JP2001503245A - ボレリア属ｄｎａを投与するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 少なくとも一種類のボレリア属遺伝種抗原をコード化するプラスミドＤＮＡ並びにそのようなプラスミドを作成する方法および使用する方法が開示され、クレームされている。それらの遺伝種は、ブルグドルフェリ、ガリニイおよび／またはアフゼリであって差し支えない。その抗原は、ＯｓｐＡおよび／またはＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣであって差し支えない。そのプラスミドＤＮＡを含有する組成物は、防御応答のような生体内応答のために、ライム病に感染しやすい宿主に投与するのに、または有用な抗体を産生するのに有用である。本発明のプラスミドはまた、生体外で抗原を産生するために細胞内に形質移入することができる。そして、本発明のプラスミドは、ＤＮＡ（プロモータ、リーダー配列、抗原、およびターミネータをコード化するＤＮＡのような）を単離し、三元ライゲーションのようなライゲーションを行うことにより調製することができる。より詳しくは、ボレリア属遺伝種抗原、例えば、ＯｓｐＡおよび／またはＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣをコード化するＤＮＡの投与およびライム病を防ぐ防御応答のようなボレリア属に対する免疫応答を誘発するその組成物が開示され、クレームされている。したがって、ライム病ワクチンまたは免疫組成物、並びにそれらを産生し、使用する方法が開示され、クレームされている。

Description

【発明の詳細な説明】 ボレリア属ＤＮＡを投与するための組成物および方法 関連出願 1994年10月3日に出願された米国特許出願第08/320,416号（許可された）、199 3年10月26日に出願された同第08/137,175号、1994年6月20日に出願された同第08 /262,220号、ＰＣＴ出願第US95/07665号、1995年1月17日に出願された米国特許 出願第08/373,455号、ＰＣＴ出願第US92/08697号、国際公開第WO90/04411号、19 95年6月6日に出願された米国特許出願第08/470,672号および1995年6月6日に出願 された同第08/479,017号を参照する。これらの各々をここに引用する。本出願に おいて、いくつかの文書が引用されており、それらは、引用された箇所、または 請求の範囲の前の「参考文献」という見出しの付いている箇所に完全に列挙され ている。ここに引用した各々の文書を文献としてここに包含する。発明の分野 本発明は、生体内または生体外で抗原をコード化するボレリア属(Borrelia)遺 伝種ＤＮＡを投与するための組成物および方法に関するものである。本発明は、 より詳しくは、生体内、半ビボまたは生体外で、抗原をコード化するボレリア属 遺伝種ＤＮＡ、例えば、ＯｓｐＡ（外側表面タンパク質Ａ）および／またはＯｓ ｐＢ（外側表面タンパク質Ｂ）および／またはＯｓｐＣ（外側表面タンパク質Ｃ ）、またはそれらの断片を、その発現のために投与するための組成物および方法 に関するものである。発明の背景 ライム病は、マダニ属トウコマ属(Ricinus)コンプレックスのダニにより媒介 される多重システム(multisystem)の病気である。スピロヘータ ボレリア ブ ルグドルフェリ(burgdorferi)は、広義で、ライム病の病因因子である。この病 気は、米国内で現在最もよく知られた節足動物媒介病であり、中央ヨーロッパに 特有である（Barbour and Fish 1993）。より詳しくは、ライム病に関連するボ レリア属には三種類の遺伝種がある：ボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア アフゼリ (afzelli)およびボレリア ガリニイ(garinii)。ボレリア ブルグドルフェリは 北アメリカのライム病の病因因子であり、あるヨーロッパライム病は、狭義で、 ボレリア ブルグドルフェリであると考えられている。ボレリア アフゼリおよ びボレリア ガリニイは、ヨーロッパライム病の主な原因であり、広義で、ボレ リア ブルグドルフェリであると考えられている。 ライム病は、初期の段階で抗生物質療法により治すことができるけれども、ラ イム病が進行してしまった場合には、心臓、神経および関節に異常を来たすこと がある。ライム病のためのヒトワクチンの開発が現在研究されている。ボレリア ブルグドルフェリの外側表面リポタンパク質ＯｓｐＡが、そのようなワクチン の開発に関する現在主要な候補分子である。 組換えＯｓｐＡリポタンパク質（ｒＯｓｐＡ）が、感染性ボレリア ブルグド ルフェリによる抗原投与に対してマウス内で防御免疫応答を誘発することが知ら れている（Fikrig等、1990；Erdile等、1993；米国特許出願第08/373,455号）。 ＯｓｐＡには、米国内で皮下投与ワクチンとして現在人間の分野の試験が行われ ている（Keller等、1994）。 上述した出願第08/373,455号およびＰＣＴ出願第US92/08697号は、ｒＯｓｐＡ ワクチン、特に、脂質化された(lipidated)ｒＯｓｐＡＮおよびＯｓｐＡをコー ド化するＤＮＡを発現する方法に関するものである。上述した出願第08/320,416 号および国際公開第WO90/04411号は、ＯｓｐＡコード化ＤＮＡ、ＯｓｐＡのアミ ノ酸配列、合成ＯｓｐＡ、ＯｓｐＡまたは合成ＯｓｐＡを含有する組成物、およ びそのような組成物を用いる方法に関するものである。そして、上述した他の出 願は、他のボレリア属抗原または他のＯｓｐをコード化するＤＮＡ、もしくは、 ＯｓｐＡまたは他のＯｓｐの有用な断片をコード化するＤＮＡ、そのアミノ酸配 列、そのような断片または他のＯｓｐを含有する組成物、およびそのような組成 物を使用する方法に関するものである。ＯｓｐＡ、他のボレリア属抗原または外 側表面タンパク質（Ｏｓｐ）、またはそれらの断片を製造するために米国特許出 願第08/373,455号およびＰＣＴ出願第US92/08697号の方法で用いることのできる そのようなＤＮＡを本発明に用いても差し支えない。本発明において有用なＤＮ Ａに関して、Molecular Microbiology(1989)3（4）479-486、およびＰＣＴ国際 公開 第WO93/04175号、および同第WO96/06165号を参照のこと。 投与への新たな方法または応答への新たな方法が提供されるので、新たなワク チン接種計画が望まれている。 特に、これまでの従来技術には、生体外または半ビボでの真核細胞への、もし くは、特にここに開示されているような、ライム病に感染しやすい哺乳類宿主（ 家畜化されたまたは野生型またはヒト）への、ボレリア属遺伝種ＤＮＡ、例えば 、ＯｓｐＡおよび／またはＯｓｐＢ、および／またはＯｓｐＣをコード化するＤ ＮＡの投与、もしくは生体内でのそれらの発現は、教示も、示唆もされていない と考えられている。発明の目的および概要 本発明の目的は、ライム病に感染しやすい哺乳類宿主のような宿主に、抗原を コード化するボレリア属遺伝種単離および／または精製ＤＮＡ、例えば、Ｏｓｐ Ａ、および／またはＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣをコード化する単離および ／または精製ＤＮＡのような、ボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア アフゼ リ、ボレリア ガリニイまたはそれらの組合せからの抗原をコード化する単離お よび／または精製ＤＮＡ；例えば、ボレリア ブルグドルフェリＯｓｐＡおよび ／またはＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣをコード化するＤＮＡを投与するため の方法および組成物を提供することにある。これらの組成物は、キャリアまたは 希釈液を含んでいても差し支えない。前記ＤＮＡは、前記宿主により発現される 形態で、好ましくは、防御免疫応答のような応答を誘発するのに十分な量で投与 され、このＤＮＡは、免疫原性向上アジュバントを添加する必要なく投与するこ とができる。 したがって、本発明は、真核細胞による発現のためのボレリア属遺伝種抗原Ｄ ＮＡプラスミド、そのプラスミドを含有する組成物、およびその組成物を使用し 、この組成物からの生成物を使用する方法を提供する。 本発明のプラスミドは、上流から下流まで（５’から３’まで）：真核細胞中 で発現を作用させるプロモータをコード化するＤＮＡ、哺乳類細胞からの真核性 タンパク質配列の分泌を可能にするリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ、ボ レリア属遺伝種抗原ＤＮＡ、およびターミネータをコード化するＤＮＡからなっ ていても差し支えない。 この真核細胞内での発現を作用させるプロモータをコード化するＤＮＡは、真 核性の、例えば、ヘルペスウイルスプロモータのような、哺乳類ウイルスプロモ ータであっても差し支えない。ヒトサイトメガロウイルスプロモータが現在好ま しい。このヒトサイトメガロウイルスプロモータは、ＨＣＭＶ−ＩＥのような即 初期（immediate early）ヒトサイトメガロウイルスプロモータであっても差し 支えない。前記プラスミドは、イントロンＡを含むこのＨＣＭＶ−ＩＥ遺伝子５ ’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含んでいても差し支えない。この配列は、このＨＣＭ Ｖ−ＩＥプロモータに対して３’であり、キメラ５’ＵＴＲ配列およびリーダー ペプチドの部分に対して５’であって差し支えない（このＵＴＲおよびリーダー ペプチド暗号配列は、以下に記載するように、ヒト組織プラスミノゲン活性化因 子をコード化するＤＮＡ由来であっても差し支えない）。 このリーダーペプチドをコード化するＤＮＡは、哺乳類細胞からの原核タンパ ク質配列の分泌を促進させるためのものである。このＤＮＡは、咄乳類細胞から の分泌を目的とした適切なまたは類似のリーダーペプチドをコード化するいかな るＤＮＡ、例えば、真核性リーダーペプチドをコード化するＤＮＡであっても差 し支えない。例えば、このリーダーペプチドをコード化するＤＮＡは、ペプチド ホルモン、すなわち、哺乳動物からの、例えば、ヒトペプチドホルモンリーダー ペプチドのような、ペプチドホルモンリーダーペプチドをコード化するＤＮＡか らのものであっても差し支えない。本発明に使用するのに適したリーダーペプチ ドをコード化するＤＮＡの特別な例としては、インシュリン（ヒト、ウシ、ブタ 等）、レニン、第VIII因子、および組織プラスミノゲン活性化因子のリーダーペ プチドをコード化するＤＮＡが挙げられる。 ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーをコード化するＤＮＡ が現在好ましい。このＴＰＡをコード化するＤＮＡは、ＴＰＡ遺伝子から由来し 、この遺伝子の５’ＵＴＲおよびリーダーペプチドの一部をコード化する。５’ ＵＴＲおよびリーダーペプチドの一部を有するＴＰＡ ＤＮＡでさえ、真核細胞 発現を増大させることができる。ある特定の理論に結びつけることを意図するも のではないが、増大した発現は、この５’ＵＴＲによるものであり得る。 前記ボレリア属遺伝種抗原ＤＮＡは好ましくは、自然リーダー配列を含まない 。このボレリア属遺伝子抗原ＤＮＡは好ましくは、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、Ｏｓｐ Ｃ、ＯｓｐＤ、他のＯｓｐ、および他の抗原から選択される少なくとも１つの抗 原でコード化する（関連出願の項目に引用した出願を参照のこと）。ＯｓｐＡお よび／またはＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣをコード化する自然リーダー配列 を含まないＤＮＡが現在好ましい。このＤＮＡは、ボレリア ブルグドルフェリ 、ボレリア アフゼリ、ボレリア ガリニイまたはこれらのいずれかの組合せか らのものであっても差し支えなく、ボレリア ブルグドルフェリが現在好ましい 。 前記ターミネータは、真核細胞内で使用するためのいかなる適切なターミネー タ配列、例えば、哺乳類ペプチドホルモンからのターミネータ配列であっても差 し支えない。ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータが現在好ましい。 本発明のプラスミドは、活性化因子（例えば、ＴＰＡ）およびボレリア属抗原 （例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ）の融合タンパク質に関する遺伝子を 含有していても差し支えない。 本発明は、前記プラスミドおよびキャリアからなる組成物を包含する。このキ ャリアは、前記ＤＮＡまたはこのプラスミドの機能を破壊しないいかなる適切な キャリアであって差し支えない。生理食塩水が現在好ましいキャリアである。 本発明はさらに、前記組成物を用いる方法、例えば、その組成物をライム病に 感染しやすい宿主に投与して、応答を誘発または抗原を発現させることを包含す る。この応答は、防御的であっても差し支えない。その応答は単に抗体応答であ っても差し支えなく、その方法はさらに、抗体および／または抗体産生細胞を回 収することを含んでも差し支えない（これらの細胞は、例えば、その抗体産生細 胞を融合して、ハイブリドーマ細胞を産生し、次いで、これらのハイブリドーマ 細胞による発現からモノクローナル抗体を得ることにより、ハイブリドーマ細胞 およびモノクローナル抗体を産生するのに有用である）。その宿主は、ヒトのよ うな哺乳類であっても差し支えない。 本発明はさらに、抗原を発現する方法、または本発明のプラスミドにより真核 細胞の形質移入を含む生体外で抗原を調製する方法を提供する。この方法はさら に、それらの細胞から抗原を回収することを含んでも差し支えない。 そのプラスミドか構成されるＤＮＡのそれぞれの片（ＤＮＡ分子）をライゲー トすることによりそのプラスミドを調製する方法、および前記抗体および抗原を 使用する方法、並びにそれらの抗原および抗体自体が本発明により考えられる。 他の目的および実施の形態が、開示されているかまたは以下の詳細な説明から 明白である。図面の簡単な説明 以下の詳細な説明において、ここに包含する添付した図面を参照する。 図１は、いくつかの特徴的な制限部位を有するＶＲ２２１０の構造を示してい る。 図２は、下線および上線により示された、ＯｓｐＡ暗号配列を増幅し、挿入す るのに使用する、プライマーの位置が示されたＶＲ２２１０のヌクレオチド配列 （配列番号１）を示している。 図３は、いくつかの特徴的な制限部位を有するＶＲ２２１１の構造を示してい る。 図４は、下線および上線により示された、ＯｓｐＢ暗号配列を増幅し、挿入す るのに使用する、プライマーの位置が示されたＶＲ２２１１のヌクレオチド配列 （配列番号２）を示している。 図５は、ｏｓｐＡのヌクレオチド配列（ＴＲＨ４３；ボレリア ブルグドルフ ェリ株３１）（配列番号３）を示している。 図６は、ｏｓｐＢのヌクレオチド配列（ＴＲＨ４６；ボレリア ブルグドルフ ェリ株Ｂ３１）（配列番号４）を示している。 図７は、ｏｐｓＡおよびｏｐｓＢのヌクレオチド配列（配列番号５）並びに予 測されるそのアミノ酸配列（配列番号１８）を示している。 図８は、ＶＲ１０１２の構造を示している。 図９は、ヌクレオチド１８４１から２００１までのＶＲ１０１２の多重クロー ニング部位配列（配列番号６）を示している。 図１０は、ＶＲ１０１２のヌクレオチド配列（配列番号７）を示している。 図１１は、ｎｋＣＭＶｉｎｔＢＬのヌクレオチド配列（配列番号８）を示して いる。 図１２は、ＴＰＡ信号ペプチド配列を有するｎｋＣＭＶｉｎｔＢＬのヌクレオ チド配列（配列番号９）を示している。 図１３は、ｏｓｐＡを増幅するためのＰＣＲプライマー（配列番号１０、１１ ）を示している。 図１４は、ｏｓｐＢを増幅するためのＰＣＲプライマー（配列番号１２、１３ ）を示している。 図１５は、ＶＲ２２１０の部分的なヌクレオチド配列（配列番号１６）を示し ている。 図１６は、ＶＲ２２１１の部分的なヌクレオチド配列（配列番号１７）を示し ている。 図１７、１８Ａおよび１８Ｂは、免疫ブロットを示している。 図１９は、免疫ブロットを示している。詳細な説明 プラスミドＤＮＡの直接注射が、様々な感染病に対するワクチン接種の単純で 効果的な方法となってきた（例えば、Science，259:1745-49，1993を参照のこと ）。これは、体液性並びに細胞性免疫応答の両方を誘発するので、潜在的に、組 換えタンパク質ワクチン接種よりも強力で持続性である。 本発明は、ライム病に対するＤＮＡベースのワクチンまたは免疫組成物（例え ば、ボレリア ブルグドルフェリ、アフゼリ、またはガリニイ）を提供し、免疫 応答を誘発することができる。この応答は、ボレリア ブルグドルフェリの感染 性株の抗原投与に対して、マウス内で100％までもの防御を与えることができる 。本発明のプラスミドの例としては、Ｂ３１外側表面タンパク質（ＯｓｐＡ）の 発現を作用させるヒトサイトメガロウイルス即初期プロモータが挙げられる。真 核細胞内での発現を促進させるために、ＯｓｐＡをコード化する遺伝子の自然リ ーダー配列が、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子リーダー配列により置き換え られている。 発現および分泌が、ウェスターンブロット法により、一過性に形質移入された ＵＭ４４９およびＢＨＫ細胞内で示された（図１７、１８Ａおよび１８Ｂ）。 裸のプラスミドＤＮＡを筋肉内に注射し、続いて、Ｓｈ２スピロヘータにより 抗原投与を行うことにより、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ内で防御が示された。ワクチン接種 後に採取された血清は、生体外でスピロヘータの増殖を阻害したＯｓｐＡに対す る抗体を高力価で含有していた。免疫化された動物は、抗原投与から14日後には ライム病の徴候を示していなかった。さらに、検査した全ての組織には、スピロ ヘータが完全に含まれていなかった。 このように、ボレリア属抗原、例えば、ボレリア ブルグドルフェリ、ボレリ ア アフゼリ、ボレリア ガリニイの抗原またはそれらの組合せ、例えば、Ｏｓ ｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣのタンパク質またはこれらのいかなる組合せを発現す る、ＤＮＡワクチンまたは免疫組成物は、ライム病の病原因子である、ボレリア 属遺伝種による感染に対してマウスを防御することができる。したがって、この 組成物は、ライム病に感染しやすい宿主内に防御応答を誘発するのに、並びに抗 原および抗体を誘発するのに有用である。また、これらの抗原および抗体自体も 有用である。 したがって、上述したように、本発明は一般的な意味において好ましくは、生 理食塩水のような適切なキャリアまたは希釈液内の、ボレリア属抗原をコード化 するＤＮＡ、例えば、ボレリア ブルグドルフェリ、ボレリア アフゼリ、ボレ リア ガリニイの抗原またはそれらの組合せ、例えば、ＯｓｐＡおよび／または ＯｓｐＢ、および／またはＯｓｐＣ、好ましくは、ＯｓｐＡをコード化するＤＮ Ａを投与することにより、ライム病に感染しやすい宿主、例えば、哺乳類の宿主 のような宿主を、ボレリア属、すなわち、ライム病に対して、免疫化する方法、 またはその宿主にワクチン接種する方法、またはその宿主内において、免疫応答 を誘発させる方法を提供する。本発明は、この方法を実施するためのプラスミド および組成物、並びにそれらのプラスミドを製造する方法、およびこれらプラス ミドの発現産生物とそれによって誘発された抗体との使用方法を提供する。 マウスに関する効力研究（Erdile等、1993；USSN 08/373,455）に基づく現在 のイヌおよびヒトの試みから、マウスは現在、家畜動物、人間、およびライム病 またはボレリア属に感染しやすい他の動物（例えば、シカのような野生動物）に 外挿するための、ボレリア属およびライム病に関する適切な動物モデルであるこ とが明白である。 本発明の広い性質の観点から、すなわち、本発明はブルグドルフェリ以外のボ レリア属遺伝種（すなわち、本発明は、遺伝種のアフゼリおよびガリニイ、並び に広くは、いかなるボレリア属遺伝種の抗原およびそれらの免疫活性断片にも適 用できる）に適用できるという観点から、ここではＯｓｐＡに関する議論は、本 発明の広い性質のために意図したものである、すなわち、「ＯｓｐＡ」は、例示 であり、いかなるボレリア属遺伝種の抗原またはその免疫断片を含むようにこの 明細書内で読むことができる。 本発明において、このＯｓｐＡ、すなわち広くは、ボレリア属遺伝種抗原また はその免疫活性断片をコード化するＤＮＡは、年齢、性別、体重、種および特定 の患者の状況、並びに経路のような因子を考慮して、医療または獣医業界の当業 者によく知られた技術により、ある供給量で投与することができる。ＯｓｐＡ、 すなわち広くは、ボレリア属遺伝種抗原またはその免疫活性断片をコード化する ＤＮＡは、単独で投与することができ、または他のボレリア属抗原、もしくは他 のボレリア属遺伝種抗原をコード化するＤＮＡと共に投与、またはその連続投与 を行うことができる。ＯｓｐＡすなわち広くはボレリア属遺伝種抗原またはその 免疫活性断片をコード化するこのＤＮＡは、例えば、「ライム病の季節」が始ま りそうな春毎に、連続して投与することができる。 上記のごとく広く論じたように、本発明は、真核細胞による発現のために、ボ レリア属遺伝種抗原ＤＮＡを含むＤＮＡを含有するプラスミドを包含する。この ＤＮＡは上流から下流まで（５’から３’まで）、真核細胞中の発現を作用させ るプロモータをコード化するＤＮＡ、哺乳類細胞からの真核性タンパク質配列の 分泌を可能にするリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ、ボレリア属遺伝種抗 原をコード化するＤＮＡ、およびターミネータをコード化するＤＮＡを含んでも 差し支えない。 例えば、このプロモータは、ヘルペスウイルスプロモータ、例えば、ヒトサイ トメガロウイルスプロモータＤＮＡのような真核性ウイルスプロモータであって も差し支えない。 哺乳類細胞からの真核性タンパク質配列の分泌を可能にするリーダーペプチド をコード化するこのＤＮＡは、真核性の、好ましくは、哺乳類のリーダー配列を コード化するＤＮＡ、例えば、ペプチドホルモン、すなわち、例えば、インシュ リン、レニン、第VIII因子、ＴＰＡ等のリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ のような、この目的のための適切なリーダーをコード化するＤＮＡであり、ヒト 組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）リーダーペプチドをコード化するＤＮ Ａが現在好ましい。 このヒトサイトメガロウイルスプロモータは、ＨＣＭＶ−ＩＥのような即初期 ヒトサイトメガロウイルスプロモータであって差し支えない。ＨＣＭＶプロモー タに関しては、米国特許第5,168,062号および同第5,385,839号を参照のこと。本 発明のプラスミドは、イントロンＡを含むＨＣＭＶ−ＩＥ遺伝子５’非翻訳領域 （ＵＴＲ）を含有しても差し支えない。この配列は、ＨＣＭＶ−ＩＥプロモータ に対して３’であり、５’ＵＴＲ配列およびリーダーペプチドの活性化因子部分 に対しては５’であって差し支えない。 このＴＰＡ配列は、ＴＰＡ遺伝子から由来でき、その遺伝子からの５’ＵＴＲ およびリーダーペプチドの一部をコード化できる。ＴＰＡの５’ＵＴＲにより、 真核細胞の発現が増大するかもしれない。前記ボレリア属遺伝種ＤＮＡは、ボレ リア ブルグドルフェリ、アフゼリ、ガリニイまたはそれらの組合せ、例えば、 ボレリア ブルグドルフェリからのものであって差し支えなく、好ましくは自然 リーダー配列を含まない、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、ＯｓｐＤ、他の外側 表面タンパク質または抗原の組合せ、例えば、ＯｓｐＡおよび／またはＯｓｐＢ および／またはＯｓｐＣのような抗原をコード化できる。 前記転写ターミネータ配列は、真核性ターミネータ、例えば、哺乳類ペプチド のターミネータをコード化するＤＮＡのようないかなる適切なターミネータであ っても差し支えなく、ＢＧＨターミネータが現在好ましい。 前記プラスミドは、無菌水、生理学的食塩水等のようないかなる適切なキャリ ア、希釈液または賦形剤との混合物であっても差し支えない。もちろん、そのキ ャリア、希釈液または賦形剤は、そのプラスミドＤＮＡを破壊したり、損傷を与 えてはならない。 このプラスミドは、いかなる適切な様式で投与しても差し支えない。このプラ スミドは、投与の様式に適した組成物であっても差し支えない。そのような組成 物としては、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシルのような、開口部投与、例え ば、口、鼻、肛門、膣、経口、胃内の投与等のための液体試料；および、例えば 、注射による投与のための、無菌の溶液、懸濁液またはエマルジョンのような、 非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈の投与等のための液体試料が挙げられる。筋 肉内投与およびそのための組成物が現在好ましい。 本発明のプラスミドは、真核細胞による抗原の生体外発現のために用いること ができる。そのような抗原の回収は、いかなる適切な技術、例えば、ここに引用 した文書（関連出願の元に引用された出願およびここに引用された文書のような ）に用いられた回収技術と類似の技術によるものであって差し支えない。 このように発現された抗原は、免疫原性向上アジュバント（「発現された抗原 組成物」）の有無にかかわらず、免疫抗原またはワクチン組成物内に使用するこ とができる。そのような組成物は、年齢、性別、体重、種、特定の患者の状況、 並びに投与の経路のような要因を考慮して、医療または獣医の業界における当業 者によく知られた技術により、ある供給量で投与することができる。これらの組 成物は、単独でも、または他の組成物と共に投与しても差し支えなく、例えば、 「ライム病の季節」が始まりそうになる春毎に連続的に投与しても差し支えない 。 これらの発現された抗原組成物の投与の経路は、口、鼻、肛門、膣、経口、胃 内、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈等であって差し支えない。 それらの発現された抗原組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、 エリキシル、カプセル（「ゲルキャップ」−液体の抗原またはその断片を含有す るゼラチンカプセル製剤−を含む）、錠剤、硬い飴状の製剤等であって差し支え ない。この発現された抗原組成物は、無菌の水、生理的食塩水、ブドウ糖等のよ うな適切なキャリア、希釈液、または賦形剤を含有していてもよい。これらの組 成物は、所望の製剤および投与の経路に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝 剤、アジュバント、ゲル化または粘度向上添加剤、防腐剤、調味剤、色等のよう な補助物質を含んでいても差し支えない。ここに引用する「REMINGTON'S PHARMA CEUTICAL SCIENCE」、第17版、1985のような標準的なテキストを調べて、必要以 上の実験を行わずに、適切な製剤を調製してもよい。 プラスミド組成物および発現された抗原組成物の適切な供給量は、以下の実験 に基づいていても、引用した文書に基づいていても差し支えない。例えば、適切 な供給量は、0.5-500μｇの抗原、好ましくは、0.5-50μｇの抗原、例えば、発 現された抗原組成物中1-10μｇの抗原であって差し支えない。プラスミド組成物 において、その供給量は、これら発現された抗原組成物と類似の応答、または発 現された抗原組成物中の供給量と類似の発現を誘発するのに十分な量のプラスミ ドであるべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な 量は、0.1μｇから２mｇ、好ましくは、1-10μｇであって差し支えない。 このように、本発明はさらに、広義で、真核細胞による免疫、抗原またはワク チン（防御）応答を誘発するのに前記抗原を生体内で発現するために、もしくは 半ビボまたは生体外で発現するために、ボレリア属遺伝種抗原をコード化するＤ ＮＡを含むプラスミドＤＮＡを含有する組成物を投与する工程を含む方法を提供 する（すなわち、その細胞は、ライム病に感染しやすい宿主の細胞であって差し 支えなく、すなわち、その投与は、哺乳類、例えば、ヒトのようなライム病に感 染しやすい宿主に行われ、もしくは、その細胞は、半ビボまたは生体外の細胞で あっても差し支えない）。本発明はさらに、生体外または半ビボで、真核細胞に よる前記プラスミドＤＮＡの発現からのボレリア属遺伝種抗原を含有する組成物 、およびライム病に感染しやすい宿主である哺乳類にそのような組成物を投与し て、応答を誘発させる方法を提供する。 これらの方法は免疫または免疫応答を刺激することができるので、本発明の方 法は、形成された抗体（防御のない）がそれにもかかわらず有用であるために、 単に免疫応答（防御応答でもあることと対照的に）を刺激するために用いても差 し支えない。抗体を誘発することから、この業界でよく知られた技術により、モ ノクローナル抗体を調製することができ、それらのモノクローナル抗体を、よく 知られた抗体結合アッセイ、診断キットまたは試験に用いて、ボレリア属遺伝種 の存在または不在を決定したり、その細菌に対する免疫応答が単に刺激されてい るか否かを決定することができる。それらのモノクローナル抗体は、回収または 試験工程、例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、またはＯｓｐＣのようなボレリア属遺 伝種抗原を回収または単離するための免疫吸着クロマトグラフィーに用いること もできる。 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリン である。モノクローナル抗体は、一つの抗原決定因子と反応し、従来の血清由来 抗体よりも大きい特異性を提供する。さらに、多数のモノクローナル抗体をスク リーニングすることにより、所望の特異性、結合活性およびアイソタイプを有す る個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系統は、化学的に同 一の抗体の一定した安価な供給源を提供し、そのような抗体の調製を容易に標準 化することかできる。モノクローナル抗体を産生する方法が、例えば、1989年4 月1日に発行されたKoprowski，H.等の米国特許第4,196,265号におけるように、 当業者によく知られている。この特許をここに引用する。 モノクローナル抗体を使用することが知られている。そのような使用の一つと しては、診断方法、例えば、1983年3月8日に発行されたDavid，G.およぴGreene ，H.の米国特許第4,376,110号が挙げられる。この特許をここに引用する。モノ クローナル抗体はまた、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのに 用いられた、例えば、Milstein，C．1980，Scientific American 243:66，70。 この文献をここに引用する。 本発明のプラスミドを調製するために、その内のＤＮＡを好ましくは互いにラ イゲートして、プラスミドを形成する。例えば、好ましくは、プロモータ、リー ダー配列、抗原およびターミネータＤＮＡを単離し、精製し、５’から３’まで 上流より下流の方向に互いにライゲートする。以下に例示するように、三方ライ ゲーション(three-way ligation)が現在好ましい。 したがって、本発明の方法およびそれからの産生物には、ここに述べるような いくつかの有用な用途かある。他にも、本発明の実施の形態に関する用途がある 。 本発明およびその多くの利点が、説明として以下の実施例からより良好に理解 されよう。 実施例 実施例１−プラスミドの構築 三種類のＤＮＡ分子：(1)制限エンドヌクレアーゼ（ｐｓｔＩおよびＸｂａＩ ）で消化されたＶＲ１０１２プラスミド（図８、９、１０）（配列番号６、７） からのＤＮＡ配列を有する第一のＤＮＡ分子；(2)ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで消 化さ れた（ＰＣＲ増幅の後に）ＰＣＲ増幅ＴＰＡ５’ＵＴＲおよびリーダーペプチド 暗号配列（ｎｋＣＮＶｉｎｔＢＬからの；Manthorpe等，（1993）Human Gene Th e rapy 4，419-431を参照のこと；Chapman等（1991）Nucleic Acids Research 1 9，3979-86も参照のこと）（図１１、１２）（配列番号８、９）からのＤＮＡ配 列を有する第二のＤＮＡ分子；および(3)ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化された ＰＣＲ増幅ボレリア属抗原暗号配列、例えば、ＯｓｐＡ（図５；配列番号３）（ ＰＣＲプライマー：図１３；配列番号１０、１１）またはＯｓｐＢ（図６；配列 番号５）（ＰＣＲプライマー：図１４；配列番号１２、１３）をコード化するＰ ＣＲ増幅ＤＮＡからのＤＮＡ配列を有する第三のＤＮＡ分子（図７；配列番号５ ；およびHowe等，1986，Infection and Immunity 54:207-212（「Howe等1986」 ）；Berstrom等，1989，Molecular Microbiology，3(4)，479-486）をここに単 離することにより、それぞれ、ボレリア ブルグドルフェリ（図７参照）（配列 番号５）からのＯｓｐＡ（図５）（配列番号３）およびＯｓｐＢ（図６）（配列 番号４）の遺伝子暗号を含有するＤＮＡプラスミドＶＲ２２１０（図１および２ ）（配列番号１）およびＶＲ２２１１（図３および４）（配列番号２）を構築し た。このボレリア属抗原をコード化するＤＮＡの自然リーダー配列は、咄乳類細 胞中の発現および分泌を促進させるために存在しない。これらの構築物（ＶＲ２ ２１０、ＶＲ２２１１）は、生体外で分泌タンパク質を発現し、生体内で特異的 抗体応答を誘発する。 特に、構築物ＶＲ２２１０は、ＯｓｐＡをコード化するＤＮＡを含有し、上述 した三種類のＤＮＡ分子（断片）を互いにライゲートすることにより作成した（ ここで、前の段落における第三のＤＮＡ分子または配列は、Howe等，1986におけ るプラスミド、例えば、ｐＴＲＨ４３からの、ＯｓｐＡをコード化するＤＮＡで ある）。そして、構築物ＶＲ２２１１は、ＯｓｐＢをコード化するＤＮＡを含有 し、上述した三種類のＤＮＡ断片を互いにライゲートすることにより作成した（ ここで、前の段落における第三のＤＮＡ分子または配列は、Howe等，1986におけ るプラスミド、例えば、ｐＴＲＨ４６からの、ＯｓｐＢをコード化するＤＮＡで ある）。 より詳しくは、ＴＰＡ ５’ ＵＴＲおよびリーダーペプチドをコード化する ためのＤＮＡ、ｏｓｐＡおよびｏｓｐＢをＰＣＲ増幅した。このＴＰＡ信号を、 以下のプライマーを用いて、プラスミドｎＫＣＭＶｉｎｔＢＬからＰＣＲ増幅し た： このｏｓｐＡ遺伝子を、図１３に示したプライマー（配列番号１０、１１）を 用いて、ｐＴＲＨ４３からＰＣＲ増幅した（「順行」はｏｓｐＡ ５’プライマ ーであり、「逆行」はｏｓｐＡ ３’プライマーである）。上記ｏｓｐＢ遺伝子 を、図１４に示したプライマー（配列番号１２、１３）を用いて、ｐＴＲＨ４６ からＰＣＲ増幅した（「順行」はｏｓｐＢ ５’プライマーであり、「逆行」は ｏｓｐＢ ３’プライマーである）。ＰＣＲプログラム ： 第１ − プライマーおよびテンプレートをアニール １． 94℃、２分間 ２． 45℃まで、10分間でゆっくりと低下させる ３． 45℃、５分間 第２ − サイクルプログラム １． 72℃、３分間 ２． 93℃、１分30秒間 ３． １．に戻って32サイクル ４． 54℃、２分30秒間 ５． 72℃、10分間 ６． ４℃、24時間 ｏｓｐＡ ＰＣＲ断片を、以下のょぅにＫｐｎＩ／ＸｂａＩで消化した： Ａ． 混合： 72μＬ ｏｓｐＡ 10μＬ ＮＥＢ緩衝液１番（New England Biolabs （「ＮＥＢ」）緩衝液１番） 10μＬ 10×ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） 8μＬ ＫｐｎＩ（10μｇ／μＬ）（10ユニット／μＬ） 100μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置し、次いで、精製のために、ベンゼン／ ＣＨＩ₃抽出を行い、スピンカラム（Ｇ−５０５セファデックス）を施した。 Ｂ． 混合： 100μＬ ＤＮＡ（５μｇ）（Ａ．から） 11.5μＬ ＮＥＢ緩衝液２番（New England Biolabs （「ＮＥＢ」）緩衝液２番） 1μＬ ＢＳＡ 100× 4 μＬ ＸｂａＩ（20ｇ／μＬ）（20ユニット／μＬ） 115μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置した。 ＱＩＡｑｕｉｃｋ（Qiagen）カラムを用いて、これらの断片を精製した（最終 容積＝10ｍＭのトリス中50μＬ、ｐＨ8.5）。 このＴＰＡ断片を、以下のようにＰｓｔＩ／ＫｐｎＩで消化した： Ａ． 混合： 20μＬ ＴＰＡ（トリスｐＨ8.5中） 10μＬ ＮＥＢ緩衝液１番 1μＬ 100×ＢＳＡ 64μＬ ＴＥ（10ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ8.0) 5μＬ ＫｐｎＩ（10μｇ／μＬ）（10ユニット／μＬ） 100μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置し、次いで、ＯＩＡｑｕｉｃｋ ＤＮＡ スピンカラムに施し、50μＬのＨ₂Ｏで溶出した（次いで、Ｂを施す）。 Ｂ． 混合： 50μＬ ＴＰＡ（Ａ．から） 6μＬ ＮＥＢ緩衝液３番（New England Biolabs （「ＮＥＢ」）緩衝液２番） 2μＬ ＰｓｔＩ（10ユニット／μＬ） 2 μＬ ＴＥ 60μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置した。その後、40μＬのＴＥ加え、次い で、フェノール／クロロホルムの抽出（１×）を行った。抽出後、この混合物に Ｇ−５０スピンカラムを施して、精製した。 切断しなかったｏｓｐＢ ＰＣＲ反応生成物を、以下のように、エタノール析 出によりゲル精製し、再懸濁させ、１％のＴＢＥ（トリス−ホウ酸塩）ミニ−ゲ ルに装填し、次いで、ＱＩＡＥＸ方法を用いてゲル精製した： １． バンドを切除し、秤量する。 ２． ３μＬ／ｍｇのゲルスライスを加える。 ３． １分間に亘りＱＩＡＥＸに渦を生じさせ、完全に再懸濁させる。 ４． ５μｇのＤＮＡ毎に10μＬのＱＩＡＥＸを加えるか、またはそれほど渦を 生じさせない。 ５． ２分毎に、50℃で10分間に亘り保温する。 ６． 30秒間に亘り遠心分離する。 ７． ＱＸ２中で２回洗浄する；500μＬの洗浄。渦を生じさせることにより再 懸濁させる。30秒間に亘り全速で回転させる。 ８． ＱＸ３中で２回洗浄する；500μＬの洗浄。 ９． 最後の洗浄後、上澄みの全ての微量物を除去する。 10． 15分間に亘り空気乾燥させる。 11． 20μＬのＴＥで溶出させる。再懸濁させる。室温で５分間に亘り保温し、 回転させＱＩＡＥＸを沈降させる。上澄みを除去する。 ｏｓｐＢ断片を、以下のようにＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩで消化した： Ａ． 混合： 5μＬ ＴＥ（1.3μｇ） 33μＬ ｏｓｐＢ（1/3μｇ） 5μＬ ＮＥＢ緩衝液１番 5μＬ 10×ＢＳＡ 2 μＬ ＫｐｎＩ（10μｇ／μＬ） 50μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置した。その後、この混合物をＱｕｉａｑ ｕｉｃｋにより洗浄し、スピンカラムを施した。 Ｂ． 混合： 30μＬ ＤＮＡ（1.3ｍｇ；Ａ．から） 4 μＬ ＢａｍＨＩ緩衝液（New England Biolabs） 1μＬ ＢａｍＨＩ（20μｇ／μＬ）（20ユニット／μＬ） 5 μＬ ＴＥ 40μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置した。その後、この混合物をＱＩＡｑｕ ｉｃｋカラムに施し、洗浄し、30μＬのＨ₂Ｏ中に溶出した。 ＶＲ１０１２を、以下のようにＸｂａＩ／ＰｓｔＩで消化した： Ａ． 混合： 5μＬ ＤＮＡ（5μｇ）ＶＲ１０１２ 3μＬ 10×ＢＳＡ 3μＬ ＮＥＢ緩衝液２番 18μＬ ＴＥ 1 μＬ ＸｂａＩ 30μＬ 合計 この混合物を２時間に亘り37℃で放置した。次いで、１μＬを、ゲル分析のた めに取り出した。この分析により、消化を確認した。 Ｂ． Ａの生成物に添加： 1.5μＬ １Ｍのトリス 3.5μＬ ＮａＣｌ（500ｍＭ） 1 μＬ ＰｓｔＩ 35μＬ 合計 Ｂ．の混合物を２時間に亘り37℃で放置した。その後、１μＬのＥｃｏＲＶを 加え、得られた混合物をさらに１時間に亘り37℃で保温した（これにより、この 小さな制限断片を半分に切断し、スピンカラムによる除去効率を増大できる）。 次いで、この混合物をＧ５０スピンカラムに施して、この小さな挿入物を除去し た。 次いで、ＶＲ２２１０を構築するために、１μＬのＶＲ１０１２切断ＤＮＡ（ 25ｎｇ）、１μＬの切断ｏｓｐＡ ＤＮＡ（600ｎｇ）、６μＬの切断ＴＰＡ ＤＮＡ（50ｎｇ）、２μＬのＮＥＢ緩衝液２番、10μＬのＮＥＢ緩衝液１番、お よび１μＬのリガーゼ（Boehringer Mannheim）を含有する混合物を調製した。 ＶＲ２２１１を構築するために、１μＬのＶＲ１０１２切断ＤＮＡ（25ｎｇ）、 ５μＬの切断ｏｓｐＢ ＤＮＡ（150ｎｇ）、３μＬの切断ＴＰＡ ＤＮＡ、２ μＬのＮＥＢ緩衝液２番、10μＬのＮＥＢ緩衝液１番、および１μＬのリガーゼ （Boehringer Mannheim）を含有する混合物を調製した。これら混合物の各々に おいて、急速三方ライゲーションを行い、それぞれ、ＶＲ２２１０およびＶＲ２ ２１１を得た。(ｉ)ｏｓｐＡとＴＰＡ ＤＮＡおよび(ii)ｏｓｐＢとＴＰＡを含 まない対照混合物もまた調製した。これらの対照混合物を準備して、非切断ベク ターによるバックグラウンドクローンの数に関して試験を行った。この三元ライ ゲーションが効率的に機能したことを明確に示すこれらの対照ライゲーションの 結果、非常に少数（十分の一未満）のクローンが検出された。 図１５は、ＰｓｔＩ部位に対する位置５’から、ＫｐｎＩ部位（ＫｐｎＩ、２ ３１）に対する任意の点３’まで延在する（ｐｓｔＩ部位、ＴＰＡリーダー、Ｋ ｐｎＩ部位を通って、ｏｓｐＡ ＤＮＡ中に）ＶＲ２２１０の部分配列を提供し ている（配列番号１６）。図１６は、ＰｓｔＩ部位に対する位置５’から、Ｋｐ ｎＩ部位（ＫｐｎＩ、２６６）に対する任意の点３’まで延在する（ＰｓｔＩ部 位、ＴＰＡリーダー、ＫｐｎＩ部位を通って、ｏｓｐＢ ＤＮＡ中に）ＶＲ２２ １１の部分配列を提供している（配列番号１７）。 分析制限消化： ＶＲ２２１０ 酵素 断片の数およびサイズ １．ＫｐｎＩ ２断片：1042／4804 ２．ＨｉｎｄＩＩＩ ２断片：2803／3043 ３．ＰｓｔＩ ２断片：783／5063 ＶＲ２２１１ 酵素 断片の数およびサイズ １．ＫｐｎＩ ２断片：1091／4803 ２．ＨｉｎｄＩＩＩ ２断片：2460／3439 ３．ＰｓｔＩ ２断片：834／5065 図７は、ｏｓｐＡとｏｓｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）および ＯｓｐＡとＯｓｐＢの予測されるアミノ酸配列（配列番号１８）を提供する。各 々の線の上の数は、アミノ酸の位置を示しており、一方で、配列の下の数はヌク レオチドの位置を示している。プロモータ領域Ｐ１およびＰ２が横線により示さ れている。それぞれ−35および−10領域も示されている。リボソーム結合部位（ ＲＢＳ）が、横線およびボールド文字により示されている。ｏｓｐＢ配列の端部 での可能性のあるステムおよびループ構造が、点線の横矢印により示されている 。それぞれのＯｓｐＡおよびＯｓｐＢタンパク質の開始コドンが示されており、 終止コドンがアスタリスクにより印付けられている。図７はまた、ＫｐｎＩ、Ｘ ｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位の位置を示しており、矢印が方向を示している（Ｏ ｓｐＡ ＤＮＡに関しては、第一のＫｐｎＩからＸｂａＩまで、ＯｓｐＢ ＤＮ Ａに関しては、第二のＫｐｎＩからＢａｍＨＩまでも示されている）。 実施例２ − 形質移入 Felgner等(1994)，J.Biol.Chem．269，2550-2561の実験記録にしたがって、５ μｇのＶＲ２２１０をＢＨＫおよびＵＭ４４９ヒトメラノーマ細胞（ミシガン大 学、Mark Cameronから）中両方に形質移入した。得られた上澄みおよび細胞抽出 物を、二種類の抗−ＯｓｐＡ抗体、５％のミルク／ＢＢＳ中で1:100希釈の３Ｔ Ｓおよび1:10希釈のＨ５３３２を用いて、ウェスターンブロットによりＯｓｐＡ の発現に関して分析した（これらの抗体に関しては、Barbour,A.G.等，J.Infect .Dis．1985，152，478-84；Barbour等，Infect Immun．1983，41，795-804を参 照のこと）。 このウェスターンブロット（図１７）が示すように、ＵＭ４４９細胞は、ＢＨ Ｋ細胞よりも高いレベルのＯｓｐＡの発現を与える。また、培養上澄み中のほう が、細胞溶解産物中よりも多くＯｓｐＡを含んでいる。したがって、原核タンパ ク質は、真核信号ペプチド配列（ＴＰＡ）により、効率的に、哺乳類細胞の外に 運搬される。図１７に示した結果の概要が、以下の表に与えられている。 ^*ＶＲ２２１１は、ＯｓｐＢ遺伝子を含有するプラスミドであり、ウェスターン における陰性の対照として用いられる。 この実施例は、本発明のボレリア属抗原ＤＮＡプラスミド組成物がさらに、生 体外での抗原の発現にも有用であることも示している（それら自体が、例えば、 抗原、免疫またはワクチン組成物の調製にとって、もしくは診断、検出またはア ッセイの目的にとって有用である）。 実施例３ − 形質移入 Felgner等(1994)，J.Biol.Chem．269，2550-2561の実験記録にしたがって、５ μｇのＶＲ２２１１をＵＭ４４９ヒトメラノーマ細胞中に形質移入した。上澄み および細胞抽出物を、Ｈ６８と呼ばれるモノクローナル抗−ＯｓｐＢおよびＨ６ ８３１と呼ばれるモノクローナル抗−ＯｓｐＢを用いてウェスターンブロットに よりＯｓｐＢの発現に関して分析した（抗体に関しては、Barbour等，Infect.Im mun．1984，45，94-100を参照のこと）（図１８Ａおよび１８Ｂ）。抗−Ｏｓｐ Ｂ Ｈ６８およびＨ６８３１は、ブロット(blotto)中で1:10で希釈されていた。 これらの抗体は、上澄みおよび細胞抽出物中の両方でＯｓｐＢを検出する。Ｈ６ ８３１と称するこのモノクローナル抗−ＯｓｐＢは、スピロヘータＯｓｐＢ（株 Ｂ３１）および非修飾ＯｓｐＢ（生体外翻訳された）に結合するが、修飾Ｏｓｐ Ｂ（すなわち、哺乳類細胞組織によりグリコシル化されたおよび／またはホスホ リ ル化された）には結合しない。ことによると、Ｈ６８３１のエピトープは、真核 翻訳後修飾により遮断されている。 図１８Ａに示した結果の概要が、以下の表に与えられている。 図１８Ｂに示した結果の概要が、以下の表に与えられている。 この実施例は、本発明のボレリア属抗原ＤＮＡプラスミド組成物がさらに、生 体外での抗原の発現にも有用であることも示している（それら自体が、例えば、 抗原、免疫またはワクチン組成物の調製にとって、もしくは診断、検出またはア ッセイの目的にとって有用である）。 実施例４ − ＶＲ２２１０による動物研究 ５匹ずつの二つの群のマウスにＶＲ２２１０を注射し（すなわち、10匹のマウ ス；マウスＡ１−Ａ５、Ｂ１−Ｂ５）、５匹ずつの二つの群のマウス（すなわち 、10匹のマウス）にプラスミドＶＲ１０２０陰性対照ＤＮＡを注射した。ＶＲ１ ０２０は、ボレリア属抗原に暗号配列を含んでいない。このプラスミドおよび対 照ＤＮＡを標準的な生理食塩水中で希釈した。ＤＮＡの三回の双方の注射を、二 週間間隔で、直股筋（rectus femoris muscle)中に50μｇ／脚の投与量で行った 。各々の注射から12日後に、血清を採取し、１）抗体ＥＬＩＳＡおよび２）スピ ロヘータの増殖阻害により分析を行った。最初と三回目の注射の後の力価（力価 １、力価３）を以下に示す。 最後の注射から二週間後に、尾に皮中に注射することにより10⁴のＳｈ２スピ ロヘータ（Ｂ３１と同一のＯｓｐＡ血清群）を抗原投与した。Ｓｈ２は、Ｂ３１ と同一の血清群の毒性分離株である。マウスは、抗原投与から11日後に犠牲にな った。膀胱、心臓、血漿、および頸末関節(tibiotarsal joint)の横切り(cross- cutting)を増殖培地中34℃で15日間に亘り培養した。培養物を、位相差顕微鏡に よりスピロヘータの存在について調べ、50倍（high-power field）でスピロヘー タが見られない場合には陰性であると採点した。 ＶＲ２２１０を投与した10匹のマウスに関する抗体ＥＬＩＳＡ力価が、以下の 表に示されている。これらの力価は、一回の注射後には低かったが、その群には 、それらの免疫応答において著しくばらつきがあった。しかしながら、三回の注 射後には、10匹のマウスの内８匹において、体液性免疫応答は、均一して高く、 それらの力価は、1:40,000よりも大きかった。 抗体ＥＬＩＳＡ力価 高継代Ｂ３１は、ＥＬＩＳＡにおいて用いた抗原であった。 マウス 免疫原 力価１ 力価３ Ａ１ ｏｓｐＡ 640 10240 Ａ２ ｏｓｐＡ 640 10240 Ａ３ ｏｓｐＡ 40 >40,960 Ａ４ ｏｓｐＡ 1280 >40,960 Ａ５ ｏｓｐＡ 1280 >40,960 Ｂ１ ｏｓｐＡ <20 >40,960 Ｂ２ ｏｓｐＡ <20 >40,960 Ｂ３ ｏｓｐＡ 2560 >40,960 Ｂ４ ｏｓｐＡ 5120-10,240 >40,960 Ｂ５ ｏｓｐＡ 1280 >40,960 Ｂ３１に結合している抗体（またはＢ３１に対する免疫応答）は、前記陰性対 照ＤＮＡが投与されたマウスに関して観察されなかった。以下の表は、スピロヘ ータ増殖阻害力価を示している。数字は、生体外でスピロヘータの増殖を阻害す る血清の最大希釈を示している。ＶＲ２２１０の最初の注射後に、32から128倍 の 血清希釈で増殖阻害が見られた。しかしなから、三回の注射後には、増殖の阻害 は、高い希釈倍率（512倍まで）で検出された。このことは、抗休力価データと 一致している。 増殖阻害力価 方法：株Ｂ３１スピロヘータを、８倍希釈の血清と混台し、連続して96−ウェ ルプレート中で２倍に希釈した。各々のウェルにモルモット補体を加え、抗体に 結合したスピロヘータを分離させた。各々のウェル中の増殖を、赤から黄までの 培地中のフェノールレッド指示薬の観察により、並びに位相差顕微鏡により決定 した。数字は、ウェル中でのスピロヘータの増殖を阻害する血清の最大希釈であ った。 前記陰性対照ＤＮＡを投与したマウスの血清に関しては、阻害は観察されなか った。以下の表に示された臓器培養データは、ＶＲ２２１０をワクチン接種した マウスの10匹全てが、調査した全ての組織内においてスピロヘータを完全に含ま なかったが、10匹の陰性対照マウスの全ては、それらの膀胱および関節において スピロヘータを有したことを示している。したがって、ＶＲ２２１０の三回の投 与によるワクチン接種は、生体内でのスピロヘータの抗原投与に対して100％の 防御を与える。 培養した臓器内のスピロヘータの存在 全ての群に関する培養データの総計 陽性培養／合計 免疫原 血漿 心臓 膀胱 関節 ｏｓｐＡ 0/10 0/10 0/10 0/10 対照 3/10 7/10 10/10 10/10 これは、このボレリア属ＤＮＡプラスミドが細菌病原標的に対して効果的であ ることを示している。ＯｓｐＡをコード化するＶＲ２２１０による免疫化は、10⁴ の毒性スピロヘータの皮内抗原投与に対してマウスを完全に防御する。この生 体内防御は、抗体ＥＬＩＳＡおよび生体外スピロヘータ増殖阻害アッセイの両方 により測定された血清ＩｇＧ応答と相関する。 本発明の組成物の、スピロヘータ増殖を阻害できる防御応答を誘発させる能力 は、細菌タンパク質上の重要な免疫原性エピトープが、これらのタンパク質をコ ード化する遺伝子が咄乳類細胞中に発現されたときに保護されることを示してい る。このことは、自然のＯｓｐＡが、大腸菌から作成された組換えタンパク質ワ クチンの免疫原性に関する必須の決定因子であることが示されたＮ末端の脂質部 位を含むので、特に興味のあることであり、驚くべきことである。これとは対照 的に、本発明のＤＮＡおよび発現産生物において、脂質化(lipidation)信号を含 む自然ＯｓｐＡリーダー配列が、ＶＲ２２１０内のヒトＴＰＡリーダー配列によ り置き換えられている。この脂質化の出来事は、原核細胞中に特異的に発見され た翻訳後処理段階の一部であるので、その脂質部位がＶＲ２２１０タンパク質産 生物上に存在することはありそうにない。したがって、本発明により得られた結 果は、十分に驚くべきことであり、予期せぬことである。 この実施例は、ＶＲ２２１１のようなＯｓｐＢ、または別のボレリア属抗原、 例えば、ＯｓｐＣをコード化するプラスミド、もしくは、多数のボレリア属抗原 、例えば、ＯｓｐＡおよびＯｓｐＢおよび／またはＯｓｐＣをコード化するプラ スミドが本発明の範囲に含まれ、それらが有用であることも示している。例えば 、この実施例は、本発明のボレリア ブルグドルフェリ抗原ＤＮＡ組成物が、生 体内および生体外の用途（例えば、防御応答；診断、検出またはアツセイ目的） がある抗体を誘発するのに有用であることを示している。 実施例５ − 核酸の免疫化 マウスの免疫化：生後6-10週間のメスのＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス（インディアナ 州、Harlan Laboratories）を、カラード(collared)２８Ｇ 1/2インチ（12.7ｍ ｍ）の針を用いて、無菌標準生理食塩水で希釈したプラスミドＶＲ２２１０また はＶＲ１０２０（対照）で免疫化した。各々の脚の直股筋中に、0.05ｍｌ組成物 の容積で、50μｇのプラスミドを筋肉内に投与した。14日後と28日後に、それら のマウスに同一の組成物を追加抗原投与した。 感染性ボレリア ブルグドルフェリの抗原投与：二回目の追加抗原投与から13 日後に、ボレリア ブルグドルフェリＳｈ−２−８２（Erdile等，1993）をマウ スに抗原投与した。尾の付け根に、ＰＢＳ（ｐＨ7.4）中で10％容積／容積のＢ ＳＫＩＩ中において10⁴のボレリア ブルグドルフェリＳｈ−２−８２を皮内に 注射した。この接種物は、ボレリア ブルグドルフェリのこの株に関する50％致 死量の100倍である（Erdile等,1993）。これらのマウスは、抗原投与から10日後 に犠牲になった。膀胱、心臓および頸末関節の横切りを無菌的に除去し、抗生物 質を含有する６ｍｌのＢＳＫＩＩ中に配置した。培養物を34℃で保温した。15日 後、臓器の培養物を、スピロヘータの存在に関して、位相差顕微鏡により調査し た。20倍でスピロヘータが見られない場合に、培養物は陰性であると考えた。 ＥＬＩＳＡ：抗原として、高次継代ボレリア ブルグドルフェリＢ３１、株Ｂ ３１１（Sadziene等,1995）を用いて、前述したように（Sadziene等,1991）、湿 式全細胞ＥＬＩＳＡを行った。マウスの血清の一連の希釈物を、ＰＢＳ（ｐＨ7. 4）中の１％ｗ／ｖの脱脂粉乳中で作成した。二次抗体は、ＰＢＳ／１％粉乳中1 :1000の希釈倍率で用いられたアルカリ性ホスファターゼに接合されたヤギ抗− マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＡ（Ｈ＋Ｌ）（カリフォルニア州、Zymed Laborato ries）であった。前述したように、プレートを展開させた（Sadziene等,1991） 。ダイナテック５８０プレートリーダーで490ｎｍでの吸光度を読み取った。そ の吸光度値が、非免疫性の対照血清に関する吸光度値の平均の平均＋３標準偏差 よりも大きい場合に、試料は陽性であると考えた。 生体外増殖阻害アッセイ：免疫化したマウスからの血清の増殖阻害力価（ＧＩ 力価）を、Sadziene等,1993により以前に記載されたように測定した。マイクロ タイタプレートの各々のウェルに、２溶血単位の非加熱モルモット補体（カリフ ォルニア州、Calbiochem）を加えて、抗体添加後の、１０ＨＵ／ｍｌの培地の最 終濃 度を得た。それらのウェルを、培地中のフェノールレッド指示薬の色の変化に関 しては目視で、並びにセットされたスライドのウェルの内容物を位相差顕微鏡で モニタした。このＧＩ力価は、ウェルが黄色ではなく桃色となり、血清が加えら れていないウェルよりも少なくとも二十分の一未満の細胞を示した抗血清の最低 希釈として定義した。 ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法：ＰＡＧＥおよび免疫ブロットを、前述したよ うに（Sadziene等,1995）行った。組換え脂質化ＯｓｐＡ（Erdile等,1993、USSN 08/373,455を参照のこと）またはボレリア ブルグドルフェリＢ３１の24の微生 物を、準備したポリアクリルアミドゲル上で展開させ、ニトロセルロース膜上に 移した。免疫ブロットを乾燥させ、使用する時まで４℃で貯蔵した。 ＯｓＤＡ−特異的抗体応答が得られたＶＲ２２１０によるマウスの免疫化：そ れらのマウスからの血清の免疫ブロットにより、ボレリア ブルグドルフェリＢ ３１ｏｐｓＡ遺伝子を有するプラスミド、ＶＲ２２１０を受容したマウスが、Ｏ ｓｐＡ−特異的抗体応答を示したことが分かった（図１９）。血清のＥＬＩＳＡ によっても、これらのマウスはＢ３１に対する著しい抗体応答を備えたことが示 された。相乗平均相互ＥＬＩＳＡ力価が以下の表に示されている。ボレリア属遺 伝子が挿入されていないプラスミド、ＶＲ１０２０を受容したマウスからの血清 は、ボレリア ブルグドルフェリに対する抗体応答を示さなかった。ＶＲ２２１ ０により免疫化したマウスからの血清もまた、防御性であることが知られている 血清と同一のレベルまで、ボレリア ブルグドルフェリの増殖を生体外で阻害す ることが分かった。それらの血清の相乗平均相互ＧＩ力価もまた、以下の表に与 えられている。 この表はまた、ＩＰ−９０（ボレリア ガリニイ）およびＡＣＡ−Ｉ（ボレリ ア アフゼリ）を抗原として用いたときの、ＶＲ２２１０により免疫化したマウ スからの血清の相互相乗平均ＥＬＩＳＡ力価を示している（血清は、抗原投与の ２日前に採取した血液からのものである）。 感染性ボレリア ブルグドルフェリによる抗原投与：ボレリア ブルグドルフ ェリＳｈ−２−８２によるＤＮＡ免疫化マウスの抗原投与の結果が以下の表に示 されている。ＶＲ２２１０を受容した全てのマウスが抗原投与に対して防御され たが、ＶＲ１０２０プラスミドを受容した全てのマウスからボレリア属が回収さ れた。表 ：ＤＮＡ構築物であるＶＲ２２１０およびＶＲ１０２０により免疫化したマウ スの感染性抗原投与の相互相乗平均ＥＬＩＳＡ力価とＧＩ力価並びに結果 ^*一つ以上の部位での培養物陽性 この表の結果より、本発明は、遺伝種ブルグドルフェリ、ガリニイおよびアフ ゼリに適用でき、ブルグドルフェリまたはＢ３１に制限する必要がない。 図１９は、プラスミドＶＲ２２１０（ｏｓｐＡ）またはＶＲ１０２０のいずれ かにより免疫化されたマウスからの血清でプローブしたボレリア ブルグドルフ ェリｒＯｓｐＡの免疫ブロットである。血清は、1:100に希釈した。陽性対照（ ＋）は、1:10に希釈したＨ５３３２（抗−ＯｓｐＡ）モノクローナルハイブリド ーマ上澄みであった。 ボレリア ブルグドルフェリＢ３１のｏｓｐＢを含有するプラスミド構築物Ｖ Ｒ２２１１についても、免疫化を繰り返した。このプラスミドのさらなる追加抗 原投与は、二回目の追加抗原投与から２週間後に行った。この構築物を受容した ５匹のマウスに、ＶＲ１０２０を受容した３匹のマウスとともに抗原投与し、後 に犠牲になった。ＶＲ２２１１（ｏｓｐＢ）により免疫化したマウスからの血清 中に、ＯｓｐＢ−特異的抗体がウェスターンブロットにより検出された。 また、ｒＯｓｐＡリポタンパク質対照（皮下または筋肉内に１μｇで免疫化し た）とともにＶＲ２２１０の免疫化（群毎に５匹のマウス）を繰り返し、２週間 毎にこれらのマウスに採血を行い、ＥＬＩＳＡおよび増殖阻害アッセイにより、 ＯｓｐＡに対する免疫応答の存続期間を評価した。それらの結果は、上述した結 果に対応している。 この実施例は、本発明のボレリア属抗原ＤＮＡ組成物は、感染に対して（した がって、ライム病に対して）防御的でありうる生体内応答を誘発するのに有用で あること、並びに本発明の組成物は、それら自体で有用である（診断、検出また はアッセイの目的のために）、抗体を単に誘発するのに有用であることを示して いる。 本発明の好ましい実施の形態を詳細に記載してきたが、請求の範囲により定義 された本発明は、その明らかに多くの変形が、本発明の精神すなわち範囲から逸 脱せずに可能であるので、上述した記載に述べた特定の詳細により制限されるべ きではないことが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (71)出願人 テキサス ヘルス サイエンス センター ユニヴァーシティー オブ アット サ ン アントニオ アメリカ合衆国 テキサス州 78701 オ ースティン ウエスト セヴンス ストリ ート 201 (72)発明者 ヒューブナー，ロバート シー アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 18960―1941 ストローズバーグ クイー ン ストリート 860 (72)発明者 ノーマン，ジョン エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92128 サン ディエゴ ヴィア タヴィ ート 11602 (72)発明者 ライアン，サイオウ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョーラ デザート ヴュー ドライヴ 5851 (72)発明者 カーナー，クリスティン アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92127 サン ディエゴ アルヴァ ロー ド ナンバー2733 17161 (72)発明者 バーバー，アラン ジー アメリカ合衆国 テキサス州 78209 サ ン アントニオ チャールズ ロード 404 (72)発明者 ルーク，キャサリン ジェイ アメリカ合衆国 テキサス州 78240 サ ン アントニオ ダニー カイエ ドライ ヴ ナンバー3006 5903

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．真核細胞による暗号ＤＮＡの発現のためのＤＮＡを含むプラスミドであって 、該暗号ＤＮＡがボレリア属抗原をコード化することを特徴とするプラスミド 。 ２．前記ＤＮＡが、上流から下流まで、真核細胞内の発現を作用させるプロモー タをコード化するＤＮＡ、哺乳類細胞からの原核タンパク質配列の分泌を促進 するリーダーペプチドをコード化するＤＮＡ、ボレリア属抗原をコード化する ＤＮＡ、およびターミネータをコード化するＤＮＡを含むことを特徴とする請 求の範囲第１項記載のプラスミド。 ３．前記プロモータが哺乳類ウイルスプロモータであることを特徴とする請求の 範囲第２項記載のプラスミド。 ４．前記プロモータがヘルペスウイルスプロモータであることを特徴とする請求 の範囲第３項記載のプラスミド。 ５．前記プロモータがヒトサイトメガロウイルスプロモータであることを特徴と する請求の範囲第４項記載のプラスミド。 ６．前記リーダーペプチドをコード化するＤＮＡが、ヒト組織プラスミノゲン活 性化因子をコード化するＤＮＡからのものであることを特徴とする請求の範囲 第５項記載のプラスミド。 ７．前記ターミネータをコードがするＤＮＡが、ウシ成長ホルモンをコード化す る遺伝子からの３’転写ターミネータであることを特徴とする請求の範囲第６ 項記載のプラスミド。 ８．前記ボレリア属抗原が、ボレリア ブルグドルフェリ、ガリニイ、アフゼリ またはそれらの混合物の抗原を含むことを特徴とする請求の範囲第１項から第 ７項いずれか一つに記載のプラスミド。 ９．前記抗原が、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣまたはそれらの混合物であるこ とを特徴とする請求の範囲第８項記載のプラスミド。 10．請求の範囲第１項から第７項いずれか一つに記載のプラスミドおよびキャリ アまたは希釈液からなることを特徴とする免疫組成物。 11．請求の範囲第８項記載のプラスミドおよびキャリアまたは希釈液からなるこ とを特徴とする免疫組成物。 12．請求の範囲第９項記載のプラスミドおよびキャリアまたは希釈液からなるこ とを特徴とする免疫組成物。 13．ライム病に感染しやすい宿主中に免疫応答を誘発させる方法であって、該宿 主に請求の範囲第10項記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方 法。 14．ライム病に感染しやすい宿主中に免疫応答を誘発させる方法であって、該宿 主に請求の範囲第11項記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方 法。 15．ライム病に感染しやすい宿主中に免疫応答を誘発させる方法であって、該宿 主に請求の範囲第12項記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方 法。 16．生体外でボレリア属抗原を発現する方法であって、真核細胞に請求の範囲第 １項から第７項いずれか一つに記載のプラスミドを形質移入することを含むこ とを特徴とする方法。 17．生体外でボレリア属抗原を発現する方法であって、真核細胞に請求の範囲第 ８項記載のプラスミドを形質移入することを含むことを特徴とする方法。 18．前記抗原が、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＯｓｐＣ、またはそれらの混合物を含む ことを特徴とする請求の範囲第17項記載の方法。