intera
ction)は二本鎖に安定化効果を及ぼすことができる(Freier等,Nucl
eic Acids Research,(1997)25:4429−444
2)。このようなゴーシュ相互作用は多年にわたって実験的に観察されている(
Wolfe等,Acc.Chem.Res.,1972,5,102;Abe等
,J.Am.Chem.Soc.,1976,98,468)。このゴーシュ効
果は、二本鎖形成に有利である側鎖の配置(configuration)を生じることができ
る。 この安定化配置の正確な性質はまだ説明されていない。本発明者らは理論によっ
て縛られることを望むわけではないが、アルキル側鎖に見られるランダムな分布
ではなく、単一ゴーシュ配置にO−C−C−Oねじれを保持することが二本鎖形
成のためのエントロピー的利益を与えると考えられる。
鎖のO−C−C−Oねじれ周囲の酸素原子間のゴーシュ相互作用(gauche intera
ction)は二本鎖に安定化効果を及ぼすことができる(Freier等,Nucl
eic Acids Research,(1997)25:4429−444
2)。このようなゴーシュ相互作用は多年にわたって実験的に観察されている(
Wolfe等,Acc.Chem.Res.,1972,5,102;Abe等
,J.Am.Chem.Soc.,1976,98,468)。このゴーシュ効
果は、二本鎖形成に有利である側鎖の配置(configuration)を生じることができ
る。 この安定化配置の正確な性質はまだ説明されていない。本発明者らは理論によっ
て縛られることを望むわけではないが、アルキル側鎖に見られるランダムな分布
ではなく、単一ゴーシュ配置にO−C−C−Oねじれを保持することが二本鎖形
成のためのエントロピー的利益を与えると考えられる。
【0035】 本発明は、式:2’−OCH2CH2OCH2CH2N(R1)(R2)[式中、R 1 とR2はそれぞれアルキル又は置換アルキル基であることができる]を有して、
プロトン化されうる第3級アミンを生じる2’側鎖を有する。R1とR2が両方と
もメチル基であるときに、側鎖のpKaは9.0〜10.0である(脂肪族飽和
3°アミン)。この第3級アミンは生理的pH(7.0)において、及びエンド
ソームとリソソーム(pH5.0)中でプロトン化されると期待される。得られ
る正電荷はヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合するのを阻害するか又はヌ
クレアーゼがその機能を発揮するために必要な金属イオンを排除することによっ
て、薬物の生体内安定性(biostability)を改良することになる(Beese等,
EMBO J.,1991,10,25−33;及びBrautigam等,J
.Mol.Bio.,1998,277,363−377)。
プロトン化されうる第3級アミンを生じる2’側鎖を有する。R1とR2が両方と
もメチル基であるときに、側鎖のpKaは9.0〜10.0である(脂肪族飽和
3°アミン)。この第3級アミンは生理的pH(7.0)において、及びエンド
ソームとリソソーム(pH5.0)中でプロトン化されると期待される。得られ
る正電荷はヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合するのを阻害するか又はヌ
クレアーゼがその機能を発揮するために必要な金属イオンを排除することによっ
て、薬物の生体内安定性(biostability)を改良することになる(Beese等,
EMBO J.,1991,10,25−33;及びBrautigam等,J
.Mol.Bio.,1998,277,363−377)。
【0036】 本明細書で用いる限り、“オリゴヌクレオシド”なる用語は、非リン結合部分
を有する2つ以上のヌクレオシド・サブユニットを含有するオリゴマー又はポリ
マーを包含する。本発明によるオリゴヌクレオシドは、グリコシル結合を通して
複素環式塩基に結合したリボフラノース部分を有するモノマーサブユニットであ
る。本発明のためにオリゴ−ヌクレオチド/ヌクレオシドは、非リン酸結合によ
って共有結合した少なくとも2つのヌクレオシドと、ヌクレオチドによる少なく
とも1つのリン含有共有結合を有する混合バックボーン・オリゴマーであり、こ
の場合にモノマーヌクレオチド又はヌクレオシド単位の少なくとも1つは本発明
の方法を用いて製造された2’−O−置換化合物である。オリゴ−ヌクレオチド
/ヌクレオシドは、リン含有及び/又は非リン含有結合によってカップリングし
た複数個のヌクレオチドとヌクレオシドとを付加的に有することができる。
を有する2つ以上のヌクレオシド・サブユニットを含有するオリゴマー又はポリ
マーを包含する。本発明によるオリゴヌクレオシドは、グリコシル結合を通して
複素環式塩基に結合したリボフラノース部分を有するモノマーサブユニットであ
る。本発明のためにオリゴ−ヌクレオチド/ヌクレオシドは、非リン酸結合によ
って共有結合した少なくとも2つのヌクレオシドと、ヌクレオチドによる少なく
とも1つのリン含有共有結合を有する混合バックボーン・オリゴマーであり、こ
の場合にモノマーヌクレオチド又はヌクレオシド単位の少なくとも1つは本発明
の方法を用いて製造された2’−O−置換化合物である。オリゴ−ヌクレオチド
/ヌクレオシドは、リン含有及び/又は非リン含有結合によってカップリングし
た複数個のヌクレオチドとヌクレオシドとを付加的に有することができる。
【0037】 本発明に関連して、“オリゴマー化合物”なる用語は、天然及び非天然生成ヌ
クレオシドから特定の配列で一緒に結合した、複数個のヌクレオシドを意味する
。この用語はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、非リン含有ヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、及び総てリン含有ヌクレオシド間
結合又はリン含有ヌクレオシド間結合と非リン含有ヌクレオシド間結合とを包含
しうる混合ヌクレオシド間結合を有するキメラ・オリゴマー化合物を包含する。
本発明のオリゴマー化合物の各々は少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを有し、
この場合に修飾は本発明のアミノオキシ化合物である。本発明の好ましいヌクレ
オシドはリン結合を経て糖部分を通して結合するものであり、アデニン、グアニ
ン、アデニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、2
−アミノアデニン、6−メチル、2−プロピル及び他のアルキルアデニン、5−
ハロウラシル、5−ハロシトシン、6−アザウラシル、6−アザシトシン及び6
−アザチミン、プソイドウラシル、4−チオウラシル、8−ハロアデニン、8−
アミノアデニン、8−チオールアデニン、8−チオールアルキルアデニン、8−
ヒドロキシルアデニン及び他の8−置換アデニン、8−ハログアニン、8−アミ
ノグアニン、8−チオールグアニン、8−チオールアルキルグアニン、8−ヒド
ロキシルグアニン及び他の8−置換グアニン、他のアザ及びデアザウラシル、他
のアザ及びデアザチミジン、他のアザ及びデアザシトシン、他のアザ及びデアザ
アデニン、他のアザ及びデアザグアニン、5−トリフルオロメチルウラシル、及
び5−トリフルオロシトシンを包含する。
クレオシドから特定の配列で一緒に結合した、複数個のヌクレオシドを意味する
。この用語はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、非リン含有ヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、及び総てリン含有ヌクレオシド間
結合又はリン含有ヌクレオシド間結合と非リン含有ヌクレオシド間結合とを包含
しうる混合ヌクレオシド間結合を有するキメラ・オリゴマー化合物を包含する。
本発明のオリゴマー化合物の各々は少なくとも1つの修飾ヌクレオシドを有し、
この場合に修飾は本発明のアミノオキシ化合物である。本発明の好ましいヌクレ
オシドはリン結合を経て糖部分を通して結合するものであり、アデニン、グアニ
ン、アデニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、2
−アミノアデニン、6−メチル、2−プロピル及び他のアルキルアデニン、5−
ハロウラシル、5−ハロシトシン、6−アザウラシル、6−アザシトシン及び6
−アザチミン、プソイドウラシル、4−チオウラシル、8−ハロアデニン、8−
アミノアデニン、8−チオールアデニン、8−チオールアルキルアデニン、8−
ヒドロキシルアデニン及び他の8−置換アデニン、8−ハログアニン、8−アミ
ノグアニン、8−チオールグアニン、8−チオールアルキルグアニン、8−ヒド
ロキシルグアニン及び他の8−置換グアニン、他のアザ及びデアザウラシル、他
のアザ及びデアザチミジン、他のアザ及びデアザシトシン、他のアザ及びデアザ
アデニン、他のアザ及びデアザグアニン、5−トリフルオロメチルウラシル、及
び5−トリフルオロシトシンを包含する。
【0038】 リン含有結合 ホスホロジチオエート(−O−P(S)(S)−O−); ホスホロチオエート(−O−P(S)(O)−O−); ホスホロアミデート(−O−P(O)(NJ)−O−); ホスホネート(−O−P(J)(O)−O−); ホスホトリエステル(−O−P(OJ)(O)−O−); ホホスホロアミデート(phophosphoramidate)(−O−P(O)(NJ)−S−
); チオノアルキルホスホネート(−O−P(S)(J)−O−); チオノアルキルホスホトリエステル(−O−P(O)(OJ)−S−); ボラノホスフェート(−R5−P(O)(O)−J−);
); チオノアルキルホスホネート(−O−P(S)(J)−O−); チオノアルキルホスホトリエステル(−O−P(O)(OJ)−S−); ボラノホスフェート(−R5−P(O)(O)−J−);
【0039】 非リン含有結合 チオジエステル(−O−C(O)−S−); チオノカルバメート(−O−C(O)(NJ)−S−); シロキサン(−O−Si(J)2−O−); カルバメート(−O−C(O)−NH−及び−NH−C(O)−O−); スルファメート(−O−S(O)(O)−N−及び−N−S(O)(O)−N
−); モルホリノスルファミド(−O−S(O)(N(モルホリノ)−); スルホンアミド(−O−SO2−NH−); スルフィド(−CH2−S−CH2−); スルホネート(−O−SO2−CH2−); N,N’−ジメチルヒドラジン(−CH2−N(CH3)−N(CH3)−); チオホルムアセタール(−S−CH2−O−); ホルムアセタール(−O−CH2−O−); チオケタール(−S−C(J)2−O−);及び ケタール(−O−C(J)2−O−); アミン(−NH−CH2−CH2−); ヒドロキシルアミン(−CH2−N(J)−O−); ヒドロキシルイミン(−CH=N−O−);並びに ヒドラジニル(−CH2−N(H)−N(H)−)。
−); モルホリノスルファミド(−O−S(O)(N(モルホリノ)−); スルホンアミド(−O−SO2−NH−); スルフィド(−CH2−S−CH2−); スルホネート(−O−SO2−CH2−); N,N’−ジメチルヒドラジン(−CH2−N(CH3)−N(CH3)−); チオホルムアセタール(−S−CH2−O−); ホルムアセタール(−O−CH2−O−); チオケタール(−S−C(J)2−O−);及び ケタール(−O−C(J)2−O−); アミン(−NH−CH2−CH2−); ヒドロキシルアミン(−CH2−N(J)−O−); ヒドロキシルイミン(−CH=N−O−);並びに ヒドラジニル(−CH2−N(H)−N(H)−)。
【0040】 上記において、“J”は置換基を意味し、一般に水素又はアルキル基又はより
複雑な基であり、結合の種類によって変化する。
複雑な基であり、結合の種類によって変化する。
【0041】 天然生成結合の−O−P−O−原子の修飾又は置換を包含する上記連結基(lin
king group)の他に、5’−メチレン基並びに1つ以上の−O−P−O−原子の
修飾を包含する連結基も本発明の範囲内に含まれる。この種類の結合は先行技術
に充分に記録されており、非限定的に下記:アミド(−CH2−CH2−N(H)
−C(O))と−CH2−O−N=CH−;及びアルキルリン(−C(J)2−P
(=O)(OJ)−C(J)2−C(J)2−)を包含する。式中、Jは上述した
通りである。
king group)の他に、5’−メチレン基並びに1つ以上の−O−P−O−原子の
修飾を包含する連結基も本発明の範囲内に含まれる。この種類の結合は先行技術
に充分に記録されており、非限定的に下記:アミド(−CH2−CH2−N(H)
−C(O))と−CH2−O−N=CH−;及びアルキルリン(−C(J)2−P
(=O)(OJ)−C(J)2−C(J)2−)を包含する。式中、Jは上述した
通りである。
【0042】 上述した置換ヌクレオシド間結合を合成するための合成スキームは、WO91
/08213;WO90/15065;WO91/15500;WO92/20
822;WO92/20823;WO91/15500;WO89/12060
;EP216860;US92/04294;US90/03138;US91
/06855;US92/03385;US91/03680;米国特許第07
/990,848号;第07/892,902号;第07/806,710号;
第07/763,130号;第07/690,786号;第5,466,677
号;第5,034,506号;第5,124,047号;第5,278,302
号;第5,321,131号;第5,519,126号;第4,469,863
号;第5,455,233号;第5,214,134号;第5,470,967
号;第5,434,257号;Stirchak,E.P.等,Nucleic
Acid Res.,1989,17,6129−6141;Hewitt,
J.M.等,1992,11,1661−1666;Sood,A.等,J.A
m.Chem.Soc.,1990,112,9000−9001;Vaseu
r,J.J.等,J.Amer.Chem.Soc.,1992,114,40
06−4007;Musichi,B.等,J.Org.Chem.,1990
,55,4231−4233;Reynolds,R.C.等,J.Org.C
hem.,1992,57,2983−2985;Mertes,M.P.等,
J.Med.Chem.,1969,12,154−157;Mungall,
W.S.等,J.Org.Chem.,1977,42,703−706;St
irchak,E.P.等,J.Org.Chem.,1987,52,420
2−4206;Coull,J.M.等,Tet.Lett.,1987,28
,745;及びWang,H.等,Tet.Lett.,1991,32,73
85−7388に記載されている。
/08213;WO90/15065;WO91/15500;WO92/20
822;WO92/20823;WO91/15500;WO89/12060
;EP216860;US92/04294;US90/03138;US91
/06855;US92/03385;US91/03680;米国特許第07
/990,848号;第07/892,902号;第07/806,710号;
第07/763,130号;第07/690,786号;第5,466,677
号;第5,034,506号;第5,124,047号;第5,278,302
号;第5,321,131号;第5,519,126号;第4,469,863
号;第5,455,233号;第5,214,134号;第5,470,967
号;第5,434,257号;Stirchak,E.P.等,Nucleic
Acid Res.,1989,17,6129−6141;Hewitt,
J.M.等,1992,11,1661−1666;Sood,A.等,J.A
m.Chem.Soc.,1990,112,9000−9001;Vaseu
r,J.J.等,J.Amer.Chem.Soc.,1992,114,40
06−4007;Musichi,B.等,J.Org.Chem.,1990
,55,4231−4233;Reynolds,R.C.等,J.Org.C
hem.,1992,57,2983−2985;Mertes,M.P.等,
J.Med.Chem.,1969,12,154−157;Mungall,
W.S.等,J.Org.Chem.,1977,42,703−706;St
irchak,E.P.等,J.Org.Chem.,1987,52,420
2−4206;Coull,J.M.等,Tet.Lett.,1987,28
,745;及びWang,H.等,Tet.Lett.,1991,32,73
85−7388に記載されている。
【0043】 本発明のヌクレオシドモノマー及びオリゴマー化合物は修飾糖と修飾塩基とを
包含しうる(例えば、米国特許第3,687,808号とPCT出願PCT/U
S89/02323参照)。このようなオリゴマー化合物は、天然生成又は合成
野性型オリゴヌクレオチドとは構造的に区別可能であるが、まだこれらと機能的
に互換性であると最も良く述べられている。代表的な修飾糖は炭素環式又は非環
式糖、2’位に置換基を有する糖、3’位に置換基を有する糖、及び糖の1つ以
上の水素の代わりに置換基を有する糖を包含する。代表的な修飾は国際公報WO
91/10671(1991年7月25日公開)、WO92/02258(19
92年2月20日公開)、WO92/03568(1992年3月5日公開)、
及び米国特許第5,138,045号、第5,218,105号、第5,223
,618号、第5,359,044号、第5,378,825号、第5,386
,023号、第5,457,191号、第5,459,255号、第5,489
,677号、第5,506,351号、第5,541,307号、第5,543
,507号、第5,571,902号、第5,578,718号、第5,587
,361号、第5,587,469号に開示されており、これらは総て本出願の
譲受人に譲渡されている。上記公報の各々の開示は本明細書に援用される。
包含しうる(例えば、米国特許第3,687,808号とPCT出願PCT/U
S89/02323参照)。このようなオリゴマー化合物は、天然生成又は合成
野性型オリゴヌクレオチドとは構造的に区別可能であるが、まだこれらと機能的
に互換性であると最も良く述べられている。代表的な修飾糖は炭素環式又は非環
式糖、2’位に置換基を有する糖、3’位に置換基を有する糖、及び糖の1つ以
上の水素の代わりに置換基を有する糖を包含する。代表的な修飾は国際公報WO
91/10671(1991年7月25日公開)、WO92/02258(19
92年2月20日公開)、WO92/03568(1992年3月5日公開)、
及び米国特許第5,138,045号、第5,218,105号、第5,223
,618号、第5,359,044号、第5,378,825号、第5,386
,023号、第5,457,191号、第5,459,255号、第5,489
,677号、第5,506,351号、第5,541,307号、第5,543
,507号、第5,571,902号、第5,578,718号、第5,587
,361号、第5,587,469号に開示されており、これらは総て本出願の
譲受人に譲渡されている。上記公報の各々の開示は本明細書に援用される。
【0044】 例えば、3’末端ヌクレオシドモノマーの糖の3’−位置及び5’末端ヌクレ
オシドモノマーの5’−位置において他の修飾を行うこともできる。本発明の1
態様では、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取り込みを強化する、
部分又はコンジュゲートが修飾のために利用可能である1つ以上の位置に化学的
に結合される。このような部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のよ
うな脂質部分(Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,1989,86,6553)、コール酸(Manoharan等,B
ioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)、チオ
エーテル、例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan等,
Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306;Manoh
aran等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1993,3,2
765)、チオコレステロール(Oberhauser等,Nucl.Acid
s Res.,1992,20,533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオー
ル若しくはウンデシル残基(Saison−Behmoaras等,EMBO
J.,1991,10,111;Kabanov等,FEBS Lett.,1
990,259,327;Svinarchuk等,Biochimie,19
93,75,49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロ
ール又はトリエチルアンモニウム 1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グ
リセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan等,Tetrahedro
n Lett.,1995,36,3651;Shea等,Nucl.Acid
s Res.,1990,18,3777)、ポリアミン又はポリエチレングリ
コール鎖(Manoharan等,Nucleosides & Nucleo
sidic monomers、1995,14,969)、又はアダマンタン
酢酸(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,1995
,36,3651)、パルミチル部分(Mishra等,Biochim.Bi
ophys.Acta,1995,1264,229)、又はオクタデシルアミ
ン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Croo
ke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,9
23)を包含する。
オシドモノマーの5’−位置において他の修飾を行うこともできる。本発明の1
態様では、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取り込みを強化する、
部分又はコンジュゲートが修飾のために利用可能である1つ以上の位置に化学的
に結合される。このような部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のよ
うな脂質部分(Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,1989,86,6553)、コール酸(Manoharan等,B
ioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4,1053)、チオ
エーテル、例えば、ヘキシル−S−トリチルチオール(Manoharan等,
Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306;Manoh
aran等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1993,3,2
765)、チオコレステロール(Oberhauser等,Nucl.Acid
s Res.,1992,20,533)、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオー
ル若しくはウンデシル残基(Saison−Behmoaras等,EMBO
J.,1991,10,111;Kabanov等,FEBS Lett.,1
990,259,327;Svinarchuk等,Biochimie,19
93,75,49)、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−rac−グリセロ
ール又はトリエチルアンモニウム 1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グ
リセロ−3−H−ホスホネート(Manoharan等,Tetrahedro
n Lett.,1995,36,3651;Shea等,Nucl.Acid
s Res.,1990,18,3777)、ポリアミン又はポリエチレングリ
コール鎖(Manoharan等,Nucleosides & Nucleo
sidic monomers、1995,14,969)、又はアダマンタン
酢酸(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,1995
,36,3651)、パルミチル部分(Mishra等,Biochim.Bi
ophys.Acta,1995,1264,229)、又はオクタデシルアミ
ン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分(Croo
ke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,9
23)を包含する。
【0045】 本発明に受容される、代表的な複素環式塩基は、グアニン、シトシン、ウリジ
ン及びチミン、並びに他の合成及び天然核酸塩基、例えば、キサンチン、ヒポキ
サンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル及び他のア
ルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル及び他のアルキル誘導体、
5−ハロ ウラシル及びシトシン、6−アゾ ウラシル、シトシン及びチミン、
5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、オキサ、ア
ミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の8−置換アデニン及びグ
アニン、5−トリフルオロメチル及び他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−
メチルグアニンを包含する。他のプリン及びピリミジンは米国特許第3,687
,808号に開示されるもの、Concise Encyclopedia O
f Polymer Science And Engineering,85
8−859頁,Kroschwitz,J.I.編集,John Wiley
& Sons,1990に開示されるもの、及びEnglisch等,Ange
wandte Chemie,International Edition
1991,30,613に開示されるものを包含する。このようなオリゴマー化
合物は総て本発明によって包含される。
ン及びチミン、並びに他の合成及び天然核酸塩基、例えば、キサンチン、ヒポキ
サンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル及び他のア
ルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル及び他のアルキル誘導体、
5−ハロ ウラシル及びシトシン、6−アゾ ウラシル、シトシン及びチミン、
5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、オキサ、ア
ミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の8−置換アデニン及びグ
アニン、5−トリフルオロメチル及び他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−
メチルグアニンを包含する。他のプリン及びピリミジンは米国特許第3,687
,808号に開示されるもの、Concise Encyclopedia O
f Polymer Science And Engineering,85
8−859頁,Kroschwitz,J.I.編集,John Wiley
& Sons,1990に開示されるもの、及びEnglisch等,Ange
wandte Chemie,International Edition
1991,30,613に開示されるものを包含する。このようなオリゴマー化
合物は総て本発明によって包含される。
【0046】 本発明のオリゴマー化合物の製造に用いられるヌクレオシドモノマーは、例え
ば活性化リン酸(phosphate)基又は活性化亜リン酸(phosphite)基のような、適当
な活性化リン基を包含することができる。本明細書で用いる限り、活性化リン酸
基又は活性化亜リン酸基なる用語は、他のモノマー又はオリゴマー化合物のヒド
ロキシル基と反応して、リン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性化モノマー
又はオリゴマーを意味する。このような活性化リン基はPIII又はPV原子価状態
の活性化リン原子を含有する。このような活性化リン原子は当該技術分野で知ら
れており、非限定的に、ホスホロアミダイト、H−ホスホネート及びホスフェー
トトリエステルを包含する。好ましい合成固相合成(synthetic solid phase syn
thesis)は活性化ホスフェートとしてホスホロアミダイトを用いる。ホスホロア
ミダイトはPIII化学を用いる。中間体のホスフィット化合物を次に既知方法を
用いてPV状態に酸化して、好ましい実施態様では、ホスホジエステル又はホス
ホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生成する。他の活性化ホスフェート及び
ホスフィットはTetrahedron Report Number 309
(BeaucageとIyer,Tetrahedron,1992,48,2
223−2311)に開示されている。
ば活性化リン酸(phosphate)基又は活性化亜リン酸(phosphite)基のような、適当
な活性化リン基を包含することができる。本明細書で用いる限り、活性化リン酸
基又は活性化亜リン酸基なる用語は、他のモノマー又はオリゴマー化合物のヒド
ロキシル基と反応して、リン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性化モノマー
又はオリゴマーを意味する。このような活性化リン基はPIII又はPV原子価状態
の活性化リン原子を含有する。このような活性化リン原子は当該技術分野で知ら
れており、非限定的に、ホスホロアミダイト、H−ホスホネート及びホスフェー
トトリエステルを包含する。好ましい合成固相合成(synthetic solid phase syn
thesis)は活性化ホスフェートとしてホスホロアミダイトを用いる。ホスホロア
ミダイトはPIII化学を用いる。中間体のホスフィット化合物を次に既知方法を
用いてPV状態に酸化して、好ましい実施態様では、ホスホジエステル又はホス
ホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生成する。他の活性化ホスフェート及び
ホスフィットはTetrahedron Report Number 309
(BeaucageとIyer,Tetrahedron,1992,48,2
223−2311)に開示されている。
【0047】 多くの化学官能基を本発明の化合物中にブロックされた形で導入して、後で脱
ブロックして最終の所望の化合物を形成することができる。このような基は複素
環式塩基に直接又は間接的に結合した基として、及び2’、3’及び5’位にお
ける糖置換基として導入することができる。一般に、ブロッキング基は大きい分
子の化学官能基(chemical functionality)を特定の反応条件に対して不活性にし
て、後でこのような官能基から分子の残りの部分を実質的に損傷することなく除
去されることができる(GreenとWuts,Protective Gro
ups in Organic Synthesis,2版、John Wil
ey & Sons,New York,1991)。例えば、アミノ基の窒素
原子はフタルイミドとして、9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)
として、及びトリフェニルメチルスルフェニル、t−BOC又はベンジル基によ
ってブロックされることができる。カルボキシル基はアセチル基として保護され
ることができる。代表的なヒドロキシル保護基はBeaucage等、Tetr
ahedron 1992,48,2223によって記載されている。好ましい
ヒドロキシル保護基は酸に不安定(acid-labile)であり、例えば、トリチル、モ
ノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、9−フェニ
ルキサンチン−9−イル(Pixyl)及び9−(p−メトキシフェニル)キサ
ンチン−9−イル(MOX)である。化学官能基は先駆体形にそれらを含めるこ
とによって“ブロックされる”こともできる。したがって、アジド基は容易にア
ミンに転化されるので、アジド基はアミンの“ブロックされた”形と見なされる
ように用いられることができる。オリゴヌクレオチド合成に用いられる、他の代
表的な保護基はAgrawal等,Protocols for Oligon
ucleotide Conjugates,編集者,Humana Pres
s,New Jersey,1994,26巻,1−72頁で考察されている。
ブロックして最終の所望の化合物を形成することができる。このような基は複素
環式塩基に直接又は間接的に結合した基として、及び2’、3’及び5’位にお
ける糖置換基として導入することができる。一般に、ブロッキング基は大きい分
子の化学官能基(chemical functionality)を特定の反応条件に対して不活性にし
て、後でこのような官能基から分子の残りの部分を実質的に損傷することなく除
去されることができる(GreenとWuts,Protective Gro
ups in Organic Synthesis,2版、John Wil
ey & Sons,New York,1991)。例えば、アミノ基の窒素
原子はフタルイミドとして、9−フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)
として、及びトリフェニルメチルスルフェニル、t−BOC又はベンジル基によ
ってブロックされることができる。カルボキシル基はアセチル基として保護され
ることができる。代表的なヒドロキシル保護基はBeaucage等、Tetr
ahedron 1992,48,2223によって記載されている。好ましい
ヒドロキシル保護基は酸に不安定(acid-labile)であり、例えば、トリチル、モ
ノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、9−フェニ
ルキサンチン−9−イル(Pixyl)及び9−(p−メトキシフェニル)キサ
ンチン−9−イル(MOX)である。化学官能基は先駆体形にそれらを含めるこ
とによって“ブロックされる”こともできる。したがって、アジド基は容易にア
ミンに転化されるので、アジド基はアミンの“ブロックされた”形と見なされる
ように用いられることができる。オリゴヌクレオチド合成に用いられる、他の代
表的な保護基はAgrawal等,Protocols for Oligon
ucleotide Conjugates,編集者,Humana Pres
s,New Jersey,1994,26巻,1−72頁で考察されている。
【0048】 ヒドロキシル保護基の例は、非限定的に、t−ブチル、t−ブトキシメチル、
メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロ
ロエトキシ)エチル、2−トリメチルシリルエチル、p−クロロフェニル、2,
4−ジニトロフェニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、ジフェニルメチ
ル、p、p’−ジニトロベンズヒドリル、p−ニトロベンジル、トリフェニルメ
チル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−
ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテ
ート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピ
バロエート、ベンゾエート、p−フェニルベンゾエート、9−フルオレニルメチ
ル、カーボネート、メシレート及びトシレートを包含する。
メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、1−エトキシエチル、1−(2−クロ
ロエトキシ)エチル、2−トリメチルシリルエチル、p−クロロフェニル、2,
4−ジニトロフェニル、ベンジル、2,6−ジクロロベンジル、ジフェニルメチ
ル、p、p’−ジニトロベンズヒドリル、p−ニトロベンジル、トリフェニルメ
チル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、t−ブチルジメチルシリル、t−
ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテ
ート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピ
バロエート、ベンゾエート、p−フェニルベンゾエート、9−フルオレニルメチ
ル、カーボネート、メシレート及びトシレートを包含する。
【0049】 酸処理に安定なアミノ保護基は塩基処理によって選択的に除去され、置換に選
択的に利用可能な反応性アミノ基を作成するために用いられる。このような基の
例はFmoc(E.AthertonとR.C.Sheppard,The P
eptides、S.UdenfriendとJ.Meienhofer編集,
Academic Press,Orlando,1987,9巻,1頁)と、
Nsc基によって例示される、種々な置換スルホニルエチルカルバメート(Sa
mukov等,Tetrahedron Lett.,1994,35:782
1;VerhartとTesser,Rec.Trav.Chim.Pays−
Bas,1987,107:621)である。
択的に利用可能な反応性アミノ基を作成するために用いられる。このような基の
例はFmoc(E.AthertonとR.C.Sheppard,The P
eptides、S.UdenfriendとJ.Meienhofer編集,
Academic Press,Orlando,1987,9巻,1頁)と、
Nsc基によって例示される、種々な置換スルホニルエチルカルバメート(Sa
mukov等,Tetrahedron Lett.,1994,35:782
1;VerhartとTesser,Rec.Trav.Chim.Pays−
Bas,1987,107:621)である。
【0050】 他のアミノ−保護基は非限定的に例えば2−トリメチルシリルエトキシカルボ
ニル(Teoc)、1−メチル−1−(4−ビフェニリル)エトキシカルボニル
(Bpoc)、t−ブトキシカルボニル(BOC)、アリルオキシカルボニル(
Alloc)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)及びベン
ジルオキシカルボニル(Cbz)のようなカルバメート保護基と;例えばホルミ
ル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル及びニトロフェニルアセチルのよ
うなアミド保護基と;例えば2−ニトロベンゼンスルホニルのようなスルホンア
ミド保護基と;例えばフタルイミド及びジチアスクシノイルのようなイミン−及
び環式イミド−保護基とを包含する。これらのアミノ保護基の同等物も、本発明
の化合物及び方法によって包含される。
ニル(Teoc)、1−メチル−1−(4−ビフェニリル)エトキシカルボニル
(Bpoc)、t−ブトキシカルボニル(BOC)、アリルオキシカルボニル(
Alloc)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)及びベン
ジルオキシカルボニル(Cbz)のようなカルバメート保護基と;例えばホルミ
ル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル及びニトロフェニルアセチルのよ
うなアミド保護基と;例えば2−ニトロベンゼンスルホニルのようなスルホンア
ミド保護基と;例えばフタルイミド及びジチアスクシノイルのようなイミン−及
び環式イミド−保護基とを包含する。これらのアミノ保護基の同等物も、本発明
の化合物及び方法によって包含される。
【0051】 幾つかの特に好ましい実施態様では、本発明の、1つ以上のヌクレオシド間結
合を含むオリゴマー化合物は、任意に保護されたホスホロチオエート・ヌクレオ
シド間結合である。例えばホスフィット、ホスホジエステル及びホスホロチオエ
ート結合のようなリン含有ヌクレオシド間結合のための代表的な保護基はβ−シ
アノエチル、ジフェニルシリルエチル、δ−シアノブテニル、シアノp−キシリ
ル(CPX)、N−メチル−N−トリフルオロ−アセチルエチル(META)、
アセトキシフェノキシエチル(APE)、及びブテン−4−イルを包含する。例
えば、米国特許第4,725,677号と第Re.34,069号(β−シアノ
エチル);Beaucage,S.L.とIyer,R.P.,Tetrahe
dron、49,10号,1925−1963頁(1993);Beaucag
e,S.L.とIyer,R.P.,Tetrahedron、49,46号,
10441−10488頁(1993);Beaucage,S.L.とIye
r,R.P.,Tetrahedron、48,12号,2223−2311頁
(1992)を参照のこと。
合を含むオリゴマー化合物は、任意に保護されたホスホロチオエート・ヌクレオ
シド間結合である。例えばホスフィット、ホスホジエステル及びホスホロチオエ
ート結合のようなリン含有ヌクレオシド間結合のための代表的な保護基はβ−シ
アノエチル、ジフェニルシリルエチル、δ−シアノブテニル、シアノp−キシリ
ル(CPX)、N−メチル−N−トリフルオロ−アセチルエチル(META)、
アセトキシフェノキシエチル(APE)、及びブテン−4−イルを包含する。例
えば、米国特許第4,725,677号と第Re.34,069号(β−シアノ
エチル);Beaucage,S.L.とIyer,R.P.,Tetrahe
dron、49,10号,1925−1963頁(1993);Beaucag
e,S.L.とIyer,R.P.,Tetrahedron、49,46号,
10441−10488頁(1993);Beaucage,S.L.とIye
r,R.P.,Tetrahedron、48,12号,2223−2311頁
(1992)を参照のこと。
【0052】 本明細書に関連して、アルキル(一般に、C1−C20)、アルケニル(一般に
、C2−C20)、及びアルキニル(一般に、C2−C20)(より好ましい範囲は、
C1−C10アルキル、C2−C10アルケニル及びC2−C10アルキニルから)基は
、非限定的に、置換及び非置換直鎖、分枝鎖及び脂環式炭化水素を包含し、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシ
ル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及び
他のより高級な炭素アルキル基を包含する。他の例は2−メチルプロピル、2−
メチル−4−エチルブチル、2,4−ジエチルブチル、3−プロピルブチル、2
,8−ジブチルデシル、6,6−ジメチルオクチル、6−プロピル−6−ブチル
オクチル、2−メチルブチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、2−
エチルヘキシル、及び他の分枝鎖基、アリル、クロチル、プロパルギル、2−ペ
ンテニル及び他のパイ結合含有不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、ア
ダマンタン、並びに他の脂環式基、3−ペンテン−2−オン、3−メチル−2−
ブタノール、2−シアノオクチル、3−メトキシ−4−ヘプタナール、3−ニト
ロブチル、4−イソプロポキシドデシル、4−アジド−2−ニトロデシル、5−
メルカプトノニル、4−アミノ−1−ペンテニル並びに他の置換された基を包含
する。代表的なアルキル置換基は米国特許第5,212,295号、第12欄、
41〜50行に開示されており、この特許はその全体において本明細書に援用さ
れる。
、C2−C20)、及びアルキニル(一般に、C2−C20)(より好ましい範囲は、
C1−C10アルキル、C2−C10アルケニル及びC2−C10アルキニルから)基は
、非限定的に、置換及び非置換直鎖、分枝鎖及び脂環式炭化水素を包含し、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシ
ル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及び
他のより高級な炭素アルキル基を包含する。他の例は2−メチルプロピル、2−
メチル−4−エチルブチル、2,4−ジエチルブチル、3−プロピルブチル、2
,8−ジブチルデシル、6,6−ジメチルオクチル、6−プロピル−6−ブチル
オクチル、2−メチルブチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、2−
エチルヘキシル、及び他の分枝鎖基、アリル、クロチル、プロパルギル、2−ペ
ンテニル及び他のパイ結合含有不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、ア
ダマンタン、並びに他の脂環式基、3−ペンテン−2−オン、3−メチル−2−
ブタノール、2−シアノオクチル、3−メトキシ−4−ヘプタナール、3−ニト
ロブチル、4−イソプロポキシドデシル、4−アジド−2−ニトロデシル、5−
メルカプトノニル、4−アミノ−1−ペンテニル並びに他の置換された基を包含
する。代表的なアルキル置換基は米国特許第5,212,295号、第12欄、
41〜50行に開示されており、この特許はその全体において本明細書に援用さ
れる。
【0053】 さらに、本発明に関連して、直鎖化合物は開鎖化合物、例えば、アルキル、ア
ルケニル又はアルキニル化合物を含めた脂肪族化合物を意味し;本明細書で用い
る限り、低級アルキル、アルケニル又はアルキニル化合物は非限定的に炭素数約
1〜約6のヒドロカルビル化合物を包含する。本明細書で用いる限り、分枝鎖化
合物は、直鎖の炭素原子に結合したさらなる直鎖又は分枝鎖を有するアルキル、
アルケニル、アルキニル化合物のような直鎖化合物を含む。
ルケニル又はアルキニル化合物を含めた脂肪族化合物を意味し;本明細書で用い
る限り、低級アルキル、アルケニル又はアルキニル化合物は非限定的に炭素数約
1〜約6のヒドロカルビル化合物を包含する。本明細書で用いる限り、分枝鎖化
合物は、直鎖の炭素原子に結合したさらなる直鎖又は分枝鎖を有するアルキル、
アルケニル、アルキニル化合物のような直鎖化合物を含む。
【0054】 本明細書で用いる限り、環式化合物は閉鎖化合物、即ち、例えば脂環式化合物
又は芳香族化合物のような炭素原子の環を意味する。直鎖、分枝鎖又は環式化合
物は、アルコキシ化合物又は複素環式化合物に置けるように、内部で中断されう
る。本発明に関連して、内部で中断されるとは、炭素鎖が例えばO、N又はSの
ようなヘテロ原子によって中断されうることを意味する。しかし、必要な場合に
は、炭素鎖はヘテロ原子を有さないこともできる。
又は芳香族化合物のような炭素原子の環を意味する。直鎖、分枝鎖又は環式化合
物は、アルコキシ化合物又は複素環式化合物に置けるように、内部で中断されう
る。本発明に関連して、内部で中断されるとは、炭素鎖が例えばO、N又はSの
ようなヘテロ原子によって中断されうることを意味する。しかし、必要な場合に
は、炭素鎖はヘテロ原子を有さないこともできる。
【0055】 本発明の化合物は、窒素原子を含む環構造を包含しうる(例えば、−N(R1
)(R2)と−N(R3)(R4)、この場合(R1)(R2)と(R3)(R4)は
それぞれ、それらが結合する各Nの周囲に環構造を形成する)。得られた環構造
は、N、O及びSから選択されるさらなるヘテロ原子を包含しうる複素環又は複
素環構造である。このような環構造は単環式、二環式又は三環式であることがで
き、例えばオキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、
カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒド
ラジノ、ODMT、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スル
ホンアミド、チオール及びチオアルコキシのような置換基によって置換されるこ
とができる。窒素を包含する、好ましい二環式環構造はフタルイミドである。
)(R2)と−N(R3)(R4)、この場合(R1)(R2)と(R3)(R4)は
それぞれ、それらが結合する各Nの周囲に環構造を形成する)。得られた環構造
は、N、O及びSから選択されるさらなるヘテロ原子を包含しうる複素環又は複
素環構造である。このような環構造は単環式、二環式又は三環式であることがで
き、例えばオキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、
カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒド
ラジノ、ODMT、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スル
ホンアミド、チオール及びチオアルコキシのような置換基によって置換されるこ
とができる。窒素を包含する、好ましい二環式環構造はフタルイミドである。
【0056】 一般に、“ヘテロ”なる用語は炭素以外の原子を意味し、好ましくは排他的で
はなく、N、O又はSを意味する。したがって、“複素環”なる用語は1つ以上
のヘテロ原子(即ち、非炭素原子)を有するアルキル環系を意味する。本発明の
複素環構造は完全に飽和、部分的に飽和、不飽和であることができる、又は環の
各々が利用可能な飽和状態のいずれかでありうる多環状複素環でありうる。本発
明の複素環構造は、1つ以上の縮合環がヘテロ原子を含有しない系を含めた、縮
合環を包含するヘテロアリールをも包含する。本発明による、窒素複素環を含め
た、複素環は非限定的にイミダゾール、ピロール、ピラゾール、インドール、1
H−インダゾール、α−カルボリン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキ
サジン、テトラゾール、トリアゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン及
びモルホリン基を包含する。窒素複素環のより好ましい群はイミダゾール、ピロ
ール、インドール及びカルバゾール基を包含する。
はなく、N、O又はSを意味する。したがって、“複素環”なる用語は1つ以上
のヘテロ原子(即ち、非炭素原子)を有するアルキル環系を意味する。本発明の
複素環構造は完全に飽和、部分的に飽和、不飽和であることができる、又は環の
各々が利用可能な飽和状態のいずれかでありうる多環状複素環でありうる。本発
明の複素環構造は、1つ以上の縮合環がヘテロ原子を含有しない系を含めた、縮
合環を包含するヘテロアリールをも包含する。本発明による、窒素複素環を含め
た、複素環は非限定的にイミダゾール、ピロール、ピラゾール、インドール、1
H−インダゾール、α−カルボリン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキ
サジン、テトラゾール、トリアゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン及
びモルホリン基を包含する。窒素複素環のより好ましい群はイミダゾール、ピロ
ール、インドール及びカルバゾール基を包含する。
【0057】 本発明に関連して、アリール基は置換及び非置換芳香族環式部分であり、非限
定的に、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル及びキ
シリル基を包含する。アルカリール基は、アリール部分がアルキル部分をコア構
造に結合させる基であり、アラルキル基は、アルキル部分がアリール部分をコア
構造に結合させる基である。
定的に、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル及びキ
シリル基を包含する。アルカリール基は、アリール部分がアルキル部分をコア構
造に結合させる基であり、アラルキル基は、アルキル部分がアリール部分をコア
構造に結合させる基である。
【0058】 ターゲット核酸にハイブリダイズ可能である、本発明によるオリゴマー化合物
は好ましくは約5〜約50ヌクレオシドを含む。このような化合物が約8〜約3
0ヌクレオシドを含むことがより好ましく、15〜約25ヌクレオシドが特に好
ましい。本明細書で用いる限り、ターゲット核酸は、相補的核酸様化合物とハイ
ブリダイズ可能である任意の核酸である。さらに本発明に関連して、“ハイブリ
ダイゼーション”は、相補的核酸塩基の間のWatson−Crick、Hoo
gsteen又は逆Hoogsteen水素結合でありうる水素結合を意味する
。本明細書で用いる限り、“相補的”は2つの核酸塩基の間の正確に対合する能
力を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成によって対合す
る相補的核酸塩基である。本明細書で用いる限り、“相補的”及び“特異的にハ
イブリダイズ可能な”とは、ヌクレオシド・サブユニットを含有する第1核酸様
オリゴマーと第2核酸様オリゴマーとの間の正確な対合又は配列相補性を意味す
る。例えば、第1核酸のある一定の位置における核酸塩基が第2核酸の同じ位置
における核酸塩基と水素結合を形成することができる場合に、第1核酸と第2核
酸とはその位置において相互に相補的であると見なされる。各分子中の充分な数
の対応位置が相互に水素結合することができる核酸塩基によって占められる場合
に、第1核酸と第2核酸とは相互に相補的である。したがって、“特異的にハイ
ブリダイズ可能な”及び“相補的”は、本発明の化合物とターゲットRNA分子
との間に安定で特異的な結合が生ずるような、充分な相補度を表示するために用
いられる用語である。
は好ましくは約5〜約50ヌクレオシドを含む。このような化合物が約8〜約3
0ヌクレオシドを含むことがより好ましく、15〜約25ヌクレオシドが特に好
ましい。本明細書で用いる限り、ターゲット核酸は、相補的核酸様化合物とハイ
ブリダイズ可能である任意の核酸である。さらに本発明に関連して、“ハイブリ
ダイゼーション”は、相補的核酸塩基の間のWatson−Crick、Hoo
gsteen又は逆Hoogsteen水素結合でありうる水素結合を意味する
。本明細書で用いる限り、“相補的”は2つの核酸塩基の間の正確に対合する能
力を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成によって対合す
る相補的核酸塩基である。本明細書で用いる限り、“相補的”及び“特異的にハ
イブリダイズ可能な”とは、ヌクレオシド・サブユニットを含有する第1核酸様
オリゴマーと第2核酸様オリゴマーとの間の正確な対合又は配列相補性を意味す
る。例えば、第1核酸のある一定の位置における核酸塩基が第2核酸の同じ位置
における核酸塩基と水素結合を形成することができる場合に、第1核酸と第2核
酸とはその位置において相互に相補的であると見なされる。各分子中の充分な数
の対応位置が相互に水素結合することができる核酸塩基によって占められる場合
に、第1核酸と第2核酸とは相互に相補的である。したがって、“特異的にハイ
ブリダイズ可能な”及び“相補的”は、本発明の化合物とターゲットRNA分子
との間に安定で特異的な結合が生ずるような、充分な相補度を表示するために用
いられる用語である。
【0059】 本発明のオリゴマー化合物が、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその
ターゲットRNA配列に対して100%相補的である必要がないことは理解され
るであろう。ターゲットRNA分子に対するオリゴマー化合物の結合がターゲッ
トRNAの正常な機能を妨害して有用性の損失を生じるときに、及び特異的な結
合が望ましい条件下で、即ち、in vivo分析若しくは治療的処置の場合に
生理的条件下で、又はin vitro分析の場合に分析が行われる条件下で、
非ターゲット配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるために充分
な相補度が存在するときに、オリゴマー化合物は特異的にハイブリダイズ可能で
ある。
ターゲットRNA配列に対して100%相補的である必要がないことは理解され
るであろう。ターゲットRNA分子に対するオリゴマー化合物の結合がターゲッ
トRNAの正常な機能を妨害して有用性の損失を生じるときに、及び特異的な結
合が望ましい条件下で、即ち、in vivo分析若しくは治療的処置の場合に
生理的条件下で、又はin vitro分析の場合に分析が行われる条件下で、
非ターゲット配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるために充分
な相補度が存在するときに、オリゴマー化合物は特異的にハイブリダイズ可能で
ある。
【0060】 本発明のオリゴマー化合物は、診断薬、治療薬及び研究試薬として用いること
ができる。本発明のオリゴマー化合物は適当な製薬的に受容される希釈剤又はキ
ャリヤーを含めることによって、薬剤組成物として用いることもできる。これら
の化合物はさらに、タンパク質の好ましくない産生を特徴とする疾患を有する生
物の治療に用いることができる。この好ましくないタンパク質をコードする核酸
の鎖と特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチ
ドに、生物を接触させるべきである。このタイプの処置は単細胞原核及び真核生
物から多細胞真核生物までの範囲の多様な生物に行うことができる。その遺伝的
、代謝的又は細胞的調節の基本的部分としてDNA−RNA転写又はRNA−タ
ンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、本発明による治療的及び/又は予防的
処置を受けやすい。見たところでは、例えば細菌、酵母、原生動物、藻類、全て
の植物及び温血動物を含めた全ての高等動物体のような種々な生物が処置される
ことができる。さらに、多細胞真核生物の各細胞はそれらの細胞活性の不可欠な
部分(integral parts)としてDNA−RNA転写及びRNA−タンパク質翻訳を
有するので、多細胞真核生物の各細胞を処置することができる。さらに、真核細
胞のオルガネラ(例えば、ミトコンドリア及びクロロプラスト)の多くも転写及
び翻訳機構を包含する。したがって、単細胞、細胞集団又はオルガネラも、治療
用又は診断用オリゴマー化合物によって処置することができる生物の定義内に含
めることができる。本明細書で用いる限り、治療薬とは、生物を殺すことによる
又は異常な若しくは有害な細胞増殖若しくは発現を制御することによる疾患状態
の撲滅を包含する意味である。
ができる。本発明のオリゴマー化合物は適当な製薬的に受容される希釈剤又はキ
ャリヤーを含めることによって、薬剤組成物として用いることもできる。これら
の化合物はさらに、タンパク質の好ましくない産生を特徴とする疾患を有する生
物の治療に用いることができる。この好ましくないタンパク質をコードする核酸
の鎖と特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチ
ドに、生物を接触させるべきである。このタイプの処置は単細胞原核及び真核生
物から多細胞真核生物までの範囲の多様な生物に行うことができる。その遺伝的
、代謝的又は細胞的調節の基本的部分としてDNA−RNA転写又はRNA−タ
ンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、本発明による治療的及び/又は予防的
処置を受けやすい。見たところでは、例えば細菌、酵母、原生動物、藻類、全て
の植物及び温血動物を含めた全ての高等動物体のような種々な生物が処置される
ことができる。さらに、多細胞真核生物の各細胞はそれらの細胞活性の不可欠な
部分(integral parts)としてDNA−RNA転写及びRNA−タンパク質翻訳を
有するので、多細胞真核生物の各細胞を処置することができる。さらに、真核細
胞のオルガネラ(例えば、ミトコンドリア及びクロロプラスト)の多くも転写及
び翻訳機構を包含する。したがって、単細胞、細胞集団又はオルガネラも、治療
用又は診断用オリゴマー化合物によって処置することができる生物の定義内に含
めることができる。本明細書で用いる限り、治療薬とは、生物を殺すことによる
又は異常な若しくは有害な細胞増殖若しくは発現を制御することによる疾患状態
の撲滅を包含する意味である。
【0061】 本発明によるオリゴマー化合物は、例えば、適当なDNA合成装置上でヌクレ
オシド、ホスホロアミダイト及び本発明による制御多孔質ガラス(CPG)誘導
体及び/又は標準ヌクレオシドモノマー先駆体を用いて溶液中で又は固相反応を
介して構築することができる。本発明の新規な修飾を包含するヌクレオシドの他
に、オリゴヌクレオチド内の他のヌクレオシドを2’位の他の修飾によってさら
に修飾することができる。このような付加的な修飾を形成するために用いられる
先駆体ヌクレオシド及びヌクレオシドモノマー先駆体は2’位又は3’位のいず
れかに置換基を有することができる。このような先駆体は、本発明によって、少
なくとも1つの遊離の2’又は3’ヒドロキシル基を有する適当に保護されたヌ
クレオシドを、例えば、非限定的に、アルコキシアルキルハライド、アルコキシ
アルキルスルホネート、ヒドロキシアルキルハライド、ヒドロキシアルキルスル
ホネート、アミノアルキルハライド、アミノアルキルスルホネート、フタルイミ
ドアルキルハライド、フタルイミドスルホネート、アルキルアミノアルキルハラ
イド、アルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノアルキルハライ
ド、ジアルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノオキシアルキル
ハライド、ジアルキルアミノオキシアルキルスルホネート、及びこれらの適当に
保護された形のような、適当なアルキル化剤と反応させることによって合成する
ことができる。アルキル化反応に用いられる好ましいハライド(halides)はクロ
リド、ブロミド、フルオリド及びヨージドを包含する。アルキル化反応に用いら
れる好ましいスルホネート脱離基(leaving groups)は、非限定的に、ベンゼンス
ルホネート、メチルスルホネート、トシレート、p−ブロモベンゼンスルホネー
ト、トリフレート(triflate)、トリフルオロエチルスルホネート、及び(2,4
−ジニトロアニリノ)−ベンゼンスルホネートを包含する。
オシド、ホスホロアミダイト及び本発明による制御多孔質ガラス(CPG)誘導
体及び/又は標準ヌクレオシドモノマー先駆体を用いて溶液中で又は固相反応を
介して構築することができる。本発明の新規な修飾を包含するヌクレオシドの他
に、オリゴヌクレオチド内の他のヌクレオシドを2’位の他の修飾によってさら
に修飾することができる。このような付加的な修飾を形成するために用いられる
先駆体ヌクレオシド及びヌクレオシドモノマー先駆体は2’位又は3’位のいず
れかに置換基を有することができる。このような先駆体は、本発明によって、少
なくとも1つの遊離の2’又は3’ヒドロキシル基を有する適当に保護されたヌ
クレオシドを、例えば、非限定的に、アルコキシアルキルハライド、アルコキシ
アルキルスルホネート、ヒドロキシアルキルハライド、ヒドロキシアルキルスル
ホネート、アミノアルキルハライド、アミノアルキルスルホネート、フタルイミ
ドアルキルハライド、フタルイミドスルホネート、アルキルアミノアルキルハラ
イド、アルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノアルキルハライ
ド、ジアルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノオキシアルキル
ハライド、ジアルキルアミノオキシアルキルスルホネート、及びこれらの適当に
保護された形のような、適当なアルキル化剤と反応させることによって合成する
ことができる。アルキル化反応に用いられる好ましいハライド(halides)はクロ
リド、ブロミド、フルオリド及びヨージドを包含する。アルキル化反応に用いら
れる好ましいスルホネート脱離基(leaving groups)は、非限定的に、ベンゼンス
ルホネート、メチルスルホネート、トシレート、p−ブロモベンゼンスルホネー
ト、トリフレート(triflate)、トリフルオロエチルスルホネート、及び(2,4
−ジニトロアニリノ)−ベンゼンスルホネートを包含する。
【0062】 適当に保護されたヌクレオシドを既知方法によってオリゴマー化合物に構築す
ることができる。例えば、Beaucage等,Tetrahedron,19
92,48,2223参照。 オリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融解
温度(Tm)を測定することによって、オリゴマー化合物がそれらの相補的ター
ゲット鎖に結合する能力を比較する。二重らせんの特徴的な物理的性質である融
解温度(Tm)は、50%らせん形(ハイブリダイズした)対コイル状(ハイブ
リダイズしない)形が存在する温度(摂氏温度)を意味する。UVスペクトルを
用いて、ハイブリダイゼーション複合体の形成と破壊(融解)を判定することに
よって、Tmが測定される。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基重層はUV
吸収の低下(低色素性(hypochromicity))を付随する。したがって、UV吸収の
低下はTm上昇を意味する。Tmが高ければ高いほど、鎖間の結合強度は大きい。
多数の核酸修飾の構造安定性関係が検討されている(FreierとAltma
nn,Nucl.Acids Research,1997,25,4429−
443)。
ることができる。例えば、Beaucage等,Tetrahedron,19
92,48,2223参照。 オリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融解
温度(Tm)を測定することによって、オリゴマー化合物がそれらの相補的ター
ゲット鎖に結合する能力を比較する。二重らせんの特徴的な物理的性質である融
解温度(Tm)は、50%らせん形(ハイブリダイズした)対コイル状(ハイブ
リダイズしない)形が存在する温度(摂氏温度)を意味する。UVスペクトルを
用いて、ハイブリダイゼーション複合体の形成と破壊(融解)を判定することに
よって、Tmが測定される。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基重層はUV
吸収の低下(低色素性(hypochromicity))を付随する。したがって、UV吸収の
低下はTm上昇を意味する。Tmが高ければ高いほど、鎖間の結合強度は大きい。
多数の核酸修飾の構造安定性関係が検討されている(FreierとAltma
nn,Nucl.Acids Research,1997,25,4429−
443)。
【0063】 本発明のオリゴマー化合物の相対的結合能力を、文献に記載されたようなプロ
トコールを用いて測定した(FreierとAltmann,Nucl.Aci
ds Research,1997,25,4429−443)。100mM
Na+、10mMホスフェート、0.1mM EDTA及び4μMの相補的な長
さの一致したRNA中に4μMオリゴヌクレオチドを含有するサンプルを用いて
、典型的な吸光度対温度曲線を作成した。
トコールを用いて測定した(FreierとAltmann,Nucl.Aci
ds Research,1997,25,4429−443)。100mM
Na+、10mMホスフェート、0.1mM EDTA及び4μMの相補的な長
さの一致したRNA中に4μMオリゴヌクレオチドを含有するサンプルを用いて
、典型的な吸光度対温度曲線を作成した。
【0064】 オリゴマー化合物のin vivo安定性は、オリゴヌクレオチド治療薬の開
発において考慮すべき重要な要因である。それ故、ヌクレアーゼ、ホスホジエス
テラーゼ及び他の酵素による分解に対するオリゴマー化合物の耐性を測定する。
リン酸緩衝化生理食塩水中の5mg/kgのオリゴヌクレオチドの単回量をBA
LB/cマウスに投与することによって、本発明のオリゴマー化合物の安定性の
典型的なin vivo評価を行う。投与後の特定の時間間隔で採取した血液を
HPLC又はキャピラリー・ゲル電気泳動(CGE)によって分析して、循環中
に無傷で残留するオリゴマー化合物の量と分解生成物の性質(nature)とを測定す
る。
発において考慮すべき重要な要因である。それ故、ヌクレアーゼ、ホスホジエス
テラーゼ及び他の酵素による分解に対するオリゴマー化合物の耐性を測定する。
リン酸緩衝化生理食塩水中の5mg/kgのオリゴヌクレオチドの単回量をBA
LB/cマウスに投与することによって、本発明のオリゴマー化合物の安定性の
典型的なin vivo評価を行う。投与後の特定の時間間隔で採取した血液を
HPLC又はキャピラリー・ゲル電気泳動(CGE)によって分析して、循環中
に無傷で残留するオリゴマー化合物の量と分解生成物の性質(nature)とを測定す
る。
【0065】 限定であるとは意図されない下記実施例を検討するならば、本発明の他の目的
、利益及び新規な特徴が当業者に明らかになるであろう。総てのオリゴヌクレオ
チド配列は左から右へ、標準の5’〜3’順序で記載する。
、利益及び新規な特徴が当業者に明らかになるであろう。総てのオリゴヌクレオ
チド配列は左から右へ、標準の5’〜3’順序で記載する。
【0066】 実施例1 2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチル
ウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ジメチルアミノ)エトキシ]エタノール(A
ldrich,6.66g,50mmol)を撹拌しながら徐々に加えた。固体
が溶解するにつれて、水素ガスが発生した、O2−,2’−アンヒドロ−5−メ
チルウリジン(1.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を
加えて、ボンベを密封して、油浴に入れ、155℃に26時間加熱した。ボンベ
を室温に冷却して、開けた。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキ
サン(200ml)とに分配した。過剰なアルコールはヘキサン層に抽出された
。水層を酢酸エチル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を
水によって1回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を
溶離剤としてメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む
)を用いて、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーした(columned)。カラム
フラクションを濃縮すると、無色固体が形成され、これを回収して、490mg
の標題化合物を白色固体として得た。Rf=0.56、CH2−CH12:CH3−
OH(10:1)中;MS/ES計算値374;実測値374.5.
ウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ジメチルアミノ)エトキシ]エタノール(A
ldrich,6.66g,50mmol)を撹拌しながら徐々に加えた。固体
が溶解するにつれて、水素ガスが発生した、O2−,2’−アンヒドロ−5−メ
チルウリジン(1.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を
加えて、ボンベを密封して、油浴に入れ、155℃に26時間加熱した。ボンベ
を室温に冷却して、開けた。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキ
サン(200ml)とに分配した。過剰なアルコールはヘキサン層に抽出された
。水層を酢酸エチル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を
水によって1回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を
溶離剤としてメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む
)を用いて、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーした(columned)。カラム
フラクションを濃縮すると、無色固体が形成され、これを回収して、490mg
の標題化合物を白色固体として得た。Rf=0.56、CH2−CH12:CH3−
OH(10:1)中;MS/ES計算値374;実測値374.5.
【0067】 実施例2 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノエ
トキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.5g,1.3mmol)に、トリ
エチルアミン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、
0.87g、2当量)を加えて、1時間撹拌した。反応混合物を水(200ml
)中に注入し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出した。一緒にしたC
H2Cl2層を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液によって
洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、続いてMeOH
:CH2Cl2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを含む)を
用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、0.72g(82%)の標題化
合物を得た。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノエ
トキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.5g,1.3mmol)に、トリ
エチルアミン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、
0.87g、2当量)を加えて、1時間撹拌した。反応混合物を水(200ml
)中に注入し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出した。一緒にしたC
H2Cl2層を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液によって
洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、続いてMeOH
:CH2Cl2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを含む)を
用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、0.72g(82%)の標題化
合物を得た。
【0068】 実施例3 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N
−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解した5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジ
ン(2.17g,3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピル
アミノテトラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピ
ルホスホロアミダイト(1.1ml,2当量)を加えた。反応混合物を一晩撹拌
して、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマ
トグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、1.98g
(83%収率)の標題化合物を得た。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N
−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解した5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−N,N−ジメチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジ
ン(2.17g,3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピル
アミノテトラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピ
ルホスホロアミダイト(1.1ml,2当量)を加えた。反応混合物を一晩撹拌
して、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマ
トグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、1.98g
(83%収率)の標題化合物を得た。
【0069】 実施例4 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(270mg,0.41mmol)
を、ヒーティング・ブロック(heating block)中のPyrex管内で、ジクロロ
エタン(1ml)中の68mgの無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N
−ジメチルアミノピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃
において10分間加熱した。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)
によって希釈し、クエン酸の10%水溶液(3x20ml)によって、続いて水
によって洗浄した。得られた溶液を無水Na2SO4上で乾燥させて、217mg
(58%収率)の標題化合物を得た。 TLC(CH2Cl2/MeOH,10:1)は予想通りに起源に極性生成物が
あることを示した。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(270mg,0.41mmol)
を、ヒーティング・ブロック(heating block)中のPyrex管内で、ジクロロ
エタン(1ml)中の68mgの無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N
−ジメチルアミノピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃
において10分間加熱した。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)
によって希釈し、クエン酸の10%水溶液(3x20ml)によって、続いて水
によって洗浄した。得られた溶液を無水Na2SO4上で乾燥させて、217mg
(58%収率)の標題化合物を得た。 TLC(CH2Cl2/MeOH,10:1)は予想通りに起源に極性生成物が
あることを示した。
【0070】 実施例5 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多孔質ガ
ラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート(116
mg、0.15mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させた。この乾燥した
物質に、CPG(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチ
ルモルホリン(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベ
ンゾトリアゾル−1−イル 2−1H−ベンゾトリアゾル−1−イル−1,1,
3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレート(TBTU,48
mg,2当量)を12時間振とうしながら加えた。次に、CPGを濾過して、D
MF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄した。最後に、これを乾
燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッピングした(capped)。CPGの負
荷はジメトキシトリチル分析法によって53μmole/gであると測定された
。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多孔質ガ
ラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジメチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート(116
mg、0.15mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させた。この乾燥した
物質に、CPG(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチ
ルモルホリン(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベ
ンゾトリアゾル−1−イル 2−1H−ベンゾトリアゾル−1−イル−1,1,
3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレート(TBTU,48
mg,2当量)を12時間振とうしながら加えた。次に、CPGを濾過して、D
MF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄した。最後に、これを乾
燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッピングした(capped)。CPGの負
荷はジメトキシトリチル分析法によって53μmole/gであると測定された
。
【0071】 実施例6 2−[2−(ジメチルアミノ)エチルメルカプト]エタノール 2−(ジメチルアミノ)エタンチオール塩酸塩(Aldrich)をエタノー
ル(95%)中NaOH(0.2N)によって処理する。このスラリーに、2−
ブロモエタノール(1.2当量)を加えて、混合物を2時間還流させた。反応混
合物を冷却し、濾過し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラ
ムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
ル(95%)中NaOH(0.2N)によって処理する。このスラリーに、2−
ブロモエタノール(1.2当量)を加えて、混合物を2時間還流させた。反応混
合物を冷却し、濾過し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラ
ムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
【0072】 実施例7 2’−O−[2−[2−((ジメチルアミノ)エチル)メルカプト]エチル]−
5−メチルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2−[2−((ジメチルアミノ)エチル)メルカプト]
エタノール(50mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつ
れて、水素ガスが発生する。O2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1
.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボンベを
密封し、次に油浴に入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却し
て、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200m
l)とに分配する。過剰なフェノールはヘキサン中に抽出される。水層を酢酸エ
チル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって1回
洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。得られる残渣を、メタ
ノール/塩化メチレン(2%トリエチルアミンを含む)を用いて、シリカゲル・
フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
5−メチルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2−[2−((ジメチルアミノ)エチル)メルカプト]
エタノール(50mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつ
れて、水素ガスが発生する。O2,2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1
.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボンベを
密封し、次に油浴に入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却し
て、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200m
l)とに分配する。過剰なフェノールはヘキサン中に抽出される。水層を酢酸エ
チル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって1回
洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。得られる残渣を、メタ
ノール/塩化メチレン(2%トリエチルアミンを含む)を用いて、シリカゲル・
フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
【0073】 実施例8 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エ
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エチ
ル]メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(1.3mmol)に、トリエチ
ルアミン(0.36ml)とDMT−Cl(0.87g、2当量)を加えて、1
時間撹拌する。反応混合物を水(200ml)中に注入し、CH2Cl2(2x2
00ml)によって抽出する。一緒にしたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液
によって、続いて飽和NaCl溶液によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させ、濃縮する。得られる残渣をメタノール/塩化メチレン(1%トリエチル
アミンを含む)を用いてシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーによ
って精製して、標題化合物を得る。
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エチ
ル]メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(1.3mmol)に、トリエチ
ルアミン(0.36ml)とDMT−Cl(0.87g、2当量)を加えて、1
時間撹拌する。反応混合物を水(200ml)中に注入し、CH2Cl2(2x2
00ml)によって抽出する。一緒にしたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液
によって、続いて飽和NaCl溶液によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させ、濃縮する。得られる残渣をメタノール/塩化メチレン(1%トリエチル
アミンを含む)を用いてシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーによ
って精製して、標題化合物を得る。
【0074】 実施例9 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エ
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−
N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミデート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)
エチル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(3mmol)をCH2Cl2 (20ml)中に溶解し、この溶液に、アルゴン下で、ジイソプロピルアミノテ
トラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホ
ロアミダイト(1.1ml,2当量)を加える。この反応を一晩撹拌して、溶媒
を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィ
ーによって、酢酸エチルを用いて精製して、標題ホスホロアミダイトを得る。
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−
N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミデート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)
エチル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(3mmol)をCH2Cl2 (20ml)中に溶解し、この溶液に、アルゴン下で、ジイソプロピルアミノテ
トラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホ
ロアミダイト(1.1ml,2当量)を加える。この反応を一晩撹拌して、溶媒
を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィ
ーによって、酢酸エチルを用いて精製して、標題ホスホロアミダイトを得る。
【0075】 実施例10 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エ
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)
エチル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(0.41mmol)を、ヒ
ーティング・ブロック(heating block)中のPyrex管内で、ジクロロエタン
(1ml)中の無水コハク酸(68mg,0.6mmol)、4−N,N−ジメ
チルアミノピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃におい
て10分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によっ
て希釈し、10%クエン酸水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって
洗浄して、無水Na2SO4上で乾燥させて、標題スクシネートを得る。
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)
エチル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン(0.41mmol)を、ヒ
ーティング・ブロック(heating block)中のPyrex管内で、ジクロロエタン
(1ml)中の無水コハク酸(68mg,0.6mmol)、4−N,N−ジメ
チルアミノピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃におい
て10分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によっ
て希釈し、10%クエン酸水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって
洗浄して、無水Na2SO4上で乾燥させて、標題スクシネートを得る。
【0076】 実施例11 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−2−[2−((ジメチルアミノ)エ
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多
孔質ガラス(CPG) 上記実施例10からのスクシネート(0.15mmol,2当量)を高真空下
で一晩乾燥させる。この乾燥したスクシネートに、CPG(650mg,1当量
)と、無水DMF(2ml)と、N−メチルモルホリン(33μl,4当量)と
、48mg(2当量)のTBTU(2−1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)と
を加える。1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレー
トを加えて、混合物を12時間振とうする。次に、CPGを濾過して、DMF、
CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄する。CPGを乾燥させて、無
水酢酸/Et3Nによってキャッピングする。負荷を標準ジメトキシトリチル分
析法によって測定する。
チル)メルカプト]エチル]5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多
孔質ガラス(CPG) 上記実施例10からのスクシネート(0.15mmol,2当量)を高真空下
で一晩乾燥させる。この乾燥したスクシネートに、CPG(650mg,1当量
)と、無水DMF(2ml)と、N−メチルモルホリン(33μl,4当量)と
、48mg(2当量)のTBTU(2−1H−ベンゾトリアゾル−1−イル)と
を加える。1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレー
トを加えて、混合物を12時間振とうする。次に、CPGを濾過して、DMF、
CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄する。CPGを乾燥させて、無
水酢酸/Et3Nによってキャッピングする。負荷を標準ジメトキシトリチル分
析法によって測定する。
【0077】 実施例12 2−[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]エタノール 2−(2−アミノエトキシ)エタノール(Aldrich 0.5mmol)
を50%水性メタノール(30ml)中のNaBH3CN(Aldrich、2
00mg,3.0mmol)によって処理する。この溶液に、アセトアルデヒド
95%純度(2ml,17mmol)を1度に加えて、混合物をアルゴン下のフ
ラスコ中で50℃において2日間加熱する。減圧下で溶媒を除去した後に、残渣
を水中に溶解して、酢酸エチルによって抽出して、標題化合物を得る。
を50%水性メタノール(30ml)中のNaBH3CN(Aldrich、2
00mg,3.0mmol)によって処理する。この溶液に、アセトアルデヒド
95%純度(2ml,17mmol)を1度に加えて、混合物をアルゴン下のフ
ラスコ中で50℃において2日間加熱する。減圧下で溶媒を除去した後に、残渣
を水中に溶解して、酢酸エチルによって抽出して、標題化合物を得る。
【0078】 実施例13 2’−O−[2−(2−N,N−ジエチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチ
ルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]エタノール(5
0mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつれて、水素ガス
が発生する。O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1.2g,5mm
ol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボンベを密封し、油浴に
入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却して、開ける。粗溶液
を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200ml)とに分配する。
過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢酸エチル(3x200
ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって1回洗浄して、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤としてメタノール/塩化
メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を用いて、シリカゲル上でカ
ラムクロマトグラフィーする。適当なカラムフラクションを濃縮して、標題化合
物を得る。
ルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ジエチルアミノ)エトキシ]エタノール(5
0mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつれて、水素ガス
が発生する。O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジン(1.2g,5mm
ol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボンベを密封し、油浴に
入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却して、開ける。粗溶液
を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200ml)とに分配する。
過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢酸エチル(3x200
ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって1回洗浄して、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤としてメタノール/塩化
メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を用いて、シリカゲル上でカ
ラムクロマトグラフィーする。適当なカラムフラクションを濃縮して、標題化合
物を得る。
【0079】 実施例14 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノエ
トキシ)エチル]−5−メチルウリジン(1.3mmol)に、トリエチルアミ
ン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、0.87g
、2当量)を加えて、1時間撹拌する。反応混合物を水(200ml)中に注入
し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出する。一緒にしたCH2Cl2層
を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液によって洗浄し、無
水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いてMeOH:CH2C
l2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを含む)を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノエ
トキシ)エチル]−5−メチルウリジン(1.3mmol)に、トリエチルアミ
ン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−Cl、0.87g
、2当量)を加えて、1時間撹拌する。反応混合物を水(200ml)中に注入
し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出する。一緒にしたCH2Cl2層
を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液によって洗浄し、無
水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いてMeOH:CH2C
l2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを含む)を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
【0080】 実施例15 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N
−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解する5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−N,N−ジエチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジ
ン(3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピルアミノテトラ
ゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホロア
ミダイト(1.1ml,2当量)を加える。反応混合物を一晩撹拌して、溶媒を
蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィー
によって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化合物を得る。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シアノエチル−N,N
−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解する5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−N,N−ジエチルアミノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジ
ン(3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピルアミノテトラ
ゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプロピルホスホロア
ミダイト(1.1ml,2当量)を加える。反応混合物を一晩撹拌して、溶媒を
蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィー
によって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化合物を得る。
【0081】 実施例16 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.41mmol)を、ヒーティ
ング・ブロック中のPyrex管内で、ジクロロエタン(1ml)中の68mg
の無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N−ジエチルアミノピリジン(2
4mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃において10分間加熱する。冷
却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によって希釈し、クエン酸の1
0%水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって洗浄する。得られる溶
液を無水Na2SO4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.41mmol)を、ヒーティ
ング・ブロック中のPyrex管内で、ジクロロエタン(1ml)中の68mg
の無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N−ジエチルアミノピリジン(2
4mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃において10分間加熱する。冷
却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によって希釈し、クエン酸の1
0%水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって洗浄する。得られる溶
液を無水Na2SO4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
【0082】 実施例17 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミノ
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多孔質ガ
ラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート(0.1
5mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した物質に、CP
G(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチルモルホリン
(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベンゾトリアゾ
ル−1−イル−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー
ト(TBTU,48mg,2当量)を12時間振とうしながら加える。次に、C
PGを濾過して、DMF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄する
。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッピングする。
CPGの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシニル制御多孔質ガ
ラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−N,N−ジエチルアミ
ノエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネート(0.1
5mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した物質に、CP
G(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチルモルホリン
(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベンゾトリアゾ
ル−1−イル−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー
ト(TBTU,48mg,2当量)を12時間振とうしながら加える。次に、C
PGを濾過して、DMF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによって洗浄する
。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッピングする。
CPGの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
【0083】 実施例18 2−[ビス−2−(N,N−ジメチルアミノ−エチル)アミノエトキシ]エタノ
ール N,N−ジメチルアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(Aldric
h,1mmol)をトリフルオロ酢酸の水溶液によって処理して、一晩還流させ
て、N,N−ジメチルアミノアセトアルデヒドを得る。2−(2−アミノエトキ
シ)エタノールをメタノール溶媒中のNaBH3CNとN,N−ジメチルアミノ
アセトアルデヒドによって処理して、一晩還流させる。減圧下での溶媒の除去後
に、残渣を水中に溶解し、酢酸エチルによって抽出し、カラムクロマトグラフィ
ーによって精製して、標題化合物を得る。
ール N,N−ジメチルアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(Aldric
h,1mmol)をトリフルオロ酢酸の水溶液によって処理して、一晩還流させ
て、N,N−ジメチルアミノアセトアルデヒドを得る。2−(2−アミノエトキ
シ)エタノールをメタノール溶媒中のNaBH3CNとN,N−ジメチルアミノ
アセトアルデヒドによって処理して、一晩還流させる。減圧下での溶媒の除去後
に、残渣を水中に溶解し、酢酸エチルによって抽出し、カラムクロマトグラフィ
ーによって精製して、標題化合物を得る。
【0084】 実施例19 2’−O−[2(ビス−2−N,N−ジメチルアミノエチル)エトキシ)エチル
]−5−メチルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ビス−N,N−ジメチルアミノメチル)エト
キシ]エタノール(50mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解す
るにつれて、水素ガスが発生する。O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジ
ン(1.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボ
ンベを密封し、油浴に入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却
して、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200
ml)とに分配する。過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢
酸エチル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって
1回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤と
してメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を用い
て、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーする。カラムフラクションを濃縮
して、標題化合物を得る。
]−5−メチルウリジン 100ml ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液(1M,10m
l,10mmol)に、2[2−(ビス−N,N−ジメチルアミノメチル)エト
キシ]エタノール(50mmol)を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解す
るにつれて、水素ガスが発生する。O2−2’−アンヒドロ−5−メチルウリジ
ン(1.2g,5mmol)と炭酸水素ナトリウム(2.5mg)を加えて、ボ
ンベを密封し、油浴に入れ、155℃に26時間加熱する。ボンベを室温に冷却
して、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水(200ml)とヘキサン(200
ml)とに分配する。過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢
酸エチル(3x200ml)によって抽出して、一緒にした有機層を水によって
1回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤と
してメタノール/塩化メチレン1:20(2%トリエチルアミンを含む)を用い
て、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーする。カラムフラクションを濃縮
して、標題化合物を得る。
【0085】 実施例20 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチル
アミノエチル−エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(1.3mmol)に
、トリエチルアミン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−
Cl、0.87g、2当量)を1時間撹拌しながら加える。反応混合物を水(2
00ml)中に注入し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出する。一緒
にしたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液
によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いて
MeOH:CH2Cl2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを
含む)を用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
ルアミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン 無水ピリジン(8ml)中の2’−O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチル
アミノエチル−エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(1.3mmol)に
、トリエチルアミン(0.36ml)とジメトキシトリチルクロリド(DMT−
Cl、0.87g、2当量)を1時間撹拌しながら加える。反応混合物を水(2
00ml)中に注入し、CH2Cl2(2x200ml)によって抽出する。一緒
にしたCH2Cl2層を飽和NaHCO3溶液によって、続いて飽和NaCl溶液
によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いて
MeOH:CH2Cl2:Et3N(20:1,v/v,1%トリエチルアミンを
含む)を用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
【0086】 実施例21 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シア
ノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解する5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチルアミノエチル)エトキシ)エチル]−
5−メチルウリジン(3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロ
ピルアミノテトラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト(1.1ml,2当量)を加える。反応混合物を一晩
撹拌して、溶媒を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化
合物を得る。
ルアミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−(シア
ノエチル−N,N−ジイソプロピル)ホスホロアミデート CH2Cl2(20ml)中に溶解する5’−O−ジメトキシトリチル−2’−
O−[2(2−(ビス−N,N−ジメチルアミノエチル)エトキシ)エチル]−
5−メチルウリジン(3mmol)の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロ
ピルアミノテトラゾリド(0.6g)と2−シアノエトキシ−N,N−ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト(1.1ml,2当量)を加える。反応混合物を一晩
撹拌して、溶媒を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化
合物を得る。
【0087】 実施例22 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス(N,N−ジメチル
アミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチル−ウリジン−3’−O−スクシ
ネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.41mmol)
を、ヒーティング・ブロック中のPyrex管内で、ジクロロエタン(1ml)
中の68mgの無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N−ジメチルアミノ
エチルピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃において1
0分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によって希
釈し、クエン酸の10%水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって洗
浄する。得られる溶液を無水Na2SO4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
アミノエチル)エトキシ)エチル]−5−メチル−ウリジン−3’−O−スクシ
ネート 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン(0.41mmol)
を、ヒーティング・ブロック中のPyrex管内で、ジクロロエタン(1ml)
中の68mgの無水コハク酸(0.6mmol)、4−N,N−ジメチルアミノ
エチルピリジン(24mg)及びEt3N(56μl)と共に50℃において1
0分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン(20ml)によって希
釈し、クエン酸の10%水溶液(3x20ml)によって、続いて水によって洗
浄する。得られる溶液を無水Na2SO4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
【0088】 実施例23 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス(N,N−ジメチル
アミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチル−ウリジン−3’−O−スクシニ
ル制御多孔質ガラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネ
ート(0.15mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した
物質に、CPG(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチ
ルモルホリン(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベ
ンゾトリアゾル−1−イル−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフ
ルオロボレート(TBTU,48mg,2当量)を12時間振とうしながら加え
る。次に、CPGを濾過して、DMF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによ
って洗浄する。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッ
ピングする。CPGの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
アミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチル−ウリジン−3’−O−スクシニ
ル制御多孔質ガラス(CPG) 5’−O−ジメトキシトリチル−2’−O−[2(2−ビス−N,N−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ)エチル]−5−メチルウリジン−3’−O−スクシネ
ート(0.15mmol,2当量)を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した
物質に、CPG(650mg,1当量)と、無水DMF(2ml)と、N−メチ
ルモルホリン(33μl,4当量)とを加えて、この反応混合物に2−1H−ベ
ンゾトリアゾル−1−イル−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムテトラフ
ルオロボレート(TBTU,48mg,2当量)を12時間振とうしながら加え
る。次に、CPGを濾過して、DMF、CH2Cl2、CH3CN及びEt2Oによ
って洗浄する。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸/Et3Nによってキャッ
ピングする。CPGの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
【0089】 実施例24 オリゴヌクレオチド合成の一般的方法 オリゴマー化合物をPerSeptive Biosystems Expe
dite 8901核酸合成システム上で合成する。各オリゴヌクレオチドに関
して多重1−mmol合成を実施する。固体サポートを含有する3’末端ヌクレ
オシドをカラムに装填する。トリチル基をトリクロロ酢酸(1分間にわたって9
75ml)によって除去し、続いてアセトニトリル洗浄を行う。オリゴヌクレオ
チドは修飾ジエステル又はチオエート・プロトコールを用いて構築される。
dite 8901核酸合成システム上で合成する。各オリゴヌクレオチドに関
して多重1−mmol合成を実施する。固体サポートを含有する3’末端ヌクレ
オシドをカラムに装填する。トリチル基をトリクロロ酢酸(1分間にわたって9
75ml)によって除去し、続いてアセトニトリル洗浄を行う。オリゴヌクレオ
チドは修飾ジエステル又はチオエート・プロトコールを用いて構築される。
【0090】 ホスホジエステル・プロトコール 総ての標準アミダイト(0.1M)を1.5分間の時間枠にわたってカップリ
ングさせ、105μlの物質を得る。総ての新規なアミダイトを乾燥アセトニト
リル中に溶解して(100mgのアミダイト/1mlのアセトニトリル)、約0
.08〜0.1M溶液を得る。2’修飾アミダイトを全体で5分間にわたって2
10μlを用いて二重カップリングさせる。総カップリング時間は約5分間であ
る(210mlのアミダイトを得る)。アセトニトリル中の1−H−テトラゾー
ルを活性化剤として用いる。過剰なアミダイトをアセトニトリルによって洗い流
す。(1S)−(+)−(10−カンファースルホニル)オキサジリジン(CS
O,1.0gCSO/8.72ml乾燥アセトニトリル)を用いて、酸化して(
3分間待機工程(wait step))、約375μlの酸化剤を得る。標準アミダイト
が3分間にわたって得られる(210μl)。
ングさせ、105μlの物質を得る。総ての新規なアミダイトを乾燥アセトニト
リル中に溶解して(100mgのアミダイト/1mlのアセトニトリル)、約0
.08〜0.1M溶液を得る。2’修飾アミダイトを全体で5分間にわたって2
10μlを用いて二重カップリングさせる。総カップリング時間は約5分間であ
る(210mlのアミダイトを得る)。アセトニトリル中の1−H−テトラゾー
ルを活性化剤として用いる。過剰なアミダイトをアセトニトリルによって洗い流
す。(1S)−(+)−(10−カンファースルホニル)オキサジリジン(CS
O,1.0gCSO/8.72ml乾燥アセトニトリル)を用いて、酸化して(
3分間待機工程(wait step))、約375μlの酸化剤を得る。標準アミダイト
が3分間にわたって得られる(210μl)。
【0091】 ホスホロチオエート・プロトコール 2’修飾アミダイトを全体で5分間にわたって210μlを用いて二重カップ
リングさせる。酸化剤、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−
ジオキシド(Beaucage試薬、3.4gBeaucage試薬/200m
lアセトニトリル)の量は225μlである(1分間待機工程)。未反応ヌクレ
オシドをテトラヒドロフラン/無水酢酸と、テトラヒドロフラン/ピリジン/1
−メチルイミダゾールとの50:50混合物によってキャッピングする。合成期
間中にトリチル・モニターによって、トリチル収率をフォローする。最終DMT
基は完全な状態で残される。合成後に、合成カートリッジ(1mmole)の内
容物をPyrexバイアルに移して、オリゴヌクレオチドを制御多孔質ガラス(
CPG)から、30%水酸化アンモニウム(NH4OH,5ml)を用いて55
℃において約16時間かけて開裂させる。
リングさせる。酸化剤、3H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン−1,1−
ジオキシド(Beaucage試薬、3.4gBeaucage試薬/200m
lアセトニトリル)の量は225μlである(1分間待機工程)。未反応ヌクレ
オシドをテトラヒドロフラン/無水酢酸と、テトラヒドロフラン/ピリジン/1
−メチルイミダゾールとの50:50混合物によってキャッピングする。合成期
間中にトリチル・モニターによって、トリチル収率をフォローする。最終DMT
基は完全な状態で残される。合成後に、合成カートリッジ(1mmole)の内
容物をPyrexバイアルに移して、オリゴヌクレオチドを制御多孔質ガラス(
CPG)から、30%水酸化アンモニウム(NH4OH,5ml)を用いて55
℃において約16時間かけて開裂させる。
【0092】 オリゴヌクレオチド精製 脱保護工程後に、Gelman 0.45μmナイロン・アクロディスク・シ
リンジフィルター(syringe filter)を用いてサンプルをCPGから濾別する。S
avant AS160自動スピードバク(automatic speed vac)中で過剰なN
H4OHを蒸発させる。Hewlett Packard 8452A Dio
de Array分光光度計で260nmにおいて粗収率を測定する。次に、H
ewlett Packardエレクトロスプレイ質量分析計での質量分析(M
S)によって粗サンプルを分析する。トリチル−オン オリゴマー化合物(trity
l-on oligomeric compound)を逆相分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC
)によって精製する。HPLC条件は次の通りである:991デテクター付きW
aters 600E;Waters Delta Pak C4カラム(7.
8x300mm);溶媒A:50mMトリエチルアンモニウムアセテート(TE
A−Ac)、pH7.0;溶媒B:100%アセトニトリル;2.5ml/分の
流速度;勾配:最初の5分間は5%B、次の55分間中にBは60%まで直線的
に上昇。所望の生成物(単数又は複数)を含有するフラクション(保持時間=D
MT−ON−16314では41分間;保持時間=DMT−ON−16315で
は42.5分間)を回収し、スピードバクにおいて溶媒を乾燥させる。オリゴマ
ー化合物を80%酢酸中で約60分間脱トリチルして、再び凍結乾燥させる。脱
トリチルしたオリゴマー化合物をSephadex G−25(サイズ排除クロ
マトグラフィー)に通して適当なサンプルをPharmacia・フラクション
・コレクターによって回収することによって、遊離トリチルと過剰な塩とを除去
する。溶媒を再びスピードバク中で蒸発させる。次に、精製オリゴマー化合物を
CGE、HPLC(流速度:1.5ml/分;Waters Delta Pa
k C4カラム、3.9x300mm)及びMSによって純度に関して分析する
。最終収率は260nmにおいて分光光度計によって測定する。
リンジフィルター(syringe filter)を用いてサンプルをCPGから濾別する。S
avant AS160自動スピードバク(automatic speed vac)中で過剰なN
H4OHを蒸発させる。Hewlett Packard 8452A Dio
de Array分光光度計で260nmにおいて粗収率を測定する。次に、H
ewlett Packardエレクトロスプレイ質量分析計での質量分析(M
S)によって粗サンプルを分析する。トリチル−オン オリゴマー化合物(trity
l-on oligomeric compound)を逆相分取高速液体クロマトグラフィー(HPLC
)によって精製する。HPLC条件は次の通りである:991デテクター付きW
aters 600E;Waters Delta Pak C4カラム(7.
8x300mm);溶媒A:50mMトリエチルアンモニウムアセテート(TE
A−Ac)、pH7.0;溶媒B:100%アセトニトリル;2.5ml/分の
流速度;勾配:最初の5分間は5%B、次の55分間中にBは60%まで直線的
に上昇。所望の生成物(単数又は複数)を含有するフラクション(保持時間=D
MT−ON−16314では41分間;保持時間=DMT−ON−16315で
は42.5分間)を回収し、スピードバクにおいて溶媒を乾燥させる。オリゴマ
ー化合物を80%酢酸中で約60分間脱トリチルして、再び凍結乾燥させる。脱
トリチルしたオリゴマー化合物をSephadex G−25(サイズ排除クロ
マトグラフィー)に通して適当なサンプルをPharmacia・フラクション
・コレクターによって回収することによって、遊離トリチルと過剰な塩とを除去
する。溶媒を再びスピードバク中で蒸発させる。次に、精製オリゴマー化合物を
CGE、HPLC(流速度:1.5ml/分;Waters Delta Pa
k C4カラム、3.9x300mm)及びMSによって純度に関して分析する
。最終収率は260nmにおいて分光光度計によって測定する。
【0093】 方法 方法1 ICAM−1発現 HUVECsのオリゴヌクレオチド処理: 37℃に予め加温したOpti−
MEM(Life Technologies,Inc.)によって細胞を3回
洗浄した。オリゴマー化合物に10μg/mlのOpti−MEM中のLipo
fectin(Life Technologies,Inc.)を予め混合し
、所望の濃度に順次希釈して、洗浄済み細胞に供給した。基底の、未処理(オリ
ゴヌクレオチドなし)対照細胞をもLipofectinによって処理した。細
胞を37℃において4時間インキュベートし、この時点において培地を除去し、
5mg/mlのTNF−α(登録商標)(& D Systems)を含む又は
含まない標準増殖培地と交換した。37℃におけるインキュベーションを指定時
間まで続けた。
MEM(Life Technologies,Inc.)によって細胞を3回
洗浄した。オリゴマー化合物に10μg/mlのOpti−MEM中のLipo
fectin(Life Technologies,Inc.)を予め混合し
、所望の濃度に順次希釈して、洗浄済み細胞に供給した。基底の、未処理(オリ
ゴヌクレオチドなし)対照細胞をもLipofectinによって処理した。細
胞を37℃において4時間インキュベートし、この時点において培地を除去し、
5mg/mlのTNF−α(登録商標)(& D Systems)を含む又は
含まない標準増殖培地と交換した。37℃におけるインキュベーションを指定時
間まで続けた。
【0094】 蛍光標示式細胞分取器(fluorescence-activated cell sorter)によるICAM
−1タンパク質発現の定量: PBS中0.25%トリプシンによる短時間トリ
プシン処理によってプレート表面から細胞を取り出した。PBS(+Mg/Ca
)中の2%ウシ血清アルブミンと0.2%アジ化ナトリウムとの溶液によってト
リプシン活性をクエンチした。細胞を遠心分離(1000rpm、Beckma
n GPR遠心分離機)によってペレット化し、PBS中に再懸濁させ、ICA
M−1特異的抗体、CD54−PE(Pharmingin)3μl/105細胞
によって染色した。抗体を細胞と共に暗所で4℃において穏やかに撹拌しながら
30分間インキュベートした。細胞を遠心分離方法によって洗浄し、0.5%ホ
ルムアルデヒド(Polyscience)を含む0.3mlのFacsFlo
w緩衝剤(Becton Dickinson)中に再懸濁させた。次に、細胞
表面ICAM−1発現をBecton Dickinson FACScanを
用いるフローサイトメトリーによって測定した。対照ICAM−1発現の割合を
次のように算出した:[(オリゴヌクレオチド処理ICAM−1値)−(基底I
CAM−1値)/(非処理ICAM−1値)−(基底ICAM−1値)]。(B
aker,Brenda等,[2’−O−(2−メトキシ)エチル−修飾抗細胞
間接着分子1(ICAM−1)オリゴマー化合物はICAN−1 mRNAレベ
ルを選択的に高め、ヒト臍静脈内皮細胞におけるICAM−1翻訳開始複合体の
形成を阻害する],The Journal of Biological C
hemistry,272,11994−12000,1997)
−1タンパク質発現の定量: PBS中0.25%トリプシンによる短時間トリ
プシン処理によってプレート表面から細胞を取り出した。PBS(+Mg/Ca
)中の2%ウシ血清アルブミンと0.2%アジ化ナトリウムとの溶液によってト
リプシン活性をクエンチした。細胞を遠心分離(1000rpm、Beckma
n GPR遠心分離機)によってペレット化し、PBS中に再懸濁させ、ICA
M−1特異的抗体、CD54−PE(Pharmingin)3μl/105細胞
によって染色した。抗体を細胞と共に暗所で4℃において穏やかに撹拌しながら
30分間インキュベートした。細胞を遠心分離方法によって洗浄し、0.5%ホ
ルムアルデヒド(Polyscience)を含む0.3mlのFacsFlo
w緩衝剤(Becton Dickinson)中に再懸濁させた。次に、細胞
表面ICAM−1発現をBecton Dickinson FACScanを
用いるフローサイトメトリーによって測定した。対照ICAM−1発現の割合を
次のように算出した:[(オリゴヌクレオチド処理ICAM−1値)−(基底I
CAM−1値)/(非処理ICAM−1値)−(基底ICAM−1値)]。(B
aker,Brenda等,[2’−O−(2−メトキシ)エチル−修飾抗細胞
間接着分子1(ICAM−1)オリゴマー化合物はICAN−1 mRNAレベ
ルを選択的に高め、ヒト臍静脈内皮細胞におけるICAM−1翻訳開始複合体の
形成を阻害する],The Journal of Biological C
hemistry,272,11994−12000,1997)
【0095】 本発明の2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミノエチル)オキシエチ
ル]−5−メチル修飾オリゴマー化合物のICAM−1発現を、処理したHUV
EC細胞中のICAM−1レベルの減少によって測定する。オリゴマー化合物は
直接結合RNアーゼ H独立機構によって作用すると考えられる。適当なスクラ
ンブル(scrambled)対照オリゴマー化合物を対照として用いる。これらは試験配
列と同じ塩基組成を有する。
ル]−5−メチル修飾オリゴマー化合物のICAM−1発現を、処理したHUV
EC細胞中のICAM−1レベルの減少によって測定する。オリゴマー化合物は
直接結合RNアーゼ H独立機構によって作用すると考えられる。適当なスクラ
ンブル(scrambled)対照オリゴマー化合物を対照として用いる。これらは試験配
列と同じ塩基組成を有する。
【0096】 以下の表1に記載するような、2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミ
ノエチル)オキシエチル]−5−メチル修飾を含有する配列を作製して、上記分
析で試験する。配列番号:3、C−rafをターゲットとするオリゴヌクレオチ
ドを対照として用いる。
ノエチル)オキシエチル]−5−メチル修飾を含有する配列を作製して、上記分
析で試験する。配列番号:3、C−rafをターゲットとするオリゴヌクレオチ
ドを対照として用いる。
【0097】 表1 2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミノエチル)オキシエチル]−5−
メチル修飾を含有するオリゴマー化合物
メチル修飾を含有するオリゴマー化合物
【表1】
【0098】 太字のヌクレオシドは総て、2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミノ
エチル)オキシエチル]−5−メチルであり;下付きSはホスホロチオエート結
合を意味し;下付きOはホスホジエステル結合を意味し;Cの上付きm(Cm)
は5−メチル−Cを意味する。
エチル)オキシエチル]−5−メチルであり;下付きSはホスホロチオエート結
合を意味し;下付きOはホスホジエステル結合を意味し;Cの上付きm(Cm)
は5−メチル−Cを意味する。
【0099】 方法2 2’−O−修飾オリゴマー化合物の酵素分解 2’−O−位置における3’ヌクレオシドへの修飾を組み入れた、3種類のオ
リゴマー化合物を合成する(表2)。これらの修飾オリゴマー化合物をヘビ毒ホ
スホジエステラーゼにさらして、それらのヌクレアーゼ耐性を評価する。オリゴ
マー化合物(30ナノモル)を50mM Tris−HCl pH8.5、14
mM MgCl2及び72mM NaClを含有する緩衝剤 20ml中に溶解
する。この溶液に、0.1単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ(Pharmac
ia,Piscataway,NJ)、23単位のヌクレアーゼP1(Gibc
o LBRL,Gaithersberg,MD)及び24単位のウシ腸ホスフ
ァターゼ(Boehringer Mannheim,Indianapoli
s,IN)を加えて、反応混合物を37℃において100時間インキュベートす
る。Waters モデル715自動インジェクター、モデル600Eポンプ、
モデル991デテクター及びAlltech(Alltech Associa
tes,Inc.,Deerfield,IL)ヌクレオシド/ヌクレオチド・
カラム(4.6x250mm)を用いて、HPLC分析を実施する。総ての分析
は室温において実施する。用いる溶媒はA:水と、B:アセトニトリルである。
ヌクレオシド組成物の分析は次の勾配:0〜5分間、2%B(イソクラチック(i
socratic));5〜20分間、2%B〜10%B(直線);20〜40分間、1
0%B〜50%Bによって達成される。1ナノモル当りの積分面積をヌクレオシ
ド標準を用いて測定する。積分面積をモル値に換算し、総ての値を、各オリゴマ
ーに関して予測値に設定したチミジンに比較することによって、相対的ヌクレオ
シド比率を算出する。
リゴマー化合物を合成する(表2)。これらの修飾オリゴマー化合物をヘビ毒ホ
スホジエステラーゼにさらして、それらのヌクレアーゼ耐性を評価する。オリゴ
マー化合物(30ナノモル)を50mM Tris−HCl pH8.5、14
mM MgCl2及び72mM NaClを含有する緩衝剤 20ml中に溶解
する。この溶液に、0.1単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ(Pharmac
ia,Piscataway,NJ)、23単位のヌクレアーゼP1(Gibc
o LBRL,Gaithersberg,MD)及び24単位のウシ腸ホスフ
ァターゼ(Boehringer Mannheim,Indianapoli
s,IN)を加えて、反応混合物を37℃において100時間インキュベートす
る。Waters モデル715自動インジェクター、モデル600Eポンプ、
モデル991デテクター及びAlltech(Alltech Associa
tes,Inc.,Deerfield,IL)ヌクレオシド/ヌクレオチド・
カラム(4.6x250mm)を用いて、HPLC分析を実施する。総ての分析
は室温において実施する。用いる溶媒はA:水と、B:アセトニトリルである。
ヌクレオシド組成物の分析は次の勾配:0〜5分間、2%B(イソクラチック(i
socratic));5〜20分間、2%B〜10%B(直線);20〜40分間、1
0%B〜50%Bによって達成される。1ナノモル当りの積分面積をヌクレオシ
ド標準を用いて測定する。積分面積をモル値に換算し、総ての値を、各オリゴマ
ーに関して予測値に設定したチミジンに比較することによって、相対的ヌクレオ
シド比率を算出する。
【0100】 表2 2’−修飾キメラ・オリゴマー化合物の相対的ヌクレアーゼ耐性
【表2】
【0101】 方法3 Ha−rasをターゲットとするギャップ2’−O−DMAEOE修飾オリゴマ
ー化合物を評価するための一般的方法 肉腫、神経芽細胞腫、白血病及びリンパ腫を含めた、多様な種類のヒト腫瘍は
ras遺伝子ファミリーの活性癌遺伝子を含有する。Ha−rasは小分子量G
TPアーゼのファミリーであり、このファミリーの機能は、多様なヒト癌の大き
い割合に関連する、rasの構成的活性化を生じるシグナルを伝達することによ
って細胞の増殖及び分化を調節することである。したがって、rasは抗癌治療
方策の魅力的なターゲットである。
ー化合物を評価するための一般的方法 肉腫、神経芽細胞腫、白血病及びリンパ腫を含めた、多様な種類のヒト腫瘍は
ras遺伝子ファミリーの活性癌遺伝子を含有する。Ha−rasは小分子量G
TPアーゼのファミリーであり、このファミリーの機能は、多様なヒト癌の大き
い割合に関連する、rasの構成的活性化を生じるシグナルを伝達することによ
って細胞の増殖及び分化を調節することである。したがって、rasは抗癌治療
方策の魅力的なターゲットである。
【0102】 配列番号:6はヒトHa−rasの翻訳領域の開始をターゲットとする20塩
基ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドであり、これはスクリーニ
ング分析に基づいて細胞培養におけるHa−rasの強力なアイソタイプ特異的
阻害剤である(IC50=45nm)。配列番号:6によるin vitro細胞
の処理は、Ha−ras mRNA及びタンパク質合成の迅速な減少と、活性化
Ha−ras突然変異を含有する細胞の増殖阻害とを生じる。1日1回腹腔内注
入(IP)によって25mg/kg以下の投与量で投与したときに、配列番号:
6は多様な腫瘍異種移植片モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示すが、ミスマッ
チ対照は抗腫瘍活性を示さない。配列番号:6はマウス異種移植片の研究におい
て肺、胸部、膀胱及び膵臓を含めた、多様な腫瘍種類に対して有効であることが
判明している(Cowsert,L.W.,Anti−cancer drug
design,1997,12,359−371)。配列の5’及び3’末端
(“ウィング”)が2’−メトキシエチル(MOE)修飾によって修飾され、バ
ックボーンがホスホロチオエートとして維持される、配列番号:6の第2世代類
似体(表2、配列番号:12)は、細胞培養分析において15nmのIC50を示
す。したがって、効力の3倍の改良がこのキメラ類似体から観察される。2’−
MOEホスホロチオエートの改良されたヌクレアーゼ耐性のために、配列番号:
12はin vitroでのアンチセンス効果の持続時間を増加する。これは癌
患者へのこの薬物の投与頻度に関係する。配列番号:12は現在、ras依存性
腫瘍モデルにおいて判定にかけられている(Cowsert,L.M.,Ant
i−cancer Drug Design,1997,12,359−371
)。親化合物、配列番号:6は全身的点滴(systemic infusion)によって固体腫
瘍に対するI期臨床トライアル(Phase I clinical trial)中である。2’−O
−DMAEOE修飾を有するアンチセンス・オリゴマー化合物を製造して、活性
の評価に関して述べたように、上記分析において試験する。最初に製造するオリ
ゴマー化合物を以下の表3に列挙する。
基ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドであり、これはスクリーニ
ング分析に基づいて細胞培養におけるHa−rasの強力なアイソタイプ特異的
阻害剤である(IC50=45nm)。配列番号:6によるin vitro細胞
の処理は、Ha−ras mRNA及びタンパク質合成の迅速な減少と、活性化
Ha−ras突然変異を含有する細胞の増殖阻害とを生じる。1日1回腹腔内注
入(IP)によって25mg/kg以下の投与量で投与したときに、配列番号:
6は多様な腫瘍異種移植片モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示すが、ミスマッ
チ対照は抗腫瘍活性を示さない。配列番号:6はマウス異種移植片の研究におい
て肺、胸部、膀胱及び膵臓を含めた、多様な腫瘍種類に対して有効であることが
判明している(Cowsert,L.W.,Anti−cancer drug
design,1997,12,359−371)。配列の5’及び3’末端
(“ウィング”)が2’−メトキシエチル(MOE)修飾によって修飾され、バ
ックボーンがホスホロチオエートとして維持される、配列番号:6の第2世代類
似体(表2、配列番号:12)は、細胞培養分析において15nmのIC50を示
す。したがって、効力の3倍の改良がこのキメラ類似体から観察される。2’−
MOEホスホロチオエートの改良されたヌクレアーゼ耐性のために、配列番号:
12はin vitroでのアンチセンス効果の持続時間を増加する。これは癌
患者へのこの薬物の投与頻度に関係する。配列番号:12は現在、ras依存性
腫瘍モデルにおいて判定にかけられている(Cowsert,L.M.,Ant
i−cancer Drug Design,1997,12,359−371
)。親化合物、配列番号:6は全身的点滴(systemic infusion)によって固体腫
瘍に対するI期臨床トライアル(Phase I clinical trial)中である。2’−O
−DMAEOE修飾を有するアンチセンス・オリゴマー化合物を製造して、活性
の評価に関して述べたように、上記分析において試験する。最初に製造するオリ
ゴマー化合物を以下の表3に列挙する。
【0103】 表3 2’−O−DMAEOE修飾を有するHa−rasアンチセンス・オリゴマー化
合物と、それらの対照
合物と、それらの対照
【表3】 配列の下線を付けた部分は2’−デオキシである。
【0104】 方法4 HCVをターゲットとする2’−O−DMAEOEオリゴマー化合物を評価する
ための一般的方法 均一に修飾された2’−O−DMAEOEホスホジエステルオリゴマー化合物
を、翻訳停止機構による、HCV遺伝子のアンチセンス阻害に関して評価する。
ための一般的方法 均一に修飾された2’−O−DMAEOEホスホジエステルオリゴマー化合物
を、翻訳停止機構による、HCV遺伝子のアンチセンス阻害に関して評価する。
【0105】 C型肝炎ウイルス(HCV)が世界中で非常に多くの人々の肝臓疾患の原因で
あることは知られている。HCVはフラビウイルス・ファミリーのエンベロープ
付きプラス鎖RNAウイルスである。ヒトにおける初期感染は通常、無症候性で
あるが、肝硬変と肝細胞癌とが長期間続発症である慢性感染がしばしば続いて起
こる。慢性的に感染した個人からウイルスを撲滅しようと試みて、インターフェ
ロン−α(IFN−α)療法が広く用いられるが、長期間の小康状態(remission
)は6か月間の療法後にも僅か約20%の患者において得られるに過ぎない。こ
れまでは、HCVの治療に有効な抗ウイルス薬は存在しない。(Blair等,
1998)。薬物の発見と開発の努力は、HCVの適当な細胞培養複製分析が無
いために妨げられており、ワクチン製造もこのウイルスのエンベロープ遺伝子の
遺伝的変異性によって妨げられている。例えばプロテアーゼ及びウイルスポリメ
ラーゼのようなクローン化ウイルス酵素の特異的阻害剤はまだ報告されていない
。
あることは知られている。HCVはフラビウイルス・ファミリーのエンベロープ
付きプラス鎖RNAウイルスである。ヒトにおける初期感染は通常、無症候性で
あるが、肝硬変と肝細胞癌とが長期間続発症である慢性感染がしばしば続いて起
こる。慢性的に感染した個人からウイルスを撲滅しようと試みて、インターフェ
ロン−α(IFN−α)療法が広く用いられるが、長期間の小康状態(remission
)は6か月間の療法後にも僅か約20%の患者において得られるに過ぎない。こ
れまでは、HCVの治療に有効な抗ウイルス薬は存在しない。(Blair等,
1998)。薬物の発見と開発の努力は、HCVの適当な細胞培養複製分析が無
いために妨げられており、ワクチン製造もこのウイルスのエンベロープ遺伝子の
遺伝的変異性によって妨げられている。例えばプロテアーゼ及びウイルスポリメ
ラーゼのようなクローン化ウイルス酵素の特異的阻害剤はまだ報告されていない
。
【0106】 アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法はHCV感染を制御するための新規な
アプローチを表す。HCVのポリタンパク質開始コドンに隣接するHCV RN
A配列に相補的な、幾つかのアンチセンス・オリゴマー化合物がIsisにおい
て設計されている(Hanecak等,J.Virol.,1996,70,5
203−5212)。ターゲット・ゲノムは独立的HCV単離体間で高度に保存
される。
アプローチを表す。HCVのポリタンパク質開始コドンに隣接するHCV RN
A配列に相補的な、幾つかのアンチセンス・オリゴマー化合物がIsisにおい
て設計されている(Hanecak等,J.Virol.,1996,70,5
203−5212)。ターゲット・ゲノムは独立的HCV単離体間で高度に保存
される。
【0107】 RNアーゼ H独立性アンチセンス・オリゴヌクレオチドがその親ホスホロチ
オエート(RNアーゼ H機構によって作用する)(これは均一に修飾された2
’−O−(メトキシエチル)ホスホジエステル(P=O 20マー)を用いて、
ヒト肝細胞系中のHCVのコアタンパク質配列のAUG部位をターゲットとする
)よりも大きい活性を有することが判明した(Hanecak等,J.Viro
l.,1996,70,5203−5212)。C型肝炎ウイルスのコアタンパ
ク質レベルは、100nmのIC50を有する対応2’−デオキシホスホロチオエ
ートと同じ程度に効率的に減少した。配列番号:15はコアタンパク質発現の強
力な阻害剤であり、HCV RNAレベルに影響を及ぼさなかった。このことは
、HCV翻訳の阻害を示唆した。親化合物(配列番号:14)は50.8℃のT m を有したが、2’−MOE化合物(配列番号:15)は83.8℃のTmを有し
た。したがって、配列番号:15はHCV RNAに対してより良好なアフィニ
ティを有した。HCVの複製サイクルは、RNアーゼ Hレベルが核の同レベル
に比べて減少すると報告されている感染細胞の細胞質中で行われる。この理由か
ら、非RNアーゼ H機構によってHCVを阻害するように作用するアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを用いるほうが適切である。オリゴヌクレオチド配列番
号:15は2’−MOE修飾を有するP=O結合を含有するので、魅力的な手が
かり(lead)である。配列番号:14と15の試験に従って、配列番号:16を試
験する。
オエート(RNアーゼ H機構によって作用する)(これは均一に修飾された2
’−O−(メトキシエチル)ホスホジエステル(P=O 20マー)を用いて、
ヒト肝細胞系中のHCVのコアタンパク質配列のAUG部位をターゲットとする
)よりも大きい活性を有することが判明した(Hanecak等,J.Viro
l.,1996,70,5203−5212)。C型肝炎ウイルスのコアタンパ
ク質レベルは、100nmのIC50を有する対応2’−デオキシホスホロチオエ
ートと同じ程度に効率的に減少した。配列番号:15はコアタンパク質発現の強
力な阻害剤であり、HCV RNAレベルに影響を及ぼさなかった。このことは
、HCV翻訳の阻害を示唆した。親化合物(配列番号:14)は50.8℃のT m を有したが、2’−MOE化合物(配列番号:15)は83.8℃のTmを有し
た。したがって、配列番号:15はHCV RNAに対してより良好なアフィニ
ティを有した。HCVの複製サイクルは、RNアーゼ Hレベルが核の同レベル
に比べて減少すると報告されている感染細胞の細胞質中で行われる。この理由か
ら、非RNアーゼ H機構によってHCVを阻害するように作用するアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを用いるほうが適切である。オリゴヌクレオチド配列番
号:15は2’−MOE修飾を有するP=O結合を含有するので、魅力的な手が
かり(lead)である。配列番号:14と15の試験に従って、配列番号:16を試
験する。
【0108】 表4 HCVC 5’−NCRヌクレオチド番号340〜359をターゲットとする5
’−TTT AGG ATT CGT GCT CAT GG−3’アンチセン
スオリゴヌクレオチド
’−TTT AGG ATT CGT GCT CAT GG−3’アンチセン
スオリゴヌクレオチド
【表4】
【0109】 方法5 in vitro分析 HCVポリタンパク質開始コドン配列に相補的なIsisアンチセンス・オリ
ゴマー化合物は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれた組換えDNAからHCV R
NAを発現するように操作された不死化細胞系(immortalized cell line)におい
てウイルスコアタンパク質の発現を阻害することが知られる(Hanecak,
同上)。非相補的な対照オリゴマー化合物はこの系においてHCV RNA又は
タンパク質レベルに影響を及ぼさない。H8Ad17C細胞を上記表4に示した
オリゴマー化合物、特に配列番号:16の濃度範囲(0〜200nm)によって
、カチオン脂質の存在下で処理し、20時間後にウェスタン・ブロット分析によ
って総タンパク質レベルを評価する。
ゴマー化合物は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれた組換えDNAからHCV R
NAを発現するように操作された不死化細胞系(immortalized cell line)におい
てウイルスコアタンパク質の発現を阻害することが知られる(Hanecak,
同上)。非相補的な対照オリゴマー化合物はこの系においてHCV RNA又は
タンパク質レベルに影響を及ぼさない。H8Ad17C細胞を上記表4に示した
オリゴマー化合物、特に配列番号:16の濃度範囲(0〜200nm)によって
、カチオン脂質の存在下で処理し、20時間後にウェスタン・ブロット分析によ
って総タンパク質レベルを評価する。
【0110】 方法6 HCVのin vivoモデル HCV感染の動物モデルは容易に入手することができない。マウスの肝臓にお
けるHCV遺伝子発現を阻害するアンチセンス・オリゴマー化合物を評価するた
めに、代替アプローチが開発されている。これらの実験のために、配列番号:1
5のターゲット配列を含むHCV配列をルシフェラーゼ・レポーター遺伝子に融
合させて、ワクシニアウイルス中に挿入した。この組換えワクシニアウイルスに
よるマウス感染は、肝臓組織中のルシフェラーゼの定量可能なレベルを生じる。
強力なホスホロチオエート・アンチセンスオリゴマー化合物はこのモデルに作用
することが判明している。配列番号:16(配列番号:15の2’−O−DMA
EOE RNA類似体)を、組換えワクシニアウイルスに感染させたマウスの肝
臓におけるHCV−ルシフェラーゼ構築体の発現の阻害に関して評価する。配列
依存性と用量反応とに関して阻害を評価する。HCVターゲット配列を有さない
対照ワクシニアウイルス・ベクターに感染させたマウスの肝臓におけるHCV−
ルシフェラーゼの発現を対照として用いて、これらの対照系におけるアンチセン
ス薬物の影響を評価する。(マウス肝臓におけるC型肝炎ウイルス遺伝子発現の
、アンチセンス・オリゴヌクレオチド仲介阻害(Anderson等,会議要約
集、International Hepatitis Meeting,Ha
waii,1997))。
けるHCV遺伝子発現を阻害するアンチセンス・オリゴマー化合物を評価するた
めに、代替アプローチが開発されている。これらの実験のために、配列番号:1
5のターゲット配列を含むHCV配列をルシフェラーゼ・レポーター遺伝子に融
合させて、ワクシニアウイルス中に挿入した。この組換えワクシニアウイルスに
よるマウス感染は、肝臓組織中のルシフェラーゼの定量可能なレベルを生じる。
強力なホスホロチオエート・アンチセンスオリゴマー化合物はこのモデルに作用
することが判明している。配列番号:16(配列番号:15の2’−O−DMA
EOE RNA類似体)を、組換えワクシニアウイルスに感染させたマウスの肝
臓におけるHCV−ルシフェラーゼ構築体の発現の阻害に関して評価する。配列
依存性と用量反応とに関して阻害を評価する。HCVターゲット配列を有さない
対照ワクシニアウイルス・ベクターに感染させたマウスの肝臓におけるHCV−
ルシフェラーゼの発現を対照として用いて、これらの対照系におけるアンチセン
ス薬物の影響を評価する。(マウス肝臓におけるC型肝炎ウイルス遺伝子発現の
、アンチセンス・オリゴヌクレオチド仲介阻害(Anderson等,会議要約
集、International Hepatitis Meeting,Ha
waii,1997))。
【0111】 方法7 in vivoヌクレアーゼ耐性 2’−O−DMAEOEを有するギャップマーのin vivoヌクレアーゼ
耐性を、マウスの血漿及び組織(腎臓と肝臓)において試験する。このために、
C−rafオリゴヌクレオチド系列 配列番号:17を用いて、以下の表5に列
挙した下記5種類のオリゴマー化合物をそれらの相対的ヌクレアーゼ耐性に関し
て評価する。
耐性を、マウスの血漿及び組織(腎臓と肝臓)において試験する。このために、
C−rafオリゴヌクレオチド系列 配列番号:17を用いて、以下の表5に列
挙した下記5種類のオリゴマー化合物をそれらの相対的ヌクレアーゼ耐性に関し
て評価する。
【0112】 表5
【表5】
【0113】 方法8 動物試験 試験すべき各オリゴヌクレオチドに関して、9匹の雄BALB/cマウス(C
harles River,Wilmington,MA)(体重約25g)を
用いる(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,19
96,277,923)。1週間の順応後に、マウスはリン酸緩衝化生理食塩水
(PBS)pH7.0中で投与されるオリゴヌクレオチド(5mg/kg)の単
回尾静脈注射を受ける。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの最終濃度はPBS製
剤として(for the PBS formulations)(5mg/kg)である。各群から1つの
眼窩後方の採血(bleed)(投与後0.25、9.05、2又は4のいずれか)と
末梢採血(投与後1、3、8又は24時間のいずれか)を回収する。ケタミン/
キシラジン麻酔後に末梢採血(約0.6〜0.8ml)を心臓穿刺によって回収
する。血液をEDTA被覆回収管に移して、血漿を得るために遠心分離する。終
了後に、肝臓と腎臓を各マウスから摘出する。完全な状態のオリゴヌクレオチド
含量を測定するためのCGEによる分析に、血漿と組織のホモジネートを用いる
。総てのサンプルを回収後直ちに凍結して、分析まで−80℃において貯蔵する
。
harles River,Wilmington,MA)(体重約25g)を
用いる(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,19
96,277,923)。1週間の順応後に、マウスはリン酸緩衝化生理食塩水
(PBS)pH7.0中で投与されるオリゴヌクレオチド(5mg/kg)の単
回尾静脈注射を受ける。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの最終濃度はPBS製
剤として(for the PBS formulations)(5mg/kg)である。各群から1つの
眼窩後方の採血(bleed)(投与後0.25、9.05、2又は4のいずれか)と
末梢採血(投与後1、3、8又は24時間のいずれか)を回収する。ケタミン/
キシラジン麻酔後に末梢採血(約0.6〜0.8ml)を心臓穿刺によって回収
する。血液をEDTA被覆回収管に移して、血漿を得るために遠心分離する。終
了後に、肝臓と腎臓を各マウスから摘出する。完全な状態のオリゴヌクレオチド
含量を測定するためのCGEによる分析に、血漿と組織のホモジネートを用いる
。総てのサンプルを回収後直ちに凍結して、分析まで−80℃において貯蔵する
。
【0114】 方法9 Tmによって推定される結合アフィニティを、2’−O−[2−(2−N,N
−ジメチルアミノエチル)オキシエチル]修飾を有するオリゴマー化合物に関し
て評価した。5−メチル−2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミノエチ
ル)オキシエチル](修飾T)をオリゴヌクレオチドの特定の位置に組み入れ、
相補的RNAオリゴマー化合物に対する結合を測定した。
−ジメチルアミノエチル)オキシエチル]修飾を有するオリゴマー化合物に関し
て評価した。5−メチル−2’−O−[2−(2−N,N−ジメチルアミノエチ
ル)オキシエチル](修飾T)をオリゴヌクレオチドの特定の位置に組み入れ、
相補的RNAオリゴマー化合物に対する結合を測定した。
【0115】 表6
【表6】 a DMT−付着(DMT-on)として、下線付きヌクレオシドは2’−O−[2−(
2−N,N−ジメチルアミノエチル)オキシエチル]−5−メチルウリジン(2
’−置換−T)である。
2−N,N−ジメチルアミノエチル)オキシエチル]−5−メチルウリジン(2
’−置換−T)である。
【0116】 表7 Tm値
【表7】
【0117】 下線付きヌクレオシドは2’−O−[2−(2−N,N−ジメチル−アミノエ
チル)オキシエチル]修飾されている。 2’−O−[2−(2−N,N−ジメチル−アミノエチル)オキシエチル]修
飾ヌクレオシドモノマーは、表7に示すように、非修飾DNAに比べてTm上昇
を示す。
チル)オキシエチル]修飾されている。 2’−O−[2−(2−N,N−ジメチル−アミノエチル)オキシエチル]修
飾ヌクレオシドモノマーは、表7に示すように、非修飾DNAに比べてTm上昇
を示す。
【0118】 当業者は、非常に多くの変化及び修正が本発明の好ましい実施態様になされう
ることと、このような変化及び修正が本発明の要旨から逸脱せずになされうるこ
とを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲がこのような同等な変更の総て
を本発明の要旨及び範囲に入るものとして包括するように意図される。
ることと、このような変化及び修正が本発明の要旨から逸脱せずになされうるこ
とを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲がこのような同等な変更の総て
を本発明の要旨及び範囲に入るものとして包括するように意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CR, CU,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,G D,GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN ,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC, LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,M K,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO ,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ, TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,Y U,ZA,ZW (72)発明者 クック,フィリップ・ダン アメリカ合衆国カリフォルニア州92069, レーク・サン・マルコス,ラ・カサ 1155 Fターム(参考) 4B024 AA01 CA01 DA02 GA13 HA17 4C057 AA18 BB02 DD01 MM05 4C086 AA03 EA16 EA17 EA18 ZA75 ZB33
Claims (31)
- 【請求項1】 式: 【化1】 [式中、Bxは複素環式塩基であり; R1とR2の各々は独立的にH、窒素保護基、置換若しくは非置換C1−C10ア
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、任意にNとOから選択される
付加的なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示される、少なくとも1つのヌクレオシドを有する
オリゴマー化合物。 - 【請求項2】 R1がH、C1−C10アルキル又はC1−C10置換アルキルで
あり、R2がC1−C10置換アルキルである、請求項1記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項3】 R1がC1−C10アルキルである、請求項2記載のオリゴマー
化合物。 - 【請求項4】 R2がC1−C10置換アルキルであり、置換基がNH3 +又はN
(R3)(R4)である、請求項2記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項5】 R1とR2が両方ともC1−C10置換アルキルである、請求項
2記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項6】 前記置換基が独立的にNH3 +又はN(R3)(R4)である、
請求項5記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項7】 R1とR2がそれぞれC1−C10アルキルである、請求項1記
載のオリゴマー化合物。 - 【請求項8】 R1とR2が、NとOから選択される少なくとも1つのヘテロ
原子を包含することができる環構造として、結合する、請求項1記載のオリゴマ
ー化合物。 - 【請求項9】 前記環構造がイミダゾール、ピペリジン、モルホリン又は置
換ピペラジンである、請求項8記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項10】 前記ピペラジンの置換基がC1−C12アルキルである、請
求項9記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項11】 前記複素環式塩基がプリン又はピリミジンである、請求項
1記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項12】 前記複素環式塩基がアデニン、シトシン、5−メチルシト
シン、チミン、ウラシル、グアニン又は2−アミノアデニンである、請求項11
記載のオリゴマー化合物。 - 【請求項13】 約5〜約50個のヌクレオシドを含む、請求項1記載のオ
リゴマー化合物。 - 【請求項14】 約8〜約30個のヌクレオシドを含む、請求項1記載のオ
リゴマー化合物。 - 【請求項15】 約15〜約25個のヌクレオシドを含む、請求項1記載の
オリゴマー化合物。 - 【請求項16】 式: 【化2】 [式中、Bxは複素環式塩基であり; T1とT2は独立的にOH、保護されたヒドロキシル、活性化リン基、ヌクレオ
チド間結合を形成するための反応性基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオシド、オリゴヌクレオチド、又は固体サポートへの結合である; R1とR2の各々は独立的にH、窒素保護基、置換若しくは非置換C1−C10ア
ルキル、置換若しくは非置換C2−C10アルケニル、置換若しくは非置換C2−C 10 アルキニルであり、前記置換基はOR3、SR3、NH3 +、N(R3)(R4)、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある; 又はR1とR2は一緒に窒素保護基であるか又は、NとOから選択される付加的
なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する;及び R3とR4の各々は独立的にH、C1−C10アルキル、窒素保護基であるか、又
はR3とR4は一緒に窒素保護基である; 又はR3とR4は、NとOから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する]で示される化合物。 - 【請求項17】 R1がH、C1−C10アルキル又はC1−C10置換アルキル
であり、R2がC1−C10置換アルキルである、請求項16記載の化合物。 - 【請求項18】 R1がC1−C10アルキルである、請求項17記載の化合物
。 - 【請求項19】 R2がC1−C10置換アルキルであり、置換基がNH3 +又は
N(R3)(R4)である、請求項17記載の化合物。 - 【請求項20】 R1とR2が両方ともC1−C10置換アルキルである、請求
項17記載の化合物。 - 【請求項21】 前記置換基が独立的にNH3 +又はN(R3)(R4)である
、請求項20記載の化合物。 - 【請求項22】 R1とR2がそれぞれC1−C10アルキルである、請求項1
6記載の化合物。 - 【請求項23】 R1とR2が、NとOから選択される少なくとも1つのヘテ
ロ原子を包含することができる環構造として、結合する、請求項16記載の化合
物。 - 【請求項24】 前記環構造がイミダゾール、ピペリジン、モルホリン又は
置換ピペラジンである、請求項23記載の化合物。 - 【請求項25】 前記置換ピペラジンがC1−C12アルキルによって置換さ
れている、請求項24記載の化合物。 - 【請求項26】 前記複素環式塩基がプリン又はピリミジンである、請求項
25記載の化合物。 - 【請求項27】 前記複素環式塩基がアデニン、シトシン、5−メチルシト
シン、チミン、ウラシル、グアニン又は2−アミノアデニンである、請求項26
記載の化合物。 - 【請求項28】 T1がヒドロキシル保護基である、請求項16記載の化合
物。 - 【請求項29】 T2が活性化リン基又は固体サポートへの結合である、請
求項16記載の化合物。 - 【請求項30】 前記固体サポート物質が微粒子である、請求項29記載の
化合物。 - 【請求項31】 前記固体サポート物質がCPGである、請求項29記載の
化合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/130,566 US6043352A (en) | 1998-08-07 | 1998-08-07 | 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides |
US09/130,566 | 1998-08-07 | ||
PCT/US1999/017895 WO2000008044A1 (en) | 1998-08-07 | 1999-08-06 | 2'-o-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002522449A true JP2002522449A (ja) | 2002-07-23 |
Family
ID=22445281
Family Applications (1)
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