CN102978125A

CN102978125A - 表达嗜热子囊菌光孢变种lgh基因的毕赤酵母工程菌株

Info

Publication number: CN102978125A
Application number: CN2012105569240A
Authority: CN
Inventors: 李多川; 李萌; 郭晓红; 黄刚
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明是一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)热稳定脂肪酶基因1gh的毕赤酵母工程菌GS-TA-LGH。通过RT-PCR及RACE等方法从嗜热子囊菌光孢变种中获得脂肪酶基因1gh，构建表达载体pPIC9K/1gh，并导入毕赤酵母GS115，从中筛选出一种表达脂肪酶的酵母工程菌GS-TA-LGH。该工程菌脂肪酶的酶活性可达19.92U/mg，酶在50℃保温60min，不损失活性，在60℃保温60min，仍有66％的活性。具有较高的热稳定性，作为热稳定脂肪酶的生产菌株，具有经济价值和社会价值。

Description

表达嗜热子囊菌光孢变种lgh基因的毕赤酵母工程菌株

（一）技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热子囊菌光孢变种Thermoascu aurantiacus var.levisporus热稳定脂肪酶基因lgh的毕赤酵母工程菌株Pichiapastoris GS-TA-LGH。

（二）背景技术

脂肪酶（lipase）全称三酰甘油酰基水解酶，属于α/β折叠酶家族。它能够分解生物产生的各种天然油和脂肪，在生物体内参与胞内脂的代谢等重要生命活动。脂肪酶的应用涉及洗涤剂、食品、油脂、皮革、医药等工业，近些年来又被研究用于制备化学方法难以得到的手性化合物，以及用于生产作为绿色可再生能源的生物柴油，使得它再度成为生物及化工工业的研究热点。因为微生物脂肪酶种类多、周期短，耐受性好且易于工业生产，所以在酶理论研究和工业应用中有着更重要的作用。

嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.blevisporus）在以橄榄油为诱导源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的脂肪酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热子囊菌光孢变种培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热子囊菌光孢变种热稳定脂肪酶基因导入常温酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定脂肪酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

（三）发明内容

本发明以嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）为材料获得一种脂肪酶基因，命名为lgh，全长cDNA为1009bp，包含一个由894个核苷酸构成的开放阅读框，编码297个氨基酸。将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现该脂肪酶属于脂肪酶第3家族。

构建重组表达质粒载体pPIC9K/lgh，利用电转仪进行电击转化Pichiapastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在28℃200rpm/min摇床培养6d后，脂肪酶活达到19.92U/mg，SDS-PAGE检测该蛋白的分子量为58kDa，酶在50℃保温60min，不损失活性，在60℃保温60min，仍有66％的活性。具有较高的热稳定性，有重要的经济价值和社会价值。

（四）附图说明

图1脂肪酶基因lghPCR产物电泳图谱

泳道M：Marker-DL2000

泳道2：cDNA(ORF)

图2脂肪酶LGH的SDS-PAGE分析

泳道M:低分子量蛋白Marker

泳道1-7：酵母工程菌Pichiapastoris GS-TA-LGH的诱导1-7天的表达情况

图3重组脂肪酶LGH的纯化

泳道M：低分子量蛋白标准

泳道1：纯化的重组脂肪酶LGH

（五）具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种（T.aurantiacus var.levisporus）的分离鉴定

（1）标本采集：从堆肥中采集。

（2）分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

（3）鉴定:参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：脂肪酶基因lgh的克隆

（1）嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。

（2）cDNA第一条链的合成：按照Takara公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行：取1~2μg总RNA，加RNase Free ddH₂O至9.5μL，将RNA样品在75℃变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分：10mmol/L dNTP Mixture2μL，10×RTBuffer(Mg²⁺)2μL，25mmol/L MgCl₂4μL，Oligo d(T)-Adaptor Primer1μL，RNaseInhibiter0.5μL，AMV Reverse Transcriptase1μL（Final Volume20μL），将反应液混合后，室温下放10min，然后42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（3）中间片段的分离：根据脂肪酶的同源保守序列设计兼并引物。上游引物为：5’-CTCTGCYGCMKCBTATTG-3’，下游引物为：5’-CRCTGGTRAYCCAGTACTC-3’

（4）3’和5’序列的分离：脂肪酶基因5’端序列克隆，使用Tail-PCR的方法，根据中间前面得到片段设计3个向外的特异巢式引物，以及通过巢式引物以及上游公共兼并引物AD_1-5扩增得到。

lip-TAIL-1：5’-GGGGACAGCCGTAGGGGTAGAGAT-3’

lip-TAIL-2：5’-GAGGTCATCCGACACCGAGTTCCAC-3’

lip-TAIL-3：5’-TCGTCTTGGTATCCGCCGCCTC-3’

AD₁：5’-NTCGASTWTSGWGTT-3’

AD₂：5’-NGTCGASWGANAWGAA-3’

AD₃：5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’

AD₄：5’-TGWGNAGSANCASAGA-3’

AD₅：5’-AGWGNAGWANCAWAGG-3’

脂肪酶基因3’端序列克隆，按照TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0（TaKaRa）和3’RACE Kit,2nd Genneration(Roche Applied Science)使用说明进行。3’RACE的上游引物序列为：

5’-AATCGTGGAACTCGGTGT-3’

5’-ACTGTTGGGACACTGGTTCT-3’

下游引物为M13M4:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

（5）基因克隆：取0.5μlPCR回收产物与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂有X－gal和IPTG的含氨卞青霉素(100μg/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA的提取：碱法提取质粒DNA。

（7）序列测定：DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行，序列引物为M13启动子引物。嗜热子囊菌光孢变种lgh全长的cDNA为1009bp。开放阅读框部分为894bp，编码297个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于脂肪酶第3家族。该序列如下：

(A)SEQ ID NO1的信息

（a）序列特征：*长度：1009碱基对；*类型：核酸；*链型：双链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：cDNA

（c）假设：否

（d）反义：否

（e）最初来源：嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascus aurantiacus var.levisporus）

（f）序列描述：

1 GGCGATTGGG CCCTCTAGAT GCATGCTCGA GCGGCCGCCA GTGTGATGGA TATCTGCAGA

61 ATTGCCCTTA TGTTCAATTC TGTAGCCAAA TGGGCCGTTA CGGCCTTGAC GCTGGGCTTA

121 TTTGTCTCTG CTGCCCCGTA TAAACCCGAA CGCCGAGACG TCTCGGCGGA ACTCCTGCAG

181 CAGTTTAACC TCTTCGAGCA ATATGCTGCT GCAGCGTATT GCGAGGAAAA CTTCAATTCG

241 ACGGGCACGA AATTAACATG CTCTGCGGGG AACTGCCCCC TAGTGGAGGC GGCGGATACC

301 AAGACGATTG ACGAGTTTAC GGATTCCAGC TATGGAAACG TAACGGGATT CCTGGCCGTC

361 GACAACACGA ACAAGCTTAT CGTGTTGTCT TTCCGCGGAA CCAGATCTAT CGACACGTGG

421 ATTTCCAATT TGGACTTCAC TCTGAAGGAT ATTGGCGATA TCTGCAGCGG TTGCGAGATC

481 CACAACGGAT TCTGGAAATC GTGGAACTCG GTGTCGGATG ACCTCACGTC CCGGCTTCAG

541 TCTACCGTCT CAGAGTATCC GGATTATGCG ATTATCTTCA CGGGCCACAG CGCCGGAGCA

601 GCCGTGGCTA CTGTTGGGAC ACTGGTTCTG AGAAAGGTGG GATACGCGGT CGATCTCTAC

661 CCCTACGGCT GTCCCCGCAT CGGCAACGGA CAGCTTGCCG AGTACATGAC GACCCAGACT

721 CCCGGTACGA ACTACCGCAT CACACACACC GACGATATCG TACCCAGGCT GCCGCCCGAA

781 TGGGCCGGCT ACAGCCACTA CAGCCCCGAG TACTGGATCA CAAGCCCGAA CAATGTGACC

841 GTGACCACGG CGGACATTCA AGTCATTCAG GGAATCGACT CCGACGCTGG GAATGCCGGT

901 ACCGACGGAC TGTCCACTGA CGCTCATGGA TGGTACTTTG GACCTATTTC TGCATGCCAA

961 TGAAAGGGCA ATTCCAGCAC ACTGGCGGCC GTTACTAGTG ATCCGAGCT

（B）SEQ ID NO2的信息

（a）序列特征：*长度：297氨基酸；*类型：氨基酸；*链型：单链；*拓扑结构：线性

（b）分子类型：蛋白质

（c）序列描述：

1 MSNSVAKWAV TALTLGLFVS AAPYKPERRD VSAELLQQFN LFEQYAAAAY CEENFNSTGT

61 KLTCSAGNCP LVEAADTKTI DEFTDSSYGN VTGFLAVDNT NKLIVLSFRG TRSIDTWISN

121 LDFTLKDIGD ICSGCEIHNG FWKSWNSVSD DLTSRLQSTV SEYPDYAIIF TGHSAGAAVA

181 TVGTLVLRKV GYAVDLYPYG CPRIGNGQLA EYMTTQTPGT NYRITHTDDI VPRLPPEWAG

241 YSHYSPEYWI TSPNNVTVTT ADIQVIQGID SDAGNAGTDG LSTDAHGWYF GPIFACQ

实施例3：表达载体的构建

（1）根据分离出的lgh基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点：

上游引物：5’-CG

GCCCCGTATAAACCCGAAC-3’

下游引物：5’-TTGCTCATTGGCATGCAGAAATAGGT-3’

（2）嗜热子囊菌光孢变种总RNA的提取:利用Trizol试剂提取。

（3）反转录合成cDNA第一条链：按照TaKaRa公司的TaKaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0试剂盒说明书进行，以Oligo dT-Adaptor primer为引物合成cDNA第一链。反应条件为：42℃温育60min，再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180μL DEPC处理的ddH₂O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃，备用。

（4）PCR反应（25μL）：cDNA2μL,10×Buffer2.5μL,10mmol/L dNTP2μL,25mmol/L MgCl₂2μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(5U/μL),ddH₂O14μL。反应条件为94℃3min预变性；94℃1min，57℃1min，72℃1min,共30个循环，72℃延伸10min，10℃保存。

（5）基因克隆：取0.5μL PCR产物与pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T/lgh，操作步骤按TaKaRa公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α，在涂有X－gal和IPTG的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。

（6）质粒DNA提取：碱法提取质粒DNA。

（7）用EcoRⅠ和NotⅠ对重组质粒pMD18-T/lgh产物进行双酶切，同时用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切酵母表达质粒pPIC9K，DNA胶回收试剂盒回收纯化lgh基因及载体pPIC9K片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pPIC9K/lgh，重组质粒转化大肠杆菌JM109，在含Amp的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。

实施例4：表达脂肪酶基因lgh的酵母工程菌株的构建及筛选

（1）重组表达质粒的线性化:将重组表达质粒pPIC9K/lgh用限制性内切酶SacⅠ线性化。

（2）转化：电击转化酵母菌株PichiapastorisGS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。

（3）筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2－4d，挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于1.00mg/mL，2.00mg/mL，3.00mg/mL，4.00mg/mL G418的YPD平板上筛选多拷贝转化子。

实施例5：毕赤酵母PichiapastorisGS115的诱导表达和活性检测

（1）将阳性转化子接种于含25mL BMGY培养基中，28℃200rpm/min摇床培养24h（OD₆₀₀达2－6），离心收集菌体，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中，至OD₆₀₀值为1.0，28℃200rpm/min继续培养，每12h补充甲醇至终浓度为1%，每24h取样，室温10，000g离心5min，取上清进行SDS-PAGE分析。

（2）酶活性检测：酶活性测定采用pNPP法，蛋白含量测定采用Bradford法。

（3）重组脂肪酶LGH的最适反应温度、pH及热稳定性：诱导表达的重组脂肪酶经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析，获得电泳均一的纯化蛋白，用纯化的重组脂肪酶测定其性质。在不同温度和pH条件下分别测定重组脂肪酶的酶活力，将最高的酶活力定义为100％，分别计算不同温度条件下脂肪酶的相对酶活性；将脂肪酶在不同的温度下保温不同的时间（10min，20min，30min，40min，50min，60min）后，检测剩余酶活力。

实施例6：表达lgh基因的毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH的保藏

表达lgh基因的毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年11月22日；酵母工程菌株编号为：CGMCC No.6862；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴氏毕赤酵母Pichiapastoris。

Claims

1.一种表达嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)脂肪酶基因lgh的酵母工程菌株，其特征在于该菌为一种毕赤酵母，通过RT-PCR及RACE等方法从嗜热子囊菌光孢变种（Thermoascusaurantiacus var.levisporus）获得热稳定脂肪酶基因lgh，将该基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,获得表达重组质粒pPIC9K/lgh，转化毕赤酵母GS115,从中筛选出表达热稳定脂肪酶基因lgh的毕赤酵母工程菌株GS-TA-LGH。