CN114652710A - 1,3-二咖啡酰奎宁酸在用于制备治疗肝癌的药物中的应用 - Google Patents
1,3-二咖啡酰奎宁酸在用于制备治疗肝癌的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了1,3‑二咖啡酰奎宁酸在用于制备治疗肝癌的药物中的用途，并且通过研究证实了1,3‑二咖啡酰奎宁酸可通过促进肝癌细胞中抑癌基因p53的表达量，从而起到抑制肝癌发生发展的效果。为肝癌的临床治疗提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及药物治疗领域，更为具体的，本发明涉及1，3-二咖啡酰奎宁酸用于制备治疗肝癌的药物的用途。
背景技术
p53基因是一种分子量为43.7KDa的蛋白质，但因蛋白条带出现在Marker所示53KDa处，命名为P53。因为蛋白中含有大量的脯氨酸，电泳速度被拖慢。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。mdm2突变与P53突变不共存，p53是一个重要的抗癌基因，其野生型使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。p53的突变型会提高癌变。
p53基因表达产物P53蛋白由393个氨基酸残基构成，在体内以四聚体的形式存在，半衰期为20-30分钟。正常情况下，细胞中P53蛋白的含量很低，因其半衰期短，所以很难检测出来，但在生长增殖的细胞中，可升高5-100倍以上。野生型P53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖种起着重要作用，因而被冠上“基因卫士”的称号。p53基因时刻监控着细胞染色体DNA的完整性，一旦细胞染色体DNA遭到损害，P53蛋白与基因的DNA的相应结合部位结合，起特殊转录因子的作用，活化p21基因转录，使细胞停滞于G1期；抑制解链酶的活性；并与复制因子A相互作用，参与DNA的复制与修复。如果修复失败，P53蛋白即启动程序性死亡(凋亡)过程诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向的突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。当p53基因发生突变后，由于空间构象影响到转录活化功能及P53蛋白的磷酸化过程，这不仅失去野生型p53抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因的功能。突变的P53蛋白与野生型的P53蛋白相结合，形成的这种寡居蛋白不能结合DNA，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。p53介导的细胞信号转导途径在调节细胞正常生命活动中起重要作用，它与细胞内其它信号转导通路间的联系十分复杂，其中p53参与调控的基因已超过160种因此，Levine等学者提出了p53基因网络的概念：他们认为不能孤立地观察各个基因的生物学功能，而应该将它们组合起来看待。p53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。正常p53的生物功能好似“基因组卫士(guardian of the genome)”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。如有损伤，p53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，p53蛋白则引发细胞凋亡；如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。
洋蓟素(1，3-二咖啡酰奎宁酸，CAS号：30964-13-7，分子式：C25H24O12，分子量：516.45)，又称朝蓟素，洋蓟酸，英文名：1，3-Dicaffeoylquinic acid。存在于菊科植物洋蓟(Cynara scolymus L.)、森林千里光(Senecio nemorensis L.)全草中，临床主要用于治疗由肝功能不足引起的各种疾病。能增强胆汁降低脂肪，肝脏解毒，预防脂肪肝；能有效抑制LDL胆固醇氧化，降低胆固醇。目前尚无关于洋蓟素对p53通路的生理调节活性的研究报道。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明首次公开了洋蓟素对p53基因表达的调节作用，以及其抗肝癌的活性。更为具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种1，3-二咖啡酰奎宁酸在制备促进p53基因表达的药物中的应用。
本发明的第二个方面，提供一种1，3-二咖啡酰奎宁酸在制备治疗肝癌的药物中的应用。
本发明的第三个方面，提供一种治疗肝癌的药物组合物，其中，所述药物组合物的活性成分为1，3-二咖啡酰奎宁酸。
本发明的第三个方面，提供一种促进p53基因表达的药物组合物，其中，所述药物组合物的活性成分为1，3-二咖啡酰奎宁酸。
在一种实施方式中，上述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明相对于现有技术具有如下显著的进步：
本发明首次通过研究证实了1，3-二咖啡酰奎宁酸可通过促进肝癌细胞中抑癌基因p53的表达量，从而起到抑制肝癌发生发展的效果，为肝癌的临床治疗提供了新的用药方案，为肝癌治疗提供了新的思路。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对裸鼠皮下肿瘤体积的抑制效果；
图2为1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对p53信号通路的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 1，3-0-二咖啡酰奎宁酸对肝癌细胞的抑制作用
实验用细胞株：人肝癌细胞HepG2以及人正常肝细胞L-02均购于中科院上海细胞库。两种细胞分别用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养。置于二氧化碳培养箱中(37℃、5％CO2)常规培养，隔天换液，待培养瓶中细胞汇合度达90％后铺板进行后续实验。试剂和仪器：DMEM培养基购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)和细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗p53(#2527)单克隆抗体均购自美国CST公司。
全部实验数据用Microsoft Excel 2003和SPSS 16.0数据处理系统进行统计处理，实验数据以均数±标准偏差(x±s)表示，并用One-Way ANOVA进行统计分析，Duncan’s检验进行多重差异显著分析，p＜0.05表示差异具有统计学意义。
通过CCK-8方法在肝癌细胞HepG2上评价1，3-O-二咖啡酰奎宁酸的抗肝癌活性，且在正常肝细胞L-02上评价1，3-O-二咖啡酰奎宁酸的细胞毒性，具体实验步骤如下所述：
将HepG2、L-02细胞按照1×104个/孔均匀接种于96孔板，待细胞贴壁后，用不同浓度的1，3-O-二咖啡酰奎宁酸(0、25、50、100、200μM)处理24h和48h。在相应时间点，加入10μlCCK-8试剂，空白组中加入100μl含10％CCK-8试剂的培养基，37℃避光孵育1h后，检测各孔吸光度值(A450)。细胞活力(％)＝(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100％；空白组是指不添加药物的细胞组。
实验结果如下表1所示：
表1 1，3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度对HepG2和L-02细胞活力的影响
注：相对于空白组，*为P＜0.05；**为P＜0.01。
实验结果显示，1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对正常肝细胞无明显细胞毒性，而对HepG2肝癌细胞活力具有明显的抑制作用。
实施例2 1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对p53信号通路的调节作用
取对数生长期的HepG2细胞系分为对照组(1，3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为0uM)、50uM组(1，3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为50uM)、25uM组(1，3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为25uM)、5uM组(1，3-O-二咖啡酰奎宁酸浓度为5uM)，经相应处理24h后，取新的酶标板一块，用多通道移液器对各组细胞上清取样分析，每孔取样20ul，添加底物天然腔肠荧光素150ug/ml，进行Nano-luciference体外生物发光检测。具体检测步骤如下：
1.Nano-luciference体外生物发光检测检测：
(1)天然腔肠荧光素(Coelenterazine，Catalog Number：CZ10，CAS Number：55779-48-1，生产商：goldbio)分子式：C26H21N3O3分子量：423.48g/mol，纯度：95％保存：-15摄氏度避光，保存在-80摄氏度冰箱中。用前取出水浴化冻，将其配制成100mM的储存液(200x，浓度30mg/ml)。混匀后立即使用。
(2)用预热好的组织培养基(细胞系培养在添加有青霉素(100unit/mL)、链霉素(100μg/mL)和10％胎牛血清(FBS)的相应细胞培养基中)1∶200稀释储存液，配制为荧光素工作液(终浓度150μg/mL)。
(3)去除培养细胞的培养基直至无残留；
(4)图像分析前立即向细胞内添加1×荧光素工作液，然后使用小动物成像仪(PE公司，型号：IVIS Lumina III)进行图像分析(或者细胞放在37℃短时间孵育后检测可增强信号)，设备常数为：
luminescent
Exposure time：Auto
Binning：2
F/stop：1
Camera temp：-90
Stage Temp：37
3.实验结果：
结果如表2所示，相对于空白对照组，1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对HepG2细胞中p53蛋白表达量提高表现出显著的剂量依赖性(P＜0.01)，可显著促进癌细胞内P53抑癌基因的表达。
表2各给药组P53转录蛋白表达量提高倍数
| 5uM给药组 | 25uM给药组 | 50uM给药组 | |
| 第一次实验 | 1.21 | 4.68 | 6.68 |
| 第二次实验 | 1.52 | 4.15 | 6.21 |
| 第三次实验 | 1.15 | 4.02 | 6.80 |
实施例3 1，3-O-二咖啡酰奎宁酸这在体内抗肝癌转移的药效学研究
1.肝癌肺转移小鼠模型的建立：
将HepG2细胞接种在裸鼠背部皮下，接种量约为5×106个/只，接种后隔天观察，1周后开始腹腔注射各实验组药物。
2. 1，3-O-二咖啡酰奎宁酸对肝癌肺转移小鼠模型的药效学分析：
将在无病原条件下适应性饲养一周后的裸鼠随机分为2组(每组5只)，分别为对照组(注射等剂量DMSO)和1，3-O-二咖啡酰奎宁酸组(2mg/kg)，各给药组裸鼠每天按相应剂量给药1次。每隔3d测量皮下肿瘤的长、短径，4周后处死裸鼠，瘤体组织液氮冻存用于后续实验。皮下瘤的体积＝瘤体长径×瘤体短径2/2。
结果如图1-2所示，接种1周后通过腹腔注射1，3-O-二咖啡酰奎宁酸，定期监测皮下肿瘤的生长。结果发现，1，3-O-二咖啡酰奎宁酸能显著抑制裸鼠皮下肿瘤的生长(图1)；对肿瘤组织进行蛋白水平检测发现，1，3-O-二咖啡酰奎宁酸处理的肝癌组织(图2：A为control组，B为1，3-O-二咖啡酰奎宁酸组)中p53、p21及Bax水平显著升高，Bcl-2表达水平显著降低，说明1，3-O-二咖啡酰奎宁酸可能通过激活肝癌细胞中p53信号通路从而发挥对肝癌的抑制作用。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种1，3-二咖啡酰奎宁酸在制备促进p53基因表达的药物中的应用。
2.一种1，3-二咖啡酰奎宁酸在制备治疗肝癌的药物中的应用。
3.一种治疗肝癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为1，3-二咖啡酰奎宁酸。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
5.一种促进p53基因表达的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的活性成分为1，3-二咖啡酰奎宁酸。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
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