JP2000517323A - Ｂ型肝炎およびレトロウイルス関連疾患の治療のためのジカフェオイルキナ酸の新規使用および新規カフェオイルキナ酸誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、Ｂ型肝炎およびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）関連疾患の治療のためのジカフェオイルキナ酸誘導体の新規使用、新規カフェオイルキナ酸誘導体、およびこれを含有する組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｂ型肝炎およびレトロウイルス関連疾患の治療のためのジカフェオイルキナ酸の 新規使用および新規カフェオイルキナ酸誘導体 発明の分野 本発明は、Ｂ型肝炎およびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）関連疾患の治療の ためのジカフェオイルキナ酸（dicaffeoylquinic acid）誘導体の新規使用、新 規カフェオイルキナ酸（caffeoylquinic acid）誘導体、およびこれを含有する 薬剤組成物に関する。 先行技術 Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による世界的な重大な疾患である。３億 人以上がＨＢＶに慢性に感染している。中国はＢ型肝炎の流行の多い地域である 。急性および慢性肝疾患以外に、ＨＢＶ感染は、ヒトで肝硬変および原発性肝細 胞癌を発症する高リスクに流行性に関係している。慢性ＨＢＶ感染者については 、インターフェロンやヌクレオシド類似体を含む数種類の治療法が報告されてい る。しかしこれらの治療法は、中程度から重症の副作用を有し、ＨＢＶ抑制に一 時的に有効なだけであり、あるいは一般のＨＢＶ感染者集団の少数にのみ有効な だけである。新生児の予防接種が全体的に実施されても、治療を必要とするかま たは治療を受けているキャリアーがいるであろう。ＨＩＶにより引き起こされる ＡＩＤＳのようなレトロウイルス関連疾患には有効な治療法はない。従って、慢 性キャリアーにおけるＨＢＶおよびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）を撲滅する ための新しい有効な薬剤の開発は、非常に重要であろう。 発明の要約 本発明の目的は、有効性が高く、副作用が小さく、薬剤の停止後のＨＢＶリバ ンドがない、新しいクラスのＢ型肝炎治療薬および抗レトロウイルス薬を提供す ることである。 広範かつ詳細な研究の結果、予想外にも本発明者らは、ジカフェオイルキナ酸 誘導体およびいくつかの新規カフェオイルキナ酸誘導体は、ウイルスＤＮＡの複 製およびＨＢＶやレトロウイルスの抗原発現を阻害し、薬剤の投与中止後もＨＢ Ｖレベルのリバンドがないことを発見した。さらにジカフェオイルキナ酸誘導体 およびいくつかの新規カフェオイルキナ酸誘導体は、ＨＩＶに対しても有効であ る可能性がある。本発明は上記発見に基づく。 本発明の第１の目的は、Ｂ型肝炎およびレトロウイルス（ＨＩＶ）関連疾患を 治療するための式Ｉ （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃は同じであるかまたは異なり、ＯＨまたはカフェ オイルオキシ基であり；Ｒ₁がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₂とＲ₃の両方 ともＯＨであり；またはＲ₂がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₁とＲ₃の両方 ともＯＨであり；またはＲ₃がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₁とＲ₂の両方 ともＯＨである）のジカフェオイルキナ酸誘導体の新規使用に関する。 本発明の第２の目的は、式II （式中、Ｒ₁'、Ｒ₂'、およびＲ₃'は同じであるかまたは異なり、Ｈ、Ｃ_1-6アル キル基、 であり；ただし、Ｒ₁'、Ｒ₂'、およびＲ₃'は、同時にＨではあり得ず； Ｒ₁はＣ_1-6アルキル墓またはＭすなわちＮａ、Ｋなどのアルカリ金属であり； Ｒ₂とＲ₃の両方ともＨ、Ｃ_1-6アルキル基またはＣＨ₃ＣＯである） の新規ジカフェオイルキナ酸誘導体に関する。 本発明はまた、ＨＢＶおよびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）に対して良好な 阻害作用を有する、式Ｉの化合物を含有する薬剤組成物に関する。 本発明において、薬剤組成物は、任意の薬剤学的に許容される賦形剤、添加剤 または担体を含有してもよい。 本発明において、式ＩおよびIIの化合物またはこれらを含有する本発明の薬剤 組成物は、ＨＢＶおよびレトロウイルスに関連する疾患、特にＨＢＶまたはＨＩ Ｖの感染により引き起こされる疾患の治療に使用することができる。 本発明において、本発明の薬剤組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射用 剤のような経口投与またはまたは非経口投与の型で処方することができる。 本発明において、式ＩまたはIIの化合物は、合成法により調製されるかまたは イヌラ・ブリタニック（Inula britannic）のような植物から得られる。 本発明において、本発明の好適な抗ＨＢＶおよびレトロウイルス化合物は、式 III の１，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸である。 本発明において、１，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸は、イヌラ・ブリタニ ック（Inula britannic）から単離することができる。単離経路を以下に示す。発明の詳細な説明 本発明を、インビトロおよびインビボでのＨＢＶに対する、およびインビトロ でのＨＩＶに対する１，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸（これは以後、化合物 Ａと略記する）の阻害作用について、さらに説明する。 インビトロでのＨＢＶおよびＨＩＶに対する化合物Ａの阻害作用は、ＨＢＶＤ ＮＡポリメラーゼ（ＨＢＶ ＤＮＡｐ）、ＨＢｅＡｇとＨＢｓＡｇの合成と分泌 、ＨＢＶ ＤＮＡトランスフェクション細胞株（ＨｅｐＧ２誘導体２．２．１５ ）の培養液中でのＨＢＶ ＤＮＡの複製、およびＭＴ₄細胞中のＨＩＶ、につい ての阻害試験により評価される。インビボでのＨＢＶに対する化合物Ａの阻害作 用は、ＤＨＢＶで感染したカモ（duck）のモデルで評価される。 １．化合物Ａの抗ＨＢＶ試験で使用される材料と方法 １．１．材料 １．１．１ ウイルス、細胞および動物 ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、ＨＢＶ ＤＮＡが強い陽性（+++）であった患者の 血液から超遠心分離により精製したＨＢＶ粒子は、北京医科大学（Beijing Medi cal University）から供与された。 ＨｅｐＧ２細胞でトランスフェクションしたＨＢＶ ＤＮＡから得られた２． ２．１５細胞は、北京医科大学（Beijing Medical University）から供与された 。 ＤＨＢＶ：ＤＨＢＶ ＤＮＡが陽性（+++）のシャンハイダック（Shanghai d uck）の血清、−７０℃で保存。 動物：ナンユアンダックス農場（Nanyuan ducks farm）（北京）から得た、＜ １日令のペキンダック。 １．１．２ 試薬 ＨＢＶとＤＨＢＶ ＤＮＡプラスミド：中国医科学アカデミー（Chinese Acad emy of Medical Sciences）の医学バイオテクノロジー研究所（Institute of Me dicine and biotechnology）のリー・ツアン（Li Zhuang）から供与された。 α³²Ｐ−ｄＣＴＰ：フレイバイオテクノロジーエンジニアリング社（Furei bi otechnology engineering Co.）（北京）から。 ³Ｈ−ｄＴＴＰ：デュポン（DuPonds） ＤＭＥＭ（ダルベッコー改変イーグル培地）、胎児牛血清、Ｇ−４１８（ゲネ ンチシン）：ギビコビーアールエル（GIBICO BRL）（米国）から。 ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇプロトコール：疫試薬ベイファン研究所（Beifang In stitute of Immune Reagent）（北京）から供与された。 １．２ 方法 １．２．１ ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ測定 測定は、ハンツ（Hantz）（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ ４（１９８４）１ ８７−１９９）の方法を若干変更して行なった。反応混合物は、２００mmol/lの トリス−塩酸（ｐＨ７．６）、２００mmol/lのＮＨ₄Ｃｌ、５０mmol/lのＭｇＣ ｌ₂、１０mmol/lの２−メルカプトエタノール、２％のノニデットＰ−４０およ び３００μmol/lのデオキシヌクレオチド三リン酸（ただし、［³Ｈ］ｄＴＴＰを ２０μCi/mlで測定系に加えた）中の、ウイルス粒子中のＨＢＶ ＤＮＡポリメ ラーゼからなっていた。種々の濃度の化合物Ａを加えた。混合物を３７℃で４時 間インキュベートした後、ワットマンＮｏ．３ろ紙にスポットして、冷５％トリ クロロ酢酸で４回洗浄し、次にエタノールで洗浄した。ウイルスＤＮＡへの放射 性ヌクレオチドの取り込みの指標であるＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ活性は、レ クベータ（Recbeta）（エルケービー（LKB））シンチレーションカウンターで計 測した。 １．２．２ ２．２．１５細胞中の抗ＨＢＶ活性の測定 １．２．２．１ ２．２．１５細胞の培養 ＨｅｐＧ２ ２．２．１５細胞株を、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）と１００単 位/mlのペニシリンとストレプトマイシン、３８０μｇ/mlのＧ４１８を補足した ＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ₂を含有する加湿空気中で３７℃で維持した。培養物を トリプシン処理により４日毎に継代した。バイオアッセイのために細胞を、１． ０×１０⁵細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに広げた。２日令の培養物 を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中の種々の濃度の薬剤で処理した。薬剤を 培地中に４日間放置し、次に培地を吸引し、同じ濃度の薬剤を含有する新鮮な培 地を加えた。３回の４日問の期間の最後に、細胞を採取した。培養液のアリコー トを、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とＨＢＶｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）の測定のた めに使用した。 １．２．２．２ 細胞毒性試験 ２日令の培養物を、種々の濃度の薬剤で４日問処理し、次に培地を吸引した。 細胞の生存をＭＴＴにより測定した。 １．２．２．３ ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇに及ぼす薬剤の効果の測定 培養液中のＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇを、それぞれのプロトコールに従って測定 した。結合体の存在下でＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇに対する抗体を含有するビーズ に培養液（２００μｌ）を吸収させた。一晩インキュベート後、ビーズを、０． ０５％ツイーン−８０を含有する０．０１mol/mlのＰＢＳで６回洗浄し、２００ μｌの［¹²⁵Ｉ］抗ＨＢｓ（Ｈｂｅ）で一晩インキュベートした。ビーズを前記 したように６回洗浄した。［¹²⁵Ｉ］標識免疫複合体のｃｐｍの指標であるＨＢ ｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ量を、ν−カウンターで計測した。 １．２．２．４ ２．２．１５細胞中のＨＢＶ ＤＮＡ複製についての阻害試験 ２．２．１５細胞中のＤＮＡ抽出：２．２．１５細胞から総ＤＮＡを単離し、 細胞をＰＢＳで洗浄し、５０mmol/lのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）、１０mmol/l のＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、および５０μｇ/mlのプロテイナーゼＫ（シグマ（Sig ma））を含有する溶液中で溶解した。３７℃で４時間インキュベート後、総ＤＮ Ａをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽 出し、次にクロロホルム−イソアミルアルコールで２回抽出した。ＤＮＡを、１ ／１０容量のＮａＯＡｃと２．５容量のエタノールで−７０℃で一晩沈殿させた 。１２０００ｇで室温で１０分遠心分離後、ペレットを冷７５％エタノールで２ 回洗浄し、乾燥し、トリス／ＥＤＴＡ緩衝液に再懸濁し、次に−２０℃で保存し た。 サザンブロッティング：ＤＮＡの試料を１％アガロースゲルで電気泳動し、ニ トロセルロースに移した。[³²Ｐ］ニックトランスレーションにより放射能標識 した完全長ＨＢＶゲノムＤＮＡプローブとともに、４２℃で一晩ハイブリダイゼ ーションを行なった。ＨＢＶ ＤＮＡ分子種をオートラジオグラフィーにより視 覚化した。エピソーム性ＨＢＶ ＤＮＡを示す露光したＸ線フィルム上の密度の 相対的レベルを、デンシトメトリーで比較した。 １．２．３ カモ中の抗ＤＨＢＶ試験 １日令の子ガモを、１０¹¹ウイルスゲノム当量／mlを含有するＤＨＢＶ陽性血 清を２００μｌ静脈内注射して感染させた。小ガモが７日令になった時治療を始 めた。全部で８９羽の７日令のウイルス血症カモを、ランダムに５群に分類した 。３つの群に化合物Ａを５、１２．５、および５０mg/kg体重/日で、普通の生理 食塩水（ＮＳ）に溶解した２つの等量（朝とタ方）を１４日間経口投与した。他 の２つの群は、化合物Ａの代わりにＮＳと５０mg/kg体重/日のアシクロビル（Ａ ＣＶ）で治療した。治療後の追跡調査を５日間行なつた。すべてのカモの足の静 脈から血液試料を得て、血清分離後、治療まで、治療の間毎週、および治療の停 止後５日間−７０℃で保存した。これらを、ドットブロットハイブリダイゼーシ ョンによりＤＨＢＶ ＤＮＡの存在についてスクリーニングした。 ドットブロットハイブリダイゼーションによるＤＨＢＶ ＤＮＡの検出 血清中のＤＨＢＶ ＤＮＡを、ＰＢ３２５中の完全長ＤＨＢＶ ＤＮＡクロー ンを使用して、分子ハイブリダイゼーションにより分析した。ＤＨＢＶ ＤＮＡ 挿入体を、ＥｃｏＲＩで消化後アガロースゲル電気泳動により精製した。ＤＨＢ Ｖ ＤＮＡを、クレノウ断片を用いてα³²Ｐ−ｄＣＴＰランダムオリゴプライミ ングにより放射能標識した。ドットブロットハイブリダイゼーションは、スコッ ト（scotto）らの方法により行なった。簡単に説明すると、血清のアリコート（ ２００μｌ）をドットブロットマニホールド中のナイロン膜（ハイボンド（Hybo nd）−Ｎ、アマシャムインターナショナル（Amersham International）（英国） 上にスポットし、０．５Ｍ ＮａＯＨ−ＮａＣｌで室温で３０分変性させた。各 スポット試料を、１Ｍトリス−塩酸−１．５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）で中和 した。膜上のＤＮＡを、８０℃で２時間加熱して固定し、５０％ホルムアミド、 ５×デンハルツ（Denhardt's）、６×ＳＳＣ、１０Ｍ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤ Ｓおよび１０mg/mlのウシ胸腺ＤＮＡ中で３７℃で一晩プレハイブリダイゼーシ ョンした。１０⁶cpm/mlのＤＨＢＶ［³²Ｐ］ＤＮＡプローブを加えて、同じプレ ハイブリダイゼーション条件で一晩ハイブリダイゼーションを開始した。膜を３ ×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで室温、４２℃および６５℃で、各１０分洗浄した。 ハイブリダイゼーション後、膜を空気乾燥し、コダックフィルムでエンハンサー スクリーンを用いで−７０℃で最大１４日問まで露光した。ウイルスＤＮＡの量 を、デンシトメトリーとオートラジオグラフィー膜の画像解析により測定した。 ２． 結果 ２．１ ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼに対する化合物Ａの阻害 化合物Ａと陽性対照としてのＰＦＡによるＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害 を表１に示す。 表１．化合物ＡとＰＦＡによるＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの阻害 ＰＦＡはＨＢＶ ＤＮＡｐに対して用量依存性の阻害作用を示した。その５０ ％阻害濃度（ＩＣ₅₀）の２３．２μg/mlは、報告されたものと同じであった。 化合物Ａは、ＨＢＶ ＤＮＡｐに対して有意な用量依存性の阻害作用を示した 。その５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は３０．６μｇ/mlであった。 ２．２ ２．２．１５細胞中の化合物Ａの抗ＨＢＶ作用 ２．２．１ ２．２．１５細胞の細胞増殖 化合物Ａは、１．０μｇ/mlの濃度でＨｅｐＧ２細胞株と２．２．１５細胞に 対して毒性を示さなかった。 ２．２．２ ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの産生に及ぼす化合物Ａの作用 ２．２．１５細胞を２４ウェルプレートに広げ、２日間付着させ、次に種々の 濃度の化合物Ａを、４、８、および１２日間加えた。培養液中のＨＢｓＡｇとＨ ＢｅＡｇを調べると、ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの顕著な抑制が用量依存性に観察 された。 化合物Ａの種々の濃度を有する培養液からのＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇのレベル を測定すると、化合物ＡはＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇに対して有意な用量依存性の 阻害作用を示した。ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの産生の阻害についての化合物Ａの ＩＣ₅₀は、それぞれ約２１〜７８μｇ/mlと２１〜１６５μｇ/mlであった。 表２． ＨＢｓＡｇとＨＢｅＡｇの産生に及ぼす化合物Ａの作用＊と＊＊：薬剤群対プラセボ、ｐ＜０．０５と０．０１ ２．２．３ 化合物ＡによるＨＢＶ ＤＮＡ複製の阻害 化合物Ａは、図１に示すように用量依存性にＨＢＶ ＤＮＡ複製を阻害する可 能性がある。 図１は、ＨＢＶ ＤＮＡ複製に対する種々の濃度の化合物Ａの阻害作用を示す 。 ２．３ カモ中のＤＨＢＶに対する化合物Ａの阻害作用 すべてのカモは健康を維持し、プラセボと処理群の両方とも平均体重は試験中 にやや増加した。ウイルス血症は、血清ドットブロットハイブリダイゼーション により追跡した。陰性対照群のカモは、試験の全期間を通してウイルスＤＮＡは 陰性であった。カモの持続的感染は明らかであった。これはプラセボ処理群でも 変化はなかった。報告されている有効な薬剤であるＡＣＶで治療すると、すべて の処理した７羽の鳥で１４日間の治療中に、血清からＤＨＢＶ ＤＮＡが実質的 に低下した。治療の中止の５日目に、ウイルス血症は、治療前より４３％高いレ ベルに戻った。化合物Ａで治療した鳥の群では、血清からのウイルス血症は、用 量依存性かつ時間依存性に低下した。５０mg/kg体重/日の化合物Ａで治療した群 では、治療の１４日目に、ウイルス血症の強力な阻害（８７％）が観察され、化 合物Ａの中止の４日後もウイルス血症は低レベルに維持され、これはＮＳおよび ＡＣＶ後のレベルより有意に低かった。予備的結果は、カモの最大許容量は、４ ｇ/kgより高かった。 表３．カモのＤＨＢＶ ＤＮＡに対する化合物Ａの阻害作用 （ドットのＫグレイネス（Grayness）、平均±ＳＤ、ｎ＝７） ＊と＊＊：０日に対して、ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１、ｐ５：薬剤中止後の５ 日目 ３．結論 化合物Ａは、インビトロおよびインビボで抗ＨＢＶ作用を有する。 化合物Ａは、２．２．１５細胞中でＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨＢｓＡｇ およびＨＢｅＡｇの産生を、用量依存性にＩＣ₅₀がそれぞれ１４．３〜３０．６ μｇ/ml、２１〜７８μｇ/ml、および２１〜１６５μｇ/mlで、阻害する。化合 物Ａは、５００μｇ/mlでは２．２．１５細胞に明らかな有害な作用は及ぼさな い。 化合物Ａは、カモのＤＨＢＶ ＤＮＡに対して用量依存性にかつ時間依存性に 阻害作用を有する。化合物Ａは、５０mg/kg体重/日の投与量でＤＨＢＶ ＤＮＡ の奇妙な阻害を示し、ＤＨＢＶ ＤＮＡは、化合物Ａの中止後５日目に低いレベ ルで維持され、これはＮＳやＡＣＶ後の値より有意に低かった。予備的結果は、 カモでの最大許容量は４g/kgより高いことを示した。 ４．化合物Ａの抗ＨＩＶ作用 ４．１ 材料と方法 ４．１．１ 細胞とウイルス この試験では、ヒトＴ細胞白血病細胞株であるＭＴ４細胞を使用した。これは 、１０％ＦＣＳ、１００U/mlのペニシリン、および１００μｇ/mlのストレプト マイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で５％ＣＯ₂を含む加湿 空気で維持された。細胞培養液を、４日毎に新鮮な培地に分けた。 ＨＩＶ−１ウイルスをＭＴ４細胞中で増殖させた。ＨＩＶ−１を感染させたＭ Ｔ４細胞培養液の無細胞上清を、ウイルスストックとして使用し、使用するまで −８０℃まで凍結した。無細胞ウイルスストックの５０％組織培養感染量（ＴＣ ＩＤ₅₀）は、９６ウェルマイクロ希釈プレート中でＭＴ４細胞で終点力価測定に より測定した。 ４．１．２ 細胞毒性の測定 非感染ＭＴ４細胞中の化合物Ａの細胞毒性を、３−（４，５−ジメチルチアゾ ール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）法に より評価した。１×１０⁵細胞／mlの培養液に懸濁したＭＴ４細胞（０．１ml） を、種々の量の化合物Ａを含有する９６ウェルマイクロプレートのウェルに接種 した。３７℃で４日間インキュベート後、１０μｌのＭＴＴ溶液（７．５mg/ml ）を加えて、生存細胞に負荷を加えた。４時間後、１００μｌの溶媒（１０％ト リトンＸ−１００と０．４％ＨＣＩイソプロパノール）を培養物に加えて、ホル マザンを可溶化した。一晩インキュベート後、各ウェルの吸光度を、マイクロプ レートリーダー（バイオラッド（Bio-Rad）、モデル４５０）を使用して５６０n mで測定した。 ４．１．３ 抗ＨＩＶ−１測定 培養ＭＴ４細胞を、トリパンブルー排除法により計測した。ＭＴ４細胞を、Ｆ ＣＳを含まない少量のＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２００ＴＣＩＤ₅₀／１０⁶ 細胞でＨＩＶ−１を感染させた。次にＭＴ４細胞とウイルスの混合物を３７℃ で５％ＣＯ₂の加湿空気中で１時間インキュベートし、ウイルスを細胞に吸着さ せた。次に１０mlの新鮮な培地で１回洗浄し、１０００ｒｐｍで１０分遠心分離 して、吸着しなかったウイルスを除去した。細胞を培地に懸濁し、１２ウェルの マイクロ培養プレート（１０細胞／３ｍｌ／ウェル）に分散した。種々の濃度の 化合物Ａを直ちに細胞培養液に加えた。３７℃で５％ＣＯ₂を含む加湿空気中で ４日間インキュベート後、培地を吸引し、同じ濃度の薬剤を含む新鮮な培地を加 えた。 ４．１．４ 感染したＭＴ４細胞のシンシチウムの観察 ４日間インキユベート後、感染ＭＴ４細胞のシンシチウムが観察される。７日 間のインキュベート後、生存細胞を前記したようにＭＴＴ法により評価した。 ４．１．５ 逆転写酵素（ＲＴ）測定 感染し薬剤で処理した細胞培養液と感染し薬剤処理のない細胞培養液の上清中 のＨＩＶ−１ ＲＴの存在を測定した。細胞培養液を、１０００ｒｐｍで１０分 遠心分離して細胞破片を除去して、清澄化した。二重測定の上清試料（１０μｌ ）を、５mlのプラスチック製ファルコン（Falcon）試験管に移した。次に１０μ ｌのウイルス可溶化緩衝液［０．８ＭのＮａＣｌ中の０．５％トリトンＸ−１０ ０、０．５mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２０％（v/v）グリセロ ールおよび５０mMのトリス−塩酸（ｐＨ７．８）］を加えて、上清試料中のウイ ルス粒子を可溶化し、ウイルスのコア中のＲＴを放出させ、次に１７０μｌの反 応混合物（カクテル１）［５２mMのトリス−塩酸（ｐＨ７．８）、１０mMのＭｇ Ｃｌ₂、２mMのジチオスレイトール、５μｇのポリ（ｒＡ）−オリゴ（ｄＴ）／m l、８３μｇのｄＡＴＰ／ml、および３μＣｉの［³Ｈ］ＴＴＰ／ml］を加え、 ３７℃で２時問インキュベートした。ウイルスＲＴによるポリ（ｒＡ）−オリゴ （ｄＴ）鋳型プライマーを用いるＤＮＡへの［³Ｈ］ＴＴＰの取り込みを、トリ クロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿により評価し、直径２７nmのガラスファイバーフィル ターでろ過した。３mlの冷１０％ＴＣＡを加えてＤＮＡを沈殿させた。沈殿ＤＮ Ａを次に、ミリポア（Millipore）サンプリングマニホールド中のフィルターに 集め、追加の５部の５％ＴＣＡと２部の７０％エタノールで洗浄した。フィルタ ー上のＤＮＡの反応性を、シンチレーションカウンターで測定した。 ４．１．６ ＬＰ−ＢＭ５マウスレトロウイルスを感染させたマウス中の治療効 果 マウス：この実験を通して、５週令の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。 すべてのマウスを、ろ過した空気を通した部屋の滅菌したケージに入れた。マウ スにペレットの食物を与え、塩素処理した水を自由に与えた。 ＬＰ−ＢＭ５ ＭｕＬＶによる感染：通常のＳＣ−１細胞とともにＧ６ ＳＣ −１クローンを５日間同時培養して、ＬＰ−ＢＭ５ ＭＵＬＶの無細胞上清を調 製した。１０^5.4×Ｃプラーク形成単位と１０^2.7×ミンク細胞フォックス（fock s）形成単位／mlを有する１５０μｌのストック溶液を、マウスの腹腔内に接種 した。 ウイルスの接種の翌日から初めて５０日問、化合物Ａを経口投与により週に１ 回投与した。次に脾臓を摘出した。ピペットで全脾臓の繰り返し継代により細胞 懸濁液を調製し、カプセルと破片を沈降させ、細胞を含有する上清を集め、ＰＢ Ｓで２回洗浄した。ＦＡＣＳ溶解液で赤血球を除去後、脾臓細胞を培地に懸濁し 、９６ウェルマイクロ培養プレートに広げ（５×１０⁵細胞／１００μｌ／ウェ ル）、その間それぞれＣｏｎＡ（２μｇ／１００μｌ／ウェル）とＬＰＳ（４μ ｇ／１００μｌ／ウェル）を加えた。直ちに、種々の濃度の化合物Ａを細胞培養 液に加えた。５％ＣＯ₂を含む加湿空気中で３７℃で５６時間インキュベート後 、３Ｈ−ＴｄＲを加えた（０．５μＣｉ／ウェル）。インキュベートを１６時間 続け、次に細胞をフィルターに集め、シンチレーションカウンターで計測した。 ４．２ 結果 化合物Ａの細胞毒性をＭＴＴ法により測定した。１０００μｇ/mlの濃度でも 化 合物Ａは、ＭＴ４細胞に強い細胞毒性を与えた。 ４日間インキュベート後に、２５μｇ/mlを超える投与量の化合物Ａで処理し たプレートではシンジチウムは観察されず、一方表４に示すように未処理のプレ ートではシンシチウムが明らかであった。 表４．ＭＴ４細胞中のＨＩＶに対する化合物Ａの阻害作用（シンシチウム） 化合物の非存在下では、約７２％の細胞がＨＩＶにより７日間のインキュベー ト後に死滅した。表５に示すように化合物Ａは、生存細胞の量を用量依存性に増 加させた。 表５．化合物Ａは生存細胞の数を増加させた 表６に示すように化合物Ａは、ＨＩＶに感染したＭＴ４細胞中のＲＴを阻害し 、そのＩＣ₅₀は１７．１μｇ/mlであった。 表６．化合物ＡはＨＩＶに感染したＭＴ４細胞中のＲＴを阻害する 表７に示すように、ＭｕＬＶに感染したマウスの免疫系は有意に抑制された。 化合物Ａは、ＣｏｎＡにより誘導されるリンパ球の増殖をＡＺＴに近い程度に増 強する。 表７．化合物Ａは、ＣｏｎＡにより誘導されるリンパ球の増殖を増強する ４．３ 結論 化合物Ａは、インビトロおよびインビボでＨＩＶに対して阻害作用を有する可 能性がある。これは、シンシチウムの出現を抑え、生存細胞の量を増加させ、Ｈ ＩＶに感染したＭＴ４細胞中のＲＴを阻害し、そのＩＣ₅₀は１７．１μｇ/mlで あった。化合物Ａは、ＭｕＬＶに感染したマウスのリンパ球の増殖を増強する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ミ，ズヒバオ 中国100071 ベイジン，フェンタイ ディ ストリクト，ドンダジー 20 (72)発明者 ワン，ビンジー 中国100850 ベイジン，ハイディアン デ ィストリクト，タイピン ロード 27

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ型肝炎およびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）関連疾患を治療するための 薬剤製造用の式： （式中、Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃は同じであるかまたは異なり、ＯＨまたはカフェ オイルオキシ基であり；Ｒ₁がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₂とＲ₃の両方 ともＯＨであり；またはＲ₂がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₁とＲ₃の両方 ともＯＨであり；またはＲ₃がカフェオイルオキシ基である時、Ｒ₁とＲ₂の両方 ともＯＨである）のジカフェオイルキナ酸誘導体の使用。 ２．式II （式中、Ｒ₁'、Ｒ₂'、およびＲ₃'は同じであるかまたは異なり、Ｈ、Ｃ_1-6アル キル基、 であり；ただし、Ｒ₁'、Ｒ₂'、およびＲ₃'は、同時にＨではあり得ず； Ｒ₁はＣ_1-6アルキル基またはＭすなわちＮａ、Ｋなどのアルカリ金属であり； Ｒ₂とＲ₃の両方ともＨ、Ｃ_1-6アルキル基またはＣＨ₃ＣＯである） の新しいジカフェオイルキナ酸誘導体。 ３．活性成分として請求の範囲第１項記載のジカフェオイルキナ酸および／また は請求の範囲第２項記載のジカフェオイルキナ酸誘導体、および任意の薬剤学的 に許容される賦形剤、添加剤または担体を含有する、Ｂ型肝炎およびレトロウイ ルス（例えばＨＩＶ）関連疾患の治療のための薬剤組成物。 ４．ジカフェオイルキナ酸は、式 を有する１，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸である、請求の範囲第１項記載の 使用。 ５．活性成分としての請求の範囲第１項記載のジカフェオイルキナ酸は、以下の 式の１，５−ジ−Ｏ−カフェオイルキナ酸である、請求の範囲第３項記載の薬剤 組成物。 ６．Ｂ型肝炎およびレトロウイルス（例えばＨＩＶ）関連疾患を治療するための 薬剤製造用の、請求の範囲第２項記載のジカフェオイルキナ酸誘導体の使用。 ７．組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、および注射用剤のような経口または または非経口調製物の型で処方される、請求の範囲第３項記載の薬剤組成物。 ８．レトロウイルスはＨＩＶである、請求の範囲第６項記載の使用。 ９．請求の範囲第１項記載のジカフェオイルキナ酸および／または請求の範囲第 ２項記載のカフェオイルキナ酸誘導体、または請求の範囲第３項記載の薬剤組成 物の有効量を、治療の必要な患者に投与することを特徴とする、Ｂ型肝炎および レトロウイルス関連疾患の治療方法。 １０．レトロウイルスはＨＩＶである、請求の範囲第９項記載の方法。 １１．患者はヒトである、請求の範囲第９項記載の方法。