JP2002051654A - 新規植物発現型の遺伝子工学 - Google Patents

新規植物発現型の遺伝子工学

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Carolyn A Napoli
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Abstract

(57)【要約】 【課題】所望の表現型特徴を有する植物の生産のための
改良された方法を提供すること。 【解決手段】植物において内因性遺伝子のタンパク質産
物の産生を減少させる方法であって、該タンパク質は植
物における表現型特性に影響し、該方法は以下の工程：
プロモーターの作動可能な制御下にあるＤＮＡセグメン
トで形質転換された植物細胞から、植物を生長させる工
程であって、ここで該ＤＮＡセグメントの転写産物は、
センス方向に産生され、該ＤＮＡセグメントの転写産物
はタンパク質をコードする内因性遺伝子の転写産物に実
質的に相同であり、ここで該タンパク質の産生が減少さ
れる、工程；および表現型特性の改変について該植物を
スクリーニングすることにより、表現型の変化を示す植
物を同定する工程、を包含する、方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般に、遺伝子工学
的に植物を変異せしめる方法のための組換ＤＮＡ方法、
そして更に詳しくは、植物表現型、例えば、色彩、並び
に花及びその他の植物器官の色調の増大のための改善さ
れた方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】（発明の背景技術）植物における代謝経
路の調節は、長年の園芸学者の目標であった。本明細書
に参考文献として援用する、Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｖ
ａｒｎｅｒ（１９７６）Ｐｌａｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
を参照のこと。組換ＤＮＡ工学の出現は、この目標を達
成するための新しい方法を提供した。遺伝子調節の知識
における有意な進歩がありながら、植物遺伝子調節のコ
ントロールは開発の比較的初期の状態に留まる。
【０００３】水溶性色素フラボノドは高等植物の色及び
その他の特性のための働きにおいて重要である。例え
ば、このフラボノイドは橙色、深紅色、ふじ色、紫色及
び青色のもとであり、そして黄色、アイボリー色及びク
リーム色の花のために重要に働く。Ｈａｒｂｏｒｎｅ，
（１９７６）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｉｇｍｅｎｔ
ｓ，２ｄ ｅｄ．，Ｇｏｏｄｗｉｎ（Ｅｄ．）Ａｃａ
ｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎを参照のこと。色素分子
で最も重要なものはアントシアニン、特にぺラーゴニジ
ン、シアニジン及びデルフィニジンである。これらはそ
れぞれ、橙赤色、マゼンタ色及びふじ色のもとである。
その他の主なフラボノイドタイプ、即ち、カルコーン、
異性フラバノン、フラボン及びフラボノールは薄い色で
あり、色調の増大又はパターンに比較的小さい影響を及
ぼす傾向にある。
【０００４】しかしながらこれらの色素の機能は、花の
彩色にわたり、よく働く。この色素は、果実、葉及びそ
の他の植物の器官をも色付けし、そして重要なこととし
て、ＵＶ保護、並びに草食動物及び微生物に対する防御
を提供する。その他の利用には、遠隔作用、及びいくつ
かの医薬品用途でさえも含む。
【０００５】これらの種々の色素の生合成経路は、もっ
ぱら多数の異なる植物種において研究されてきた。カル
コン及びオーロン（ａｕｒｏｎｅ）は、初期の先駆体の
直接的な生成物である初期の生合成酵素のみを必要とす
る生成物である。フラボン及びフラボノールは中間体で
あり、そしてアントシアニンは初期先駆体からの実質的
な修飾を必要とする生成物である。これら全ての生成物
は３つの分子のマロニル補酵素Ａと１分子のクマロイル
補酵素Ａからのカルコンの生成に触媒作用する初期酵素
カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）の活性に依存する。
【０００６】本質的に、これら全ての表現型の特徴は、
植物の繁殖に関する制限と調和しながら自然に進化して
きた。例えば、花の出現は一般に、高等植物の性殖に本
質的な授粉工程において補助する昆虫を魅了するための
必要性からもたらされる。もちろん、花に授けられる装
飾的及び装身の特徴は商業価値として重要である。
【０００７】人類は歴史的に、例えば自然においては生
存し続けられないかれ知れない特定の花の色及びパター
ンを単純に選択することにより、ある程度自然工程にお
いて介在してきた。ブリーダーは、新規、且つめずらし
い花の表現型を、種々の回数−試験品種改良方法により
日常的に作り上げてきた。改良された植物、例えば変異
した花の色調の増大又は色調パターンを伴う異なった花
の新品種の品種改良方法のための伝統的な方法は、一般
にこれらの種及びその親種類の実験室内での遺伝子プー
ルにおける自然の遺伝的変異を必要とする。更に最近で
は、変異種の誘導による突然変異の発生が利用されてい
る。次いでブリーダーは、興味ある表現型を示すこれら
の生産物より得られる集団の中から、更なる特徴付けの
ために選択を行う。
【０００８】残念ながら、多品種を発生せしめるための
突然変異の誘導は化学的突然変異誘発、放射線突然変異
誘発、組織培養工学又は変異遺伝子ストックをしばしば
含む。これらの方法は、所望の遺伝子における遺伝子の
変異性を増大するための手段を提供するが、しかしその
他の多くの遺伝子におげる欠損変異を頻繁に与える。こ
れらの他の特徴は、ある場合において更なる遺伝的操作
（例えばもどし交配）により除去されうるが、しかしこ
のような作業は一般に高価、且つ時間がかかる。例え
ば、花産業において、茎の強度及び長さの特徴、病気に
対する耐性、並びに品質の保持は重要であるが、しかし
通常は主に突然変異誘発処理に妥協する。
【０００９】前述の通り、組換ＤＮＡ工学の進歩は、園
芸学者に植物ゲノムを改良せしめる更なる手段を提供す
る。ある領域においては確かに実用的であるが、現在の
遺伝子工学方法はフラボノイド生合成又はその他の経路
を改良せしめる上において限界のある結果を有してい
た。最近、構造的に表現された「アンチセンス」カルコ
ンシンターゼ遺伝子による花の着色の阻害が報告されて
いる（Ｖａｎ ｄｅｒＫｒｏｌ 他；（１９８８）Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３３：８６６−８６９）。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】それ故、所望の表現型
特徴を有す植物の生産のための改良された方法のための
ニーズが存在する。特に、これらの方法は表現型の改良
のための一般的方法を提供すべきであり、そして高価、
且つ時間のかかるもどし交配を行う必要性を少なくす
る、又は完全に削除せしめるであろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】（発明の要旨）本発明に
より、−もしくは複数の所望の表現型又は遺伝子型特徴
を示す植物を生産するための方法及び組成物が提供され
る。本発明は、所望の特徴を示す植物が、プロモーター
と作動連結した核酸セグメントを含んで成るトランスジ
ェノートから選ばれる驚くべき発見にある程度基づいて
おり、ここでこのセグメントの転写生成物は内因性遺伝
子に相当する転写物と実質的に相同性である。このトラ
ンスジェノートは、例えば、色調の増大、変異したパタ
ーンの色調、又は植物の花もしくはその他の植物の器官
の基本的な色調における変化を含む、新規の特徴を示す
ことが可能な花を有する植物へと生長する。
【００１２】本発明は更に、−又は複数の代謝酵素遺伝
子領域、例えば、プロモーター領域のコントロール下
（自然状態又は異種のいづれかで）のフラボノイド生体
合成経路遺伝子領域を、この遺伝子が内因性にある双子
葉植物及びその他の植物の中に導入せしめることを包含
する。特に、本発明は植物、例えばペチュニア（Ｐｅｔ
ｕｎｉａ）及びキク科（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）
の種の植物を含んで成り、ここでこの植物は、所望の遺
伝子と実質的に相同性のＲＮＡ配列（アンチセンス以
外）へと転写される配列により形質転換された細胞から
生育する。好ましい態様において、この遺伝子はフラボ
ノイド生体合成経路遺伝子である。ＤＮＡ又はＲＮＡ相
当物は、更なる内因性（既に存在）転写物を生産せし
め、アンチセンス転写物を全っく生産しない方法におい
て、植物の中に導入される。これは好ましくは、プロモ
ーターがコード化領域の５’末端にて正常の配向性にお
いて位置するＤＮＡセグメント（天然又は構成品）を利
用することにより提供され、従って「有意」な転写物
（アンチセンス転写物でなく）が得られるであろう。植
物細胞は種々のベクター、例えばウィルスベクター、エ
ピソームベクター、シャトルベクター、Ｔ1プラスミド
ベクター等により形質転換せしめることができ、全ては
よく知られる方法に従って行われる。
【００１３】本発明はまた、種々の生合成又はその他の
酵素経路、例えば植物のフラボノイド生合成経路におい
て働くタンパク質をコード化する内因性核酸配列の表現
を下げるための方法を包含し、この方法は、植物細胞の
中に、この内因性配列と実質的に相同性であり、そして
プロモーター配列の作動調節下にあるＤＮＡ配列、例え
ばカリフラワーモザイクウィルスを導入せしめることを
含んで成る。このＤＮＡセグメントはリプレッション効
果を植物に導き入れるのに十分であり、そして典型的に
は、少なくとも５０個のヌクレオチドを、しかしながら
全長遺伝子を含んで成ることがある。他に、本発明は、
本発明の種々のＤＮＡ構造物を調製、且つ利用する方法
を含んで成る。
【００１４】本発明はまた、以下を提供する。
【００１５】１．少なくとも１つの改良された表現特徴
を示す植物を生産する方法であって、以下の工程：植物
細胞を核酸によって形質転換せしめ、これによってトラ
ンスジェノート細胞を生産せしめ（該核酸はプロモータ
ーと作動連結した転写可能なセグメントを有し、ここで
該セグメントの転写生成物は、関連する内因性遺伝子を
コード化する配列の転写物と実質的に相同性である）；
１又は複数の該トランスジェノート細胞から植物を成長
せしめ；該表現特徴を示す植物を選別すること；を含ん
で成る方法。
【００１６】２．前記の植物が花を発生する植物であ
る、項目１に記載の方法。
【００１７】３．前記のセグメントが全長のタンパク質
をコード化する、項目１に記載の方法。
【００１８】４．前記のセグメントがフラボノイド代謝
経路タンパク質をコード化する、項目１記載の方法。
【００１９】５．前記のセグメントが脂肪酸生合成経路
におけるタンパク質をコード化する、項目１記載の方
法。
【００２０】６．前記のセグメントが糖からデンプンヘ
の生合成経路におけるタンパク質をコード化する、項目
１記載の方法。
【００２１】７．前記の転写可能なセグメント及び前記
の内因性遺伝子の両者が前記のトランスジェノート細胞
において転写される、項目１記載の方法。
【００２２】８．前記のプロモーターが構成プロモータ
ーである、項目１記載の方法。
【００２３】９．前記のトランスジェノートにおける前
記のセグメントの転写物が、該トランスジェノート細胞
における内因性遺伝子配列の転写物と同一である、項目
１に記載の方法。
【００２４】１０．前記の核酸がＤＮＡベクター中にあ
る、項目１に記載の方法。
【００２５】１１．項目１に従って生産される植物。
【００２６】１２．植物の代謝経路におけるタンパク質
の生産を低めるための方法であって、以下の工程：該タ
ンパク質をコード化する内因性遺伝子配列と実質的に相
同性のＤＮＡセグメントを植物細胞に導入せしめ（該セ
グメントはプロモーター配列の作動的コントロール下に
ある）；そして、低められた該内因性遺伝子の転写物を
示す細胞を同定すること、を含んで成る方法。
【００２７】１３．前記植物細胞が、前記セグメントを
含んで成るＴｉプラスミドベクターにより形質転換され
たものである、項目１２に記載の方法。
【００２８】１４．前記ベクターが構成プロモーターを
含んで成る、項目１２に記載の方法。
【００２９】１５．前記のプロモーターが前記植物に対
して外因性である、項目１２に記載の方法。
【００３０】１６．前記のセグメントが前記の内因性転
写物の前又は同時に、一過性的に表現される、項目１２
に記載の方法。
【００３１】１７．前記のセグメントがフラボノイド代
謝経路遺伝子をコード化する、項目１２に記載の方法。
【００３２】１８．前記の内因性転写物がカルコンシン
ターゼ酵素をコード化する、項目１２に記載の方法。
【００３３】１９．前記の植物が双子葉植物である、項
目１２に記載の方法。
【００３４】２０．前記の植物が花を生産する、項目１
２に記載の方法。
【００３５】２１．前記の植物がペチュニア（Ｐｅｔｕ
ｎｉａ）属の一員である、項目１２に記載の方法。
【００３６】２２．ペチュニアの花の色付けを改質せし
めるための方法であって、アグロバクタートウメファシ
エン（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）の無力化Ｔｉプラスミドにおいて含まれるカル
コンシンターゼ遺伝子により、ペチュニア細胞を形質転
換せしめることにより花色素生産を変えること（ここで
該カルコンシンターゼ遺伝子はプロモーターと作動連結
している）を含んで成る方法。
【００３７】２３．変異した花の色付けを示すペチュニ
ア属の植物（該植物は、内因性フラボノイド生合成経路
遺伝子転写物と実質的に相同性のＲＮＡ配列へと転写さ
れる配列により形質転換された少なくとも１細胞を含ん
で成る）。
【００３８】２４．前記の細胞がＴｉプラスミドベクタ
ーにより形質転換された、項目２３に記載の植物。
【００３９】２５．前記のＲＮＡ配列がカルコンシンタ
ーゼタンパク質をコード化する、項目２３に記載の植
物。
【００４０】２６．植物細胞を形質転換でき、そしてペ
チュニアカルコンシンターゼ以外をコード化する遺伝子
の植物における表現型を改質せしめることができるベク
ター（該ベクターはプロモーターと作動連結している該
遺伝子の少なくとも一部を含んで成る）。
【００４１】２７．前記のプロモーターがカリフラワー
モザイクウィルスプロモーターである、項目２６に記載
のベクター。
【００４２】２８．前記のベクターが無力化Ｔｉプラス
ミドを含んで成る、項目２６に記載のベクター。
【００４３】本発明は、また、ペチュニア植物の内因性
カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子の発現を抑制する
ことによって、該植物の花色パターンを改変する方法を
提供する。この方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの無力化Ｔｉプラスミドでペチ
ュニア細胞を形質転換することにより花の色素の産生を
改変する工程であって、ここで該無力化Ｔｉプラスミド
は、ＣＨＳ遺伝子セグメントの実質的に完全長のコード
領域を含み、該セグメントはプロモーターに作動可能に
連結され、その結果、センスな転写産物が産生され、こ
こで該セグメントは該内因性ＣＨＳ遺伝子に実質的に相
同であり、そしてトランスジェノートにおいて転写され
る場合、花色パターンの改変をもたらし得る、工程を包
含する。
【００４４】本発明はまた、ペチュニア植物の内因性カ
ルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子の発現を抑制するこ
とによって、該内因性ＣＨＳ遺伝子を有する該植物の花
色パターンを改変する方法を提供する。この方法は以下
の工程：細胞から完全な植物トランスジェノートを生長
させる工程であって、該トランスジェノートは、プロモ
ーターに作動可能に連結されたＣＨＳ遺伝子セグメント
の実質的に完全長のコード領域を含む組換え核酸配列で
形質転換され、ここで該セグメントは該プロモーターに
連結され、その結果、センスな転写産物が産生され、該
セグメントは該内因性ＣＨＳ遺伝子に実質的に相同であ
り、そして該トランスジェノートにおいて転写される場
合、花色パターンの改変をもたらし得る、工程；および
改変された花色パターンを示す植物を選択する工程、を
包含する。
【００４５】本発明において、前記プロモーターが構成
的プロモーターであり得る。
【００４６】本発明において、前記プロモーターがカリ
フラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターであり得
る。
【００４７】本発明において、前記プロモーターが異種
プロモーターであり得る。
【００４８】本発明はまた、５０ペチュニア植物の内因
性カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子の発現を抑制す
ることによって、該植物の花の彩色を改変するための方
法を提供する。本発明において、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの無力化Ｔｉプラスミ
ドに含まれる完全長のＣＨＳ遺伝子でペチュニア細胞を
形質転換することにより、花の色素の産生を改変させる
工程、ここで該完全長のＣＨＳ遺伝子はプロモーターに
作動可能に連結されている、工程を包含する。
【００４９】本発明は、植物細胞において内因性遺伝子
の発現を減少させるためにベクターを使用する方法を提
供する。この方法は、該遺伝子の配列の少なくとも一部
分を含む該ベクターで植物細胞を形質転換する工程であ
って、該遺伝子配列の少なくとも一部分は、プロモータ
ーに作動可能に連結され、そして転写可能であってセン
ス方向でｍＲＮＡを産生する、工程を包含する。
【００５０】本発明はまた、植物の既存の遺伝子の発現
を減少させるためにＤＮＡ配列を使用する方法を提供す
る。この方法は、該配列で該植物のゲノムを改変する工
程であって、該配列の転写産物はセンス方向に産生さ
れ、そして該配列は、該既存の遺伝子によりコードされ
るｍＲＮＡに相補的な配列を含有する、工程を包含す
る。
【００５１】本発明はまた、植物の既存の遺伝子の発現
を減少させるためにＤＮＡ配列を使用する方法を提供す
る。この方法は、該配列で該植物のゲノムを改変する工
程であって、該配列の転写産物は、センス方向に産生さ
れ、そして該既存の遺伝子の転写産物に対して６５％よ
り大きい配列同一性を有する、工程を包含する。
【００５２】
【発明の実施の形態】（詳細な説明）本発明は、植物を
作るための新規な方法を提供し、且つこれにより作られ
た植物及びそれらの利用方法を含む。本発明は、細胞の
遺伝子生成物の表現における減少（即ち、リプレッショ
ン）が、遺伝子の転写部分と実質的に相同性のｍＲＮＡ
転写物を得るために最終的に転写される核酸フラグメン
ト、例えばフラボノイド生合成経路の遺伝子の配列を、
細胞に導入せしめることに基づいて達成されうることの
発見にある程度基づく。この導入された転写物は、天然
の転写物（存在すれぱ）に先立って好適に生成される
が、しかし天然転写物生成と同時に生成されることもあ
りうる。トランスジェノートにおいて生成された転写物
の回数及び量に依存して、これより生育する植物は種々
の異なる表現型特性を示すであろう。特に、所望の植物
特性が害されることなく、種々の表現型、例えば色調パ
ターン及び色調の強度を有する選択された植物は、本発
明に従って容易に得られる。
【００５３】例示であって限定ではないが、典型的な本
発明は、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）全長をコード化
する配列を、カリフラワーモザイクウィルスプロモ一夕
ーと作動連結する配向において、ペチュニアハイブリダ
（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）細胞に導入せしめ
ることを必要とする。これらのトランスジェノートは植
物の中にて増殖し、そして種々の色付いた花が選別され
る。この改良された花は天然のペチュニアハイブリダ植
物の実質的に全ての特徴を示す。本発明の他の見解にお
いて、当業者は容易に更なる特徴（即ち、フラボノイド
生合成経路におけるタンパク質以外）を容易に理解で
き、更なる植物の核酸配列等は、以降のガイドラインに
より容易に代用されうる。
【００５４】（特徴）種々の特徴が適切な方法及び十分
な数のトランスジェノートにより選択可能である。この
ような特徴は、識別できる特徴、環境又は抑圧に関連す
る特徴、疾病に関連する特徴及び成熟化の特徴を含む
が、これらに限定されない。この抑制効果は植物におい
て表現される種々の遺伝子、例えば、ペプチド、タンパ
ク質、脂肪酸、脂質、ワックス、油、デンプン、糖、炭
水化物、風味料、臭気物、芳香物、毒素、カロチノイド
色素、ホルモン、細胞壁ポリマー、遺伝子調節分子、フ
ラボノイド、貯蔵タンパク質、フェノール酸、クマリ
ン、アルカロイド、キノン、リグニン、グルコシノレー
ト、タンニン、脂肪族アミン、セルロール、ポリサッカ
ライド、糖タンパク質及び糖脂質の合成又は代謝のため
に重要な遺伝子に有用である。
【００５５】例えば、脂肪酸又は脂質の生成における変
化（及び脂肪酸の構成、例えば油生産植物の変異）は、
特定の鎖伸長の合成を阻害せしめること、又は不飽和酵
素により操作できる。また、デンプン合成のために必要
な酵素を遮断せしめることによりデンプンの合成を抑え
ることができ、且つ糖分が蓄積される（そして、例えば
食用植物の糖含有率はこれにより変異する）。同様に、
このような分子のグリコシル化に必要な酵素を遮断せし
めることにより、芳香分子が細胞から除去される（それ
故、例えば装飾用花の芳香特徴を変えられる）。
【００５６】これらの中で選択に容易なのは、識別でき
る特徴を示すフラボノイド遺伝子である。特に、この特
徴又は色調の強度、色合い及び色彩は抑制効果に支配さ
れる。
【００５７】フラボノイド生合成経路における遺伝子の
クラスは、フラボノイド成分を合成もしくは修飾する反
応又は反応のコントロールにおいて直接包含されるそれ
らの核酸配列を含む。フラボノイドは、花、果実、葉及
びその他器官における色付けを含む、植物において機能
する約３０００個の数の成分のクラスである。フラボノ
イド生合成遺伝子の例には、カルコーンシンターゼ、カ
ルコーン異性体（ＣＨＩ）、フラバノン３−ヒドロキシ
ラーゼ、ジヒドロフラボノールリダクターゼ、フラバノ
ン２−ヒドロキシラーゼ、ジヒドロフラバノール２−ヒ
ドロキシラーゼ、フラボノイド３’−ヒドロキシラー
ゼ、フラボノイド５’ヒドロキシラーゼ、フラボノイド
グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰＧ：フラボノイ
ド３−０−グルコシルトランスフェラーゼ及びＵＤＰ
Ｇ：フラボノール７−０−グルコシルトランフェラーゼ
のようなグリコシルトランスフェラーゼ、並びにラムノ
シルトランスフェラーゼを含む）、フラボノイドメチル
トランスフェラーゼ（例えば、ＳＡＭ：アントシアニジ
ン３−（ｐ−クマロイル）−ルチノジド−５−グルコシ
ド３’，５’−０−メチルトランスフェラーゼ）及びフ
ラボノイドアシルトランスフェラーゼのための遺伝子を
含む。
【００５８】アントシアニン色付け花は、橙色から赤色
から紫色から青色の範囲にわたる色を有す。フラボン及
びフラボノールは非常に薄い黄色又は「クリーム色」で
ある。フラバノンは無色である。アントシアニンの除
去、及びフラボン又はフラボノール生成への経路の転換
は、クリーム色の花を作り上げるであろう。広範囲にわ
たる二色のパターンを作り上げることができ、この二色
は、研究植物の操作前の色、及び導入せしめたフラボノ
イド遺伝子の表現型からもたらされる色である。パター
ンの種類には、放射状の星状パターン、ピコティー（白
いふちどり）、白い環状の中心、同心円状に色付いた
輪、とっぴで不規則なパターン、例えばまだら又はしみ
状が含まれる。これらのパターンに基づく多種のバリエ
ーションがあり、あるものは他よりもより魅力的であ
り、あるものは色の問にはっきりとした境界線を有し、
あるものはぼやけた境界線を有し、あるものは直線上の
境界線を有し、あるものは波打った、曲線状の境界線を
有する。また、より薄い単色も観察できる。
【００５９】本発明は、種々の油生産の絶対的なレベル
又は相対的な比率の改質を示す植物を作り上げるために
も適用される。特に、脂質代謝において包含される酵素
をコード化する遺伝子は、油及びその他の脂質、例えば
脂肪の代謝を改質するための詳載方法において用いられ
うる。油は、一般に室温で液状であり、そして一般に脂
肪酸成分において種々の不飽和物、及び脂肪よりも短い
脂質鎖を有するであろう脂質である。Ｌｅｈｎｉｎｇｅ
ｒ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ Ｅ
ｄ），Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；及びＢｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｎｅｒ（１
９７６）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３ｄ
Ｅｄ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ を参照のこと。有用な生合成経路については遺
伝子レベルにおいてもよく知られている。本明細書にて
引用する以下の文献を参照のこと：Ｓｈｕｒｅ ｅｔ
ａｌ．（１９８），Ｃｅｌｌ ３５：２２５−２３３；
Ｐｒｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ Ｇ
ｅｎｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎ
ｔ（Ｂｒｕｅｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ｐｌ
ｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８７），１３３−１５２；
Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８），Ｐｌａｎｔ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２１５−２２４；Ｏｌｉｖ
ｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８９），Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５２５−５３８；及びＢｈａｔｔ
ａｃｈａｒｙｙａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０），Ｃｅ
ｌｌ ６０：１５５−１２２。これら全ては本明細書に
おいて参考文献として組入れている。
【００６０】油を生成するための経路において見い出せ
る種々の酵素をコード化する遺伝子を、必要な内因性遺
伝子の表現型を変異せしめるため、目的植物の中に導入
せしめた。よって、油の種々の異なるタイプの相対的な
比率又は絶対的な含有量は、当業界において遺伝子レベ
ルで知られている糖−デンプン生合成経路の知識を利用
することにより変更できうる（例えば、前述と同様の論
文を参照のこと）。特定の目的の種々酵素には、他にス
テアリルディサチュラーゼ、アセチルトランスアシラー
ゼ、マロニルトランスアシラーゼ、β−ケトアシルＡＣ
Ｐ−シンテターゼ、β−ケトＡＣＰ−リダクターゼ、エ
ノイルＡＣＰ−ヒドラーゼ、アシル−ＡＣＰチオエステ
ラーゼ及びエノイルＡＣＰ−リダクターゼが含まれる。
【００６１】本発明は、植物における糖代謝又は炭水化
物代謝の変異にも適用できる。例えば、炭水化物代謝、
例えば、アミロース、ペクチン、セルロール及び細胞壁
の代謝に利用される酵素をコード化する遺伝子は、代謝
中間体のプールサイド、又は変換の反応速度を変更せし
めるための酵素的表現型及び活性を調節せしめるために
利用され、これにより種々の植物のデンプン又は糖含有
量を変化できる。
【００６２】炭水化物代謝における種々の酵素をコード
化する遺伝子は、この経路における種々の酵素の表現型
を変えるために目的植物の中に導入されうる。炭水化物
代謝における特定の目的の種々の酵素には、ホスホリラ
ーゼ、デンプンシンテターゼ、Ｑ−酵素、スクロース−
６−ホスフェートシンテターゼ、スクロース−６−ホス
フェートホスファターゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホス
ホリラーゼ及び種々のアミラーゼが含まれる。Ｂｏｎｎ
ｅｒ ａｎｄ Ｖａｒｎｅｒ（Ｅｄｓ）（１９７６）Ｐ
ｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（３ｄ ｅｄ），
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参
照のこと。遺伝子レベルでの生合成経路の有用性につい
てもよく知られている。ここで引用する以下の文献を参
照のこと：Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９
６１），Ｃｏｎ．Ｊ．ＰｌａｎｔＳｃｉ．４１：２１８
−２１９；Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７
２），Ｏｉｌ Ｃｒｏｐｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ
（Ｒｏｂｂｅｌｅｎ ｅｔａｌ．，ｅｄｓ．），ＭｃＧ
ｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２６０−２８２；Ｈａｍｍｏｎｄ
ｅｔ ａｌ．（１９８３），Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２３：
１９２−１９７；Ｗｉｄｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（１
９８４），Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２４：１１１３−１１１
５；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｅｕｐｈ
ｙｔｉｃａ３３：３２１−３２８；Ｇｒａｅｆ ｅｔ
ａｌ．（１９８５），Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．２５：１０７
６−１０７９；Ｓｏｍｅｒｒｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，
Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｙｔｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｎｎ，ｅｄ．），Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｒｅｓｓ（１９８８），１９−４４；Ｋｕｎｓｔｅ
ｔ ａｌ．，（１９８８），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：
４１４３−４１４７；及びＢｒｏｗｓｅ ｅｔ ａ
ｌ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｙ
ｉｎｇ Ｐｌａｎｔ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉ
ｏｎ”（１９８９），Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ（Ｌａｍｂ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ），Ａ
ｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ．これら全ては本明細書にて、参
考文献として援用する。
【００６３】本発明に関して有用な遺伝子配列のための
適切な原料は、植物、特に高等植物である。例えば、実
際には全ての高等植物はあるタイプのフラボノイド生合
成経路を通常有す。特に、ナリンゲニンカルコン又はナ
リンゲニンカルコンから作られる成分であって、それ自
身はカルコンシンターゼによりクマロイル補酵素Ａ及び
マロニル補酵素Ａから作られるものを作り上げる全ての
フラボノイド経路が適切であろう。
【００６４】（導入した核酸配列）核酸配列の特性の変
更された好ましい態様は、当業者により完全に本質的に
は理解されないかも知れないが、しかし明確に便宜上理
解されうる数多くの特徴を説明するであろう。これは導
入すべき特定配列の単離方法、この配列の一定の特徴、
及びもし必要ならば一体化するベクターの一定の特徴を
含む。導入遺伝子の転写表現型は一般に重要であり（特
定の機構に限定することなく）、内因性型のこの配列の
正常な表現型に対応する更なる転写物の生成は、基本的
な機構（特に内因性遺伝子表現の最高レベルの到達に先
立ち）の一部でありうる。しかしながら、その他の機構
も含まれることがあり、例えば大いなる複写数、又は特
定遺伝的領域への一体化におけるこれらの遺伝子の体外
性複写物の単なる物理的存在は、抑制効果に貢献しう
る。
【００６５】転写により得られるＲＮＡは本明細書にて
時折「転写物」又はある場合において「ｍＲＮＡ」と称
する。一般に、処理された転写物（例えば、イントロン
の除去及び３’末端のポリアデニル化）をｍＲＮＡ（メ
ッセンジャー）として称する。本明細書に用いる「相同
性」は一致する（同様である）ことを意味する。例え
ば、遺伝子と相同性のＲＮＡは、鋳型鎖配列（通常のＤ
ＮＡについてのチミジンの代わりに、ＲＮＡについての
ウラシルの例外を有する）と一致するＲＮＡである。そ
れ故、本明細書に用いる細胞生産の「相同性のｍＲＮ
Ａ」は遺伝子鋳型ＤＮＡ鎖と相補的でない。
【００６６】ｍＲＮＡは、ポリペプチドを作り上げるア
ミノ酸への翻訳のためにコード化せしめるコドントリプ
レットの「コード領域」を含みうる。初期転写物はエク
ソン（一般にコード化領域を含む）及びイントロンの両
方を含み、後者は翻訳前に通常削除される。
【００６７】内因性遺伝子、例えばフラボノイド経路に
おける遺伝子の表現型は、細胞のタイプ及び進行段階に
依存する変動レベルの転写物を作り出す。花の発生の
際、ある細胞、例えば花びら表皮組織を発生させる細胞
は、それが増大するレベルにて、又はその後の花分裂開
始時にて転写物を製造するか又は製造を開始する。転写
物レベルは花の発生の後にピークに到達し、そして最終
的には減少する。転写物レベルの増大及び減少は一連の
日数、例えば７−１４日にわたり起こりうる。この増大
は迅速に起こることもあり、例えば数時間の間に、特に
例えばＵＶ又は可視光による誘導（Ｍｏｌ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９
２：４２４−４２９を参照のこと；本明細書に参考文献
として組入れている）において、特に自然の夏光線条件
（又は人工的なその相当物）のもとで起こりうる。例え
ば、転写物レベルは通常、成熟花段階（花の成熟化）に
て減少する。
【００６８】考えられる抑制機構の一つは、いくつかの
導入配列の転写、例えば転写された内因性ＤＮＡと相同
性の、導入ＤＮＡの転写（転写されていない、内因性Ｄ
ＮＡと相同性の、導入ＤＮＡの転写も含む）を必要とす
る。しかしながら特に、得られた遺伝子の内因性転写レ
ベルは自然条件に対して約５０倍低下した。導入遺伝子
の転写物レベルも内因性遺伝子レベルに関して低く、そ
してそのトータルも低かった。導入配列は最終翻訳情報
又はその一部と一致する必要はないが、それらは抑制に
おいて機能的なｍＲＮＡに相当する型の傾向にあり、し
かしながらイントロンの一部又は正常の内因性配列の最
初の転写物の単なる非翻訳セグメントを含み続けるであ
ろう。それ故、この効果は、導入配列が本質的に全っく
コード化配列を含まず、イントロン又は内因性配列の初
期転写において存在する配列と実質的に相同性の非翻訳
配列のみを含む際に生ずるであろう。更に、本発明は任
意の特定の機構と結び付く必要はないが、この機構は導
入配列及び内因性の相同性の配列の両者のメチル化を含
みうる（メチル化は配列から隣接配列にわたって広がる
ことができるものと知られる）。
【００６９】この導入配列は一般に、抑制すべき内因性
配列と実質的に相同性であろう。従って、調節因子は導
入配列が存在することを認識し、この相互作用は抑制効
果をもたす。最小の相同性は一般に約６５％より大きい
であろうが、しかし更に高い相同性は、内因性配列の表
現型の更なる効率的な抑制を及ぼすであろう。実質的に
高い相同性、又は約８０％より大きい相同性が好まし
く、しかしながら完全同一の約９５％が最も好ましい。
この結果、この効果は、相同性又は実質的な相同性を示
す類似の科の遺伝子における全てのその他のタンパク質
に適応するであろう。例えば、カルコンシンターゼタン
パク質は、カルコンシンターゼ遺伝子科を含んで成る、
１又は複数の相同性遺伝子によりコード化されることが
あり、そしてその科の一構成員の抑制は、一般にその科
の他のものに同様の抑制を引き起こす効果のために働く
であろう。同様に、例えば他の植物種由来のカルコンシ
ンターゼ遺伝子も利用できうる。
【００７０】完全なる相同性を必要としない導入配列は
また、初期転写生成物又は完全に処理されたｍＲＮＡの
いづれの全長に相当するものである必要がない。
【００７１】全長配列よりも短い配列におけるより高い
相同性は、より長くて相同性の低い配列を補う。更に、
導入配列は同等のイントロン又はエクソンパターンを必
要とせず、そして非コード化セグメントの相同性も同様
に有効であろう。通常、５０−１００個以上のヌクレオ
チドの配列が利用されうるが、しかしながら約２００〜
３００のヌクレオチドの配列が好ましく、そして５００
−１０００のヌクレオチド以上の配列は、内因性遺伝子
のサイズに依存して特に好ましいであろう。
【００７２】全長コード化配列は不必要であるため、同
様の効果を複数のタンパク質に与えることは、種々の異
なる遺伝子の調和のとれた抑制のために複数の配列を融
合することによる単一の形質転換を用いることで可能で
あることが理解されるであろう。十分な数の導入物がで
きるとすると、導入配列は作動プロモーター配列と結合
せしめる必要がない。しかしながら、プロモーター配
列、特に構成プロモーターを部分的に、又は完全に必要
とするであろう。「作動 連結」は、影響を及ぼす配列
（例えばプロモーター又は３’セグメント）とコントロ
ールされた核酸配列との間の機能的な結合を称する。同
様の効果は、内因性配列をコード化する鎖と作動連結す
るプロモーターの導入により提供されうる。これはプロ
モーターを単独で標的配列と作動連結する部位に導入せ
しめること、又は作動連結したプロモーターと組換的に
結合する内因性由来の配列の再導入のいづれかにより及
ぼされる。
【００７３】異種の配列は、異種の種由来のものである
か、又はもし同種由来の場合、その本来の形を実質的に
改質せしめたものである。
【００７４】予想される導入遺伝子の表現型の一過性の
段階を考える上において、関連する因子はプロモーター
のタイプ、プロモーターの一過性のパターン及びプロモ
ーターのゲノムにおけるその位置の見地における作用を
含む。相同性内因性配列の正常な活性化と同時、又はそ
の前に表現されるプロモーターが好ましい。構成プロモ
ーター、例えばカリフラワーモザイクウィルスプロモー
ターが最も好ましい。これは構成的（Ｃｏｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｖｅ）であり、なぜならその作用は、それらが含ま
れる細胞の発生過程と相対的に独立しているからであ
る。調節プロモーター、例えばリブロース−１，５−ビ
スホスフェートカルボキシラーゼと一体化するクロロフ
ィル結合タンパク質又はグリシンに富む根タンパク質の
遺伝子も適切である。この調節は細胞の発生工程と関連
して一過性であるか、又は植物の異なる部分又は器官に
よる異なる表現型に基づくかのいづれかにありうる。
【００７５】前述の通り、プロモーターの作用はそのゲ
ノムにおける位置に依存して変化するであろう。それ
故、調節プロモーターはその通常の位置においてどのよ
うに作用するかによって異なって作用することがあり、
例えば、これは完全又は部分的に構成的となりうる。
【００７６】ＤＮＡ配列は、プロモーターから、このプ
ロモーターが通常最も有効な位置に相当する距離で結
合、且つ位置することで、十分なる転写活性を確実にせ
しめることが好ましい。この距離は翻訳開始コドンの約
１０００ヌクレオチド以内、好ましくは約５００ヌクレ
オチド以内、そしてより好ましくは約３００ヌクレオチ
ド以内であるべきである。
【００７７】コード化配列の３’末端に、作動連結した
セグメントを含むこともできる。それ故、ポリアデニル
化部位及び任意の関連転写終結部位を含む３’非翻訳領
域を有すことが最適であろう。約１０００ヌクレオチド
より少ない３’配列で十分であり、約５００が好まし
く、そして約３００、又は内因性配列の３’非翻訳尾部
の長さがより好ましい。
【００７８】もし導入遺伝子が目的植物又はその他の種
からのインタクト遺伝子（コード化配列、イントロン、
プロモーター、エンハンサー及びその他のコード化配列
の上流（５’）又は下流（３’）のいづれかのシス作用
調節因子を含む完全な遺伝子を意味する）ならば、それ
ぞれのトランスジェノートの断片はその遺伝子に依存し
て、導入遺伝子を異常な表現型、即ち、発生における異
常な回数の表現をもたらす位置において有することがあ
る。もし導入遺伝子がキメラ遺伝子（他の遺伝子からの
もしくは複数の要素、例えばプロモーターがインタクト
遺伝子の成分に置換されているか、又はインタクト遺伝
子に加えられたものであって、表現のために必要な、又
は有利な上流及び下流配列と融合したコード化する配列
を含むものを意味する）であり、そして構成的（完全又
は部分的に）プロモーターにより活性化される場合、表
現の異常なレベル及び回数はトランスジェノートの大き
な断片においても起こりうる。もしこの導入遺伝子がキ
メラ遺伝子であり、そして発生調節プロモーターにより
活性化される場合、あるトランスジェノートの断片は異
常なレベル及び回数のこの導入遺伝子の表現を示すであ
ろう。このプロモーター又はその他のシス要素の強さ
は、コード化配列の通常のプロモーターと同等、低め、
又は高めでありうる。発生における時期は早いか同じで
ありうる。
【００７９】これらの多数の改良は本質的ではないと考
えられるが、有用なトランスジェノートの製造の効率は
大いに影響された。いくつかのトランスジェノートは親
株植物と同一でありうり、その他は花びら又はその他の
注目の器官にわたり低められた量の色付いた、又は無色
のフラボノイドを有することがある。その他は、一定の
細胞もしくは細胞の一部、又は花びらの断片、あるいは
その他の器官において、低められた量のフラボノイドを
有することがあり、規則的又は不規則的な色彩をもたら
す。同じ植物における花も異なるパターンを有すること
がある。所望のトランスジェノートを得る可能性は、ス
クリーンしたトランスジェノートの数、並びに実際の形
質転換の効率及び異種の核酸配列の表現型の効率に依存
するであろう。一般に、少なくとも２５から５０のトラ
ンスジェノートがスクリーンされうるが、しかし詳細な
効果が見られる前には、１００から５００、又はそれ以
上をスクリーンする必要がある。
【００８０】前述の抑制効果を及ぼすための核酸の選択
は広い。適切な選択方法及び十分な数のトランスジェノ
ートが得られたなら、広範囲の植物遺伝子がこの効果を
示すことができる。例えば、ペプチド、タンパク質、脂
質、ワックス、油、デンプン、糖、炭水化物、風味料、
臭気物、芳香物、毒素、カロチノイド色素、ホルモン、
細胞壁ポリマー、遺伝子調節分子、フラボノイド、種子
貯蔵タンパク質、フェノール酸、クマリン、アルカロイ
ド、キノン、リグニン、グルコシノレート、タンニン、
脂肪族アミン、セルロース、ポリサッカライド、糖タン
パク質及び糖脂質の合成又は代謝のために必要な遺伝
子、並びに植物の色付けに関連する特定の遺伝子が挙げ
られる。植物に色付けする遺伝子の中ではフラボノイド
遺伝子、そして最も特別にはカルコンシンターゼ遺伝子
配列が挙げられる。
【００８１】これらの遺伝子は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅ
ｔ ａｌ．（以降を参照のこと）にて詳細の方法によ
り、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼ
ーションの標準的な方法により単離されうる。スクリー
ニングは、（１）他の生物由来の相同性の遺伝子を用い
る核酸ハイブリダイゼーション、（２）既知のタンパク
質配列をコード化する特定配列とハイブリダイズせしめ
るために合成的に生成したプローブ、又は（３）ＤＮＡ
シーケンシングし、そして既知の配列と比較すること、
により行われうる。特定遺伝子についての配列は、例え
ばＧｅｎＢａｎｋ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（コンピューターデーター
ベース）において見出すか、又は前述した技術を一般に
利用することで単離後に検定しうる。
【００８２】フラボノイド遺伝子は例えば、標的遺伝子
のｍＲＮＡが他に比べ１つの組織においてより豊富に表
現されることを必要とする異なるハイブリダイゼーショ
ンにより、ライブラリーにおいて豊富となりうる。各組
織からの標識ＲＮＡ、又はｃＤＮＡをこのライブラリー
のレプリカとハイブリダイズさせ、そして組織特異性の
クローンが同定、且つ単離される。よってスクリーニン
グは一組の組織特異性遺伝子の中から標的遺伝子を同定
するために利用できる（Ｋｒｅｕｚａｌｅｒｅｔ ａ
１．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８０：２５９１−２５９３）。
【００８３】相同性タンパク質に対して作られた抗体に
よる表現型ライブラリーの抗体スクリーニングは、相同
性の機能をコード化するであろう核酸配列を選ぶことが
できる。既知のフラボノイド生合成経路タンパク質と相
同性の配列の選択は、その他の型又は同等の型を異なる
原料から単離せしめることを可能にする。
【００８４】トランスポゾンを抱えることは問題の遺伝
子の単離において補助しうる。トランスポゾンを抱える
ことは一般に、標的遺伝子の突然変異を包含する。突然
変異はトランスポゾンが挿入された標的遺伝子から単離
され、そして得られる表現型を変化せしめる。トランス
ポゾンに対するプローブの利用により、突然変異遺伝子
が単離できる。そして、プローブとしての、単離せしめ
た突然変異遺伝子におけるトランスポゾンに隣接するＤ
ＮＡを利用することにより、通常の野性型の標的遺伝子
のアレルが単離できる（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ａｎｄ
Ｗａｌｂｏｔ（１９８７）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１
７：７７１−７７６；Ｄｏｏｎｅｒ ｅｔａｌ．，（１
９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００：
２４０−２４６；及びＦｅｄｅｒｏｆｆ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８１：３８２５−３８２９）。
【００８５】しかしながら、前述の通り、挿入遺伝子と
内因性遺伝子間の相同性は完全に同一でなくてもよい。
異種の相同性の遺伝子はこの同じ抑制表現型を授けるで
あろう。述べた通り、この抑制効果は多数の種々の遺伝
子を発生できる。本明細書ではとりわけ、フラボノイド
経路遺伝子に関して例示する。
【００８６】（目的植物）本明細書に用いる「植物」
は、植物全体、植物の一部、植物細胞、又は植物細胞の
集団を称する。本発明方法に用いることができる植物の
分類は一般に、形質転換技術の行い易い、単子葉植物及
び双子葉植物の両者を含む高等植物の分類と同等であ
る。これは多倍性、２倍性及び１倍性を含む種々のプロ
イディー（倍数性）レベルの植物を含む。
【００８７】多数の植物遺伝子の表現型の調節において
有用であるにもかかわらず、本発明はフラボノイド経路
遺伝子を表現する特定の用途により容易に特徴付けられ
る。少なくともいくつかのフラボノイド経路遺伝子は、
高等植物において実質的に遍在的である。それらの生成
物は花又はその他の色付いた植物器官（例えば、葉、
茎、根、塊茎、がく片、果実、野菜）にて見い出せる。
これらの色は、アントシアニン色素、その他のフラボノ
イド色素、補助色素、又は植物によってカルコンから合
成された無色のフラボノイドにより主に提供される。前
記のＨａｈｌｂｒｏｃｋ；Ｈａｒｂｏｎｅ，（１９８
６）Ｐｌａｎｔ Ｆｌａｖｅｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ ＡｃｔｉｖｉｔｙＲｅｌａｔｉｏｎｓ
ｈｉｐｓ；Ｈａｒｂｏｎｅ，（１９７６）Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐ
ｌａｎｔ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，（２ｄ ｅｄ．）Ｖｏ
ｌ．１，Ｇｏｏｄｗｉｎ（Ｅｄ．）Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓ
ｓ．参照のこと。
【００８８】果実（例えば、リンゴ、チェリー、プラ
ム、グレープ）、野菜（例えばナス、ペッパー、ケー
ル、レタス、ダイコン、カリフラワー）又はその他の食
用植物（例えばポテト）の色付けも、これらの技術を利
用する操作に従う。花の色はむろん、通常フラボノイド
経路遺伝子の作用に非常に依存し、そしてそれ故、これ
らはフラボノイド生合成経路遺伝子の表現型の絶対的及
び相対的レベルに特に感受性である。装飾植物及び花は
商業的に価値があり、それ故この方法の典型的な標的を
本明細書に記載した。新しく色付いた組織の生産及び選
択は装飾花を産する植物、例えばキク、カーネーショ
ン、バラ、ガーベラ、ユリ、ゼラニウム、ポインセチア
及びペチュニリにおいて特に有用である。
【００８９】（形質転換）本発明に関する植物の形質転
換は、本質的に植物分子生物学の当業者に知られる任意
の種々の方法により行われうる。本明細書に参考文献と
して組入れている、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１５３（”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ ＤＮＡ Ｐａｒｔ Ｄ”）１９８７，Ｗｕ ａｎｄ
Ｇｒｏｓｓｍａｎ Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓを参照のこと、本明細書に用いる語、「形質転
換」は、核酸配列を導入せしめることによる宿主植物の
ゲノタイプの変異を意味する。この核酸は異なる原料に
由来する必要はないが、しかしある点では、それらは導
入される細胞に対して外因性であろう。
【００９０】一つの態様において、この異種核酸はマイ
クロピペットを利用する植物細胞の中への直接的なマイ
クロインジェクションにより機械的に移し入れられる。
他方、異種の核酸をポリエチレングリコールを利用して
植物細胞の中に移し入れうる。これは遺伝子材料の沈殿
複合物を形成せしめ、これらは細胞から採取される（Ｐ
ａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）ＥＭ
ＢＯＪ．３：２７１７−２２）。
【００９１】本発明の他の態様において、この導入遺伝
子はエレクトロポレーションにより植物細胞に導入する
ことができる（Ｆｒｏｍｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８
５）”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏＭｏｎｏｃｏｔ ａｎｄ
Ｄｉｃｏｔ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５８２４（本明細書に
参考文献として組入れる）。この技術において、植物プ
ロトプラストは、関連の遺伝子構造物を含むプラスミド
又は核酸の存在下においてエレクトポレートされる。高
い電場強度の電気的なインパルスは、可逆的に生体膜を
浸透性にし、プラスミドの導入を可能にする。エレクト
ロポレートされた植物プロトプラストは細胞壁を修正
し、分裂し、そして植物カルスを形成する。形質転換さ
れた遺伝子を有する形質転換された植物細胞の選択は、
表現型マーカーの利用により行われうる。
【００９２】カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭ
Ｖ）も異種核酸を植物細胞に導入するためのベクターと
して利用できる（Ｈｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８
２）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐ
ｌａｎｔ Ｔｕｍｏｒｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５４９−５６０；Ｈｏ
ｗｅｌｌ，米国特許４，４０７，９５６号）。ＣａＭＶ
ウィルス性ＤＮＡゲノムを親株細菌プラスミドの中に挿
入して組換ＤＮＡ分子を作ることができ、これは細菌中
で増殖することができる。クローン化後、この組換プラ
スミドは再度クローン化でき、そして目的のＤＮＡ配列
はリンカーの固有制限部の中に導入することにより更に
修飾されうる。この修飾された組換プラスミドのウィル
ス部を次いで親株細菌プラスミドから切り出し、そして
植物細胞又は植物の接種に用いる。
【００９３】核酸セグメントの他の導入方法は、小ビー
ズもしくは粒子のいづれかの中、又はその表面上の核酸
による、小粒子に高速弾道貫通である（Ｋｌｅｉｎ ｅ
ｔａｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−
７３）。一般に単一の新しい核酸セグメントの導入のみ
が必要であるが、この方法は特に複数の導入を提供す
る。
【００９４】核酸セグメントを植物細胞に導入する好ま
しい方法は、植物細胞、外植体、成長点又は種子に、こ
のセグメントで形質転換されたアグロバクター トウメ
ファシエン （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓ）を感染せしめることである。当業界に
おいて知られる条件のもとで、形質転換植物細胞は苗
条、根を形成するために成長し、そして更に植物へと成
長する。この核酸セグメントは適切な植物細胞の中に、
例えばアグロバクター トウメファシエンのＴｉプラス
ミドにより導入できる。このＴｉプラスミドは、アグロ
バクター トウメファシエンによる感染に基づいて植物
細胞に移し入れられ、そして安定的に植物ゲノムの中に
一体化する（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８
４）”Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：４９６−４９８；Ｆ
ｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：４８０
３）。
【００９５】Ｔｉプラスミドは形質転換細胞の生成のた
めに実質的に二つの領域を含む。この一方はトランスフ
ァーＤＮＡ（ＴＤＮＡ）と称され、腫瘍形成を引き起こ
す。他方はヴィルレント領域と称され、ＴＤＮＡの植物
への導入のために重要である。植物ゲノムを転移せしめ
るトランスファーＤＮＡ領域は、異種核酸配列の挿入に
より、その転移能力が影響されることなく、サイズが増
大されうる。腫瘍発生遺伝子を除去することにより、こ
れらをもはや妨害できなくせしめ、これによりこれら
「無力化Ｔｉベクター」となったこの修飾Ｔｉプラスミ
ドを本発明の遺伝子構成物の輸送のためのベクターとし
て適当な植物細胞に導入せしめる。
【００９６】アグロバクターにより形質転換されうる全
ての植物細胞及び形質転換細胞から再生した植物全体も
本発明により形質転換され、形質転換された異種核酸配
列を含む形質転換植物全体を生産できる。
【００９７】現在、３つの異なるアグロバクターによる
植物細胞を形質転換させる方法が存在する。
【００９８】（１）アグロバクターを、培養した単離プ
ロトプラストと共に培養せしめること、（２）アグロバ
クターにより、細胞又は組織を形質転換せしめること、
（３）アグロバクターにより、種子、成長点又は分裂組
織を形質転換せしめること。
【００９９】方法（１）は、プロトプラストの培養及び
培養プロトプラストから植物を再生せしめることを可能
にする確立された培養システムを必要とする。
【０１００】方法（２）は、（ａ）植物細胞又は組織が
アグロバクターにより形質転換されること、及び（ｂ）
形質転換細胞又は組織が完全な植物へと更生せしめるこ
と、を必要とする。
【０１０１】方法（３）はマイクロプロパゲーションを
必要とする。
【０１０２】感染体を得るためのバイナリーシステムに
おいて、二つのプラスミドを必要とする：Ｔ−ＤＮＡ含
有プラスミド及びウィルス（ｖｉｒ）プラスミドであ
る。数多くのＴ−ＤＮＡ含有プラスミドのいづれをも用
いることができるが、唯一の必要条件は、それが二つの
プラスミドのそれぞれに対して独立に選択できることに
ある。
【０１０３】植物細胞又は植物の形質転換後、所望のＤ
ＮＡセグメントを一体化せしめるためにＴｉプラスミド
により形質転換されたそれら植物細胞又は植物は、適当
な表現型マーカーにより選択されうる。これらの表現型
マーカーには、抗生物質耐性、除草剤耐性又は目視観察
が含まれるが、それらに限定しない。その他の表現型マ
ーカーが当業界に知られ、そして本発明に用いられう
る。
【０１０４】プロトプラストが単離でき、培養されて完
全な再生植物を提供しうる全ての植物が本発明により形
質転換せしめることができ、これにより転移された異種
の遺伝子を含む完全植物が得られる。適切な植物の属に
は、例えば、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ミヤコグサ
（Ｌｏｆｕｓ）、ウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、イ
ガマメ（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、シャジクソウ（Ｔｒ
ｉｆｏｌｉｕｍ）、レイショウコウ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌ
ｌａ）、サザケ（Ｖｉｇｎａ）、ミカン（Ｃｉｔｒｕ
ｓ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ）、フロウソウ（Ｇｅｒａｎｉ
ｕｍ）、イモノキ（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ニンジン（Ｄａ
ｕｃｕｓ）、シロイヌナズケ（Ａｒａｂｉｄｏｐｉ
ｓ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイコン（Ｒａ
ｐｈａｎｕｓ）、シロガラシ（Ｓｉｎａｐｉｓ）、オオ
カミナスビ（Ａｔｒｏｐａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉ
ｃｕｍ）、ヒヨス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、トマト
（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉ
ａｎａ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ）、シクバネアサガオ
（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉ
ｓ）、ハナハッカ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、シオホリウム
（Ｃｉｏｈｏｒｉｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌａｎｔｈｕ
ｓ）、アキノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ）、スズメノチャ
ヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ）、クサスギガラ（Ａｓｐａｒａｇ
ｕｓ）、キンギョウソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、
ヘレロカリ（Ｈｅｒｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、アフリカウ
ンラン（Ｎｅｍｅｓｉａ）、テンジクアオイ（Ｐｅｌａ
ｒｇｏｎｉｕｍ）、キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシ
バ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、キンポウゲ（Ｒａｎｕｎ
ｃｕｌｕｓ）、キオン（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、サルメンバ
ナ（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕ
ｍｉｓ）、ルリマガリバナ（Ｂｒｏｗａａｌｉａ）、ダ
イズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ドクムギ（Ｌｏｌｉｕｍ）、
トウモロコシ（Ｚｅａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕ
ｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ）及びチョウセンアサ
ガオ（Ｄａｔｕｒａ）が含まれる。
【０１０５】実際には全ての植物が培養細胞又は組織か
ら再生できることが知られ、その中には全ての主要な穀
物種、サトウキビ、テンサイ、綿、果実及びその他の
木、マメ類並びに野菜が含まれるが、それに限定されな
い。全てのこれらの植物がアグロバクターにより形質転
換されうるかどうかに基づく最大限の知識が現存する。
アグロバクターについての通常の植物宿主の種は、イン
ビトロにて形質転換されうる。単子葉植物、そして特に
穀類及び草類はアグロバクターの通常の宿主ではない
が、アグロバクターを利用するそれらの形質転換のため
の操作が実施されている（Ｈｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ Ｓ
ｌｏｇｔｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１１：７６３−７６４）。アグロバクターに
より形質転換されうる更なる植物の属には、キク（Ｃｈ
ｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、ナデシコ（Ｄｉａｎｔｈｕ
ｓ）、ガーベラ（Ｇｅｒｂｅｒａ）、トウダイグサ（Ｅ
ｕｐｈｏｒｂｉａ）、ペラルオニウム（Ｐｅｌａｒｏｎ
ｉｕｍ）、サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ）、トウケイソ
ウ（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ）、シクラメン（Ｃｙｃｌａ
ｍｅｎ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）、サクラ（Ｐｒｕｎｕ
ｓ）、バラ（Ｒｏｓａ）、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ）、ヤ
マナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、ビャクダン（Ｓａｎｔａ
ｌｕｍ）、ネギ（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリ（Ｌｉｌｉｕ
ｍ）、スイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）、パイナップル
（Ａｎａｎａｓ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ）、イ
ンゲン（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、及びエンドウ（Ｐｉｓ
ｕｍ）が含まれる。
【０１０６】（再生）通常、再生は完全植物を形質転換
工程から得ることに包含されうる。「トランスジェノー
ト」なる語は、形質転換工程の中間生成物及びトランス
ジェニック植物に関する。
【０１０７】本明細書に用いる「再生」なる語は、完全
植物を植物細胞、植物細胞の集団、植物の一部又は植物
の断片（例えばプロトプラスト、カルス又は組織部分）
から成長させることを意味する。
【０１０８】培養プロトプラストからの植物の発生はＥ
ｖａｎｓ ｅｔ ａｌ，，”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ，”Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ １：１２４−１７６（ＭａｃＭｉｌｌａｎＰ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８
３）；Ｍ．Ｒ．Ｄａｖｅｙ，”Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａ
ｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ
Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，
（１９８３）−Ｌｅｃｔｕｒｅ−Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ，ｐｐ．１２−２９，（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂａ
ｓａｌ １９８３）；Ｐ．Ｊ．Ｄａｌｅ，”Ｐｒｏｔｏ
ｐｌａｓｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒ
ｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆＣｅｒｅａｌｓ ａｎｄ
Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ Ｃｒｏｐ
ｓ，”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ（１９８３）−Ｌｅｃｔ
ｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，ｐｐ．３１−４１，
（Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｅｓｅｌ １９８３）；及
びＨ．Ｂｉｎｄｉｎｇ，”Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ，”Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａ
ｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏ
ｃａ Ｒａｔｏｎ １９８５）に記載されている。
【０１０９】プロトプラストからの発生は植物の種の間
で異なるが、しかし一般には、外因性配列の複写物を含
む形質転換プロトプラストの懸濁物を最初に作り上げ
る。ある種においては、このプロトプラスト懸濁物か
ら、天然の胚と同様に成熟及び発芽段階迄の胚形成が引
き起こされうる。培地は一般に種々のアミノ酸並びにホ
ルモン、例えばオーキシン及びサイトカイニンを含む。
培地にグルタミン酸及びプロリンを加えることは、特に
トウモロコシ及びムラサキウマゴヤシのような種に好都
合でありうる。苗条と根は通常同時に発生する。発生効
率は、培地、ゲノムタイプ及び培養物の履歴に依存する
であろう。もしこのような変動がコントロールできるな
ら、発生は完全に再現性を有し、そして繰り返りが可能
となる。
【０１１０】発生は、カルス、外植片、器官又はその一
部からも行える。形質転換は、器官又は植物の部分発生
の状況に応じて行うことができる。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（前述）；更にＭｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１８；及び
Ｋｌｅｅ ｅｔ ａ１．，（１９８７）Ａｎｎｕａｌ
Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ，３８：４６７−４８６、を参照のこと。
【０１１１】栄養繁殖穀類において、この成熟トランス
ジェニック植物を、試験、例えば生産特性を試験するた
めの複数の同一植物を提供するために切除部分を採取す
るか、又は組織培養技術により繁殖せしめる。目的のト
ランスジェノートの選別が確立され、そして新規の種が
これにより得られ、更に商業スケールのために栄養繁殖
される。
【０１１２】種子繁殖穀類においては、この成熟トラン
スジェニック植物は同系交配植物を生産するために自己
交雑せしめる。この同系交配植物は新しく導入せしめた
異種遺伝子活性レベルのための遺伝子を含む種子を生産
する。これらの種子は成長して、選択された表現型を提
供しうる植物を生産する。
【０１１３】本発明に関する同系交配は新規のハイブリ
ドを作り上げるために用いられうる。この方法におい
て、ハイブリドを生産するために同系交配系を他の同系
交配系と交雑させる。
【０１１４】再生植物由来の器官、例えば花、種子、
葉、枝、果実等は本発明に包含でき、形質転換された細
胞を含んで成るこれらの器官が提供できる。導入ＤＮＡ
配列を含んで成る器官の付与された再生植物の子孫及び
変異種、並びに突然変異種も本発明の範囲に含まれる。
再生植物の子孫及び変異種、並びに突然変異種も本発明
の範囲に含まれる。
【０１１５】（ベクター）適当なベクターの選別は比較
的簡単であり、その制限は少ない。明らかなるベクター
の小さな特徴は、目的の核酸配列が比較的完全な状態に
おいて導入されることにある。それ故、導入ＤＮＡ配列
を有する植物を提供しうる任意のベクターで十分であろ
う。更に、安定的に保存されるＤＮＡ配列へと最終的に
転換されることができる実質的に完全なＲＮＡを導入す
る任意のベクターが有用であろう。
【０１１６】むき出しのＤＮＡ片でさえも本発明の特性
を授けるものと予想できうるが、しかしその効率は低い
であろう。ベクターを用いるべきか、又はどのベクター
を用いるべきかの判断は選択した形質転換の方法により
決まるであろう。
【０１１７】もしむき出しの核酸の導入方法を選択した
のなら、ベクターの必要性は、更なる他の配列を必要と
せずに目的の特徴を授けるのに十分な最小の核酸配列の
みである。それ故、有用なベクターには、Ｔｉプラスミ
ドベクター、多量の複写物を最大に生産するために単に
デザインされたシャトルベクター、形質転換が行われた
後の最後の複製のために必要な最小の配列を含むエピソ
ーマルベクター、トランスポゾンベクター、同型組換ベ
クター、ミニクロモソームベクター及びウィルスベクタ
ーが含まれる（遺伝子配列のＲＮＡ型の可能性を含
む）。ベクター及びそれらを組立てるための方法の選択
は通常の当業者に一般に知られ、そして一般的な技術文
献に記載されている（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ（前述））。
【０１１８】ところで、任意の更なる、導入すべき核酸
フラグメントの分解のために耐性力を授けるであろう結
合したベクター配列であって、ゲノムの一体化の工程を
補助せしめるか、又は事実上形質転換された細胞又は植
物について容易に選別する手段を提供するものは、好都
合であり、且つ有用なトランスジェノートの選択の困難
さを少なくする。
【０１１９】（選別）更なる研究のためのトランスジェ
ノートの選別は一般に、目視試験、例えば色調変化（例
えば白色花、種々の色素生産、及び花における一様な色
彩又は不規則な色彩）に基づくが、しかし酵素活性又は
生成物の定量のいづれかの生化学的試験も包含しうる。
トランスジェノートは目的の植物器官を発生せしめる植
物のへと生長し、そしてその遺伝子活性は、例えば目視
により見られるか（フラボノイド遺伝について）、又は
生化学的試験（ノーザンブロット（以降のＭａｎｉａｔ
ｉｓ参照）；ウェスタンブロット（以降のＡｕｓｕｂｅ
ｌ参照）；分光学を含む酵素活性及びフラボノイド化合
物試験；Ｈａｒｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｄ
ｓ．），（１９７５）Ｔｈｅ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，
Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ２，［Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ］に
より検定されうる。
【０１２０】以降の実験の節は例示であって限定ではな
い。
【０１２１】
【実施例】（実験）一般にプラスミドＤＮＡの調製、酵
素分解の制限、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、サザ
ンブロット、ＤＮＡリゲーション及び細菌形質転換は標
準の方法を用いて行われる（Ｍａｎｔａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９
８２）；本明細書にて「マニアティス」と称し、参考文
献として組入れている）。ウェスタンブロット及びその
他の標準分子生物学技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔａ
ｌ．，（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏ
ｌｓ．１及び２にも記載され、本明細書に参考文献とし
て組入れている。
【０１２２】（実施例１：植物形質転換方法）実施例１
〜４における試薬材料は特に記載のない限り商業的に入
手できる。クローン化処理において用いられる酵素は商
業手段から入手できる。全ての制限エンドヌクレアーゼ
反応は仕様書に従って実施した。特に記載のない限り、
その他の反応のための反応条件は当業界において利用さ
れる、前述の例えばマニアティスに記載の標準条件であ
る。ルリア（Ｌ）アガー及びミニマルＡ（Ｍｉｎ Ａ）
アガー並びに培地は、Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７２）（本明
細書にて「ミラー」と称し、参考文献として組入れてい
る）に記載されている。感応エスシェリヒア コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）株ＤＨ−１の形質転
換は、マニアティスに従って行われる。プラスミドＤＮ
Ａはマニアティスに従うアルカリ抽出により調製される
（本明細書では「ミニ−プレプＤＮＡ」又は「ミニ−プ
レプ技術」と称する。位置特異性突然変異誘発は、Ｇｅ
ｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５：（８），７８６−７９１
に記載の通りに実施されるが、ただしＥ．コリ株ＢＷ３
１３（ｄｕｔ，ｕｎｇ）をウラシル含有一本鎖ＤＮＡの
製造のために用い、インビトロで合成した二本鎖ＤＮＡ
をＥ．コリ株ＤＨ−１に形質転換せしめ、そしてＤＮＡ
ポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメン
トを室温で一夜インキュベートする第２の鎖合成のため
に用いた。
【０１２３】抗生物質は以下の通りに略した；Ａｐはア
ンピリシリン、Ｋｍはカナマイシン、Ｒｉｆはリフアン
ピシリン、そしてＴｃはテトラサイクリンである。微生
物は本明細書ではμｇとして表わし、ミリリッターはｍ
ｌで表わした。マイクロリッターはμｌとして表わし
た。
【０１２４】（アグロバクタートウメファシエンＬＢＡ
４４０４／ｐ５９７２及びｐ７５０６）プラスミドｐｃ
ＰＥＩはＨ．Ｒｅｉｆ，Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔ，Ｋｏｌｎより入手した。このプラスミドは
全長に近いペチュニア ハイブリダカルコンシンターゼ
ｃＤＮＡクローンをＥｃｏＲＩフラグメントとして含
む。（カルコンシンターゼ遺伝子の配列については、Ｎ
ｉｅｓｂａｃｈ−Ｋｌｏｓｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９
８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ２６：２１３−
２２５（本明細書に参考文献として組入れている）を参
照のこと）。このカルコンシンターゼ遺伝子の目的植物
への再導入及び表現のために用いるバイナリーベクター
ｐ５９７２及びｐ７５０６の構造へと導く構成方法は図
１に示す。この方法において示すプラスミドは、組立工
程又は試験における検査におけるいづれかに利用した関
連する制御部位でのみ標識している。図中の環の中央の
プラスミド番号は、組立方法におけるプラスミドに与え
られる実用状の番号表示である。環の下部にあるプラス
ミド番号は関連するクローンを発生せしめるクローニン
グベクターに関する。例えばこの方法において最初に挙
げられているプラスミドはｐｃＰＥＩである。このクロ
ーンはＥｃｏＲＩフラグメントの商業的に入手できるク
ローニングベクターｐＵＣ１８へのリゲーションにより
得られ、従ってｐｃＰＥＩを環の中央に記載し、そして
ｐＵＣ１８を下部に記載する。描かれた環の横に記載す
る制限酵素は、このプラスミドを切るために用いた酵素
を示し、そして矢印はリゲーション反応が行われた位置
を示す。クローンの選別のための抗生物質耐性遺伝子を
環の内側に示した。
【０１２５】カルコンシンターゼタンパク質について完
全にコード化する配列を含むＥｃｏＲＩフラグメント
を、プラスミドｐＵＣ１１９のＥｃｏＲＩ部位に、両方
のプラスミドをＥｃｏＲＩにより切断せしめ、リゲーシ
ョンせしめ、そして感応Ｅ．コリ株ＤＨ−１へと形質転
換せしめることで再クローン化せしめた（Ｖｉｅｒａｎ
ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３（２）ｅｄｓ．Ｗｕ
ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ｐ
ｐ．３−１１，１９８７）。ｐＵＣ１１９及びＥｃｏＲ
Ｉカルコンシンターゼフラグメントを含むプラスミドを
制限地図化により同定し、プラスミドｐ６０１０で示
す。プラスミドｐ６０１０を感応Ｅ．コリ株ＢＷ３１３
に形質転換せしめ、そしてウラシルを含む一本鎖ＤＮＡ
が単離された（Ｖｉｅｒａ及びＭｅｓｓｉｎｇ（同
上））。５’−ＣＴＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＣＣＡ
ＴＧＧＴＧＣＴ−３’の配列より構成される２６塩基合
成プライマー及び５’ＣＴＡＣＴＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣ
ＧＧＣＴＴＡＴＡＴ−３’の配列により構成される２４
塩基合成プライマーを、アプライドバイオシステム（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８１Ａ ＤＮ
Ａ合成装置において、固相ホスホトリエステル方法を用
いて合成した、この２６塩基プライマーは新規の制限部
位、ＨｐａＩ及びＮｃｏＩをコード化配列の先端に導入
するために用いた。このＮｃｏＩ部位はカルコンシンタ
ーゼのＡＴＧ開始コドンと重なり、そして組立方法にお
ける後の方でのプロモーター融合のために用いる。この
２４塩基プライマーは、ＴＡＧ翻訳停止コドンと重なる
ＢａｍＨＩ部位を導入するために用いられ、そして組立
方法における後の方で、カルコンシンターゼ遺伝子をポ
リアデニル化シグナル配列と融合せしめるために利用さ
れうる。インビトロで合成された二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤ
ＮＡ）はこの二つのプライマーを用いて合成し、そして
感応Ｅ．コリ株ＤＨ−１へと形質転換せしめた。遺伝子
の開始部に位置する新しいＨｐａＩ及びＮｃｏＩ制限部
位、並びに遺伝子の終点に位置するＢａｍＨＩ部位のた
めに、ミニ−プレプＤＮＡを利用してアンピシリン耐コ
ロニーをスクリーンした。このプラスミドはこのことを
満足し、そしてプラスミドｐ５５７１により更なる地図
評価を示す。
【０１２６】組立方法における次の段階は、３５Ｓカリ
フラワーモザイクウィルス（本明細書のテキストにおい
てはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと称し、図中ではｐ３
５Ｓと記載する）をカルコンシンターゼコード化配列の
開始部に融合せしめ、そしてポリアデニル化シグナル配
列をこのコード化配列の末端に融合せしめることを提供
する。プラスミドｐＪＪ２１０４配列は、本明細書に参
考文献として組入れている、Ｈａｒｐｓｔｅｒ ｅｔ
ａ１．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２
１２：１８２−１９０に記載され、そしてこれをＣａＭ
Ｖ３５Ｓプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列
の原料として用いた。このプラスミドはＢｇｌＩＩとＮ
ｃｏＩフラグメントとの間に含まれる修飾されたＣａＭ
Ｖ３５Ｓを有す。プラスミドｐＪＪ２２１０４における
このＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを光合成２２Ｌクロロ
フィルａ／ｂ結合タンパク質（本明細書では「Ｃａｂ２
２Ｌ」と称す）の非翻訳誘導配列と融合せしめ、転写効
率を増大せしめた（前述の文献を参照のこと）。このポ
リアデニル化シグナル配列はノパリン合成遺伝子（Ｄｅ
ｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｍｏｌ．Ａ
ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１（６）：５６１−５７３）由来
であり、そしてプラスミドｐＪＪ２１０４におけるＢａ
ｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩの間に含まれている。プラスミ
ドｐ５５７１ＤＮＡを単離し、そして完成のためにＢａ
ｍＨＩで切断せしめ、その後、部分的に不完全なＤＮＡ
切断を提供する条件（なぜなら第２のＮｃｏＩ部位がカ
ルコンシンターゼコード化配列において存在するから）
のもとでＮｃｏＩで切断せしめた。このＤＮＡを、標準
的なトリス−酢酸ＥＤＴＡ緩衝液における０．５％の低
融点アガロース中での０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロマイドがこのアガロースに一体化された電気泳動（マ
ニアティスに記載）にかけた。このゲルを直ちに、中程
度の波長の紫外線により、トランスイルミネーターを用
いて検査し（波長３１２ｎｍ）、そしてカルコンシンタ
ーゼコード化配列に相当するバンド（約１２００塩基
対）をこのゲルから切り出した。このゲル断片を容量を
測定するために秤量し、そして０．３Ｍの酢酸ナトリウ
ムに浸した。この平衡化したアガロースを６５℃で１０
分間加熱せしめ、その後０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８で飽和の、当量のフェノールで抽出せしめた。水性
相を除去し、そしてクロロホルム−イソアミルアルコー
ル（２４：１）混合物で２回抽出を行い、そしてＤＮＡ
をこの水性溶液から沈殿せしめた。（これら全ての技術
はマニアティスに記載の標準条件に従って利用した。）
この抽出フラグメントを、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで補完
するために切断せしめたプラスミドｐＪＪ２１０４と混
合せしめ、そしてリゲーション反応を行い、室温で１時
間インキュベートせしめ、そして反応生成物をその後感
応Ｅ．コリ株ＤＨ−１の中に形質転換せしめた。３５Ｓ
ＣａＭＶプロモーター、カルコンシンターゼコード化配
列、及びポリアデニル化配列を含む適切なプラスミドを
同定するために、このプラスミドを制限酵素によりスク
リーンした。このプラスミドｐ５６３４を同定し、そし
て制限分解にかけることでこのプラスミドが目的のもの
であることが確認された。
【０１２７】二つの異なるバイナリーベクターをこの組
立方法に用いた。プラスミドｐＪＪ３９４２及びｐＡＧ
Ｓ５０２は共にブロードホストレンジ（ｂｒｏａｄ ｈ
ｏｓｔ ｒａｎｇｅ）クローニングベクターｐＲＫ２９
０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：７３４
７−７４５１）に基づき、そしてＴＤＮＡ範囲の左側と
右側の間にて、ノパリンシンターゼプロモーターの５’
末端と、そしてオクトパインシンターゼポリアデニル化
シグナル配列の３’末端とで融合したネオマイシンホス
ホトランスフェラーゼＩＩコード化配列を含む（Ｖａｎ
ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４１−１５
４）。プラスミドｐＡＧＳ５０２は、ＴＤＮＡの右側ボ
ーダーの近くでのフラグメントの挿入のため、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩ
及びＨｐａＩに対するクローニング部位を有するポリリ
ンカーを含む。プラスミドｐＪＪ３９４２はボーダーの
右側付近に、独特のクローニング部位としてのＨｉｎｄ
ＩＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＨｐａＩを含む。３５ＳＣａＭ
Ｖプロモーターからのエンハンサ一様配列はＢａｍＨＩ
とＨｐａＩ部位の間に含まれる。このフラグメントは３
５ＳＣａＭＶプロモーターの−４５から−２００の位置
の間の配列に広がり、これによりＴＡＴＡＡボックスか
らおよそ２００塩基対上流の配列が得られる。
【０１２８】３５ＳＣａＭＶプロモーター全体、カルコ
ンシンターゼコード化配列及びｎｏｓポリアデニル化シ
グナル配列はプラスミドｐ５６３４におけるＢｇｌＩＩ
とＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの間に含まれる。プラス
ミドｐ５６３４を補完のため、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで切断せしめた。二つの異なるバイナリーベクタ
ー、ｐＪＪ３９４２及びｐＡＧＳ５０２を補完のため、
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてそれぞれ
をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩにより切断せしめたプラ
スミドｐ５６３４との別々のリゲーション反応において
用いた。酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩにより作り出さ
れた５’−突き出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）は互いに結合
し合うことができるが、いづれの酵素によっても再分解
されない。このリゲーション反応物を感応Ｅ．コリ株Ｄ
Ｈ−１に形質転換せしめ、そしてテトラサイクリン耐性
コロニーを単離した。ＤＮＡをミニプレプ技術を利用し
て単離し、そしてＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントを受け入れたｐＪＪ３９４２及びｐＡＧＳ５０２
誘導プラスミドを単離するために適当な制限酵素により
スクリーンした。更なる制限分解を、得られるプラスミ
ドの同定の確認のために行った。この挿入物を含むｐＪ
Ｊ３９４２のリゲーション生成物をプラスミドｐ５９７
２として示し、そしてこの挿入物を含むｐＡＧＳ５０２
のリゲーション生成物をプラスミドｐ７５０６と命名し
た。
【０１２９】プラスミドｐ５９７２及びｐ７５０６を別
々に、アグロバクター トウメファシエン株ＬＢＡ４４
０４に移し入れた（Ｏｏｍｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
１）Ｇｅｎｅ １４：３３−５０）。ｐ５９７２又はｐ
７４１５０６（両方ともテトラサイクリン耐性）を有す
るＥ．コリ株ＤＨ１、プラスミドｐＲＫ２０１３（カナ
マイシン耐性）を有するＥ．コリＨＢ１０１（Ｄｉｔｔ
ａ ｅｔ ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：７３４７−７３
５１）、及びＡ．トウメファシエン株ＬＢＡ４４０４
（リフアンピシリン耐性）を用いる、三母細胞交配工程
を行った。この二つのＥ．コリ株は適当な抗生物質を含
むＬアガー（ミラー参照）において一夜成育せしめた。
Ａ．トウメファシエンは選択なしのＭｉｎＡ培地（ミラ
ー参照）において一夜成育せしめた。１ｍｌのＡ．トウ
メファシエン培養物を滅菌マイクロ遠沈管に移し入れ、
そしてマイクロ遠心機にて２分間遠心せしめ、細胞をペ
レット化せしめた。この上清液を除去し、そして１００
μｌの新鮮なＭｉｎＡ培地を、このペレットを再懸濁せ
しめるために加えた。各一夜培養物からのＥ．コリ細胞
を少量、ペトリ皿に滴下し、そして両者を共に新鮮なＬ
アガープレート（抗生物質を含まない）上に散布せしめ
た。これらの細胞に覆われる面積はおよそ２ｃｍ平方で
あった。培養物１ｍｌから集められる各Ｅ．コリ細胞の
量はＡ．トウメファシエン細胞の量とほぼ同じであっ
た。懸濁したＡ．トウメファシエン細胞１００μｌを散
布したＥ．コリ細胞の上に加え、そして混合して複合バ
ッチ（ｐａｔｃｈ）を形成せしめた。このペトリ皿を室
温で一夜インキュベートした。
【０１３０】翌日、複合パッチから約１／４の細胞を取
り出し、そしてこれらの細胞を１００μｇ／ｍｌのリフ
アンピシリン及び１．２μｇ／ｍｌのテトラサイクリン
を含むＬアガープレートを用い、単一のコロニーについ
て画線培養せしめた。この工程を４回繰り返し、そして
４つの別々のプレート上に画線培養された複合パッチの
全てをもたらした。これらのプレートを、コロニーが出
現する迄室温で暗室にてインキュベートした（およそ３
〜５日）。単離したコロニーを１．２μｇ／ｍｌのテト
ラサイクリンを含むＭｉｎＡアガープレート上におい
て、単一コロニーのために画線培養せしめた。このプレ
ートを２８℃で２日間インキュベートした。１．２μｇ
／ｍ１のテトラサイクリンの添加されたＭｉｎＡアガー
を含むペトリ皿を、８当分し、そして８つによく単離さ
れたコロニーをペトリ皿の区分にそれぞれ画線培養せし
めた。このプレートを２８℃で一夜成育せめした。各８
つの区分から３／４の細胞をこのアガーから滅菌つまよ
うじを用いて採取し、そしてミニ−プレプ技術を利用し
てこれらの細胞からＤＮＡを単離した。これら８つの調
製物からの各ＤＮＡをそれぞれ感応Ｅ．コリ株ＤＨ−１
に形質転換せしめ、そしてテトラサイクリン耐性コロニ
ーが単離された。各Ｅ．コリ形質転換体由来の１コロニ
ーを生育せしめ、そしてこのＤＮＡをミ二−プレプ技術
を利用して単離した。このＤＮＡを制限酵素分析にか
け、このＤＮＡが、三母細胞交配を介してＡ．トウメフ
ァシエンＬＢＡ４４０４に移し入れられたオリジナルの
バイナリークローンであるかを確認した。
【０１３１】（植物形質転換）ペチュニアハイブリダ
種：ピンクカスケード（Ｐｉｎｋ Ｃａｓｃａｄｅ）を
Ｄｒ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｅｉｄ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｅ
ｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄ
ａｖｉｓ、より入手し、そしてＲ１８及びＶ２６をＤ
ｒ，ＡｎｔｏｎＧｅｒａｔｓ，Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ，Ｆｒｅｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｍｓ
ｔｅｒｄａｍから入手した。ペチュニアハイブリダ植物
を表面除菌種子から、０．５％のスクロースの添加した
ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）の培地ＭＳの１／１０
の濃度の滅菌固形アガー上で成育せしめた。発芽後、実
生の頂点部を胚軸領域において切除することにより切り
取り、そして３％のスクロースを有するＭＳに移し入れ
た。植物を、４−５０００ルックスの「クールホワイ
ト」蛍光（１６時間／日）のもとで２８℃に保った。
【０１３２】植え付け（０日）てから約６週間後、葉を
切除し、約５ｍｍ平方の断片へとスカルペル刃（ｓｃａ
ｌｐｅｌ ｂｒａｄｅ）により切断し、そして０．２％
のグルコースの添加せしめたＭｉｎＡ培地（Ｊ．Ｈ．Ｍ
ｉｌｌｅｒ（１９７２）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋに記載の培地）中で一夜成育させそして
０．１−０．２Ａ550ユニットに調整したＡ．トウメフ
ァシエンにより感染せしめた。感染した葉断片をインキ
ュベーション培地〔基礎ＭＳ培地（ＭＳ＋３％のスクロ
ース＋ビタミンＢ５）＋７５〜１００μＭアセトシリン
ゴン、１リットルあたり１ｍｇのベンジルアデニン（Ｂ
Ａ）及び０．２ｍｇ／ｌのインドール酢酸（ＩＡＡ）〕
に、２日間、無菌トランスファーフッドにおいて室温
（約２２℃）で浸した。２日目、液状基礎ＭＳ培地＋セ
フォタキシム（５００ｍｇ／ｌ）２５〜３０ｍｌをこの
プレートに加えた。このプレートを７０−１００ｒｐｍ
で３０−６０分間かき混ぜた。葉断片は、選択培地（基
礎ＭＳ培地＋ＢＡ（１ｍｇ／ｌ）、ＩＡＡ０．２ｍｇ／
ｌ、バンコマイシン（１００ｍｇ／ｌ））上に浮き出た
上方の表皮と共に移した。このプレートをパラフィルム
で封入し、そして２４℃で温和な光（３０００−５００
０ルックス）のもとでインキュベートせしめた。１４日
目、葉断片を新鮮な選択培地に移した。２８日目、カリ
（ｃａｌｌｉ）を葉断片から切除し、そして新鮮な選択
培地に移し入れ、更に苗条を切除し、そして無ホルモン
培地〔基礎ＭＳ＋バンコマイシン（１００ｍｇ／ｌ）及
びカナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）〕に移し入れた。４
２日目及びそれ以降、苗条をカリから切除し、そして無
ホルモン培地に移し入れた。苗条の伸長後、苗条を切除
し、そして根の発生のためにナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
（０．１ｍｇ／ｌ）に浸した。根が発生した後、苗木を
土の中に植え込み、そしてグリーンハウス内で生育せし
めた。
【０１３３】ｐ５９７２及びｐ７５０６におけるこのキ
メラＣＨＳ遺伝子を複数の種のペチュニアに導入せしめ
た：（１）「ピンクカスケード」と称する雑種、（２）
同系交配株Ｒ１８及び（３）同系交配株Ｖ２６（実施例
２−４参照のこと）。
【０１３４】（実施例２：新規のピンクカスケードペチ
ュニア誘導体）ピンクカスケートは単色のピンク色の花
を発生する。ピンクカスケード種からの葉の外植片をｐ
５９７２により形質転換せしめた。６つの完全な植物
（ＣＳ１８２０１から１８２０６）が生産された。ＣＳ
１８２０１，１８２０３及び１８２０６は純白色の花
弁、花弁管及び花弁葯を提供する。ＣＳ１８２０２及び
１８２０５は花に色彩を提供せしめた：花弁の外縁又は
その中心にピンクのくさび形、そして花の残り部分に純
白色を提供する（この植物上のある花は単一の純白色で
あり、そしてその他の花はこの色彩を有す）。ＣＳ１８
２０４花は薄い、しみ状のピンク色であった。
【０１３５】Ｖ２６×ＣＳ１８２０２交配の子孫には、
Ｖ２６×ピンクカスケードの色を有する１２の植物及び
ＣＳ１８２０２のパターンと類似する新規の色彩を有す
る６の植物が含まれるが、一部の子孫においては低部の
花弁の方が高部の花弁よりも少ない色付けられた領域を
有していた。そえ故、この導入遺伝子による新規の色彩
の生産は遺伝性であるが、しかしそのパターン自身は子
孫の中で変化しうる（なぜなら、ピンクカスケードは雑
種であり、この子孫は遺伝的に異種であるからであ
る）。
【０１３６】(実施例３：ｐ５９７２により形質転換さ
れたＲ１８種の新規の誘導体）Ｒ１８種は単色の薄いピ
ンク色の花を発生する。Ｒ１８種からの細胞をｐ５９７
２により形質転換せしめ、１４種類の植物を生産した。
９つの植物はＲ１８花の通常の薄いピンク色の花を発生
せしめた。５つの植物は新規のパターンを有していた。
１つの植物は単色の白地にピンク色の放射状のストライ
プを示した。他の植物は主に純白色の花を示したが、１
つの花はＣＳ１８２０２上のくさび形と類似のいくつか
のピンク色のくさび形を有していた。３つ目は時折、花
弁の接点に単色のピンク地に白色のくさび形を示してい
た。４つ目は純白色の花と放射状の筋（星状のパター
ン）を有するピンク色の花の混合を示した。最後は、花
弁の外縁にピンク色のくさび形を有する白色の花を示し
た。
【０１３７】（実施例４：ｐ５９７２及びｐ７５０６に
より形質転換せしめたＶ２６種の新規の誘導体）種Ｖ２
６は単色の深い紫色の花を発生する。Ｖ２６種からの細
胞をｐ５９７２により形質転換せしめ、３７の植物が生
産された。２８の植物はＶ２６親株と同じ色の花を発生
せしめた。７の植物は新規のパターンの花を有し、２つ
の植物は純白色の花を発生せしめた。３つの植物はＣＳ
１８２０２と類似の花弁の縁にある色付いたくさび形を
有していた。１つはほとんど純白色の花であるが、しか
しいくつかの花が単一の、小さな（３ｍｍ）白色の斑点
を有していた。１つは美しい「コサックダンサー」パタ
ーン、即ち、改質された放射状の、星状パターンを示し
た。２つの植物は幾分不規則的な、白色及び紫色パッチ
のしみ状のパターンを示した；これらの花は不規則であ
るにもかかわらず、幾分ダンサーパターンに似ていた。
【０１３８】Ｖ２６種からの細胞をｐ７５０６により形
質転換せしめ、２０の植物が得られた。１７の植物はＶ
２６親株と同じ色の花を提供した。３つの植物は色彩を
有する花を提供した。１つの植物は時折小さな白色斑点
を有する花を提供した。１つの植物は、白色の管を有す
る花１つと、他のＶ２６親株と同等の花を提供した。１
つの植物はほとんど無秩序に分散した、しかしながらく
っきり描かれたしみを示す花を有していた。
【０１３９】白色又は色彩化された花を有する複数のト
ランスジェノートをＶ２６と交配せしめた。白色トラン
スジェノートの子孫は、紫及び白色の花をおよそ１：１
の割合で発生せしめ、これは単一遺伝子によるものと予
想さる。色彩花を有する植物の子孫も色彩化されている
か、又は時折純白色であった。全ての植物は花の色調の
強度又はパターンにおいて同一ではなかった。花の色の
表現型の浸透度はあるトランジェノートの子孫集団にお
いては完全であり、そしてその他においては不完全、即
ち、単紫色の色彩化又は単白色に対する分離の割合は明
らかに１より大きかった（不完全浸透度）。
【０１４０】（ペチュニアハイブリダトランスジェニッ
ク植物の分析）ＲＮＡ分析：野性型植物（即ち、内在性
カルコンシンターゼ遺伝子を有するもの）及びトランス
ジェニック植物（即ち、導入された３５ＳＣａＭＶ作用
カルコンシンターゼ遺伝子を有するもの）の両者由来
の、安定状態レベルのメッセンジャーＲＮＡを、ＲＮａ
ｓｅ保護分析を利用してペチュニア花弁において分析し
た（プロトコールの表題はＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔｉｏｎ，（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，１１０９９ Ｎｏ
ｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ より入手可能）。
【０１４１】６つの異なる発生段階の花弁を最初にＶ２
６ペチュニア植物、そして白色の花を有する１つのトラ
ンスジェニックＶ２６（植物＃２１８３８）から採取し
た。これらの段階は花弁の全長、色付けの程度及び形態
学により定義した。
【０１４２】 段階 長さ 色付け及び形態 １ １５ｍｍ 色付けなし（葉脈のみ） ２ ３０ 葉脈の周辺にわずかな薄紫色の発生 ３ ４０ 表面からの一定の色付け ４ ５３ 深い色付け、完全なる伸長、未開花 ５ ５８ 完全なる色付け、開花の開始 ６ 未測定 新鮮に成熟、完全に開花 野性型Ｖ２６及びトランスジェニック植物＃２１８３８
の両者についてのＲＮＡを、前述の発生段階から単離し
た。段階１を除き、各段階は花１輪でＲＮＡを抽出せし
めるのに十分な組織であった。段階１については、この
処理のために８から１０個の花を混合せしめた。花弁組
織を液体窒素中で凍結せしめ、そして液体窒素中であら
かじめ冷却したすりばち及び乳棒を用いて微細粉へと粉
砕せしめた。この組織を０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７．５及び４ｍｌの緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、
１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤ
ＴＡ、１％のＳＤＳ）で飽和となった１ｍｌのフェノー
ルに加え、そしてこの内容物を混合した。クロロホル
ム：イソアミルアルコール混合物（２４：１）１ｍｌを
加え、そして再度この内容物を混合した。この水性相を
清浄なチューブに移し、そして新鮮なクロロホルム：イ
ソアミルアルコール混合物で２回抽出した。この水性相
を清浄なチューブに移し、等容量の４Ｍのリチウムアセ
テートを加え、そしてこのチューブの内容物を氷の上で
３時間置いた。ＲＮＡを遠心によりペレット化し、そし
て上清液を除去せしめた。このペレットを滅菌水に溶解
し、この溶液を０．３Ｍの酢酸ナトリウムに入れ、そし
てＲＮＡを沈殿せしめるために２．５容量のエタノール
を加えた。このＲＮＡペレットを滅菌水１００μｌに溶
解し、そしてＲＮＡの濃度を分光光度計により測定し
た。
【０１４３】ＲＮＡ５μｇを各タンパク質アッセイのた
めに用いた。１６０ヌクレオチド、放射線標識アンチセ
ンスｃａｂ２２Ｌ−ＣＨＳ ＲＮＡをインビトロで複写
し、保護アッセイにおけるプローブとして用い、そして
花弁ＲＮＡへとアニール化せしめた（全てはＳｔｒａｔ
ａｇｅｎｅプロトコールに記載されている）。一本鎖特
異性リボヌクレアーゼＲＮａｓｅＡ及びＲＮａｓｅＴ１
とのインキュベーション後、２つの異なる保護フラグメ
ント内因性ＣＨＳｍＲＮＡを表わす９４ヌクレオチドフ
ラグメント及び導入カルコンシンターゼ転写物を表わす
１６０ヌクレオチドフラグメントが残るであろう。
【０１４４】野性型Ｖ２６ペチュニア花弁ＲＮＡｓの６
段階全てのためのＲＮａｓｅ保護アッセイのオートラジ
オグラムは、カルコンシンターゼ保護フラグメントが段
階３及び段階４において最も豊富であることを示した。
この実験から、内因性ＣＨＳｍＲＮＡは試験された花弁
の全ての発生段階において存在し、段階４迄徐々に増大
して豊富となり、その後成熟花弁においてほとんど検出
不能なレベルまで下がることがわかった。
【０１４５】トランスジェニック植物＃２１８３８にお
けるＲＮＡ保護アッセイは、内因性及び導入カルコンシ
ンターゼの両者のための保護フラグメントが存在するこ
とを示した。この内因性カルコンシンターゼメッセージ
の相対レベルは野性型植物に見られるものと類似の発生
プロフィールに続くが、しかしながら、全体的なメッセ
ージレベルは目視検査により見られる通り、野性型Ｖ２
６植物において見られるレベルからの各段階において，
実質的に下がっている。野性型カルコンシンターゼメッ
セージに比べ、導入３５ＳＣａＭＶプロモーター由来の
このカルコンシンターゼ情報は各発生時点にわたりやや
一定の低いレベルで存在する。この結果は、導入ＣＨＳ
遺伝子が内因性ＣＨＳｍＲＮＡの安定的な状態のレベル
を大きく抑えることを示す。
【０１４６】（タンパク質分析）ウサギに、Ｅ．コリに
おいて生産された融合タンパク質を注射せめしることに
より、カルコンシンターゼに対する抗体がウサギにおい
て生成された。この融合タンパク質は、ベーターガラク
トシダーゼの３’末端フレームに結合した、カルコンシ
ンターゼのコード化配列全体を有する野性型ベーターガ
ラクトシダーゼ遺伝子より成る（Ｒｕｔｈｅｒ ａｎｄ
Ｍuｌｌｅｒ−Ｈｉ１１（１９８３）ＥＭＢＯＪ．
２：（１０）：１７９１−１７９４）。このウサギから
の免疫抗血清を野性型及び形質転換ペチュニア花弁の評
価のためのウェスタン分析に用いた。ウェスタン分析
は、プロメガバイオテク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃ）からのプロトブロットシステムを用いる製造者の仕
様に従って行ったが、尚、類似の技術はＡｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ ａｌ．，（前記）にも記載されている。
【０１４７】タンパク質抽出物を紫及び白色のセグリガ
ント（前述）から調製した。前述と同じ発生段階を利用
した。花弁組織を液体窒素中で凍結せしめ、その後乳ば
ち及び乳棒を用いて微細粉へと粉砕せしめた。この凍結
粉をガラス製組織ホモジナイザーに移し、そしてこの組
織のホモジナイズのために抽出緩衝液（５０ｍＭのリン
酸緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭのジチオスレオトール、
０．１％のトリトンＸ−１００、１ｍＭのＥＤＴＡ）を
利用した。最終濃度１ｍＭのフェニルメチルスルホニル
フルオライド及び０．２ｍＭのロイペプチンのプロテア
ーゼインヒビターを加えた。細胞断片を遠心により除去
し、そして上清液のタンパク質含有量をブラッドフォー
ドアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）を用いて決定
した。各サンプルにつき１７μｇのタンパク質を８％の
ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上に添加した。
【０１４８】紫色花の子孫のウェスタン分析はＣＨＳタ
ンパク質が全ての発生段階の花弁抽出物に存在すること
を示した。ＣＨＳタンパク質の量は段階１及び２におい
て同等、段階３において増加し、段階３，４及び５につ
いてはほとんど同等に保たれ、そして段階６で若干少な
くなった。白色子孫のウェスタン分析は、紫色花子孫に
比べ、段階１においてかろうじて検出できるＣＨＳタン
パク質が見られ、そして段階２，３，４，５及び６にお
いてより少なく現われた。この分析が示すには、紫色花
子孫からのタンパク質抽出物においてはＣＨＳタンパク
質は容易に検出できるが、白色花子孫のタンパク質抽出
物におけるＣＨＳタンパク質はかろうじて検出できる低
いレベルであったことである。
【０１４９】（フラボノイドのＴＬＣ分析）薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）を、＃２１８３８×Ｖ２６の交
配の子孫からの白色、対紫色花におけるフラボノイド合
成を比較せしめるために行った。ミッチェル（Ｍｉｔｃ
ｈｅｌｌ）ペチュニア花をアントシアニン合成の陰性コ
ントロールのためのもの、及びフラボノイド合成の陽性
コントロールのためのものとして用いた。３つの異なる
以下の花の長さのものを用いた：ミッチェル（３３ｍ
ｍ、４３ｍｍ、６５ｍｍ）紫（３３ｍｍ、４２ｍｍ、５
５ｍｍ）、及び白（３５ｍｍ、４９ｍｍ、５７ｍｍ）。
管状部をリンブと別けてアッセイした。組織を２ＮのＨ
Ｃｌ １ｍｌに入れ、室温で２時間放置せしめ、その後
１００℃で２０分間加水分解せしめた。上清液を清浄な
チューブに移し入れ、そしてイソアミルアルコール２０
０μｌを加えた。このサンプルを少なくとも５秒ほど攪
拌し、そして二相へと分離せしめた。サンプルをセルロ
ールＴＬＣプレート上に、４つの別々の適用においてス
ポットせしめた（各適用の間、乾燥せしめた）。同一の
二つのプレートを準備し、そして二つの異なる溶媒系に
おいて展開せしめた；酢酸／３６％ＨＣｌ／水（３０：
３：１０）及びイソプロパノール／２ＮのＨＣｌ（１：
１）。この二つの系はこれらのアントシアニンを区別せ
しめた。紫色の子孫の花はアントシアニンとフラボノー
ルの両者を示した。ミッチェル花はフラボノールを示し
たが、アントシアニンはわずかに、又は全っく示さなか
った。白色子孫花はアントシアニンをわずかに、又は全
っく示さず、そして通常の紫色花により示されるわずか
に、又は全っく示さないタイプのフラボノールを示し
た。
【０１５０】（実施例５：ゲノミックカルコンシンター
ゼ（ＣＨＳ））実施例５及び６における実験工程は本発
明の教示に従ってＶｒｉｊｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉ
ｔで行った（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ，Ｍｕｒ，Ｂｅ
ｌｄ，Ｍｏｌ ａｎｄ Ｓｔｕｉｔｊｅ，”Ｆｌａｖｏ
ｎｏｉｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒ
ｉｄａ：Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｍｉｔｅｄ
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｏｐｉｅｓ ｍａ
ｙ ｌｅｎｄ ｔｏａ ｃｏｌｌａｐｓｅ ｉｎ ｇｅ
ｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（更なる一定数の遺伝子複
写物は遺伝子表現型における崩壊をもたらしうる）巻
頁 （１９９０）を参照のこと）。表示しない限り、標
準的な方法はマニアティス及びＢｅｒｎａｒｄ Ｐｅｒ
ｂａｌ（１９８８）、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉ
ｄｅｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄＳｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
に見い出せるプロトコールに従って行った。
【０１５１】（Ａ．形質転換体の調製）ＶＩＰ７６及び
ＶＩＰ１０６はペチュニア ハイブリダＶ３０ＣＨＳ遺
伝子ＡゲノミッククローンＶＩＰ１７より、Ｋｏｅｓ
ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１４：５２２９−５２３９に記載に従って得られ
た。特に、ＶＩＰ７６は、ＣＨＳ遺伝子Ａを含むＶＩＰ
１７由来の７．２ｋｂＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグメン
トを０．８ｋｂ５’プロモーター領域で、バイナリーベ
クターＢＩＮ１９のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位にクロー
ニングすることにより構成される（Ｂｅｖａｎ ｅｔ
ａ１．，（１９８４）Ｎｕｃ１．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
２：８７１１−８７２１）。ＶＩＰ１０６はＣＨＳ遺伝
子Ａを含む、ＶＩＰ１７由来の８．０ｋｂＸｂａＩフラ
グメントを４．５ｋｂ５’プロモーター領域で、ＢＩＮ
１９のＸｂａＩ部位にクローニングすることで構成され
る。
【０１５２】ペチュニア ハイブリダＶＲ植物の形質転
換のために（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８６６−８
６９）、異なる遺伝子構造を有するこのバイナリーベク
ターを、標準的な三母細胞交配技術（Ｄｉｔｔａ ｅｔ
ａｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７７：７３４７−７３５
１）を利用してアグロバクタートウメファシエン株ＬＢ
Ａ４４０４へ転移せしめた。形質転換体は標準的なリー
フディスク（１ｅａｆ−ｄｉｓｃ）形質転換方法を介し
て得られる（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８
５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２７：１２２９−１２３１）。
形質転換ペチュニア ハイブリダＶＲ植物をグリーンハ
ウス内で成育せしめた。
【０１５３】（Ｂ．形質転換体の説明）ＶＩＰ７６はＣ
ＨＳＡ遺伝子の０．８ｋｂの５’プロモーター領域、
２．５ｋｂのＣＨＳＡ遺伝子エクソン及びイントロン配
列、並びに３．９ｋｂのＣＨＳＡ遺伝子３’側ＤＮＡを
含む。ＶＩＰ１０６はＣＨＳＡ遺伝子の４．６ｋｂの
５’プロモーター領域、２．５ｋｂのＣＨＳＡ遺伝子エ
クソン及びイントロン配列、並びに０．５ｋｂのＣＨＳ
Ａ遺伝子３’側ＤＮＡを含む。両ゲノミックＣＨＳクロ
ーンをペチュニアＶＲ植物に導入せしめた。ＶＩＰ１０
６を含む２０の再生植物のうち、１つの植物は花冠の均
一な低い色付けを示した。ＶＩＰ７６を含む１５の植物
の中の１つは小さな色付いたセクションを有する白色の
花を示した。
【０１５４】（Ｃ．メッセンジャーＲＮＡのデータ）Ｒ
ＮＡをつぼみ（Ｋｏｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２１３−２２６
により定義した段階１−６）から抽出した。つぼみの発
生段階における小さな相違を平均化せしめるため、各段
階につき１植物から採取した５つのつぼみをプールし
た。核酸の単離はＫｏｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１０：３７５−３８
５に記載に従って行った。
【０１５５】ＶＩＰ１０６及びＶＩＰ７６からの転写物
はペチュニア株Ｖ３０由来のＣＨＳ遺伝子Ａ配列を含
む。それらは、プライマー伸長実験により内因性ペチュ
ニアＶＲのＣＨＳ遺伝子Ａ転写物と区別できる。32Ｐ−
標識オリゴマーＥＬ−４（５’ｄＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡ
ＧＴＴＴＧＴＡＧＧ−３’）及び５μｇのフローラルＲ
ＮＡ（段階４）を用いたプライマー伸長実験は、このオ
リゴマー及びＲＮＡを１００ｍＭのトリスＨＣｌ、２０
ｍＭのＭｇＣｌ2及び１００ｍＭのＫＣ１ １０μｌ中
で１６時間、３０℃でアニール化することによって行っ
た。次いで逆転写酵素５Ｕを含む１ｍＭのｄＧＴＰ、１
ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、ｌｍＭのｄＣＴ
Ｐ、１０μｌを加え、そしてこの溶液を３０分間３７
℃、次いで３０分間４３℃でインキュベートせしめた。
伸長生成物はフェノールクロロホルム（１：１）抽出及
びエタノール沈殿により回収し、その後マーカーとして
の同じオリゴヌクレオチドにより認識化されるＨＳＡ遺
伝子Ａの配列ラダーを用い、６％シーケジングゲル上で
認別化せしめた。ＣＨＳ遺伝Ａの第１のエクソンとハイ
ブリダイズしたプライマーＥＬ−４の伸長は、Ｖ３０Ｃ
ＨＳ遺伝ＡｍＲＮＡについての１つの主要フラグメント
（１７６ヌクレオチド）、並びにＶＲＣＨＳ遺伝子Ａｍ
ＲＮＡについての２つの主要フラグメント及び１つの主
要でないフラグメント（それぞれ、１８６及び１８９ヌ
クレオチド、並びに１８１ヌクレオチド）によりもたら
される。ＶＩＰ１０６及びＶＩＰ７６を含む通常の色付
いた形質転換体は、色付いたフローラル組織において、
ＶＲＣＨＳｍＲＮＡの通常の表現型レベルを有す。花の
色付けが阻害されたＶＩＰ７８形質転換体７６−１Ａは
ＶＲＣＨＳｍＲＮＡの通営レベルよりも低く示された。
【０１５６】（実施例６：ジヒドロフラボノールリダク
ターゼ（ＤＦＲ）） （Ａ．形質転換体の調製）ＶＩＰ１７８は、以下により
単離されたクローンラムダＤＦＲ−Ａ１からの１．３ｋ
ｂＥｃｏＲＩ ＤＦＲ ｃＤＮＡフラグメントを用いて
構成せしめた。ｖａｎ Ｔｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，
（１９８８）ＥＭＢＯＪ．７：１２５７−１２６３に記
載のラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ ライブラリーは、Ｙｏｕ
ｎｇ ａｎｄＤａｖｉｄ，（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：１１９
４−１１９８に従って調製した。ペチュニア ハイブリ
ダ系Ｒ２７のつぼみの花冠組織から調製したライブラリ
ー（Ｖａｎ Ｔｕｎｅｎｅｔａｌ．，（１９８８）ＥＭ
ＢＯＪ．７：１２５７−１２６３）をパリダ（Ｐａｌｌ
ｉｄｅ）遺伝子の１．４ｋｂ ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ
フラグメント（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８
５）ＥＭＢＯＪ．４：１６２５−１６３０）によりスク
リーンした。このプローブとハイブリダイズする１４の
クローンが精製された。これらの内の１３個はほぼ同じ
サイズ（１．５ｋｂ）のインサートを含み、一方、１ク
ローンは約１．６ｋｂのインサートを含んだ。両タイプ
のクローンの５’及び３’末端の配列分析が示すには、
小さいｃＤＮＡインサート（ラムダＤＦＲ−Ａ１）はほ
ぼ全長であり、一方、大きめのｃＤＮＡインサートは伸
長された３’領域及び短くなった５’末端を有すことで
あった。配列分析はクローン間の違いを示さなかった。
１４全てのクローンは同一のハイブリダイゼーション性
を示し、これらのクローンが同じ遺伝子の転写物を表わ
すことを示す。このＥｃｏＲＩ付着端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウフラグメント及びｄＮＴＰｓ用いるこ
とによって埋めた。このブラント末端フラグメントをＭ
１３ｍｐ７のＨｉｎｃＩＩ部位にクローン化せしめるこ
とで、その後ＢａｍＨＩフラグメントとして単離できる
ようにした。これを、ＣＨＳ配列の除去せしめたＶＩＰ
１０３のＢａｍＨＩ部位（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ
ｅｔ ａ１．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３３：８
６６−８６９）にクローン化せしめた。ＣａＭＶ３５−
Ｓプロモーターに対して有意な配向においてＢａｍＨＩ
ＤＦＲフラグメントを含むクローンをＶＩＰ１７８と称
した。
【０１５７】ペチュニア ハイブリダＶＲ植物の形質転
換のため、異なる遺伝子構造を有すバイナリーベクター
をアグロバクタートウメファシエン株ＬＢＡ４４０４
に、標準的な三母細胞交配技術（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：７３４７−７３５１）により
移し入れた。形質転換体はリーフディスク形質転換方法
（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔａ１．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２２７：１２２９−１２３１）により得られた。
形質転換ペチュニア ハイブリダＶＲ植物をグリーンハ
ウス内で成育せしめた。
【０１５８】（Ｂ．形質転換体の説明）ＶＩＰ１７８は
ＣａＭＶ３５−Ｓプロモーター、ペチュニアＲ２７ＤＦ
Ｒ遺伝子の全長ｃＤＮＡ複写物及びノパリンシンターゼ
３’尾部フラグメントを含む。再生した２５の植物のう
ち、１９の植物が非形質転換ペチュニアＶＲ植物のもの
と区別できない花の表現型を示した。しかしながら、６
の植物は、花の色付けにおける扇形又は環状模様におけ
る減少が示された。色付けの程度は同じ植物の異なる花
にわたって変化していた。例えば形質転換体１７８−１
６上の花は完全に色付けられた、又は白色の花冠のいづ
れかであった。
【０１５９】（Ｃ．メッセンジャーＲＮＡのデータ）Ｒ
ＮＡをつぼみ（Ｋｏｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８
９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：２１３−２
２６により定義する１−６段階）から抽出せしめた。こ
れらのつぼみの発生段階における小さな相異を平均化せ
しめるため、各段階につき１植物から５つのつぼみを採
取しプールした。核酸の単離はＫｏｅｓｅｔ ａｌ．，
（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３
７５−３８５に記載に従って行った。32Ｐ標識ＤＦＲア
ンチセンスＲＮＡを全長ＤＦＲｃＤＮＡ ＥｃｏＲＩフ
ラグメントがクローン化されたベクターｐＴＺ１８Ｕよ
り合成した。ペチュニアＶＲ ＤＦＲ ＲＮＡによるＲ
Ｎａｓｅ保護が、ペチュニア系Ｒ２７とＶＲのＤＦＲ遺
伝子との間の配列不一致に寄因して複数のフラグメント
をもたらす際、このプローブは完全にＶＩＰ１７８の転
写物により保護されている。
【０１６０】ＲＮａｓｅ保護実験は有効なＤＦＲ遺伝子
構造からのＤＦＲｍＲＮＡ（ＶＩＰ１７８；Ｒ２７−Ｄ
ＦＲプローブにより完全に保護された転写物）と、ペチ
ュニアＶＲ ＤＦＲ ｍＲＮＡ（Ｒ２７−ＤＦＲプロー
ブによるＲＮａｓｅ保護に基づく二つのサブフラグメン
ト）との間の区別を可能にする。形質転換体１７８−１
６及び１７８−１７について、このトランスジエンの表
現型より得られるつぼみ段階４におけるＤＦＲｍＲＮＡ
の安定状態レベル及び内因性ＤＦＲ遺伝子の安定状態レ
ベルを分析した。１７８−１７において、ＤＦＲトラン
スジエンの高い表現率が内因性遺伝子のそれと比較して
観察された。１７８−１６の色付いたフローラル組織に
おいて同じ結果が見られた。反対に、内因性及びトラン
スジエンＤＦＲｍＲＮＡの両方の安定状態レベルの大い
なる低下が形質転換体１７８−１６の白色フローラ組織
において見られた。
【０１６１】（実施例７：アセトラクテートシンターゼ
（ＡＬＳ））本実施例において、二つの遺伝子座、Ｓｕ
ＲＡ及びＳｕＲＢを有し、酵素アセトラクテートシンタ
ーゼ（ＡＬＳ）をそれぞれコード化するニコチアナ タ
バカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）（Ｃｈ
ａｌｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ＣｒｏｐＰｒ
ｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｂｉｏ１ｏｇｙ（Ａｒｎｔｚｅｎ ａｎｄＲｙａｎ，ｅ
ｄｓ．）４８：１５−４２５）を形質転換研究に利用し
た。ＡＬＳは、植物における分枝鎖アミノ酸の生合成に
おける第１の共通段階に包含される。ＡＬＳはスルホニ
ルウレア（ＳＵ）除草剤が作用する部位であり、且つ感
受性である（Ｌａ Ｒｏｓｓａ ｅｔ ａｌ．，（１９
８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：８７５３−８
７５７）。ＡＬＳタンパク質における１個のアミノ酸の
置換はこの酵素に除草剤耐性型をもたらす（Ｌｅｅ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ
７：１２４１−１２４８）；この効果はＳｕＲＡ及びＳ
ｕＲＢ遺伝子座いづれもの突然変異によりもたらされう
る。
【０１６２】この研究において、以下の通り、ＡＬＳ遺
伝子の欠損した型を含むもし全長ならばＡＬＳ酵素の耐
性型をコード化するＤＮＡにより、タバコ細胞を形質転
換せしめる。相同性組換は、ＡＬＳ遺伝子の感受性型
の、ＳｕＲＢ遺伝子座でのＡＬＳ遺伝子の欠損、及び耐
性型による置換の結果、ＳＵに対して耐性（カリと同
様）の複数のクローンを導いた。これらのクローンは、
置換されたＳｕＲＢ遺伝子配座の他に導入フラグメント
の種々の数（１〜３）の複写物を有した。植物への再生
に基づき、１つのクローン（フラグメントの３つの更な
る複写物を含む）は回復されたＳＵに対する感受性を有
することが見い出せた。即ち、ＳｕＲＡ遺伝子座の感受
性表現型（相同的に組換えたものでない）が現われ、そ
して相同性組換部位（更に、突然変異フラグメントのゲ
ノムにおける更なる複写物が存在する）であるＳｕＲＢ
の遺伝子座の耐性表現型はマスクされたか、又は制御さ
れた。このことは、本発明の方法によるＡＬＳ耐性表現
型の抑制を証明する。
【０１６３】実験の詳細及び結果を以下に記載する。
【０１６４】（方法） （標的プラスミドの組立）プラスミドｐＡＧＳ１５７は
３つのヌクレオチドが置き代り（５８６，５８７，１７
１９）、２つのアミノ酸の置換の生じた（１９６：ｐｒ
ｏ→ａｌａそして５７３：ｔｒｐ→ｌｅｕ）、タバコ突
然変異ＡＬＳ遺伝子〔これらのアミノ酸置換のいづれも
コード化ＡＬＳ酵素に除草剤耐性を授ける（Ｌｅｅ ｅ
ｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａ１
７：１２４１−１２４８）〕を含み、ｐＡＧＳ１６７は
相当する野性型遺伝子を有する。これらのプラスミド
を、目的のプラスミドの組立のために用いた。インビト
ロの突然変異誘導（Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ８２：４８
８−４９２）を、プラスミドｐＡＧＳ１７５を形成せし
めるため、ｐＡＧＳ１５７における５７３：ｔｒｐ→ｌ
ｅｕ突然変異部位から２５ｂｐ下流の特定のＡｐａＩ部
位（ＡＧＡＧＣＡＣＡＣ1753→ＡＧＧＧＣＣＣＡ
Ｇ1753）を誘導するために用いた。この新しい部位はタ
ンパク質のアミノ酸配列を変化せしめなかった。その
後、１９６：ｐｒｏ→ａｌａ突然変異を含むｐＡＧＳ１
７５由来の１．０ｋｂのＮｃｏＩ−ＨｐａＩフラグメン
トを、野性型配列を含むｐＡＧＳ１６７由来の等価のフ
ラグメントにより置換せしめた。得られるプラスミドｐ
ＡＧＳ１７７は、単一の５７３：ｔｒｐ→ｌｅｕ突然変
異、及び導入ＡｐａＩ部位を含む。ｐＡＧＳ１７７をバ
イナリーベクターｐＡＧＳ１４０のＢａｍＨＩ部位に
て、Ｔ−ＤＮＡボーダーの間にリゲートせしめ（Ｄｅａ
ｎ ｅｔ ａ１．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７６０１−７６１７）、プラス
ミドｐＡＧＳ１８０ＢＶを提供せしめた。このプラスミ
ドを陽性コントロールとして用いた。このプラスミドに
よる形質転換により発生する植物細胞はヒグロマイシ
ン、カナマイシン及びクロロスルフロンに耐性である。
プロモーター及び５’５１０ｂｐのＡＬＳコード化領域
を除去せしめた１．５ｋｂの欠損を有する除草剤耐性Ａ
ＬＳ遺伝子の不活性型を以下の通りに組立てた。プラス
ミドｐＡＧＳ１７７をＣｌａＩ及びＰｓｔＩにより分解
せしめ、そして一本鎖突き出しをＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼ及びｄＮＴＰの処理により除去せしめた。５７３：ｔ
ｒｐ→ｌｅｕ突然変異及び新規のＡｐａＩ部位を含む
１．８６ｋｐのフラグメントをアガロースゲルから精製
し、そしてバイナリーベクターｐＪＪ２５２５における
Ｔ−ＤＮＡボーダーの間のＨｐａＩ部位にクローン化せ
しめた。得られたプラスミドをｐＡＧＳ１８２ＢＶと命
名し、そしてこの実験のために用いた。これは全体でＳ
ｕＲＢＡＬＳ遺伝子に対して１．８６ｋｂの相同性を有
した。このバイナリーベクターｐＡＧＳ１８０ＢＶ及び
ｐＡＧＳ１８２ＢＶを、アグロバクター株 ＬＢＡ４４
０４（Ｈｏｅｋｅｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）
Ｎａｔｕｒｅ ３０３：１７９−１８０）の中に、Ｅ．
コリ株ＨＢ１０１／ｐＲＫ２０１３による三母細胞交配
によって接合せしめた（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ ａｎｄ Ｈ
ｅｌｉｎｓｋｉ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ，ＵＳＡ７６：１６４８−１６５２）。
【０１６５】（タバコプロトプラストとのアグロバクタ
ーの共同培養）プロトプラストはノーダル（ｎｏｄａ
ｌ）培養により成育せしめたＮ．タバカムの種々のウィ
スコンシンの３８の植物から得られた。プロトプラスト
誘導タバココロニーとＡ．トウメファシエンとの共同培
養は前述（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｌｚｅｎ ｅｔ ａ
ｌ．，（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
５：１４９−１５４）に記載の通りに行った。カナマイ
シン又はクロルスルフロン耐性についての選別は、プロ
トプラストの単離後８日目に開始した。共同培養植物細
胞をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）又はクロルスルフ
ロン（２ｎｇ／ｍｌ）のいづれかを含む培地上に散布せ
しめ、そしてこの培地を週に２回交換した。植物は、コ
ロニーを０．１μｇ／ｍｌのＮＡＡ、１．０μｇ／ｍｌ
のＢＡＰ及び１０ｎｇ／ｍｌのクロルスルフロンを含む
ムラシゲとスクーグの培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎ
ｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎ
ｔ１５：４７３−４９７）上に置くことにより再生し
た。
【０１６６】（ゲノミックＤＮＡのサザン分析）ゲノミ
ックＤＮＡを選別した除草剤耐性カルス及びマゲンタボ
ックス（Ｍａｇｅｎｔａ ｂｏｘｅｓ）内で成長した苗
条組織、又はグリーンハウス内にて成長した再生植物の
葉から単離した（Ｄｏｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９
８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２００：２４０−
２４６）。約１０μｇのＤＮＡを５０ユニットの適切な
制限エンドヌクレアーゼにより、３７℃で２〜４時間分
解せしめた。ハイブリダイゼーション及び洗浄は前述
（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ．Ｊｏ
ｕｒｎａｌ．７：１２４１−１２４８）により、慎重に
行った。プローブは、リボプローブベクター（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）又はランダムプライミ
ング（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のいづれかにより、製造
者の仕様書に従って調製した。
【０１６７】（セグリゲーション分析）形質転換植物は
自己授粉し、そして得られる種子を、２００μｇ／ｍｌ
のカナマイシン又は５０ｎｇ／ｍｌのクロルスルホンの
いづれかを含むＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ
Ｓｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ
１５；４７３‐４９７）に植え付けた。実生が、それら
の根を形成する能力に依存して感受性であるか耐性であ
るかに従って１０から１４日目に得られた。
【０１６８】（結果） （標的方法）目的のＤＮＡは、５’コード化配列及びプ
ロモーターの欠損により不活性化された除草剤耐性を授
けるＳｕＲＢ遺伝子配座由来の突然変異ＡＬＳ遺伝子よ
り成る。この耐性突然変異はアミノ酸５７３でのｔｒｐ
→Ｌｅｕ変化である。ＡｐａＩ制御部位を目的のＤＮＡ
を現わすためにこの突然変異の２５ｂｐ下流に導入せし
めた（この配列変化はコード化ＡＬＳタンパク質のアミ
ノ酸配列を変化させなかった）。．ＳｕＲＡとＳｕＲＢ
間のコード化配列が強く保存されているため（Ｌｅｅ
ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ
７：１２４１−１２４８）、組換は両遺伝子配座にて
可能であるが、しかしながら、いづれもの遺伝子配座で
の組換の生成物は、その制限消化パターンにより異なっ
ていた。
【０１６９】（クロルスルフロン耐性コロニーを生ずる
非機能性突然変異遺伝子による形質転換体）タバコ（ｃ
ｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ３８）プロトプラストをｐＡ
ＧＳ１８０ＢＶ（コントロールプラスミド）又はｐＡＧ
Ｓ１８２ＢＶ（突然変異ＡＬＳ遺伝子からの欠損フラグ
メントを有する）を有するＡ．トウメファシエンと共に
培養せしめた。培養後、これらのプロトプラストを分割
せしめ、そしてクロルスルフロン（２ｎｇ／ｍｌ）又は
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上に散布せしめた。ｐ
ＡＧＳ１８２ＢＶによる形質転換体は７つのクロルスル
フロン耐性クローンを生産した。形質転換カリ及びこれ
らのカリ由来の再生植物を、グリーンハウスに移す迄１
０ｎｇ／ｍｌのクロルスルフロン上に保存した。各除草
剤耐性形質転換体を、カルス断片を２００μｇ／ｍｌの
カナマイシンを含むプレートに移し、そしてその生存力
をモニターすることにより、カナマイシン耐性について
試験した。選ばれた７つのクロルスルフロン耐性形質転
換体のうち、２つはカナマイシン耐性であった（ＨＲ１
１及びＨＲ１５）。
【０１７０】（相同性組換より得られる３つのクロルス
ルフロン耐性クローン）相同性組換又は自発性突然変異
によりクロルスルフロン耐性クローンが得られたかを検
定するため、７つのクロルスルフロン耐性形質転換体か
らのゲノミックＤＮＡにおいてサザンハイブリダイゼー
ションを行った。プローブとして、誘導された突然変異
に広がり、そして５’において４５０ｂｐ及び３’方向
において７５０ｂｐ伸ばすＳｕＲＡ遺伝子由来のＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを用いた。ゲノミックＤＮＡをＮ
ｃｏＩ及びＡｐａＩで分解後、二つの内因性遺伝子、Ｓ
ｕＲＡ及びＳｕＲＢが４．７ｋｂ及び２．０ｋｂのハイ
ブリダイジングバンドを生じせしめた。ｐＡＧＳ１８２
ＢＶＤＮＡとＳｕＲＡ又はＳｕＲＢでのＡＬＳ遺伝子と
の相同性組換は１．２ｋｂ及び０．８ｋｂの新しい二つ
のバンドの出現をもたらすであろう。
【０１７１】それぞれの場合において、ＮｃｏＩ及びＡ
ｐａＩで分解された３つの独立したクロルスルフロン耐
性形質転換体（ＨＲ１１、ＨＲ１４及びＨＲ１５）から
単離されたＤＮＡのハイブリダイゼーションパターン
は、相同性組換が行われたのならば予想されるバンドを
示した。その他の４つのクロルスルフロン耐性形質転換
体は形質転換タバコと同一のハイブリダイゼーションパ
ターンを有していた。それ故、それらはＳｕＲＡ又はＳ
ｕＲＢ遺伝子配座での自発性突然変異により生じたこと
が想像される。ＨＲ１１，ＨＲ１４及びＨＲ１５からの
ＤＮＡについてのサザンハイブリダイゼーションパター
ンは、ＳｕＲ遺伝子座での相同性組換によりもたらされ
る予想通りの、１．２ｋｂ及び０．８ｋｂのバンドを示
した。ＨＲ１１及びＨＲ１４からのＤＮＡにおいて、相
同性組換に寄因するＡＬＳハイブリダイジングバンド以
外は現れず、更なるＴ−ＤＮＡランダム挿入が起きなか
ったものと考えられる。植物ＨＲ１５において、３つの
更なるハイブリダイジングＡＬＳバンドが現れ、この形
質転換体において更に３つの挿入があったものと考えら
れる。
【０１７２】サザンハイブリダイゼーションをＳｕＲ遺
伝子座の横のゲノミック配列を切断するＳｐｅＩによる
ＤＮＡの分解後も行った。タバコゲノミックＤＮＡをＳ
ｐｅＩ及びＡｐａＩにより分解せしめた場合、内因性Ａ
ＬＳ遺伝子は１０ｋｂ及び３．４ｋｂのハイブリダイジ
ングバンドを発生せしめるであろう。ｐＡＧＳ１８２Ｂ
ＶＤＮＡとＳｕＲＡ間の相同性組換は新しい５．４ｋｂ
及び０．８ｋｂのバンドをもたらし、そしてＳｕＲＢで
の組換は２．６ｋｂ及び０．８ｋｂのハイブリダイジン
グフラグメントをもたらすであろう。
【０１７３】ハイブリダイゼーションバンドはＳｐｅＩ
及びＡｐａＩにより分解せしめた後の、再生植物から単
離せしめたゲノミックＤＮＡのために分析した。ＳｕＲ
Ｂでの相同性組換の後に予想される２．６ｋｂのバンド
はＨＲ１１，ＨＲ１４及びＨＲ１５の推定組換体からの
ＤＮＡにおいてのみ現れた。その他のこれらのＤＮＡに
おけるハイブリダイジングフラグメントは、目的のＡＬ
Ｓ遺伝子をゲノムの中に運ぶ、Ｔ−ＤＮＡのランダムな
挿入から発生したＳｐｅＩ−ＡｐａＩフラグメントを明
らかに示した。予想通り、ＮｃｏＩ−ＡｐａＩハイブリ
ダイゼーションパターンに基づき、ＨＲ１５はそのＳｐ
ｅＩ−ＡｐａＩ分解において少なくとも２つの他のハイ
ブリダイゼーションバンドを有していた。更なるバンド
がＨＲ１１ＤＮＡにおいても見られ、少なくとも１つの
Ｔ−ＤＮＡのランダム挿入が考えられる。これらのデー
ターはＨＲ１１及びＨＲ１５もカナマイシン耐性である
観察と一致し、それらが機能性ＮＰＴＩＩ遺伝子を有す
ことを示す。ＳｐｅＩ−ＡｐａＩハイブリダイゼーショ
ンの結果は、目的のＤＮＡにおける新規のＡｐａＩ制限
部位マーカーがＳｕＲＢ遺伝子の外側の制限部位と現在
結合していることを示す。
【０１７４】（組換植物ＨＲ１１及びＨＲ１４における
単一メンデル遺伝子としてのクロルスルフロン耐性分
離）形質転換体ＨＲ１１，ＨＲ１４及びＨＲ１５の遺伝
分析結果を以降に要約する。自己授粉ＨＲ１４由来の子
孫における、クロルスルフロン耐性の、感受性に対する
分離度は耐性：感受性が３：１の比であり、これはクロ
ルスルフロン耐性についての単一ドミナント遺伝子座を
示す。ＨＲ１４由来の全ての種子はカナマイシン耐性で
あった。自己授粉ＨＲ１１からの子孫は３：１又は２：
１の比のいづれかに相当するクロルスルフロン耐性の感
受性に対する比を示し、これは不完全な浸透度またはホ
モ接合致死率を伴った単一メンデル遺伝子座を示す。こ
れらの子孫におけるカナマイシン耐性の分離はカナマイ
シン耐性についての単一配位座と一致する。カマイシン
及びクロルスルフロン両者を含む培地上での成育の際、
これらの子孫は耐性体：感受性体が９：７で分離した。
これは、カナマイシン耐性とクロルスルフロン耐性につ
いてのマーカーが結合しなかったと推定する。ＨＲ１５
由来の子孫はクロルスルフロン耐性でなかった（０／５
００種子）。カナマイシンに基づく耐性体の感受性子孫
に対する比は６３：１の比に相当し、カナマイシン耐性
についての三つの独立した遺伝子座の存在を示す。
【０１７５】全体にわたり、ＨＲ１５植物の観察された
表現型は、ＳｕＲＢ遺伝子座の遺伝子感受型と置換し
た、このゲノムにおいて生ずる、更なる三つの他の複写
物（非表現状態における）により抑制された、導入ＡＬ
Ｓ遺伝子の耐性フラグメントと一致する。この抑制は耐
性ＡＬＳ遺伝子の導入に基いて直ちに起こるのではな
く、なぜならＨＲ１５が誘導されるカルスは除草剤耐性
であるからである：しかしながら、進行する細胞分裂及
び植物再生に伴い、除草剤耐性は表現される。
【０１７６】（実施例８：植物油の改良された生産を伴
う新規の植物誘導体）ステアリルディザチュラーゼ（Ｓ
Ｄ）遺伝子のコード化領域を、カルコンシンターゼ遺伝
子のための例１において詳述した同様の方法、及び遺伝
子レベルでの脂質生合成経路について知られる当業界に
おいて知られる知識（例えば上記の論文を参照のこと）
を利用して単離せしめた。このＳＤ遺伝子を、ｐＪＪ２
１０４プラスミドヘの導入のために、独立した側面の制
限部位を含むために修飾せしめた。このことは、ノバリ
ンシンターゼ遺伝子由来のポリアデニル化シグナルを有
する有用な転写物を生成するための正しい配向にある、
修飾３５Ｓカルフラワーモザイクウィルスを有する遺伝
的構造を提供する。修飾された光合成２２Ｌクロロフィ
ルａ／ｂ誘導配列も前述の通り含まれる。
【０１７７】この新しい構造物は、正しい配向及びベク
ター含有について試験した。次いで、例１に記載する三
母細胞交配をＳＤ遺伝子に関連するベクター構造物及び
菌株を用いて行った。
【０１７８】Ａ．トウメファシエン クローンとの植物
形質転換を例１に記載通りに行った。トランスジェノー
ト細胞の発生後、植物全体が前述同様再生された。目的
の改良された油含有を示す植物のスクリーニングを、Ｈ
ＰＬＣカラム又は標準方法に関連する他の方法に基づ
き、トランスジェノート植物の油又は脂質生産量のアッ
セイにより行った。
【０１７９】（実施例９：糖又は炭水化物の改質された
生産を伴う新規の植物誘導体）実施例１及び８に記載の
方法において単離せしめたペチュニアスターチシンター
ゼ遺伝子をカルコンシンターゼ遺伝子に対して置換せし
めた。この方法はスクリーニング以外は本質的に前述通
り行った。生体サンプルのデンプン含有のため、標準ヨ
ードベースデンプンアッセイ又は他のアッセイを、改良
されたデンプン含有率を示す植物トランスジェノートの
選別のための測定に用いた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは本発明の典型的なプラスミドの作製
を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは本発明の典型的なプラスミドの作製
を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 カロリン エー． ナポリ アメリカ合衆国， カリフォルニア 94602， オークランド， フーバー ア ベニュ 1962 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD12 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD12 CD13 4B024 AA08 BA07 BA08 BA14 BA79 DA01 DA05 EA01 GA17 GA27 4B065 AA08X AA88Y AB03 AC14 BA02 CA28 CA29 CA53

Claims (44)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 植物において内因性遺伝子のタンパク質
    産物の産生を減少させる方法であって、該タンパク質は
    植物における表現型特性に影響し、該方法は以下の工
    程：プロモーターの作動可能な制御下にあるＤＮＡセグ
    メントで形質転換された植物細胞から、植物を生長させ
    る工程であって、ここで該ＤＮＡセグメントの転写産物
    は、センス方向に産生され、該ＤＮＡセグメントの転写
    産物はタンパク質をコードする内因性遺伝子の転写産物
    に実質的に相同であり、ここで該タンパク質の産生が減
    少される、工程；および表現型特性の改変について該植
    物をスクリーニングすることにより、表現型の変化を示
    す植物を同定する工程、を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記植物が花成植物である、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記植物が双子葉植物である、請求項１
    に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記植物が、Ｆｒａｇａｒｉａ、Ｌｏｔ
    ｕｓ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、Ｔｒ
    ｉｆｏｌｉｕｍ、Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｇｎａ、
    Ｃｉｔｒｕｓ、Ｌｉｎｕｍ、Ｇｅｒａｎｉｕｍ、Ｍａｎ
    ｉｈｏｔ、Ｄａｕｃｕｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｂ
    ｒａｓｓｉｃａ、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｓｉｎａｐｉｓ、
    Ａｔｒｏｐａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕ
    ｓ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、
    Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｐｅｔｕｎｉａ、Ｄｉｇｉｔａｌｉ
    ｓ、Ｍａｊｏｒａｎａ、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉ
    ａｎｔｈｕｓ、Ｌａｃｔｕｃａ、Ｂｒｏｍｕｓ、Ａｓｐ
    ａｒａｇｕｓ、Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、Ｈｅｒｅｒｏ
    ｃａｌｌｉｓ、Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕ
    ｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、Ｒａｎｕ
    ｎｃｕｌｕｓ、Ｓｅｎｅｃｉｏ、Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓ
    ｉｓ、Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａａｌｉａ、Ｇｌｙｃ
    ｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓ
    ｏｒｇｈｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍ
    ｕｍ、Ｄｉａｎｔｈｕｓ、Ｇｅｒｂｅｒａ、Ｅｕｐｈｏ
    ｒｂｉａ、Ｐｅｌａｒｏｎｉｕｍ、Ｉｐｏｍｏｅａ、Ｐ
    ａｓｓｉｆｌｏｒａ、Ｃｙｃｌａｍｅｎ、Ｍａｌｕｓ、
    Ｐｒｕｎｕｓ、Ｒｏｓａ、Ｒｕｂｕｓ、Ｐｏｐｕｌｕ
    ｓ、Ｓａｎｔａｌｕｍ、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、
    Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、Ａｎａｎａｓ、Ａｒａｃｈｉｓ、
    ＰｈａｓｅｏｌｕｓおよびＰｉｓｕｍ属からなる群から
    選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記セグメントが完全長のタンパク質を
    コードする、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記プロモーターが構成的なプロモータ
    ーである、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記プロモーターが、前記植物に対して
    外因性である、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記セグメントの転写産物が、前記内因
    性遺伝子の転写産物に対して８０％より大きい配列同一
    性を有する、請求項１に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記セグメントの転写産物が、前記内因
    性遺伝子の転写産物に対して９５〜１００％の配列同一
    性を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記セグメントがＤＮＡベクター中に
    ある、請求項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記セグメントがＴｉプラスミドベク
    ター中にある、請求項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記セグメントがフラボノイド代謝経
    路の酵素をコードする、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記セグメントがジヒドロフラボノー
    ルレダクターゼまたはアセトラクテートシンターゼ酵素
    をコードする、請求項１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記セグメントの転写産物が、前記内
    因性遺伝子配列の転写産物と同一である、請求項１に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記セグメントが５０ヌクレオチドを
    越える長さである、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記セグメントが５００ヌクレオチド
    を越える長さである、請求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 植物において内因性遺伝子の発現を抑
    制することにより少なくとも１つの改変された表現型特
    性を示す植物を産生する方法であって、該方法は以下の
    工程：ポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換して、ト
    ランスジェノート細胞を作製する工程であって、該ポリ
    ヌクレオチドはＤＮＡセグメントに作動可能に連結され
    たプロモーターを含み、その結果、該セグメントの転写
    産物は、該トランスジェノート細胞においてセンス方向
    に産生され、該セグメントの転写産物は、該内因性遺伝
    子の転写産物に対して６５％より大きい配列同一性を有
    し、そして該植物細胞において該内因性遺伝子の発現を
    抑制するのに有効である、工程；１つ以上の該トランス
    ジェノート細胞から植物を生長させる工程であって、こ
    こで該内因性遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの産生
    が、１つ以上の該植物で減少される工程；および該改変
    された表現型特性を示す植物を選択する工程、を包含す
    る、方法。
  18. 【請求項１８】 前記植物が花成植物である、請求項１
    ７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記セグメントが完全長のタンパク質
    をコードする、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記セグメントが５０ヌクレオチドを
    越える長さである、請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記セグメントが５００ヌクレオチド
    を越える長さである、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記トランスジェノート細胞において
    産生される前記セグメントの転写産物が、前記内因性遺
    伝子の転写産物に対して８０％より大きい配列同一性を
    有する、請求項１７に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記トランスジェノート細胞において
    産生される前記セグメントの転写産物が、前記内因性遺
    伝子の転写産物に対して９５％より大きい配列同一性を
    有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記セグメントがフラボノイド代謝経
    路のタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 前記セグメントが脂肪酸生合成経路に
    おけるタンパク質をコードする、請求項１７に記載の方
    法。
  26. 【請求項２６】 前記セグメントが糖からデンプンヘの
    生合成経路におけるタンパク質をコードする、請求項１
    ７に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記プロモーターが構成的プロモータ
    ーである、請求項１７に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記トランスジェノート細胞における
    前記セグメントの転写産物が、該トランスジェノート細
    胞における前記内因性遺伝子配列の転写産物と同一であ
    る、請求項１７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡベクタ
    ー中にある、請求項１７に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記植物細胞が前記セグメントを含む
    Ｔｉプラスミドベクターで形質転換される、請求項１７
    に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記改変された表現型特性を示す植物
    が視覚的に選択される、請求項１７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記内因性遺伝子によりコードされる
    ｍＲＮＡのレベルの減少を同定することにより植物が選
    択される、請求項１７に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 植物細胞中の内因性遺伝子によりコー
    ドされるｍＲＮＡのレベルを減少させることによって、
    植物の表現型を改変する方法であって、該方法は以下の
    工程：転写可能なＤＮＡ鎖のセグメントを含むポリヌク
    レオチドで形質転換した植物細胞から植物を生長させる
    工程であって、ここで該セグメントは作動可能に連結さ
    れたプロモーターから下流に位置し、それにより該セグ
    メントは該細胞内でセンス方向に転写され、そして該鎖
    は内因性の完全長の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ
    に相補的である配列を有する、工程；および、改変され
    た表現型について該植物をスクリーニングする工程、を
    包含する、方法。
  34. 【請求項３４】 前記プロモーターが構成的プロモータ
    ーである、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記内因性遺伝子がジヒドロフラボノ
    ールレダクターゼである、請求項３３に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記植物細胞が双子葉植物細胞であ
    る、請求項３３に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記植物細胞がタバコプロトプラスト
    である、請求項３３に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記転写可能なセグメントが、除草剤
    抵抗性タバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子をコー
    ドする、請求項３３に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 植物細胞中の内因性遺伝子によりコー
    ドされるｍＲＮＡのレベルを減少させることによって、
    植物細胞の表現型を改変する方法であって、該方法は以
    下の工程：転写可能なＤＮＡセグメントを含むポリヌク
    レオチドで形質転換した植物細胞を生長させる工程であ
    って、ここで該セグメントは作動可能に連結されたプロ
    モーターから下流に位置し、それにより該セグメントは
    該細胞内でセンス方向に転写され、ここで該転写される
    ＤＮＡセグメントは内因性の遺伝子によりコードされる
    ｍＲＮＡに相補的である配列を有し、それにより該ＤＮ
    Ａセグメントの転写は、該内因性遺伝子により転写され
    るｍＲＮＡのレベルを減少させるのに有効である、工
    程；および、 改変された表現型について該細胞をスクリーニングする
    工程、を包含する、方法。
  40. 【請求項４０】 前記プロモーターが構成的プロモータ
    ーである、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記内因性遺伝子がジヒドロフラボノ
    ールレダクターゼである、請求項３９に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記植物細胞が双子葉植物細胞であ
    る、請求項３９に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記植物細胞がタバコプロトプラスト
    である、請求項３９に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記転写可能なセグメントが、除草剤
    抵抗性タバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子をコー
    ドする、請求項３９に記載の方法。
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