CN1087608C - 二咖啡酰奎宁酸在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病中的用途及新咖啡酰奎宁酸衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及二咖啡酰奎宁酸在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病上的新用途，新的咖啡酰奎宁酸衍生物及含二咖啡酰奎宁酸或新的咖啡酰奎宁酸衍生物的药物组合物。

Description

二咖啡酰奎宁酸在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病中的用途及新咖啡酰奎宁酸衍生物
本发明涉及二咖啡酰奎宁酸在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病上的新用途，新的咖啡酰奎宁酸衍生物及含二咖啡酰奎宁酸或新的咖啡酰奎宁酸衍生物的药物组合物。
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种严重的世界性传染疾病。目前全世界约有3.5亿人带有HBV标志的感染者。中国是乙型肝炎的高流行区，其中50-70％的人群受过HBV感染，约8-10％的人是乙型肝病毒表面抗原携带者。由于HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞肝癌等慢性肝脏疾病，故其死亡率很高。近几十年以来，人们一直在寻找治疗和/或预防乙型肝炎的药物，并已开发出一些治疗乙型肝炎的药物，如化学药物如阿糖腺苷单磷酸，无环鸟苷，苏拉明，喹诺铜类药物，中国传统中草药的有效成份如苦参碱、甘草甜素、猪苓多糖、香菇多糖等，生物制剂如干扰素，白细胞介素-2，乙肝疫苗等。但这些药物由于副作用或使用不方便，尤其是停药后病毒水平反跳等原因，尚不能达到令人满意的治疗程度。另外，与逆转录病毒有关的疾病，如由逆转录病毒HIV感染引发的人免疫缺乏综合症(AIDS)，目前仍无十分有效的药物对其进行治疗。因此，研究和开发停药后使乙型肝炎病毒水平几乎没有反跳的新的治疗乙型肝炎药物及新的抗逆转录病毒，如HIV病毒的药物是十分需要的。
本发明的目的是提供一类新的抗乙型肝炎药物及新的抗逆转录病毒药物，其具有优良的疗效且副作用很低，尤其是其停药后，可使乙型肝炎病毒水平几乎不发生反跳。
本发明人经广泛深入的研究，出人意料地发现二-咖啡酰奎宁酸及咖啡酰奎宁酸衍生物对乙型肝炎病毒及逆转录病毒抗原的表达，病毒DNA的复制有良好的抑制作用，尤其是在停药后，可使乙型肝炎病毒水平几乎不发生反跳。本发明基于上述发现得以完成。
本发明第一个目的涉及式I的二咖啡酰奎宁酸衍生物在治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关疾病中的用途。
其中R1，R2和R3可相同或不同，分别为OH或咖啡酰氧基，条件是：R1为咖啡酰氧基时，R2，R3为OH，或R2为咖啡酰氧基时，R1，R3为OH，或R3为咖啡酰氧基时，R1，R2为OH。
本发明第二个目的涉及的是式II新的咖啡酰奎宁酸衍生物。
Figure C9611169100042
其中R1’，R2’和R3’可相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，
条件是R1′，R2′，R3′不能同时为氢，
R4为碱金属M，C1-6烷基，M选自碱金属如N2，K等，
R5＝R6且为氢，C1-6烷基，CH3CO。
本发明再一目的涉及的是含式I化合物的药物组合物，该药物组合物对乙型肝炎病毒(HBV)及逆转录病毒有良好的抑制作用。根据本发明，该药物组合物中可加有各种药用赋形剂，添加剂及载体。
根据本发明，本发明的式I或式II化合物或含式I或式II化合物的药物组合物可用于治疗乙型肝炎及与逆转录病毒有关的各种疾病，尤其是用于治疗乙型肝炎。
根据本发明，本发明的药物组合物可按本领域已知方法配成肠道或非肠道给药的制剂，如片剂，胶囊，粒剂，注射液等。
根据本发明，本发明的式I或式II化合物，主要来自植物，如菊科植物旋复花。其中式II化合物可通过半合成法对式I化合物进行适当化学修饰得到。
根据本发明，本发明优选的抗乙肝病毒及逆转录病毒的化合物为下式1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸。
Figure C9611169100052
根据本发明，1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸可从菊科植物旋复花中提取得到，其具体提取路线如下所示：
Figure C9611169100061
在上述提取路线中，组份IEB5即为1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸。
下面将通过1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸(今后简称为化合物A)在体内外抗乙型肝炎病毒的生物作用来进一步阐述本发明。
在下面生物实验中主要通过化合物A对HBV DNA聚合酶的抑制作用和对2.2.15细胞合成、分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用及对HBV DNA复制的抑制作用研究，对化合物A的体外抗HBV作用进行评价。利用鸭乙型肝炎病毒模型对化合物A进行初步体内抗HBV作用评价。一.材料与方法1.1材料1.1.1病毒，细胞和动物
HBV悬液：购自北京医科大学肝病研究所。
2.2.15细胞株：HBV DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2.2.15细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，我国北京医科大学传染科引进，中国医学科学院医药生物技术研究所膝立提供，自行传代培养。
鸭乙型肝炎病毒：上海麻鸭血清，核酸杂交DHBV DNA阳性(+++)，-70℃保存。
动物：1日龄北京鸭，购自北京禽蛋公司养殖场。1.1.2试剂
HBV DNA质粒、DHBV DNA质粒：中国医学科学院医药生物技术研究所李壮提供。
α32P-dCTP：北京福瑞生物技术工程公司。
缺口翻译药盒：Promega公司。
Sephadex G-50，PVP：瑞典Pharmacia公司。
SDS：德国Merck公司。
硝酸纤维素膜：英国Amersham公司。
鱼精蛋白，牛血清白蛋白：中国科学院生物物理所
DMEM(Dulbecco`s Modified Eagle Medium)干粉：美国GIBCO BRL产品。
胎牛血清：美国GIBCO BRL产品。
G-418(Geneticin)：美国GIBCO BRL产品。
青霉素，链霉素，华北制药厂
HEPES：香港FARCO公司产品。
四甲基偶氮唑盐(MTT)：Sigma公司产品(400μg/100ml MEM)；
HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒：北方免疫试剂研究所产品；
脱氧三磷酸腺苷(dATP)、脱氧三磷酸胞苷(dCTP)、脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)和脱氧三磷酸胸甙(dTTP)：为美国Sigma公司产品。
β-巯基乙醇(β-ME)、NP-40：为英国BDH公司产品。
1，4-双-[2-(5-苯基恶唑)]苯(POPOP)：为Baker公司产品。
3H-dTTP：英国Amersham公司产品。
十二烷基磺酸钠(S.D.S)、2，5-二苯恶唑(PPO)：西德Merck公司产品。
其它化学试剂均为国产优级纯或分析纯试剂，均由本院提供。
2.2.15细胞培养液及试剂配制：
检测DNAp用3H-dTTP底物掺入液：
                  配制终浓度     贮存液浓度      取量
Tris.HCl PH7.6     200mmol/L       1mol/L      1000μl
NH4Cl             200mmol/L       1mol/L      1000μl
MgCl2             50mmol/L        1mol/L      250μl
NP-40              2％             100％       100μl
β-ME              0.6％           100％       30μl
dATP               0.3mmol/L       100mmol/L   15μl
dCTP               0.3mmol/L       100mmol/L   15μl
dGTP               0.3mmol/L       100mmol/L   15μl
3H-dTTP            20μCi/ml       1mCi/ml     100μl
D.D.W                                    加至5000μl
在冰浴中配制，即配即用。
闪烁液：0.5％PPO和0.015％POPOP的二甲苯溶液。
DM EM培养液：含胎牛血清10％，青霉素100μg/ml，链霉素100u/ml，用5％NaHCO3调PH至7.0。
传代用DM EM培养液加G418 380μg/ml，
细胞消化液：0.25％胰酶，用Hanks液配制。
MTT染色液：用DMEM液配制成，-4℃保存，400μg/ml，每孔100μl。
化合物A溶液：化合物A以DMEM培养液配制成100mg/ml和10mg/ml两种贮存液，以5％NaHCO3调节PH至7.2。
实验用品及仪器：
培养瓶，丹麦Tunclon TM；
培养板，96孔板，24孔板，美国Corning公司产品；
二氧化碳孵箱，美国Shel-Lab产品；
γ-计数器1.2实验方法1.2.1化合物A对HBV DNA聚合酶活性的抑制试验1.2.1.1方法
以下步骤在冰浴上进行：
(1)取新配制的掺入液40μl，加到1.5ml的Eppendorf管中，再加配制好的化合物A溶液8μl于管中，最后加超离心制备的HBV DNAp样品32μl，充分混匀，Eppendorf管中溶液总体积为80μl。酶对照组不加药而加8μl双蒸水，阳性对照药为PFA(磷甲酸)，阴性对照为40μl掺入液加40μl双蒸水。将管内反应体系充分混匀。
(2)离心10秒，将装有反应体系的Eppendorf管放置在37℃水浴，慢摇(50转/分)反应3小时。
(3)65℃水浴2分钟，终止反应。离心10秒。
(4)取上清70μl点样于已编号标记的Whatman 3号滤纸片园片(2cm)上。
(5)将点好样的滤纸片用4℃预冷好的5％三氯乙酸(TCA)(含0.1％焦磷酸)振荡洗涤10分钟，共3次。
(6)用4℃预冷的无水乙醇浸泡10分钟，自然晾干。
(7)将滤片置于闪烁液中，用液烁仪测定其cpm值。1.2.1.2化合物A作用结果处理与统计
计算化合物A在不同浓度时3H-d TTP掺入HBV DNA的cpm均值与标准误，与不加化合物A阳性对照组比较进行t检验。
计算化合物A在不同浓度时对HBV DNAp活性的抑制率。
公式1：
Figure C9611169100091
抑制率与化合物A浓度转化为两参数的logit作图法作图若为直线，可以在图上直接读出IC50。IC50＝10(截距/斜率)1.2.2化合物A对2.2.15细胞合成分泌HBV的抑制作用1.2.2.1 2.2.15细胞培养
2.2.15自中国医学科学院医药生物技术研究所病毒研究室引进，自行传代培养。在长满2.2.15细胞的培养瓶内加5ml 0.25％胰酶消化液轻洗，倒出，再加2ml消化液，37℃消化，于细胞发生变化前倒出消化液，平放。待细胞开始脱落时加培养液吹打，1∶3传代，加150μg/ml G418压克隆，7天长满。进行细胞计数，配制成105个/ml接种细胞培养板，96孔每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃，5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。1.2.2.2细胞毒性试验
化合物A贮存液(100mg/ml)用培养液2倍稀释10个浓度，每孔20μl于96孔细胞培养板至终浓度为8-0.03mg/ml，每浓度6孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照，8天观察结果。
倾去培养液，每孔加入MTT培养液(400μg/ml)，每孔100μl，37℃，5％CO2孵育4小时，可见黄黑色甲瓒颗粒，弃去上清，加DMSO 100μl溶解，待甲瓒颗粒完全溶解后，用酶标仪570nm波长测定OD值。1.2.2.3对HBeAg、HBsAg合成和分泌的抑制试验1.2.2.3.1方法
2.2.15细胞以105个/ml接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃，5％CO2培养48小时，加无毒浓度以下2倍稀释化合物A溶液，至终浓度分别为250，125，62.5，31.25，15.6和7.8μg/ml。每浓度3孔，同时设阳性对照药和无药物细胞对照，37℃5％CO2培养，共12天，每4天更换原浓度药液培养，将收集的培养液-20℃冰冻保存；将收集的培养液同时测定HBeAg和HBsAg，同时设细胞对照和阳性药物对照。计算细胞对照及各浓度cpm均值及标准误、对HBsAg和HBeAg的抑制百分率(％)和半数抑制浓度(IC50)：
HBeAg和HBsAg测定：用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放设免疫测定盒测定，方法见说明书：分别取相应细胞培养板各孔培养液200μl加入抗HBe(HBs)包被株1粒，室温过夜，以0.01M PBS洗液(含0.05％吐温-20)洗涤6次，沥干，加200μl 125I-抗-HBe(HBs)，室温过夜，PBS洗涤6次，沥干。用γ-计数器测定每孔药液cpm值。1.2.2.3.2化合物A作用结果处理与统计
化合物A对HBsAg和HBeAg的抑制百分率(％)计算：
公式2.1：
Figure C9611169100111
IC50：以cpm值或抑制率与药物浓度的对数用四参数Logistic函数拟合作图，曲线形状若为典型的S型浓度-效应曲线，可以得到在不同浓度处理时抗原生成量RIMA测定cpm的最大值(Emax)和最小值(Emin)，最大抑制率、最低抑制率、抑制50％所需浓度(IC50)和斜率(Hill′s系数)。IC50为抑制曲线中最重要的参数，它代表抑制抗原生成所需的药物浓度，在曲线斜率相同的条件下，显然浓度越低表示药物的抑制活性越高。抑制率与药物浓度转化为两参数的logit作图法作图若为直线，可以在图上直接读出IC50。IC50＝10(截距/斜率)。1.2.2.4化合物A对2.2.15细胞内HBV-DNA复制的抑制作用
2.2.15细胞DNA提取：
24孔板2.2.15细胞培养加不同浓度药液培养12天。倾去培养液，PBS洗三次，加0.1ml消化液(0.1％SDS，0.15MNaCl，0.01 MTris，HClPH7.5，0.01M EDTA，2mg/ml Pronase)，37℃反应2小时，消化产物以等体积苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次处理10分钟，离心12000rpm，10分钟。取上清，加1/10体积5MNaCl和2.5倍体积无水乙醇，液氮气相冷冻30分钟，12000rpm离心10分钟沉淀DNA，真空抽干，重溶于TE缓冲液中，作为样品。
α-32P探针标记：
按Promega缺口转移试剂盒说明书标记探针：取1μl含HBV DNA质粒，加10μl 100mM dNTP(dATP，dGTP，dTTP)，5μl 10×缺口翻译缓冲液，α32P-dCTP 5μCi，5μlDNA聚合酶/DNA内切酶混合物，用双蒸水补足50μl，置12℃反应2小时。加0.5M EDTA 5μl终止反应。标记物加到用1×TE平衡的Sephadex G-50柱(0.6×12cm)，TE洗脱，从上样开始计数，第8滴开始收集，每管8滴，共收集10管，低能辐射仪测定各管放射性强度。合并第一峰液体，-20℃备用。
细胞DNA的Southern Blot分析：
1)凝胶制备：制做1％琼脂糖凝胶，凝固后将胶置于电泳槽中，拔出梳子。
2)上样：样品加1/10体积的加样缓冲液，混匀，加至各梳孔中，同时加HindIII DNA作对照。
3)电泳：样品孔一端接阴极，50mA电泳过夜
4)检查：加溴化乙锭染色30分钟，紫外灯下检查，切除不需要部分。
5)预处理：将胶放入0.25M HCl中10分钟，水冲洗三遍。
6)变性：将胶放入变性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中1小时，不间断的轻轻摇动，以水漂洗。
7)中和：将胶放入中和液(1MTris.HCl PH7.6，1.5MNaCl)中1小时，不断振徭，更换中和液，继续中和15分钟。
8)转膜：在转移槽中加入10×SSC。在小架子上铺两层润湿的滤纸，两端浸在10×SSC中，滤纸上再放一层与胶大小相同的滤纸，赶走气泡，四周用塑料条盖上，以免“短路”。将胶翻转过来放在滤纸上，赶气泡，将大小相同的硝酸纤维素膜仔细放在胶上，赶走气泡，再放大小相同的滤纸若干层，最后放吸水纸，压上玻璃板及重物，适时更换吸水纸，转移过。夜。丢弃吸水纸、滤纸，小心取下硝酸纤维素膜，夹在干燥滤纸中，做好标记，室温凉干，放冰箱中备用。
9)预杂交：将胶置于杂交袋中加入预杂交液(3×SSC-0.1％SDS10ml)65℃，30分钟。接10×Denhardt液-0.1％SDS 10ml，10mg/ml变性载体DNA 200ml，65℃过夜。
10)杂交：去掉预杂交液，换杂交液(50％甲酰胺，25％Denhardt液0.1％SDS)，20％2×SSC，5％D.D.H2O，100μl变性DNA，200μl变性探针，1％焦磷酸)，42℃，48小时。
11)洗膜：用3×SSC-0.1％SDS分别在室温，42和65℃各洗涤10分钟。
12)夹片曝光：夹片，-70℃曝光，D72显影7分钟，定影10分钟，水洗胶片。1.2.3化合物A在鸭体内的抗HBV作用1.2.3.1鸭乙型肝炎病毒感染
孵出24小时内的北京鸭，由足静脉注射上海麻鸭DHBV DNA阳性血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分离血清，-70℃保存等检。1.2.3.2药物治疗试验
第一批：DHBV感染雏鸭7天后，随机分为5组，每组7只。三组化合物A给药组剂量分别为50、12.5和5mg/kg体重，阳性药物为无环鸟苷(ACV)50 mg/kg口服，bid×14。设病毒对照组以生理盐水代替药物。在感染后7天用药前(T0)、用药第7天(T7)、第14天(T14)和停药后第5天(P5)自鸭足静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
第二批：DHBV感染雏鸭7天后，随机分4组，每组5只。二组化合物A给药组剂量分别为50和12.5mg/kg体重，阳性药物为无环鸟苷(ACV)50mg/kg口服，bid×10。设病毒对照组以生理盐水代替药物。在感染后7天用药前(T0)、用药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)自鸭足静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
DHBV DNA检测方法
DHBV DNA探针标记：按Promega缺口翻译药盒说明书用α32P-dCTP标记探针：方法同HBV DNA探针标记。
斑点杂交检测鸭血清中DHBV DNA：
1)膜处理：用蒸馏水和10×SSC浸泡硝酸纤维素膜各30分钟，置室温凉干。
1)点膜：取40μl上述待检血清，每批各组样品同时点膜，室温凉干。
2)变性：将硝酸纤维素膜分别浸于下列变性液中变性：
变性液I，0.5MNaOH 10分钟。
中和液II，1MTris.HCl PH7.6，0.6MNaCl，10分钟
中和液III，0.5MTris.HCl PH7.6，1.5MNaCl，10分钟。室温凉干。
3)置80℃烤箱中2小时。
4)预杂交：将胶置于杂交袋中加入预杂交液(3×SSC-0.1％SDS10ml)65℃，30分钟。换10×Denhardt液-0.1％SDS 10ml，10mg/ml变性载体DNA 200ml，65℃过夜。
5)杂交：去掉预杂交液，换杂交液(50％甲酰胺，25％Denhardt液0.1％SDS)，20％2×SSC，5％D.D.H2O，100μl变性DNA，200μl变性探针，1％焦磷酸)，42℃，48小时。
6)洗膜：用3×SSC-0.1％SDS分别在室温，42℃和65℃各洗涤10分钟。
7)夹片曝光：夹片，-70℃曝光，D72显影7分钟，定影10分钟，水洗胶片。
8)用DG3022型酶标检测仪测定光密度值(OD)(λ＝490nm)和Primax扫描仪测定总灰度。
计算每组鸭不同时间血清DHBV DNA OD490(总灰度)均数并将每组鸭用药后各时间及停药后血清OD490(总灰度)与给药前T0比较，进行t检验。
将各组不同时间DHBV DNA抑制率分别与对照组相同时间的同一指标比较，进行t检验。
计算每组鸭用药后DHBV DNA抑制率
公式2.2：
Figure C9611169100141
结果2.1化合物A对HBV DNA聚合酶活性的抑制作用
表1.化合物A和PFA对HBV DNAp活性的体外抑制作用
    [HBV DNA3H-dTTP掺入值(cpm)和抑制率(％)，
表内数值为标准差±标准误，n＝2，病毒阳性对照为
11093±992.6，不加酶阴性对照cpm值为146.4±
12.8]
药物       浓度(μl/ml)        1                10               100                   1000
化合物A      cpm值        9856.1±200.9    7990.4±78.5       3522.0±50.6**     1982.7±158.6**
             抑制率(％)   11.17±1.93      30.81±0.75        68.39±0.49         82.31±1.52
  PFA        cpm值        10266.8±76.6    5495.0±218.4**   3064.9±67.4**     2377.1±329.0**
             抑制率(％)   -5.23±15.31     44.39±2.27        69.65±0.70         76.81±3.42
重复实验结果显示：化合物A具有较强的抑制HBV DNAp活性的作用，具有典型的量效关系，各批实验IC50变化很小，为14.3-30.6μg/ml。化合物A和PFA在以两参数logit作图法所得抑制曲线中IC50接近，化合物A斜率较PFA小，说明化合物A在低浓度时作用强，而在高浓度时PFA作用较强。2.2化合物A在2.2.15细胞培养中的抗乙型肝炎病毒作用2.2.1化合物A对2.2.15细胞增殖的影响
2.2.15细胞以105个/ml接种96孔细胞培养板，每孔0.2ml，37℃，5％CO2培养48小时，加2倍稀释化合物A溶液10个浓度，化合物A在8、4、2mg/ml剂量组第4天起，2.2.15细胞培养液开始有轻微颜色变化，8mg/ml剂量组第8天时颜色变绿。在显微镜下观察化合物A在8、4、2mg/ml剂量组第4天起形态有较轻微的变化，0.5mg/ml以下剂量组2.2.15细胞形态正常。MTT染色后，各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同(结果见表2)
表2不同浓度化合物A对转染HBV DNA肝癌细胞株HepG2 2.2.15细胞
                       的影响，
培养8天后细胞用MTT染色，在570nm波长条件下测定O.D.值。剂量             8.00    4.00    2.00   1.00   0.50    0.25   0.13   0.06   0.03   0.015  0(mg/ml)一批    均数     2.76    2.19    2.23   2.03   2.03    1.96   1.96   1.95   1.89   2.09   1.99
     SD      0.12    0.09    0.09   0.07   0.06    0.10   0.05   0.05   0.07   0.08   0.04二批    均数     2.17    2.21    2.05   1.86   1.86    1.83   1.66   1.90   1.45   1.78   1.89
     SD      0.19    0.19    0.15   0.14   0.12    0.12   0.09   0.13   0.23   0.13   0.092.2.2  化合物A在2.2.15细胞培养内对HBeAg和HBsAg表达的作用
2.2.15细胞以105个/ml接种24孔细胞培养板，加无毒浓度以下2倍稀释化合物A溶液，将加药后第4，8和12天收集的培养液同时以RIMA法测定HBeAg和HBsAg的量。用γ-计数器测定每孔药液cpm值。两指批重复实验结果见表3、4表3.化合物A在2.2.15培养中对HBeAg和HBsAg合成和分泌的抑制作
                        用(表内数据为均值±标准误，n＝3，阴性血清对照为171.1±13.86)(第一批实验)浓度        时间      HBe              Ag              HBs               Ag(μg/ml)    (天)     cpm值          抑制率(％)        cpm值            抑制率
         4    5062.4±204.7                      831.5±36.60            8    6731.8±571.8#                     866.3±66.2
         12   7499.4±167.7##                    773.4±11.8
         4    4830.7±269.7     4.84±5.61       786.6±36.1      6.47±5.197.81         8    6600.7±544.9     2.03±8.43       728.7±43.6      18.85±5.98
         12   6421.7±716.7     14.9±9.91       800.5±67.0      -4.25±10.5
         4    4187.7±230.4*   18.25±4.79      652.2±50.2*    25.78±7.2215.63        8    591 2.3±1001     12.67±1.56      671.0±20.0*    26.75±2.74
    12     5544.8±763.6      27.02±1 0.6     774.9±53.7        -0.23±8.43
    4      3270.1±84.3**    37.37±1.76      530.2±66.5*      43.33±9.5631.25   8      4373.7±241.9*    36.47±3.74      640.7±24.5*      30.89±3.36
    12     5090.9±268.9**   33.29±3.72      674.2±55.1        15.57±8.65
    4      3014.7±64.5**    42.70±1.35      466.2±27.9**     52.53±4.0162.5    8      3789.0±134.0**   45.36±2.07      550.9±14.1**     43.19±1.93
    12     3782.8±379.5**   51.38±5.25      509.0±39.9**     41.49±6.26
    4      2667.7±67.0**    49.93±1.40      435.4±16.6**     56.97±2.38125     8      3136.4±471.4**   55.60±7.29      479.5±20.1**     52.98±3.30
    12     3314.8±255.9**   57.85±3.54      432.8±21.7**     53.44±3.40
    4      2200.9±194.5**   9.66±4.05       393.4±32.2**     63.01±4.63250     8      2341.5±359.4**   67.90±5.56      454.1±27.4**     56.45±3.76
    12     2558.8±281.8**   68.30±3.90      389.9±27.5**     60.18±4.32
    4      4720.5±354.9      7.14±7.39       706.5±23.7*      17.98±3.41ACV     8      6101.9±949.2      9.74±14.7       769.3±85.1        13.29±11.7
    12     6527.5±2081       13.44±28.8      749.8±12.8        3.71±2.01*和**与同一培养时间不加药细胞对照比较p＜0.05或0.01#和##不加药正常细胞培养不同时间比较p＜0.05或0.01表4.化合物A在2.2.15培养中对HBeAg和HBsAg合成和分泌的抑制作用(表内数据为均值±标准误，n＝3，阴性血清对照为265.85±16.36)(第二实验)浓度          时间          HBc               Ag               HBe              Ag(μg/ml)      (天)         cpm值           抑制率(％)        cpm值           抑制率(％)
           4        5205.2±136.2                      1211.6±39.10              8        8231.8±172.9##                    1163.2±41.8
           12       8499.4±167.7##                    759.0±15.6
           4        4764.0±212.0      8.94±4.29      1032.6±10.8**   17.21±1.037.81           8        7400.7±163.3*    10.43±2.05     979.3±42.3*    18.54±4.26
           12       7188.3±197.5**   15.93±2.40     617.0±27.2**    24.17±4.63
       4        4264.0±192.1*      19.06±3.89       941.1±27.2**    26.00±2.6215.63      8        5707.0±567.8**     31.70±7.1        888.9±16.3**    27.65±1.64
       12       6211.5±183.3**     27.80±2.23       574.6±18.8**    31.37±3.20
       4        3503.4±328.9**     34.47±6.66       824.2±29.7**    37.24±2.8631.25      8        4906.8±196.4**     41.75±2.47       808.5±18.9**    35.75±1.90
       12       5991.2±291.9**     30.47±3.55       546.5±8.7**     36.15±1.48
       4        3181.4±181.7**     40.99±3.68       717.5±12.2**    47.48±1.1762.5       8        4631.7±196.8**     45.21±2.47       699.7±20.2**    46.72±2.03
       12       4603.5±66.76**     47.33±0.81       464.2±7.50**    50.14±1.28
       4        2867.7±53.8**      47.35±1.09       618.5±25.4**    57.00±2.44125        8        4052.1±150.6**     52.49±1.89       617.7±20.6**    54.99±2.08
       12       4014.8±82.8**      54.48±1.01       416.1±14.7**    58.32±2.51
       4        2034.2±1000.3**    64.23±2.03       563.5±23.1**    62.29±2.22250        8        3081.5±181.7**     64.67±2.28       480.8±46.5**    68.79±4.68
       12       3025.4±74.0**      66.50±0.90       367.5±6.70**    66.60±1.15
       4        3910.9±57.6**      26.22±1.17       710.1±65.7**    48.20±6.31ACV        8        6101.9±96.17**     26.75±1.21       870.1±51.1**    29.54±5.15
      12        8194.1±111.5        3.71±1.36        622.5±58.8       23.22±2.01*和**与同一培养时间不加药细胞对照比较p＜0.05或0.01#和##不加药正常细胞培养不同时间比较p＜0.05或0.012.2.2.1化合物A在2.2.15细胞培养内对HBeAg合成和分泌的抑制作用
自表3、4结果看出：2.2.15细胞株在不同浓度的化合物A处理条件下培养4、8和12天后，对培养液HBeAg生成量的抑制作用与浓度的对数成正比。抑制程度并不随药物作用时间延长而变化，第4、8和12天时的IC50相近。
表5.2.2.15细胞株在不同浓度的化合物A处理条件下培养
  4、8和12天后，对培养液HBeAg生成量的影响。
              Logit模型拟合量效曲线数据，。
培养时间      截矩A)         斜率(B)       IC50    R        P
4天-1      -2.05±0.27     1.41±0.17     28.4     0.98    0.00378
4天-2      -1.68±0.17     1.02±0.10     44.4     0.98    0.00054
8天-1      -2.45±0.27     1.55±0.18     38.1     0.98    0.00306
8天-2      -2.70±1.04     2.02±0.60     21.7     0.86    0.02834
12天-1     -1.41±0.08     0.88±0.05     40.0     0.99    0.00005
12天-2     -1.27±0.08     0.67±0.05     78.6     0.99    0.000152.2.2.2化合物A在2.2.15细胞培养内对HBsAg合成和分泌的作用
从表3、4可以看出：2.2.15细胞株在不同浓度的化合物A处理条件下培养4、8和12天后，对培养液HBeAg生成量的抑制作用与浓度的对数成正比。第4和8天时的IC50相近，第12天时一批试验IC50增大。
表6.2.2.15细胞株在不同浓度的化合物A处理条件下培养4、8
和12天后，对培养液乙肝病毒表面抗原(HBsAg生成量的影响。
           Logit模型拟合量效曲线数据。
             截矩(A)            斜率(B)         IC50       R         P
4天-1     -2.18±0.23         1.64±0.15       21.3       0.987     0.00166
4天-2     -1.30±0.019        0.895±0.011     28.3       0.999     0.00001
8天-1     -1.34±0.145**     0.889±0.084     32.2       0.992     0.0001
8天-2     -2.70±104*        2.02±0.60       21.7       0.982     0.00046
12天-1    -4.35± 0.353**      2.59±0.21       47.8       0.993     0.00653
12天-2    -1.03±0.0041**     0.464±0.023     165        0.995     0.00004*、**和***与药物作用4天时比较时，P＜0.05、P＜0.01和P＜0.001。2.2.3化合物A在2.2.15细胞培养内对细胞内HBV-DNA复制的抑制作用(Southern Blot分析)
对正常2.2.15细胞及经不同浓度化合物A处理的2.2.15细胞进行DNA提取，凝胶电泳和转膜杂交。放射自显影结果可见正常细胞对照有约3.7kb的游离的HBV DNA带，化合物A在62.5和125μg/ml时DNA带的量明显降低，250μg/ml时降低最为明显。可见化合物A能抑制HBV DNA的复制，抑制作用随剂量增加而增强。
图1表示化合物A于不同浓度下在2.2.15细胞培养内对细胞内HBV-DNA酶抑制作用(southern Blot分析)2.3化合物A口服治疗对DHBV感染雏鸭血清DHBV DNA量的抑制作用
口服不同剂量化合物A对感染鸭肝病毒(DHBV)雏鸭血清DHBV DNA量的影响(试验一)DHBV感染雏鸭7天后，开始口服给药，分别在感染后7天用药前(T0)、用药第7天(T7)、第14天(T14)和停药后第5天(P5)自鸭足静脉取血，分离血清，32P-dCTP标记探针，斑点杂交检测DHBV DNA，放射自显影图象所得显影图象见图2。
口服不同剂量化合物A对感染鸭肝病毒(DHBV)雏鸭血清DH BVDNA量的影响(试验二)DH BV感染雏鸭7天后，口服给药，在感染后7天用药前(T0)、用药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)自鸭足静脉取血，分离血清，32P-dCTP标记探针，斑点杂交检测DHBV DNA，放射自显影图象所得显影图象见图3。
化合物A北京鸭最大耐受量＞4g/kg。
图2和图3是感染雏鸭治疗前、治疗后第7和14天和停药后5天取鸭血清，用32P-dCTP斑点杂交后的放射自显影图象。表7显示各处理组同一检查时间7只鸭血清斑点，酶标仪检测斑点黑度、光密度的平均数±标准差和各组DHBV DNA量随治疗的变化。其主要结果是治疗前各组病毒DNA量无统计差别；治疗后盐水对照光密度值有些波动但无统计意义。阿昔洛韦组治疗后7和14天黑度明显减低，但停药后平均值高于治疗前。化合物A组的疗效依赖于治疗持续的时间和服药剂量，连续治疗14天的疗效优于治疗7天，停药后疗效减弱。5mg组无明显降低病毒DNA的作用，50mg剂量组疗效最好，抑制作用出现较早，检测到的病毒水平较低，而且在停药后仍保持在与治疗前对照明显低的水平(p＜0.05)。表7.口服不同剂量化合物A对感染鸭肝病毒(DHBV)雏鸭血清病毒DNA量的影响(试验一)斑点杂交法检测，酶标仪测定斑点总吸光度(O.D./斑点，均数±标准误，n＝7)
            对照        阿昔洛韦        化合物A       化合物A          化合物A
                        50mg/kg         5mg/kg        12.5mg/k g      50mg/kg治疗前       0.17±0.16    0.15±0.05       0.16±0.05    0.21±0.06      0.15±0.06治疗后7天    0.13±0.04    0.03±0.04**    0.16±0.05    0.13±0.06*    0.06±0.04**治疗后14天   0.19±0.13    0.03±0.04**    0.15±0.05    0.06±0.06**   0.03±0.06**停药后5天    0.22±0.13    0.24±0.16       0.16±0.04    0.17±0.08      0.05±0.07* *和**：与治疗前比较时P＜0.05和P＜0.01。
为了验证结果的可靠性进行了第二次重复试验，DHBV感染雏鸭7天后，口服给药，在感染后7天治疗前(T0)、用药第5天(T5)、第10天(T10)和停药后第3天(P3)自鸭足静脉取血，分离血清用斑点杂交检测DHBVDNA。图3是放射自显影图，表8是用图象分析法得到的结果。本次试验中ACV组治疗后10天病毒DNA有减低趋势(P＞0.05)，化合物A的12.5mg组未显示明显疗效，但是50mg组显示与第一次试验类似特点的疗效。表8.口服不同剂量化合物A对感染鸭肝病毒(DHBV)雏鸭血清病毒DNA量的影响(试验二)斑点杂交法：图象分析法测定斑点总灰度(KGrayness/斑点，均数±标准误，n＝4或5)
           对照          阿昔洛韦      化合物A      化合物A
                         50mg/kg       12.5mg/kg    50mg/kg治疗前        4.0±1.5       4.0±1.4      2.6±0.4     9.1±3.2治疗后5天     3.6±1.1       5.1±0.8      2.1±0.8     4.0±2.3*治疗后10天    3.6±1.0       2.4±1.6      2.4±0.4     1.5±0.3**停药后3天     4.3±1.4       6.4±0.8      2.4±0.4     3.8±1.4* *和**：与治疗前比较时P＜0.05和P＜0.01。
讨论与结论
在HBV DNA复制过程中，至少有3种病毒特异性酶活性是必须的：1)依赖RNA的DNAp，2)依赖DNA的DNAp，3)RNase H(为降解前基因组RNA而合成正股DNA的酶)。一般认为，这三种酶活性为同一蛋白分子所具有，与DNA P区基因编码有关。HBV DNAp是HBV DNA复制过程中的关键酶，一旦DNAp被抑制，HBV DNA的复制就会中断，HBV的生长增殖就会停止。因此能抑制HBV DNAp活性的药物即具有抗病毒作用。对HBV DNAp活性抑制作用的测定，是进行药物筛选和疗效判断的重要指标。
化合物A各剂量组2.2.15细胞培养8天，MTT染色后，各剂量组OD值与正常细胞对照基本相同，甚至高浓度(8和4mg/ml)时略有升高。在显微镜下观察化合物A在8、4、2mg/ml剂量组2.2.15细胞形态有较轻的变化，可能与药物在血清及各种金属离子于37℃长时间作用下生成的有色物质有关。1mg/ml以下剂量组2.2.15细胞形态正常。
2.2.15细胞培养液中HBeAg的量较高，而HBsAg的量则较低。药物作用4、8和12天后，对HBeAg和HBsAg的生成量都有显著的抑制作用，作用随化合物A浓度增强，但是剂量增大至一定量后(IC50)抑制作用呈饱和趋势，表现为典型的S形抑制曲线。培养时间越长，不加药时培养液中生成HBeAg抗原量越多，而HBsAg则有相反的趋势，但抑制程度并不随药物作用时间延长而增强或降低，IC50稳定在一定范围内，说明化合物A的抑制作用比较稳定。化合物A对2.2.15细胞DNA复制也有抑制作用。
感染DHBV北京雏鸭于感染后7天进行治疗，给药14天，其主要结果是治疗前各组病毒DNA量无统计差别；治疗后盐水对照组血清DHBV DNA水平有波动，但无统计意义。阿昔洛韦组治疗后7和14天DNA水平明显减低，但停药后平均值高于治疗前。化合物A组的疗效依赖于治疗持续的时间和服药剂量，连续治疗14天的疗效优于治疗7天，停药后疗效减弱。5mg组无明显降低病毒DNA的作用，50mg剂量组疗效最好，抑制作用出现较早，检测到的病毒水平较低，而且在停药后仍保持在与治疗前对照明显低的水平(p＜0.05)。重复实验得到类似的结果，ACV(50mg/kg)治疗5天未见明显的抑制作用，第10天的作用也相对较小，同时化合物A的作用也较第一次实验偏低。
用体外HBV DNAp活性抑制实验筛选分离得到的合物A，在2.2.15细胞和DHBV感染鸭模型中都显示明显的抗HBV作用，进一步证明了初筛方法的可行性和可靠性，同时说明化合物A具有抑制DNA聚合酶活性，从而抑制DNA复制的作用途径。
结论：化合物A具有较强的抑制HBV DNAp的作用，IC50为14.3-30.6μg/ml，具有典型的S型浓度-效应曲线，化合物A在2.2.15细胞培养中对HBV复制及抗原生成有较强抑制作用。对培养液中HBeAg和HBsAg的合成和分泌有典型的量效关系的抑制作用，两批重复实验IC50分别为21～78μg/ml和21～165μg/ml，Southern杂交表明对HBV DNA的生成有抑制作用。1.0μg./ml浓度的化合物A对2.2.15细胞的增殖无明显不良影响。
化合物A在DH BV感染北京鸭体内模型也有抗病毒作用，北京鸭感染DHBV第7天开始口服给药，化合物A给药后第7和14天对血清DHBV有依赖于剂量的抑制作用，50mg/kg/天剂量组作用最强，停药5天后血清DHBV DNA仍维持在较低水平，明显低于NS和ACV组。初步试验表明化合物A口服最大耐受量大于4g/kg。

Claims (3)

1.下式的二-咖啡酰奎宁酸衍生物在制备用于治疗乙型肝炎及与逆转录病毒感染有关疾病的药物中的用途，
其中R1，R2和R3可相同或不同，分别为OH或咖啡酰氧基，条件是：R1为咖啡酰氧基时，R2，R3为OH，或R2为咖啡酰氧基时，R1，R3为OH，或R3为咖啡酰氧基时，R1，R2为OH。
2.根据权利要求1的用途，其中二-咖啡酰奎宁酸为下式的1，5-二-O-咖啡酰奎宁酸，
Figure C9611169100022
3.权利要求1或2的用途，其中逆转录病毒为HIV。
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