JPWO2013077341A1 - セルラーゼの製造方法およびその装置 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]以下の工程(1)〜(3)を含むセルラーゼの製造方法。
(1)糸状菌由来セルラーゼ水溶液を分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜に通じてろ過して透過液を得るとともに、非透過液として濃縮酵素液を得る工程。
(2)工程(1)で得られた透過液を、さらに分画分子量5,000〜50,000の第2の限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過液として第2の濃縮酵素液を得る工程。
(3)工程(1)および(2)で得られた濃縮酵素液を混合して糸状菌由来セルラーゼを得る工程。
[2]糸状菌がトリコデルマ菌である、[1]に記載のセルラーゼの製造方法。
[3]工程(1)において糸状菌由来セルラーゼ水溶液をpH2.6〜5.4またはpH8.6〜9.4に調整する、[1]または[2]に記載のセルラーゼの製造方法。
[4]糸状菌由来セルラーゼ水溶液が糸状菌培養液または糸状菌由来セルラーゼを使用したセルロース含有バイオマスの加水分解物である、[1]から[3]のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
[5]糸状菌由来セルラーゼ水溶液が、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼおよびキシラナーゼからなる群から選ばれた1以上の酵素成分を含む、[1]から[4]のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
[6]糸状菌由来セルラーゼ水溶液の温度が15〜35℃の温度範囲である、[1]から[5]のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
[7]セルラーゼの製造装置であって、セルラーゼ水溶液タンクと、これと連結する限外ろ過膜ポンプと、少なくとも1以上の直列または並列に連結された分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜と、前記限外ろ過膜の透過液保持タンクと、分画分子量5,000〜50,000の第2の限外ろ過膜と、第2の濃縮酵素液保持タンクとを含む装置。
[8]セルラーゼ水溶液タンクがpHセンサーを具備し、さらに該セルラーゼ水溶液タンクにpH調整剤タンクが連結している、[7]に記載のセルラーゼの製造装置。
工程(1)では、糸状菌由来セルラーゼ水溶液を分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜に通じてろ過し、透過液を得るとともに非透過液として濃縮酵素液を得る。この際、糸状菌由来セルラーゼ水溶液に含まれる一部の酵素成分が分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜の非透過液として分離されることを見出した。また一方で、透過側にも残りの酵素成分が透過側に分離されること見いだされており、以下の工程(2)において残りの酵素成分を回収する。
工程(2)では、前記工程(1)の透過液をさらに、分画分子量5,000〜50,000の第2の限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過液として第2の濃縮酵素液を得る。これにより、工程(1)の透過液に含まれる酵素成分をもれなく回収することができる。前述工程(1)の分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜、および工程(2)の分画分子量5,000〜50,000の限外ろ過膜、の2段階で糸状菌由来セルラーゼを分離・濃縮することにより、従来の分画分子量5,000〜50,000の限外ろ過膜のみで分離・濃縮する手法よりも高い酵素活性を分離することができる。
工程(3)では、工程(1)で得られた第1の濃縮酵素液と工程(2)で得られた第2の濃縮酵素液を混合して、糸状菌由来セルラーゼ水溶液から高い酵素活性を有するセルラーゼを得る。本工程(3)で得られたセルラーゼはそのままでも使用できるが、適宜セルラーゼ濃度やpHを調整して使用してもよい。
ろ過速度(m/day)=フラックス(m3/h)×24÷膜面積(m2)・・・(式1)。
トリコデルマ菌の培養液は、次の方法で調製した。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるように蒸留水に添加し、100mLを500mLバッフル付き三角フラスコに張り込み、121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80を、それぞれ0.01%(w/vol)添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイATCC66589を1×105個/mLになるように植菌し、28℃の温度で72時間、180rpmで振とう培養し、前培養とした(振とう装置:TAITEC社製 BIO−SHAKER BR−40LF)。
コーンスティップリカー5%(w/vol)、グルコース2%(w/vol)、セルロース(アビセル)10%(w/vol)、酒石酸アンモニウム0.37%(w/vol)、硫酸アンモニウム0.14%(w/vol)、リン酸二水素カリウム0.2%(w/vol)、塩化カルシウム二水和物0.03%(w/vol)、硫酸マグネシウム七水和物0.03%(w/vol)、塩化亜鉛0.02%(w/vol)、塩化鉄(III)六水和物0.01%(w/vol)、硫酸銅(II)五水和物0.004%(w/vol)、塩化マンガン四水和物0.0008%(w/vol)、ホウ酸0.0006%(w/vol)、および七モリブデン酸六アンモニウム四水和物0.0026%(w/vol)となるように蒸留水に添加し、2.5Lを5L容撹拌ジャー(ABLE社製、DPC−2A)容器に張り込み、121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ121℃の温度で15分間オートクレーブ滅菌したPE−MとTween80を、それぞれ0.1%添加し、あらかじめ前記の方法により液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイATCC66589を250mL接種した。その後、28℃の温度で87時間、300rpm、通気量1vvmの条件で振とう培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過(ミリポア社製の“ステリカップ”−GV、材質:PVDF)した。この前述条件で調整した培養液をトリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液として、以下の実施例に使用した。
糖液に含まれるグルコースおよびキシロース濃度は、下記に示すHPLC条件で標品との比較により定量した。
カラム:Luna NH2(Phenomenex社製)
移動相:ミリQ:アセトニトリル=25:75(流速0.6mL/分)
反応液:なし
検出方法:RI(示差屈折率)
温度:30℃。
セルラーゼ活性は、(1)アビセル分解活性、(2)セロビオース分解活性および(3)キシラン分解活性の3種の分解活性に分けて、次の手順で活性を測定評価した。
酵素液(所定条件で調製)に対し、アビセル(メルク社製)を1g/Lと酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を100mMとなるように添加し、50℃の温度で24時間回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例2に記載の方法に準じて測定した。アビセル分解活性は、生成したグルコース濃度(g/L)をそのまま活性値とした。
酵素液に対し、セロビオース(和光純薬)500mg/Lと酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を100mMとなるように添加し、50℃の温度で0.5時間回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のグルコース濃度を測定した。グルコース濃度は、参考例2に記載の方法に準じて測定した。セロビオース分解活性は、生成したグルコース濃度(g/L)をそのまま活性値とした。
酵素液に対し、キシラン(Birch wood xylan、和光純薬)10g/Lと酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)を100mMとなるように添加し、50℃で4時間回転混和しながら反応を行った。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分のキシロース濃度を測定した。キシロース濃度は、参考例2に記載の方法に準じて測定した。キシロース分解活性は、生成したキシロース濃度(g/L)をそのまま活性値とした。
タンパク質濃度の測定は、Pierce BCA Protein Assay Kitを使用して、同Kitプロトコルに準じて行った。タンパク質濃度の検量線は、Albumin standard(2mg/mL)を段階希釈したものを同様に測定し作製し、検量線の目的試料と比色によって定量した。
上記の参考例1で調製したトリコデルマ菌由来セルラーゼを3.5g/Lとなるように希釈し、これに希塩酸もしくは希水酸化ナトリウムを使用して、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11、およびpH12(pH2〜12)の水溶液を調製した。pH調整後、タンパク質濃度を再測定したところ、3.5g/L前後であったため、これらpH調整済みのセルラーゼ水溶液のタンパク質濃度を3.5g/Lと見なして、以下評価を実施した。
参考例5のトリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液(pH3、pH9)20mLについて、分画分子量10,000の限外ろ過膜(Sartorius社製“VIVASPIN” 20、10,000MWCO、PES、有効膜面積6cm2)を使用して、デッドエンドろ過で非透過液の液量が1mLになるまで濃縮を行った(温度25℃、遠心力6000g)。濃縮液を回収し、質量を測定しながら、初期質量である20gとなるまで、RO水を加えながらメスアップを行った。これを非透過液として、セルラーゼ分解活性を上記の参考例3に準じて測定を行った。限外ろ過前のトリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液に関しても、セルラーゼ分解活性を参考例3に準じて測定し得られた活性値を100%として、非透過液のセルラーゼ分解活性を評価した。得られた結果を表5に示す。
参考例5で示したように、トリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液を分画分子量100,000の限外ろ過膜に通じてろ過することで、非透過液側にセルラーゼ成分の一部を回収可能であることが判明した。しかしながら、一方で、限外ろ過膜の透過液として一部の酵素成分を損失していることが同時に課題であった。そこで、分画分子量100,000の限外ろ過膜において、トリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液を分離して、非透過液(第1の濃縮酵素液)を回収した後に、その透過液に関して、さらに分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いてろ過することにより、さらに非透過液として第2の濃縮酵素液を得ることを検討した。具体的には以下手順にて実施した。
参考例5のトリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液1L(pH5)トリコデルマ水溶液について、分画分子量150,000の中空糸限外ろ過膜(東レ株式会社製“トレフィル”HFU)に通じてクロスフローろ過し、透過液を得た。次に、分画分子量10,000の限外ろ過膜(VIVASCIENCE、“VIVAFLOW” 50、PES、VF05P0)を使用して、ろ過フラックスを変化させながらクロスフローろ過を行い、各ろ過フラックス時の膜間差圧を測定した。比較のため、分画分子量150,000の中空糸限外ろ過膜を行わない場合(比較例2とする。)に関しても、前記同様分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いてろ過フラックスを変化させながらろ過を行い、各ろ過フラックス時の膜間差圧を測定した。結果を図3に示す。
比較例1ではpH3およびpH9の場合の評価を実施したが、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8(pH4〜8)での比較例を下記手順にて実施した。
実施例1では、pH3およびpH9の場合の工程(2)の評価を実施したが、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8(pH4〜8)において、工程(1)および工程(2)の効果があるか、以下手順にて実施した。
参考例5のトリコデルマ菌由来セルラーゼ水溶液(pH3およびpH9)各20mLを、比較例1と同じ手順にて非透過液の液量が0.5mLになるまで濃縮を行い、非透過液(第1の濃縮酵素液)0.5mLおよび透過液19.5mLを回収した。
比較例1では分画分子量10,000の限外ろ過膜を使用したが、本比較例5では分画分子量30,000の限外ろ過膜(Sartorius社製“VIVASPIN” 20、30,000MWCO、PES、有効膜面積6cm2)を使用して実施した。前記使用する限外ろ過膜の分画分子量以外は、比較例1と同じ手順で実施した。得られた結果を表7に示す。
実施例1では第2の限外ろ過膜として分画分子量10,000の限外ろ過膜を使用したが、本実施例4では分画分子量30,000の限外ろ過膜(Sartorius社製“VIVASPIN” 20、30,000MWCO、PES、有効膜面積6cm2)を使用して実施した。前記使用する限外ろ過膜の分画分子量以外は、実施例1と同じ手順で実施した。得られた結果を、表7に示す。
2 pHセンサー
3 pH調整剤タンク
4 pH調整ポンプ
5 バルブ
6 限外ろ過膜ポンプ1
7 コンプレッサー
8 分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜
9 逆洗ポンプ
10 透過液保持タンク
11 バルブ2
12 限外ろ過膜ポンプ2
13 分画分子量5,000〜50,000の限外ろ過膜
14 第2の透過液保持タンク
15 第2の濃縮酵素液保持タンク
Claims (8)
- 以下の工程(1)〜(3)を含むセルラーゼの製造方法。
(1)糸状菌由来セルラーゼ水溶液を分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜に通じてろ過して透過液を得るとともに、非透過液として濃縮酵素液を得る工程。
(2)工程(1)で得られた透過液を、さらに分画分子量5,000〜50,000の第2の限外ろ過膜に通じてろ過し、非透過液として第2の濃縮酵素液を得る工程。
(3)工程(1)および(2)で得られた濃縮酵素液を混合して糸状菌由来セルラーゼを得る工程。 - 糸状菌がトリコデルマ菌である、請求項1に記載のセルラーゼの製造方法。
- 工程(1)において糸状菌由来セルラーゼ水溶液をpH2.6〜5.4またはpH8.6〜9.4に調整する、請求項1または2に記載のセルラーゼの製造方法。
- 糸状菌由来セルラーゼ水溶液が糸状菌培養液または糸状菌由来セルラーゼを使用したセルロース含有バイオマスの加水分解物である、請求項1から3のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- 糸状菌由来セルラーゼ水溶液が、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼおよびキシラナーゼからなる群から選ばれた1以上の酵素成分を含む、請求項1から4のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- 糸状菌由来セルラーゼ水溶液の温度が15〜35℃の温度範囲である、請求項1から5のいずれかに記載のセルラーゼの製造方法。
- セルラーゼの製造装置であって、セルラーゼ水溶液タンクと、これと連結する限外ろ過膜ポンプと、少なくとも1以上の直列または並列に連結された分画分子量100,000〜200,000の限外ろ過膜と、前記限外ろ過膜の透過液保持タンクと、分画分子量5,000〜50,000の第2の限外ろ過膜と、第2の濃縮酵素液保持タンクとを含む装置。
- セルラーゼ水溶液タンクがpHセンサーを具備し、さらに該セルラーゼ水溶液タンクにpH調整剤タンクが連結している、請求項7に記載のセルラーゼの製造装置。
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