JP2001506845A - クリソスポリウムセルラーゼ及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、中性及び／又はアルカリ性セルラーゼの新規な組成物と、クリソスポリウム培養物、特に、クリソスポリウムラクノウェンスから中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物を得る方法に関する。また、本発明は、中性及び／又はアルカリ性セルラーゼを生成することができるクリソスポリウム変異体と変異体の生成方法にも関する。更に、本発明は中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成を含む酵素をコード化する遺伝子にも関する。また、この発明は中性及び／又はアルカリ性セルラーゼを生成するためにクリソスポリウムを培養する方法にも関する。本発明の中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物は衣類の小石洗浄、洗浄処理、インクの除去、色彩の鮮明化、毛玉除去、紙やパルプのバイオ漂白、廃液処理を含む様々な処理で利用することができる。本発明はグルカナーゼやセロビオヒドラーゼ活性を有して小石洗濯のアプリケーションに有用な酵素の分離及び精製にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 名称 クリソスポリウムセルラーゼ及び使用方法 発明の分野 本発明は、中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ及びその新規な製造方法に関 する。より特定的には、本発明は、クリソスポリウム(Chrysosporium)属の菌類 及びクリソスポリウムラクノウェンス(lucknowense)の特定の株によって生成さ れるセルラーゼに関する。本発明は、これらの中性及び／又はアルカリ性セルラ ーゼ及びそれらを有する組成物の産業上の利用にも関する。 発明の背景 綿、リネン、麻、ラミー、キュプロ、リオセル、ニューセル、レーヨン、ポリ ノシクスなどの生地からなる衣料は大変人気がある。特に興味深いのは、綿や混 綿製のインディゴ染色されたデニム地から作られるジーンズなどの衣料品である 。かかる衣料品は、典型的に所定の大きさを有して切断された布から縫い合わさ れ、織物用糊剤があるために布地は堅くなり易い。他の場合では、繊維やロール 状生地は最終衣服裁縫前に酵素処理される。しばらく身に着けると、衣料品は、 ある程度柔らかくなり、全体的に色合いが減少し、局所的に変色する。加えて、 繰り返し洗濯した後は、衣服は、より快適にフィットし、柔らかい感触を与え、 外見は使い古されたようになる。近年、このような快適さ、感触及び外 見はますます人気のあるものとなっている。 この快適さ、感触及び外見を作る最も広く知られた方法は、軽石その他の研磨 剤が入った大型洗濯機でセルラーゼにより衣料品を洗濯するものである。軽石は 生地が柔かくなるのを促進し、その生地の長期間の着用によって作られるものと 同様の色褪せた表面を与えるのに役立つ。しかし、軽石の使用には幾つかの欠点 がある。例えば、軽石は、ポケット、内面、しわや折り目にたまり易いので、処 理された衣料品から手で除去されなければならない。また、軽石は小石洗濯機(s tone washing machine)の電気モータに過負荷の損害を与え、洗濯機の排管や排 水ラインを詰まらせる。これらの処理及び設備の問題はビジネスの費用と商品購 入価格を著しく増加する。 軽石を使用する問題に関し、小石洗浄処理で軽石その他の研磨剤を使用するこ とに対する代替的な方法が求められてきた。一の代替案は生地のセルロースを分 解する酵素処理の使用である(ゲラー(Geller)米国特許第4,951,366号、オルソン (Olson)米国特許第5,006,126号、第5,122,159号及び第5,213,581号、クリストナ ー(Christner)等米国特許第4,943,530号、ボー(Boegh)等米国特許第4,788,682号 )。生地の柔軟性又は感触を向上するためにセルラーゼなどの加水分解酵素によ りかかる生地を含むセルロースを処理する方法は当業界で公知である(ノボブロ ーシュア(ノボBrochure)セルラーゼSP 227、ノボブローシュアセルザイム、ムラ タ米国特許第4,443,355号、パースロー(Perslow)米国特許第4,661,289号；タイ( Tai)米国特許第4,479,881号、バーベスガード(Barbcsgaard)米国特許第4,435,30 7号、ブロウイング(Browning)英国特許第1,368,599号)。 セルラーゼはセルロース(β-1,4-グルカン結合)を加水分解し、これによって グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカリデースなどの構造体をもたらす 酵素系として当業界で公知である。セルラーゼ組成物は、エキソセロビオヒドラ ーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼとして識別されているものを含 む幾つかの異なる酵素成分から構成されている。その上、これらの種類の酵素は 個々のイソ酵素に分類することができる。 結晶セルロースをグルコースに効率的に変換するには完全なセルラーゼ系が必 要である。一般に、セルロース基質の全加水分解が必要な場合、セルラーゼ混合 物はエンドグルカナーゼと共に、β-グルコシダーゼ及びセロビオヒドラーゼを 含む必要がある。エンドグルカナーゼは、セルロースポリマーのグルコース単位 間のβ-1,4-グルコシド結合のランダムな加水分解に対する触媒となる。かかる 構成成分はカルボキシメチルセルロースなどの可溶セルロース誘導体を加水分解 し、これによりかかる溶液の粘性を減少させる。かかる酵素成分はポリマー内部 の領域で作用し、還元基数を緩やかに増加させながら平均ポリマー鎖長は急激な 減少をもたらす。セルロースポリマーの平均鎖長の急激な減少はセルロース溶液 の粘性の減少によって明らかになる。 異なるセルラーゼの基質特異性と作用形態はセルラーゼを生成する有機体の株 によって変化する。例えば、トリコデルマ・レッセイ(Trichoderma Ressei)菌類 からのセルラーゼにおける現在受け入れられているセルラーゼ作用の機構は、エ ンドグルカナーゼ活性がまずセルロースの低結晶部位にある内部のβ-1,4-グル コシド結合を切断する(ルーネン・エル等(Ruohnen L.，et al.)、「プロシーディ ングス・オブ・セカンド・トライセル・シンポジウム・オン・トリコデルマ・レ ッセイセルラーゼアンドアザーハイドロレーシーズ」(ピー・サドミネン及びテ ィー・レイカネン編集)、ファウンデーション・フォー・バイオテクノロジー・ アンド・インダストリアル・ファーメンテーション・リサーチ８(1993)87-96頁) 。セロビオヒドラーゼ活性はセルロースの非還元基の結晶部位に優先的に結合し 、セルビオースを主生成物として遊離する。β-グルコシダーゼやセルビアーゼ 活性は、セルビオースなどのセロオリゴサッカリデースに作用し、グルコースを 唯一の生成物として与える。 セルラーゼは菌類、バクテリアその他の微生物によって作られる。菌類は典型 的に、セルロースの結晶形を分解する能力がある完全なセルラーゼ系を作る。例 えば、トリコデルマ・レッセイは、結晶セルロースの効率的分解に必要な全酵素 活性、即ち、エンド-1,4-β-D-グルコシダーゼ、セルビオヒドラーゼ（エキソ-1 ，4-β-D-グルカナーゼ）及び1,4- β-D-グルカナーゼ又はβ-グルコシダーゼを生成又はセクリエート(secreate)す る。菌類状セルラーゼは、菌類においてセルラーゼが発酵過程で容易に大量に生 産されることができるという付加的長所を有する。 セルラーゼ又はその成分は、小石洗濯処理に加えて、様々な産業上の織物のア プリケーションに有用であることが当業界で知られている。例えば、セルラーゼ は、柔軟剤として、色彩の鮮明化、デピリング(depilling)その他の利用のため に組成物の洗浄能力を高める目的で洗剤に使用されている。そのように使用され ると、セルラーゼはセルロース材料の一部、例えば、綿地を洗浄において分解し 、生地の洗浄及び／又は柔軟比を促進する。菌類状セルラーゼ成分であるエンド グルカナーゼも、柔軟剤として使用、及び、綿地などの感触を改善するのに使用 されて、洗剤の洗浄能力を高める目的で使用されている。しかし、トリコデルマ (Trichoderma spp.)由来のセルラーゼ、特に、トリコデルマ・ロンギブラチアタ ム(Trichoderma longibrachiatum)を洗剤に使用する場合には問題がある。−般 に、かかる成分は酸性ペーハーで最高活性を有するが、ほとんどの洗濯洗剤は中 性又はアルカリ性状態での使用よう決まっているからである。 セルラーゼが使用されてきた他の織物のアプリケーションは、柔軟剤(ブラウ ニング(Browning)英国特許第1,368,599号、パースロー(Perslow)米国特許第4,66 1,289号、タイ(Tai)米国特許第4,479,881号、バーベスガード(Barbesgaard)米国 特許第4,435,307号)、デフィブリレーション(defibrillation)(ギンティス・デ ィー・ミード(Gintis D．Mead)E.J.,テクスタイル・リサーチ・ジャーナル(Text ile Research Journal)，29，1959、クーク(Cooke),W.D.,ジャーナル・オブ・ザ ・テクスタイル・リサーチ・インスティテュート(Journal Of The Textile Rese arch Institute)，74，3，1983、ボー(Boegh),欧州特許出願第0220016号）を含 んでいる。また、セルラーゼは、繊維の色密度の局所的変化を与える処理におけ る重合剤と結合して使用されてもきた(WO/94/19528及びWP/94/1529)。 セルラーゼは、衣類や織物産業ではそのペーハー作用範囲に従って分類されて いる。酸 性セルラーゼは典型的に約4.0乃至5.0以下のペーハー値において極大活性を有し 、中性セルラーゼは約ペーハー5.5乃至7.5において、アルカリ性セルラーゼは約 ペーハー7.5乃至11.0において有する。幾つかの酵素組成物より広い作用範囲を 有することができる。例えば、中性／アルカリ性セルラーゼは、約40℃乃至60℃ で、酸性、中性及びアルカリ性のペーハーで作用することができる。 酸比、中性及びアルカリ性のセルラーゼは、界面活性剤、緩衝液、洗剤、再堆 積防止剤(anti-redeposition agent)、柔軟剤、軽石その他の研磨剤、光漂白な どの漂白剤、酵素その他の手段と共に又はなしに、デニムジーンズの小石洗濯処 理に典型的に使用される。セルラーゼ組成物が定型化及び／又は予め緩衝されな い場合、ペーハーは、酸性セルラーゼに対しては、例えば、クエン酸ナトリウム とクエン酸緩衝液によって、典型的にペーハー4.5乃至5.5に、中性又はアルカリ 性セルラーゼに対しては、例えば、リン酸ナトリウム(Ｉ)、リン酸ナトリウム(I I)緩衝液によって、5.5乃至7.5に調整される。中性及びアルカリ性セルラーゼは 、作用のペーハーが約ペーハー7.0乃至11.5の範囲に亘ることができる洗濯洗剤 への添加物として典型的に使用される。小石洗濯アプリケーションにおいて、典 型的な酸性セルラーゼは、インディゴ染色のバックステイニング(backstaining) と再堆積が大きく、生地強度損失が大きいが、典型的な中性及びアルカリ性セル ラーゼは、一般に、侵食はより少なく、バックステイニング又は再堆積はより低 く、生地強度損失はより少ない。 中性／アルカリ性セルラーゼは、酸性セルラーゼ(即ち、トリコデルマ（Trich oderma）sp.)よりバックステイニングや再堆積が低レベルで強度損失が少ないた め、小石洗濯業界にとって最も好まれる種類のセルラーゼである。更に、中性/ アルカリ性セルラーゼは、酸性のものとは異なり、はるかに広いペーハー範囲で 作用し、小石洗濯業界においてより広いペーハー範囲(ペーハー5.0乃至8.0)内で 良好な相対洗浄性能を維持することができる。従って、中性／アルカリ性セルラ ーゼは幾つかの長所を有している。第一に、湿式処理施設における入来給水は、 典型的に、酸性セルラーゼに比較して同様に正確なペーハー制御 の必要性を減少するこのペーハー範囲内にある。このことは、酸性のセルラーゼ を使用する処理よりも、小石洗浄処理をオペレータがペーハーを誤ったり無視す ることに対してより寛容にし、処理全体により高い許容性を残すこどができる。 第二に、デニム地は染色処理用品が苛性ソーダを使用するという事実のために本 来アルカリ性であることが知られている。デニムの単純な洗浄はこの苛性剤を洗 浄水に開放するため洗浄水のペーハーは一般に上がる。アルカリ度は液槽緩衝液 よりも強いかもしれないが、中性/アルカリ性セルラーゼは高いペーハーだけで なくより広いペーハー範囲に亘って作用するので、増加したペーハーの効果は酸 性セルラーゼに比較して中性/アルカリ性セルラーゼにはより緩和されている。 セルラーゼ又はセルラーゼの成分、特に、アルカリ性及び／又は中性セルラー ゼに対する幅広い産業上の利用性により、中性及び／又はアルカリ性ペーハーで 作用するセルラーゼの明確な需要がある。本発明は、中性及び／又はアルカリ性 ペーハーで酵素活性を有する中性/アルカリ性セルラーゼを生成する方法の手順 とそれを有する組成物を提供している。 発明の要約 本発明は、中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ及びその新規な製造方法に関 する。より特定的には、本発明は、クリソスポリウム(Chrysosporium)属の菌類 及び特定のクリソスポリウムラクノウェンスからセルラーゼ組成物を生成する方 法を提供しており、セルラーゼ組成物は中性及び／又はアルカリ性ペーハーで酵 素活性を有している。また、セルラーゼ組成物に対する産業上の利用性も同様に 提供される。 本発明の一実施例は、中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物を生成する ことができるクリソスポリウム属の野生型及び変異体菌類の分離及び精製培養物 に関し、特にクリ ソスポリウムラクノエンスの株−ガーグ27K及びその変異体に関する。 本発明の別の実施例は、クリソスポリウム属の菌類から中性又はアルカリ性セ ルラーゼを生成するための培養条件を提供している。 更なる実施例において、本発明はクリソスポリウム属の菌類から組換え技術を 通して中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物を作る方法を提供している。 また、本発明の更なる実施例においては、中性及び／又はアルカリ性セルラー ゼを作ることができるクリソスポリウム菌類の変異体株の生成及び培養方法が提 供されている。 本発明の別の実施例は、クリソスポリウム又は遺伝子変更されたクリソスポリ ウム株によって生成されたセルラーゼ組成物の酵素をコード化する核酸配列に関 する。 別の実施例は、クリソスポリウム又は遺伝子変更されたクリソスポリウム株に よって生成されたセルラーゼ組成物の精製及び分離酵素に関する。 本発明の更なる実施例においては、柔軟化、漂白及び小石洗浄処理のような織 物のアプリケーション、衣服染色のアプリケーション、ディフィブリレーッショ ン(defibrillation)、又はバイオ磨き(biopolishing)、色彩の鮮明化及びデピリ ング(depilling)においてクリソスポリウムにより生成されるアルカリ性及び／ 又は中性セルラーゼの使用方法が提供されている。 本発明の別の実施例は、洗剤調製においてクリソスポリウムセルラーゼを有す る洗剤組成物に関する。 本発明の別の実施例は、農業、森林製品、都市の固形廃棄物その他のソースか らのリグノセルロースバイオマス(Biomass)の糖化におけるセルラーゼ組成物の 使用方法を提供している。 本発明の更に他の実施例は、燃料その他の化学物質の製造、木材パルプのバイ オ漂白、及び再生印刷紙のインク除去に、セルラーゼ組成物を使用することに関 する。 発明の詳細な開示 ここで、「中性−アルカリ性セルラーゼ」とは約5.5以上のペーハー値で相当の 酵素活性を有するセルラーゼ組成物をいう。好ましい実施例においては、本発明 の中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物は、40℃乃至約60℃、約ペーハー 5.5乃至7.5で、最大酵素活性を有する。最大酵素活性が約5.5より低いペーハー の場合には、中性−アルカリ性セルラーゼ組成物は、約40℃乃至約60℃、約ペー ハー6.0乃至約7.0で、少なくとも約50%の最適酵素活性を有するであろう。一例 としてかかる活性は、RBB-カルボキシメチルセルラーゼ法、カルボキシメチルセ ルラーゼ法、セラザイム(Cellazyme)法及び細胞内粘度測定法又はろ紙活性（FPA ）法によって測定することができる。従って、本発明のセルラーゼ組成物は、中 性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性が必要な場合に酵素組成物が小石洗浄， 洗剤及びインク除去その他のアプリケーションに使用可能なように、5.5より大 きいペーハーで有用な酵素活性を有する。 本発明は、中性又はアルカリ性ペーハーで高い活性を有するセルラーゼの組成 物及び中性及びアルカリ性セルラーゼ組成物を作る独特な方法に関する。本発明 の中性／アルカリ性セルラーゼ組成物は、クリソスポリウムのどのような種から でも得ることができる。特に好ましい実施例においては、本発明のセルラーゼ組 成物は、1996年８月29日に、郵便番号13184、ロシア連邦モスクワバクルシナ（B akhrushina）８番通りのロシア科学アカデミーの全ロシア微生物収蔵物の国際寄 託当局においてブダペスト条約の下で寄託され、寄託番号VKM F-3500Dが付され たクリソスポリウムラクノウェンスガーグ27K（指定分離C1と称される）から分 離される。本発明のセルラーゼ組成物は、中性及び／又はアルカリ性ペーハーで 酵素活性を有し、それにより産業上の利用において有益な性能特徴を提供してい るので、非常に都合がよい。 本発明での菌株から調製されるセルラーゼ混合物は、RBB-カルボキシメチルセ ルラーゼ 法、カルボキシメチルセルラーゼ法、セラザイム(Cellazyme)法、及び細胞内粘 度測定法又はろ紙活性（FPA）分析法よって決定されているように、約40℃乃至6 0℃、約ペーハー5.0乃至約12.0で活性を示す。小石洗浄処理の好ましい実施例に おいては、セルラーゼ組成物は、約40℃乃至60℃、ペーハー約5.5乃至約7.0で最 適活性を有することができる。中性及びアルカリ性ペーハー(即ち、6.0,7.0と8. 0)での良好な活性性能が、本発明の中性及び／又はアルカリ性セルラーゼに対し て小石洗浄アプリケーション試験及びペーハー10.0以上で洗浄アプリケーション 試験において示された。 セルラーゼを生成するためのセルロース分解微生物培養発酵手順は当業界では 公知である。例えば、セルラーゼ系は、固体、バッチ、流れバッチ及び連続フロ ー処理を含む固体又は液中培養によって作られる。発酵ブロースからのセルラー ゼ系の収集と精製も当業界で公知の処理によって実施することができる。セルラ ーゼ組成物は，例えば、膜又はホローファイバー限外ろ過装置を介して、遠心分 離又はろ過工程及びろ液の濃縮によって容易に菌類培養から分離される。 本発明のセルラーゼ混合物の作成するのに使用されるクリソスポリウム菌株は 当業界で公知の標準方法と条件に従って培養することができる。好ましい実施例 においては、本発明のセルラーゼ組成物はC1株から入手される。C1クリソスポリ ウム株は、無機塩、ペプトンなどの有機窒素源、脱脂綿種粉、トウモロコシを浸 した酒(corn steep liquor)又は酵母抽出物及び炭素源を含む培養液で成長され ることができる。炭素源の例にはグルコース、ラクトース、サッカロース、セル ロースその他の炭水化物が含まれるが、これらには限定されない。より好ましく は、菌株は、ラクトース及びペプトン又はラクトースと酵母抽出物の両方を含む 培養液において成長される。一例として発酵培養液は、約0.3%乃至約1.0%、好ま しくは、約0.5%乃至0.6%のラクトースと、約0.3%乃至約1.0%、好ましくは、約0. 5%乃至0.6%のペプトンとを有するこどができる。当業界で公知の他の窒素源と炭 水化物源は、テンサイパルプ、大麦麦芽、小麦糠その他を含む菌成長培養液に使 用されること ができるが、これらには限定されない。一例として、テンサイパルプの濃縮は、 約15乃至約30グラム／リットル(g/L)、好ましくは、約20乃至約25g/Lの範囲で使 用されることができる。大麦麦芽は、約10g/L乃至約20g/L、好ましくは、約14g/ L乃至約16g/Lの範囲で使用されるこどができる。小麦豆は、約3g/L乃至約8g/L、 好ましくは、約5g/L乃至約6g/Lまでの範囲で使用されるこどができる。ある実施 例においては、C1株は、テンサイパルプ、大麦麦芽及び小麦糠を含む塩性培養液 において回転振盪フラスコで培養される。セルラーゼ組成物は、細胞培養液の遠 心分離と限外ろ過濃縮によって、増殖培地で約３日乃至７日培養された菌類から 分離されることができる。 代替的に、クリソスポリウム培養物は商業的利用のために従来の発酵技術によ り大規模培養が可能である。この点に関して、発酵はいかなる制御された菌培養 条件をも広義に述べるのに使用される。大規模成長前に成長培養移植が一般に培 養される。移植培養液は炭素源、有機窒素源及び無機塩の従来の成分を含むこと ができるが、これに限定されるものではない。炭素源は、約0.5及至200g/Lの範 囲、より好ましくは、約５及至50g/Lの範囲で濃縮したグルコース、ラクトース 、グリセロール及び／又はセルロースを含むことができるが、これに限定される ものではない。有機窒素源は約0.5及至30g/Lの範囲、より好ましくは、約５及至 15g/Lの範囲で濃縮した酵母抽出物、ペプトン又は脱脂綿種粉を含むことができ るが、これに限定されるものではない。無機塩は、例えば、約0.01及至10g/Lの リン酸カリウム、例えば約0.01及至3.0g/Lの硫酸マグネシウム、例えば、約0.00 1及至10mg/Lの硫酸鉄を含むことができるが、これに限定されるものではない。 移植又はスタータ培養物を、当業界で公知の方法でファーメンターに対してク リソスポリウム培養を開始するのに使用することができる。発酵用培養液は、セ ルロース、有機窒素源、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムを含む従来の菌培 養成分を含むことができるが、これに限定されるものではない。有機窒素源の例 はペプトン又はファーマメディア(Pharmamedia)などの脱脂綿種粉であるが、こ れに限定されるものではない。 一例として、培養液は、約0.5g/l乃至約20g/Lのペプトン又は脱脂綿種粉、約1 0g/l乃至約30g/Lのセルロース、約0.03g/l乃至約0.06g/Lの硫酸マグネシウム７ 水和物又は約0.4g/l乃至約0.8g/Lの塩化カルシウム２水和物を含むことができる 。 当業者は、発酵中の発酵混合物の温度、酸素含量、ペーハー及び栄養レベルを 維持しなければならないことを理解するであろう。例えば、溶解酸素レベルは空 気飽和の約10%乃至60%、好ましくは空気飽和の約20%乃至40%に維持されなければ ならない。ペーハーは約５乃至８、好ましくは、約6.5乃至7.5、より好ましくは 、6.9乃至7.1に維持されなければならず、温度は約25℃乃至40℃、好ましくは、 約28℃乃至35℃に維持されることができる。供給溶液は発酵培養液に類似の成分 を含んでいるが、発酵培養液に添加されたときの希釈が最小になるように高濃度 を有する。 本発明の方法により生成されたセルラーゼ組成物は、セルラーゼ活性、特に、 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性が必要である多様なその他のアプリケ ーションに有用である。本発明の実施例においては、中性及び／又はアルカリ性 セルラーゼ組成物は、デニム地ジーンズ用の小石洗浄処理に使用される。例示的 に、小石洗浄のアプリケーションに最も好まれるペーハーの範囲は約5.5乃至7.5 で、最も好ましくは、約ペーハー６乃至約７である。クリソスポリウム分離物か ら得られる中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ組成物は、中性又はアルカリ性 ペーハー以上で、好都合に相当の酵素活性を有している。中性及び／又はアルカ リ性ペーハーで動作する中性及び／又はアルカリ性セルラーゼにより行われる小 石洗浄処理は、より低レベルの衣服へのバックステイニングと、より少ない生地 への強度損失と、本処理中に中性に存在する水のアルカリ度のために、酸性セル ラーゼ（例えば、トリコデルマレッセイからのもの）を使用する伝統的処理に比 較して、特に好都合である。これらの小石洗浄処理は大変望ましい感触と外見を 有するジーンズをもたらす。例えば、ここに記述されている0.02乃至10gのセル ラーゼ調整47.0528はデニム135gごとに使用することができる。当業者は、セル ラーゼ活性などの因子や温度及びペーハー を含むがこれに限定されない洗浄条件に基づいて、本発明によって作られたセル ラーゼ組成物の量又は濃縮の調整方法を知るであろう。 本発明の更なる実施例において、本発明のセルラーゼ組成物は洗剤組成物に添 加することによってセルロース製生地の粗さを減少又は除去するのに使用するこ とができる。例えば、洗剤組成物の好ましい範囲は、ペーハー約８及至約12、最 も好ましくは、ペーハー10及至約11である。本発明のセルラーゼ組成物は洗剤組 成物に中性及び又はアルカリ性ペーハーで使用されることができる。本発明のセ ルラーゼ組成物に使用されるよう企図された洗剤成分は当業界では公知のいかな る洗剤成分をも含んでいる。かかる成分の例は、洗剤、緩衝液、界面活性剤、漂 白剤、柔軟材、溶剤、固体形成剤、研磨剤、アルカリ塩類、無機電解質、酸化防 止剤、ビルダー(builder)、珪酸塩、防腐剤及び安定剤を含んでいるが、これら に限定されず、また、これらは当業界で公知である。本発明の洗剤組成物は、洗 剤組成物においてその使用が周知である陰イオン、非イオン及び両性界面活性剤 を含む界面活性剤、即ち、表面活性剤を好ましくは使用している。セルラーゼ組 成物及び界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物は以下の一以上の成分を付加 的に含むことができる。即ち、酵素アミラーゼ、セルラーゼ、プロテナーゼ、リ パーゼ、オキシド-レダククターゼ、ペロキシダーゼ及び他の酵素、陽イオン界 面活性剤及び長鎖脂肪酸、ビルダー、非還元剤、漂白剤、青み剤及び蛍光染料、 ケーキング防止剤、セルラーゼ活性因子防止用マスキング剤、セルラーゼ活性化 剤、酸化防止剤及び可溶化剤である。また、必要があれば、本発明の洗剤組成物 と共に、香料、防腐剤、染料などを使用するこどができる。セルラーゼを使用す る洗剤組成物の例は、ここに参照して結合される特許第4,435,307号、第4,443,3 55号、第4,661,289号、第4,479,881号、第5,120,463号に例示されている。 本発明で使用される洗剤ベースが粉状であれば、それは、スプレー乾燥方法及 び／又は顆粒化方法を含むいかなる公知の調製方法によっても調製されることが できる。顆粒化方法は、顆粒非塵的比質のためスプレー乾燥製品に比べて非常に 好まれる。スプレー乾燥方 法により得られる洗剤ベースは、界面活性剤やビルダーなどの熱抵抗成分の水性 スラリーを熱空間にスプレーすることによって得られるホロー顆粒である。顆粒 は約50及至約2000マイクロメートルの大きさを有している。スプレー乾燥後、香 料、酵素、漂白剤及び／又は無機アルカリ性ビルダーを添加することができる。 スプレー乾燥顆粒化方法などによって得られる顆粒洗剤ベースは高濃度であれば 様々な成分もベース調製後に添加することができる。洗剤ベースが液体であれば 均一溶液又は不均一溶液どちらかになる。 本発明のセルラーゼ組成物は好ましくはアルカリ性又は中性ペーハーで高活性 レベルを示すが、酸性ペーハーで酵素活性を示す場合もある。従って、本発明の セルラーゼを有する洗剤組成物は酸性乃至アルカリ性の広いペーハー範囲で使用 することができる。 これらのセルラーゼ組成物が使用可能なその他の織物のアプリケーションは以 下のものを含むがこれらに限定されない。即ち、ビスコースの酵素マースライゼ ル法を含むがこれに限定されない衣料染色、バイオ磨きのアプリケーション、酵 素表面磨き、バイオ洗浄(織物材料の洗浄又はすすぎ処理)、酵素マイクロフィブ リレーション、リネン、ラミー及び麻の酵素「綿化」、及び、リョーセル(Lyocel) 又はニューセル(Newcell)の処理(即ち、コータール（Courtauld）のテンセル(TE NCEL))、キュプロ及びその他の綿生地又は衣服、染色された綿などの染色された セルロース基質からの脱色(レイソラ＆リンコ-(1976)アナリティカル・バイオケ ミストリー(Analytical Biochemistry) 、70巻、592頁、デタミナーション・オブ ・ザ・ソルビリジング・アクティビティ・オブ・ア・セルラーゼ・コンプレック ス・ウィズ・ダイド・サブストレイツ(Determination Of Solubilizing Act ivi ty Of A cellulase Complex With Dyed Substrates)、ブラム＆ストール(Blum & Stahl)−エンザイミック・ディグラデーション・オブ・セルロース・ファイバ ース(Enzymic Degradation Of Cellulase Fibers)、静岡県浜松織物工業研究所 報告、24巻、(1985)、使い古したように見える新規のインディゴ染色デニムを作 る漂白剤として(フジカワ（fujikawa）-日本特許出願公開公報第50-132269号)、 漂白剤の漂白力を高めるため(スズキ-英国特許第2 094 826号)、及び、衣類の酵素のり抜き及び漂白用組成物処理において（ウインドビ ッター(Windbichtler)ら，米国特許第2,974,001号である。セルラーゼを使用す る酵素のり抜きの別の例は、ジャーナル・オブ・テックスタイル・アソシエーショ ン(Journal of the Textile Association)、83-86頁、バタワデカール(Bhatawad ekar)(5月、1983)に与えられている。 その他の産業上の実施例においては、セルラーゼ組成物は、発酵を通して燃料 及び他の化学薬品を製造するため、木材パルプをバイオ漂白するため、及び、当 業者に公知の全方法によりリサイクル印刷用紙をインク除去するため、農業、森 林製品、都市の固形廃棄物その他のソースからのリグノセルロースバイオマスの 糖化に使用することができる。 他の産業上の実施例として、セルラーゼ組成物は農業、森林製品、地方自治体 の固形廃棄物、及び他の源からのリグノセルロースの糖化バイオマスにおいて、 当業界では公知である発酵からの燃料及び他の化学薬品の生産、木材パルプをバ イオ漂白、リサイクルされた印刷紙のインク除去に使用できる。 更なる本発明の実施例として、中性及びアルカリ性セルラーゼ混合物の様々な 構成要素は互いに分離及び互いに独立して使用することができる。セルラーゼ構 成要素により豊かになった特定の組成物又はセルラーゼ組成物は、変異体又は遺 伝子工学的方法により特に生成された物から化学及び物理的な方法により生産又 は分離される。セルラーゼ系は、適当なペーハーでのイオン交換クロマトグラフ ィー、親和性クロマトグラフィー、サイズ除外、クロマトグラフィーなど当業周 知の分離技術によって別個の組成物に精製される。例えば、イオン交換クロマト グラフィーはペーハー勾配、又は塩の勾配、又はそれらの両方によって溶離する ことによってセルラーゼ構成要素を分離するこどが可能である。かかる分離方法 は、当業者にもたらされた技術の利益をもって実施することができる。 セルラーゼ組成物のそれぞれ酵素要素は一旦分別及び分離されると、たんぱく 質は部分的な配列又は微細な配列とされ、興味ある酵素たんぱく質を遺伝子コー ド化するための合成DNAやプローブを設計する。−般に、たんぱく質のアミノ末 端基の配列は、従来のたん ぱく質配列方法又は自動化された配列により決定される(アウスバル(Ausubel)ら 、(1987)「カレントプロトコールインモレキュラーバイオロジー(Current Protoc ols in Molecular Biology)」、ジョンウィレイ アンド サンズ(John Wiley an d Sons)、ニューヨーク、ニューヨーク州)。或いは、たんぱく質の他の領域は、 化学分裂又は酵素分裂及びたんぱく質分離技術の組み合わせによって配列される 。(「カレントプロトコールインモレキュラーバイオロジー(Currcnt Protocols i n Molecular Biology)」、ジョンウィレイ アンド サンズ(John Wiley and Son s)、ニューヨーク、ニューヨーク州)。当業者には、クルソスポリウムにより生 産された中性／アルカリ性セルラーゼ組成物内に存在する酵素に対応する遺伝子 を分離するための常套のクローン技術には合成DNAの複製又はプローブが使用さ れるものと理解される。 当業界において公知のことは、本発明によって得られた核又は配列又はDNA配 列の遺伝コード多様住の退化によって違うものとなりうる。しかしセルラーゼ組 成物の酵素の構成要素をコード化するこどが可能なDNA配列が得られる。そのよ うなDNA配列がそれゆえ本発明の核酸配列と機能的に等しく、現在の発明に包摂 されているものとする。また、本発明で意図されるところは、さまざまな条件下 での明確にされた核酸配列に合成される核酸配列に相補的な核酸配列である。 本発明はさらに進んで、本発明のセルラーゼ組成物の酵素をコード化するたん ぱく質、又はペプチド又はそれらの類似体、及びこの発明の酵素たんぱく質又は ペプチドとして実質的に同機能を持つたんぱく質又はペプチドを含む。かかるた んぱく質又はポリペプチドはたんぱく質の断片、又は変異体の代替、添加又は削 除を含むが、それに限らない。またこの発明はこの発明のセルラーゼ組成物を構 成する酵素をコード化するたんぱく質の同類体であるたんぱく質又はペプチドを 包摂する。「同類体」の用語は、一つ又はそれ以上の残存基が機能的に類似の残 存基と−時的でなく置換され且つここに説明されるところのたんぱく質の機能的 な特徴を示す配列と実質的同一のアミノ酸残存配列を有するどのようなポ リペプチドも含む。一時的でない置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン 又はアラニンなどの一つの非極性（疎水性）残存基による置換と、アルギニン及 びリジンの間としてグルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間な どの一つの極性（親水性）残存基による置換と、リジン、アルギニン又はヒスチ ジンなどの一つの基本的な残存基の置換や、アスパラギン酸及びグルタミン酸な どの酸性残存基の置換が含まれる。 本発明はまた核酸配列の全て又は一部分を含むDNA組み換え分子力体発明又は 仲介物から分離されていることをも提供する。本発明において使用に適当な仲介 物の発現は、核酸配列をつなぐ操作上での少なくとも一つの表現制御要素（元素 ）から成っている。表現制御要素は、仲介物において核酸配列の表現を制御及び 調節するために挿入される。表現制御要素の例は、乳汁系、ラムダファージ（la mbda phage）の領域の作動遺伝子及び促進剤、イースト、又は他の菌類促進剤を 含むが、それに限らない。使うことのできる促進剤の例はグルコアミラーゼ含む が、それに限らない。付加的に好まれる又は必要である操作上の要素は、前駆体 配列、終止コドン、ポリアデニル化信号及び他の必要な又は好まれるホストシス テムでの核酸配列の適切な複写及び翻訳の配列を含むが、それに限らない。当業 界で公知のこことして、必要又は好まれた発現制御要素の適当な組み合わせは、 選ばれたホストシステムに依存する。さらに発現仲介物が、ホストシステムでの 核酸配列を含む発現仲介物の準配列複製及び転送のための必要な添加要素を含む 。かかる要素の例は複製の由来及び選択マーカーを含むが、それに限らない。当 業界において公知のことは、かかる仲介物は従来の方法(「カレントプロトコール インモレキュラーバイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)」、 ジョンウィレイ(John Wiley)、及び息子、ニューヨーク州、ニューヨーク)の使 用、又は営利的な利用で構成される。 本発明の別の様子は、全て又は一部分の挿入された核酸配列を含む発現仲介物 の組換えのホスト有機体に関する。本発明の核酸配列によって変換されたホスト 細胞は、E.coliや他のバクテリアなど動物、植物又は種子、昆虫及び酵母細胞、 菌細胞などの成熟核、及び E-大腸菌又はその他のバクテリアのような原子核、を含む。菌ホスト細胞の例と して、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ヒミコラ属、ペニシリウム属、又は ヌーロスポーラを含むが、それの限らない。細胞内から伝わった遺伝子を運んで いる仲介物が、セルに導入できる方法が転換、微量注射、エレクトロポラーショ ン(electroporation)、形質導入、トランスフェクションDEAE-デキストラン、リ ポフェクション(lipofection)、リン酸カルシウム、又は他の手順を含むが、そ れに限らない。(サンブローク（Sambrook）ら、「モレキュラークローニングアラ ボラトリーマニュアル(Molecular Cloning．A Laboratory Manual)」、コールド スプリングハーバー出版、ニューヨーク州、プレインビュー)。代わりに、クリ ソスポリウム細胞は、本発明の核酸配列によるセルラーゼsの生産を拡大するた めに、Chrysosporiumによってこの発明の核酸連続によって変換できる。権化に おいて、一時的なセルの機能は表現ベクトルthat使われる。そのようなベクトル の例は含むけれども、plasmids.に制限されず、特許権(Ogawaにおいて記述され る；日本語はJP5095787A 930420、大関の特許を取得する；日本語はJP71 15976 A 950509、Murakamiの特許を取得する；日本語はJP3094690 A 910419、Ishidaの 特許を取得する：日本語は、JP325 1 175A 91 1 108、Uozumiの特許を取得する ；日本語は、JP5268953 A 931019 DW9346 C12N-00の特許を取得する。 原料及び方法酵素分析 酵素基質としてカルボキシルメチルセルロースを使用したカルボキシ ルメチルセルラーゼ法では加水分解の初速度を測定し、ソモギーとネルソンの方 法に従って糖の還元量の定量を行った。この方法は、メソッヅオブエンザイモロ ジー(methods of enzynlology)、160A巻、102-104ページに記述されている。エ ンド-1,4-β-グルカナーゼ法はバイオオーガニッケスカヤキミア（Bioorganlche skaya Khimia）6巻、1225-1242ペー ジ（エンド粘度分析法）に従ってカルボキシメチルセルロース基質溶液の粘度が 減少する速度による粘度測定法によって分析された。ろ紙活性分析法（FPA）も しくは全セルラーゼ活性には基質としてろ紙を用いた。そして活性はろ紙サンプ ル50mgから必要とされる２mgのグルコースを取り出し評価した。分析法は、全セ ルラーゼ活性または真のセルラーゼのための測定法として生物工学（IUPAC）の 委員会に基づいており、メソッヅオブエンザイモロジー(methods of emzymology )、160A巻、94-97ページに記述されている。アビセラーセ活性はアビセル-セル ロース（バイオリソーステクノロジー(Bioresource technology)、52巻、119-12 4ページにおいて記述されている）ならば、加水分解中の糖構造の初期還元速度 によって評価される。セロビアーゼの分析法は基質としてセルビオースを使用し 、発生したグルコース量を測定した(メソッヅオブエンザイモロジー(methods of cmzymology)、160A巻、111-112ページに記述されている)。β-グルコシダーゼ 活性の分析法は、基質としてp-ニトロフェニル-β-D-クルコシドを使用した(メ ソッヅオブエンザイモロジー(methods of emzymology)、160A巻、109-1100ペー ジに記述されている)。たんぱく質は、ローリー(Lowry)法(ジャーナルオブバイ オロジカルケミストリー(Biological Chemistry)、193巻、165-175ページによる )によって測定される。RBB-カルボキシルメチルセルラーゼの分析法は、RBB-カ ルボキシメチルセルロース（レマゾルブリリアントブルーによって染色されるカ ルボキシメチルセルロース）基質溶液の染色の測定に基づいている。分析法とし てメガザイム（Megazyme）(オーストラリア)社の1995年４月の製品情報報告を参 照する。エンドーセルラーゼはまたアズリン-クロスリンク（Azurine-crosslink ed）されたHE-セルロースを基質としてセラザイム分析法を使用し測定すること ができる(メガザイム社（Megazyme）製品報告CEL、1996年１月を参照)。例1-C1株の分離 株は、ロシア連邦の極東のタサネム湖（ロシアの太平洋の沿岸、モスクワから 約5000 マイル東）からの森林アルカリ性土壌のサンプルから分離された。混合土壌サン プルは、10の異なる場所から収集された。個々のサンプルの１グラムは、100ml 無菌水道水と一緒にフラスコにいれ、１分間超音波ディスペンサーで音波処理さ れた(0.44Amp、22のKHz)。懸濁液（1:500に希釈）は、100mg／Lのストレプトマ イシンを含んだツァペック（Czapek）培地（pH5.5-6.0）の入ったペトリざらに 接種された。この研究は３つの複製品について実施された。様々な色形とサイズ の群体は２番目の分離過程で見分けた。更なるサンプルの分離は、プレートにお いてツァペック（Czapek）媒体、麦芽寒天、ジャガイモデキストロース寒天、ま たはpH7.5のゲッチンソン（Getchinson）含塩水媒体で実行した(表2)。プレート は、数日の間約28℃で接種された。セルラーゼの製造菌の選択は、表1に示され ている構成要素を含んでいるセルロース寒天プレートにおいて行われた。非晶質 セルロースの準備はについてはメソッヅオブエンザイモロジー(methods of emzy mology)、160A巻において記述されている。 プレートは28℃で3-7日の間接種された。群体のまわりの明るく鮮明な量の構成 は、セルラーゼ活性を示していた。ここにC1として明示されている１つの株はセ ルラーゼ活性の重要なレベルを示しており、付加的な研究のために選ばれた。株 は、ロシア科学アカデミー （VKM）(英語短縮-RCM)、ロシア連邦モスクワバクルシナ（Bakhrushina）８通り 113184、ブダペスト条約下1996年８月29日、クリソスポリウムラクノウエンスガ ーグ27Kとして、VKM F-3500D）の全ロシア微生物収蔵物のなかに置かれている。例2-C1株の説明 ジャガイモデキストロース寒天上でのC1株の成長は７日後に55-60mm直径の群 体を与えた。C1群体の表す白いクリーム色は、表面がビロード状で、中央がわず かにあがった表面を持っています。群体の端は平らで薄く繊維状である。群体の 裏側は淡いクリーム色を持っている。菌糸体は透明でわずかに分岐していてなめ らかです。菌糸は薄い壁で囲まれている。気中菌糸は隔膜で2.0-3.0マイクロメ ートル幅の胞子形をしている；基質菌糸は殺菌してある。分生子は、終端および 側面にある。不介在の分生子がある。分生子の大多数は短い柄または短い側枝を 通して菌糸と関係している。分生子は分離されるが隣接している。分生子は透明 、薄い壁で囲まれている、楕円形または根棒形、単一な細胞である。それらのサ イズは直径の４マイクロメートルから10マイクロメートルまで変化する。C1株は 麦芽エキス寒天（4'Cでの）で培養されて６カ月ごとに移される。凍結乾燥のた めの液体窒素の維持はまた可能である。C1株は糸状となり半数になり、牛の胆汁 （1.5%）のような成長限定媒介を持つ寒天プレートで成長することができ、胞子 を生み出す。例3−C1株の分類 サットン（Sutton）分類(ファンダースコット,C.A.N.[1980]、“アリビジョン オブクリソスポリウムアンドアライドゲネラ（A revision of Chrysosporium an d allied genera)”スタディーオブマイコロジー(Study of Mycology)、20巻、C entraaddbureau voor Schimmelcultures、Baarn、オランダ、ページ1-36)、発明 の主題であるC1株のMonillaceaeのHyphomycetales.ファミリーの順序、Chrysosp oriumの種類、クリソスポリウムラクノウ ェンスガーグ（Chrysosporium lacknowense Garg）1966の種に付属しています。 この分類はC1種の以下の特徴の観察に基づきました １．ハイフォマイセタールス目の兆候 分生子は菌糸体、別個の胞子生殖の細胞、または区別できる分生子柄から直接 生成される。 ２．モニリアセアーゼの種の兆候 分生子および分生子柄（もし存在すれば）の両方とも硝子状で明るい色である 。分生子柄は単体か緩い房状である。 ３．クリソスポリウム コルダ １８３３属の兆候 群生は通常、広がって、白色、ときどきクリーム色となる淡い茶色または黄色 で、フエルト状および／または粉状である。菌糸は硝子状で滑らかな壁面を有し 、不規則で、多少正常屈性分岐を有する。増殖力のある菌糸は殆どまたは全く相 違をみせない。 分生子は頂生で、側生で、葉状で、菌糸、無柄または短い突起または側分岐の いたるところで生成し、すこし曇った硝子状または薄い黄色で、薄いまたは厚い 壁を有する完全ではない球状、バット形、洋梨形、倒卵形、単細胞まれに二細胞 の切形である。節間の分生子はときどき存在して群生せず、しばしば連鎖し、す こし曇った硝子状または薄い黄色で、支持菌糸より広がり、通常単細胞で、両端 で切形を呈する。クラマイドスポアズはしばしば存在する。 ４．クリソスポリウム ルタノウエンセ ガルグ １９６６種の兆候 サボウアラウウドグルコース寒天に１４日間で直径５５ミリに成長した群生は クリーム色で、フェルト状で、けば立っている。濃く３から５ミリの高さで、縁 部はくっきりと規則正しく、毛縁がある。裏面は淡い黄色からクリーム色を呈す 。菌糸は硝子状で滑らかで薄い壁を有し、少し分岐している。空中菌糸はほとん ど増殖力を有し近くに中隔を有して、１から３．５ミリの幅を持つ。液内で培養 した菌糸は増殖せず、１から４．５ミリの幅を 持ち、薄い菌糸がしばしば輪郭を形成する。分生子は頂生で、側生で、ほとんど 無柄または短いしばしば円錐の突起または短い側分岐を有する。分生子は群生せ ずしかし互いに近接して位置し、１つの菌糸細胞上に１から４の分生子が成長し 、すこし曇った硝子状で、ごく薄く滑らかな壁部を有し、多くは完全ではない球 状、且つバット状、倒卵形で、単細胞、２．５乃至１１ミリｘ1．５乃至６ミリ の大きさ、広い根元からの瑕（１から２ミリ）を有する。節間分生子は存在せず 。クラマイドスポアズも存在しない。 ５．Ｃ１株の説明 群生は７日間でポテト−ブドウ糖寒天上に５５から６６ミリの大きさに成長し 、白−クリーム色のフエルト状とされ、中央で２から３ミリの高さを持ち、縁部 はくっきりと規則正しく、毛縁がある。裏面は淡いクリーム色を呈す。菌糸は硝 子状で滑らかで薄い壁を有し、少し分岐している。空中菌糸は増殖力を有し近く に中隔を有し、１から３．５ミリの幅を持つ。液内で培養した菌糸は増殖しない 。分生子は頂生で、側生で、無柄または短い側分岐を有し、存在しないか群生せ ずしかし互いに近接して位置し、すこし曇った硝子状で、ごく薄く滑らかな壁部 を有し、完全ではない球状、バット状、倒卵形で、単細胞、４乃至１０ミリであ る。クラマイドスポアズは存在せず。節間分生子は存在せず。 結論 Ｃ１はクリソスポリウム ルクノウェンセ ガルグ １９６６種の株である。 この株で作られたセルロースを簡単のためここに「Ｃ１」または「Ｃ１セルロー ス」と言及する。実施例４--セルラーゼ活性の測定 C1株は、220rp・で回転されて28℃で恒温処理された800ml振盪フラスコで成長 された。C1株は、5ｇ/Lの様々な栄養素、ある場合には、2ｇ/Lの微結晶セルロー スを含む塩類ゲッチンソン(Getchlnson)培養液（表２参照）(ペーハー7.5)で成 長された。100ml培養液 が各フラスコに添加された。 グルコースと微結晶セルロース、デキストロースと微結晶セルロース、グリセ ロールと微結晶セルロース、ラクトースど微結晶セルロースの組み合わせは大変 低い成長、大きなマイセリウム凝集体の形成及びセルラーゼ活性の欠如(カルボ キシメチルセルラーゼ法)。その結果を表３に示す。窒素有機源、即ち、ペプト ン、トウモロコシを浸した酒又は酵母抽出物は成長とセルラーゼ生成を高めて、 マイセリウム凝集体をもたらさなかった。ラクトースと酵母抽出物はC1によって 最高のセルラーゼ生成を与えた。ラクトース及び酵母抽出物が25g/Lのテンサイ パルプ、15g/Lの大麦麦芽及び5g/Lの小麦糠に置きかえられると同様の結果が得 られた。 実施例５―小石洗浄試験用セルラーゼの生成 1. 振盪フラスコにおける生成 C1株は、220rpmで回転されて28℃で恒温処理 された800ml振盪フラスコで成長された。フラスコ毎の成長培養液100mlは、25g/ Lのテンサイパルプ、15g/Lの大麦麦芽及び5g/Lの小麦糠を含む塩類ゲッチンソン 培養液（表２参照）(ペーハー7.5)であった。細胞固形分は遠心分離され、固形 分なしの上澄は更なる試験のために乾燥されて保存された。C1セルラーゼ調製#s 47.1.1乃至47.15.1がこの方法で作られた。C1調製#47.16.1が同一の方法で作ら れたが、固形分なしの上澄は遠心分離後乾燥前に10kDaカットオフ膜を使用して 限外ろ過された。C1調製#47.18.1乃至47.22.1はゲッチンソン培養液により振盪 フラスコで同一の方法で作られたが、ラクトース（0.5%w/v）及びペプトン（0.5 %w/v）がテンサイパルプ、大麦麦芽及び小麦糠の代わりに含まれている。細胞固 形分は遠心分離され、固形分なしの上澄は更なる試験のために乾燥されて保存さ れた。調製#s 47.1000、47.1001、47.2000及び47.2001が、それらは他のクリソ スポリウム株を使用して生成された点を除いて、調製#47.1.1乃至47.15.1と同一 の方法によって振盪フラスコで作られた。特に、47.2001はクリソスポリウム・ パノラム、調製47.2000はクリソスポリウム・ブルノサム、調製47.1001はクリソ スポリウム・ケラチノフィラム、そして、調製47.1000はクリソスポリウム・ク イーンズランディカム（例８参照）により生成された。これらC1調製のタンパク 質含有量及び活性指紋を表４に示す。 2. ファーメンターの生成 C1セルラーゼが、ゲッチンソン培養液、ラクトー ス(0.5% w/v)、ペプトン（0.5% w/v）及びクロラムフェニコール（50mg/mL）で1 0-L「ANKUM-1M」 ファーメンターにおいて生成された。栄養培養液の初期容積は7.0Lで、発酵後の 最終容積は7.3Lであった。分解酸素濃度(DO)、攪拌速度、通気レベル、温度及び ペーハーが制御された。発酵はバッチモードで実行された。発酵温度は28℃に制 御された。初期ペーハーは7.5で、その後、NH₄OH（12% w/v）の添加によりその レベルで維持された。通気は４乃至５L/分で、攪拌は400乃至500であった。DOは 50%以上に維持された。８時間毎に分析用標本（30ml）が取られた。発酵終了時 に、菌バイオマスが遠心分離され(10,000g、室温、20分)、培養ろ液が更なる試 験のために乾燥されて保存された。結果を表５に示す。セルラーゼ調製#47.17.1 がこの方法で生成された。このC1調製のタンパク質含有量及び活性指紋は表４に 示す。 3. C1調製#47.0325及び47.0528の生成 C1セルラーゼ調製#47.0325は野生 型C1株を使用して生成さ札調製#47.0528は野生型C1株から得られた改良された変 異体を使用して生成された。これらの調製は、実施例13及び15に記載の条件の下 で成長されたファーメンターであった。調製47.0325はバッチ発酵法、47.0528は 給飼バッチ発酵法により生成された。4. ヒュミコラ野生型標品#14.22.1および14.23.1の調製 野生型ヒュミコラ・グリセア変異株サーモイディアの調製#14.22.1は、ATCC 1 6453株より調製し、野生型ヒュミコラ・インソレンス調製#14.23.1は、ATCC 164 54株から生成した。これらヒュミコラ野生型調製は、C1調製#47.1.1〜#47.15.1 の調製(振盪フラスコにおける生成)に関して上述されたのと同一の方法を使用し て振盪フラスコにおいて生成された。実施例6--C1と他の中性セルラーゼとの比較 C1酵素調製#47.0528のFPA、カルボキシメチルセルラーゼ活性及びエンドグル カナーゼ活性が、商業用のヒュミコラ・インソレンス(デニマックスXT)及び野生 ATCC型ヒュミコラ（調製#14.22.1ヒュミコラ・グリセア変異株サーモディア(ATC C 16453)及び14.23.1ヒュミコラ・インソレン(ATCC 16454)中性セルラーゼに比 較された。その結果を表６に示す。C-1 #47.0528の総活性は、野生型ヒュミコラ 由来又は商業用のヒュミコラ・インソレン調製由来のそれよりも明らかに高かっ た。C-1 47.0528の特定カルボキシメチルセルラーゼ及びエンドグルカナーゼ活 性（乾燥調製1ｇ当たり又はタンパク質1ｇ当たり単位数）は、表６に挙げた全て の試験ヒュミコラ調製よりも高かった。C-1 #47.0528の特定FPA活性はヒュミコ ラ野生型調製#14.22.1及び14.23の特定FPA活性よりも高く、ヒュミコラ・インソ レン商業製品デニマックスXTの特定FPA活性より僅かに低かった。C1セルラーゼ のペーハーと熱安定性はデニマックスXTと同様であった。 （^*）活性はpH5.0及び50℃で測定された。実施例7―ペーハーと温度のC1のFPA及びカルボキシメチルセルラーゼ活性の活性 と安定性に対する効果 C1のFPAとカルボキシメチルセルラーゼ活性は、約ペーハー６乃至７及び約50 乃至60℃で最適の安定性と活性を示した。カルボキシメチルセルラーゼ活性の最 適ペーハーは約6.5及び最適温度は約55℃であった(表８、９参照)。ペーハー8.0 (50℃)でカルボキシメチルセルラーゼは活性80%、FPAは活性78%を有し、ペーハ ー9.0(50℃)でカルボキシメチルセルラーゼは活性65%、FPAは活性52%有している (表７参照)。 FPA法に対する恒温時間は60分、カルボキシメチルセルラーゼ法の恒温時間は ５分であった。 FPA法の恒温時間は60分、カルボキシメチルセルラーゼ法の恒温時間は５分と した。 C1のカルボキシメチルセルラーゼは最適ペーハーと温度で高い安定性を示す。 例えば、ペーハー7.2及び50℃でカルボキシメチルセルラーゼは１時間後に95%、 ５時間後に75%の活性を有しており、ペーハー7.7及び50℃でカルボキシメチルセ ルラーゼは１時間後に 93%、５時間後に45%の活性を維持している(表９参照)。実施例８…クリソスポリウム同属の他の株の中性及び／又はアルカリ性セルラー ゼ活性／性能 クリソスポリウム属の様々な株のセルラーゼ生成試験が行われた。これらの株 の正式名と起源を以下に示す。 メリーランド州ロックビルのアメリカ型培養収集所(ATCC)由来の株は以下のも のを含んでいる。 1. ATCC 44006 クリソスポリウム・ラクノウェンス 2. ATCC 34151 クリソスポリウム・パノラム 3. ATCC 24782 クリソスポリウム・プルイノサム ロシア微生物収集所(VKM)由来の株は以下のものを含んでいる。 1. VKMF-2119 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 2. VKMF-2875 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 3. VKMF-2120 クリソスポリウム・ロバタム 4. VKMF-2121 クリソスポリウム・マーダリウム 5. VKMF-2116 クリソスポリウム・クイーンズランディカム 6. VKMF-2117 クリソスポリウム・クイーンズランディカム 7. VKMF-2877 クリソスポリウム・トロピカム 本研究では、２種類の成長培養液が使用された。即ち、培養液Ａは、圧搾テン サイ、大麦麦芽、小麦糠を含有するゲッチンソン培養液、培養液Ｂは、ペプトン とラクトースを含有するゲッチンソン培養液である。培養液の組成を表11に示す 。 各株は、振盪フラスコにおいて220rpm、28℃にて成長された。培地Ａで成長さ せた各株標本は、培養６日目および７日目に分析用に取り出した。また、培地Ｂ で生育させた各株標本は、培養５日目に分析用に取り出した。全標本がペーハー ５及び７でカルボキシメチルセルラーゼ活性に対して測定した。カルボキシメチ ルセルラーゼ測定結果を表12に示す。 ATCC 34151クリソスポリウム・パノラム、ATCC 24782クリソスポリウム・プリ ノサム、VKMF-2875クリソスポリウム・ケラチノフィラム、VKMF 2116クリソスポ リウム・クイーンズランディカムの各菌株の場合、細胞固形分を遠心分離され、 10kDaカットオフ膜を使用した限外濾過により固形分を含まない上澄を5リットル から0.5リットルまで濃縮した。その後、限外濾過後の濃縮液を試験用に乾燥し て保存した。 以下のセルラーゼの#s乾燥調整が使用された。 47.2001-ATCC 34151 クリソスポリウム・パノラム 47.2000-ATCC 24782 クリソスポリウム・プルイノサム 47.1001-VKMF-2875 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 47.1000-VKMF-2116 クリソスポリウム・クイーンズランディカム これらの調製のタンパク質含有率と活性指紋を表４に示す。実施例9―小石洗浄試験 A. 2-L特別洗濯機による試験 本システムは、ごく少量の酵素を用いた擦 り切れとバックステイニンングに関連した小石洗浄性能特性を評価する。 糊抜き デニム生地（ロール）(1.2kg)の布片40片(各30ｇ、25×20cm)につ いて、 布地：洗濯液比率を1:6(7.2リットル)とし、Sandoclean PC液(非イオン性洗浄濡 れ剤、エチルオキシ化脂肪族アルコール系、平均エチレンオキシド含量６モル)0 .5g/L(3.6ｇ)、Sirrix 2UD(酸性緩衝化金属イオン封鎖剤)1/L(7.2ｇ)、およびBa ctosol TK液（高温安定型α−アミラーゼ）1/L(7.2ｇ)を使用し、pH約5〜6、60 ℃、20分間の条件下、家庭用洗濯機で糊抜きを行った。20分後、洗濯液を脱水し 、液量比1:10にて冷水(14リットル)で5分間すすいだ。続いて、布片を40℃で乾 燥させ、セルラーゼ活性測定用の比較標本として保管した。 布片のセルラーゼ処理は、内側槽の内径29cm、総容積10.6リットル(ドラム回 転数20rpm、左回りに５周、右回りに５周)の洗濯機を用いて行った。各布片は、 セルラーゼ処理を行う前に４本のゴム製ストッパーで縫い合わせて１個の衣類パ ッケージの形態とし、機械的作用が主として衣類の色の濃い外側面に及ぼされる ようにした。各ドラムにはパッケージ１個とゴム製ストッパー10個ずつを投入し た。 一般洗濯条件は、糊抜きジーンズ生地30ｇと0.02Mクエン酸緩衝液に溶解した セルラーゼを使用し、50℃、60分間、衣類：洗濯液＝1:4とした。セルラーゼ処 理を終了後、パッケージを温水(50℃)で５分間すすぎ(衣類：水＝1:20)、乾燥し て評価用標本とした。 種々のC1セルラーゼ調製の他、クリソスポリウム属の様々な菌株から調製され たセルラーゼ調製、並びに、ノボ・ノルディスク社から市販されている中性セル ラーゼ製品デニマックスXT（米国特許第4,4,35,307号）及びUltra MG（WPO 91/1 7243）を用いて、アプリケーション試験を行った。これらのアプリケーション試 験では、C-1その他のクリソスポリウム・セルラーゼの小石洗浄性能をノボ社の 市販中性セルラーゼと比較した。試験は、中性及びアルカリペーハー域（6.5，6 .7，7.0及び8.0）で行った。結果を表13に示す。種々のC1及びその他のクリソス ポリウム・セルラーゼ調製で処理された衣類の洗濯性能特性は、市販中性セルラ ーゼデニマックスXTおよびデニマックスUltra MGによる衣類のそれと同等であっ た。C1、および他のクリソスポリウム・セルラーゼ調製は、中性及びアル カリペーハー条件下で使用した場合、良好な柔軟化効果、漂白／黒ずみ低減効果 、擦り切れ具合を示し、しかもバックステインニングが少なかった。標本の明度 (光反射率)を調べるデータカラー測定を行った。標本に白色光（2パルス型キセ ノンフラッシュランプ)を照射し、16個のダイオードを用いて400乃至700nmの波 長域で反射光を測定した。表側の面からの反射光強度は擦り切れ具合が大きいほ ど高い値となった。また、裏面からの反射光強度はバックステインニングが増す ほど高い値となった。 B. 35 ポンド容量洗濯機による実験 35ポンド容量洗濯機（ミルナー社製、 洗濯槽回転数30RPM）を用いて応用実験を行った。使用衣類はリーバイス社製505 ジーンズとし、投入量は2400g（3着）とした。セルラーゼ洗濯槽の水位は、液量 比を6.25:1（低濃度）とした場合は15リットルとし、それ以外の液量比10:1（中 濃度）とした場合は、洗濯槽の水位をいずれも24リットルとした。MAP（リン酸 一アンモニウム）−DAP（リン酸二アンモニウム）系緩衝液を使用し、セルラー ゼ洗濯槽のpHを6.7に維持した。実験4,5,6及び7ではセルラーゼ洗濯槽に非イオ ン性界面活性剤を添加した。セルラーゼ槽に洗剤を添加すると衣類のバックステ インニングを低減できることが知られている。Zekeは糊抜き剤である。SSCEは、 非イオン性界面活性剤の一種、Super Scourである（ZekeとSuper Scourは共に、 CPN Intcrnational社（フロリダリ刊ジュピター）から市販されている特殊生地 処理剤)。これらの実験における洗濯手順の一例を、下記の実験２に示す。 上の例及び商業的利用において、小石洗浄加工に軽石は衣類の小石洗浄効果全 体を高めることを当業者は理解するであろう。 表14の結果より、C1セルラーゼ調製#47.0325及び#47.0528は、衣類の全体的擦 り切れレベルが良好であり、またバックステイニングレベルの範囲は他の市販中 性セルラーゼ製品を用いた場合と同様であることがわかった。 表14の図の説明 表14に示した実験ではいずれも、Super Scourを濃度1.0% OWGで用い、160Fで５分間、洗濯を行った。SB＝自己緩衝化−市販品"ROCKSOFT"B TV 202-318には、本品の小石洗浄性能を高める洗剤デニマックスXT、緩衝液系そ の他の添加剤が含まれている。 C. 60リットル容量大型洗濯機による試験 ２リットル容量の洗濯機による 試験と同様に、デニム製衣類全体の糊抜きを行った。各試験では、ブルージーン ズ１着(700ｇ)と洗濯液2.8リットル(衣類：洗濯液＝1:4)を使用した。ジーンズ はいずれも、同一染色ロット品である。各ジーンズについては、酸化法による予 備洗浄を15分間行い、乾燥させた。C1セルラーゼ標品47.0325は実験１回につき2 .4ｇを使用し、C1セルラーゼ標品47.0528は第１の実験では1.5ｇ、第２の実験で は1.0ｇをそれぞれ使用した。これらの実験結果を、実験１回につき12ｇのデニ マックスXT、あるいは、他の市販中性セルラーゼ２種類を使用して同様の手順で 中性pH域で洗濯したジーンズど直接比較した。ここで使用した市販中性セルラー ゼは、Bactosol JE(使用量2.0% OWG)およびBTU 202-318（使用量2.0% OWG）であ る(Bactosol JEとBTU 202-318は、デニマックスXT、緩衝剤、洗剤その他の添加 剤を含有し、洗浄性能が強化されている)。表15の結果は、３種類のいずれのC-1 実験で得られたブルージーンズも、最終的な擦り切れ具合と全体的な色褪せ具合 において、従来の 市販中性セルラーゼ３種類による処理品よりも優れていることを示している。６ 種類の実験すべてにおいて、ブルージーンズのバックステインニングレベルは非 常に良好、かつ互いに似通っており、また、ノボ社製の中性セルラーゼデニマッ クスXTの使用時にもよく似ていた。これら３種類のC-1実験におけるバックステ インニング値は、表13に示したバックステインニング値の範囲内であった。これ らの実験、および条件を調節した表14に示す実験で仕上げられた衣類について、 各グループ３人以上の人数から成る独立した４グループが目隠し試験による評価 を行った。各グルーブのメンバーは、いずれも小石洗浄の当業者である。各メン バーには、(1)全体的な擦切れ具合と色褪せが最も大きいものから小さくなる順 に、また、(2)再付着の最も少ないものから多くなる順に、これらの衣類を並べ るよう指示を出した(表15参照)。 表15の説明 擦切れ／色褪せ − ++++++(+6)最大（++++(4)以上を良好と見なし、市販の中 性セルラーゼ(デニマックスXT等)と同等であった） バックステインニング − 数値が低いほど良好(どのジーンズのバックステイ ンニングレベルも、ノボ社製のデニマックスTX使用時と同等と判定された)。中 性セルラーゼを使用することにより、Trhchodermaのような従来の酸比セルラー ゼに比べ、バックステインニングをかなり低減するこどができた(実施例13参照) 。 %OWG − 衣類重量に対する割合(%)。例えば、乾燥重量100ポンドのジーンズに 対して1% OWGとは、酵素使用量が１ポンドであることを意味する。 D. 光反射率 バックステインニングの別の試験法として、処理済み衣類の 光反射率測定を行った。洗濯終了時に、反射計を用いて２種類の波長でジーンズ の標本を分析した。(1)680nmにおける検出信号強度（ジーンズの外側で測定）が 高いほど、バックステインニングは少なく、(2)420nmにおける検出信号強度（ジ ーンズの内側で測定）が高いほど、バックステインニングは少なかった。表16に 、ノボ・ノルディスク社製及びジェネコー・インクーナショナル社製の各市販セ ルラーゼと、C1標品#47.6.1とをそれぞれ用いて処理されたデニム地ジーンズの 光反射率の値を比較して示す。 C1セルラーゼ使用時の光反射率の値は、680nm，420nmのいずれの波長において も、ノボ・ノルディスク社製の中性セルラーゼ・デニマックスL使用時の値と同 等であった。また、C1セルラーゼ使用時の光反射率の値は、680nm，420nmのいず れの波長においても、ジェネンカー社製の酸性セルラーゼプリマファスト100使 用時の値に比べてかなり優れていた。 E. 準工業洗濯機の試験 試験#1 ２ジーンズ、重量1343gr 水比６：１ ペーハー5.5 温度54℃ 酵素：C1（調製#47.6.1）12gr （0.9%） 研磨時間90分 ドロップバス 66℃で非イオン洗剤でリンス５分 ドロップバス 冷リンス ドロップバス 49℃でカチオン柔軟剤で５分柔軟 取出し及び乾燥 試験#2 酵素としてデニマックス700T(2% OWFG，28.9ｇ)を用い、洗濯条件 をpH7.0，54℃とした以外は、試験#1に同じ。 C1セルラーゼを、ノボ社製の市販中性セルラーゼデニマックス700Tと比較した 。ジーンズはいずれも同一染色ロット品であり、酸化法により15分間の予備洗浄 を行った後、乾燥させた。 C1セルラーゼ標品#47.6.1による処理ジーンズは、デニマックス700Tによる処 理ジーンズに比べ、擦切れ具合はやや少ないものの、バックステインニングは低 減されていた。実施例10--洗濯用洗剤添加剤としてのC1セルラーゼ A. 綿生地の汚れ落とし C1セルラーゼ標品#47.6.1の洗濯性能を、洗濯性能試験法PW 09406(Solvay)に したがって試験した。綿生地の汚れ（インク）落ちを、デルタ反射率(%)で調べ た。アルカリプロテアーゼOpticlean L500の存在下および非存在下における洗濯 試験により、C1セルラーゼ標品(#47.6.1)とノボ・ノルディスク社製のセルジメ( Celluzyme)0.7Tを比較した。試験結果を表17に示す。 有色洗剤の形でC1セルラーゼを綿生地のインク汚れ落としに用いると、中性pH 域において、ヒュミコラ・インソレンスから得られたセルラーゼ酵素に似た汚れ 落とし効果を発揮した。 B. セリンプロテアーゼとの併用によるC1セルラーゼの安定性 セリンプロテアーゼとして、トリプシン(3.2μM，ウシ膵臓由来、活性10,000- 30,000N-ベンジル-L-アルギニンエチルエステル(BAEE)，Sigma社製T-8253)、お よびα-キモトリプシン(8μM，ウシ肝臓由来、40-60U/mg，Sigma社製C-4129)を 使用した。 プロテアーゼをC1セルラーゼと共に20℃、pH7.0でインキュベートした。キモ トリプシンは、C1セルラーゼの活性を12時間にわたって低下させなかったが、ト リプシンはC1活性をわずかに減少（約20%）させた。表18を参照。 トリプシンとキモトリプシンは、pH4.5から7.0の範囲内、および50℃から57℃ の範囲内でC1カルボキシメチルセルラーゼ活性を大幅に変化させることはなかっ た。表18を参照。 C. クエン酸、EDTA、Tween-80および過硫酸のカルボキシメチルセルラーゼ活 性に及ぼす影響 酢酸からクエン酸緩衝剤（キレート剤）に変更しても、C1のカルボキシメチル セルラーゼ活性（緩衝液のモル濃度0.1M，pH4.5，50℃および57℃）に影響は現 れなかった。表19を参照。 キレート剤であるEDTA（エチレンジアミン四酢酸）(5mM)は、pH4.5，50℃にお いて、カルボキシメチルセルラーゼ活性に影響を与えなかったが、pH4.5(57℃) およびpH7.0(50℃)では、カルボキシメチルセルラーゼ活性が僅かに低下した。 表19を参照。 非イオン性界面活性剤Tween-80(3g/L，ポリオキシエチレンソルビタンモノオ レエート)は、C1のカルボキシメチルセルラーゼ活性（pH4.5および7.0、50℃お よび57℃）に影響を与えなかった。表19を参照。 酸化剤である過硫酸（3g/L）は、C1のカルボキシメチルセルラーゼ活性（pH4. 5および7.0、50℃および57℃）に影響を与えなかった。表19を参照。 従って、C1のカルボキシメチルセルラーゼ活性は、セリンプロテアーゼ(トリ プシン及びキモトリプシン)、キレート剤(EDTA、クエン酸)、非イオン性界面活 性剤(Tween-80)および酸化剤（過硫酸）に耐性を有する。 実施例11--クリソスポリウムの異なる株に由来するセルラーゼ標品を用いた小石 洗浄試験 クリソスポリウムの異なる株に由来するセルラーゼ標品#47.1000，47.1001，4 7.2001と２リットル容の専用洗濯機を用い、pH6.5、50℃、60分間の条件で、135 ｇの糊抜きデニム地ジーンズ生地の洗濯試験を行った。各実験ごとのカルボキシ メチルセルラーゼ活性の合計値は、336U/回で一定とした。 乾燥後、衣類の擦切れ具合とバックステインニングをデータカラー測定により 評価した。結果を表20に示す。この結果から、擦切れ具合とバックステインニン グでみた洗濯性能は、中性pH域においては、クリソスポリウムの異なる菌株から 産生されたセルラーゼも、クリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ1966のC- 1株から産生されたセルラーゼも、同等であることがわかった。 実施例12--セルラーゼ組成物の精製 1. 精製用C1標品の選択 C1セルラーゼ標品#47.11.1を精製用に選択した。 その根拠は、47.11.1が(i)タンパク含有量が多く、(ii)FPAおよびカルボキシメ チルセルラーゼ活性が高いからである(表４参照)。 2. C1複合成分の単離と精製 最初の精製段階では、DEAE-Toyopearlカラム (TosoHaas社製、日本)を用いたイオン交換クロマトグラフィーを行った。即ち、 C1セルラーゼの乾燥標品(1.5ｇ)を15mlの0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)に 溶解した。この溶液を遠心分離し、上清をAcrylex P-2カラムで脱塩した。脱塩 後の標本を0.03Mリン酸緩衝液中(pH4.7)でDEAE-Toyopearlカラム(1.5×30cm)に 載せ、続いて0〜0.2M NaCl水溶液を流速１ml/分にて流し、吸着されたタンパク の濃度勾配溶出を行った。３種類の画分を採取した。非結合(NB)画分は最初の緩 衝液で溶出され、画分ＩとIIは0〜0.2M NaCl濃度勾配にしたがって溶出された。 セルロース分解活性は、どの画分にもみられた。 3. タンパク画分のSDS-PAGE 硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った結果、NB画分には分子量30〜70kDのタンパク 、画分Ｉには分子量25〜100kDのタンパク、画分IIには分子量35〜100kDのタンパ タが含まれていることがわかった。SDS-PAGEは、変性条件下で10％濃度の分離用 ゲル(100×80×0.75mm)を用いて行った。試薬とキットは、Bio-Rad社（米国）か ら入手した。タンパク染色には、25%トリクロロ酢酸に溶解したクーマシー・ブ リリアント・ブルーR-250を使用した。 4. タンパク画分のIEF 等電収束(IEF)を行った結果、NB画分には等電点(pI) が4.6〜 8.0のタンパク、画分ＩにはpIが3.2〜5.5のタンパク、画分IIにはpIが3.0〜5.5 のタンパクが含まれていることがわかった。等電収束は、7% PAAGの存在下、min i-IEF Model 111(Bio-Rad社製)を用いて行った。試薬とキットは、Bio-Rad社（ 米国）から入手した。タンパク染色には、25%トリクロロ酢酸に溶解したクーマ シー・ブリリアント・ブルーR-250を使用した。 5. タンパク画分のカルボキシメチルセルラーゼ活性のpH依存性 C1セルラ ーゼの画分NB、IおよびIIのカルボキシメチルセルラーゼ活性とRBBカルボキシメ チルセルラーゼ活性のpH依存住を、表21に示す。使用した緩衝液系は、酢酸緩衝 液(pH4-5)、リン酸緩衝液(pH6-8)、および炭酸緩衝液(pH8.5-10)である。この他 、酢酸、ホウ酸、リン酸から成るユニバーサル緩衝液系(pH4-10)も使用した。 DEAE-Toyopearlイオン交換クロマトグラフィー後の画分NB、I、IIのカルボキ シメチルセルラーゼ活性およびRBB-カルボキシメチルセルラーゼは、非対称な釣 鐘型のpHプロファイルを示した。画分NBのカルボキシメチルセルラーゼ活性はpH 4.5-5.5で最大となり、pH8.0でも最大活性の50%が維持されていた。画分NBのRBB -カルボキシメチルセルラーゼ活性はpH5.0-6.0で最大となり、pH8.0でも最大活 性の50%が維持されていた。画分Ｉのカルボキシメチルセルラーゼ活性はpH5.0-6 .0で最大となり、pH8.5でも最大活性の50%が維持されていた。画分ＩのRBB-カル ボキシメチルセルラーゼ活性はpH4.5-7.0で最大となり、pH8.5でも最大活性の50 %が維持されていた。画分IIのカルボキシメチルセルラーゼ活性はpH4.0-5.5で最 大となり、pH8.5でも最大活性の50%が維持されていた。更に、画分IIのRBB-カル ボキシメチルセルラーゼ活性はpH4.5-7.5で最大となり、pH8.5でも最大活性の50 %が維持されていた。 6. タンパク画分Ｉのカルボキシメチルセルラーゼ活性の安定性（DEAE-Toyop earlイオン交換クロマトグラフィー後） DEAE-Toyopearlイオン交換クロマトグラフィー後、画分Ｉの一時的なカルボキ シメチルセルラーゼ活性曲線を異なるpH(5.2-8.7)下、50℃で測定した結果を表2 2に示す。画分Ｉ のカルボキシメチルセルラーゼ活性は、pH5.2-7.2で最も安定であった(但し、３ 時間経過以降は活性が約30〜45%失われる)。pH7.7では約１時間後に60%の活性が 失われ、pH8.3およびpH8.7では0.5時間後に50%の活性が失われた。pH8.3では、 カルボキシメチルセルラーゼ活性が３時間後に100%消失し、pH8.7では２時間後 に100%消失した。 7. DEAE-Toyopearlカラムによるイオン交換クロマトグラフィー後の各画分の 特性 Avicel（微結晶セルロース）を基質に用いた吸着試験を行った結果、画分Ｉと IIは結晶性基質に結合しなかったが、画分NBはAvicelに結合し、その時の分布係 数は0.2L/gであった。色々な基質に対する画分NB、I、IIの特異的活性を表23に 示す。これら３つの画分はいずれも、カルボキシメチルセルラーゼ、エンドグル カナーゼ、アヴィセラーゼ、β−グルカナーゼ、キシラナーゼの各活性を有して いたが、画分NBだけは画分ＩおよびIIとは異なり、β−グルカナーゼ活性を有し ていなかった。画分NB、I、IIのマイクロデニム洗濯試験を行ったところ、画分 ＩとIIはpH7で同程度の活性を有していたが、画分NBの活性はより低かった(マイ クロデニム洗濯試験による)。 8. マイクロデニム洗濯試験 この試験は、所定レベルのカルボキシメチル セルラーゼ活性を有する緩衝化酵素溶液20mlを用いて行った。純正藍染めデニム 地の布片に対し、50℃で60分間、過剰な機械的ストレス（摩擦）を与えながら処 理を行った。セルラーゼの洗濯性能は、標本乾燥後の退色にもとづく得点方式で 評価した。色彩測定器やソフトウェアを利用してもよい。“＋”以上の値が、良 好な擦切れ具合を示す。 9. DEAE-Toyopearlイオン交換クロマトグラフィーの溶出タンパク画分Ｉの更 なる精製 脱塩した画分Ｉ（25ml，タンパク含量0.8g/l）のMaro Prep Qクロマトグラフィ ーを行った。MacroPrep Qカラム(1.5×10cm)は0.03M酢酸緩衝液(pH4.7)を用いて 平衡化し、吸着されたタンパクは0〜0.1M NaClを用いた濃度勾配溶出により溶出 させ、画分I.1、I.2、I.3を得た。pH7におけるマイクロデニム洗濯活性は、画分 I.2が最も高く、画分I.3が最も低かった。SDS-PAGEを行ったところ、画分I.2に みられた低分子量タンパク(25kD)が、画分I.1にはみられなかった。これが、小 石洗浄活性に関連していると考えられる。IEFによると、画分I.1のpIは4.2であ ったが、画分I.1とI.3はタンパク含量が低過ぎ、これ以上の検討は困難であった 。そこで、以降の精製には画分I.2を使用した。 次の精製段階では、Mono Pカラムを使用した。画分I.2を0.03Mイミダゾール緩 衝液(pH6.8)で平衡化し、カラムに流した。吸着されたタンバクをpH4.0のPolybu ffer 74(1:8)を用いて溶出したところ、タンパク含量プロファイルと活性プロフ ァイルに２個の主ピークが認められた。ピークＡと名付けた最初のピークのカル ボキシメチルセルラーゼ活性(2.5ユニット/mg)は、ピークＢの同活性（3.6ユニ ット/mg）に比べて低かった。非変性 条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、ピータＡにはタンパ クのバンドが２本認められ、コンゴー・レッドを用いた染色により、分子量の高 い方のバンドにカルボキシメチルセルラーゼに対する活性が存在することがわか った。ピークＢには、非変性条件下でタンパクのバンドが１本認められた。SDS- PAGEを行ったところ、ピークＡには主バンドに該当するタンパクが２種類（60kD と70kD）があり、ピークＢには主バンドに該当するタンパクが１種類（25kD）と 、小バンドに該当するタンパクが１種類(27kD)あることがわかった。ピークＢか ら回収された画分を25kD-endoC1と命名し、以降の検討に用いた。表24に、色々 な基質に対する25kD-endoC1の特異的活性を示す。25kD-endoC1は、カルボキシメ チルセルラーゼ活性、RBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性、エンドグルカナー セ活性、FPA活性、アヴィセラーゼ活性、β−グルカナーゼ活性、キシラナーゼ 活性を示したが、β−グルコシダーゼ活性は示さなかった。このように様々な活 性を併せ持つことから、25kD-endoC1はエンドグルカナーゼの一種である。カル ボキシメチルセルラーゼ活性とRBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性の最適pHは 、約6.0である(表24)。25kD-endoC1は、高い小石洗浄活性を有していた（木綿の 布片を用いたマイクロデニム洗濯試験による）(表24参照)。 Mono PカラムからピークＡを溶出する間、多数の画分が回収された。これらの 画分は、60kDと70kDのタンパクの含量比が異なっており、特に、60kDタンパクが 優勢な画分70(60)kD-C1と、70kDタンパクが優勢な画分70kD-cndoC1の含量比が異 なる。色々な基質に対するこれらの画分の特異的活性を、表24に示す。この表か ら明らかなように、画分70kD-endoC1(エンドグルカナーゼ活性2.8U/mg、アヴィ セラーゼ活性0.18U/mg）に比べ、画分70(60)kD-C1は特異的エンドグルカナーゼ 活性が低く(0.5U/mg)、特異的アヴィセラーゼ活性が高かった(0.31U/mg)が、β −グルコシダーゼ活性は極めて低かった。FP、β−グルカンおよびキシランに対 する画分70(60)kD-C1の特異的活性は低く(表24参照)、アヴィセルの加水分解生 成物として唯一セロビオースが生成した。画分70(60)kD-C1の小石 洗浄活性（木綿布片を用いたマイクロデニム洗濯試験による）は低かった(表24 参照)。これらのデータより、DEAE-Toyopcarlを用いたイオン交換クロマトグラ フィーで得られた画分Ｉに由来する60kDタンパクは、セロビオヒドロラーゼであ ると考えられる。画分70(60)kD-C1の最適pHカルボキシメチルセルロースおよびR BB-カルボキシメチルセルロースに対して)は、約5.0であった(表24参照)。 70kD-endoC1は高いカルボキシメチルセルラーゼ活性、RBB-カルボキシメチル セルラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、FPA活性、β−グルカナーゼ活性お よびキシラナーゼ活性を示し、この他に若干のアヴィセラーゼ活性とβ−グルカ ナーゼ活性を示した(表24参照)。70kD-endoC1は、小石洗浄活性（木綿布片を用 いたマイクロデニム洗濯試験による）も示した(表24参照)。DEAE-Toyopearlを用 いたイオン交換クロマトグラフィーで得られた画分Ｉに由来する70KD-endoC1タ ンパクは、エンドグルカナーゼであると考えられる。表24から明らかなように、 画分70kD-endoC1のカルボキシメチルセルラーゼ活性およびRBB-カルボキシメチ ルセルラーゼ活性の最適pHは、約6.0であった。 10 ．DEAE-Toyopcarlイオン交換クロマトグラフィーの溶出タンパク画分IIの更 なる精製 DEAEクロマトグラフィーで得られた画分IIを、DEAE-Toyopearlカラム 上で0〜0.2M NaClを用いたより長時間（8時間以上）にわたる濃度勾配溶出によ り、更に３つの画分に分けた(画分II.1，II.2、II.3)。SDS-PAGEを行った結果、 画分II.1には分子量60kDと100kDのタンパクの主バンドが２本あり、画分II.2に は分子量35kD、60kDおよび100kDのタンパクの主バンドが３本あり、さらに、画 分II.3には分子量43kDと60kDのタンパクの主バンドが２本あった。画分II.3は、 カルボキシメチルセルラーゼ活性が最も高かった（10ユニット/mgタンパク）が 、洗濯活性（サブマイクロ洗濯試験による）は低く、またカルボキシメチルセル ラーゼ活性は１ユニット/mgであった。画分II.2は、洗濯活性を示さなかった(但 し、カルボキシメチルセルラーゼ活性は0.7ユニット/mgであった)。そこで、画 分II.1とII.3を更に精製することにした。 11 ．サブマイクロデニム洗濯試験 この試験では、純正藍染めデニムの布片に 対し、 ２mlの緩衝化酵素溶中、50℃で60分間、過剰な機械的ストレス（摩擦）を与えた 。セルラーゼの洗濯性能は、標本乾燥後の退色にもとづく得点方式で評価した。 12 ．画分II.1の精製 0.03M酢酸緩衝液(pH4.75)を用いて平衡化したMacro P rep Qカラムに、画分II.2を流し、吸着されたタンパクをNaCl濃度勾配溶出（0〜 0.3M）により溶出した。タンパクのピークは２つ現れたが、最初のピークにのみ カルボキシメチルセルラーゼ活性が認められた。最初のピークに由来する材料の SDS-PAGEを行ったところ、分子量60kDと100kDのタンパクが均一な状態で単離さ れた。IEFにより、60kDタンパクと100kDタンパクは、いずれも酸性域に約３のpI を示すことがわかった。色々な基質に対する60kDタンパクと100kDタンパクの活 性を表24に示す。60kDタンパクを、60kD(II.1)-endoC1と表記する。このタンパ クは、pH5において、エンドグルカナーゼ活性、カルボキシメチルセルラーゼ活 性、RBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性、FPA活性、β−グルカナーゼ活性を 示した(それぞれ0.2，0.7，0.9，0.3および1.3ユニット/mg、表24参照)。アヴィ セラーゼ活性、β−グルコシダーゼ活性およびキシラナーゼ活性は、かなり低か った。このように様々な活性を併せ持つことから、60kD(II.1)-endoC1はエンド グルカナーゼの一種であることがわかる。60kD(II.1)-endoC1はまた、pH5とpH7 のいずれにおいても高い小石洗浄活性（サブマイクロデニム洗濯試験による）を 示した(表24参照)。このタンパクのカルボキシメチルセルラーゼ活性とRBB-カル ボキシメチルセルラーゼ活性のpH依存性を調べたところ、pH4.0-4.5で最大とな り、pH6においてもカルボキシメチルセルロースに対する最大活性の50%、および RBB-カルボキシメチルセルロースに対する最大活性の85%が維持され、更に、pH9 および10においても、これら両最大活性の20%が維持されていた(表25参照)。 画分II.2から得られた100kDタンパクを、100kD(II.1)と表記する。このタンパ クは、セルラーゼ活性を殆ど示さなかった(表24)。わずかにカルボキシメチルセ ルラーゼ活性(0.3U/mg)とキシリナーゼ活性(0.008U/mg)を示したが、セルロース 分解性酵素と同定す るには至らなかった。サブマイクロ洗濯試験を行ったところ、100kD(II.1)タン パクは小石洗浄活性を示さず(表24)、また、pH5と７のいずれにおいても何らプ ロテアーゼ活性を示さなかった。 13 ．画分II.3の精製 画分II.3も、Macro Prep Qカラムを用いて精製した。 吸着されたタンパクは、0.2〜0.6M NaClを用いた濃度勾配溶出により溶出した( 開始緩衝液は、0.03M酢酸緩衝液、pH4.75)。Macro Prep Qクロマトグラフィーで 得られた画分のSDS-PAGEを行ったところ、分子量43kDと60kDのタンパクが均一な 状態で単離された。IEFにより、43kDタンパクと60kDタンパクのpIは、いずれも 約３であることがわかった。これら43kDタンパクと60kDタンパクを、それぞれ43 kD(II.3)-endoC1、6OkD(II.3)-endoC1と表記する。色々な基質に対するこれら両 タンパクの活性(表24参照)を調べたところ、いずれも同程度の特異的カルボキシ メチルセルラーゼ活性、FPA活性、アヴィセラーゼ活性およびキシラナーゼ活性 を有することがわかった。RBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性、エンドグルカ ナーゼ活性およびFPA活性については、60kD(II.3)-endoC1の方が高かった(表24) 。また、43kD(II.3)-endoC1と60kD(II.3)-endoC1のいずれも、pH5における小石 洗浄活性（サブマイクロデニム洗濯試験による）が非常に低いことも特筆される 。しかし、pH7における小石洗浄活性については、43kD(II.3)-endoC1も60kD(II. 3)-endoC1も顕著であり、43kD(II.3)-endoC1の方が60kD(II.3)-endoC1に比べて 高い活性を有していた。表25に示したpH依存性より、43kD(II.3)-endoC1はカル ボキシメチルセルラーゼ活性およびRBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性に関し て最適pH範囲が広い(pH4.5〜8)ことがわかる。43kD(II.3)-endoC1は、pH9におい ても最大カルボキシメチルセルロース活性の50%、最大RBB-カルボキシメチルセ ルロース活性の70%を維持しており、更に、pH10においても、これら両最大活性 の20%を維持していた。これとは対照的に、60kD(II.3)-endoC1はカルボキシメチ ルセルロースに対する最適pH範囲がpH4〜4.5と狭かったが、RBB-カルボキシメチ ルセルロースに対する最適pH範囲は広く(pH4〜8)、pH9 においても最大RBB-カルボキシメチルセルラーゼ活性の30%を維持していた。 ここで開示したタンパクはいずれも、分子量をゲル電気泳動法（特にSDS-PAGE ）により決定しており、この方法では分子量既知の標準タンパクをリファレンス に用いている。この種の方法すべてについて言えることであるが、得られた数値 は近似的なものであり、別の人物が別の標準タンパクの一揃いをリファレンスに 用い、別の異なるゲルで電気泳動を行えば、結果が若干ばらつく可能性はある。 このように完全精製、または一部精製された酵素標品は、洗剤、生地柔軟剤、 毛羽除去剤、増白剤、小石洗浄用の各組成物の成分として非常に有用である。よ って、本発明によれば、上述の単離精製された酵素標品をこれらの用途に有効に 用いることができる。また、これまで述べてきた小石洗浄、生地柔軟化、毛羽除 去、増白、洗浄の各方法に加え、これらを達成するための公知の方法においても 、上記の完全精製酵素標品、一部精製酵素標品、あるいはこれらを含む組成物を 、上記の方法の目的を達成するための主成分または添加剤として容易に適用する ことができる。これらの用途における他の異なる完全精製酵素標品や一部精製酵 素標品の応用については公知であり、多くの酵素が実用化されている。 上述の中性および／またはアルカリ性セルラーゼの活性は、活性測定に用いる 基質の化学構造や活性測定の独自の分析手法に応じて変化し得ると理解すべきで ある。つまり、完全精製または一部精製された中性および／またはアルカリ性セ ルラーゼは、分析手法や使用基質によってpH／活性プロファイルが変化する。本 実施例の方法により調製された実質純粋なセルラーゼの活性や比質に関する混乱 を避けるために、以下、完全精製画分のセルラーゼに関して測定された活性や性 質についてのみ述べることとする。 ここで調製された完全精製または一部精製酵素標品は、適当な基質を使用した 際に、エンドグルカナーゼ活性および／またはセロビオヒドロラーゼ活性を示し た。また、エンドグルカナーゼ活性を示した酵素標品はすべて、pIが約3〜約4.5 の範囲にあった。より具体的には、これらの画分には下記のような分子量とpI値 を有するセルラーゼ(エンドグルカナーゼ)が含まれていた。即ち、分子量約25kD (pI約4.0)、分子量約70kD(pI約4.2)、分子量約60kD(pI約3.0)、および分子量約4 3kD(pI約3.1)である。これらのセルラーゼ画分には、セロビオヒドロラーゼ活性 を有するタンパクも含まれていた。より具体的には、後者のタンパクの分子量は 約60kD、pIは約4.2であった。 本発明の組成物と精製酵素を用いる方法については、多数の特許公報も含め、 過去の文献に開示されており、ここではその開示内容を引用する。Clarkson(米 国特許第5,290,474号)の特許には、セルラーゼ酵素、あるいは界面活性剤その他 の添加剤を加えたセルラーゼ酵素含有組成物を、水性洗濯料、洗剤組成物、色持 ちおよび／または色回復改善剤に使用したり、あるいは特に綿混紡生地の柔軟住 や風合いの改善剤として使用することが開示されている。本発明のセルラーゼ酵 素およびセルラーゼ含有組成物も、同様の用途を想定しており、個々の説明は、 全てではないにしても、幾多の引用文献に記載されている。さらに、ざらつき低 減や生地柔軟化といった用途におけるセルラーゼ酵素および組成物の有用性につ いては、Barbesgaardら(米国特許第4,435,307号)が既に提案している。この特許 には、アルカリpH域における菌産生セルラーゼ(但し、クリソスポリウム属に由 来するものではない)の使用が開示されている。また、本発明に係る新規なセル ラーゼおよびセルラーゼ組成物と併用した様々な添加剤についても言及され、ざ らつき低減または生地柔軟化と洗濯とが１回の操作で可能となることが開示され ている。本発明のセルラーゼ酵素およびセルラーゼ含有組成物も同様に有用であ り、これらの用途に関するBarbesgaardの言及は本発明にも当てはまる。さらに 、本発明の新規なセルラーゼおよびセルラーゼ含有組成物とは異なるセルラーゼ およびセルラーゼ含有組成物を増白に応用した例が、Boegh(欧州特許第EP 0 220 016号)に開示されており、その記述も本発明に本質的に当てはまる。 勿論、本発明の新規なセルラーゼ酵素およびセルラーゼ含有組成物が、以前の 参照文献に開示された用途と同じ用途において有用であることは当業者にとって 自明であり、これらの応用例についてさらに詳述するまでもない。しかし、これ ら完全精製または一部精製酵素標品、および酵素含有組成物は、紙・パルプ材料 のインク抜きやバイオ漂白にも有用であり、これらを実施する方法についても、 本明細書の記載から当業者にとって自明である。 実施例13--60リットル容バッチ発酵槽を用いたC-1セルラーゼの生産 1. 接種材料の調製 バッチ発酵用の接種材料または発端培養物は、下記のように調製した。先ず、 C-1胞子培養液１mlを２個のフラスコの各々に接種し、計2.0リットルの接種材料 を調製する。発端培養物は、150rpmにて30℃で56時間、インキュベートした。移植調整培養液 2. 60 リットル容バッチ発酵槽を用いたセルラーゼの生産(47.0325の調製) 震盪フラスコで調製された２リットルの上記培養物を、60リットル容発酵槽内 で40リットルの培地に接種した。発酵用培地の組成は、下記の通りである。発酵培養液* 発酵用培地へ接種を行った後、pHをNH₃を用いて6.9より高く保ち、H₂SO₄を用 いて7.1より低く保った。発酵槽に振動を与えながら、また必要に応じて溶存酸 素量を飽和量の30%より高く保つための曝気を行いながら、64時間のインキュベ ーションを行った。 3. セルラーゼ活性の回収 ブフナー漏斗にWhatman54濾紙、および濾材として10g/LのCelite 503を装填し 、発酵培養物中の懸濁固形物を濾過により取り除いた。濾液を集め、10,000MWカ ットオフ型中空繊維フィルターを用いた限外濾過を行ってセルラーゼを濃縮した 。濃縮液を凍結乾燥した。乾燥濃縮物を、セルラーゼ標品47.0325と命名した。 この標品の活性を、表４に示す。実施例14…C-1の変異株を発生させるための変異手順 C1株の胞子形成培養物を含むPridham寒天プレート（酵母エキス４g/L、麦芽エ キス10g/L、ブドウ糖10g/L、寒天15g/L）を用いて、胞子懸濁液を調製した。プ レートに10mlの0.05%Twcen 80を満たした。懸濁液をねじ蓋付きの滅菌試験管に 移し、ボルテックス・ミキサーを「強」にセットして１分間攪拌した。次に、懸 濁液をカラムで濾過し、菌糸体を除去した。胞子数を数え、水１ml当たりの胞子 数が７×10⁶個となるように希釈した。この胞子懸濁液の10mlに対し、Pen-Ray紫 外線ランプの光を720μWatt/cm²にて75秒間照射した。照射期間中を通じ、滅菌 したペーパークリップを磁気攪拌子代わりに用い、胞子懸濁液を穏やかに攪拌し た。照射後、胞子懸濁液をアルミホイルで包んだ試験管に移 し、水で希釈し、減光下、下記のNH₄最小培地で培養した。30℃で20日間インキ ュベーションを行ったところ、大きなコロニーが認められ、コロニーの周囲には 広範囲にわたってセルロースが透明化した領域が存在していた。 実施例15--60 リットル容バッチ発酵槽を用いたC-1変異セルラーゼの生産(47.052 8の調製) 1. 接種材料の調製 バッチ発酵用の発端培養物は、実施例13（第１節）と同様に調製した。 2. 60 リットル容バッチ発酵槽を用いたセルラーゼの生産 ２リットルの上記培養物を、下記のようにして40リットルの培地に接種した。 3. 発酵条件 pHは約7.0に保ち、pHをNH₃を用いて6.9より高く保ち、H₂SO₄を用いて7.1より 低く保った。恒温時間は87時間とし、必要に応じて震盪と曝気を行い、溶存酸素 量を飽和量の30%より高く保った。40時間後、下記の培養液を５分毎に5.0mlずつ 、計3.0リットル添加した。 4. セルラーゼ活性の回収 ブフナー漏斗にWhatman54濾紙、および濾材として10g/LのCelite 503を装填し 、懸濁固形物を濾過により取り除いた。濾液を集め、10,000MWカットオフ型中空 繊維フィルターを用いた限外濾過を行ってセルラーゼを濃縮した。濃縮液は、凍 結乾燥法により乾燥した。濃縮物を、セルラーゼ標品47.0528と命名した(活性は 表４に示す)。 実施例16―セラジメ検定によるセルラーゼ活性分析 この分析は、Megazyme Pty.Ltd.社（シドニー，NSW2101，オーストラリア）製 のセラジメCタブレットと分析キットを用いて行った。使用した基質はアズリン 架橋型HE-セルロース(AZCL-セルロース)であり、Cellazyme Cタブレットとして 市販されており、購入後すぐに使用できる。概略を述べると、0.025M酢酸緩衝液 (pH4.5)に溶解した酵素標品（必要に応じ希釈）0.5mlをガラス製試験管(16×122 mm)に入札40℃で５分間、平衡化した。Cellazyme Cタブレットを添加して、試験 反応を開始させる(攪拌は行わない)。40℃で正確に10秒後、Trizma Base溶液（1 0.0mL，2% w/v，Sigma Chemical Co.,ミズーリ州セントルイス）を添加して反応 を停止させ、ボルテックス・ミキサーで攪拌した。試験管を室温に約５分間放置 した後、スラリーを再び攪拌し、Whatman No.1濾紙(直径９cm)を用いて濾過し、 濾液の590nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定は、ブランクを用いて行 った。ブランクには、基質と酵素が共に含まれているが、Cellazyme Cタブレッ トを添加する前にTrizma Baseを添加している。このスラリーは、40℃ではなく 、室温に保った。各測定ごとにブランクは１種類を使用し、分光器のゼロ点調整 に利用した。 この分析では、酵素活性１ユニットとは、指定の分析条件下において、１分間 に１マイクロモルのグルコース還元糖を放出させるのに必要な酵素量と定義され る。続いて、エンドセルラーゼ活性を標準曲線にもとづいて求めた(標本曲線は キットに添付されているが、ある一連の実験において酵素の種類、酵素の希釈率 、条件を変更した場合には、容易に自作することもできる)。 この分析法により、本発明者らの中性／アルカリ酵素活性を測定したところ、 pH7における活性を100%とした場合のエンドセルラーゼ活性は、92.4%(pH6)、75. 6%(pH5.0)および69.7%(pH4.0)であった。 実施例17…毛羽除去および増白（退色防止）のための洗剤洗濯試験 この試験は、AATCC 技術マニュアル1997(1995年改訂)に収載の“家庭洗濯試験 条件の標 準化”と題するAATCCモノグラフに準拠して行った。ここでは、Kenmore社製の標 準トップローディング型の洗濯機とKenmore社製の家庭用衣類乾燥機を使用した 。試験衣類として、大人サイズの赤色の靴下（綿88%、ポリエステル10%、ライク ラ2%）でスタイルの異なる３種類（平リブ編み、厚手リブ編み、ワッフル織り） を用いた。ソックスは３グループに分け、各グループには各スタイルを同数割り 当て、各スタイルの未洗濯品を対照用とした。各グループの概略重量は１ｋｇで あった。 洗剤の標本は、洗濯開始前に次のようにして調製した。a）手を加えない状態 のCheer Triple Guard(米国内で購入、通常アルカリpH域)(Cheerに元来含まれる セルラーゼの毛羽防止効果と色持ち効果を調べるため)、b）Cheerの標本を加熱 して元来含まれている酵素を全て失活させる(Cheerの性能を、酵素以外の成分に 限定するため)。失活は、Cheerの標本40ｇを水200mlに懸濁し、家庭用電子レン ジの高出力側(1000W)で５分間加熱することにより行い、このときの最終到達温 度は95℃であった。次に、上記(a)、(b)に５ｇのC1を添加した標品を同様に調製 した。 各グループについて、洗濯／乾燥サイクルを25回ずつ繰り返した。各グループ については、25回の洗濯サイクル全体を通じて常に、20リットルの洗濯液(洗濯 機内の水位は「低」)に対して１kgの衣類を使用し、上記の洗剤標品のいずれか１ 種類を40ｇを投入した。温度は「高−高」にセットし、洗濯時間は30分とし、そ の後の脱水は通常の高速遠心脱水により行った。乾燥機温度は「高」にセットし 、乾燥サイクルは45分間とした。25回洗濯後に実験を終了した。衣類の検査に当 たっては、当業者の数グループ／審査員が毛羽除去と増白の度合いを評価した。 手順の概略は、下記の通りである。 調製 原チア酵素の不活性 AARLからの酵素添加 a. チア(完全) いいえ いいえ b. チア（酵素なし） はい いいえ c. チア＋C1 はい はい（C1の５ｇ） 各洗濯グループの結果の等級付けは、次の通り(3種類のスタイルのソックスは 全て同 じ評価であった)。 チア(完全) チア(酵素不 チア＋C1 活性) 毛玉除去 ++++ - +++ 色の鮮明化 ++ - ++++ なお、以上述べた実施例は単に例示を目的としたものであり、これらに照らし て当業者が容易に想到し得る様々な変形や変更も、本出願の趣旨および範囲、並 びに特許請求の範囲に含まれるものと理解すべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年４月２９日（１９９８．４．２９） 【補正内容】 明細書 例えば、イオン交換クロマトグラフィーはペーハー勾配、又は塩の勾配、又はそ れらの両方によって溶離することによってセルラーゼ構成要素を分離することが 可能である。かかる分離方法は、当業者にもたらされた技術の利益をもって実施 することができる。 セルラーゼ組成物のそれぞれ酵素要素は一旦分別及び分離されると、たんぱく 質は部分的な配列又は微細な配列とされ、興味ある酵素たんぱく質を遺伝子コー ド化するための合成DNAやプローブを設計する。一般に、たんぱく質のアミノ末 端基の配列は、従来のたんぱく質配列方法又は自動化された配列により決定され る(アウスバル(Ausubel)ら、(1987)「カレントプロトコールインモレキュラーバ イオロジー(Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョンウィレイ ア ンド サンズ(John Wiley and Sons)、ニューヨーク、ニューヨーク州)。或いは 、たんぱく質の他の領域は、化学分裂又は酵素分裂及びたんぱく質分離技術の組 み合わせによって配列される。(「カレントプロトコールインモレキュラーバイオ ロジー(Current Protocols in Molecular Biology)」、ジョンウィレイ アンド サンズ(John Wiley and Sons)、ニューヨーク、ニューヨーク州)。当業者には 、クルソスポリウムにより生産された中性／アルカリ性セルラーゼ組成物内に存 在する酵素に対応する遺伝子を分離するための常套のクローン技術には合成DNA の複製又はプローブが使用されるものと理解される。 当業界において公知のことは、本発明によって得られた核又は配列又はDNA配 列の遺伝コード多様住の退化によって違うものとなりうる。しかしセルラーゼ組 成物の酵素の構成要素をコード化することが可能なDNA配列が得られる。そのよ うなDNA配列がそれゆえ本発明の核酸配列と機能的に等しく、現在の発明に包摂 されているものとする。また、本 発明で意図されるところは、さまざまな条件下での明確にされた核酸配列に合成 される核酸配列に相補的な核酸配列である。 本発明はさらに進んで、本発明のセルラーゼ組成物の酵素をコード化するたん ぱく質、又はペプチド又はそれらの類似体、及びこの発明の酵素たんぱく質又は ペプチドとして実質的に同機能を持つたんぱく質又はペプチドを含む。 C1調製#47.18.1乃至47.22.1はゲッチンソン培養液により振盪フラスコで同一の 方法で作られたが、ラクトース（0.5%w/v）及びペプトン（0.5%w/v）がテンサイ パルプ、大麦麦芽及び小麦糠の代わりに含まれている。細胞固形分は遠心分離さ れ、固形分なしの上澄は更なる試験のために乾燥されて保存された。調製#s47.1 000、47.1001、47.2000及び47.2001が、それらは他のクリソスポリウム株を使用 して生成された点を除いて、調製#47.1.1乃至47.15.1と同一の方法によって振盪 フラスコで作られた。特に、47.2001はクリソスポリウム・パノラム、調製47.20 00はクリソスポリウム・プルノサム、調製47.1001はクリソスポリウム・ケラチ ノフィラム、そして、調製47.1000はクリソスポリウム・クイーンズランディカ ム（例８参照）により生成された。これらC1調製のタンパク質含有量及び活性指 紋を表４に示す。 これらの調製は、実施例13及び15に記載の条件の下で成長されたファーメンタ ーであった。調製47.0325はバッチ発酵法、47.0528は給飼バッチ発酵法により生 成された。4. ヒュミコラ野生型標品#14.22.1および14.23.1の調製 野生型ヒュミコラ・グリセア変異株サーモイディアの調製#14.22.1は、ATCC 1 6453株より調製し、野生型ヒュミコラ・インソレンス調製#14.23.1は、ATCC 164 54株から生成した。これらヒュミコラ野生型調製は、C1調製#47.1.1〜#47.15.1 の調製（振盪フラスコにおける生成）に関して上述されたのと同一の方法を使用 して振盪フラスコにおいて生成された。実施例6--C1と他の中性セルラーゼとの比較 C1酵素調製#47.0528のFPA、カルボキシメチルセルラーゼ活性及びエンドグル カナーゼ活性が、商業用のヒュミコラ・インソレンス(デニマックスXT)及び野生 ATCC型ヒュミコラ（調製#14.22.1ヒュミコラ・グリセア変異株サーモディア(ATC C 16453)及び14.23.1ヒュミコラ・インソレン(ATCC 16454)中性セルラーゼに比 較された。その結果を表６に示す。C-1 #47.0528の総活性は、野生型ヒュミコラ 由来又は商業用のヒュミコラ・インソレン調製由来のそれよりも明らかに高かっ た。C-1 47.0528の特定カルボキシメチルセルラーゼ及びエンドグルカナーゼ活 性（乾燥調製１ｇ当たり又はタンパク質１ｇ当たり単位数）は、表６に挙げた全 ての試験ヒュミコラ調製よりも高かった。C-1 #47.0528の特定FPA活性はヒュミ コラ野生型調製#14.22.1及び14.23の特定FPA活性よりも高く、ヒュミコラ・イン ソレン商業製品デニマックスXTの特定FPA活性より僅かに低かった。C1セルラー ゼのペーハーと熱安定性はデニマックスXTと同様であった。 C1のカルボキシメチルセルラーゼは最適ペーハーと温度で高い安定性を示す。 例えば、ペーハー7.2及び50℃でカルボキシメチルセルラーゼは１時間後に95%、 ５時間後に75%の活性を有しており、ペーハー7.7及び50℃でカルボキシメチルセ ルラーゼは１時間後に93%、５時間後に45%の活性を維持している（表９参照）。実施例８…クリソスポリウム同属の他の株の中性及び／又はアルカリ性セルラー ゼ活性／性能 クリソスポリウム属の様々な株のセルラーゼ生成試験が行われた。これらの株 の正式名と起源を以下に示す。 メリーランド州ロックビルのアメリカ型培養収集所(ATCC)由来の株は以下のも のを含んでいる。 1. ATCC 44006 クリソスポリウム・ラクノウェンス 2. ATCC 34151 クリソスポリウム・パノラム 3. ATCC 24782 クリソスポリウム・プルイノサム ロシア微生物収集所(VKM)由来の株は以下のものを含んでいる。 1. VKMF-2119 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 2. VKMF-2875 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 3. VKMF-2120 クリソスポリウム・ロバタム 4. VKMF-2121 クリソスポリウム・マーダリウム 5. VKMF-2116 クリソスポリウム・クイーンズランディカム 6. VKMF-2117 クリソスポリウム・クイーンズランディカム 7. VKMF-2877 クリソスポリウム・トロピカム 本研究では、２種類の成長培養液が使用された。即ち、培養液Ａは、圧搾テン サイ、大麦麦芽、小麦糠を含有するゲッチンソン培養液、培養液Ｂは、ペプトン とラクトースを含有するゲッチンソン培養液である。培養液の組成を表11に示す 。 ATCC 34151クリソスポリウム・パノラム、ATCC 24782クリソスポリウム・プリ ノサム、VKMF-2875クリソスポリウム・ケラチノフィラム、VKMF 2116クリソ スポリウム・クイーンズランディカムの各菌株の場合、細胞固形分を遠心分離さ れ、10kDaカットオフ膜を使用した限外濾過により固形分を含まない上澄を５リ ットルから0.5リットルまで濃縮した。その後、限外濾過後の濃縮液を試験用に 乾燥して保存した。 以下のセルラーゼの#s乾燥調整が使用された。 47.2001-ATCC 34151 クリソスポリウム・パノラム 47.2000-ATCC 24782 クリソスポリウム・プルイノサム 47.1001-VKMF-2875 クリソスポリウム・ケラチノフィラム 47.1000-VKMF-2116 クリソスポリウム・クイーンズランディカム これらの調製のタンパク質含有率と活性指紋を表４に示す。実施例9―小石洗浄試験 A. 2-L特別洗濯機による試験 本システムは、ごく少量の酵素を用いた擦 り切れとバックステイニンングに関連した小石洗浄性能特性を評価する。 糊抜き デニム生地（ロール）(1.2kg)の布片40片(各30ｇ、25×20cm)につ いて、布地：洗濯液比率を1:6(7.2リットル)とし、Sandoclean PC液(非イオン性 洗浄濡れ剤、エチルオキシ化脂肪族アルコール系、平均エチレンオキシド含量６ モル)0.5g/L(3.6ｇ)、Sirrix 2UD(酸性緩衝化金属イオン封鎖剤)1/L(7.2ｇ)、お よびBactosol TK液（高温安定型α−アミラーゼ）1/L(7.2ｇ)を使用し、pH約5〜 6、60℃、20分間の条件下、家庭用洗濯機で糊抜きを行った。20分後、洗濯液を 脱水し、液量比1:10にて冷水(14リットル)で５分間すすいだ。続いて、 布片を40℃で乾燥させ、セルラーゼ活性測定用の比較標本として保管した。 布片のセルラーゼ処理は、内側槽の内径29cm、総容積10.6リットル(ドラム回 転数20rpm、左回りに５周、右回りに５周)の洗濯機を用いて行った。各布片は、 セルラーゼ処理を行う前に４本のゴム製ストッパーで縫い合わせて１個の衣類パ ッケージの形態とし、機械的作用が主として衣類の色の濃い外側面に及ぼされる ようにした。各ドラムにはパッケージ１個とゴム製ストッパー10個ずつを投入し た。 一般洗濯条件は、糊抜きジーンズ生地30ｇと0.02Mクエン酸緩衝液に溶解した セルラーゼを使用し、50℃、60分間、衣類：洗濯液＝1:4とした。セルラーゼ処 理を終了後、パッケージを温水(50℃)で５分間すすぎ(衣類：水＝1:20)、乾燥し て評価用標本とした。 種々のC1セルラーゼ調製の他、クリソスポリウム属の様々な菌株から調製され たセルラーゼ調製、並びに、ノボ・ノルディスク社から市販されている中性セル ラーゼ製品デニマックスXT（米国特許第4,4,35,307号）及びUltra MG（WPO 91/1 7243）を用いて、アプリケーション試験を行った。これらのアプリケーション試 験では、C-1その他のクリソスポリウム・セルラーゼの小石洗浄性能をノボ社の 市販中性セルラーゼと比較した。試験は、中性及びアルカリペーハー域(6.5，6. 7，7.0及び8.0）で行った。結果を表13に示す。種々のC1及びその他のクリソス ポリウム・セルラーゼ調製で処理された衣類の洗濯性能特性は、市販中性セルラ ーゼデニマックスXTおよびデニマックスUltra MGによる衣類のそれと同等であっ た。C1、および他のクリソスポリウム・セルラーゼ調製は、中性及びアルカリペ ーハー条件下で使用した場合、良好な柔軟化効果、漂白／黒ずみ低減効果、擦り 切れ具合を示し、しかもバックステインニングが少なかった。標本の明度(光反 射率)を調べるデータカラー測定を行った。標本に白色光（2パルス型キ セノンフラッシュランプ）を照射し、16個のダイオードを用いて400乃至700nmの 波長域で反射光を測定した。表側の面からの反射光強度は擦り切れ具合が大きい ほど高い値となった。また、裏面からの反射光強度はバックステインニングが増 すほど高い値となった。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年５月１９日（１９９８．５．１９） 【補正内容】 請求の範囲 1. 寄託番号VKM F-3500Dを有するクリソスポリウム・ラクノウェ ンス・ガーグ27Kの分離培養物。 2. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有する組成物であ って、適正な培地で培養されたクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類を 成長させることを含む方法によって得られ、前記菌類は、クリソスポリウム・ラ クノウェンス、クリソスポリウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフィ ラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソ スポリウム・クイーンズランディカム又はクリソスポリウム・トロピカムである 組成物。 3. 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項２ 記載の組成物。 4. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有し、適正な培地 中で培養されたクリソスポリウム属の変異体の菌類を成長させることを含む方法 によって得られる組成物。 5. 前記菌類は、寄託番号VKM F-3500D、クリソスポリウム・ラク ノウェンス・ガーグ27Kである請求項２記載の組成物。 6. 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27K の変異体株である請求項２記載の組成物。 8. 約6.0乃至約7.0のペーハー、約40℃乃至約60℃の温度で最適セ ルラーゼ活性の少なくとも50%を有する請求項２乃至６のいずれか一項記載の組 成物。 9. 前記セルラーゼ活性は、カルボキシメチルセルラーゼ活性測定 法、RBBカルボキシメチルセルラーゼ活性測定法、細胞内粘度測定法又は濾紙活 性測定法によって測定される請求項２乃至６のいずれか一項記載の組成物。 10． 実質的に精製及び分離されるタンパク画分であって、請求項２ 又は請求項４記載の組成物から得られ、カルボキシメチルセルラーゼ活性測定法 、RBBカルボキシメチルセルラーゼ活性測定法、細胞内粘度測定法又は濾紙活性 測定法のいずれかによって測定されると約6.0乃至約7.0ペーハーで最適セルラー ゼ活性の少なくとも50%を有するタンパク画分。 11． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約25kD、pI約４を有す るエンドグルカナーゼ。 12． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約70kD、pI約４を有す るエンドグルカナーゼ。 13． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約60kD、pI約３を有す るエンドグルカナーゼ。 14． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約43kD、pI約３を有す るエンドグルカナーゼ。 15． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約60kD、pI約４を有す るセロビオヒドロラーゼ。 16． 実質的に精製及び分離された中性及び／又はアルカリ性セルラ ーゼ酵素であって、請求項10記載のタンパク画分から分離され、pI約３乃至約5. 5を有するセルラーゼ酵素。 17． 前記セルラーゼはエンドグルカナーゼ又はセロビオヒドロラー ゼ活性のいずれかを有する請求項16記載のセルラーゼ。 18． 最大セルラーゼ活性の少なくとも50%を約6.0乃至約7.0のペー ハーで有する請求項16記載のセルラーゼ。 19． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約25kDを有するエンド グルカナーゼ。 20． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約70kDを有するエンド グルカナーゼ。 21． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約43kDを有するエンド グルカナーゼ。 22． 請求項10記載のタンパク画分から分離された一以上の精製酵素 を有し、更に界面活性剤を有する洗剤組成物。 23． 請求項10記載の前記タンパク画分から得られた一以上の精製酵 素を有する生地柔軟剤組成物。 24． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを含み、ペーハー約8.0乃至約12. 0を有する組成物。 25． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・ブルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項24記載の組成物。 26． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項25 記載の組成物。 27． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項24乃至26のいずれか一項記載の組成物。 28． 軽石、研磨剤、柔軟剤、溶媒、保存料、漂白剤、青み剤、蛍光 染料、酸化防止剤、可溶化剤、洗剤、界面活性剤、酵素、ビルダー、再汚染防止 剤、緩衝剤、ケー キング防止剤、セルラーゼ活性阻害因子用のマスキング剤及びセルラーゼ活性化 剤からなるグループから選択された一以上の成分を有する請求項24乃至26のいず れか一項記載の組成物。 29． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項28記載の組成物。 30． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項24記載の組成物。 31． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項25記載の組成物。 32． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項26記載の組成物。 33． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項27記載の組成物。 34． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項28記載の組成物。 35． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項29記載の組成物。 36． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、タンパク分解酵素、洗剤 及び界面活性剤からなるグループから選択される一以上の成分を更に有する組成 物。 37． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項36記載の組成物。 38． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項37 記載の組成物。 39． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項36乃至38のいずれか一項記載の組成物。 40． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも124単位あり、前記セ ルラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸 配列によってコード化されている組成物。 41． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項40記載の組成物。 42． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項41 記載の組成物。 43． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも124単位あり、前記セ ルラーゼはクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得られる 組成物。 44． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項43記載の組成物。 45． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項44 記載の組成物。 46． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも191単位あり、前記セ ルラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸 配列によってコード化されている組成物。 47． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・ パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラチノフィ ラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソ スポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカムからなる グループから選択される請求項46記載の組成物。 48． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項47 記載の組成物。 49． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも191単位あり、前記 セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得ら れる組成物。 50． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項49記載の組成物。 51． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項 50記載の組成物。 52． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性がセルラ ーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも964単位あり、前記セルラーゼのアミノ 酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってコー ド化されている組成物。 53． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項52記載の組成物。 54． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項54 記載の組成物。 55． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度測定法により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナ ーゼ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも964単位あり、前記 セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得ら れる組成物。 56． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項55記載の組成物。 57． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項57 記載の組成物。 58． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更 に有する洗濯用洗剤組成物。 59． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項58記載の組成物。 60． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項56 記載の組成物。 61． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られるセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更に有する洗濯用洗剤組成物。 62． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項61記載の組成物。 63． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項62 記載の組成物。 64． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有し、 クリソスポリウム属の変異菌類又は野生菌類から得られるセルラーゼ組成物。 65． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項64 記載のセルラーゼ組成物。 66． 前記菌類は寄託番号VKM F-3500Dのクリソスポリウム・ラクノ ウェンス・ガーグ27Kである請求項65記載のセルラーゼ組成物。 67． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有する 組成物の製造方法であって、適正な培地中でクリソスポリウム属の野生型又は変 異体の菌類を成長させることを有する方法。 68． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフィラム、クリソスポリウム・ ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソスポリウム・クイーンズラ ンディカム又はクリソスポリウム・トロピカムである請求項67記載の方法。 69． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項6 8記載の方法。 70． 前記菌類は寄託番号VKM F-3500Dのクリソスポリウム・ラクノウ ェンス・ガーグ27Kである請求項69記載の方法。 71． 前記菌類はクリソスポリウム属の変異体株である請求項67記載 の方法。 72． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27Kの 変異体株である請求項71記載の方法。 73． デニム生地又はデニム地ジーンズのストーンウォッシュ加工を 行う方法であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列に よってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記デニム生地又はデニ ム地ジーンズを処理することを有する方法。 74． 生地をバイオ磨き、デフリブレート、漂白、染色、又は糊抜き する方法であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列に よってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記生地を処理すること を有する方法。 75． 紙又はパルプのインク抜き又はバイオ漂白を行う方法であって 、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配 列がコード化されたセルラーゼにより前記紙又はバルブを処理することを有する 方法。 76． セルロース又は綿の混紡生地の柔軟性や感触を強める方法であ って、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ 酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記生地を処理することを有する方法 。 77． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項73乃至76のいずれか一項記載の方法。 78． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項73 乃至76のいずれか一項記載の方法。 79． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項77 記載の方法。 80． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーで高められたセルラーゼ活 性を作るクリソスポリウム属の変異体株を生成する方法であって、 (a) クリソスポリウム属の菌類の胞子を変異し、 (b) 工程(a)の前記胞子を培養し、 (c) 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性の高められたレベルの ために工程(b)の前記培養物をスクリーニングすることを有する方法。 81． 前記変異工程は、前記胞子に紫外線照射又は化学的変異原の処 理を行う請求項80記載の方法。 82． 前記化学的変異原は、亜硝酸、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ ソグアニジン又は4-ニトロキノロン-N-オキシドである請求項81記載の方法。 83． 請求項80乃至82のいずれか一項記載の方法により得られたクリ ソスポリウム属の変異体株。 84． クリソスポリウムのセルラーゼをコード化する遺伝子を分離す る方法であって、 (a) 野生型又は変異体のクリソスポリウムにより作られる中性及び／ 又はアルカリ性セルラーゼ組成物からタンパク質を分離し、 (b) 工程(a)で分離された前記タンパク質の全部又は一部を配列し、 (c) 工程(b)の前記配列に由来する核酸プローブを生成し、 (d) 工程(c)の前記核酸プローブにより野生型又は変異体のクリソスポ リウムライブラリをスクリーニングし、 (e) 前記プローブで認識された核酸配列を分離し、 (f) 工程(e)で分離された前記核酸配列を配列することを有する方法。 85． 請求項84記載の方法によって得られる核酸配列。 86． 配列がセルラーゼ酵素をコード化する分離核酸であって、前記 セルラーゼ酵素はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られる分離核酸。 87． 配列が請求項11乃至21のいずれか一項のセルラーゼをコード化 する分離核酸。 88． 請求項85乃至87のいずれか一項記載の核酸配列を有する組換え 発現ベクター。 89． 請求項88記載の組換え発現ベクターを有する宿主細胞。 90． 酵母細胞、真菌類細胞、植物細胞及び細菌類細胞からなるグル ープから選択される請求項89記載の宿主細胞。 91． 前記宿主細胞は、トリコダーマ、アスペルギルス、ヒュミコラ 、ペニシリウム、クリソスポリウム及びノイロスポラからなるグループから選択 される真菌類細胞である請求項90記載の宿主細胞。 92． クリソスポリウム属の菌類を培養する方法であって、前記菌類 は、ペーハー約５乃至８で無機塩類、炭素源、および有機窒素源を有する培養液 で成長される方法。 93． ペーハーが約6.5乃至7.5である請求項92記載のクリソスポリウ ム属の菌類を培養する方法。 94． ペーハーが約6.9乃至7.1である請求項92記載のクリソスポリウ ム属の菌類を培養する方法。 【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１１月１２日（１９９８．１１．１２） 【補正内容】 請求の範囲 7. 約40℃乃至約60℃の温度、約5.0乃至約11.0のpHでセルラーゼ 活性を有する請求項２乃至６のいずれか一項記載の組成物。 【手続補正書】 【提出日】平成１１年１０月６日（１９９９．１０．６） 【補正内容】 請求の範囲 1. 寄託番号VKM F-3500Dを有するクリソスポリウム・ラクノウェ ンス・ガーグ27Kの分離培養物。 2. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有する組成物であ って、適正な培地で培養されたクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類を 成長させることを含む方法によって得られ、前記菌類は、クリソスポリウム・ラ クノウェンス、クリソスポリウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフィ ラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソ スポリウム・クイーンズランディカム又はクリソスポリウム・トロピカムである 組成物。 3. 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項２ 記載の組成物。 4. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有し、適正な培地 で 培養されたクリソスポリウム属の変異体の菌類を成長させることを含む方法に よって得られる組成物。 5. 前記菌類は、寄託番号VKM F-3500D、クリソスポリウム・ラク ノウェンス・ガーグ27Kである請求項２記載の組成物。 6. 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27K の変異体株である請求項２記載の組成物。 7. 約40℃乃至約60℃の温度、約5.0乃至約11.0のpHでセルラーゼ 活性を有する請求項２乃至６のいずれか一項記載の組成物。 8. 約6.0乃至約7.0のpH、約40℃乃至約60℃の温度で最適セルラー ゼ活性の少なくとも50%を有する請求項２乃至６のいずれか一項記載の組成物。 9. 前記セルラーゼ活性は、CMCase 検定、RBBCMCase 検定、細胞内 粘度検定又はろ紙活性検定によって検定される請求項２乃至６のいずれか一項記 載の組成物。 10． 実質的に精製及び分離されるタンパク画分であって、請求項２ 又は請求項４記載の組成物から得られ、CMCase 検定、RBBCMCase 検定、細胞内粘 度検定又はろ紙活性検定のいずれかによって測定されると約6.0乃至約7.0のpHで 最適セルラーゼ活性の少なくとも50%を有するタンパク画分。 11． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約25kD、pI約４を有す るエンドグルカナーゼ。 12． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約70kD、pI約４を有す るエンドグルカナーゼ。 13． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約60kD、pI約３を有す るエンドグルカナーゼ。 14． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約43kD、pI約３を有す るエン ドグルカナーゼ。 15． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約60kD、pI約４を有す るセロビオヒドロラーゼ。 16． 実質的に精製及び分離された中性及び／又はアルカリ性セルラ ーゼ酵素であって、請求項10記載のタンパク画分から分離され、pI約３乃至約5. 5を有するセルラーゼ酵素。 17． 前記セルラーゼはエンドグルカナーゼ又はセロビオヒドロラー ゼ活性のいずれかを有する請求項16記載のセルラーゼ。 18． 最大セルラーゼ活性の少なくとも50%を約6.0乃至約7.0のpHで 有する請求項16記載のセルラーゼ。 19． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約25kDを有するエンド グルカナーゼ。 20． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約70kDを有するエンド グルカナーゼ。 21． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約43kDを有するエンド グルカナーゼ。 22． 請求項10記載のタンパク画分から分離された一以上の精製酵素 を有し、更に界面活性剤を有する洗剤組成物。 23． 請求項10記載の前記タンパク画分から得られた一以上の精製酵 素を有する生地柔軟剤組成物。 24． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを含み、pH約8.0乃至約12.0を有 する組成物。 25． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項24記載の組成物。 26． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項25 記載の組成物。 27． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項24乃至26のいずれか一項記載の組成物。 28． 軽石、研磨剤、柔軟剤、溶媒、防腐剤、漂白剤、青み剤、蛍光 染料、酸化防止剤、可溶化剤、洗剤、界面活性剤、酵素、ビルダー、非還元剤、 緩衝液、ケーキン グ防止剤、セルラーゼ活性阻害因子用のマスキング剤及びセルラーゼ活性化剤か らなるグループから選択された一以上の成分を有する請求項24乃至26のいずれか 一項記載の組成物。 29． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項28記載の組成物。 30． pHが約10.0乃至約11.0である請求項24記載の組成物。 31． pHが約10.0乃至約11.0である請求項25記載の組成物。 32． pHが約10.0乃至約11.0である請求項26記載の組成物。 33． pHが約10.0乃至約11.0である請求項27記載の組成物。 34． pHが約10.0乃至約11.0である請求項28記載の組成物。 35． pHが約10.0乃至約11.0である請求項29記載の組成物。 36． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、タンパク分解酵素、洗剤 及び界面活性剤からなるグループから選択される一以上の成分を更に有する組成 物。 37． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項36記載の組成物。 38． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項37 記載の組成物。 39． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項36乃至38のいずれか一項記載の組成物。 40． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー ゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも124単位あり、前記セル ラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配 列によってコード化されている組成物。 41． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項40記載の組成物。 42． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項41 記載の組成物。 43． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー ゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも124単位あり、前記セル ラーゼはクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得られる組 成物。 44． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウエンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項43記載の組成物。 45． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項44 記載の組成物。 46． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー ゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも191単位あり、前記セル ラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配 列によってコード化されている組成物。 47． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・ パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラチノフィ ラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソ スポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカムからなる グループから選択される請求項46記載の組成物。 48． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項47 記載の組成物。 49． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー ゼ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも191単位あり、前記セ ルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得られ る組成物。 50． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項49記載の組成物。 51． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項5 0記載の組成物。 52． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー ゼ活性がセルラー ゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも964単位あり、前記セルラーゼのアミノ酸 配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってコード 化されている組成物。 53． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・タイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項52記載の組成物。 54． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項54 記載の組成物。 55． セルロース系繊維又はセルロース系生地の酵素処理に供される 組成物であって、細胞内粘度検定により測定されるとエンド-1,4-β-グルカナー セ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも964単位あり、前記セ ルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得られ る組成物。 56． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項55記載の組成物。 57． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項57 記載の組成物。 58． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更 に有する洗濯用洗剤組成物。 59． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項58記載の組成物。 60． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項56 記載の組成物。 61． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られるセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更に有する洗濯用洗剤組成物。 62． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項61記載の組成物。 63． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項62 記載の組成物。 64． 中比及び／又はアルカリ性pHでセルラーゼ活性を有し、クリソ スポリウム属の変異菌類又は野生菌類から得られるセルラーゼ組成物。 65． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項64 記載のセルラーゼ組成物。 66． 前記菌類は寄託番号VKM F-3500Dのクリソスポリウム・ラクノ ウェンス・ガーグ27Kである請求項65記載のセルラーゼ組成物。 67． 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有する組成物の製 造方法であって、適正な培地でクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類を 成長させることを有する方法。 68． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフィラム、クリソスポリウム・ ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソスポリウム・クイーンズラ ンディカム又はクリソスポリウム・トロピカムである請求項67記載の方法。 69． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項 68記載の方法。 70． 前記菌類は寄託番号VKM F-3500Dのクリソスポリウム・ラクノ ウェンス・ガーグ27Kである請求項69記載の方法。 71． 前記菌類はクリソスポリウム属の変異体株である請求項67記載 の方法。 72． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27Kの 変異体株である請求項71記載の方法。 73． デニム生地又はデニム地ジーンズの小石洗濯の方法であって、 クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配列 がコード化されたセルラーゼにより前記デニム生地又はデニム地ジーンズを処理 することを有する方法。 74． 織物をバイオ磨き、デフリブレード漂白、染色、又は糊抜きす る方法であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記織物を処理する工程を 含む方法。 75． 紙又はパルプのインク除去又はバイオ漂白を行う方法であって 、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配 列がコード化されたセルラーゼにより前記紙又はパルプを処理する工程を含む方 法。 76． セルロース又は綿の混紡生地の柔軟比や感触を高める方法であ って、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ 酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記生地を処理する工程を含む方法。 77． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項73乃至76のいずれか一項記載の方法。 78． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項73 乃至76のいずれか一項記載の方法。 79． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項77 記載の方法。 80． 中性及び／又はアルカリpHで高められたセルラーゼ活性を作る クリソスポリウム属の変異体株を生成する方法であって、 (a) クリソスポリウム属の菌類の胞子を変異し、 (b) 工程(a)による前記胞子を培養し、 (c) 中性及び／又はアルカリセルラーゼ活性の高められたレベルのた めに工程(b)による前記培養物をスクリーニングすることを有する方法。 81． 前記変異工程では、前記胞子への紫外線照射又は化学的変異原 の処理を行う請求項80記載の方法。 82． 前記化学的変異原は、亜硝酸、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ ソグアニジン、又は4-ニトロキノロン-N-オキシドである請求項81記載の方法。 83． 請求項80乃至82のいずれか一項記載の方法により得られたクリ ソスポ リウム属の変異体株。 84． クリソスポリウムのセルラーゼ酵素をコード化する遺伝子を分 離する方法であって、 (a) 野生型又は変異体のクリソスポリウムによって作られる中性及び ／又はアルカリ性セルラーゼ組成物からタンパクを分離し、 (b) 工程(a)で分離された前記タンパクの全体又は一部を配列し、 (c) 工程(b)の前記配列に由来する核酸プローブを生成し、 (d) 工程(c)の前記核酸プローブを用いて野生型又は変異体のクリソス ポリウムライブラリーをスクリーニングし、 (e) 前記プローブで認識された核酸配列を分離し、 (f) 工程(e)で分離された前記核酸配列を配列することを有する方法。 85． 請求項84記載の方法によって得られる核酸配列。 86． 配列がセルラーゼ酵素をコード化する分離核酸であって、前記 セルラーゼ酵素はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られる分離拡散。 87． 配列が請求項11乃至21のいずれか一項のセルラーゼをコード化 する分離核酸。 88． 請求項85乃至87のいずれか一項記載の核酸配列を有する組換え 発現ベクター。 89． 請求項88記載の組換え発現ベクターを有する宿主細胞。 90． 酵母細胞、真菌類細胞、植物細胞及び細菌類細胞からなるグル ープから選択される請求項89記載の宿主細胞。 91． 前記宿主細胞は、トリコダーマ、アスペルギルス、フミコーラ 、ペニシリウム、クリソスポリウム、及びニューロスポーラからなるグループか ら選択される真菌類細胞である請求項90記載の宿主細胞。 92． クリソスポリウム属の菌類を培養する方法であって、前記菌類 は、pH約５乃至８で無機塩類、炭素源、および有機窒素源を有する培地で成長さ れる培養方法。 93． pHが約6.5乃至7.5である請求項92記載のクリソスポリウム属の 菌類を培養する方法。 94． pHが約6.9乃至7.1である請求項92記載のクリソスポリウム属の 菌類を培養する方法。 95． pH が7.5に維持される請求項92記載のクリソスポリウム属の菌類 を培養する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 9/42 9/42 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｄ０６Ｍ 16/00 Ａ Ｄ０６Ｍ 16/00 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 アリエ・ベンバサット アメリカ合衆国デラウエア州ウイルミント ンボールファームウエイ73 (72)発明者 リチャード・ピー・バーリンゲイム アメリカ合衆国ウィスコンシン州マニトー コノース９番ストリート808 (72)発明者 ウラディミール・ミハイロビッチ・チェル ノグラゾフ ロシア連邦モスクワアカデミックカピテア ステイション32―３―178 (72)発明者 オレグ・ニコラエビッチ・オコウネフ ロシア連邦モスクワプスキノＡｂ９―６ (72)発明者 フィリップ・ティー・オルソン アメリカ合衆国ウイスコンシン州マニトー コウォルドーブルバード3220 (72)発明者 アルカディ・パンテレイモノヴィッチ・シ ニチン ロシア連邦モスクワドブゼンコストリート ７―761

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 寄託番号VKM F-3500Dを有するクリソスポリウム・ラクノウェ ンス・ガーグ27Kの分離培養物。 2. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有する組成物であ って、適正な培地中で培養されたクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類 を成長させることを含む方法によって得られ、前記菌類は、クリソスポリウム・ ラクノウェンス、クリソスポリウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフ ィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリ ソスポリウム・クイーンズランディカム又はクリソスポリウム・トロピカムであ る組成物。 3. 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項２ 記載の組生物。 4. 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性を有し、適正な培地 中で培養されたクリソスポリウム属の変異体の菌類を成長させることを含む方法 によって得られる組成物。 5. 前記菌類は、寄託番号VKM F-3500Dのクリソスポリウム・ラク ノウェンス・ガーグ27Kである請求項２記載の組成物。 6. 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27K の変異体株である請求項２記載の組成物。 7. 約40℃乃至約60℃の温度、約5.0乃至約12.0のペーハーで最適 セルラーゼ活性を有する請求項２乃至６のうちいずれか一項記載の組成物。 8. 約6.0乃至約7.0のペーハー、約40℃乃至約60℃の温度で最適セ ルラーゼ活性の少なくとも50%を有する請求項２乃至６のうちいずれか一項記載 の組成物。 9. 前記セルラーゼ活性は、カルボキシメチルセルラーゼ活性測定 法、RBBカルボキシメチルセルラーゼ活性測定法、細胞内粘度測定法又は濾紙活 性測定法によって測定される請求項２乃至６のうちいずれか一項記載の組成物。 10． 実質的に精製及び分離されたタンパク画分であって、請求項２ 乃至４記載の組成物から得られ、カルボキシメチルセルラーゼ活性測定法、RBB カルボキシメチルセルラーゼ活性測定法、細胞内粘度測定法又は濾紙活性測定法 によって測定されると最適セルラーゼ活性の少なくとも50%を約6.0乃至約7.0の ペーハーで有するタンパク画分。 11． 請求項10記載のタンパク画分から得られ、分子量約25kD、pI約 ４を有するエンドグルカナーゼ。 12． 請求項10記載のタンパタ画分から得られ、分子量約70kD、pI約 ４を有するエンドグルカナーゼ。 13． 請求項10記載のタンバタ画分から得られ、分子量約60kD、pI約 ３を有するエンドグルカナーゼ。 14． 請求項10記載のタンパク画分から得られ、分子量約43kD、pI約 ３を有するエンドグルカナーゼ。 15． 請求項10記載のタンパク画分から得られ、分子量約60kD、pI約 ４を有するセロビオヒドロラーゼ。 16． 実質的に精製及び分離された中性及び／又はアルカリ性セルラ ーゼ酵素であって、請求項10記載のタンパク画分から分離され、pI約３乃至約5. 5を有するセルラーゼ酵素。 17． 前記セルラーゼはエンドグルカナーゼ又はセロビオヒドロラー ゼ活性のいずれかを有する請求項16記載のセルラーゼ。 18． 最大セルラーゼ活性の少なくとも50%を約6.0乃至約7.0のペー ハーで有する請求項16記載のセルラーゼ。 19． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約25kDを有するエンド グルカナーゼ。 20． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約70kDを有するエンド グルカナーゼ。 21． 請求項10記載の画分から得られ、分子量約43kDを有するエンド グルカナーゼ。 22． 請求項10記載のタンパク画分から分離された一以上の精製酵素 を有し、界面活性剤を更に有する洗剤組成物。 23． 請求項10記載の前記タンパク画分から得られた一以上の精製酵 素を有する生地柔軟剤組成物。 24． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異 体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配列がコード化されているセルラーゼを有 し、ペーハー約8.0乃至約12.0を有する組成物。 25． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム及びクリソスポリウム・トロピカ ムからなるグループから選択される請求項24記載の組成物。 26． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項25 記載の組成物。 27． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項24乃至26のうちいずれか一項記載の組成物。 28． 軽石、研磨剤、柔軟剤、溶媒、保存料、漂白剤、青み剤、蛍光 染料、酸 化防止剤、可溶化剤、洗剤、界面活性剤、酵素、ビルダー、再汚染防止剤、緩衝 剤、ケーキング防止剤、セルラーゼ活性阻害因子用のマスキング剤及びセルラー ゼ活性化剤からなるグループから選択された一以上の成分を更に有する請求項24 乃至26のうちいずれか一項記載の組成物。 29． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項28記載の組成物。 30． ペーハーが10.0乃至約11.0である請求項24記載の組成物。 31． ペーハーが10.0乃至約11.0である請求項25記載の組成物。 32． ペーハーが10.0乃至約11.0である請求項26記載の組成物。 33． ペーハーが10.0乃至約11.0である請求項27記載の組成物。 34． ペーハーが10.0乃至約11.0である請求項28記載の組成物。 35． ペーハーが約10.0乃至約11.0である請求項29記載の組成物。 36． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異 体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、 タンパク分解酵素、洗剤及び界面活性剤からなるグループから選択される一以上 の成分を更に有する組成物。 37． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・タイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項36記載の組成物。 38． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項37 記載の組成物。 39． 前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる請求項36乃至38のうちいずれか一項記載の組成物。 40． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定するとエ ンド-1,4-β-グルカナーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも 124単位あり、前記セルラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又 は変異体の菌類の核酸配列によってコード化されている組成物。 41． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項40記載の組成物。 42． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項41 記載の組成物。 43． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定するとエ ンド-1,4-β-グルカナーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも 124単位あり、前記セルラーゼは、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌 類から分離又は得られる組成物。 44． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項43記載の組成物。 45． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項44 記載の組成物。 46． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定するとエ ンド-1,4-β-グルカナーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも 191単位あり、前記セルラーゼのアミノ酸配列は、クリソスポリウム属の野生型 又は変異体の菌類の核酸配列によってコード化されている組成物。 47． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・ パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラチノフィ ラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソ スポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカムからなる グループから選択される請求項46記載の組成物。 48． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項47 記載の組成物。 49． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定するとエ ンド-1,4-β-グルカナーゼ活性がセルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも 191単位あり、前記セルラーゼはクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類 から分離又は得られる組成物。 50． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項49記載の組成物。 51． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項50 記載の組成物。 52． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定したエン ド-1,4-β-グルカ ナーゼ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なくとも964単位あり、前 記セルラーゼのアミノ酸配列はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の 核酸配列によってコード化されている組成物。 53． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項52記載の組成物。 54． 前記菌類はクリソスポリウム・ラタノウェンスである請求項54 記載の組成物。 55． セルロース系繊維、セルロース系生地その他のセルロース系基 質の酵素処理に供される組成物であって、細胞内粘度測定法により測定するとエ ンド-１,4-β-グルカナーゼ活性が、セルラーゼの乾燥組成物１ｇ当たり少なく とも964単位あり、前記セルラーゼはクリソスポリウム属の野生型又は変異体の 菌類から分離又は得られる組成物。 56． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラタノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項55記載の組成物。 57． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項57 記載の組成物。 58． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更 に有する洗濯用洗剤組成物。 59． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項58記載の組成物。 60． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項56 記載の組成物。 61． クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られるセルラーゼを有し、一以上の界面活性剤を更に有する洗濯用洗剤組成物。 62． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ケラ チノフィラム、クリソスポリウム・ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム 、クリソスポリウム・クイーンズランディカム、クリソスポリウム・トロピカム からなるグループから選択される請求項61記載の組成物。 63． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項62 記載の組成物。 64． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有し、 クリソスポリウム・ラクノウェンスの変異体又は野生型の菌類から得られるセル ラーゼ組成物。 65． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有し、 寄託番号VKM F-3500Dを有するクリソスポリウム・ラクノウェンス・ガーグ27Kの 変異体又は野生型の菌類から得られるセルラーゼ組成物。 66． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有し、 クリソスポリウム属の変異体又は野生型の菌類から得られ、前記菌はクリソスポ リウム・プルイノサム、クリソスポリウム・ファーガシー又はクリソスポリウム ・サーモフィルではないセルラーゼ組成物。 67． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーでセルラーゼ活性を有する 組成物の製造方法であって、摘正な培地中でクリソスポリウム属の野生型又は変 異体の菌類を成長させることを有する方法。 68． 前記菌類は、クリソスポリウム・ラクノウェンス、クリソスポ リウム・パノラム、クリソスポリウム・ケラチノフィラム、クリソスポリウム・ ロバタム、クリソスポリウム・マーダリウム、クリソスポリウム・クイーンズラ ンディカム又はクリソスポリウム・トロピカムである請求項67記載の方法。 69． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項68 記載の製造方法。 70． 前記菌類は、寄託番号VKM F-3500Dを有するクリソスポリウム ・ラクノウェンス・ガーグ27Kである請求項69記載の方法。 71． 前記菌類はクリソスポリウム属の変異体株である請求項67記載 の方法。 72． 前記菌類はクリソスポリウム・ラタノウェンス・ガーグ27Kの 変異体株である請求項71記載の方法。 73． デニム生地又はデニム地ジーンズの小石洗浄方法であって、ク リソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配列が コード化されたセルラーゼにより前記デニム生地又はデニム地ジーンズを処理す ることを有する方法。 74． 織物をバイオ磨き、デフリビレート、漂白、染色又は糊抜きす る方法であって、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によ ってアミノ酸配列がコード化されたセルラーゼにより前記織物を処理することを 有する方法。 75． 紙又はパルプのインク除去又はバイオ漂白を行う方法であって 、クリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配 列がコード化されたセルラーゼにより前記紙又はパルプを処理することを有する 方法。 76． セルロース又は混綿生地の柔軟性又は感触を強める方法であっ て、クリ ソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類の核酸配列によってアミノ酸配列がコ ード化されたセルラーゼにより前記生地を処理することを有する方法。 77． 前記セルラーゼはクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌 類から分離又は得られる請求項73乃至76のうちいずれか一項記載の方法。 78． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項73 乃至76のうちいずれか一項記載の方法。 79． 前記菌類はクリソスポリウム・ラクノウェンスである請求項77 記載の方法。 80． 中性及び／又はアルカリ性ペーハーで高められたセルラーゼ活 性を作るクリソスポリウム属の変異体株を生成する方法であって、 (a) クリソスポリウム属の菌類の胞子を変異させ、 (b) 工程(a)で得られた前記胞子を培養し、 (c) 中性及び／又はアルカリ性セルラーゼ活性の高められたレベルのために 工程(b)で得られた前記培養物をスクリーニングする方法。 81． 前記変異工程は、前記胞子に紫外線照射又は化学的変異原を行 うことを有する請求項80記載の方法。 82． 前記化学的変異原は、亜硝酸、N-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロ ソグアニジン、または4-ニトロキノロン-N-オキシドである請求項81記載の方法 。 83． 請求項80乃至82のうちいずれか一項記載の方法により得られた クリソスポリウム属の変異体株。 84． クリソスポリウムのセルラーゼ酵素をコード化する遺伝子を分 離する方法であって、 (a)野生型又は変異体のクリソスポリウムによって作られた中性及び／又はア ルカリ性セルラーゼ組成物からタンパク質を分離し、 (b) 工程(a)で分離されたタンパク質の全部又は一部を配列し、 (c) 工程(b)の前記配列に由来する核酸プローブを生成し、 (d) 工程(c)の前記核酸プローブにより野生型又は変異体のクリソスポリウム ライブラリをスクリーニングし、 (e) 前記プローブによって認懺された核酸配列を分離し、 (f) 工程(e)で分離された核酸配列を配列することを有する方法。 85． 請求項84記載の方法によって得られる核酸配列。 86． 配列がセルラーゼ酵素をコード化する分離核酸であって、前記 セルラーゼ酵素はクリソスポリウム属の野生型又は変異体の菌類から分離又は得 られる分離核酸。 87． 配列が請求項11乃至21のうちいずれか一項のセルラーゼをコー ド化する分離核酸。 88． 請求項85乃至87のうちいずれか一項記載の核酸配列を有する組 換え発現ベタター。 89． 請求項88記載の組換え発現ベタターを含む宿主細胞。 90． 酵母細胞、真菌類細胞、植物細胞及び細菌類細胞からなるグル ープから選択される請求項89記載の宿主細胞。 91． 宿主細胞は、トリコダーマ、アスペルギルス、ヒュミコラ、ベ ニシリウム、クリソスポリウム及びノイロスポラからなるグループから選択され る真菌類細胞である請求項90記載の宿主細胞。 92． クリソスポリウム属の菌類を培養する方法であって、前記菌類 は、ペーハー約５乃至８で、無機塩類、炭素源及び有機窒素源を有する培養液で 成長される方法。 93． ペーハーが約6.5乃至7.5である請求項92記載のクリソスポリウ ム属の菌類を培養する方法。 94． ペーハーが約6.9乃至7.1である請求項92記載のクリソスポリウ ム属の菌類を培養する方法。