BR112014011968B1

BR112014011968B1 - método de produção de celulase

Info

Publication number: BR112014011968B1
Application number: BR112014011968-6A
Authority: BR
Inventors: Hiroyuki Kurihara; Katsushige Yamada
Original assignee: Toray Industries, Inc
Priority date: 2011-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2020-10-20
Also published as: CN103958678A; AU2012341519B2; BR112014011968A2; DK2784156T3; EP2784156A4; US11253818B2; JPWO2013077341A1; WO2013077341A1; EP2784156A1; US20140295525A1; CA2856343A1; EP2784156B1; CN103958678B; IN2014CN03792A; AU2012341519A1; JP6119245B2

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CELULASE E DISPOSITIVO DE PRODUÇÃO DE CELULASE. A presente invenção se refere a um método para a produção da celulase que compreende as seguintes etapas de (1) a (3), em que a celulase obtida pode ser eficazmente utilizada na aplicação detergente e nas aplicações, tais como a hidrólise de amido e a hidrólise da celulose; (1) a etapa de submeter uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso à filtração através de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 para obter um filtrado e para simultaneamente obter um líquido concentrado da enzima como um retentado; (2) a etapa de ainda submeter o filtrado obtido na etapa (1) à filtração através de uma segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 para obter um segundo líquido concentrado da enzima como um retentado; e (3) a etapa de misturar o líquido concentrado da enzima obtido nas etapas (1) e (2) para obter a celulase derivada a partir do fungo filamentoso.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método para a produção da celulase através da separação por membrana e à concentração de um componente da celulase derivado a partir do fungo filamentoso e um dispositivo para esse propósito.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os polissacarídeos, tais como o amido ou celulose estão disponíveis como fontes da biomassa. É conhecido mm método para a produção dos monossacarídeos, tais como a glicose ou a xilose através da hidrólise enzimática de tais polissacarídeos. O líquido do açúcar obtido através da decomposição desses polissacarídeos é amplamente utilizado como fontes de carbono na cultura de microrganismos. Em particular, a celulase é conhecida como uma enzima que hidrolisa a celulose. O fungo filamentoso é conhecido como os microrganismos que produzem esta celulase. O fungo filamentoso produz uma grande quantidade de celulases como enzimas extracelulares através da criação de condições de cultura, para a produção indutiva da celulase. Como estes fungos filamentosos, os fungos filamentosos disponíveis são aqueles do gênero Aspergillus,do gênero Humicola, do gênero Mucor, do gênero Trichoderma, e do gênero Acremonium, que são amplamente utilizados na produção da celulase.

[003] Os componentes das enzimas que exibem diversas especificidades do substrato estão presentes na celulase derivada a partir do fungo filamentoso. Especificamente, estão presentes a celobiohidrolase que atua sobre a região cristalina da celulose, a endoglucanase que atua a partir de dentro da cadeia molecular da celulose para a redução do seu peso molecular, a β-glicosidase que atua nos oligossacarídeos hidrossolúveis ou a celobiose, e a hemicelulase que atua na hemicelulose. Sabe-se que cada um destes componentes da enzima com especificidade variada do substrato sinergicamente atua nas fibras de celulose e, por conseguinte, ocorre a degradação eficiente da celulose (vide, Publicação de Não Patente 1). Também se sabe que, em tal celulase derivada a partir do fungo filamentoso, está presente cada um dos componentes da enzima cujo peso molecular varia em tamanho a partir de pequeno a grande, em que o peso molecular varia a partir de 20 a 100 kDa.

[004] Em relação à celulase derivada a partir do fungo filamentoso, são conhecidos os métodos de separação por membrana e a concentração, utilizando uma membrana de ultrafiltração da mesma maneira como as enzimas comuns. Por exemplo, são conhecidos os métodos de separação e recuperação das celulases, utilizando uma membrana de ultrafiltração, esse método compreende a separação por membrana e a concentração da celulase a partir de uma cultura de microrganismos, tais como o fungo filamentoso ou um hidrolisado de celulose obtido utilizando a celulase (vide Publicações de Patente de 1 a 3). Os métodos foram sugeridos como um tratamento, antes da etapa de separação da membrana e a concentração através de tal membrana de ultrafiltração, esse método compreende a remoção antecipada dos sólidos contidos em uma solução aquosa da celulase a partir de uma cultura de microrganismos ou do hidrolisado de celulose através da utilização, por exemplo, de um filtro de cerâmica filtro de malha giratória (vide Publicação de Patente 2), ou um tecido não tecido com um diâmetro de poro de 20 a 200 pm (vide Publicação de Patente 3). No entanto, para a separação por membrana e a concentração de cada um dos componentes da celulase, é comum a utilização de uma membrana de ultrafiltração com um diâmetro de poros finos ou o peso molecular de corte que é suficiente para bloquear o peso molecular correspondente ao componente da celulase a ser recuperado.

PUBLICAÇÕES DE PATENTES

[005] Publicação de Patente 1: WO 2007/034999.

[006] Publicação de Patente 2: Pedido de Patente Publicado Japonês 2010/221.136.

[007] Publicação de Patente 3: Pedido de Patente Publicado Japonês 2009/240.167.

[008] Publicação de Não patente 1: Encyclopedia of Celulose, Capítulo 6, Biodegradation of Cellulose(editado pela The Cellulose Society of Japan, 2000).

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] Na separação por membrana e na concentração da celulase do fungo filamentoso, utilizando uma membrana de ultrafiltração convencional, os problemas incluíram as incrustações da membrana de ultrafiltração e a inativação ou a agregação do componente da celulase. Estes problemas ocasionaram que a velocidade do tratamento da filtração de membrana de ultrafiltração se tornasse mais lenta ou ocasionaram que uma atividade da celulase obtida através da membrana de ultrafiltração se tornasse inferior, o que também é problemático.

[010] Em vista disto, um objeto da presente invenção é, à luz dos problemas mencionados acima no estado da técnica anterior, fornecer um método eficiente para a separação por membrana e a concentração dos componentes da celulase derivados a partir da Trichodermaatravés da utilização de uma membrana de ultrafiltração e fornecer um dispositivo para esse propósito.

[011] Para alcançar o objeto acima, o presente Depositante concluiu a presente invenção de [1] a [7]: (1) Um método para a produção da celulase que compreende as seguintes etapas de (1) a (3): (2) a etapa de submeter uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso à filtração através de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 para obter um filtrado e para simultaneamente obter um líquido concentrado da enzima como um retentado; (3) a etapa de ainda submeter o filtrado obtido na etapa (1) à filtração através de uma segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 para obter um segundo líquido concentrado da enzima como um retentado; e (4) a etapa de misturar o líquido concentrado da enzima obtido nas etapas (1) e (2) para obter a celulase derivada a partir do fungo filamentoso. [2] O método para a produção da celulase, de acordo com [1], em que o fungo filamentoso é a Trichoderma. [3] O método para a produção da celulase, de acordo com [1] ou [2], em que a solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é ajustada para pH 2,6 a 5,4 ou pH 8,6 a 9,4 na etapa (1). [4] O método para a produção da celulase, de acordo com qualquer de [1] a [3], em que a solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é um líquido da cultura do fungo filamentoso ou um hidrolisado da biomassa que contém a celulose obtida através da utilização da celulase derivada a partir do fungo filamentoso. [5] O método para a produção da celulase, de acordo com qualquer de [1] a [4], em que a solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso compreende um ou mais componentes das enzimas selecionados a partir do grupo que consiste em celobiohidrolase, endoglucanase e xilanase. [6] O método para a produção da celulase, de acordo com qualquer de [1] a [5], em que a temperatura da solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso está em uma faixa de temperatura de 15 a 35° C. [7] Um dispositivo para a produção da celulase que compreende um tanque para uma solução aquosa da celulase, uma bomba de ultrafiltração que está conectada com a mesma e, pelo menos, uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000, que estão conectados em série ou em paralelo, um tanque de retenção para um filtrado da membrana de ultrafiltração mencionada acima, uma segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000, e um segundo tanque de retenção para um líquido concentrado da enzima. [8] O dispositivo para a produção da celulase, de acordo com [7], em que o tanque para uma solução aquosa da celulase compreende um sensor de pH e ainda está conectado a um tanque de ajuste de pH.

[012] De acordo com a presente invenção, é possível realizar de forma eficiente a separação por membrana e a concentração dos componentes da celulase a partir de uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso. Especificamente, uma parte dos componentes da celulase a partir do fungo derivados filamentoso pode ser separada e recuperada na etapa (1) e, além disso, o componente restante da celulase derivado a partir do fungo filamentoso contido em um filtrado pode ser recuperado na etapa (2), por conseguinte, recuperando uma atividade da degradação de teor particularmente elevado de Avicel.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[013] A Figura 1 é um desenho que mostra um fluxo de uma das etapas do método para a produção da celulase da presente invenção.

[014] A Figura 2 é um desenho que mostra o resultado da análise de um líquido concentrado da enzima através de um Bioanalizador (Agilent, Protein 230 kit), cujo líquido concentrado da enzima foi obtido ajustando o pH da celulase derivada a partir da Trichodermapara diversos pH e submetendo o produto resultante para a filtração através da primeira membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 para separar como um retentado.

[015] A Figura 3 é um desenho que mostra o fluxo crítico de uma membrana de ultrafiltração, no momento de obter um segundo líquido concentrado da enzima.

[016] A Figura 4 é uma vista em seção transversal que mostra um exemplo de um dispositivo para a realização do método para a produção da celulase da presente invenção.

[017] A Figura 5 é uma vista em seção transversal que mostra um outro exemplo de um dispositivo para a realização do método para a produção da celulase da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[018] O método para a produção da celulase da presente invenção consiste em etapas que compreendem as seguintes etapas de (1) a (3) (Figura 1).

ETAPA (1)

[019] Na etapa (1), uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é submetida à filtração através de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 para obter um filtrado, e ao mesmo tempo, para obter um líquido concentrado da enzima como um retentado. Descobriu-se que, nesta ocasião, uma parte dos componentes da enzima contida na solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso foi separada como o retentado da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000. Além disso, por outro lado, descobriu-se que, também na parte lateral da alimentação, o componente da enzima remanescente é separado na parte lateral da alimentação; e o componente da enzima remanescente é recuperado na etapa seguinte (2).

ETAPA (2)

[020] Na etapa (2), o filtrado da etapa (1) mencionada acima é submetido à filtração através da segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 para obter o segundo líquido concentrado da enzima como um retentado. Devido a isso, é possível recuperar totalmente o componente da enzima que está contido no filtrado da etapa (1). A separação e a concentração da celulase derivada a partir do fungo filamentoso em duas etapas da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 na etapa (1) descrita acima e a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000, na etapa (2), permite uma maior atividade da enzima a ser separada, em comparação com a técnica convencional, que compreende a separação e concentração apenas utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000.

ETAPA (3)

[021] Na etapa (3), o primeiro líquido concentrado da enzima obtido na etapa (1) e o segundo líquido concentrado da enzima obtido na etapa (2) são misturados para obter uma celulase que possui uma atividade elevada da enzima a partir da solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso. A celulase obtida nesta etapa (3) pode ser utilizada como tal. No entanto, ela pode ser utilizada com a concentração ou pH da celulase a serem ajustados, conforme adequado.

[022] A realização preferida da presente invenção será ainda descrita abaixo em detalhes.

[023] A celulase derivada a partir do fungo filamentoso se refere à celulase que é produzida pelo fungo filamentoso. Os exemplos do fungo filamentoso que produzem a celulase incluem os microrganismos, tais como a Trichoderma, Aspergillus, Cellulomonas, Clostridium, Streptomyces, Humicola, Acremonium, Irpex, Mucor, ou Talaromyces. Uma vez que estes microrganismos produzem a celulase em um líquido da cultura do mesmo, o líquido da cultura pode ser utilizado tal e qual como uma celulase do fungo filamentoso não purificado; ou o líquido da cultura pode ser purificado e formulado, e o formulado pode ser utilizado como uma celulase do fungo filamentoso.

[024] A celulase derivada a partir do fungo filamentoso utilizada na presente invenção, de preferência, é a celulase derivada a partir da Trichoderma. A Trichoderma se refere ao fungo filamentoso que é classificado no gênero Trichoderma, no gênero Humicola, e no gênero Hypocrea. Além disso, a celulase derivada a partir da Trichoderma se refere a todos os componentes da celulase que são intracelularmente ou extracelularmente produzidos pela Trichoderma mencionada acima. Além disso, a celulase utilizada na presente invenção se refere a uma enzima que apresenta uma atividade da hidrólise da celulose e a uma enzima que apresenta uma atividade da hidrólise da hemicelulose.

[025] Além disso, entre a celulase derivada a partir da Trichoderma, de preferência, está a celulase derivada a partir da Trichoderma reesei. Os exemplos da celulase derivada a partir da Trichoderma reesei incluem a celulase derivada a partir da Trichoderma reesei QM9414, Trichoderma reesei QM9123, Trichoderma reesei RutC-30, Trichoderma reesei PC3-7, Trichoderma reesei ATCC66589, Trichoderma reesei CI-847, Trichoderma reesei MCG77, e Trichoderma reesei MCG80. Além disso, uma cepa mutante com uma produtividade aprimorada da celulase pode ser utilizada, em que a cepa mutante é derivada a partir da Trichoderma descrita acima e obtida através de submeter a cepa bacteriana á mutagênese através de um mutagênico, irradiação com raios UV ou similares.

[026] Uma vez que diversas celulases são secretadas e produzidas em um líquido da cultura através da cultura de Trichoderma em condições médias adequadas, é possível obter a celulase derivada a partir da Trichoderma a partir desse líquido da cultura. Esse líquido da cultura pode permanecer não purificado e ser utilizado como a celulase derivada a partir da Trichoderma', ou o líquido da cultura pode ser aquele que é purificado ou ainda formulado através de uma técnica conhecida. Nos casos em que a celulase derivada a partir da Trichoderma é purificada a partir do meio do líquido da cultura mencionado acima e utilizada como aquela que foi formulada, ela pode ser adicionada, com as substâncias diferentes da enzima, tais como os inibidores da protease, os dispersantes, os aceleradores de dissolução e os estabilizadores.

[027] Além disso, a celulase derivada a partir da Trichoderma utilizada na presente invenção pode ser obtida ajustando o DNA que codifica para uma sequência de aminoácidos de um componente da celulase presente no genoma de Trichoderma, que liga o DNA resultante a um vetor de expressão, e introduzindo este vetor de expressão em um hospedeiro para a produção de uma proteína recombinante, seguido pelo seu isolamento e purificação.

[028] A Trichoderma produz, pelo menos, dois tipos de endoglucanases (endoglucanase I, endoglucanase II), pelo menos, dois tipos de celobiohidrolases (celobiohidrolase I, celobiohidrolase II), pelo menos, dois tipos de hemicelulases (xilanase, xilosidase), e um ou mais tipos de β-glucosidases.

[029] A celobiohidrolase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da hidrólise da celulose a partir das porções terminais. O grupo de enzimas que pertence à celobiohidrolase está descrito como o número EC: EC3.2.1.91. A endoglucanase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da hidrólise das cadeias moleculares da celulose a partir de suas porções centrais. O grupo de enzimas que pertence à endoglucanase está descrito como o número EC: EC3.2.1.4. A exoglucanase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da hidrólise das cadeias moleculares da celulose a partir de seu término. O grupo de enzimas que pertence à exoglucanase está descrito como o número EC: EC3.2.1.74. A β-glucosidase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da ação nas celo- oligossacarídeos ou celobiose. O grupo de enzimas que pertence à β-glicosidase está descrito como o número EC: EC3.2.1.21.

[030] A xilanase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da ação na hemicelulose ou, em particular, no xilano. O grupo de enzimas que pertence à xilanase está descrito como o número EC: EC3.2.1.8. A xilosidase é um termo geral para as celulases caracterizadas através da ação nos xilo-oligossacarídeos. O grupo de enzimas que pertence à xilosidase está descrito como o número EC: EC3.2.1.37.

[031] A celulase derivada a partir do fungo filamentoso utilizado na presente invenção pode ser aquela em que uma atividade de enzima particular é intensivada através da adição dos componentes da celulase a partir de diferentes espécies de microrganismos. O que pode ser adicionada é a celulase derivada a partir do fungo filamentoso que inclui, por exemplo, do gênero Aspergillus,do gênero Cellulomonas, do gênero Clostridium,do gênero Streptomyces, do gênero Acremonium, do gênero Irpex, do gênero Mucor, e do gênero Talaromyces. Além disso, os exemplos dos termófilos incluem os microrganismos, tais como do gênero Sulofolobus, do gênero Thermoplasma,do gênero Caldivirgra, do gênero Thermosphaera, do gênero Pyrococcus,do gênero Picrophilus, do gênero Caldivirgra, e do gênero Fervidobacterium.

[032] Em relação a cada um dos componentes da enzima contidos na celulase derivada a partir do fungo filamentoso, é possível especificar o seu componente utilizando uma técnica de separação conhecida. A identificação pode ser realizada, por exemplo, através da separação por meio de uma técnica conhecida, tal como a filtração em gel, troca iônica, ou eletroforese bidimensional, e análise da sequência de aminoácidos (análise N-terminal, análise C-terminal e espectrometria de massa) do componente separado, seguido pela comparação com uma base de dados.

[033] A atividade da enzima de celulase derivada a partir do fungo filamentoso pode ser avaliada através da atividade da hidrólise dos polissacarídeos, que inclui uma atividade da degradação de Avicel, atividade da degradação da celulose de carboximetila (CMC), atividade da degradação da celobiose, atividade da degradação do xilano e atividade da degradação do manano. Em relação à atividade da degradação de Avicel, a celobiohidrolase ou exoglucanase, que apresenta características da hidrólise da celulose a partir das porções terminais é a principal enzima que exibe essa atividade. Além disso, em relação à atividade da degradação do xilano, a xilanase e a xilosidase são as enzimas principais que exibem essa atividade. Em relação à atividade da degradação da celobiose, a β-glicosidase principalmente é uma principal enzima que exibe essa atividade. Para o CMC, todos os tipos de celulases podem exibir uma ação catalítica. No presente, o termo “principal” se refere a uma expressão com base no fato da enzima ser conhecida por estar mais envolvida na degradação. Isso significa que, os componentes da enzima diferentes desse principal também estão envolvidos na degradação.

[034] Uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é uma solução aquosa que contém um ou mais tipos de componentes da celulase derivados do fungo filamentoso descrito acima. Deve ser observado que, na presente invenção, uma solução aquosa que contém diversos tipos de componentes da celulase derivados a partir do fungo filamentoso é a de preferência. Além disso, além do componente intrínseco da celulase derivado a partir do fungo filamentoso, pode estar contida uma enzima ou celulase originada de diferentes espécies de microrganismos.

[035] A solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso utilizado na presente invenção não é restringida, em particular e, de preferência, é um hidrolisado obtido através da adição da celulase derivada a partir do fungo filamentoso em uma cultura do fungo filamentoso ou biomassa que contém a celulose para a hidrólise. Os exemplos de um ácido utilizado no ajuste de pH incluem o ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, e ácido nítrico. Os exemplos de um alcalino incluem o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, e hidróxido de cálcio. O ácido ou o alcalino não é, em particular, restrito, desde que seja capaz de se ajustar a um pH fixado de maneira econômica e os componentes da enzima da celulase derivada a partir do fungo filamentoso não são inativadas ou não se agregam.

[036] A solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso, de preferência, é aquela que é submetida a uma ou mais operações de separação sólido-líquido selecionadas a partir da centrifugação, filtração do filtro-prensa, filtração do filtro-tambor, filtração do filtro-profundidade, separação da sedimentação, tratamento de agregação, e filtração de areia; e ajustada a turbidez para uma faixa de 0,1 a 100 NTU. A turbidez é definida em JIS K0101 “Testing Methods for Industrial WateT conforme a seguir: “A turbidez é uma expressão de um grau de nebulosidade da água e é resolvida na turbidez visual, turbidez da luz transmitida, turbidez da luz dispersa, e turbidez da esfera integrada a ser indicada. Nos casos em que a medição é realizada, em comparação com um líquido padrão de caulino, a turbidez é expressa em “graus (caulino)”, tal como uma unidade;, enquanto que nos casos em que a medição é realizada, em comparação com um líquido padrão de formazina, a turbidez é expressa em “graus (formazina)” como uma unidade.

[037] Na presente invenção, é utilizado um líquido padrão de formazina que exibe melhor reprodutibilidade e estabilidade que aqueles de um líquido padrão de caulino; e a turbidez “NTU”, que é medida através de um método de medição de luz dispersa é empregada. A NTU se refere a “Unidade Nefelométrica de Turbidez” e quando a turbidez é superior a 100 NTU, uma turbidez elevada se torna um fator da membrana de incrustação na filtração através de uma membrana de ultrafiltração, na etapa (2) descrita mais adiante. Por conseguinte, de preferência, se ajusta a turbidez para uma faixa de 0,1 a 100 NTU, realizando uma ou mais operações de separação sólido-líquido descrita acima. A técnica de separação sólido-líquido descrita acima pode ser realizada através de um dispositivo e um procedimento conhecido. Em contraste, para ajustar a turbidez para inferior a 0,1 NTU, é necessária a utilização de uma membrana de microfiltração, com um diâmetro de poro fino de 0,05 a 1,0 pm. Nos casos em que uma membrana de microfiltração é utilizada, existe uma possibilidade do componente da enzima da celulase derivado a partir do fungo filamentoso estar bloqueado como um retentado da membrana de microfiltração e, por conseguinte, a turbidez, de preferência, é de 0,1 NTU ou superior.

[038] A membrana de ultrafiltração utilizada na presente invenção se refere a uma membrana de separação, que possui um diâmetro médio de poro fino de 0,02 a 0,0001 pm e uma membrana de separação capaz da separação por membrana e da concentração dos compostos de elevado peso molecular principalmente hidrossolúvel, tais como as enzimas ou proteínas por meio de um efeito de crivagem molecular.

[039] Na presente invenção, são utilizados dois tipos de membranas de ultrafiltração, que são a primeira membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.0000 a 20.0000 e a segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000. O peso molecular de corte (MWCO) se refere àquele que define o desempenho da membrana através da medição do peso molecular que pode ser separado como uma fração do retentado da membrana, conforme é descrito “A curva obtida através da representação gráfica dos dados, com o peso molecular do soluto ao longo do eixo horizontal e a taxa de bloqueio ao longo do eixo vertical é denominada uma curva do peso molecular de corte. O peso molecular em que a taxa de bloqueio é de 90% é denominado o peso molecular de corte da membrana” em The Membrane Society of Japan ed., Membrane Experiment Series, Volume III, Artificial Membrane, membros do Comitê Editorial:. Shoji Kimura, Shin-ichi Nakao, Haruhiko Ohya, e Tsutomu Nakagawa (Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., 1993), página 92. Quanto a uma técnica para a determinação do peso molecular de corte, diversas amostras padrão do dextrano ou amostras padrão da proteína cujos pesos moleculares são conhecidos podem ser filtradas através de uma membrana de ultrafiltração para avaliar a sua taxa de bloqueio e desenhar uma curva de separação do mesmo, por conseguinte, determinando o peso molecular de corte. Especificamente, uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 se refere a uma membrana de ultrafiltração que bloqueia 90% das moléculas com um peso molecular de 100.000.

[040] A celulase derivada a partir do fungo filamentoso contém os componentes de enzima, variando em tamanho desde pequeno a grande em uma faixa de 20 a 100 kDa; e em que uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é submetida à filtração através da primeira membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000, espera-se que o componente da enzima não possa ser recuperado a partir da parte lateral da alimentação. No entanto, ao contrário das expectativas, na etapa (1) da presente invenção, uma parte dos componentes da enzima em uma faixa de 20 kDa a 100 kDa de celulase derivada a partir do fungo filamentoso pode ser recuperada a partir da parte lateral da alimentação, através da utilização da primeira membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000. Quando o peso molecular de corte da primeira membrana de ultrafiltração excede 200.000, a quantidade do componente da enzima recuperada como um retentado é reduzido, o que, por conseguinte, não é de preferência. Quando o peso molecular de corte é inferior a 100.000, a quantidade dos componentes da enzima recuperada pela membrana de ultrafiltração aumenta excessivamente, o que, por conseguinte, não é de preferência. Deve ser observado que o peso molecular de corte preferido da primeira membrana de ultrafiltração é de 100.000 a 150.000.

[041] E, o filtrado da etapa (1) é submetido a uma filtração com uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000, na etapa (2); e os componentes da enzima da celulase derivados a partir do fungo filamentoso que ainda não foram completamente recuperados na etapa (1) são recuperados. Com o peso molecular de corte da segunda membrana de ultrafiltração inferior a 5.000, o fluxo das reduções da membrana e, além disso, a quantidade e a atividade da enzima recuperada não se alteram significativamente, o que, por conseguinte, não é de preferência. Com o peso molecular de corte de fora superior a 50.000, o componente da celulase derivado a partir do fungo filamentoso contido no filtrado da etapa (1) é filtrado para a parte lateral do filtrado e, por conseguinte, a quantidade e a atividade da enzima recuperada são reduzidas, o que, por conseguinte, não é de preferência. Deve ser observado que o peso molecular de corte preferido da segunda membrana de ultrafiltração é de 10.000 a 30.000.

[042] A propriedade de separação de uma membrana de ultrafiltração (membrana de polímero) é determinada pelo diâmetro de poro fino de uma camada densa denominada uma camada de função. Como materiais da camada de função da membrana de ultrafiltração utilizada na etapa (1) e na etapa (2), os materiais, tais como a sulfona de poliéter (PES), polissulfona (PS), poliacrilonitrilo (PAN), difluoreto de polivinilideno (PVDF), celulose regenerada, celulose, éster de celulose, polissulfona sulfonada, sulfona sulfonada de poliéter, poliolefina, álcool de polivinila, polimetacrilato de metila, ou tetrafluoreto de polietileno podem ser utilizados. Devido a celulose regenerada, celulose, e éster de celulose passarem pela degradação através da celulase derivada a partir da Trichoderma, é preferida a utilização de uma membrana de ultrafiltração, em que o material da camada de função é um composto de polímero sintético, tal como o PES ou PVDF.

[043] Em relação a uma condição de pH no momento da filtração através de uma membrana de ultrafiltração, de preferência, na etapa (1) da presente invenção, se ajusta o pH de uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso para pH 2,6 a 5,4 ou pH 8,6 a 9,4. Deve ser observado que, na presente invenção, se o pH da solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso já estiver dentro de uma faixa de pH de 2,6 a 5,4 ou um pH de 8,6 a 9,4, o pH é considerado ajustado a essa faixa. Quanto a um efeito de ajuste do pH na etapa (1) e, em seguida, filtrando através de uma membrana de ultrafiltração, a presente invenção possui um efeito através de que a quantidade dos componentes da enzima contida em um líquido concentrado da enzima que pode ser recuperado como um retentado pode aumentar.

[044] Deve ser observado que a permeabilidade de uma enzima ou proteína através de uma membrana de ultrafiltração é conhecida por se alterar devido a uma condição de pH. Acredita-se que isto é ocasionado pelo fato de que a condição de carga da superfície de uma enzima ou proteína dissolvida em uma solução aquosa e, por conseguinte, o peso molecular aparente da mesma, na solução aquosa se altera. No entanto, é conhecido que tal condição e extensão da alteração do peso molecular aparente são alteradas através de diversos fatores, incluindo uma sequência de aminoácidos característica e estrutura estérica específica para cada um dos componentes de enzima e, além disso, a interação atuando entre as respectivas enzimas dissolvidas na solução aquosa. No caso da celulase derivada a partir do fungo filamentoso, as alterações no peso molecular aparente de cada um dos componentes da enzima em cada condição de pH ou estados de associação de um componente individual da enzima na solução aquosa, em que os diversos tipos de cada componente da enzima da celulase derivada a partir do fungo filamentoso são dissolvidos não foram esclarecidas. Por conseguinte, como é evidente, as alterações na permeabilidade de cada componente da enzima da celulase derivada a partir do fungo filamentoso através da membrana de ultrafiltração através das alterações no pH também não foram esclarecidas.

[045] Uma condição de temperatura no momento da filtração através de uma membrana de ultrafiltração, na etapa (1) e na etapa (2) não é, em particular, restrita, desde que esteja em uma faixa de temperatura em que as enzimas não são inativadas ou não se agregam e a temperatura, de preferência, está em uma faixa de 15 a 35° C. Em particular, quando a temperatura for superior a 35° C, os componentes que possuem uma atividade enzimática da xilanase ou da endoglucanase podem ser agregados, em alguns casos, esses componentes são os componentes das enzimas com um peso molecular inferior a 40 kDa, que são uma parte dos componentes da enzima da celulase do fungo filamentoso.

[046] Uma taxa de filtração através de uma membrana de ultrafiltração da etapa (1), não é, em particular, restrita, desde que esteja em uma faixa em que as enzimas são bloqueadas na parte lateral da alimentação e a taxa de filtração, de preferência, é de 0,5 a 8 m/dia. Com a taxa de filtração sendo inferior a 0,5 m/dia, essa taxa é um fator de redução da taxa de bloqueio da celulase derivada a partir do fungo filamentoso. Por outro lado, com a taxa de filtração superior a 8 m/dia, essa taxa pode ocasionar um aumento acentuado na diferença da pressão da transmembrana da membrana de ultrafiltração e a sua incrustação abrupta.

[047] Entretanto, devido à membrana de ultrafiltração utilizada na etapa (2) corresponder ao peso molecular da celulase derivada a partir do fungo filamentoso, a taxa de filtração afeta menos a taxa de bloqueio da celulase derivada a partir do fungo filamentoso e a taxa de filtração pode ser determinada tendo em consideração a incrustação da membrana. E, a taxa de filtração, de preferência, é de 0,1 a 4 m/dia.

[048] Deve ser observado que a taxa de filtração (m/dia) é calculada através da seguinte Fórmula (Fórmula 1), em que a solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso para ser filtrada é submetida à filtração através da membrana de ultrafiltração com uma área de membrana determinada específica (m2); e o fluxo resultante (m3/h) é medido.

[049] Taxa de filtração (m/dia) = Fluxo (m3/h) x 24 - área da membrana (m2) (Fórmula 1)

[050] Na etapa (1) e na etapa (2), a concentração de um líquido concentrado da enzima que é obtido como um retentado de uma membrana de ultrafiltração, de preferência, está em uma faixa de 1 a 100 g/L. Com a concentração superior a 100 g/L, a viscosidade do líquido concentrado da enzima e separado por uma membrana na parte lateral da alimentação aumenta, o que pode provocar uma redução abrupta na taxa de filtração. Por outro lado, com a concentração inferior a 1 g/L, a solução é demasiadamente diluída, como o líquido concentrado da enzima e separado por uma membrana e, por conseguinte, essa concentração não pode ser considerada uma concentração suficiente para a razão da utilização do líquido concentrado da enzima.

[051] Quanto a membrana de ultrafiltração utilizada na etapa (1) e na etapa 2, aquela em uma forma adequada, tais como a membrana do tipo plana, tipo espiral, tipo tubular, ou tipo de fibra oca pode ser utilizada.

[052] Em particular, devido existir uma possibilidade que uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso utilizada na etapa (1) conter sólidos ou similares, uma membrana de separação com uma forte resistência na incrustação da membrana é a de preferência. Isto é, uma membrana de ultrafiltração do tipo de pressão de fibra oca externa é de preferência. Uma membrana de fibra oca se refere a uma membrana de separação, que possui uma cavidade oca no seu interior e possui camadas de função dentro ou fora da cavidade oca. Em particular, na presente invenção, de preferência, é uma membrana de ultrafiltração do tipo de pressão de fibra oca externa com capacidade para permear a filtração da água de alimentação a partir da parte externa da membrana de fibra oca e para obter um filtrado na parte interna da membrana de fibra oca. A membrana do tipo de pressão de fibra oca externa apresenta as características de possuir uma resistência mais forte à incrustação da membrana por sólidos e, além disso, é mais fácil de lavar que uma do tipo de pressão interna.

[053] Enquanto isso, a membrana de ultrafiltração que é utilizada na etapa (2) pode assumir qualquer forma. Em particular, um tipo espiral que possui uma área elevada de membrana por unidade de volume é o de preferência. Uma vez que o filtrado obtido na etapa (1), na presente invenção, é utilizado na etapa (2), a presente invenção possui efeitos de aprimoramento da taxa de filtração na etapa (2) e também permite a prevenção das incrustações da membrana.

[054] Os exemplos concretos destes incluem o tipo G-5, tipo G-10, tipo G-20, tipo G-50, tipo PW, e tipo HWS UF, que são fabricados por DESAL; HFM-180, HFM-183, HFM-251, HFM-300, HFM-116, HFM-183, HFM-300, HFK- 131, HFK-328, MPT-U20, MPS-U20P e MPS-U20S, todos são fabricados por KOCH; SPE1, SPE3, SPE5, SPE10, SPE30, SPV5, SPV50, e SOW30, todos são fabricados por Snyder; “Microza” (marca registrada) séries UF fabricados pela Asahi Kasei Corporation; e NTR7410 e NTR7450, os dois são fabricados pela Nitto Denko Corporation.

[055] A ultrafiltração na etapa (1) e na etapa (2) pode ser de filtração sem saída (filtração de fluxo normal) ou filtração de fluxo cruzado (filtração de fluxo tangencial). A filtração sem saída (filtração de fluxo normal) é um método de aplicação da pressão vertical contra a superfície da membrana da membrana de ultrafiltração para realizar a filtração a partir da parte lateral da alimentação para a parte lateral do filtrado. Por outro lado, a filtração de fluxo cruzado (filtração de fluxo tangencial) é um método de realização da filtração durante a remoção de uma camada sedimentar formada na superfície da membrana de ultrafiltração através da geração do fluxo paralelo à superfície da membrana, que é uma direção de filtração, (fluxo cruzado ou fluxo tangencial), através de uma bomba, bolhas de ar, ou outros similares. Através deste fluxo cruzado (ou fluxo tangencial), as incrustações da membrana da membrana de ultrafiltração podem ser evitadas. Em particular, nos casos em que um tipo de fibra oca de pressão externa for utilizado na etapa (1), a filtração sem saída, é a de preferência. Além disso, nos casos em que uma membrana do tipo plana ou de tipo espiral for utilizada na etapa (1) e na etapa (2), a filtração de fluxo cruzado é a de preferência.

[056] Nos casos em que a membrana de ultrafiltração que é utilizada na etapa (1) para uma membrana de ultrafiltração do tipo de pressão de fibra oca externa, de preferência, é realizada uma operação de retrolavagem em que um filtrado é intermitentemente passado através da parte lateral do filtrado para a parte lateral da alimentação. Através desta operação de retrolavagem, os materiais depositados, que são depositados sobre a membrana da membrana de ultrafiltração, tal como os sólidos ou enzimas, podem ser separados. Isto é, através desta operação, o entupimento no momento da filtração através da membrana de ultrafiltração pode ser evitado e o processo de filtração pode ser realizado de forma estável durante um longo período de tempo. Esta operação pode ser realizada no momento da filtração através da membrana de ultrafiltração, no término da filtração, ou similares. O momento para a realização desta operação inclui os casos em que a pressão diferencial filtração da membrana de ultrafiltração aumenta ou nos casos em que a operação é realizada em faixass regulares, independentemente da pressão diferencial. O último é o de preferência.

[057] Em relação ao líquido concentrado da enzima obtido na forma de um retentado da membrana de ultrafiltração, na etapa (1) ou na etapa (2), de preferência, se recupera a líquido concentrado da enzima através da geração do fluxo cruzado através do arejamento e/ou a circulação da solução em uma faixa de uma velocidade linear da superfície da membrana de 1 a 200 cm/s. Além disso, nesta ocasião, o líquido concentrado da enzima também pode ser obtido enquanto a operação de retrolavagem descrita acima é continuamente ou intermitentemente realizada para gerar o fluxo cruzado descrito acima.

[058] A celulase obtida na presente invenção pode ser utilizada, aproveitando da sua própria atividade catalítica, na aplicação do produto alimentar, detergentes, agentes de limpeza, agentes de limpeza ambiental, aplicação de adubação, aplicação de alimentação, aplicação cosmética, aplicação de farmacêutica, ou similares.

[059] A celulase obtida na presente invenção pode ser amplamente utilizada na hidrólise da biomassa, que contém a celulose. A biomassa que contém a celulose se refere àquela que contém, pelo menos, a celulose ou a hemicelulose. Os exemplos concretos incluem o bagaço de cana, palha de milho, sabugo de milho, gramíneas do gênero Panícum {switchgrass), palha de arroz, palha, árvore, madeira, materiais dos resíduos de construção, papel, papel usado, e celulose. Estas biomassas que contêm a celulose contêm as substâncias impuras, tais como a lignina do composto aromático do polímero ou hemicelulose. As biomassas que contêm a celulose, em que a lignina ou hemicelulose foi parcialmente degradada através da utilização do ácido, alcalino, água quente pressurizada, ou similares, tal como o pré-tratamento pode ser utilizada como celulose. As condições de hidrólise podem ser definidas como as condições de reação ótimas para a celulase derivada a partir do fungo filamentoso. Uma temperatura de tratamento de 40 a 60 0 C, um pH de tratamento de 3 a 7, e uma concentração do teor dos sólidos da biomassa que contém a celulose de 0,1 a 30% são de preferência. Através da configuração do faixa da condição de reação ótima acima, a eficiência da hidrólise da biomassa pode ser realizada a uma máxima. 0 tratamento da hidrólise pode ser realizado através de um método descontínuo ou pode ser realizado através de um método contínuo. Devido a um hidrolisado obtido através desse tratamento enzimático conter os componentes dos monossacarídeos, tais como a glicose ou a xilose, ele pode ser utilizado como a fermentação do açúcar bruto, tais como o etanol ou o ácido láctico.

[060] Quando a celulase obtida na presente invenção é utilizada, um componente da enzima que possui outra função, tal como a oxidase, redutase, hidrolase, transferase, ou isomerase pode ser adicionado para ser utilizado como um agente de enzima. Em particular, esse componente da enzima que possui outra função não se limita ao fungo filamentoso; e os componentes das enzimas derivadas a partir de qualquer organismo ou componentes das enzimas produzidos através da recombinação dos genes, podem ser adicionados e utilizados.

[061] Um dispositivo para a realização da presente invenção será descrito utilizando a Figura 4 e a Figura 5, como suas realizações. A Figura 4 e a Figura 5 são vistas em corte transversal que descrevem um exemplo do dispositivo da realização da presente invenção.

[062] O dispositivo da Figura 4 é um dispositivo do tipo de elemento em espiral, que utiliza uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000. Uma solução aquosa da celulase derivada a partir do fungo filamentoso é mantida no tanque para uma solução aquosa da celulase (1). Neste reservatório (1), o ajuste do pH é realizado e, por conseguinte, o sensor (2) do pH está instalado no tanque. Um sinal de pH detectado é transferido para a bomba de ajuste de pH. A bomba (3) de ajuste de pH está conectada ao tanque (4) de regulação do pH, que contém um ácido ou alcalino; e um regulador de pH é enviado para o tanque de uma solução aquosa da celulase (1). O tanque para uma solução aquosa da celulase (1) está conectado à membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 por meio da bomba de ultrafiltração (6).

[063] No dispositivo da Figura 4, a membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 está conectada em uma estrutura em árvore. No entanto, não existem limitações particulares. Além disso, o filtrado da membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 está conectado ao tanque de retenção de filtrado (10). O retentado da membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 é recuperado como o primeiro líquido concentrado da enzima. O líquido concentrado da enzima, que é o retentado pode ser recuperado tal e qual, como o primeiro líquido concentrado da enzima, desde que a separação e a concentração necessárias e suficientes possam ser alcançadas; e o líquido concentrado da enzima pode ser conectado ao tanque por uma solução aquosa da celulase (1) para uma circulação a fim de obter uma taxa de concentração mais suficiente.

[064] Em relação ao filtrado da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000, a separação e a concentração ainda são realizadas com a segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte médio de 5.000 a 50.000. O tanque de retenção do filtrado (10) está conectado à membrana de ultrafiltração (13) com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000, por meio da válvula (11) e da bomba de ultrafiltração (12). Conforme mostrado na Figura 4, a membrana de ultrafiltração (13) com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 pode ser conectada em uma estrutura em árvore. O retentado da membrana de ultrafiltração (13) com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 é recuperado na forma de um líquido concentrado da enzima. O líquido concentrado da enzima é recuperada no segundo tanque de retenção para o líquido concentrado da enzima (14) e o filtrado é recuperado no segundo tanque de retenção para o filtrado (15).

[065] O dispositivo da Figura 5 é uma realização em que uma membrana de ultrafiltração do tipo de pressão de fibra oca externa é utilizada como a membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000. Nos casos em que a membrana de ultrafiltração do tipo de pressão de fibra oca externa é utilizada, o dispositivo compreende o compressor (7), que gera as bolhas de ar para a lavagem da superfície da membrana da fibra oca e a bomba de retrolavagem (9) para a realização da retrolavagem da membrana através da utilização do filtrado da membrana de ultrafiltração (8) com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000. O restante é igual ao descrito no dispositivo da Figura 4.

EXEMPLOS

[066] A título de exemplo, a presente invenção será agora concretamente descrita abaixo. A presente invenção, no entanto, não se limita aos mesmos.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE CULTURA DA TRICHODERMA

[067] Um líquido da cultura de Trichoderma foi preparado através do seguinte método.

PRÉ-CULTURA

[068] 5% da água de maceração de milho (p/v), 2% de glicose (p/v), 0,37% de tartarato de amónio (p/v), 0,14% de sulfato de amónio (p/v), 0,2% de fosfato diidrogênio de potássio (p/v), 0,03% de cloreto de cálcio diidratado (p/v), 0,03% de sulfato de magnésio heptaidratado (p/v), 0,02% de cloreto de zinco (p/v), 0,01% cloreto de ferro hexaidratado (III) (p/v), 0,004% de sulfato de cobre pentaidratado (II) (p/v), 0,0008% de cloreto de manganês tetraidratado (p/v), 0,0006% de ácido bórico (p/v), e 0,0026% de heptamolibdato de hexamônio tetraidratado (p/v) foram adicionados a água destilada; e 100 mL do produto resultante foram colocados em um balão Erlenmeyer de 500 mL com defletores e submetidos à esterilização em autoclave, a uma temperatura de 121° C durante 15 minutos. Após o resfriamento, o produto resultante foi adicionado a cada um dos PE-M e Tween 80 a 0,01% (p/v), esses PE-M e Tween 80 foram separadamente submetidos à esterilização em autoclave, a uma temperatura de 121° C durante 15 minutos. A Trichoderma reesei ATCC66589 foi semeada a este meio de pré-cultura, de maneira a ser de 1 x 105 células / mL e cultivada a uma temperatura de 28° C durante 72 horas com agitação a 180 rpm (dispositivo de agitação: Bio-Agitador BR-40LF fabricado por TAITEC), por conseguinte, obtendo a pré-cultura.

CULTURA PRINCIPAL

[069] 5% da água de maceração de milho (p/v), 2% de glicose (p/v), 10% de celulose (Avicel) (p/v), 0,37% de tartarato de amónio (p/v), 0,14% de sulfato de amónio (p/v), 0,2% de fosfato diidrogênio de potássio (p/v), 0,03% de cloreto de cálcio diidratado (p/v), 0,03% de sulfato de magnésio heptaidratado (p/v), 0,02% de cloreto de zinco (p/v), 0,01% cloreto de ferro hexaidratado (III) (p/v), 0,004% de sulfato de cobre pentaidratado (II) (p/v), 0,0008% de cloreto de manganês tetraidratado (p/v), 0,0006% de ácido bórico (p/v), e 0,0026% de heptamolibdato de hexamônio tetraidratado (p/v) foram adicionados à água destilada; e 2,5 L do produto resultante foi introduzido em um frasco de agitação 5 L (fabricado por ABLE, DPC-2A) e submetido à esterilização em autoclave, a uma temperatura de 121° C durante 15 minutos. Após o resfriamento, o produto resultante foi adicionado a cada um dos PE-M e Tween 80 a 0,1%, esse PE-M e Tween 80 foram separadamente submetidos à esterilização em autoclave a uma temperatura de 121° C durante 15 minutos; e 250 mL de Trichoderma reesei ATCC66589 que foram previamente pré-cultivadas em meio líquido através do método mencionado acima foram inoculados. Posteriormente, a cultura foi realizada com agitação, a uma temperatura de 28° C durante 87 horas a 300 rpm em uma condição de um volume de aeração de 1 vvm; e, após a centrifugação, o sobrenadante foi submetido à filtração por membranas (“STERICUP”-GV fabricado pela Millipore, material: PVDF). Este líquido da cultura ajustado na condição descrita acima foi utilizado nos exemplos seguintes como uma solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DO AÇÚCAR

[070] A concentração da glicose e xilose, que estavam contidas no líquido do açúcar foi quantificada nas condições de HPLC descritas abaixo através da comparação com uma amostra padrão. Coluna: Luna NH2 (fabricada por Phenomenex) Fase móvel: Milli-Q: acetonitrila = 25:75 (taxa defluxo de 0,6 mL/min) Líquido de reação: Nenhum Método de detecção: RI (índice diferencial de refração) Temperatura: 30° C

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 MÉTODO DE MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DA CELULASE

[071] A atividade da celulase foi dividida em três tipos de atividades da degradação: (1) atividade da degradação de Avicel, (2) atividade da degradação da celobiose, e (3) atividade da degradação do xilano; e a atividade foi medida e avaliada por meio do seguinte procedimento.

(1) ATIVIDADE DA DEGRADAÇÃO DO AVICEL

[072] Para um líquido da enzima (preparado em condições predeterminadas), 1 g/L de Avicel (fabricado pela Merck) e o tampão de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados a 100 mM. A mistura resultante, enquanto girada e misturava, foi deixada para reagira uma temperatura de 50° C durante 24 horas. Após a reação, um tubo foi centrifugado e a concentração da glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração da glicose foi medida, de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração da glicose produzida (g/L) foi utilizada tal e qual como o nível da atividade da degradação do Avicel.

(2) ATIVIDADE DA DEGRADAÇÃO DA CELOBIOSE

[073] Para um líquido da enzima, 500 mg/L da celobiose (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e o tampão de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados a 100 mM. A mistura resultante, enquanto girada e misturava, foi deixada para reagir a uma temperatura de 50° C durante 0,5 horas. Após a reação, um tubo foi centrifugado e a concentração da glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração da glicose foi medida, de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração da glicose produzida (g/L) foi utilizada tal e qual como o nível da atividade da degradação da celobiose.

(3) ATIVIDADE DA DEGRADAÇÃO DE XILANO

[074] Para um líquido da enzima, 10 g/L do xilano (xilano do vidoeiro madeira, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e o tampão de acetato de sódio (pH 5,0) foram adicionados a 100 mM. A mistura resultante, enquanto girada e misturava, foi deixada para reagir a uma temperatura de 50° C durante quatro horas. Após a reação, um tubo foi centrifugado e a concentração da glicose do componente sobrenadante foi medida. A concentração de xilose foi medida, de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. A concentração de xilose produzida (g/L) foi utilizada tal e qual como o nível da atividade da degradação.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4 MEDIÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA PROTEÍNA

[075] A medição da concentração da proteína foi realizada utilizando o Conjunto de Análise da Proteína Pierce BCA, de acordo com o protocolo do conjunto. Uma curva padrão da concentração da proteína foi preparada através da medição, da mesma maneira, daquelas obtidas submetendo a albumina padrão (2 mg/mL) para a diluição em série; e a quantificação foi realizada através das amostras alvo da curva e calorimetria padrão.

EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5 SEPARAÇÃO POR MEMBRANA E CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA TRICHODERMA ATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO COM O PESO MOLECULAR DE CORTE DE 100.000

[076] A celulase derivada a partir da Trichoderma, preparada do Exemplo de Referência 1 acima, foi diluída de maneira a ser 3,5 g/L. Devido a isso, o ácido clorídrico diluído ou o hidróxido de sódio diluído foi utilizado para a preparação de uma solução aquosa com pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8, pH 9, pH 10, pH 11 e pH 12 (pH de 2 a 12). Após o ajuste do pH, a concentração da proteína foi novamente medida e descobriu-se ser de cerca de 3,5 g/L. Por conseguinte, a concentração da proteína destas soluções aquosas da celulase cujo pH foi ajustado foi considerado presumivelmente ser de 3,5 g/L e a avaliação seguinte foi realizada.

[077] A solução aquosa, mencionada acima, da celulase derivada a partir da Trichoderma, cujo pH foi ajustado (pH de 2 a 12), 20 mL de cada foram concentrados utilizando uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 (“VIVASPIN" 20 fabricado pela Sartorius, 100.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) por meio da filtração sem saída até que o volume do líquido do retentado alcançasse 0,5 mL (temperatura de 25° C, força centrífuga de 6.000 g). Para medir a quantidade de proteínas do líquido concentrado e a sua atividade da celulase, o líquido concentrado recuperado e, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g (20 mL). Este foi utilizado, como um retentado, na análise seguinte. Além disso, como para um filtrado, um filtrado da membrana de ultrafiltração não foi submetido a um tratamento especial, tal como a diluição e foi utilizado tal e qual como o filtrado na análise seguinte.

[078] A medição da concentração da proteína do retentado e do filtrado foi realizada através do método descrito acima no Exemplo de Referência 4. Além disso, para o retentado e o filtrado descritos acima, a eletroforese foi realizada utilizando um Bioanalizador (Agilent, Protein 230 kit)). O resultado obtido da eletroforese é mostrado na Figura 2 Na Figura 2, uma banda atribuída à celobiohidrolase da celulase derivada a partir da Trichoderma pode ser confirmada a qualquer pH de pH de 2 a 10.; e descobriu-se que existia uma diferença na intensidade de cada banda dependendo do pH de uma solução aquosa da celulase Trichoderma. Em particular, descobriu-se que a intensidade da banda de celobiohidrolase (CBH) é elevada a pH 3, pH 4 e pH 5 (Figura 2) e a intensidade da banda da celobiohidrolase tendeu a ser inferior, no caso de estar acima de pH 6 ou no caso de ser de pH 2. Além disso, ela foi capaz de confirmar que este resultado era totalmente consistente com a tendência na concentração da celobiohidrolase calculada através de um Bioanalizador. O resultado é mostrado na Tabela 1. TABELA 1

[079] Em seguida, a medição de cada uma das atividades da celulase do retentado foi realizada, de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. O resultado é mostrado na Tabela 2. TABELA 2

[080] A atividade da degradação da celulase do retentado em particular, a atividade da degradação de Avicel em cada pH foi comparada Descobriu-se que a atividade foi superior em condições de pH 3, pH 4 pH 5 θ pH 9 que em outro pH. Isto foi considerado devido à atividade correlacionada com a quantidade de celobiohidrolase recuperada na Tabela 1 a pH 3, pH 4 e pH 5; e a quantidade de celobiohidrolase recuperada aumentou entre os componentes da celulase derivada a partir da Trichoderma,a pH 3, pH 4 e pH 5. Além disso, em contraste, descobriu-se que a atividade da degradação de Avicel aumentou a uma condição de pH 9. Descobriu-se que este resultado não se correlacionou com o resultado da eletroforese na Figura 2 ou a quantidade de celobiohidrolase recuperada na Tabela 1. Para verificar o motivo, a análise foi realizada por a banda 1 e banda 5 diferente da celobiohidrolase na Figura 2, utilizando um bioanalizador. Cada peso molecular da banda 1 a banda 5 foi: banda 1: 23,5 kDa, banda 2: 26,1 kDa, banda 3: 27,6 kDa, banda 4: 30,8 kDa, e banda 5: 42,5 kDa, respectivamente. Além disso, de maneira similar à CBH, a concentração de cada um dos componentes da celulase de bandas de 1 a 5, foi calculada por um bioanalizador. O resultado é apresentado na Tabela 3. TABELA 3

[081] Como resultado da análise, descobriu-se que, como para as bandas de 1 a 5, dos componentes da celulase, a quantidade recuperada como um retentado aumentou em pH 3, pH 4, pH 5 e pH 9.

[082] Deve ser observado que a banda 4 e a banda 5 dos componentes da celulase, em particular, foram encontrados para estarem presentes como bandas com o aumento da quantidade recuperada a pH 9 ou superior (Tabela 3, *: asterisco). Em relação a esses dois tipos de componentes de enzima, foi considerado que a atividade da degradação de Avicel do retentado aumentou devido a que uma grande quantidade dos mesmos foi especificamente recuperada como o retentado a pH 9. A identificação da banda 4 e da banda 5 não foi concluída. No entanto, a partir do peso molecular da celulase derivada a partir do componente da Trichoderma escrito em um banco de dados conhecido, presume-se que eles são a endoglucanase ou a xilanase.

[083] Além disso, embora a taxa de recuperação da proteína fosse elevada a uma condição de pH 10 ou superior, a taxa de recuperação da atividade da enzima significativamente foi reduzida. Isto foi considerado devido à que, embora a proteína do componente da celulase derivada a partir da Trichodermapoderia ser recuperada a pH 10 ou superior, a sua atividade da enzima foi inativada. Isto foi considerado devido à que a taxa de recuperação da atividade da enzima significativamente foi reduzida também a pH 2, devido à mesma razão que a um pH 10 ou superior.

[084] Isto é, descobriu-se que a atividade da celulase recuperada como o retentado aumentou ou reduziu através do ajuste do pH da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma no Exemplo de Referência 5. Além disso, em particular, foi possível confirmar que devido à atividade da degradação da celulase recuperada se tornar máxima a pH 3, pH 4, pH 5 e pH 9, um retentado que apresente uma atividade elevada da degradação da celulase poderia ser recuperado através do ajuste do pH da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma para uma faixa de pH de 2,6 a 5,4 ou pH 8,6 a 9,4 e, em seguida, ser submetido à filtração através da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 CONCENTRAÇÃO DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA TRICHODERMA ATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO COM PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 (PH 3EPH9)

[085] 20 mL da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma(pH 3, pH 9) do Exemplo de Referência 5 foram concentrados utilizando uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 (“ VIVASPIN “ 20 fabricado pela Sartorius, 10.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) por meio da filtração sem saída até que o volume do líquido do retentado alcançasse 1 mL (temperatura de 25° C, força centrífuga de 6.000 g). O líquido concentrado recuperado e, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g (20 mL). Este foi utilizado, como um retentado e a sua atividade da degradação da celulase foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. Em relação à solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma antes da ultrafiltração, a atividade da degradação da celulase do retentado foi avaliada com um valor de atividade obtido através da medição, de acordo com o Exemplo de Referência 3 como 100%. O resultado obtido é mostrado na Tabela 5.

EXEMPLO 1 SEPARAÇÃO POR MEMBRANA E CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA 7R/CHODER/IM ATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO COM O PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 E 100.000 (PH3 E 9)

[086] Conforme mostrado no Exemplo de Referência 5, descobriu- se que uma parte dos componentes da celulase pode ser recuperada na parte lateral da alimentação através de submeter uma solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma à filtração através de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000. No entanto, um problema concomitante foi, em outra frente, que uma parte dos componentes da enzima foi perdida como um filtrado da membrana de ultrafiltração. Em vista disto, examinou-se se o segundo líquido concentrado da enzima ainda foi obtido como um retentado através de ainda submeter o filtrado à filtração utilizando uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 após a separação da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma através da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 e recuperando o retentado (primeiro líquido concentrado da enzima). Para ser mais específico, o exame foi realizado através do procedimento seguinte.

[087] A ultrafiltração foi realizada utilizando a solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma no Exemplo de Referência 5 (pH 3 e pH 9). A filtração através da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 foi realizada, de acordo com o Exemplo Comparativo 1; e 0,5 ml_ do retentado (primeiro líquido concentrado da enzima) e 19,5 ml_ do filtrado foram recuperadas.

[088] 19,5 mL do filtrado ainda foi concentrado utilizando a segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 (“VIVASPIN” 20 fabricado pela Sartorius, 10.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) por meio da filtração sem saída até que o volume do líquido do retentado alcançasse 0,5 mL (temperatura de 25° C, força centrífuga de 6.000 g). Eventualmente, 0,5 mL do primeiro líquido concentrado da enzima e 0,5 mL do segundo líquido concentrado da enzima foram misturadas, por conseguinte, obtendo 1 mL do líquido da enzima recuperada.

[089] Em seguida, o líquido da enzima recuperada, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g; e a atividade da degradação da celulase do líquido resultante foi medida, de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. Além disso, também em relação à solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma antes da ultrafiltração, a atividade da degradação da celulase do retentado foi avaliada com um valor de atividade obtido através da medição da atividade da degradação da celulase de acordo com o Exemplo de Referência 3 como 100%. O resultado obtido é apresentado na Tabela 4. TABELA 4

[090] Quando o líquido concentrado da enzima obtido utilizando apenas a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 no Exemplo Comparativo 1 foi comparado com o líquido da enzima recuperada obtido através da mistura do primeiro líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 com o segundo líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 no Exemplo 1, descobriu-se que a taxa de recuperação da proteína aumentou mais no Exemplo 1 do que no Exemplo Comparativo 1. Além disso, descobriu-se que, no Exemplo 1, a taxa de recuperação da atividade da degradação de Avicel aumentou significativamente, em particular.

[091] Isto é, a partir do resultado do Exemplo 1, descobriu-se que a quantidade de enzima de celulase recuperada derivada a partir da Trichoderma e a sua atividade pode aumentar através da realização da etapa para obter o primeiro líquido concentrado da enzima utilizando uma membrana de ultrafiltração com um molecular peso de corte de 100.000 a 200.000 e, em seguida, a etapa para obter o segundo líquido concentrado da enzima, através de submeter o filtrado à filtração através de uma segunda membrana de ultrafiltração de 5.000 a 50.000.

EXEMPLO2 FLUXO CRÍTICO DA SEGUNDA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO

[092] A solução aquosa da celulase derivada a partir de 1 L da Trichodermade (pH 5) da solução aquosa de Trichoderma no Exemplo de Referência 5 foi submetida à filtração de fluxo cruzado, através de uma membrana de ultrafiltração de fibras ocas com um peso molecular de corte de 150.000 (“TORAYFIL” HFU fabricado por Toray Industries, Inc.) para obter um filtrado. Em seguida, a filtração de fluxo cruzado foi realizada utilizando uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 (Vivascience, “VIVAFLOW” 50, PES, VF05P0) com o fluxo de filtração sendo alterado, por conseguinte, medindo a diferença das pressões da transmembrana de cada fluxo de filtração. Para comparação, também em relação ao caso em que uma membrana de ultrafiltração de fibra oca com peso molecular de corte de 150.000 não foi realizada (que foi designada como Exemplo Comparativo 2), a filtração foi realizada, da mesma maneira, conforme descrito acima, utilizando uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 com o fluxo de filtração sendo alterado, por conseguinte, medindo a diferença das pressões da transmembrana de cada fluxo de filtração. O resultado é mostrado na Figura 3.

[093] Conforme mostrado na Figura 3, uma linha de regressão foi preparada utilizando os três pontos em que a diferença da pressão da transmembrana acentuadamente aumentada e um ponto antes do aumento; e o fluxo da membrana (m/dia) no ponto de interseção das duas linhas de regressão foi designado como o fluxo crítico da membrana. Como resultado, descobriu-se que o filtrado obtido através do tratamento da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma através da membrana de ultrafiltração de fibra oca com peso molecular de corte de 150.000 exibiu um valor mais aumentado do fluxo crítico da membrana. Isto é considerado devido à que uma parte dos componentes da enzima ou outros componentes dos polímeros hidrossolúveis são removidos através da membrana de ultrafiltração de fibra oca, com um peso molecular de corte de 150.000 e o fluxo crítico de um peso molecular de corte de 10.000 aumenta. Além disso, este é o resultado que mostra que este efeito permite que o fluxo da segunda membrana de ultrafiltração deve ser estabelecido elevado e o tempo para a concentração e a energia utilizada para esse propósito podem ser reduzidos.

EXEMPLO COMPARATIVO 3 CONCENTRAÇÃO DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA TRICHODERMAATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO COM PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 (PH4, PH 5, PH 6, PH7, E PH8)

[094] Embora a avaliação nos casos de pH 3 e pH 9 foi realizada no Exemplo Comparativo 1, o Exemplo foi realizado a pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, e pH 8 (pH de 4 a 8), através do seguinte procedimento.

[095] 20 mL da solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma(pH 4-8) do Exemplo de Referência 5, cada um concentrado até que o volume de líquido do retentado atingiu 1 ml_ por meio do mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo Comparativo 1. O líquido concentrado recuperado e, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g; e a atividade da degradação da celulase foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. Também em relação à solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma antes da ultrafiltração, a atividade da degradação da celulase do retentado foi avaliada com um valor de atividade obtido através da medição da atividade da degradação da celulase, de acordo com o Exemplo de Referência 3 como 100%. O resultado obtido é apresentado na Tabela 5.

EXEMPLO 3 SEPARAÇÃO POR MEMBRANA E CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DO GENÊRO DA TRICHODERMAATRAVÉS DAS MEMBRANAS DE ULTRAFILTRAÇÃO COM O PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 E 100.000 (PH 4, PH 5, PH6, PH 7, E PH8)

[096] Embora a avaliação na etapa (2) foi realizado nos casos de pH 3 e pH 9, no Exemplo 1, uma avaliação se os efeitos na etapa (1) e na etapa (2) foram exercidos foi realizada a pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, e pH 8 (pH de 4 a 8), através do procedimento seguinte.

[097] A solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichodermado Exemplo de Referência 5 (pH de 4 a 8), 20 mL de cada foram submetidos a um procedimento idêntico ao descrito no Exemplo 1, para recuperar 0,5 mL de um retentado (o primeiro líquido concentrado da enzima) e 19,5 mL de um filtrado. Além disso, também como para 19,5 mL do filtrado, a concentração foi realizada até que o volume do líquido do retentado atingiu 0,5 mL por meio de um procedimento idêntico ao descrito no Exemplo 1, por conseguinte, obtendo o segundo líquido concentrado da enzima. Eventualmente, 0,5 mL do primeiro líquido concentrado da enzima e 0,5 mL do segundo líquido concentrado da enzima foram misturadas, por conseguinte, obtendo 1 mL do líquido da enzima recuperada.

[098] Em seguida, o líquido da enzima recuperada, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g; e a atividade da degradação da celulase do líquido resultante foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. Além disso, também em relação à solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma antes da ultrafiltração, a atividade da degradação da celulase do retentado foi avaliada com um valor da atividade obtida através da medição da atividade da degradação da celulase, de acordo com o Exemplo de Referência 3 como 100%. 0 resultado obtido é apresentado na Tabela 5. TABELA 5

[099] Quando o líquido concentrado da enzima (pH 4-8) obtido utilizando apenas a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 no Exemplo Comparativo 3 foi comparado com o líquido da enzima recuperada obtido através da mistura do primeiro líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 com o segundo líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 no Exemplo 3, descobriu-se que a taxa de recuperação da proteína aumentou mais no Exemplo 3 do que no Exemplo Comparativo 3. Além disso, descobriu-se que, no Exemplo 3, a taxa de recuperação da atividade da degradação de Avicel aumentou significativamente, em particular.

[0100] Isto é, a partir do resultado do Exemplo 3, descobriu-se que a quantidade da enzima de uma celulase recuperada derivada a partir do íon de Trichoderma e a sua atividade podem ser aumentadas através da realização da etapa para obter o primeiro líquido concentrado da enzima utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 com pH de 4 a 8, e, em seguida, a etapa para obter o segundo líquido concentrado da enzima, através de submeter o filtrado à filtração através de uma segunda membrana de ultrafiltração de 5.000 a 50.000.

[0101] Além disso, quando o resultado do Exemplo 1 (pH 3 e pH 9) foi comparado com o resultado do Exemplo 3 (pH de 4 a 8), descobriu-se que a taxa de recuperação da atividade da degradação de Avicel da celulase recuperado foi superior nas condições de pH 3 no Exemplo 1, pH 4, no Exemplo 3, e pH 9 no Exemplo 1, em comparação com o resultado de “pH 6, pH 7, e pH 8” no Exemplo 3. Isto é, descobriu-se que o pH da solução aquosa da celulase do fungo filamentoso, de preferência, é ajustada de pH 2,6 a 5,4 ou de pH 8,6 a 9,4 na presente invenção.

EXEMPLO COMPARATIVO 4 SEPARAÇÃO POR MEMBRANA E CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DO GENÊRO DA TRICHODERMA ATRAVÉS DO PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 E DO PESO MOLECULAR DE CORTE DE 100.000 (PH3 E PH9)

[0102] A solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma do Exemplo de Referência 5 (pH 3 e pH 9), 20 mL de cada concentrado até que o volume de líquido retentado atingiu 0,5 mL por meio de um procedimento idêntico ao descrito no Exemplo Comparativo 1, para recuperar 0,5 mL de um retentado (primeiro líquido concentrado da enzima) 19,5 mL de um filtrado.

[0103] Em seguida, 19,5 mL do filtrado ainda foi concentrado utilizando a segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 (“VIVASPIN” 20 fabricado pela Sartorius, 10.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) até que o volume do líquido do retentado atingiu 0,5 mL por meio de um procedimento idêntico ao descrito no Exemplo Comparativo 1, por conseguinte, recuperando o segundo líquido concentrado da enzima. Eventualmente, 0,5 mL do primeiro líquido concentrado da enzima e 0,5 mL do segundo líquido concentrado da enzima foram misturadas, por conseguinte, obtendo 1 mL do líquido da enzima recuperada.

[0104] Em seguida, o líquido da enzima recuperada, com a massa a ser medida da mesma, foi preenchido com água RO até atingir a sua massa inicial de 20 g; e a atividade da degradação da celulase do líquido resultante foi medida de acordo com o Exemplo de Referência 3 acima. Além disso, também em relação à solução aquosa da celulase derivada a partir da Trichoderma antes da ultrafiltração, a atividade da degradação da celulase do retentado foi avaliada com um valor de atividade obtido através da medição da atividade da degradação da celulase, de acordo com o Exemplo de Referência 3 como 100%. O resultado obtido é apresentado na Tabela 6. TABELA 6

[0105] Quando comparado com o resultado da concentração (nos casos de pH 3 e pH 9) da celulase derivada a partir da Trichoderma através da membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 no Exemplo Comparativo 1, foi confirmado que a quantidade de proteínas recuperadas e a quantidade da atividade da degradação de Avicel recuperado no Exemplo Comparativo 4 não diferiram significativamente.

EXEMPLO COMPARATIVO 5 CONCENTRAÇÃO DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA TRICHODERMA ATRAVÉS DA MEMBRANA DE ULTRAFILTRAÇÃO COM PESO MOLECULAR DE CORTE DE 30.000 (PH 3EPH9)

[0106] Enquanto a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 foi utilizada no Exemplo Comparativo 1, uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 30.000 (“VIVASPIN” 20 fabricado pela Sartorius, 30.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) foi utilizada neste Exemplo Comparativo 5 para a realização do Exemplo. O mesmo procedimento como no Exemplo Comparativo 1 foi realizado com exceção para o peso molecular de corte da membrana de ultrafiltração mencionada acima utilizado. O resultado obtido é apresentado na Tabela 7.

EXEMPLO 4 SEPARAÇÃO POR MEMBRANA E CONCENTRAÇÃO DE UMA SOLUÇÃO AQUOSA DA CELULASE DERIVADA A PARTIR DA TRICHODERMA (PH3 E PH9) ATRAVÉS DAS MEMBRANAS DE ULTRAFILTRAÇÃO COM O PESO MOLECULAR DE CORTE DE 10.000 E 30.000

[0107] Enquanto a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 foi utilizada como a segunda membrana de ultrafiltração do Exemplo 1, uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 30.000 (“VIVASPIN” 20 fabricada pela Sartorius, 30.000 MWCO, PES, 6 cm2 de área eficaz da membrana) foi utilizada neste Exemplo 4 para a realização do Exemplo. O mesmo procedimento do Exemplo 1 foi realizado, exceto para o peso molecular de corte da membrana de ultrafiltração mencionado acima utilizado. O resultado obtido é apresentado na Tabela 7. TABELA 7

[0108] Quando o líquido concentrado da enzima obtido utilizando apenas a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 30.000 no Exemplo Comparativo 5 foi comparado com o líquido da enzima recuperada obtida através da mistura do primeiro líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 com o segundo líquido concentrado da enzima obtido utilizando a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 30.000 no Exemplo 5, descobriu-se que a taxa de recuperação da proteína aumentou mais no Exemplo 5 do que no Exemplo Comparativo 4.

[0109] Além disso, descobriu-se que, no Exemplo 5, a taxa de recuperação da atividade da degradação de Avicel aumentou significativamente, em particular. Descobriu-se que estas tendências eram a mesma tendência como nos casos em que a membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 10.000 foi utilizada (Exemplo 1 e Exemplo Comparativo 1).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[0110] A celulase obtida na presente invenção pode ser eficazmente utilizada na aplicação detergente e nas aplicações, tais como a hidrólise de amido e a hidrólise da celulose. DESCRIÇÃO DOS SÍMBOLOS (1) Tanque para uma solução aquosa da celulase (2) Sensor de pH (3) pH do tanque de regulação (4) Bomba de ajuste do pH (5) Válvula (6) Bomba de Ultrafiltração 1 (7) Compressor (8) Membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 (9) Bomba de retrolavagem (10) Tanque de retenção para o filtrado (11) Válvula 2 (12) Bomba de Ultrafiltração 2 (13) Membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 (14) Segundo tanque de retenção para o filtrado (15) Segundo tanque de retenção para o líquido da enzima concentrada

Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE CELULASE, caracterizado por compreender as seguintes etapas de (1) a (3): (1) a etapa de submeter uma solução aquosa de celulase derivada de fungo filamentoso à filtração através de uma membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 100.000 a 200.000 para obter um filtrado e para simultaneamente obter um líquido concentrado de enzima como um retentado; (2) a etapa de submeter adicionalmente o filtrado obtido na etapa (1) à filtração através de uma segunda membrana de ultrafiltração com um peso molecular de corte de 5.000 a 50.000 para obter um segundo líquido concentrado de enzima como um retentado; e (3) a etapa de misturar o líquido concentrado de enzima obtido nas etapas (1) e (2) para obter celulase derivada de fungo filamentoso.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito fungo filamentoso ser Trichoderma.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela dita solução aquosa de celulase derivada de fungo filamentoso ser ajustada para pH 2,6 a 5,4 ou pH 8,6 a 9,4 na etapa (1).

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela dita solução aquosa de celulase derivada de fungo filamentoso ser um líquido de cultura de fungo filamentoso ou um hidrolisado de biomassa que contém celulose obtida pelo uso de dita celulase derivada de fungo filamentoso.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela dita solução aquosa de celulase derivada de fungo filamentoso compreender um ou mais componentes de enzima selecionados a partir do grupo que consiste em celobiohidrolase, endoglucanase e xilanase.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por uma temperatura de dita solução aquosa de celulase derivada de fungo filamentoso estar em uma faixa de temperatura de 15 a 35°C.