CN105745331A

CN105745331A - 糖液的制造方法

Info

Publication number: CN105745331A
Application number: CN201480063493.1A
Authority: CN
Inventors: 船田茂行; 栗原宏征; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: US11155848B2; CN105745331B; CA2935043A1; EP3088530A1; EP3088530A4; US20160326559A1; WO2015099109A1; JP6508039B2; EP3088530B1; JPWO2015099109A1; MY176473A; BR112016014736A2

Abstract

本发明是糖液的制造方法，是由含纤维素生物质来制造糖液的方法，包括：将含纤维素生物质用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序(1)；以及使由工序(1)获得的水解物通过超滤膜进行过滤，作为非透过液回收源自丝状菌的纤维素酶，作为透过液获得糖液的工序(2)，在工序(1)的前段或工序(1)中，利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶来处理含纤维素生物质，可获得提高现有方法中的含纤维素生物质的水解中的糖化酶使用量的削减效果的效果。

Description

糖液的制造方法

技术领域

本发明涉及由含纤维素生物质制造能够在发酵原料等中使用的糖液的方法。

背景技术

以糖为原料的化学品的发酵生产工艺被用于各种工业原料生产中。作为成为该发酵原料的糖，现在工业上使用源自甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖，但是从今后世界人口增加引起食用原料价格的暴涨、或与食用竞争的伦理层面出发，构建由可再生的非食用资源、即含纤维素生物质有效地制造糖液的工艺，或者以所得糖液为发酵原料，有效地转化为工业原料的工艺成为今后的课题。

作为由含纤维素生物质制造糖液的方法，除了一般已知的使用浓硫酸将纤维素和半纤维素进行酸水解来制造糖液的方法以外，已知在用稀硫酸将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过进行纤维素酶等的酶处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。此外，作为不使用酸的方法，公开了在对含纤维素生物质进行250～500℃左右的亚临界水处理之后，进一步通过糖化酶处理来制造糖液的方法(专利文献1)；此外，在用240～280℃的加压热水将含纤维素生物质进行水解处理之后，进一步通过酶处理来制造糖液的方法(专利文献2)。其中，近年来，尤其是能量使用量和环境负荷少、且糖收量多的使用糖化酶的生物质的水解方法被广泛研究，但作为使用糖化酶的方法的缺点，存在酶费用高等问题。

作为解决基于糖化酶处理的糖液的制造方法中的前述技术问题的方法，提出了将用于水解的糖化酶回收再利用的方法。例如，公开了利用旋转过滤器进行连续固液分离，使所得糖液通过超滤膜进行过滤，从而回收酶的方法(专利文献3)；通过在酶糖化的阶段投入表面活性剂从而抑制酶吸附、提高回收效率的方法(专利文献4)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2001-95597号公报

专利文献2：日本特许3041308号公报

专利文献3：日本特开2006-87319号公报

专利文献4：日本特开昭63-87994号公报

非专利文献：A.Aden等，“LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover”NRELTechnicalReport(2002)

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，开发了使用糖化酶的含纤维素生物质的水解方法，但在削减糖化酶使用量这样的观点方面，其效果依然是不充分的。因此，本发明的课题是开发提高削减现有方法中含纤维素生物质的水解中的糖化酶使用量的效果的糖液制造工艺。

用于解决课题的方法

本发明具有以下[1]～[7]的构成。

[1]糖液的制造方法，是由含纤维素生物质来制造糖液的方法，包括：将含纤维素生物质用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序(1)；以及使由工序(1)获得的水解物通过超滤膜进行过滤，作为非透过液回收源自丝状菌的纤维素酶，作为透过液获得糖液的工序(2)，

在工序(1)的前段或工序(1)中，利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶来处理含纤维素生物质。

[2]根据[1]所述的糖液的制造方法，前述含纤维素生物质是选自谷物皮类生物质、秸秆和蔗渣中的1种以上。

[3]根据[2]所述的糖液的制造方法，前述谷物皮类生物质是选自玉米外皮、大豆外皮和小麦外皮中的1种以上。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的糖液的制造方法，相对于源自丝状菌的纤维素酶的重量，前述选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶的重量为1/10以下。

[5]根据[1]～[4]中任一项所述的糖液的制造方法，在前述工序(1)的前段或所述工序(1)中，利用果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶这3种酶来处理含纤维素生物质。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的糖液的制造方法，前述工序(2)是将由工序(1)获得的水解物固液分离而获得溶液成分、并使该溶液成分通过超滤膜进行过滤的工序。

[7]根据[6]所述的糖液的制造方法，前述固液分离是加压过滤。

发明的效果

通过本发明，能够提高从以含纤维素生物质为原料的糖液的制造工序中回收的糖化酶的量。

具体实施方式

关于用于实施本发明的方式，针对每个工序进行详细说明。

[工序(1)]

工序(1)是将含纤维素生物质用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序。

所谓工序(1)中使用的含纤维素生物质，是指包含纤维素的生物资源。作为含纤维素生物质的具体例，可举出蔗渣、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、秸秆(稻秸、麦秸)等草本系生物质，或者树木、废建材等木质系生物质，以及藻类、海草等源自水生环境的生物质，玉米外皮、小麦外皮、大豆外皮、稻壳等谷物皮类生物质等，谷物皮类生物质、秸秆、蔗渣最有效，因而优选被利用。

所谓含纤维素生物质的水解，以使纤维素低分子量化，生成单糖或者寡糖为目的。在含纤维素生物质的水解中，木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素成分也同时被水解。在本工序中，为了水解含纤维素生物质，作为糖化酶使用源自丝状菌的纤维素酶。

源自丝状菌的纤维素酶是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、木糖苷酶等多种酶成分、且具有水解糖化纤维素的活性的酶组合物。源自丝状菌的纤维素酶在纤维素分解中通过多种酶成分的协同效果或互补效果能够有效进行纤维素的水解。

作为源自丝状菌的纤维素酶，可以例示出源自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)、平革菌(Phanerochaete)属、白腐菌、褐腐菌等的纤维素酶。这样的源自丝状菌的纤维素酶中，优选使用纤维素分解活性高的源自木霉属的纤维素酶。

所谓源自木霉属的纤维素酶，是指以源自木霉属微生物的纤维素酶为主成分的酶组合物。对木霉属微生物不特别限定，优选里氏木霉(Trichodermareesei)，具体而言，可以例示出里氏木霉QM9414(TrichodermareeseiQM9414)、里氏木霉QM9123(TrichodermareeseiQM9123)、里氏木霉RutC-30(TrichodermareeseiRutC-30)、里氏木霉PC3-7(TrichodermareeseiPC3-7)、里氏木霉CL-847(TrichodermareeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(TrichodermareeseiMCG77)、里氏木霉MCG80(TrichodermareeseiMCG80)、绿色木霉QM9123(TrichodermavirideQM9123)。此外，也可以是将源自前述木霉属的微生物利用突变剂或紫外线照射等进行突变处理，从而纤维素酶生产性提高了的突变株。

纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始以纤维二糖单元进行水解为特征的酶的总称，已知有从纤维素链的还原末端侧切断的纤维二糖水解酶I、和从非还原末端侧切断的纤维二糖水解酶II两种。作为EC编号：EC3.2.1.91，记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。

内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始随机进行水解为特征的酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73，记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。

外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始随机进行水解为特征的酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58，记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。

β葡糖苷酶是以作用于纤维寡糖或纤维二糖为特征的酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.21，记载了归属于β葡糖苷酶的酶群。

木聚糖酶是以作用于半纤维素或特别作用于木聚糖为特征的酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.8，记载了归属于木聚糖酶的酶群。

木糖苷酶是以作用于木寡糖为特征的酶的总称，作为EC编号：EC3.2.1.37，记载了归属于木糖苷酶的酶群。

作为源自丝状菌的纤维素酶，优选使用粗酶物。粗酶物源自在为了使丝状菌产生纤维素酶而调制的培养基中将该微生物培养任意时间而得的培养上清。对使用的培养基成分不特别限定，但是为了促进纤维素酶的产生，一般可以使用添加了纤维素的培养基。而且，作为粗酶物，优选直接使用培养液、或使用仅除去了菌体的培养上清。

对粗酶物中的各酶成分的重量比不特别限定，例如，源自里氏木霉的培养液中含有50～95重量％的纤维二糖水解酶，其余成分包含内切葡聚糖酶、β葡糖苷酶等。此外，木霉属的微生物在培养液中产生强的纤维素酶成分，另一方面由于β葡糖苷酶保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β葡糖苷酶活性低，因此可以在粗酶物中进一步添加异种或同种的β葡糖苷酶。作为异种的β葡糖苷酶，可以优选使用源自曲霉属的β葡糖苷酶。作为源自曲霉属的β葡糖苷酶，可以例示出由ノボザイム社市售的“Novozyme188”等。作为向粗酶物中添加异种或同种的β葡糖苷酶的方法，可以是培养以向木霉属的微生物导入基因使其在其培养液中产生β葡糖苷酶的方式进行基因重组而得的木霉属的微生物，分离其培养液的方法。

在利用源自丝状菌的纤维素酶水解含纤维素生物质之前，为了提高水解效率，优选将含纤维素生物质进行前处理。作为含纤维素生物质的前处理方法无特别限制，具体而言，可举出酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、苛性钠处理、氨处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理，在本发明中优选水热处理、稀硫酸处理。

所谓水热处理，是在添加水使生物质的固体物浓度为0.1～50重量％之后，在100～400℃的温度下处理1秒～60分钟。通过在这样的温度条件下处理，纤维素或半纤维素发生水解。特别是温度优选为100℃～250℃的范围，处理时间优选为5分钟～30分种。对处理次数不特别限定，将该处理进行1次以上即可。特别是在将该处理进行2次以上的情况下，可以在不同的条件下进行第1次和第2次以后的处理。

此外，在水热处理中可以添加硫酸进行稀硫酸处理。关于硫酸的添加量，优选每1g重量的含纤维素生物质添加硫酸0.1～150mg。

作为利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的反应条件，只要依照源自丝状菌的纤维素酶的优选的反应条件进行就不限定，使用源自丝状菌的纤维素酶时的一般的反应温度优选为15～100℃的范围，更优选为40～60℃，进一步优选为50℃。水解的pH值优选为pH值3～9的范围，更优选为pH值4～5.5，进一步优选为pH值5。另外，为了调节pH值，可以添加酸或碱调节成所期望的pH值，此外，可以适当使用缓冲液。另外，为了促进含纤维素生物质和糖化酶的接触，而且为了使水解物的糖浓度均匀，优选进行搅拌混合，优选加水使纤维素的固体成分浓度为1～25重量％，更优选加水使纤维素的固体成分浓度为5～20重量％的范围。

[工序(2)]

在工序(2)中，使由前述工序(1)获得的水解物通过超滤膜进行过滤，作为非透过液回收源自丝状菌的纤维素酶，作为透过液获得糖液。作为非透过液回收的酶可以再利用到工序(1)，从而能够减少工序(1)中的酶的使用量。

关于本发明中使用的超滤膜的截留分子量，只要是至少能够透过作为单糖的葡萄糖(分子量180)、木糖(分子量150)，能够阻止源自丝状菌的纤维素酶的超滤膜就不特别限定，具体而言，优选截留分子量为500～50,000的范围，从将对酶反应显示阻碍作用的杂质与酶分离这样的观点出发，更优选截留分子量为5,000～50,000的范围，进一步优选截留分子量为10,000～30,000的范围。

作为超滤膜的材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等，由于再生纤维素、纤维素、纤维素酯受纤维素酶分解，因此优选使用以PES、PVDF等合成高分子作为材料的超滤膜。

作为超滤膜的过滤方式，有死端过滤、错流过滤，但从抑制膜污染的观点出发，优选错流过滤。

作为超滤膜的膜形态，可以使用平膜型、螺旋型、管状型、中空丝型等适宜的形态。具体而言，可举出DESAL社的G-5型、G-10型、G-20型、G-50型、PW型、HWSUF型，KOCH社的HFM-180、HFM-183、HFM-251、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P、MPS-U20S，Synder社的SPE1、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、SPV50、SOW30，旭化成株式会社制的マイクローザ(注册商标)UF系列的相当于截留分子量3,000～10,000的膜，日东电工株式会社制的NTR7410、NTR7450等。

[利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上进行酶处理]

本发明以在工序(1)的前段或工序(1)中，用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶处理含纤维素生物质为特征。在工序(1)的前段或工序(1)中，通过用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶处理含纤维素生物质，与不进行处理的情况比较，可获得在工序(2)中能够回收的源自丝状菌的纤维素酶量增大这样的效果，尤其是可获得作为源自丝状菌的纤维素酶所含的酶成分中的在水解含纤维素生物质方面主要的酶成分的纤维二糖水解酶的回收量显著增大这样的效果。

果胶酶是指具有分解果胶的活性的酶。果胶是构成植物体的复合多糖，是以半乳糖醛酸通过α-1,4键合而成的聚半乳糖醛酸为主成分的多糖。果胶酶的定义包含多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)、果胶裂合酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂合酶(EC4.2.2.2)、果胶酸甲酯酶(EC3.1.1.11)等至少与果胶的水解相关的酶种。

葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)是指具有水解淀粉的非还原末端的α-1,4键的活性的酶。

脂肪酶是指水解脂质的酶，尤其是指具有水解脂肪酸和甘油三酯的酯键的活性的酶(EC3.1.1.3)。

本发明中使用的果胶酶、葡糖淀粉酶或脂肪酶，优选源自曲霉属(Aspergillus)。作为曲霉属，可以例示出黑曲霉(Aspergillusnigar)、麴菌(Aspergillusorizae)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、棘孢曲霉(Aspergillusacretus)等。源自曲霉属的酶的酶活性为最大时的最适反应温度为50℃附近，因此在如后所述并用源自丝状菌的纤维素酶时，可以使用同一温度。

所谓在工序(1)的前段或工序(1)中，利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶来处理含纤维素生物质，具体而言，是将工序(1)中的含纤维素生物质利用工序(1)中的源自丝状菌的纤维素酶进行水解前或者水解时，利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶进行水解的工序。此外，也包含将由工序(1)获得的水解物利用选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶进行水解的工序。选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶处理，对工序(1)中的含纤维素生物质，可以在工序(1)中的纤维素酶水解前或者水解时单独进行或者与它们组合来进行，优选至少在工序(1)中的纤维素酶水解时进行。

在工序(1)的前段或工序(1)中，对选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶的添加量无特别限制，但从削减酶费用的观点出发，优选相对于源自丝状菌的纤维素酶其重量比为1/10以下。另外，这里所说的酶的添加量，是在工序(1)的前段或工序(1)中，选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶的总量。对于酶的添加量的下限，只要能够获得本发明的效果就无特别限制，以相对于含纤维素生物质重量的投入酶重量比计为0.001mg/g生物质。

作为在工序(1)的前段或工序(1)中添加的、选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶的构成，可以是各自单独的果胶酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶，也可以是2种以上的组合，但优选为2种以上的组合，更优选为3种的组合。

[其他工序]

另外，优选将由工序(1)获得的水解物进行固液分离。固液分离的目的在于，通过分离成包含糖的溶液成分(以下也称为糖水溶液)和作为固体成分的糖化残渣，从而能够高效地实施工序(2)中的糖液和源自丝状菌的纤维素酶的分离回收。

对固液分离的方法不特别限定，可以通过螺旋沉降器等离心分离、压滤机、带式压力机等加压过滤来进行固液分离。优选为压滤机、带式压力机等加压过滤，与离心分离相比，可获得不溶性的固体少、浊质少的溶液成分。从抑制后段的超滤膜的结垢的观点出发也优选浊质少。此外，在固液分离为压滤机、带式压力机等加压过滤的情况下，在工序(1)的前段或工序(1)中，通过选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶处理，还可带来固液分离的处理时间能够缩短这样的效果。

此外，优选在将固液分离获得的糖水溶液提供给工序(2)之前，利用精密过滤膜进行过滤。通过精密过滤膜进行过滤，能够除去利用固液分离不能被完全分离的固体成分，因此能够更高效地进行工序(2)。

精密过滤膜是平均细孔径为0.01μm～5mm的膜。作为精密过滤膜的材质，只要是能够除去利用上述固液分离不能被完全分离的固体成分的材质就不特别限定，可举出纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜、氯化聚乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚1,1-二氟乙烯、聚四氟乙烯等有机材料、或者不锈钢等金属、或者陶瓷等无机材料。

由本发明获得的糖液能够作为发酵原料使用，通过培养微生物能够制造化学品。作为化学品的具体例，可举出醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中被大量生产的物质。可举出例如，乙醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇，乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸，肌苷、鸟苷等核苷，肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸，尸胺等胺化合物。还可以适用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。

以下举出实施例来具体地说明本发明。但是，本发明不受这些实施例限定。

(参考例1)源自丝状菌的纤维素酶(培养液)的调制方法

源自丝状菌的纤维素酶(培养液)通过以下的方法调制。

[前培养]

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)以及七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加到蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃的温度下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加了另外分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15分钟的PE-M和Tween80各0.01％(w/vol)。在该前培养培养基中接种里氏木霉ATCC66589使其为1×10⁵个/mL，以28℃的温度、72小时、180rpm振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKERBR-40LF)。

[主培养]

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(Avicel，微晶纤维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)以及七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加到蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌罐(ABLE社制、DPC-2A)容器中，在121℃的温度下高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加另外分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15分钟的PE-M和Tween80各0.1％，接种250mL预先通过前述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉ATCC66589。然后，以28℃的温度、87小时、300rpm、通气量1vvm的条件进行振荡培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制ステリカップ-GV、材质：PVDF)。将以该前述条件调制的培养液作为源自丝状菌的纤维素酶在以下实施例中使用。

(参考例2)糖浓度的测定

糖液中所含的葡萄糖和木糖浓度，在下述所示的HPLC条件下，通过与标准品比较进行定量。

柱：LunaNH₂(Phenomenex社制)

流动相：MilliQ:乙腈＝25:75(流速0.6mL/分钟)

反应液：无

检测方法：RI(差示折射率)

温度：30℃。

(参考例3)源自丝状菌的纤维素酶的活性测定方法

作为纤维素酶活性，参与纤维素的分解的纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶的活性通过(1)4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷(pNP-Lac)分解活性求出，β葡糖苷酶的活性通过(2)4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-Glc)的分解活性求出，此外，参与半纤维素的主成分木聚糖的分解的内切木聚糖酶、木糖苷酶的活性通过(3)4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNP-Xyl)的分解活性求出。以下表示各分解活性的测定方法。另外，将上述(1)～(3)底物汇总称为pNP-糖。

向分别以1mM的浓度包含各底物的100mM乙酸缓冲液(pH值5.0)0.9mL中添加0.1mL酶液，在30℃使其反应。关于反应时间，底物为pNP-Lac时为60分钟，底物为pNP-Glc时为10分钟，底物为pNP-Xyl时为30分钟，反应后，添加0.1mL的2M碳酸钠水溶液使反应停止，测定405nm的吸光度(ODtest)。作为空白，向底物溶液中依次添加2M碳酸钠水溶液、酶液，对其也同样测定405nm的吸光度(ODblank)。将在上述反应体系中1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U，按照下述式算出活性值(U/mL)。另外，上述反应体系中的4-硝基苯酚的毫摩尔分子吸光系数是17.2L/mmol/cm。

pNP-Lac分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×60(分钟)×0.1(mL)}

pNP-Glc分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×10(分钟)×0.1(mL)}

pNP-Xyl分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×60(分钟)×0.1(mL)}。

(实施例1)

作为含纤维素生物质，使用了(1)玉米外皮、(2)大豆外皮、(3)秸秆、(4)蔗渣。在利用源自丝状菌的纤维素酶进行水解之前的含纤维素生物质的前处理如下所述根据不同的原料利用不同的前处理条件进行处理。

(1)玉米外皮(前处理条件：稀硫酸处理)

玉米外皮使用了中国产的干燥品(从株式会社ゴードー买入)。对于玉米外皮(干燥)1kg添加13g/L硫酸水2.3kg使其含水率为70％(30mg硫酸/g玉米外皮)。添加了硫酸水的玉米外皮在120℃使用高压釜30分钟进行水热处理。高压釜后，向前处理物中添加氨水，调制到pH值5，将其作为前处理物1。

(2)大豆外皮(前处理条件：稀硫酸处理)

大豆外皮使用中国产的干燥品(从株式会社ゴードー买入)。对于大豆外皮(干燥)1kg添加65g/L硫酸水2.3kg使其含水率为70％(150mg硫酸/g大豆外皮)。添加了硫酸水的大豆外皮在120℃使用高压釜30分钟进行水热处理。高压釜后，向前处理物中添加氨水，调制到pH值5，将其作为前处理物2。

(3)秸秆(前处理条件：水热处理)

秸秆(稻秸)使用了日本产的干燥品(由农家分售)。利用奈良机械制作所制的旋转式绞磨机RCM-400(8mm网孔)以420转/分种的旋转速度粉碎秸秆。然后，进行水热处理。装置使用了日本电热株式会社制的爆碎装置(反应器大小为2L)。蒸气发生装置使用了40kW的电锅炉。一旦设定了既定的处理压力也唯一确定了处理温度，因此反应条件为在215℃进行5分钟处理，在本条件下1次投入200g的已粉碎的秸秆，合计进行5次。对进行了爆碎处理的含水固体成分添加2L的水进行搅拌，使用日立工机株式会社制的实验室用离心分离机“HimacCF7D2”以5000rpm分离成水热处理液和固体物。调制到固体物的含水率为70％，使用氨水将pH值调节到5。将其作为前处理物3。

(4)蔗渣(前处理条件：稀硫酸处理)

蔗渣使用了台湾制的干燥品(从台糖农产贩卖株式会社买入)。将蔗渣利用奈良机械制作所制的旋转式绞磨机RCM-400(20mm网孔)以420转/分钟的旋转速度进行粉碎。对于蔗渣(干燥)1kg添加13g/L硫酸水2.3kg使其含水率为70％(30mg硫酸/g蔗渣)。添加了硫酸水的蔗渣在120℃使用高压釜30分钟进行水热处理。高压釜后，向前处理物中添加氨水，调制到pH值5，将其作为前处理物4。

对前处理物1～4添加水，将固体成分浓度调制为10％。进一步添加由参考例1调制的源自丝状菌的纤维素酶进行水解。关于源自丝状菌的纤维素酶的添加量，以对前处理物1为2mg/g前处理物，对前处理物2为4mg/g前处理物，对前处理物3为8mg/g前处理物，对前处理物4为8mg/g前处理物进行添加，开始水解。水解在50℃进行48小时反应。

在前述工序(1)的水解中，将果胶酶(天野エンザイム株式会社制、“ペクチナーゼPL‘アマノ’”)、葡糖淀粉酶(Megazyme社制、“AMYLOGLUCOSIDASE”)、脂肪酶(天野エンザイム株式会社制、“リパーゼASアマノ”)分别以表1的组合的方式添加(添加量在添加1种的情况下为0.2mg/g前处理物。在组合2种的情况下每1种添加0.1mg/g前处理物。在组合3种的情况下每1种添加0.06mg/g前处理物)，进行酶处理。此外，将不添加任何果胶酶、葡糖淀粉酶、脂肪酶的情况作为比较例1。

将由前述的工序获得的各酶处理物8kg以0.2MPa压入薮田机械株式会社制压滤机中，进行固液分离。滤布使用薮田产业制织布T2731C(聚酯制、双面织)。以压力0.3MPa进行利用空气的压榨，从固液分离后的生物质回收压榨液，与通过固液分离而分离的液体混合，作为溶液成分回收了糖水溶液6kg。将固液分离需要的时间示于表1。

表1

利用压滤机的8kg糖液的固液分离完成时间

将回收的各糖水溶液6kg使用孔径0.22μm的精密过滤膜进行全量过滤，然后进一步将所得的透过液利用超滤膜进行过滤处理。超滤膜使用HFU(TorayMembraneUSA社制、材质：聚1,1-二氟乙烯、截留分子量：150,000)。超滤膜使用平膜过滤单元“SEPA-II”(GEオスモニクス制)、在膜面线速度20cm/秒、过滤压3MPa的条件下进行过滤处理直到从非透过侧回收的液量为0.6L。将超滤处理后获得的非透过液中的酶定义为回收酶，通过参考例3的源自丝状菌的纤维素酶的活性测定方法测定回收酶的活性。将回收酶相对于投入的丝状菌纤维素酶的活性示于表2～5。

表2

从源自玉米外皮的水解物得到的回收酶活性

表3

从源自大豆外皮的水解物得到的回收酶活性

表4

从源自秸秆(水稻)的水解物得到的回收酶活性

表5

从源自蔗渣的水解物得到的回收酶活性

产业上的可利用性

本发明中的糖液的制造方法以含纤维素生物质为原料，所得的糖液能够作为各种化学品的发酵原料使用。

Claims

1.糖液的制造方法，是由含纤维素生物质来制造糖液的方法，包括：将含纤维素生物质用源自丝状菌的纤维素酶进行水解的工序(1)；以及使由工序(1)获得的水解物通过超滤膜进行过滤，作为非透过液回收源自丝状菌的纤维素酶，作为透过液获得糖液的工序(2)，

2.根据权利要求1所述的糖液的制造方法，所述含纤维素生物质是选自谷物皮类生物质、秸秆和蔗渣中的1种以上。

3.根据权利要求2所述的糖液的制造方法，所述谷物皮类生物质是选自玉米外皮、大豆外皮和小麦外皮中的1种以上。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的糖液的制造方法，相对于源自丝状菌的纤维素酶的重量，所述选自果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶中的1种以上的酶的重量为1/10以下。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的糖液的制造方法，在所述工序(1)的前段或所述工序(1)中，利用果胶酶、葡糖淀粉酶和脂肪酶这3种酶来处理含纤维素生物质。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的糖液的制造方法，所述工序(2)是将由工序(1)获得的水解物固液分离而获得溶液成分、并使该溶液成分通过超滤膜进行过滤的工序。

7.根据权利要求6所述的糖液的制造方法，所述固液分离是加压过滤。