JP2002522449A - ２’−ｏ−アミノエチルオキシエチル修飾オリゴヌクレオチド類 - Google Patents

２’−ｏ−アミノエチルオキシエチル修飾オリゴヌクレオチド類

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JP2002522449A
JP2002522449A JP2000563677A JP2000563677A JP2002522449A JP 2002522449 A JP2002522449 A JP 2002522449A JP 2000563677 A JP2000563677 A JP 2000563677A JP 2000563677 A JP2000563677 A JP 2000563677A JP 2002522449 A JP2002522449 A JP 2002522449A
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マノハラン，ムティア
クック，フィリップ・ダン
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Abstract

(57)【要約】 ２’−Ｏ−修飾リボシルヌクレオシドと、このようなヌクレオシドモノマーを含有する修飾オリゴマー化合物を開示する。分子モデリング実験によって示すように増強した結合アフィニティを有するオリゴマー化合物を開示する。本発明の２’−Ｏ−修飾−ヌクレオシドはヌクレオシドの糖部分を選択的に３’エンド形態で配置する環構造を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願データ 本特許出願は、出願第０９／１３０，５６６号（１９９８年８月７日出願）（
これの内容は本明細書に援用される）の一部継続出願である。
【０００２】発明の分野 本発明は、ヌクレオシドモノマーと、このようなヌクレオシドモノマーを組み
込んだオリゴマー化合物と、このようなオリゴマー化合物の使用方法とに関する
。本発明のオリゴマー化合物は治療及び研究目的のために有用である。さらに詳
しくは、本発明は、オリゴマー化合物のアフィニティとヌクレアーゼ耐性とを高
める２’−Ｏ−修飾を有するオリゴマー化合物の使用に関する。
【０００３】発明の背景 たいていの疾患状態を包含する、哺乳動物におけるたいていの身体状態がタン
パク質によって影響を受けることは周知である。古典的な治療モードは、このよ
うなタンパク質の疾患誘発機能又は疾患強化機能を緩和しようと試みて、このよ
うなタンパク質との相互作用に一般に集中している。しかし、最近は、このよう
なタンパク質の合成を指示する(direct)、例えば細胞内ＲＮＡのような分子との
相互作用によって、このようなタンパク質の実際の産生を抑制することが試みら
れている。タンパク質の産生を妨害することによって、最大の治療効果と最小の
副作用とを実現することができる。好ましくないタンパク質形成をもたらす遺伝
子発現を妨害するか又は他のやり方でモジュレートすることが、このような治療
アプローチの一般的な目的である。
【０００４】 特定の遺伝子発現を阻害するための１つの方法は、オリゴヌクレオチドの使用
である。オリゴヌクレオチドは現在、非常に有望な治療剤として現在受け入れら
れており、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ分子にハイブリダイズすることが知られてい
る。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの核酸塩基をターゲットＤ
ＮＡ又はＲＮＡ分子の核酸塩基に水素結合させる配列特異的塩基対である。この
ような核酸塩基対は相互に相補的であるといわれる。アンチセンス阻害としても
知られる、ターゲットＲＮＡ配列へのオリゴヌクレオチドの配列特異的結合を用
いて遺伝子発現を阻害するという概念は、生きている細胞を含めた、多様な系に
おいて実証されている（例えば、Ｗａｇｎｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）
２６０：１５１０−１５１３；Ｍｉｌｌｉｇａｎ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，
（１９９３）３６：１９２３−３７；Ｕｈｌｍａｎｎ等，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅ
ｗｓ，（１９９０）９０：５４３−５８４；Ｓｔｅｉｎ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．，（１９８８）４８：２６５９−２６６８）。
【０００５】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって核酸機能を破壊させるイベント（
Ｃｏｈｅｎ ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，（１９８９）
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）は、２種類であ
ると考えられる。最初のハイブリダイゼーション停止は、オリゴヌクレオチド阻
害剤がターゲット核酸に結合し、それによって、簡単な立体障害によって、必須
タンパク質が、最もしばしばはリボソームが核酸に結合するのを妨害する停止イ
ベントである。メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．
Ｓ．とＴｓ’Ｏ，Ｐ．Ｏ．Ｐ．（１９８７）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓｉｇｎ，２：１１７−１２８）と、α−アノマー・オリゴヌクレオチド
とは、ハイブリダイゼーション停止によって核酸機能を破壊すると考えられる、
最も広範囲に研究されている２種類のアンチセンス作用剤である。
【０００６】 アンチセンス・オリゴヌクレオチドの停止イベントの第２種類は、細胞内ＲＮ
アーゼＨによるターゲットＲＮＡの酵素開裂を包含する。２’−デオキシリボ−
フラノシル・オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体はターゲットＲ
ＮＡとハイブリダイズし、この二本鎖(duplex)がＲＮアーゼＨ酵素を活性化して
、ＲＮＡ鎖を開裂させて、それによってＲＮＡの正常機能を破壊させる。ホスホ
ロチオエート・オリゴヌクレオチドは、この種類のアンチセンス停止イベントに
よって作用するアンチセンス作用剤の最も顕著な例である。
【０００７】 オリゴヌクレオチドは二本鎖核酸に結合して、配列特異的形式でＨｏｏｇｓｔ
ｅｅｎ塩基対合を介して三本鎖複合体を形成することもできる（Ｂｅａｌ等，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，（１９９１）２５１：１３６０−１３６３；Ｙｏｕｎｇ等，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９１）８８：１００２３−１００２
６）。アンチセンス治療方策と三重らせん治療方策の両方は、疾患状態の確立又
は維持に関与する又は疾患状態の確立又は維持の原因である核酸配列を対象とす
る。このようなターゲット核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物、寄生虫、
ウイルスを含めた病原性生物のゲノム中に見出すことができるか、又は本質的に
内因性でありうる。疾患状態の確立、維持又は解消に重要な遺伝子にハイブリダ
イズする又はこのような遺伝子の発現を修飾することによって、対応する状態を
治療、予防又は軽減することができる。
【０００８】 相補的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション度の判定におい
て、相補的核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対的能力は特定のハイブリダ
イゼーション複合体の融解温度を測定することによって比較することができる。
二重らせんの融解温度（Ｔm）、特徴的な物理的性質は、５０％のらせん形（ハ
イブリダイズした）対コイル形（ハイブリダイズしない）が存在する温度（摂氏
度）を意味する。Ｔmはハイブリダイゼーション複合体の形成及び破壊（融解）
を 判定するためにＵＶスペクトルを用いることによって測定される。ハイブリダイ
ゼーション中に生ずる塩基重層はＵＶ吸収（淡色性(hypochromicity)）の低下を
付随する。したがって、ＵＶ吸収の低下は高いＴmを意味する。Ｔmが高ければ高
いほど、鎖間の結合の強度が大きい。
【０００９】 オリゴヌクレオチド類は例えば細胞内又は細胞外のポリペプチド、タンパク質
又は酵素のような非核酸バイオ分子に結合するときに、オリゴヌクレオチド類は
治療的にも価値がありうる。このようなオリゴヌクレオチド類はしばしば“アプ
タマー(aptamer)”とも呼ばれ、これらはタンパク質ターゲットに典型的に結合
して、タンパク質ターゲットの機能を妨害する（Ｇｒｉｆｆｉｎ等，Ｂｌｏｏｄ
（１９９３），８１：３２７１−３２７６；Ｂｏｃｋ等，Ｎａｔｕｒｅ（１９９
２）３５５：５６４−５６６）。
【００１０】 オリゴヌクレオチド類とそれらの類似体類（オリゴマー化合物）は診断目的、
治療用途のために及び研究試薬として開発され、用いられている。治療薬として
の使用に関しては、オリゴヌクレオチドは好ましくは細胞膜を横切って輸送され
るか又は細胞に吸収されて、ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡと適当にハイブリダイ
ズする。これらの機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの初期安
定性に依存すると考えられる。治療目的のためのターゲットＤＮＡ又はＲＮＡと
の非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション力に影響を与える非修飾
オリゴヌクレオチドの欠点(deficiency)は、多様な偏在的細胞内又は細胞外の、
ヌクレアーゼと呼ばれる核酸分解酵素によって非修飾オリゴヌクレオチドが分解
されることである。オリゴヌクレオチドが治療薬(therapeutics)又は診断薬(dia
gnostics)として有用であるためには、オリゴヌクレオチドは相補的ターゲット
核酸に対する強化された結合アフィニティを示すべきであり、好ましくはヌクレ
アーゼに対して妥当に安定であり、分解に耐性であるべきである。例えば研究試
薬としての非細胞的使用のためには、オリゴヌクレオチドは必ずしもヌクレアー
ゼ安定性を有する必要はない。
【００１１】 ターゲットＤＮＡ又はＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドの結合アフィニティ
を高め、ヌクレアーゼ分解を阻止するためにオリゴヌクレオチド中に多くの化学
的修飾が導入されている。修飾は例えばヌクレアーゼに対する耐性を高めるため
にホスフェート・バックボーン(phosphate backbone)になされている。これらの
修飾は例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエー
トのような結合の使用と、例えば２’−Ｏ−アルキルリボースのような修飾糖部
分の使用を包含する。他のオリゴヌクレオチド修飾は、吸収(uptake)と細胞内分
配をモジュレートするためになされた修飾を包含する。ヌクレオチド間結合の性
質を劇的に変える多くの修飾も文献に報告されている。これらは非リン結合、ペ
プチド核酸（ＰＮＡ’ｓ）結合及び２’−５’結合を包含する。通常は診断及び
研究用途のための、オリゴヌクレオチドに対する他の修飾は、非同位体標識、例
えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ又は
他のレポーター分子によって標識することである。
【００１２】 最近１０年間にわたって、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を高めるために又は
ターゲットｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖のアフィニティを強化するために、
多様な合成的修飾が提案されている（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ
．，１９９６，１６，３１９−３４４；Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等，ＡＣＣ．
Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９５，２８，３６６−３７４）。オリゴヌクレオチド
中の天然の、容易に開裂されるホスホジエステル結合に代わるものとして多様な
修飾リン含有結合が研究されている。一般に、たいていのこのような修飾リン含
有結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート(phosphoramidate)、
ホスホネート及びホスホロジチオエートは全て、相補的ターゲットへの結合の減
少とハイブリッド安定性の低下とを有するオリゴヌクレオチドを生じる。
【００１３】 “Ａ形”構造(geometry)と呼ばれているＲＮＡが存在し、ＤＮＡは“Ｂ形”構
造で存在する。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖はＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖よりも安
定である、又はより高い融解温度（Ｔm）を有する（Ｓａｎｇｅｒ等，Ｐｒｉｎ
ｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９８
４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｌｅｓｎｉｋ
等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１０８０７−１０８１５；Ｃ
ｏｎｔｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，２６２
７−２６３４）。ＲＮＡの大きい安定性は幾つかの構造的特徴、最も著しくは、
Ａ形構造に起因する、改良された塩基重層相互作用によるものと考えられている
（Ｓｅａｒｌｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，
２０５１−２０５６）。ＲＮＡ中の２’ヒドロキシルの存在は糖を、ノーザンパ
ッカーとも呼ばれるＣ３’エンドパッカー方向に偏らせ、二本鎖をＡ形構造に有
利にする。 他方では、デオキシ核酸はＣ２’エンド糖パッカーに有利であり、Ｃ２’エンド
パッカー、即ち、サザンパッカーとしても知られるものは安定性の低いＢ形構造
を与えると考えられる（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−
Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。さらに、ＲＮＡの２’ヒドロキシル
基は、ＲＮＡ二本鎖の安定化に役立つ水仲介水素結合のネットワークを形成する
ことができる（Ｅｇｌｉ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５，８４
８９−８４９４）。
【００１４】 しかし、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖は通常はＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖よ
りも安定性が低く、それらの配列に依存して、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖よりも高い
安定性でも、低い安定性でもありうる（Ｓｅａｒｌｅ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ハイブリッド二本
鎖の構造は、Ａ形構造とＢ形構造との中間であり、不良な重層相互作用を生じう
る（Ｌａｎｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１５，２９７−
３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３３，５
０９−５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３
４，４９６９−４９８２；Ｈｏｒｔｏｎ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６
，２６４，５２１−５３３）。提案された機構としてのアンチセンス治療法の重
要な態様であるＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性は、ｍＲＮＡ鎖への修飾Ｄ
ＮＡ鎖の結合を必要とする。理想的には、アンチセンスＤＮＡはｍＲＮＡとの非
常に大きい結合アフィニティを有するべきである。さもなくば、ＤＮＡとターゲ
ットｍＲＮＡ鎖との間の所望の相互作用が生ずることがまれになり、それによっ
てアンチセンス・オリゴヌクレオチドの効力が低下する。
【００１５】 増強したヌクレアーゼ耐性と、ヌクレオチドに対する非常に大きい結合アフィ
ニティとを与える合成２’−修飾の１つは２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ，２
’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3）である（Ｂａｋｅｒ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００；Ｆｒｅｉｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３）。ＭＯＥ置
換の直接の利益の１つは、例えばＯ−メチル、Ｏ−プロピル及びＯ−アミノプロ
ピルのような、多くの同様な２’修飾よりも大きい結合アフィニティの改良であ
る（ＦｒｅｉｅｒとＡｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，（１９９７）２５：４４２９−４４４３）。２’−Ｏ−メトキシエチル
置換もｉｎ ｖｉｖｏ使用のために有望な特徴(feature)を有する、遺伝子発現
のアンチセンス阻害剤であることが判明している（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌ
ｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９９５，７８，４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎ等
，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎ等，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；及びＡｌ
ｔｍａｎｎ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，
１６，９１７−９２６）。ＤＮＡに比べて、これらは改良されたＲＮＡアフィニ
ティと大きいヌクレアーゼ耐性とを示す。２’−Ｏ−メトキシエチル−リボヌク
レオシド・ウィング(wings) と中央のＤＮＡ−ホスホロチオエート・ウィンドウとを有するキメラ・オリゴヌ
クレオチドも動物モデルにおける腫瘍の増殖を低用量で効果的に減ずることが判
明している。ＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドは幾つかの疾患状態においてアンチ
センス作用剤としての優れた見込みを示している。このようなＭＯＥ置換オリゴ
ヌクレオチドの１つは、ＣＭＶ網膜炎の治療のための臨床トライアルで現在研究
されている。
【００１６】 ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾の使用を含めた、オリゴヌクレオチドの既知修
飾は種々な用途のためのオリゴヌクレオチドの開発に寄与しているが、オリゴヌ
クレオチド類とそれらの類似体に強化されたハイブリッド結合アフィニティ及び
／又は増強されたヌクレアーゼ耐性を与えるさらなる修飾の必要性が当該技術分
野になおも存在する。
【００１７】 発明の概要 本発明は少なくとも１つの２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ（Ｒ1
）（Ｒ2）修飾ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物を提供する。本発明の好
ましいオリゴマー化合物は式：
【化３】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基であり； Ｒ1とＲ2の各々は独立的にＨ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ1−Ｃ10ア
ルキル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ10アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ 10 アルキニルであり、前記置換基はＯＲ3、ＳＲ3、ＮＨ3 +、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある； 又はＲ1とＲ2は一緒に窒素保護基であるか又は、任意にＮとＯから選択される
付加的なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する；及び Ｒ3とＲ4の各々は独立的にＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、窒素保護基であるか、又
はＲ3とＲ4は一緒に窒素保護基である； 又はＲ3とＲ4は、ＮとＯから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する］で示される、少なくとも１つのヌクレオシドを包含す
るオリゴマー化合物である。
【００１８】 １実施態様では、Ｒ1はＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル又はＣ1−Ｃ10置換アルキルで
あり、Ｒ2はＣ1−Ｃ10置換アルキルである。他の実施態様では、Ｒ1はＣ1−Ｃ10 アルキルである。さらなる実施態様では、Ｒ2はＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、
置換基はＮＨ3 +又はＮ（Ｒ3）（Ｒ4）である。他の実施態様では、Ｒ1とＲ2は両
方ともＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にＮＨ3 +又はＮ
（Ｒ3）（Ｒ4）から選択される。さらに他の実施態様では、Ｒ1とＲ2の両方がＣ 1 −Ｃ10アルキルである。
【００１９】 １実施態様では、Ｒ1とＲ2が、ＮとＯから選択される少なくとも１つのヘテロ
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
Ｃ1−Ｃ12アルキルである。
【００２０】 １実施態様では、複素環式塩基はプリン又はピリミジンであり、好ましい複素
環式塩基はアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は２−アミノアデニンである。
【００２１】 １実施態様では、オリゴマー化合物は約５〜約５０個のヌクレオシドを含む。
好ましい実施態様では、オリゴマー化合物は約８〜約３０個のヌクレオシドを含
み、好ましい範囲は約１５〜約２５個のヌクレオシドである。
【００２２】 本発明はまた、式：
【化４】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基であり； Ｔ1とＴ2は独立的にＯＨ、保護されたヒドロキシル、活性化リン基、ヌクレオ
チド間結合を形成するための反応性基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌ
クレオシド、オリゴヌクレオチド、又は固体サポートへの結合である； Ｒ1とＲ2の各々は独立的にＨ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ1−Ｃ10ア
ルキル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ10アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ 10 アルキニルであり、前記置換基はＯＲ3、ＳＲ3、ＮＨ3 +、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、
グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
ある； 又はＲ1とＲ2は一緒に窒素保護基であるか又は、ＮとＯから選択される付加的
なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する；及び Ｒ3とＲ4の各々は独立的にＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、窒素保護基であるか、又
はＲ3とＲ4は一緒に窒素保護基である； 又はＲ3とＲ4は、ＮとＯから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
環構造として、結合する］で示されるヌクレオシド化合物をも包含する。
【００２３】 １実施態様では、Ｒ1はＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル又はＣ1−Ｃ10置換アルキルで
あり、Ｒ2はＣ1−Ｃ10置換アルキルである。他の実施態様では、Ｒ1はＣ1−Ｃ10 アルキルである。さらなる実施態様では、Ｒ2はＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、
置換基はＮＨ3 +又はＮ（Ｒ3）（Ｒ4）である。他の実施態様では、Ｒ1とＲ2は両
方ともＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、好ましい置換基は独立的にＮＨ3 +とＮ（
Ｒ3）（Ｒ4）から選択される。さらに他の実施態様では、Ｒ1とＲ2は両方ともＣ 1 −Ｃ10アルキルである。
【００２４】 １実施態様では、Ｒ1とＲ2は、ＮとＯから選択される少なくとも１つのヘテロ
原子を包含することができる環構造として、結合する。好ましい環構造はイミダ
ゾール、ピペリジン、モルホリン又は置換ピペラジンであり、好ましい置換基は
Ｃ1−Ｃ12アルキルである。
【００２５】 １実施態様では、複素環式塩基はプリン又はピリミジンであり、好ましい複素
環式塩基はアデニン、シトシン、５−メチルシトシン、チミン、ウラシル、グア
ニン又は２−アミノアデニンである。
【００２６】 １実施態様では、Ｔ1はヒドロキシル保護基である。他の実施態様では、Ｔ2は
活性化リン基又は固体サポートへの結合である。好ましい固体サポート物質は微
粒子である。ＣＰＧがより好ましい固体サポート物質である。
【００２７】 発明の詳細な説明 本発明は新規な２’−Ｏ−修飾ヌクレオシドモノマーと、これらの新規な２’
−Ｏ−修飾ヌクレオシドモノマーを組み入れたオリゴマー化合物とに関する。こ
れらの修飾は、結合アフィニティ及び／又はヌクレアーゼ耐性の増強に寄与する
、ある一定の望ましい性質を有する。
【００２８】 強化された結合アフィニティを有するオリゴマー化合物を設計する場合に、考
慮すべき多くのアイテムが存在する。非常に高いＲＮＡ結合アフィニティを有す
るオリゴマー化合物を構築するための効果的なアプローチの１つは、各々が結合
アフィニティのために重要であると考えられる種々な要因に有利に寄与する、２
種類以上の異なる修飾の組み合わせに関する。
【００２９】 ＦｒｅｉｅｒとＡｌｔｍａｎｎのＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ，（１９９７）２５：４４２９−４４４３は最近、ターゲットＲＮＡとオリ
ゴヌクレオチドとの二本鎖の安定性に対するオリゴヌクレオチドの構造的修飾の
影響に関する研究を発表した。この研究で、著者は２００種類を超える修飾を含
有するオリゴヌクレオチド系列を検討し、これらのオリゴヌクレオチド系列を合
成し、それらのハイブリダイゼーション・アフィニティとＴmとに関して評価し
ている。 研究された糖修飾は糖の２’位の置換、３’−置換、４’−酸素の置換、二環式
糖の使用及び四員環置換を包含した。チミンの５又は６位における置換、ピリミ
ジン複素環の修飾、及びプリン複素環の修飾を含めた、幾つかの複素環式塩基の
修飾も研究されている。リン含有バックボーン、リン原子を含有しないバックボ
ーン及び中性であるバックボーンを含めた、非常に多くのバックボーン修飾も研
究されている。
【００３０】 ４種類の一般的なアプローチも可能性として、ＲＮＡターゲットへのオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーションを改良するために用いることが考えられる
。これらは、オリゴヌクレオチド鎖の糖及びホスフェートの、ハイブリッド形成
に有利なコンフォメーションへの予備組織化、オリゴヌクレオチドのヌクレオシ
ドモノマーの複素環式塩基に極性化可能基を添加することによる核酸塩基重層の
改良、Ａ−Ｕ対合のために利用可能なＨ結合数の増加、及び好ましくない反撥相
互作用の除去を促進するためのバックボーン電荷の中和を包含する。本発明は特
にこれらのうちの最初のアプローチ、即ち、オリゴデオキシヌクレオチド鎖の糖
及びホスフェートの、ハイブリッド形成に有利なコンフォメーションへの予備組
織化を用いるが、これは他の３アプローチと組み合わせて用いることができる。
【００３１】 ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖中の糖はしばしばＣ３’エンドコンフォメ
ーションを採る。したがって、一本鎖中の糖部分のコンフォメーション平衡をこ
のコンフォメーション方向へシフトさせる修飾が、ＲＮＡへの結合のためにアン
チセンス鎖を予備組織化する筈である。文献に報告され、研究されている幾つか
の糖修飾のうちで、例えば２’−フルオロ又は２’−アルコキシのような電気陰
性置換基の組み込みが糖コンフォメーションを３’エンド（ノーザン）パッカー
・コンフォメーション方向にシフトする。このパッカー・コンフォメーションは
、そのターゲットを有するオリゴヌクレオチドのＴmの上昇をさらに助成した。
【００３２】 ２’位における置換基サイズと二本鎖安定性との間には明確な相関関係が存在
する。２’位におけるアルキル置換基の組み込みは典型的に結合アフィニティを
有意に低下させる。したがって、小さいアルコキシ基が一般に非常に有利であり
、２’位における大きいアルコキシ基は一般に不利である。しかし、２’−置換
基がエチレングリコール・モチーフを含有した場合には、ターゲットＲＮＡへの
結合アフィニティの強い改良が観察される。
【００３３】 ２’−置換基に起因する大きい結合アフィニティはある程度はＣ３’エンド糖
パッカーを生じる２’−置換によるとされており、このパッカーが次にオリゴマ
ーに有利なＡ形様構造を与えることができる。これは、多様な電気陰性基（例え
ば、フルオロ及びＯ−アルキル鎖）による２’位の置換はＣ３’エンド糖パッカ
ーリング(puckering)を生じることが実証されているので、妥当な仮説である（
Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９５，２８，
３６６−３７４；Ｌｅｓｎｉｋ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２
，７８３２−７８３８）。
【００３４】 さらに、エチレングリコール・モチーフを含有する２’−置換基に関して、側
鎖のＯ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれ周囲の酸素原子間のゴーシュ相互作用(gauche intera
ction)は二本鎖に安定化効果を及ぼすことができる（Ｆｒｅｉｅｒ等，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９７）２５：４４２９−４４４
２）。このようなゴーシュ相互作用は多年にわたって実験的に観察されている（
Ｗｏｌｆｅ等，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９７２，５，１０２；Ａｂｅ等
，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７６，９８，４６８）。このゴーシュ効
果は、二本鎖形成に有利である側鎖の配置(configuration)を生じることができ
る。 この安定化配置の正確な性質はまだ説明されていない。本発明者らは理論によっ
て縛られることを望むわけではないが、アルキル側鎖に見られるランダムな分布
ではなく、単一ゴーシュ配置にＯ−Ｃ−Ｃ−Ｏねじれを保持することが二本鎖形
成のためのエントロピー的利益を与えると考えられる。
【００３５】 本発明は、式：２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ（Ｒ1）（Ｒ2）［式中、Ｒ 1 とＲ2はそれぞれアルキル又は置換アルキル基であることができる］を有して、
プロトン化されうる第３級アミンを生じる２’側鎖を有する。Ｒ1とＲ2が両方と
もメチル基であるときに、側鎖のｐＫａは９．０〜１０．０である（脂肪族飽和
３°アミン）。この第３級アミンは生理的ｐＨ（７．０）において、及びエンド
ソームとリソソーム（ｐＨ５．０）中でプロトン化されると期待される。得られ
る正電荷はヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドに結合するのを阻害するか又はヌ
クレアーゼがその機能を発揮するために必要な金属イオンを排除することによっ
て、薬物の生体内安定性(biostability)を改良することになる（Ｂｅｅｓｅ等，
ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，２５−３３；及びＢｒａｕｔｉｇａｍ等，Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１９９８，２７７，３６３−３７７）。
【００３６】 本明細書で用いる限り、“オリゴヌクレオシド”なる用語は、非リン結合部分
を有する２つ以上のヌクレオシド・サブユニットを含有するオリゴマー又はポリ
マーを包含する。本発明によるオリゴヌクレオシドは、グリコシル結合を通して
複素環式塩基に結合したリボフラノース部分を有するモノマーサブユニットであ
る。本発明のためにオリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合によ
って共有結合した少なくとも２つのヌクレオシドと、ヌクレオチドによる少なく
とも１つのリン含有共有結合を有する混合バックボーン・オリゴマーであり、こ
の場合にモノマーヌクレオチド又はヌクレオシド単位の少なくとも１つは本発明
の方法を用いて製造された２’−Ｏ−置換化合物である。オリゴ−ヌクレオチド
／ヌクレオシドは、リン含有及び／又は非リン含有結合によってカップリングし
た複数個のヌクレオチドとヌクレオシドとを付加的に有することができる。
【００３７】 本発明に関連して、“オリゴマー化合物”なる用語は、天然及び非天然生成ヌ
クレオシドから特定の配列で一緒に結合した、複数個のヌクレオシドを意味する
。この用語はオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、非リン含有ヌク
レオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、及び総てリン含有ヌクレオシド間
結合又はリン含有ヌクレオシド間結合と非リン含有ヌクレオシド間結合とを包含
しうる混合ヌクレオシド間結合を有するキメラ・オリゴマー化合物を包含する。
本発明のオリゴマー化合物の各々は少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを有し、
この場合に修飾は本発明のアミノオキシ化合物である。本発明の好ましいヌクレ
オシドはリン結合を経て糖部分を通して結合するものであり、アデニン、グアニ
ン、アデニン、シトシン、ウラシル、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、２
−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル及び他のアルキルアデニン、５−
ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザウラシル、６−アザシトシン及び６
−アザチミン、プソイドウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−
アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−
ヒドロキシルアデニン及び他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミ
ノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオールアルキルグアニン、８−ヒド
ロキシルグアニン及び他の８−置換グアニン、他のアザ及びデアザウラシル、他
のアザ及びデアザチミジン、他のアザ及びデアザシトシン、他のアザ及びデアザ
アデニン、他のアザ及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、及
び５−トリフルオロシトシンを包含する。
【００３８】 リン含有結合 ホスホロジチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｓ）−Ｏ−）； ホスホロチオエート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホロアミデート（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｏ−）； ホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｊ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（ＯＪ）（Ｏ）−Ｏ−）； ホホスホロアミデート(phophosphoramidate)（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−
）； チオノアルキルホスホネート（−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｊ）−Ｏ−）； チオノアルキルホスホトリエステル（−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＪ）−Ｓ−）； ボラノホスフェート（−Ｒ5−Ｐ（Ｏ）（Ｏ）−Ｊ−）；
【００３９】 非リン含有結合 チオジエステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−）； チオノカルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）（ＮＪ）−Ｓ−）； シロキサン（−Ｏ−Ｓｉ（Ｊ）2−Ｏ−）； カルバメート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−及び−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）； スルファメート（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ−及び−Ｎ−Ｓ（Ｏ）（Ｏ）−Ｎ
−）； モルホリノスルファミド（−Ｏ−Ｓ（Ｏ）（Ｎ（モルホリノ）−）； スルホンアミド（−Ｏ−ＳＯ2−ＮＨ−）； スルフィド（−ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−）； スルホネート（−Ｏ−ＳＯ2−ＣＨ2−）； Ｎ，Ｎ’−ジメチルヒドラジン（−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−）； チオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ2−Ｏ−）； ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−）； チオケタール（−Ｓ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）；及び ケタール（−Ｏ−Ｃ（Ｊ）2−Ｏ−）； アミン（−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−）； ヒドロキシルアミン（−ＣＨ2−Ｎ（Ｊ）−Ｏ−）； ヒドロキシルイミン（−ＣＨ＝Ｎ−Ｏ−）；並びに ヒドラジニル（−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）−Ｎ（Ｈ）−）。
【００４０】 上記において、“Ｊ”は置換基を意味し、一般に水素又はアルキル基又はより
複雑な基であり、結合の種類によって変化する。
【００４１】 天然生成結合の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−原子の修飾又は置換を包含する上記連結基(lin
king group)の他に、５’−メチレン基並びに１つ以上の−Ｏ−Ｐ−Ｏ−原子の
修飾を包含する連結基も本発明の範囲内に含まれる。この種類の結合は先行技術
に充分に記録されており、非限定的に下記：アミド（−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｎ（Ｈ）
−Ｃ（Ｏ））と−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−；及びアルキルリン（−Ｃ（Ｊ）2−Ｐ
（＝Ｏ）（ＯＪ）−Ｃ（Ｊ）2−Ｃ（Ｊ）2−）を包含する。式中、Ｊは上述した
通りである。
【００４２】 上述した置換ヌクレオシド間結合を合成するための合成スキームは、ＷＯ９１
／０８２１３；ＷＯ９０／１５０６５；ＷＯ９１／１５５００；ＷＯ９２／２０
８２２；ＷＯ９２／２０８２３；ＷＯ９１／１５５００；ＷＯ８９／１２０６０
；ＥＰ２１６８６０；ＵＳ９２／０４２９４；ＵＳ９０／０３１３８；ＵＳ９１
／０６８５５；ＵＳ９２／０３３８５；ＵＳ９１／０３６８０；米国特許第０７
／９９０，８４８号；第０７／８９２，９０２号；第０７／８０６，７１０号；
第０７／７６３，１３０号；第０７／６９０，７８６号；第５，４６６，６７７
号；第５，０３４，５０６号；第５，１２４，０４７号；第５，２７８，３０２
号；第５，３２１，１３１号；第５，５１９，１２６号；第４，４６９，８６３
号；第５，４５５，２３３号；第５，２１４，１３４号；第５，４７０，９６７
号；第５，４３４，２５７号；Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．等，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９８９，１７，６１２９−６１４１；Ｈｅｗｉｔｔ，
Ｊ．Ｍ．等，１９９２，１１，１６６１−１６６６；Ｓｏｏｄ，Ａ．等，Ｊ．Ａ
ｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，９０００−９００１；Ｖａｓｅｕ
ｒ，Ｊ．Ｊ．等，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，４０
０６−４００７；Ｍｕｓｉｃｈｉ，Ｂ．等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９０
，５５，４２３１−４２３３；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ｃ．等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃ
ｈｅｍ．，１９９２，５７，２９８３−２９８５；Ｍｅｒｔｅｓ，Ｍ．Ｐ．等，
Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９６９，１２，１５４−１５７；Ｍｕｎｇａｌｌ，
Ｗ．Ｓ．等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７７，４２，７０３−７０６；Ｓｔ
ｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．等，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，５２，４２０
２−４２０６；Ｃｏｕｌｌ，Ｊ．Ｍ．等，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，１９８７，２８
，７４５；及びＷａｎｇ，Ｈ．等，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，１９９１，３２，７３
８５−７３８８に記載されている。
【００４３】 本発明のヌクレオシドモノマー及びオリゴマー化合物は修飾糖と修飾塩基とを
包含しうる（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号とＰＣＴ出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ８９／０２３２３参照）。このようなオリゴマー化合物は、天然生成又は合成
野性型オリゴヌクレオチドとは構造的に区別可能であるが、まだこれらと機能的
に互換性であると最も良く述べられている。代表的な修飾糖は炭素環式又は非環
式糖、２’位に置換基を有する糖、３’位に置換基を有する糖、及び糖の１つ以
上の水素の代わりに置換基を有する糖を包含する。代表的な修飾は国際公報ＷＯ
９１／１０６７１（１９９１年７月２５日公開）、ＷＯ９２／０２２５８（１９
９２年２月２０日公開）、ＷＯ９２／０３５６８（１９９２年３月５日公開）、
及び米国特許第５，１３８，０４５号、第５，２１８，１０５号、第５，２２３
，６１８号、第５，３５９，０４４号、第５，３７８，８２５号、第５，３８６
，０２３号、第５，４５７，１９１号、第５，４５９，２５５号、第５，４８９
，６７７号、第５，５０６，３５１号、第５，５４１，３０７号、第５，５４３
，５０７号、第５，５７１，９０２号、第５，５７８，７１８号、第５，５８７
，３６１号、第５，５８７，４６９号に開示されており、これらは総て本出願の
譲受人に譲渡されている。上記公報の各々の開示は本明細書に援用される。
【００４４】 例えば、３’末端ヌクレオシドモノマーの糖の３’−位置及び５’末端ヌクレ
オシドモノマーの５’−位置において他の修飾を行うこともできる。本発明の１
態様では、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分配又は細胞取り込みを強化する、
部分又はコンジュゲートが修飾のために利用可能である１つ以上の位置に化学的
に結合される。このような部分は、非限定的に、例えばコレステロール部分のよ
うな脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｂ
ｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０５３）、チオ
エーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，
Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６；Ｍａｎｏｈ
ａｒａｎ等，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３，３，２
７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオー
ル若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１９９１，１０，１１１；Ｋａｂａｎｏｖ等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１
９９０，２５９，３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９
９３，７５，４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ
ール又はトリエチルアンモニウム １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グ
リセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ
ｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１；Ｓｈｅａ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングリ
コール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏ
ｓｉｄｉｃ ｍｏｎｏｍｅｒｓ、１９９５，１４，９６９）、又はアダマンタン
酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５
，３６，３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９）、又はオクタデシルアミ
ン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏ
ｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９
２３）を包含する。
【００４５】 本発明に受容される、代表的な複素環式塩基は、グアニン、シトシン、ウリジ
ン及びチミン、並びに他の合成及び天然核酸塩基、例えば、キサンチン、ヒポキ
サンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のア
ルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、
５−ハロ ウラシル及びシトシン、６−アゾ ウラシル、シトシン及びチミン、
５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、ア
ミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグ
アニン、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−
メチルグアニンを包含する。他のプリン及びピリミジンは米国特許第３，６８７
，８０８号に開示されるもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏ
ｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５
８−８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編集，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、及びＥｎｇｌｉｓｃｈ等，Ａｎｇｅ
ｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ
１９９１，３０，６１３に開示されるものを包含する。このようなオリゴマー化
合物は総て本発明によって包含される。
【００４６】 本発明のオリゴマー化合物の製造に用いられるヌクレオシドモノマーは、例え
ば活性化リン酸(phosphate)基又は活性化亜リン酸(phosphite)基のような、適当
な活性化リン基を包含することができる。本明細書で用いる限り、活性化リン酸
基又は活性化亜リン酸基なる用語は、他のモノマー又はオリゴマー化合物のヒド
ロキシル基と反応して、リン含有ヌクレオチド間結合を形成する活性化モノマー
又はオリゴマーを意味する。このような活性化リン基はＰIII又はＰV原子価状態
の活性化リン原子を含有する。このような活性化リン原子は当該技術分野で知ら
れており、非限定的に、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート及びホスフェー
トトリエステルを包含する。好ましい合成固相合成(synthetic solid phase syn
thesis)は活性化ホスフェートとしてホスホロアミダイトを用いる。ホスホロア
ミダイトはＰIII化学を用いる。中間体のホスフィット化合物を次に既知方法を
用いてＰV状態に酸化して、好ましい実施態様では、ホスホジエステル又はホス
ホロチオエート・ヌクレオチド間結合を生成する。他の活性化ホスフェート及び
ホスフィットはＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｕｍｂｅｒ ３０９
（ＢｅａｕｃａｇｅとＩｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２
２２３−２３１１）に開示されている。
【００４７】 多くの化学官能基を本発明の化合物中にブロックされた形で導入して、後で脱
ブロックして最終の所望の化合物を形成することができる。このような基は複素
環式塩基に直接又は間接的に結合した基として、及び２’、３’及び５’位にお
ける糖置換基として導入することができる。一般に、ブロッキング基は大きい分
子の化学官能基(chemical functionality)を特定の反応条件に対して不活性にし
て、後でこのような官能基から分子の残りの部分を実質的に損傷することなく除
去されることができる（ＧｒｅｅｎとＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏ
ｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。例えば、アミノ基の窒素
原子はフタルイミドとして、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）
として、及びトリフェニルメチルスルフェニル、ｔ−ＢＯＣ又はベンジル基によ
ってブロックされることができる。カルボキシル基はアセチル基として保護され
ることができる。代表的なヒドロキシル保護基はＢｅａｕｃａｇｅ等、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２３によって記載されている。好ましい
ヒドロキシル保護基は酸に不安定(acid-labile)であり、例えば、トリチル、モ
ノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニ
ルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサ
ンチン−９−イル（ＭＯＸ）である。化学官能基は先駆体形にそれらを含めるこ
とによって“ブロックされる”こともできる。したがって、アジド基は容易にア
ミンに転化されるので、アジド基はアミンの“ブロックされた”形と見なされる
ように用いられることができる。オリゴヌクレオチド合成に用いられる、他の代
表的な保護基はＡｇｒａｗａｌ等，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，編集者，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４，２６巻，１−７２頁で考察されている。
【００４８】 ヒドロキシル保護基の例は、非限定的に、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、
メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロ
ロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，
４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチ
ル、ｐ、ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメ
チル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−
ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテ
ート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピ
バロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチ
ル、カーボネート、メシレート及びトシレートを包含する。
【００４９】 酸処理に安定なアミノ保護基は塩基処理によって選択的に除去され、置換に選
択的に利用可能な反応性アミノ基を作成するために用いられる。このような基の
例はＦｍｏｃ（Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎとＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｔｈｅ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ、Ｓ．ＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄとＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編集，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，１９８７，９巻，１頁）と、
Ｎｓｃ基によって例示される、種々な置換スルホニルエチルカルバメート（Ｓａ
ｍｕｋｏｖ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９４，３５：７８２
１；ＶｅｒｈａｒｔとＴｅｓｓｅｒ，Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ−
Ｂａｓ，１９８７，１０７：６２１）である。
【００５０】 他のアミノ−保護基は非限定的に例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボ
ニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル
（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（
Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）及びベン
ジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）のようなカルバメート保護基と；例えばホルミ
ル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル及びニトロフェニルアセチルのよ
うなアミド保護基と；例えば２−ニトロベンゼンスルホニルのようなスルホンア
ミド保護基と；例えばフタルイミド及びジチアスクシノイルのようなイミン−及
び環式イミド−保護基とを包含する。これらのアミノ保護基の同等物も、本発明
の化合物及び方法によって包含される。
【００５１】 幾つかの特に好ましい実施態様では、本発明の、１つ以上のヌクレオシド間結
合を含むオリゴマー化合物は、任意に保護されたホスホロチオエート・ヌクレオ
シド間結合である。例えばホスフィット、ホスホジエステル及びホスホロチオエ
ート結合のようなリン含有ヌクレオシド間結合のための代表的な保護基はβ−シ
アノエチル、ジフェニルシリルエチル、δ−シアノブテニル、シアノｐ−キシリ
ル（ＣＰＸ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリフルオロ−アセチルエチル（ＭＥＴＡ）、
アセトキシフェノキシエチル（ＡＰＥ）、及びブテン−４−イルを包含する。例
えば、米国特許第４，７２５，６７７号と第Ｒｅ．３４，０６９号（β−シアノ
エチル）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ、４９，１０号，１９２５−１９６３頁（１９９３）；Ｂｅａｕｃａｇ
ｅ，Ｓ．Ｌ．とＩｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９，４６号，
１０４４１−１０４８８頁（１９９３）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．とＩｙｅ
ｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４８，１２号，２２２３−２３１１頁
（１９９２）を参照のこと。
【００５２】 本明細書に関連して、アルキル（一般に、Ｃ1−Ｃ20）、アルケニル（一般に
、Ｃ2−Ｃ20）、及びアルキニル（一般に、Ｃ2−Ｃ20）（より好ましい範囲は、
Ｃ1−Ｃ10アルキル、Ｃ2−Ｃ10アルケニル及びＣ2−Ｃ10アルキニルから）基は
、非限定的に、置換及び非置換直鎖、分枝鎖及び脂環式炭化水素を包含し、メチ
ル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシ
ル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及び
他のより高級な炭素アルキル基を包含する。他の例は２−メチルプロピル、２−
メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルブチル、３−プロピルブチル、２
，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチル
オクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−
エチルヘキシル、及び他の分枝鎖基、アリル、クロチル、プロパルギル、２−ペ
ンテニル及び他のパイ結合含有不飽和基、シクロヘキサン、シクロペンタン、ア
ダマンタン、並びに他の脂環式基、３−ペンテン−２−オン、３−メチル−２−
ブタノール、２−シアノオクチル、３−メトキシ−４−ヘプタナール、３−ニト
ロブチル、４−イソプロポキシドデシル、４−アジド−２−ニトロデシル、５−
メルカプトノニル、４−アミノ−１−ペンテニル並びに他の置換された基を包含
する。代表的なアルキル置換基は米国特許第５，２１２，２９５号、第１２欄、
４１〜５０行に開示されており、この特許はその全体において本明細書に援用さ
れる。
【００５３】 さらに、本発明に関連して、直鎖化合物は開鎖化合物、例えば、アルキル、ア
ルケニル又はアルキニル化合物を含めた脂肪族化合物を意味し；本明細書で用い
る限り、低級アルキル、アルケニル又はアルキニル化合物は非限定的に炭素数約
１〜約６のヒドロカルビル化合物を包含する。本明細書で用いる限り、分枝鎖化
合物は、直鎖の炭素原子に結合したさらなる直鎖又は分枝鎖を有するアルキル、
アルケニル、アルキニル化合物のような直鎖化合物を含む。
【００５４】 本明細書で用いる限り、環式化合物は閉鎖化合物、即ち、例えば脂環式化合物
又は芳香族化合物のような炭素原子の環を意味する。直鎖、分枝鎖又は環式化合
物は、アルコキシ化合物又は複素環式化合物に置けるように、内部で中断されう
る。本発明に関連して、内部で中断されるとは、炭素鎖が例えばＯ、Ｎ又はＳの
ようなヘテロ原子によって中断されうることを意味する。しかし、必要な場合に
は、炭素鎖はヘテロ原子を有さないこともできる。
【００５５】 本発明の化合物は、窒素原子を含む環構造を包含しうる（例えば、−Ｎ（Ｒ1
）（Ｒ2）と−Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、この場合（Ｒ1）（Ｒ2）と（Ｒ3）（Ｒ4）は
それぞれ、それらが結合する各Ｎの周囲に環構造を形成する）。得られた環構造
は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択されるさらなるヘテロ原子を包含しうる複素環又は複
素環構造である。このような環構造は単環式、二環式又は三環式であることがで
き、例えばオキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、ア
ルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、
カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒド
ラジノ、ＯＤＭＴ、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スル
ホンアミド、チオール及びチオアルコキシのような置換基によって置換されるこ
とができる。窒素を包含する、好ましい二環式環構造はフタルイミドである。
【００５６】 一般に、“ヘテロ”なる用語は炭素以外の原子を意味し、好ましくは排他的で
はなく、Ｎ、Ｏ又はＳを意味する。したがって、“複素環”なる用語は１つ以上
のヘテロ原子（即ち、非炭素原子）を有するアルキル環系を意味する。本発明の
複素環構造は完全に飽和、部分的に飽和、不飽和であることができる、又は環の
各々が利用可能な飽和状態のいずれかでありうる多環状複素環でありうる。本発
明の複素環構造は、１つ以上の縮合環がヘテロ原子を含有しない系を含めた、縮
合環を包含するヘテロアリールをも包含する。本発明による、窒素複素環を含め
た、複素環は非限定的にイミダゾール、ピロール、ピラゾール、インドール、１
Ｈ−インダゾール、α−カルボリン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキ
サジン、テトラゾール、トリアゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン及
びモルホリン基を包含する。窒素複素環のより好ましい群はイミダゾール、ピロ
ール、インドール及びカルバゾール基を包含する。
【００５７】 本発明に関連して、アリール基は置換及び非置換芳香族環式部分であり、非限
定的に、フェニル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニル及びキ
シリル基を包含する。アルカリール基は、アリール部分がアルキル部分をコア構
造に結合させる基であり、アラルキル基は、アルキル部分がアリール部分をコア
構造に結合させる基である。
【００５８】 ターゲット核酸にハイブリダイズ可能である、本発明によるオリゴマー化合物
は好ましくは約５〜約５０ヌクレオシドを含む。このような化合物が約８〜約３
０ヌクレオシドを含むことがより好ましく、１５〜約２５ヌクレオシドが特に好
ましい。本明細書で用いる限り、ターゲット核酸は、相補的核酸様化合物とハイ
ブリダイズ可能である任意の核酸である。さらに本発明に関連して、“ハイブリ
ダイゼーション”は、相補的核酸塩基の間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ、Ｈｏｏ
ｇｓｔｅｅｎ又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合でありうる水素結合を意味する
。本明細書で用いる限り、“相補的”は２つの核酸塩基の間の正確に対合する能
力を意味する。例えば、アデニンとチミンとは、水素結合の形成によって対合す
る相補的核酸塩基である。本明細書で用いる限り、“相補的”及び“特異的にハ
イブリダイズ可能な”とは、ヌクレオシド・サブユニットを含有する第１核酸様
オリゴマーと第２核酸様オリゴマーとの間の正確な対合又は配列相補性を意味す
る。例えば、第１核酸のある一定の位置における核酸塩基が第２核酸の同じ位置
における核酸塩基と水素結合を形成することができる場合に、第１核酸と第２核
酸とはその位置において相互に相補的であると見なされる。各分子中の充分な数
の対応位置が相互に水素結合することができる核酸塩基によって占められる場合
に、第１核酸と第２核酸とは相互に相補的である。したがって、“特異的にハイ
ブリダイズ可能な”及び“相補的”は、本発明の化合物とターゲットＲＮＡ分子
との間に安定で特異的な結合が生ずるような、充分な相補度を表示するために用
いられる用語である。
【００５９】 本発明のオリゴマー化合物が、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその
ターゲットＲＮＡ配列に対して１００％相補的である必要がないことは理解され
るであろう。ターゲットＲＮＡ分子に対するオリゴマー化合物の結合がターゲッ
トＲＮＡの正常な機能を妨害して有用性の損失を生じるときに、及び特異的な結
合が望ましい条件下で、即ち、ｉｎ ｖｉｖｏ分析若しくは治療的処置の場合に
生理的条件下で、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ分析の場合に分析が行われる条件下で、
非ターゲット配列に対するオリゴマー化合物の非特異的結合を避けるために充分
な相補度が存在するときに、オリゴマー化合物は特異的にハイブリダイズ可能で
ある。
【００６０】 本発明のオリゴマー化合物は、診断薬、治療薬及び研究試薬として用いること
ができる。本発明のオリゴマー化合物は適当な製薬的に受容される希釈剤又はキ
ャリヤーを含めることによって、薬剤組成物として用いることもできる。これら
の化合物はさらに、タンパク質の好ましくない産生を特徴とする疾患を有する生
物の治療に用いることができる。この好ましくないタンパク質をコードする核酸
の鎖と特異的にハイブリダイズすることができる配列を有するオリゴヌクレオチ
ドに、生物を接触させるべきである。このタイプの処置は単細胞原核及び真核生
物から多細胞真核生物までの範囲の多様な生物に行うことができる。その遺伝的
、代謝的又は細胞的調節の基本的部分としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写又はＲＮＡ−タ
ンパク質翻訳を利用するいずれの生物も、本発明による治療的及び／又は予防的
処置を受けやすい。見たところでは、例えば細菌、酵母、原生動物、藻類、全て
の植物及び温血動物を含めた全ての高等動物体のような種々な生物が処置される
ことができる。さらに、多細胞真核生物の各細胞はそれらの細胞活性の不可欠な
部分(integral parts)としてＤＮＡ−ＲＮＡ転写及びＲＮＡ−タンパク質翻訳を
有するので、多細胞真核生物の各細胞を処置することができる。さらに、真核細
胞のオルガネラ（例えば、ミトコンドリア及びクロロプラスト）の多くも転写及
び翻訳機構を包含する。したがって、単細胞、細胞集団又はオルガネラも、治療
用又は診断用オリゴマー化合物によって処置することができる生物の定義内に含
めることができる。本明細書で用いる限り、治療薬とは、生物を殺すことによる
又は異常な若しくは有害な細胞増殖若しくは発現を制御することによる疾患状態
の撲滅を包含する意味である。
【００６１】 本発明によるオリゴマー化合物は、例えば、適当なＤＮＡ合成装置上でヌクレ
オシド、ホスホロアミダイト及び本発明による制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）誘導
体及び／又は標準ヌクレオシドモノマー先駆体を用いて溶液中で又は固相反応を
介して構築することができる。本発明の新規な修飾を包含するヌクレオシドの他
に、オリゴヌクレオチド内の他のヌクレオシドを２’位の他の修飾によってさら
に修飾することができる。このような付加的な修飾を形成するために用いられる
先駆体ヌクレオシド及びヌクレオシドモノマー先駆体は２’位又は３’位のいず
れかに置換基を有することができる。このような先駆体は、本発明によって、少
なくとも１つの遊離の２’又は３’ヒドロキシル基を有する適当に保護されたヌ
クレオシドを、例えば、非限定的に、アルコキシアルキルハライド、アルコキシ
アルキルスルホネート、ヒドロキシアルキルハライド、ヒドロキシアルキルスル
ホネート、アミノアルキルハライド、アミノアルキルスルホネート、フタルイミ
ドアルキルハライド、フタルイミドスルホネート、アルキルアミノアルキルハラ
イド、アルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノアルキルハライ
ド、ジアルキルアミノアルキルスルホネート、ジアルキルアミノオキシアルキル
ハライド、ジアルキルアミノオキシアルキルスルホネート、及びこれらの適当に
保護された形のような、適当なアルキル化剤と反応させることによって合成する
ことができる。アルキル化反応に用いられる好ましいハライド(halides)はクロ
リド、ブロミド、フルオリド及びヨージドを包含する。アルキル化反応に用いら
れる好ましいスルホネート脱離基(leaving groups)は、非限定的に、ベンゼンス
ルホネート、メチルスルホネート、トシレート、ｐ−ブロモベンゼンスルホネー
ト、トリフレート(triflate)、トリフルオロエチルスルホネート、及び（２，４
−ジニトロアニリノ）−ベンゼンスルホネートを包含する。
【００６２】 適当に保護されたヌクレオシドを既知方法によってオリゴマー化合物に構築す
ることができる。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ等，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９
９２，４８，２２２３参照。 オリゴヌクレオチドとその相補的鎖とのハイブリダイゼーション複合体の融解
温度（Ｔm）を測定することによって、オリゴマー化合物がそれらの相補的ター
ゲット鎖に結合する能力を比較する。二重らせんの特徴的な物理的性質である融
解温度（Ｔm）は、５０％らせん形（ハイブリダイズした）対コイル状（ハイブ
リダイズしない）形が存在する温度（摂氏温度）を意味する。ＵＶスペクトルを
用いて、ハイブリダイゼーション複合体の形成と破壊（融解）を判定することに
よって、Ｔmが測定される。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基重層はＵＶ
吸収の低下（低色素性(hypochromicity)）を付随する。したがって、ＵＶ吸収の
低下はＴm上昇を意味する。Ｔmが高ければ高いほど、鎖間の結合強度は大きい。
多数の核酸修飾の構造安定性関係が検討されている（ＦｒｅｉｅｒとＡｌｔｍａ
ｎｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４４２９−
４４３）。
【００６３】 本発明のオリゴマー化合物の相対的結合能力を、文献に記載されたようなプロ
トコールを用いて測定した（ＦｒｅｉｅｒとＡｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４４２９−４４３）。１００ｍＭ
Ｎａ+、１０ｍＭホスフェート、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び４μＭの相補的な長
さの一致したＲＮＡ中に４μＭオリゴヌクレオチドを含有するサンプルを用いて
、典型的な吸光度対温度曲線を作成した。
【００６４】 オリゴマー化合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性は、オリゴヌクレオチド治療薬の開
発において考慮すべき重要な要因である。それ故、ヌクレアーゼ、ホスホジエス
テラーゼ及び他の酵素による分解に対するオリゴマー化合物の耐性を測定する。
リン酸緩衝化生理食塩水中の５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの単回量をＢＡ
ＬＢ／ｃマウスに投与することによって、本発明のオリゴマー化合物の安定性の
典型的なｉｎ ｖｉｖｏ評価を行う。投与後の特定の時間間隔で採取した血液を
ＨＰＬＣ又はキャピラリー・ゲル電気泳動（ＣＧＥ）によって分析して、循環中
に無傷で残留するオリゴマー化合物の量と分解生成物の性質(nature)とを測定す
る。
【００６５】 限定であるとは意図されない下記実施例を検討するならば、本発明の他の目的
、利益及び新規な特徴が当業者に明らかになるであろう。総てのオリゴヌクレオ
チド配列は左から右へ、標準の５’〜３’順序で記載する。
【００６６】 実施例１ ２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチル
ウリジン １００ｍｌ ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０ｍ
ｌ，１０ｍｍｏｌ）に、２［２−（ジメチルアミノ）エトキシ］エタノール（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ，６．６６ｇ，５０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら徐々に加えた。固体
が溶解するにつれて、水素ガスが発生した、Ｏ2−，２’−アンヒドロ−５−メ
チルウリジン（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を
加えて、ボンベを密封して、油浴に入れ、１５５℃に２６時間加熱した。ボンベ
を室温に冷却して、開けた。粗溶液を濃縮して、残渣を水（２００ｍｌ）とヘキ
サン（２００ｍｌ）とに分配した。過剰なアルコールはヘキサン層に抽出された
。水層を酢酸エチル（３ｘ２００ｍｌ）によって抽出して、一緒にした有機層を
水によって１回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。残渣を
溶離剤としてメタノール／塩化メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを含む
）を用いて、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーした(columned)。カラム
フラクションを濃縮すると、無色固体が形成され、これを回収して、４９０ｍｇ
の標題化合物を白色固体として得た。Ｒｆ＝０．５６、ＣＨ2−ＣＨ12：ＣＨ3−
ＯＨ（１０：１）中；ＭＳ／ＥＳ計算値３７４；実測値３７４．５．
【００６７】 実施例２ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン 無水ピリジン（８ｍｌ）中の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエ
トキシ）エチル］−５−メチルウリジン（０．５ｇ，１．３ｍｍｏｌ）に、トリ
エチルアミン（０．３６ｍｌ）とジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、
０．８７ｇ、２当量）を加えて、１時間撹拌した。反応混合物を水（２００ｍｌ
）中に注入し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２００ｍｌ）によって抽出した。一緒にしたＣ
Ｈ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＨＣＯ3溶液によって、続いて飽和ＮａＣｌ溶液によって
洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、続いてＭｅＯＨ
：ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミンを含む）を
用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、０．７２ｇ（８２％）の標題化
合物を得た。
【００６８】 実施例３ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピル）ホスホロアミデート ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶解した５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジ
ン（２．１７ｇ，３ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピル
アミノテトラゾリド（０．６ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルホスホロアミダイト（１．１ｍｌ，２当量）を加えた。反応混合物を一晩撹拌
して、溶媒を蒸発させた。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマ
トグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、１．９８ｇ
（８３％収率）の標題化合物を得た。
【００６９】 実施例４ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（２７０ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）
を、ヒーティング・ブロック(heating block)中のＰｙｒｅｘ管内で、ジクロロ
エタン（１ｍｌ）中の６８ｍｇの無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ）及びＥｔ3Ｎ（５６μｌ）と共に５０℃
において１０分間加熱した。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン（２０ｍｌ）
によって希釈し、クエン酸の１０％水溶液（３ｘ２０ｍｌ）によって、続いて水
によって洗浄した。得られた溶液を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、２１７ｍｇ
（５８％収率）の標題化合物を得た。 ＴＬＣ（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ，１０：１）は予想通りに起源に極性生成物が
あることを示した。
【００７０】 実施例５ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシニル制御多孔質ガ
ラス（ＣＰＧ） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネート（１１６
ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ，２当量）を高真空下で一晩乾燥させた。この乾燥した
物質に、ＣＰＧ（６５０ｍｇ，１当量）と、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）と、Ｎ−メチ
ルモルホリン（３３μｌ，４当量）とを加えて、この反応混合物に２−１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾル−１−イル ２−１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル−１，１，
３，３−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレート（ＴＢＴＵ，４８
ｍｇ，２当量）を１２時間振とうしながら加えた。次に、ＣＰＧを濾過して、Ｄ
ＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによって洗浄した。最後に、これを乾
燥させて、無水酢酸／Ｅｔ3Ｎによってキャッピングした(capped)。ＣＰＧの負
荷はジメトキシトリチル分析法によって５３μｍｏｌｅ／ｇであると測定された
。
【００７１】 実施例６ ２−［２−（ジメチルアミノ）エチルメルカプト］エタノール ２−（ジメチルアミノ）エタンチオール塩酸塩（Ａｌｄｒｉｃｈ）をエタノー
ル（９５％）中ＮａＯＨ（０．２Ｎ）によって処理する。このスラリーに、２−
ブロモエタノール（１．２当量）を加えて、混合物を２時間還流させた。反応混
合物を冷却し、濾過し、濃縮した。得られた残渣をシリカゲル・フラッシュカラ
ムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
【００７２】 実施例７ ２’−Ｏ−［２−［２−（（ジメチルアミノ）エチル）メルカプト］エチル］−
５−メチルウリジン １００ｍｌ ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０ｍ
ｌ，１０ｍｍｏｌ）に、２−［２−（（ジメチルアミノ）エチル）メルカプト］
エタノール（５０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつ
れて、水素ガスが発生する。Ｏ2，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１
．２ｇ，５ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を加えて、ボンベを
密封し、次に油浴に入れ、１５５℃に２６時間加熱する。ボンベを室温に冷却し
て、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水（２００ｍｌ）とヘキサン（２００ｍ
ｌ）とに分配する。過剰なフェノールはヘキサン中に抽出される。水層を酢酸エ
チル（３ｘ２００ｍｌ）によって抽出して、一緒にした有機層を水によって１回
洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。得られる残渣を、メタ
ノール／塩化メチレン（２％トリエチルアミンを含む）を用いて、シリカゲル・
フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、標題化合物を得る。
【００７３】 実施例８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）エ
チル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン 無水ピリジン（８ｍｌ）中の２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）エチ
ル］メルカプト］エチル］５−メチルウリジン（１．３ｍｍｏｌ）に、トリエチ
ルアミン（０．３６ｍｌ）とＤＭＴ−Ｃｌ（０．８７ｇ、２当量）を加えて、１
時間撹拌する。反応混合物を水（２００ｍｌ）中に注入し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２
００ｍｌ）によって抽出する。一緒にしたＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＨＣＯ3溶液
によって、続いて飽和ＮａＣｌ溶液によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾
燥させ、濃縮する。得られる残渣をメタノール／塩化メチレン（１％トリエチル
アミンを含む）を用いてシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィーによ
って精製して、標題化合物を得る。
【００７４】 実施例９ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）エ
チル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミデート ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）
エチル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン（３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2 （２０ｍｌ）中に溶解し、この溶液に、アルゴン下で、ジイソプロピルアミノテ
トラゾリド（０．６ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホ
ロアミダイト（１．１ｍｌ，２当量）を加える。この反応を一晩撹拌して、溶媒
を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィ
ーによって、酢酸エチルを用いて精製して、標題ホスホロアミダイトを得る。
【００７５】 実施例１０ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）エ
チル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）
エチル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン（０．４１ｍｍｏｌ）を、ヒ
ーティング・ブロック(heating block)中のＰｙｒｅｘ管内で、ジクロロエタン
（１ｍｌ）中の無水コハク酸（６８ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノピリジン（２４ｍｇ）及びＥｔ3Ｎ（５６μｌ）と共に５０℃におい
て１０分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン（２０ｍｌ）によっ
て希釈し、１０％クエン酸水溶液（３ｘ２０ｍｌ）によって、続いて水によって
洗浄して、無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、標題スクシネートを得る。
【００７６】 実施例１１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−２−［２−（（ジメチルアミノ）エ
チル）メルカプト］エチル］５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシニル制御多
孔質ガラス（ＣＰＧ） 上記実施例１０からのスクシネート（０．１５ｍｍｏｌ，２当量）を高真空下
で一晩乾燥させる。この乾燥したスクシネートに、ＣＰＧ（６５０ｍｇ，１当量
）と、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）と、Ｎ−メチルモルホリン（３３μｌ，４当量）と
、４８ｍｇ（２当量）のＴＢＴＵ（２−１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）と
を加える。１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−テトラフルオロ−ボレー
トを加えて、混合物を１２時間振とうする。次に、ＣＰＧを濾過して、ＤＭＦ、
ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによって洗浄する。ＣＰＧを乾燥させて、無
水酢酸／Ｅｔ3Ｎによってキャッピングする。負荷を標準ジメトキシトリチル分
析法によって測定する。
【００７７】 実施例１２ ２−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］エタノール ２−（２−アミノエトキシ）エタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ ０．５ｍｍｏｌ）
を５０％水性メタノール（３０ｍｌ）中のＮａＢＨ3ＣＮ（Ａｌｄｒｉｃｈ、２
００ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）によって処理する。この溶液に、アセトアルデヒド
９５％純度（２ｍｌ，１７ｍｍｏｌ）を１度に加えて、混合物をアルゴン下のフ
ラスコ中で５０℃において２日間加熱する。減圧下で溶媒を除去した後に、残渣
を水中に溶解して、酢酸エチルによって抽出して、標題化合物を得る。
【００７８】 実施例１３ ２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチ
ルウリジン １００ｍｌ ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０ｍ
ｌ，１０ｍｍｏｌ）に、２［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］エタノール（５
０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解するにつれて、水素ガス
が発生する。Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１．２ｇ，５ｍｍ
ｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を加えて、ボンベを密封し、油浴に
入れ、１５５℃に２６時間加熱する。ボンベを室温に冷却して、開ける。粗溶液
を濃縮して、残渣を水（２００ｍｌ）とヘキサン（２００ｍｌ）とに分配する。
過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢酸エチル（３ｘ２００
ｍｌ）によって抽出して、一緒にした有機層を水によって１回洗浄して、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤としてメタノール／塩化
メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを含む）を用いて、シリカゲル上でカ
ラムクロマトグラフィーする。適当なカラムフラクションを濃縮して、標題化合
物を得る。
【００７９】 実施例１４ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン 無水ピリジン（８ｍｌ）中の２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエ
トキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．３ｍｍｏｌ）に、トリエチルアミ
ン（０．３６ｍｌ）とジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−Ｃｌ、０．８７ｇ
、２当量）を加えて、１時間撹拌する。反応混合物を水（２００ｍｌ）中に注入
し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２００ｍｌ）によって抽出する。一緒にしたＣＨ2Ｃｌ2層
を飽和ＮａＨＣＯ3溶液によって、続いて飽和ＮａＣｌ溶液によって洗浄し、無
水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いてＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃ
ｌ2：Ｅｔ3Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミンを含む）を用いてシリ
カゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
【００８０】 実施例１５ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピル）ホスホロアミデート ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶解する５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジ
ン（３ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロピルアミノテトラ
ゾリド（０．６ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロア
ミダイト（１．１ｍｌ，２当量）を加える。反応混合物を一晩撹拌して、溶媒を
蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムクロマトグラフィー
によって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化合物を得る。
【００８１】 実施例１６ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネート ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミ
ノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（０．４１ｍｍｏｌ）を、ヒーティ
ング・ブロック中のＰｙｒｅｘ管内で、ジクロロエタン（１ｍｌ）中の６８ｍｇ
の無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノピリジン（２
４ｍｇ）及びＥｔ3Ｎ（５６μｌ）と共に５０℃において１０分間加熱する。冷
却後に、反応混合物を塩化メチレン（２０ｍｌ）によって希釈し、クエン酸の１
０％水溶液（３ｘ２０ｍｌ）によって、続いて水によって洗浄する。得られる溶
液を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
【００８２】 実施例１７ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシニル制御多孔質ガ
ラス（ＣＰＧ） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミ
ノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネート（０．１
５ｍｍｏｌ，２当量）を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した物質に、ＣＰ
Ｇ（６５０ｍｇ，１当量）と、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）と、Ｎ−メチルモルホリン
（３３μｌ，４当量）とを加えて、この反応混合物に２−１Ｈ−ベンゾトリアゾ
ル−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー
ト（ＴＢＴＵ，４８ｍｇ，２当量）を１２時間振とうしながら加える。次に、Ｃ
ＰＧを濾過して、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによって洗浄する
。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸／Ｅｔ3Ｎによってキャッピングする。
ＣＰＧの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
【００８３】 実施例１８ ２−［ビス−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ−エチル）アミノエトキシ］エタノ
ール Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール（Ａｌｄｒｉｃ
ｈ，１ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸の水溶液によって処理して、一晩還流させ
て、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセトアルデヒドを得る。２−（２−アミノエトキ
シ）エタノールをメタノール溶媒中のＮａＢＨ3ＣＮとＮ，Ｎ−ジメチルアミノ
アセトアルデヒドによって処理して、一晩還流させる。減圧下での溶媒の除去後
に、残渣を水中に溶解し、酢酸エチルによって抽出し、カラムクロマトグラフィ
ーによって精製して、標題化合物を得る。
【００８４】 実施例１９ ２’−Ｏ−［２（ビス−２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）エトキシ）エチル
］−５−メチルウリジン １００ｍｌ ボンベ中でテトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，１０ｍ
ｌ，１０ｍｍｏｌ）に、２［２−（ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）エト
キシ］エタノール（５０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら徐々に加える。固体が溶解す
るにつれて、水素ガスが発生する。Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジ
ン（１．２ｇ，５ｍｍｏｌ）と炭酸水素ナトリウム（２．５ｍｇ）を加えて、ボ
ンベを密封し、油浴に入れ、１５５℃に２６時間加熱する。ボンベを室温に冷却
して、開ける。粗溶液を濃縮して、残渣を水（２００ｍｌ）とヘキサン（２００
ｍｌ）とに分配する。過剰なアルコールはヘキサン層中に抽出される。水層を酢
酸エチル（３ｘ２００ｍｌ）によって抽出して、一緒にした有機層を水によって
１回洗浄して、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する。残渣を、溶離剤と
してメタノール／塩化メチレン１：２０（２％トリエチルアミンを含む）を用い
て、シリカゲル上でカラムクロマトグラフィーする。カラムフラクションを濃縮
して、標題化合物を得る。
【００８５】 実施例２０ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−（ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノエチル）エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン 無水ピリジン（８ｍｌ）中の２’−Ｏ−［２（２−（ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノエチル−エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．３ｍｍｏｌ）に
、トリエチルアミン（０．３６ｍｌ）とジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴ−
Ｃｌ、０．８７ｇ、２当量）を１時間撹拌しながら加える。反応混合物を水（２
００ｍｌ）中に注入し、ＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２００ｍｌ）によって抽出する。一緒
にしたＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＨＣＯ3溶液によって、続いて飽和ＮａＣｌ溶液
によって洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒を蒸発させ、続いて
ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2：Ｅｔ3Ｎ（２０：１，ｖ／ｖ，１％トリエチルアミンを
含む）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーを行って、標題化合物を得る。
【００８６】 実施例２１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−（ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノエチル）エトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シア
ノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミデート ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中に溶解する５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−
Ｏ−［２（２−（ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）エトキシ）エチル］−
５−メチルウリジン（３ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下で、ジイソプロ
ピルアミノテトラゾリド（０．６ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルホスホロアミダイト（１．１ｍｌ，２当量）を加える。反応混合物を一晩
撹拌して、溶媒を蒸発させる。得られる残渣をシリカゲル・フラッシュカラムク
ロマトグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチルを用いて精製して、標題化
合物を得る。
【００８７】 実施例２２ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノエチル）エトキシ）エチル］−５−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−スクシ
ネート ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン（０．４１ｍｍｏｌ）
を、ヒーティング・ブロック中のＰｙｒｅｘ管内で、ジクロロエタン（１ｍｌ）
中の６８ｍｇの無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エチルピリジン（２４ｍｇ）及びＥｔ3Ｎ（５６μｌ）と共に５０℃において１
０分間加熱する。冷却後に、反応混合物を塩化メチレン（２０ｍｌ）によって希
釈し、クエン酸の１０％水溶液（３ｘ２０ｍｌ）によって、続いて水によって洗
浄する。得られる溶液を無水Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させて、標題化合物を得る。
【００８８】 実施例２３ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチル
アミノエチルエトキシ）エチル］−５−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−スクシニ
ル制御多孔質ガラス（ＣＰＧ） ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−ビス−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアミノエチルエトキシ）エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシネ
ート（０．１５ｍｍｏｌ，２当量）を高真空下で一晩乾燥させる。この乾燥した
物質に、ＣＰＧ（６５０ｍｇ，１当量）と、無水ＤＭＦ（２ｍｌ）と、Ｎ−メチ
ルモルホリン（３３μｌ，４当量）とを加えて、この反応混合物に２−１Ｈ−ベ
ンゾトリアゾル−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフ
ルオロボレート（ＴＢＴＵ，４８ｍｇ，２当量）を１２時間振とうしながら加え
る。次に、ＣＰＧを濾過して、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＣＨ3ＣＮ及びＥｔ2Ｏによ
って洗浄する。最後に、これを乾燥させて、無水酢酸／Ｅｔ3Ｎによってキャッ
ピングする。ＣＰＧの負荷をジメトキシトリチル分析法によって測定する。
【００８９】 実施例２４ オリゴヌクレオチド合成の一般的方法 オリゴマー化合物をＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｅｘｐｅ
ｄｉｔｅ ８９０１核酸合成システム上で合成する。各オリゴヌクレオチドに関
して多重１−ｍｍｏｌ合成を実施する。固体サポートを含有する３’末端ヌクレ
オシドをカラムに装填する。トリチル基をトリクロロ酢酸（１分間にわたって９
７５ｍｌ）によって除去し、続いてアセトニトリル洗浄を行う。オリゴヌクレオ
チドは修飾ジエステル又はチオエート・プロトコールを用いて構築される。
【００９０】 ホスホジエステル・プロトコール 総ての標準アミダイト（０．１Ｍ）を１．５分間の時間枠にわたってカップリ
ングさせ、１０５μｌの物質を得る。総ての新規なアミダイトを乾燥アセトニト
リル中に溶解して（１００ｍｇのアミダイト／１ｍｌのアセトニトリル）、約０
．０８〜０．１Ｍ溶液を得る。２’修飾アミダイトを全体で５分間にわたって２
１０μｌを用いて二重カップリングさせる。総カップリング時間は約５分間であ
る（２１０ｍｌのアミダイトを得る）。アセトニトリル中の１−Ｈ−テトラゾー
ルを活性化剤として用いる。過剰なアミダイトをアセトニトリルによって洗い流
す。（１Ｓ）−（＋）−（１０−カンファースルホニル）オキサジリジン（ＣＳ
Ｏ，１．０ｇＣＳＯ／８．７２ｍｌ乾燥アセトニトリル）を用いて、酸化して（
３分間待機工程(wait step)）、約３７５μｌの酸化剤を得る。標準アミダイト
が３分間にわたって得られる（２１０μｌ）。
【００９１】 ホスホロチオエート・プロトコール ２’修飾アミダイトを全体で５分間にわたって２１０μｌを用いて二重カップ
リングさせる。酸化剤、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−
ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬、３．４ｇＢｅａｕｃａｇｅ試薬／２００ｍ
ｌアセトニトリル）の量は２２５μｌである（１分間待機工程）。未反応ヌクレ
オシドをテトラヒドロフラン／無水酢酸と、テトラヒドロフラン／ピリジン／１
−メチルイミダゾールとの５０：５０混合物によってキャッピングする。合成期
間中にトリチル・モニターによって、トリチル収率をフォローする。最終ＤＭＴ
基は完全な状態で残される。合成後に、合成カートリッジ（１ｍｍｏｌｅ）の内
容物をＰｙｒｅｘバイアルに移して、オリゴヌクレオチドを制御多孔質ガラス（
ＣＰＧ）から、３０％水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ，５ｍｌ）を用いて５５
℃において約１６時間かけて開裂させる。
【００９２】 オリゴヌクレオチド精製 脱保護工程後に、Ｇｅｌｍａｎ ０．４５μｍナイロン・アクロディスク・シ
リンジフィルター(syringe filter)を用いてサンプルをＣＰＧから濾別する。Ｓ
ａｖａｎｔ ＡＳ１６０自動スピードバク(automatic speed vac)中で過剰なＮ
Ｈ4ＯＨを蒸発させる。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａ Ｄｉｏ
ｄｅ Ａｒｒａｙ分光光度計で２６０ｎｍにおいて粗収率を測定する。次に、Ｈ
ｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄエレクトロスプレイ質量分析計での質量分析（Ｍ
Ｓ）によって粗サンプルを分析する。トリチル−オン オリゴマー化合物(trity
l-on oligomeric compound)を逆相分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）によって精製する。ＨＰＬＣ条件は次の通りである：９９１デテクター付きＷ
ａｔｅｒｓ ６００Ｅ；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ４カラム（７．
８ｘ３００ｍｍ）；溶媒Ａ：５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥ
Ａ−Ａｃ）、ｐＨ７．０；溶媒Ｂ：１００％アセトニトリル；２．５ｍｌ／分の
流速度；勾配：最初の５分間は５％Ｂ、次の５５分間中にＢは６０％まで直線的
に上昇。所望の生成物（単数又は複数）を含有するフラクション（保持時間＝Ｄ
ＭＴ−ＯＮ−１６３１４では４１分間；保持時間＝ＤＭＴ−ＯＮ−１６３１５で
は４２．５分間）を回収し、スピードバクにおいて溶媒を乾燥させる。オリゴマ
ー化合物を８０％酢酸中で約６０分間脱トリチルして、再び凍結乾燥させる。脱
トリチルしたオリゴマー化合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（サイズ排除クロ
マトグラフィー）に通して適当なサンプルをＰｈａｒｍａｃｉａ・フラクション
・コレクターによって回収することによって、遊離トリチルと過剰な塩とを除去
する。溶媒を再びスピードバク中で蒸発させる。次に、精製オリゴマー化合物を
ＣＧＥ、ＨＰＬＣ（流速度：１．５ｍｌ／分；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ Ｐａ
ｋ Ｃ４カラム、３．９ｘ３００ｍｍ）及びＭＳによって純度に関して分析する
。最終収率は２６０ｎｍにおいて分光光度計によって測定する。
【００９３】 方法 方法１ ＩＣＡＭ−１発現 ＨＵＶＥＣｓのオリゴヌクレオチド処理： ３７℃に予め加温したＯｐｔｉ−
ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によって細胞を３回
洗浄した。オリゴマー化合物に１０μｇ／ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中のＬｉｐｏ
ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を予め混合し
、所望の濃度に順次希釈して、洗浄済み細胞に供給した。基底の、未処理（オリ
ゴヌクレオチドなし）対照細胞をもＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎによって処理した。細
胞を３７℃において４時間インキュベートし、この時点において培地を除去し、
５ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（登録商標）（＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む又は
含まない標準増殖培地と交換した。３７℃におけるインキュベーションを指定時
間まで続けた。
【００９４】 蛍光標示式細胞分取器(fluorescence-activated cell sorter)によるＩＣＡＭ
−１タンパク質発現の定量： ＰＢＳ中０．２５％トリプシンによる短時間トリ
プシン処理によってプレート表面から細胞を取り出した。ＰＢＳ（＋Ｍｇ／Ｃａ
）中の２％ウシ血清アルブミンと０．２％アジ化ナトリウムとの溶液によってト
リプシン活性をクエンチした。細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ、Ｂｅｃｋｍａ
ｎ ＧＰＲ遠心分離機）によってペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＩＣＡ
Ｍ−１特異的抗体、ＣＤ５４−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｉｎ）３μｌ／１０5細胞
によって染色した。抗体を細胞と共に暗所で４℃において穏やかに撹拌しながら
３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離方法によって洗浄し、０．５％ホ
ルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）を含む０．３ｍｌのＦａｃｓＦｌｏ
ｗ緩衝剤（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に再懸濁させた。次に、細胞
表面ＩＣＡＭ−１発現をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを
用いるフローサイトメトリーによって測定した。対照ＩＣＡＭ−１発現の割合を
次のように算出した：［（オリゴヌクレオチド処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底Ｉ
ＣＡＭ−１値）／（非処理ＩＣＡＭ−１値）−（基底ＩＣＡＭ−１値）］。（Ｂ
ａｋｅｒ，Ｂｒｅｎｄａ等，［２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル−修飾抗細胞
間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）オリゴマー化合物はＩＣＡＮ−１ ｍＲＮＡレベ
ルを選択的に高め、ヒト臍静脈内皮細胞におけるＩＣＡＭ−１翻訳開始複合体の
形成を阻害する］，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２，１１９９４−１２０００，１９９７）
【００９５】 本発明の２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）オキシエチ
ル］−５−メチル修飾オリゴマー化合物のＩＣＡＭ−１発現を、処理したＨＵＶ
ＥＣ細胞中のＩＣＡＭ−１レベルの減少によって測定する。オリゴマー化合物は
直接結合ＲＮアーゼ Ｈ独立機構によって作用すると考えられる。適当なスクラ
ンブル(scrambled)対照オリゴマー化合物を対照として用いる。これらは試験配
列と同じ塩基組成を有する。
【００９６】 以下の表１に記載するような、２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノエチル）オキシエチル］−５−メチル修飾を含有する配列を作製して、上記分
析で試験する。配列番号：３、Ｃ−ｒａｆをターゲットとするオリゴヌクレオチ
ドを対照として用いる。
【００９７】 表１ ２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）オキシエチル］−５−
メチル修飾を含有するオリゴマー化合物
【表１】
【００９８】 太字のヌクレオシドは総て、２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ
エチル）オキシエチル］−５−メチルであり；下付きＳはホスホロチオエート結
合を意味し；下付きＯはホスホジエステル結合を意味し；Ｃの上付きｍ（Ｃm）
は５−メチル−Ｃを意味する。
【００９９】 方法２ ２’−Ｏ−修飾オリゴマー化合物の酵素分解 ２’−Ｏ−位置における３’ヌクレオシドへの修飾を組み入れた、３種類のオ
リゴマー化合物を合成する（表２）。これらの修飾オリゴマー化合物をヘビ毒ホ
スホジエステラーゼにさらして、それらのヌクレアーゼ耐性を評価する。オリゴ
マー化合物（３０ナノモル）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、１４
ｍＭ ＭｇＣｌ2及び７２ｍＭ ＮａＣｌを含有する緩衝剤 ２０ｍｌ中に溶解
する。この溶液に、０．１単位のヘビ毒ホスホジエステラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、２３単位のヌクレアーゼＰ１（Ｇｉｂｃ
ｏ ＬＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ，ＭＤ）及び２４単位のウシ腸ホスフ
ァターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ
ｓ，ＩＮ）を加えて、反応混合物を３７℃において１００時間インキュベートす
る。Ｗａｔｅｒｓ モデル７１５自動インジェクター、モデル６００Ｅポンプ、
モデル９９１デテクター及びＡｌｌｔｅｃｈ（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）ヌクレオシド／ヌクレオチド・
カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ）を用いて、ＨＰＬＣ分析を実施する。総ての分析
は室温において実施する。用いる溶媒はＡ：水と、Ｂ：アセトニトリルである。
ヌクレオシド組成物の分析は次の勾配：０〜５分間、２％Ｂ（イソクラチック(i
socratic)）；５〜２０分間、２％Ｂ〜１０％Ｂ（直線）；２０〜４０分間、１
０％Ｂ〜５０％Ｂによって達成される。１ナノモル当りの積分面積をヌクレオシ
ド標準を用いて測定する。積分面積をモル値に換算し、総ての値を、各オリゴマ
ーに関して予測値に設定したチミジンに比較することによって、相対的ヌクレオ
シド比率を算出する。
【０１００】 表２ ２’−修飾キメラ・オリゴマー化合物の相対的ヌクレアーゼ耐性
【表２】
【０１０１】 方法３ Ｈａ−ｒａｓをターゲットとするギャップ２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ修飾オリゴマ
ー化合物を評価するための一般的方法 肉腫、神経芽細胞腫、白血病及びリンパ腫を含めた、多様な種類のヒト腫瘍は
ｒａｓ遺伝子ファミリーの活性癌遺伝子を含有する。Ｈａ−ｒａｓは小分子量Ｇ
ＴＰアーゼのファミリーであり、このファミリーの機能は、多様なヒト癌の大き
い割合に関連する、ｒａｓの構成的活性化を生じるシグナルを伝達することによ
って細胞の増殖及び分化を調節することである。したがって、ｒａｓは抗癌治療
方策の魅力的なターゲットである。
【０１０２】 配列番号：６はヒトＨａ−ｒａｓの翻訳領域の開始をターゲットとする２０塩
基ホスホロチオエート・オリゴデオキシヌクレオチドであり、これはスクリーニ
ング分析に基づいて細胞培養におけるＨａ−ｒａｓの強力なアイソタイプ特異的
阻害剤である（ＩＣ50＝４５ｎｍ）。配列番号：６によるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞
の処理は、Ｈａ−ｒａｓ ｍＲＮＡ及びタンパク質合成の迅速な減少と、活性化
Ｈａ−ｒａｓ突然変異を含有する細胞の増殖阻害とを生じる。１日１回腹腔内注
入（ＩＰ）によって２５ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与したときに、配列番号：
６は多様な腫瘍異種移植片モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示すが、ミスマッ
チ対照は抗腫瘍活性を示さない。配列番号：６はマウス異種移植片の研究におい
て肺、胸部、膀胱及び膵臓を含めた、多様な腫瘍種類に対して有効であることが
判明している（Ｃｏｗｓｅｒｔ，Ｌ．Ｗ．，Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇ
ｄｅｓｉｇｎ，１９９７，１２，３５９−３７１）。配列の５’及び３’末端
（“ウィング”）が２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾によって修飾され、バ
ックボーンがホスホロチオエートとして維持される、配列番号：６の第２世代類
似体（表２、配列番号：１２）は、細胞培養分析において１５ｎｍのＩＣ50を示
す。したがって、効力の３倍の改良がこのキメラ類似体から観察される。２’−
ＭＯＥホスホロチオエートの改良されたヌクレアーゼ耐性のために、配列番号：
１２はｉｎ ｖｉｔｒｏでのアンチセンス効果の持続時間を増加する。これは癌
患者へのこの薬物の投与頻度に関係する。配列番号：１２は現在、ｒａｓ依存性
腫瘍モデルにおいて判定にかけられている（Ｃｏｗｓｅｒｔ，Ｌ．Ｍ．，Ａｎｔ
ｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，１９９７，１２，３５９−３７１
）。親化合物、配列番号：６は全身的点滴(systemic infusion)によって固体腫
瘍に対するＩ期臨床トライアル（Phase I clinical trial)中である。２’−Ｏ
−ＤＭＡＥＯＥ修飾を有するアンチセンス・オリゴマー化合物を製造して、活性
の評価に関して述べたように、上記分析において試験する。最初に製造するオリ
ゴマー化合物を以下の表３に列挙する。
【０１０３】 表３ ２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ修飾を有するＨａ−ｒａｓアンチセンス・オリゴマー化
合物と、それらの対照
【表３】 配列の下線を付けた部分は２’−デオキシである。
【０１０４】 方法４ ＨＣＶをターゲットとする２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥオリゴマー化合物を評価する
ための一般的方法 均一に修飾された２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥホスホジエステルオリゴマー化合物
を、翻訳停止機構による、ＨＣＶ遺伝子のアンチセンス阻害に関して評価する。
【０１０５】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が世界中で非常に多くの人々の肝臓疾患の原因で
あることは知られている。ＨＣＶはフラビウイルス・ファミリーのエンベロープ
付きプラス鎖ＲＮＡウイルスである。ヒトにおける初期感染は通常、無症候性で
あるが、肝硬変と肝細胞癌とが長期間続発症である慢性感染がしばしば続いて起
こる。慢性的に感染した個人からウイルスを撲滅しようと試みて、インターフェ
ロン−α（ＩＦＮ−α）療法が広く用いられるが、長期間の小康状態(remission
)は６か月間の療法後にも僅か約２０％の患者において得られるに過ぎない。こ
れまでは、ＨＣＶの治療に有効な抗ウイルス薬は存在しない。（Ｂｌａｉｒ等，
１９９８）。薬物の発見と開発の努力は、ＨＣＶの適当な細胞培養複製分析が無
いために妨げられており、ワクチン製造もこのウイルスのエンベロープ遺伝子の
遺伝的変異性によって妨げられている。例えばプロテアーゼ及びウイルスポリメ
ラーゼのようなクローン化ウイルス酵素の特異的阻害剤はまだ報告されていない
。
【０１０６】 アンチセンス・オリゴヌクレオチド療法はＨＣＶ感染を制御するための新規な
アプローチを表す。ＨＣＶのポリタンパク質開始コドンに隣接するＨＣＶ ＲＮ
Ａ配列に相補的な、幾つかのアンチセンス・オリゴマー化合物がＩｓｉｓにおい
て設計されている（Ｈａｎｅｃａｋ等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，７０，５
２０３−５２１２）。ターゲット・ゲノムは独立的ＨＣＶ単離体間で高度に保存
される。
【０１０７】 ＲＮアーゼ Ｈ独立性アンチセンス・オリゴヌクレオチドがその親ホスホロチ
オエート（ＲＮアーゼ Ｈ機構によって作用する）（これは均一に修飾された２
’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ ２０マー）を用いて、
ヒト肝細胞系中のＨＣＶのコアタンパク質配列のＡＵＧ部位をターゲットとする
）よりも大きい活性を有することが判明した（Ｈａｎｅｃａｋ等，Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，１９９６，７０，５２０３−５２１２）。Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパ
ク質レベルは、１００ｎｍのＩＣ50を有する対応２’−デオキシホスホロチオエ
ートと同じ程度に効率的に減少した。配列番号：１５はコアタンパク質発現の強
力な阻害剤であり、ＨＣＶ ＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった。このことは
、ＨＣＶ翻訳の阻害を示唆した。親化合物（配列番号：１４）は５０．８℃のＴ m を有したが、２’−ＭＯＥ化合物（配列番号：１５）は８３．８℃のＴmを有し
た。したがって、配列番号：１５はＨＣＶ ＲＮＡに対してより良好なアフィニ
ティを有した。ＨＣＶの複製サイクルは、ＲＮアーゼ Ｈレベルが核の同レベル
に比べて減少すると報告されている感染細胞の細胞質中で行われる。この理由か
ら、非ＲＮアーゼ Ｈ機構によってＨＣＶを阻害するように作用するアンチセン
ス・オリゴヌクレオチドを用いるほうが適切である。オリゴヌクレオチド配列番
号：１５は２’−ＭＯＥ修飾を有するＰ＝Ｏ結合を含有するので、魅力的な手が
かり(lead)である。配列番号：１４と１５の試験に従って、配列番号：１６を試
験する。
【０１０８】 表４ ＨＣＶＣ ５’−ＮＣＲヌクレオチド番号３４０〜３５９をターゲットとする５
’−ＴＴＴ ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＧＴ ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＧ−３’アンチセン
スオリゴヌクレオチド
【表４】
【０１０９】 方法５ ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析 ＨＣＶポリタンパク質開始コドン配列に相補的なＩｓｉｓアンチセンス・オリ
ゴマー化合物は、宿主細胞ゲノム中に組み込まれた組換えＤＮＡからＨＣＶ Ｒ
ＮＡを発現するように操作された不死化細胞系(immortalized cell line)におい
てウイルスコアタンパク質の発現を阻害することが知られる（Ｈａｎｅｃａｋ，
同上）。非相補的な対照オリゴマー化合物はこの系においてＨＣＶ ＲＮＡ又は
タンパク質レベルに影響を及ぼさない。Ｈ８Ａｄ１７Ｃ細胞を上記表４に示した
オリゴマー化合物、特に配列番号：１６の濃度範囲（０〜２００ｎｍ）によって
、カチオン脂質の存在下で処理し、２０時間後にウェスタン・ブロット分析によ
って総タンパク質レベルを評価する。
【０１１０】 方法６ ＨＣＶのｉｎ ｖｉｖｏモデル ＨＣＶ感染の動物モデルは容易に入手することができない。マウスの肝臓にお
けるＨＣＶ遺伝子発現を阻害するアンチセンス・オリゴマー化合物を評価するた
めに、代替アプローチが開発されている。これらの実験のために、配列番号：１
５のターゲット配列を含むＨＣＶ配列をルシフェラーゼ・レポーター遺伝子に融
合させて、ワクシニアウイルス中に挿入した。この組換えワクシニアウイルスに
よるマウス感染は、肝臓組織中のルシフェラーゼの定量可能なレベルを生じる。
強力なホスホロチオエート・アンチセンスオリゴマー化合物はこのモデルに作用
することが判明している。配列番号：１６（配列番号：１５の２’−Ｏ−ＤＭＡ
ＥＯＥ ＲＮＡ類似体）を、組換えワクシニアウイルスに感染させたマウスの肝
臓におけるＨＣＶ−ルシフェラーゼ構築体の発現の阻害に関して評価する。配列
依存性と用量反応とに関して阻害を評価する。ＨＣＶターゲット配列を有さない
対照ワクシニアウイルス・ベクターに感染させたマウスの肝臓におけるＨＣＶ−
ルシフェラーゼの発現を対照として用いて、これらの対照系におけるアンチセン
ス薬物の影響を評価する。（マウス肝臓におけるＣ型肝炎ウイルス遺伝子発現の
、アンチセンス・オリゴヌクレオチド仲介阻害（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等，会議要約
集、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｈａ
ｗａｉｉ，１９９７））。
【０１１１】 方法７ ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ耐性 ２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥを有するギャップマーのｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ
耐性を、マウスの血漿及び組織（腎臓と肝臓）において試験する。このために、
Ｃ−ｒａｆオリゴヌクレオチド系列 配列番号：１７を用いて、以下の表５に列
挙した下記５種類のオリゴマー化合物をそれらの相対的ヌクレアーゼ耐性に関し
て評価する。
【０１１２】 表５
【表５】
【０１１３】 方法８ 動物試験 試験すべき各オリゴヌクレオチドに関して、９匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）（体重約２５ｇ）を
用いる（Ｃｒｏｏｋｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９
９６，２７７，９２３）。１週間の順応後に、マウスはリン酸緩衝化生理食塩水
（ＰＢＳ）ｐＨ７．０中で投与されるオリゴヌクレオチド（５ｍｇ／ｋｇ）の単
回尾静脈注射を受ける。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの最終濃度はＰＢＳ製
剤として(for the PBS formulations)（５ｍｇ／ｋｇ）である。各群から１つの
眼窩後方の採血(bleed)（投与後０．２５、９．０５、２又は４のいずれか）と
末梢採血（投与後１、３、８又は２４時間のいずれか）を回収する。ケタミン／
キシラジン麻酔後に末梢採血（約０．６〜０．８ｍｌ）を心臓穿刺によって回収
する。血液をＥＤＴＡ被覆回収管に移して、血漿を得るために遠心分離する。終
了後に、肝臓と腎臓を各マウスから摘出する。完全な状態のオリゴヌクレオチド
含量を測定するためのＣＧＥによる分析に、血漿と組織のホモジネートを用いる
。総てのサンプルを回収後直ちに凍結して、分析まで−８０℃において貯蔵する
。
【０１１４】 方法９ Ｔmによって推定される結合アフィニティを、２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ
−ジメチルアミノエチル）オキシエチル］修飾を有するオリゴマー化合物に関し
て評価した。５−メチル−２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチ
ル）オキシエチル］（修飾Ｔ）をオリゴヌクレオチドの特定の位置に組み入れ、
相補的ＲＮＡオリゴマー化合物に対する結合を測定した。
【０１１５】 表６
【表６】 a ＤＭＴ−付着(DMT-on)として、下線付きヌクレオシドは２’−Ｏ−［２−（
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）オキシエチル］−５−メチルウリジン（２
’−置換−Ｔ）である。
【０１１６】 表７ Ｔm値
【表７】
【０１１７】 下線付きヌクレオシドは２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエ
チル）オキシエチル］修飾されている。 ２’−Ｏ−［２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエチル）オキシエチル］修
飾ヌクレオシドモノマーは、表７に示すように、非修飾ＤＮＡに比べてＴm上昇
を示す。
【０１１８】 当業者は、非常に多くの変化及び修正が本発明の好ましい実施態様になされう
ることと、このような変化及び修正が本発明の要旨から逸脱せずになされうるこ
とを理解するであろう。それ故、特許請求の範囲がこのような同等な変更の総て
を本発明の要旨及び範囲に入るものとして包括するように意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クック，フィリップ・ダン アメリカ合衆国カリフォルニア州92069， レーク・サン・マルコス，ラ・カサ 1155 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 GA13 HA17 4C057 AA18 BB02 DD01 MM05 4C086 AA03 EA16 EA17 EA18 ZA75 ZB33

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基であり； Ｒ1とＲ2の各々は独立的にＨ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ1−Ｃ10ア
    ルキル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ10アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ 10 アルキニルであり、前記置換基はＯＲ3、ＳＲ3、ＮＨ3 +、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、
    グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
    ある； 又はＲ1とＲ2は一緒に窒素保護基であるか又は、任意にＮとＯから選択される
    付加的なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する；及び Ｒ3とＲ4の各々は独立的にＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、窒素保護基であるか、又
    はＲ3とＲ4は一緒に窒素保護基である； 又はＲ3とＲ4は、ＮとＯから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
    環構造として、結合する］で示される、少なくとも１つのヌクレオシドを有する
    オリゴマー化合物。
  2. 【請求項２】 Ｒ1がＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル又はＣ1−Ｃ10置換アルキルで
    あり、Ｒ2がＣ1−Ｃ10置換アルキルである、請求項１記載のオリゴマー化合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10アルキルである、請求項２記載のオリゴマー
    化合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ2がＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、置換基がＮＨ3 +又はＮ
    （Ｒ3）（Ｒ4）である、請求項２記載のオリゴマー化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ1とＲ2が両方ともＣ1−Ｃ10置換アルキルである、請求項
    ２記載のオリゴマー化合物。
  6. 【請求項６】 前記置換基が独立的にＮＨ3 +又はＮ（Ｒ3）（Ｒ4）である、
    請求項５記載のオリゴマー化合物。
  7. 【請求項７】 Ｒ1とＲ2がそれぞれＣ1−Ｃ10アルキルである、請求項１記
    載のオリゴマー化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ1とＲ2が、ＮとＯから選択される少なくとも１つのヘテロ
    原子を包含することができる環構造として、結合する、請求項１記載のオリゴマ
    ー化合物。
  9. 【請求項９】 前記環構造がイミダゾール、ピペリジン、モルホリン又は置
    換ピペラジンである、請求項８記載のオリゴマー化合物。
  10. 【請求項１０】 前記ピペラジンの置換基がＣ1−Ｃ12アルキルである、請
    求項９記載のオリゴマー化合物。
  11. 【請求項１１】 前記複素環式塩基がプリン又はピリミジンである、請求項
    １記載のオリゴマー化合物。
  12. 【請求項１２】 前記複素環式塩基がアデニン、シトシン、５−メチルシト
    シン、チミン、ウラシル、グアニン又は２−アミノアデニンである、請求項１１
    記載のオリゴマー化合物。
  13. 【請求項１３】 約５〜約５０個のヌクレオシドを含む、請求項１記載のオ
    リゴマー化合物。
  14. 【請求項１４】 約８〜約３０個のヌクレオシドを含む、請求項１記載のオ
    リゴマー化合物。
  15. 【請求項１５】 約１５〜約２５個のヌクレオシドを含む、請求項１記載の
    オリゴマー化合物。
  16. 【請求項１６】 式： 【化２】 ［式中、Ｂｘは複素環式塩基であり； Ｔ1とＴ2は独立的にＯＨ、保護されたヒドロキシル、活性化リン基、ヌクレオ
    チド間結合を形成するための反応性基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌ
    クレオシド、オリゴヌクレオチド、又は固体サポートへの結合である； Ｒ1とＲ2の各々は独立的にＨ、窒素保護基、置換若しくは非置換Ｃ1−Ｃ10ア
    ルキル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ10アルケニル、置換若しくは非置換Ｃ2−Ｃ 10 アルキニルであり、前記置換基はＯＲ3、ＳＲ3、ＮＨ3 +、Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）、
    グアニジノ若しくはアシルであり、前記アシルは酸、アミド若しくはエステルで
    ある； 又はＲ1とＲ2は一緒に窒素保護基であるか又は、ＮとＯから選択される付加的
    なヘテロ原子を包含してもよい環構造として、結合する；及び Ｒ3とＲ4の各々は独立的にＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル、窒素保護基であるか、又
    はＲ3とＲ4は一緒に窒素保護基である； 又はＲ3とＲ4は、ＮとＯから選択される付加的なヘテロ原子を包含してもよい
    環構造として、結合する］で示される化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｒ1がＨ、Ｃ1−Ｃ10アルキル又はＣ1−Ｃ10置換アルキル
    であり、Ｒ2がＣ1−Ｃ10置換アルキルである、請求項１６記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｒ1がＣ1−Ｃ10アルキルである、請求項１７記載の化合物
    。
  19. 【請求項１９】 Ｒ2がＣ1−Ｃ10置換アルキルであり、置換基がＮＨ3 +又は
    Ｎ（Ｒ3）（Ｒ4）である、請求項１７記載の化合物。
  20. 【請求項２０】 Ｒ1とＲ2が両方ともＣ1−Ｃ10置換アルキルである、請求
    項１７記載の化合物。
  21. 【請求項２１】 前記置換基が独立的にＮＨ3 +又はＮ（Ｒ3）（Ｒ4）である
    、請求項２０記載の化合物。
  22. 【請求項２２】 Ｒ1とＲ2がそれぞれＣ1−Ｃ10アルキルである、請求項１
    ６記載の化合物。
  23. 【請求項２３】 Ｒ1とＲ2が、ＮとＯから選択される少なくとも１つのヘテ
    ロ原子を包含することができる環構造として、結合する、請求項１６記載の化合
    物。
  24. 【請求項２４】 前記環構造がイミダゾール、ピペリジン、モルホリン又は
    置換ピペラジンである、請求項２３記載の化合物。
  25. 【請求項２５】 前記置換ピペラジンがＣ1−Ｃ12アルキルによって置換さ
    れている、請求項２４記載の化合物。
  26. 【請求項２６】 前記複素環式塩基がプリン又はピリミジンである、請求項
    ２５記載の化合物。
  27. 【請求項２７】 前記複素環式塩基がアデニン、シトシン、５−メチルシト
    シン、チミン、ウラシル、グアニン又は２−アミノアデニンである、請求項２６
    記載の化合物。
  28. 【請求項２８】 Ｔ1がヒドロキシル保護基である、請求項１６記載の化合
    物。
  29. 【請求項２９】 Ｔ2が活性化リン基又は固体サポートへの結合である、請
    求項１６記載の化合物。
  30. 【請求項３０】 前記固体サポート物質が微粒子である、請求項２９記載の
    化合物。
  31. 【請求項３１】 前記固体サポート物質がＣＰＧである、請求項２９記載の
    化合物。
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